TY - JOUR A1 - Rohmer, Carina A1 - Dobritz, Ronja A1 - Tuncbilek-Dere, Dilek A1 - Lehmann, Esther A1 - Gerlach, David A1 - George, Shilpa Elizabeth A1 - Bae, Taeok A1 - Nieselt, Kay A1 - Wolz, Christiane T1 - Influence of Staphylococcus aureus strain background on Sa3int phage life cycle switches JF - Viruses N2 - Staphylococcus aureus asymptomatically colonizes the nasal cavity of mammals, but it is also a leading cause of life-threatening infections. Most human nasal isolates carry Sa3 phages, which integrate into the bacterial hlb gene encoding a sphingomyelinase. The virulence factor-encoding genes carried by the Sa3-phages are highly human-specific, and most animal strains are Sa3 negative. Thus, both insertion and excision of the prophage could potentially confer a fitness advantage to S. aureus. Here, we analyzed the phage life cycle of two Sa3 phages, Φ13 and ΦN315, in different phage-cured S. aureus strains. Based on phage transfer experiments, strains could be classified into low (8325-4, SH1000, and USA300c) and high (MW2c and Newman-c) transfer strains. High-transfer strains promoted the replication of phages, whereas phage adsorption, integration, excision, or recA transcription was not significantly different between strains. RNASeq analyses of replication-deficient lysogens revealed no strain-specific differences in the CI/Mor regulatory switch. However, lytic genes were significantly upregulated in the high transfer strain MW2c Φ13 compared to strain 8325-4 Φ13. By transcriptional start site prediction, new promoter regions within the lytic modules were identified, which are likely targeted by specific host factors. Such host-phage interaction probably accounts for the strain-specific differences in phage replication and transfer frequency. Thus, the genetic makeup of the host strains may determine the rate of phage mobilization, a feature that might impact the speed at which certain strains can achieve host adaptation. KW - phage KW - virulence KW - induction KW - gene regulation KW - Staphylococcus KW - hemolysin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-297209 SN - 1999-4915 VL - 14 IS - 11 ER - TY - JOUR A1 - García-Martínez, Jorge A1 - Brunk, Michael A1 - Avalos, Javier A1 - Terpitz, Ulrich T1 - The CarO rhodopsin of the fungus Fusarium fujikuroi is a light-driven proton pump that retards spore germination JF - Scientific Reports N2 - Rhodopsins are membrane-embedded photoreceptors found in all major taxonomic kingdoms using retinal as their chromophore. They play well-known functions in different biological systems, but their roles in fungi remain unknown. The filamentous fungus Fusarium fujikuroi contains two putative rhodopsins, CarO and OpsA. The gene carO is light-regulated, and the predicted polypeptide contains all conserved residues required for proton pumping. We aimed to elucidate the expression and cellular location of the fungal rhodopsin CarO, its presumed proton-pumping activity and the possible effect of such function on F. fujikuroi growth. In electrophysiology experiments we confirmed that CarO is a green-light driven proton pump. Visualization of fluorescent CarO-YFP expressed in F. fujikuroi under control of its native promoter revealed higher accumulation in spores (conidia) produced by light-exposed mycelia. Germination analyses of conidia from carO\(^{-}\) mutant and carO\(^{+}\) control strains showed a faster development of light-exposed carO-germlings. In conclusion, CarO is an active proton pump, abundant in light-formed conidia, whose activity slows down early hyphal development under light. Interestingly, CarO-related rhodopsins are typically found in plant-associated fungi, where green light dominates the phyllosphere. Our data provide the first reliable clue on a possible biological role of a fungal rhodopsin. KW - microbial rhodopsins KW - intracellular pH KW - membrane proteins KW - mutants KW - virulence KW - channelrhodopsin-2 KW - growth KW - gene KW - expression KW - bacteriorhodopsin Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149049 VL - 5 IS - 7798 ER - TY - JOUR A1 - Dandekar, Thomas A1 - Fieselmann, Astrid A1 - Fischer, Eva A1 - Popp, Jasmin A1 - Hensel, Michael A1 - Noster, Janina T1 - Salmonella - how a metabolic generalist adopts an intracellular lifestyle during infection JF - Frontiers in Cellular and Infection Microbiology N2 - The human-pathogenic bacterium Salmonella enterica adjusts and adapts to different environments while attempting colonization. In the course of infection nutrient availabilities change drastically. New techniques, "-omics" data and subsequent integration by systems biology improve our understanding of these changes. We review changes in metabolism focusing on amino acid and carbohydrate metabolism. Furthermore, the adaptation process is associated with the activation of genes of the Salmonella pathogenicity islands (SPIs). Anti-infective strategies have to take these insights into account and include metabolic and other strategies. Salmonella infections will remain a challenge for infection biology. KW - enterica serovar Typhimurium KW - bacterial invasion KW - mouse model KW - defenses KW - regulation KW - "-omics" KW - virulence KW - Salmonella-containing vacuole (SCV) KW - metabolism KW - nitric oxide Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149029 VL - 4 IS - 191 ER - TY - JOUR A1 - Dandekar, Thomas A1 - Fieselmann, Astrid A1 - Fischer, Eva A1 - Popp, Jasmin A1 - Hensel, Michael A1 - Noster, Janina T1 - Salmonella—how a metabolic generalist adopts an intracellular lifestyle during infection JF - Frontiers in Cellular and Infection Microbiology N2 - The human-pathogenic bacterium Salmonella enterica adjusts and adapts to different environments while attempting colonization. In the course of infection nutrient availabilities change drastically. New techniques, “-omics” data and subsequent integration by systems biology improve our understanding of these changes. We review changes in metabolism focusing on amino acid and carbohydrate metabolism. Furthermore, the adaptation process is associated with the activation of genes of the Salmonella pathogenicity islands (SPIs). Anti-infective strategies have to take these insights into account and include metabolic and other strategies. Salmonella infections will remain a challenge for infection biology. KW - regulation KW - virulence KW - "-omics" KW - metabolism KW - Salmonella-containing vacuole (SCV) Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120686 SN - 2235-2988 VL - 4 IS - 191 ER - TY - JOUR A1 - Dandekar, Thomas A1 - Fieselmann, Astrid A1 - Popp, Jasmin A1 - Hensel, Michael T1 - Salmonella enterica: a surprisingly well-adapted intracellular lifestyle JF - Frontiers in Microbiology N2 - The infectious intracellular lifestyle of Salmonella enterica relies on the adaptation to nutritional conditions within the Salmonella-containing vacuole (SCV) in host cells. We summarize latest results on metabolic requirements for Salmonella during infection. This includes intracellular phenotypes of mutant strains based on metabolic modeling and experimental tests, isotopolog profiling using (13)C-compounds in intracellular Salmonella, and complementation of metabolic defects for attenuated mutant strains towards a comprehensive understanding of the metabolic requirements of the intracellular lifestyle of Salmonella. Helpful for this are also genomic comparisons. We outline further recent studies and which analyses of intracellular phenotypes and improved metabolic simulations were done and comment on technical required steps as well as progress involved in the iterative refinement of metabolic flux models, analyses of mutant phenotypes, and isotopolog analyses. Salmonella lifestyle is well-adapted to the SCV and its specific metabolic requirements. Salmonella metabolism adapts rapidly to SCV conditions, the metabolic generalist Salmonella is quite successful in host infection. KW - Salmonella enterica KW - metabolism KW - Salmonella-containing vacuole KW - regulation KW - virulence Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123135 ER - TY - THES A1 - Liang, Chunguang T1 - Tools for functional genomics applied to Staphylococci, Listeriae, Vaccinia virus and other organisms N2 - Genome sequence analysis A combination of genome analysis application has been established here during this project. This offers an efficient platform to interactively compare similar genome regions and reveal loci differences. The genes and operons can be rapidly analyzed and local collinear blocks (LCBs) categorized according to their function. The features of interests are parsed, recognized, and clustered into reports. Phylogenetic relationships can be readily examined such as the evolution of critical factors or a certain highly-conserved region. The resulting platform-independent software packages (GENOVA and inGeno), have been proven to be efficient and easy to handle in a number of projects. The capabilities of the software allowed the investigation of virulence factors, e.g., rsbU, strains’ biological design, and in particular pathogenicity feature storage and management. We have successfully investigated the genomes of Staphylococcus aureus strains (COL, N315, 8325, RN1HG, Newman), Listeria spp. (welshimeri, innocua and monocytogenes), E.coli strains (O157:H7 and MG1655) and Vaccinia strains (WR, Copenhagen, Lister, LIVP, GLV-1h68 and parental strains). Metabolic network analysis Our YANAsquare package offers a workbench to rapidly establish the metabolic network of such as Staphylococcous aureus bacteria in genome-scale size as well as metabolic networks of interest such as the murine phagosome lipid signalling network. YANAsquare recruits reactions from online databases using an integrated KEGG browser. This reduces the efforts in building large metabolic networks. The involved calculation routines (METATOOL-derived wrapper or native Java implementation) readily obtain all possible flux modes (EM/EP) for metabolite fluxes within the network. Advanced layout algorithms visualize the topological structure of the network. In addition, the generated structure can be dynamically modified in the graphic interface. The generated network as well as the manipulated layout can be validated and stored (XML file: scheme of SBML level-2). This format can be further parsed and analyzed by other systems biology software, such as CellDesigner. Moreover, the integrated robustness-evaluation routine is able to examine the synthesis rates affected by each single mutation throughout the whole network. We have successfully applied the method to simulate single and multiple gene knockouts, and the affected fluxes are comprehensively revealed. Recently we applied the method to proteomic data and extra-cellular metabolite data of Staphylococci, the physiological changes regarding the flux distribution are studied. Calculations at different time points, including different conditions such as hypoxia or stress, show a good fit to experimental data. Moreover, using the proteomic data (enzyme amounts) calculated from 2D-Gel-EP experiments our study provides a way to compare the fluxome and the enzyme expression. Oncolytic vaccinia virus (VACV) We investigated the genetic differences between the de novo sequence of the recombinant oncolytic GLV-1h68 and other related VACVs, including function predictions for all found genome differences. Our phylogenetic analysis indicates that GLV-1h68 is closest to Lister strains but has lost several ORFs present in its parental LIVP strain, including genes encoding CrmE and a viral Golgi anti-apoptotic protein, v-GAAP. Functions of viral genes were either strain-specific, tissue-specific or host-specific comparing viral genes in the Lister, WR and COP strains. This helps to rationally design more optimized oncolytic virus strains to benefit cancer therapy in human patients. Identified differences from the comparison in open reading frames (ORFs) include genes for host-range selection, virulence and immune modulation proteins, e.g. ankyrin-like proteins, serine proteinase inhibitor SPI-2/CrmA, tumor necrosis factor (TNF) receptor homolog CrmC, semaphorin-like and interleukin-1 receptor homolog proteins. The contribution of foreign gene expression cassettes in the therapeutic and oncolytic virus GLV-1h68 was studied, including the F14.5L, J2R and A56R loci. The contribution of F14.5L inactivation to the reduced virulence is demonstrated by comparing the virulence data of GLV-1h68 with its F14.5L-null and revertant viruses. The comparison suggests that insertion of a foreign gene expression cassette in a nonessential locus in the viral genome is a practical way to attenuate VACVs, especially if the nonessential locus itself contains a virulence gene. This reduces the virulence of the virus without compromising too much the replication competency of the virus, the key to its oncolytic activity. The reduced pathogenicity of GLV-1h68 was confirmed by our experimental collaboration partners in male mice bearing C6 rat glioma and in immunocompetent mice bearing B16-F10 murine melanoma. In conclusion, bioinformatics and experimental data show that GLV-1h68 is a promising engineered VACV variant for anticancer therapy with tumor-specific replication, reduced pathogenicity and benign tissue tropism. N2 - Genom Sequenz Analyse Im Zuge der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Programme zur Genomanalyse kombiniert, um eine effiziente Plattform zum interaktiven Vergleich lokaler Ähnlichkeiten bzw. Unterschiede in Genomen bereitzustellen. Damit können Gene und Operons schnell untersucht und “local collinear blocks” entsprechend ihrer Funktion kategorisiert werden. Phylogenetische Beziehungen, wie beispielsweise die Evolution spezifischer Elemente oder stark konservierter Regionen können leicht überprüft werden. Die hierfür entwickelte plattformunabhängige Software (GENOVA und inGeno) hat sich in mehreren Projekten als effizient und leicht handhabbar bewährt. Die Programme erlauben die Untersuchung von Virulenzfaktoren auf Sequenz- oder Annotationsebene. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten so die Genome von verschiedenen Staphylococcus aureus, Listeria spp., Escherichia coli und Vaccinia Stämmen untersucht werden. Metabolische Netzwerk Analyse Unser “YANAsquare” Programmpaket bietet eine Oberfläche um schnell metabolische Netzwerke vom genomweiten Anzatz bis hinunter zum Einzelnetzwerk zu analysieren. Dafür greift YANA mit Hilfe des integrierten KEGG-Browsers auf Onlinedatenbanken zu, um die notwendigen Informationen zum metabolischen Reaktionsweg bereitzustellen und reduziert so maßgeblich den Arbeitsaufwand beim Beschreiben von Netzwerke. Die implementierten Methoden zur Berechnung (METATOOL, eigene Implementation in Java) des Netzwerkes liefern exakt alle die möglichen Elementarmoden (EM/EP) für die Metabolite zurück. Durch den Einsatz von fortgeschrittenen Layout Algorithmen wird anschliessend die Darstellung der Netzwerktopologie möglich. Außerdem kann in der grafischen Darstellung das generierte Netzwerklayout dynamisch verändert werden. Das Speichern der Daten erfolgt im XML (SBML level-2) Format und erlaubt so die Weiterverwendung in anderen systembiologischen Programmen, wie dem “CellDesigner”. Mit Hilfe einer gen-Knockout Simulations Methode kann der Einfluss von einzelnen Mutationen im gesamten Netzwerk auf die Syntheseraten untersucht werden. Wir konnten mit dieser Methode Einzel- sowie Mehrfachgenknockouts und deren Effekte auf die Elementarmoden analysieren. Die Methode wurde ebenfalls auf Proteomdaten und extrazelluläre Metabolite von Staphylokokken angewandt, um Änderungen bezüglich der Flussverteilung zu untersuchen. Die Simulationen zu verschieden Zeitpunkten und unter verschiedenen Stessbedingungen zeigen große Übereinstimmung mit experimentell erhobenen Daten. Onkolytischer Vaccinia Virus (VACV) Wir haben die genetischen Unterschiede zwischen der de novo Sequenz des rekombinanten onkolytischen Virus GLV-1h68 und anderen VACVs untersucht und gefundene Unterschiede funktionell charakterisiert. Die phylogenetische Analyse zeigt das GLV-1h68 mit dem Lister Stamm am nächsten verwandt ist. Auffällig ist dabei der Verlust von einigen open reading frames (ORFs), die noch im Eltern LIVP Stamm vorhanden sind (CrmE, v-GAAP). Beim Vergleich der Funktion viraler Gene aus Lister, WR und COP Stämmen treten stamm-, gewebe- und wirtsspezifische Gene auf. Diese Tatsache ermöglicht die Optimierung der onkolytischen Virusstämme für den Einsatz bei humanen Krebstherapien. Die beim Vergleich identifizierten Unterschiede zwischen den ORFs enthalten Gene für die Wirtsselektion, Virulenz und immunmodulierende Proteine (Ankyrin ähnliche Proteine, Serine-Proteinasen Inhibitor SPI-2/CrmA, Tumor Nekrose Faktor (TNF) Rezeptorhomolog CrmC, semaphorinähnliche und Interleukin-1 rezeptorhomologe Proteine). An den Loki F14.5L, J2R und A56R des GLV-1h68 Virus wurden die Vorteile der eingesetzten fremden Genexpressionskassetten untersucht. So zeigt GLV-1h68 mit F14.5L-Inaktivierung gegenüber der F14.5L-Revertanten Viren eine reduzierte Virulenz. Das erlaubt die Schlussfolgerung, dass die Insertion von fremden Genexpressionskassetten in nicht-essentielle Loki zur Verminderung der Virulenz von VACVs führt, besonders, wenn der nicht-essentielle Lokus selbst ein Virulenzgen enthält. Das Replikationsvermögen, welches ausschlaggebend für die onkolytische Aktivität des Virus ist, wird trotz der verminderten Virulenz nicht eingeschränkt. Die reduzierte Pathogenität des GLV-1h68 Virus wurde durch experimentelle Daten unserer Kollaborationspartner in männlichen Mäusen mit Ratten C6 Gliom und in immunokompetenten Mäusen mit B16-F10 Mausmelanom nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen experimentelle und bioinformatisch gewonnene Daten, dass GLV-1h68 eine vielversprechende VACV Variante für die Krebstherapie mit tumorspezifischer Replikation, verringerter Pathogenität und hoher Gewebsspezifität ist. KW - Genanalyse KW - Bioinformatik KW - Systembiologie KW - bacterial KW - virulence KW - systems biologie KW - genomic KW - algorithm KW - metabolic KW - network KW - pathway KW - flux KW - Bacterial KW - genomics KW - algorithm KW - tool KW - metabolic Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48051 ER - TY - THES A1 - Herrmann, Petra T1 - Entwicklung und Evaluierung neuer Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen T1 - Development and evaluation of new methods to analyse the proteome of Listeria monocytogenes in infected host cells N2 - In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen können im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, nämlich die Überlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im Überschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit überwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellulär gewachsene Bakterien über Bindung an paramagnetische Partikel („Beads“) und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gewählt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel  Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy – CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur für die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate für die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien während der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. Für einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen“ Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begründet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen Fällen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellulären Veränderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten übereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazelluläre posttranskriptionelle Mechanismen begründet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen. N2 - In this thesis new methods to analyse the proteome of Listeria monocytogens in infected host cells have been developed. Proteomic analyses, in comparison to transcriptomic analysis, by their capacity to detect actual protein amounts and possibly post translational modifications as well as degradation processes are able to give a more precise picture of the functional status of a cell under diverse environmental conditions.The main problem of proteomic analyses, with bacteria grown inside eukaryotic host cells, the superimposition of the bacterial protein pattern by the exceedingly present host cell proteins had to be overcome. Methods have been established to selectively isolate intracellularly grown bacteria by binding to paramagnetic beads and subsequent magnetic separation from the host cell components. At this three differently coated types of beads [Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), silica gel  magnetite Beads (MERCK under way), Dynabeads M-270 Epoxy – CBD Beads (coated with phagolysine Ply 118)] have been used. At this it was only possible for the “Kieselgel + Magnetit Beads” to reach a sufficient isolation rate for the method of 2-D-electrophoresis of 6-7 * 10**7 Listeria/ cell culture flask. In the 2-D-proteingel there showed up a bad streaking whereby this approach proved not to be evaluable. In an alternative approach at infections of J774-macrophages it succeded to purify the listeria by consecutive washing steps out of the host cells. It was possible to isolate 30-50 µg listerial proteins out of infections in J774-macrophages and to have them two-dimensionally separated whereby the protein pattern qualitatively clearly matched that of in vitro grown Listeria monocytogenes. In such way it was possible to identify 38 proteins of Listeria monocytogenes, which have been induced or suppressed during the infections in macrophages and to have them identified, quantified and statistically evaluated with the Delta-2-D software. There was already evidence for some of the proteins that have been identified by the newly established method, on the basis of the present literature (on transcriptome, secretome, virulence of Listeria), for a participation in the course of infection. Up to now the proteomic analysis is subject to some restrictions for example in the detection of weakly expressed, strong alkaline, strong hydrophobic, high-molecular weight and low-molecular weight proteins so that the current methodology can not cover the whole proteome. That the “classic” virulence factors of pathogenic listeria, listeriolysin O (LLO), the phospholipases PlcA and PlcB, as well as ActA are not captured is caused by the fact that these proteins are secreted. Of particular importance is the observation that in very little cases (e.g. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) the detected intracellular changes in protein amount are consistent with the published transcription data. These discrepancies constitute no artefacts but are caused by intracellular posttranscriptional mechanisms. Altogether also this protein analysis reveals that during replication of Listeria monocytogenes in the eucaryotic host cell cytosol numerous complex adaptations of partly central but also peripheral metabolic pathways and biosyntheses to that specific milieu take place. KW - Listeria monocytogenes KW - Methode KW - Proteomanalyse KW - Zweidimensionale Elektrophorese KW - Virulenz KW - Infektion KW - Wirtszellen KW - J774-Makrophagen KW - paramagnetische Beads KW - Proteinidentifizierung KW - Quantifizierung KW - statistische Auswertung KW - methods KW - protein analysis KW - infection KW - virulence KW - statistical evaluation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37500 ER - TY - THES A1 - Raffelsbauer, Diana T1 - Identification and characterization of the inlGHE gene cluster of Listeria monocytogenes T1 - Identifizierung und Charakterisierung des inlGHE-Genclusters von Listeria monocytogenes N2 - In the present study, a new gene cluster of Listeria monocytogenes EGD containing three internalin genes was identified and characterized. These genes, termed inlG, inlH and inlE, encode proteins of 490, 548 and 499 amino acids, respectively, which belong to the class of large, surface-bound internalins. Each of these proteins contains a signal peptide, two regions of repeats (Leucine-rich repeats and B repeats), an inter-repeat region and a putative cell wall anchor sequence containing the sorting motiv LPXTG. PCR analysis revealed the presence of the inlGHE gene cluster in most L. monocytogenes serotypes. A similar gene cluster termed inlC2DE localised to the same position on the chromosome was described in a different L. monocytogenes EGD isolate. Sequence comparison of the two clusters indicates that inlG is a new internalin gene, while inlH was generated by a site-specific recombination leading to an in-frame deletion which removed the 3'-terminal end of inlC2 and a 5'-portion of inlD. The genes inlG, inlH and inlE seem to be transcribed extracellularly and independent of PrfA. To study the function of the inlGHE gene cluster several in-frame deletion mutants were constructed which lack the genes of the inlGHE cluster individually or in combination with other inl genes. When tested in the mouse model, the inlGHE mutant showed a significant reduction of bacterial counts in liver and spleen in comparison to the wild type strain, indicating that the inlGHE gene cluster plays an important role in virulence of L. monocytogenes. The ability of this mutant to invade non-phagocytic cells in vitro was however two- to three-fold higher than that of the parental strain. To examine whether deletion of the single genes from the cluster has the same stimulatory effect on invasiveness as deletion of the complete gene cluster, the single in-frame deletion mutants inlG, inlH and inlE were constructed. These mutants were subsequently reverted to the wild type by introducing a copy of the corresponding intact gene into the chromosome by homologous recombination using knock-in plasmids. To determine a putative contribution of InlG, InlH and InlE in combination with other internalins to the entry of L. monocytogenes into mammalian cells, the combination mutants inlA/GHE, inlB/GHE, inlC/GHE, inlA/B/GHE, inlB/C/GHE, inlA/C and inlA/C/GHE were constructed. Transcription of the genes inlA, inlB and inlC in these mutants was studied by RT-PCR. Deletion of inlGHE enhances transcription of inlA and inlB, but not of inlC. This enhancement is not transient but can be observed at different time-points of the bacterial growth curve. Deletion of inlA also increases transcription of inlB and vice-versa. In contrast, the amounts of inlA and inlB transcripts in the single deletion mutants inlG, inlH and inlE were similar to those from the wild type. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues Gencluster von Listeria monocytogenes EGD mit drei Internalingenen identifiziert und charakterisiert. Diese als inlG, inlH und inlE bezeichneten Gene codieren für Proteine mit 490, 548 bzw. 499 Aminosäuren, die zur Klasse der großen, oberflächengebundenen Internaline gehören. Jedes dieser Proteine enthält ein Signalpeptid, zwei Repeat-Regionen (Leucin-reiche Repeats und B-Repeats), eine Inter-Repeat-Region, und eine mögliche Zellwandankersequenz mit dem Motiv LPXTG. PCR-Analyse zeigte das Vorkommen des inlGHE-Genclusters in den meisten L. monocytogenes-Serotypen. Ein ähnliches, als inlC2DE bezeichnetes Gencluster wurde in der gleichen Position auf dem Chromosom eines anderen L. monocytogenes EGD Isolats beschrieben. Ein Sequenzvergleich beider Clusters zeigte, dass inlG ein neues Internalingen ist, während inlH durch eine in-frame-Deletion vom 3'-Ende von inlC2 und einem 5'-Teil von inlD entstanden ist. Die Gene inlG, inlH und inlE werden vorwiegend extrazellulär und PrfA-unabhängig transkribiert. Um die Funktion des inlGHE-Genclusters zu untersuchen, wurden verschiedene in-frame-Deletionsmutanten hergestellt, aus denen die Gene des inlGHE-Clusters entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Internalingenen deletiert wurden. Im Maumodell zeigte eine inlGHE-Mutante nach oraler Infektion eine signifikante Reduktion der Bakterienzahl in der Leber und Milz, die auf eine wichtige Rolle des inlGHE-Genclusters in der Virulenz von L. monocytogenes hindeutet. Die Fähigkeit dieser Mutante, in nicht-phagocytische Zellen in vitro einzudringen, ist zwei bis dreifach höher als die des Wildtyp-Stammes. Um zu untersuchen, ob die Deletion von Einzelgenen des inlGHE-Genclusters einen ähnlichen stimulatorischen Effekt auf die Invasivität ausübt wie die Deletion des kompletten Genclusters, wurden die Einzeldeletionsmutanten inlG, inlH and inlE hergestellt. Diese Mutanten wurden anschließend zum Wildtyp revertiert, indem eine Kopie des entsprechenden intakten Gens durch homologe Rekombination ins Chromosom mit Hilfe von Knock-in-Plasmiden eingeführt wurde. Um eine mögliche Rolle von InlG, InlH und InlE in Verbindung mit anderen Internalinen bei der Aufnahme von L. monocytogenes in Säugerzellen zu untersuchen, wurden die Mutanten inlA/GHE, inlB/GHE, inlC/GHE, inlA/B/GHE, inlB/C/GHE, inlA/C and inlA/C/GHE hergestellt. Die Transkription der Gene inlA, inlB and inlC in diesen Mutanten wurde durch RT-PCR untersucht. Deletion von inlGHE erhöht die Transkription von inlA und inlB, aber nicht die von inlC. Diese Erhöhung ist nicht vorübergehend sondern kann zu verschiedenen Zeitpunkten der Wachstumskurve beobachtet werden. Deletion von inlA verstärkt ebenfalls die Transcription von inlB und umgekehrt. Im Gegensatz dazu waren die Mengen an inlA- und inlB-Transkripten in den Einzeldeletionsmutanten inlG, inlH and inlE ähnlich wie die des Wildtyps. KW - Listeria monocytogenes KW - Molekulargenetik KW - Listeria monocytogenes KW - Virulenz KW - Internalin KW - inlGHE KW - Invasion KW - Leucin-reiche repeat protein KW - Listeria monocytogenes KW - virulence KW - internalin KW - inlGHE KW - invasion KW - leucine-rich repeat protein Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180595 ER -