TY  - THES
A1  - Luo, Qin
T1  - Essential features of a PrfA-dependent : promoter of Listeria monocytogenes
T1  - Die essentiellen Eigenschaften eines PrfA-abhängigen Promotors von Listeria monocytogenes
N2  - The gram-positive, facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is the causal agent of listeriosis. Most of well-known virulence genes are controlled by PrfA that belongs to the Crp-Fnr family of transcriptional activators. A PrfA-mediated transcription initiating at a virulence gene promoter, inlC promoter (PinlC) that regulates the expression of the small, secreted internalin C, was in-depth characterized by an in vitro transcription system to unravel the essential features of a PrfA-dependent promoter in this study. The obtained results indicate a dual promoter for inlC that leads to PrfA-dependent and -independent transcription in vitro and in vivo. The PrfA-dependent transcription requires, as expected, the PrfA-box, a conserved 14 bp sequence of dyad symmetry located about 40 bp upstream of the transcriptional start site of each PrfA-regulated gene. Another important structural feature for this PrfA-dependent promoter is the distance between the 3´-end of the PrfA-box and the 5´-end of the SigA-recognized –10 box fixed to 22 or 23 bp, which is observed in the interspace regions of the other known PrfA-dependent promoters, e.g. PactA, PplcA, Phly and Pmpl. The –35 box of PinlC is not necessary for PrfA-dependent transcription. The –10 box of PinlC and also that of the other PrfA-dependent promoters of L. monocytogenes closely resemble SigA-recognized –10 promoter sequences of the well-characterized gram-positive bacterium B. subtilis. Even the extended –10 motif (5´-TRTG-3´) considered to be a basic element for many SigA-recognized promoters in B. subtilis is present in PinlC. Primer extension studies reveal that both the PrfA-dependent and the independent promoter share the same –10 box. The PrfA-independent transcription of inlC depends on a –35 box located directly downstream of the PrfA-box, and the close proximity of the two sites inhibits strongly the transcription activity of the PrfA-independent promoter when the PrfA-RNA polymerase complex binds to the PrfA-box. Deletion of the PrfA-box results in PrfA-independent transcription from PinlC, which is no longer inhibited by PrfA. High concentration of GTP appears to be necessary for PrfA-dependent transcription initiated at the inlC promoter and at other PrfA-dependent promoters. Based on transcriptome analysis, Milohanic and his co-workers identified three groups of genes that were regulated differently by PrfA. Some of these genes containing putative PrfA-boxes in their 5´-upstream regulatory regions were selected for analysis of their transcriptional dependency on PrfA using again the in vitro transcription system. The data show that among these “PrfA-regulated” promoters tested, only the promoter of the hpt gene belonging to group I is clearly activated by PrfA. This promoter is also the only one that exhibited all essential features of a typical PrfA-dependent promoter as described above. In vitro transcription starting at most of the other promoters was neither positively nor negatively affected by PrfA. Transcription initiated at some of the promoters of group III genes (lmo0596 and lmo2067) is rather inefficient with SigA-loaded RNA polymerase, but is highly activated with RNA polymerase loaded with purified SigB. Addition of purified PrfA protein has no effect on the SigB-dependent transcription. These in vitro transcription results indicate that the in vivo observed PrfA effect on the expression of most of the new genes is either indirect or PrfA-mediated transcription of these genes requires - in contrast to the PrfA-dependent transcription of the known virulence genes (including hpt) - additional factors not present in the in vitro transcription assay. In addition to these new genes described by Milohanic, the promoters of two genes (lmo2420 and lmo2840) that contain putative PrfA-boxes with only a single mismatch in their upstream regulatory regions were analyzed in this study. However, transcription of none of these genes is regulated by PrfA, suggesting that these genes are either not truly regulated by PrfA or regulated by other global transcription activators that interact with PrfA by yet unknown mechanisms. By exchanging corresponding sequences between a functionally inactive promoter ParoAP2 and a typical PrfA-dependent promoter PplcA, it is found that PrfA-dependent in vitro transcription can be initiated from the hybrid promoter containing the putative PrfA-box and the SigA-recognized –10 box (TTTAAT) from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter, but it is inhibited strongly by the interspace sequence between these two sites apparently due to an additional RNA polymerase binding site [the –10 box (TAATAT) for the PrfA-independent transcription of ParoAP1)] within this region. Furthermore, a symmetric sequence downstream of the –10 box (TTTAAT) is also shown to be a strongly inhibitory for PrfA-dependent transcription from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter.
N2  - Listeria monocytogenes, ein gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium. Die meisten bekannten listeriellen Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA, der zur Crp-Fnr-Familie von Transkriptionsfaktoren zählt, reguliert. Zu den durch PrfA regulierten Genen zählt auch inlC, das das kleine sekretierte Internalin C kodiert. Mit Hilfe des in vitro Transkriptionssystems wurde in dieser Arbeit die PrfA-abhängige Transkription des inlC-Promotors (PinlC) untersucht, um die essentiellen Eigenschaften eines PrfA-abhängigen Promotors zu charakterisieren. Die hier erhaltenen Ergebnisse deuten auf einen dualen Promotor für inlC hin, der für eine PrfA-abhängige und -unabhängige Transkription in vitro und in vivo verantwortlich ist. Ein weiteres wichtiges Merkmal für diesen PrfA-abhängigen Promotor ist der Abstand zwischen dem 3'-Ende der PrfA-Box und dem 5'-Ende der SigA-abhängigen –10 Box, der 22 oder 23 bp beträgt und auch bei anderen bekannten PrfA-abhängigen Promotoren wie PactA, PplcA, Phly und Pmpl zu finden ist. Untersuchungen zeigten, dass die –35 Box von PinlC nicht notwendig für eine PrfA-abhängige Transkription ist. Die –10 Box von PinlC und anderen PrfA-abhängigen Promotoren von L. monocytogenes ähnelt stark den SigA-abhängigen –10 Promotorsequenzen des gut untersuchten gram-positiven Bakteriums B. subtilis. Sogar das erweiterte –10 Motiv (5'-TRTG-3'), das in B. subtilis als Hauptbestandteil vieler SigA-abhängiger Promotoren betrachtet wird, ist auch in PinlC zu finden. Untersuchungen mit Primer Extension zeigten, dass der PrfA-abhängige und PrfA-unabhängige inlC-Promotor die gleiche –10 Box verwenden. Die PrfA-unabhängige Transkription von inlC ist abhängig von einer –35 Box, die direkt downstream der PrfA-Box liegt. Durch die enge Nachbarschaft dieser beiden Sequenzen wird die Transkriptionsaktivität des PrfA-unabhängigen Promotors stark inhibiert, wenn der PrfA-RNA-Polymerase-Komplex an die PrfA-Box bindet. Deletion der PrfA-Box führt zu einer PrfA-unabhängigen Transkription von PinlC, die nicht länger durch PrfA inhibiert wird. Hohe Konzentration an GTP scheint zudem für die PrfA-abhängige Transkripitonsinitiation am inlC-Promotor und anderen PrfA-abhängigen Promotoren notwendig zu sein. Basierend auf Transkriptomanalysen identifizierte Milohanic et al. drei Gruppen von Genen, die differentiell durch PrfA reguliert werden. Einige dieser Gene besitzen putative PrfA-Boxen in ihren Promotorbereichen und wurden in dieser Arbeit mit Hilfe des in vitro Transkriptionssystems auf ihre PrfA-Abhängigkeit untersucht. Die hier erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass unter allen untersuchten "PrfA-regulierten" Promotoren nur der Promotor des hpt-Gens - einem Mitglied der Gruppe I - deutlich durch PrfA aktiviert wird. Die meiste andere Promotoren wurde weder positiv noch negativ durch PrfA beeinflusst. Die Transkription von einigen Promotoren der Gruppe III Gene (lmo0596 und lmo2067) ist relativ ineffizient mit SigA-beladener RNA-Polymerase, wird aber stark aktiviert, wenn RNA-Polymerase mit gereinigtem SigB beladen wird. Zugabe von gereinigtem PrfA-Protein hat keinen Einfluss auf die SigB-abhängige Transkription. Diese in vitro-Transkriptionsergebnisse deuten darauf hin, dass der in vivo beobachtete PrfA-Effekt auf die Expression der meisten neu identifizierten Gene entweder indirekt ist oder die PrfA-vermittelte Transkription dieser Gene im Gegensatz zur PrfA-abhängigen Transkription der bekannten Virulenzgene (einschließlich hpt) zusätzliche Faktoren benötigt, die im in vitro Transkriptionsansatz nicht vorhanden sind. Neben diesen neuen von Milohanic et al. beschriebenen Genen wurden die Promotoren von zwei weiteren Genen (lmo2420 und lmo2840) untersucht, die putative PrfA-Boxen mit nur einem Mismatch aufwiesen. Die Transkription dieser beiden Gene zeigte jedoch keine Abhängigkeit von PrfA. Durch Austausch entsprechender Sequenzen zwischen einem funktionell inaktiven Promotor ParoAP2 und einem typischen PrfA-abhängigen Promotor PplcA konnte gezeigt werden, dass PrfA-abhängige in vitro Transkription von einem Hybridpromotor initiiert werden kann, der die putative PrfA-Box und SigA-abhängige –10 Box (TTTAAT) des möglicherweise PrfA-abhängigen aroAP2-Promotors besitzt. In vitro Transkription wird allerdings durch die zwischen PrfA und –10 Box liegende Sequenz des aroAP2-Promotors stark inhibiert, da offensichtlich eine zusätzliche RNA-Polymerase-Bindungsstelle [die –10 Box (TAATAT) für die PrfA-unabhängige Transkription von ParoAP1] in dieser Region vorliegt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine symmetrische Sequenz downstream der –10 Box (TTTAAT) die PrfA-abhängige Transkription vom aroAP2-Promotor stark inhibiert.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Virulenz
KW  - Genregulation
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - das in vitro Transkriptionssystem
KW  - PrfA
KW  - das Promotor
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - in vitro transcription
KW  - PrfA
KW  - promoter
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10341
ER  - 
TY  - THES
A1  - Knuth, Karin
T1  - Identifizierung von essentiellen Genen in Salmonella typhimurium und Listeria monocytogenes durch Genom-weite Insertions-Duplikations-Mutagenese
T1  - Identification of essential genes in Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes by genome-wide insertion duplication mutagenesis
N2  - Die in dieser Arbeit etablierte Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM ermöglicht es, das Genom von pathogenen Bakterien zu mutagenisieren und die so generierte Mutantenbank im high-throughput-Format auf Gene zu untersuchen, die unter bestimmten Bedingungen für das infektiöse Potential oder für das Überleben dieser Keime von Bedeutung sind. Die Grundlage von IDM bildet ein konditional replizierender Vektor, in den eine Genbank des Wirtsorganismus kloniert wird und der unter nicht-permissiven Replikationsbedingungen mittels homologer Rekombination ins Chromosom integriert und dadurch einen Gen-Knockout bedingt. Das IDM-Verfahren weist gegenüber der Transposon-Mutagenese den Vorteil auf, dass das Genom nach dem Zufallsprinzip saturierend mutagenisiert werden kann und dass keine hot spots für die Insertion auftreten. Darüber hinaus kann der mutierte Genlocus nach Screening der Mutanten schnell per PCR identifiziert werden, indem die Exzision des Vektors induziert und das klonierte, homologe Fragment sequenziert wird. Die Insertion des Vektors ins Chromosom und damit der Gen-Knockout ist selbst ohne Selektionsdruck sehr stabil, so dass die Mutanten im Zellkultur- oder Tier-System untersucht werden können. IDM wurde im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf Salmonella enterica Serovar typhimurium und Listeria monocytogenes angewandt. Die Applikation von IDM auf S. typhimurium hatte zum Ziel, Gene zu identifizieren, deren Produkte für das Überleben dieses Gram-negativen Keims in Vollmedium unter Laborbedingungen essentiell sind. Ausgehend von 14.000 S. typhimurium Fragmentbank-Klonen konnten durch Induktion der Integration des Vektors 262 Klone identifiziert werden, für welche die Mutation zu einem lethalen Phänotyp führte. 116 der 262 entsprechenden Proteine konnte durch IDM erstmalig eine essentielle Funktion für die Vitalität von S. typhimurium zugewiesen werden. Darunter befinden sich sowohl Proteine, die homolog sind zu Proteinen anderer klinisch-relevanter Keime, als auch Proteine, die Salmonella-spezifisch sind. Der größte Teil der identifizierten Proteine ist in die Speicherung und Weitergabe von Information (Transkription, Translation, DNA-Reparatur etc.) involviert, viele sind allerdings auch Proteine unbekannter Funktion. Die Essentialität der durch IDM identifizierten Gene konnte durch die Konstruktion von konditional lethalen Mutanten bestätigt werden. IDM ist demnach das erste Mutagenese-Verfahren, welches das essentielle Gen-Set von S. typhimurium für das Überleben in Vollmedium zu definieren vermochte. Basierend auf den IDM Daten konnte es auf 511 Gene, d.h. auf 11 % des Gesamt-Genoms beziffert werden. Bei der Applikation von IDM auf L. monocytogenes lag der Fokus auf der Identifizierung von Genen, die für das Überleben dieses Gram-positiven Bakteriums im Zytosol von eukaryontischen Zellen von Bedeutung sind. Im Screening von bis dato 720 der 1491 L. monocytogenes Insertionsmutanten auf ein attenuiertes Replikationsverhalten in Caco-2 Zellen konnten 69 Mutanten selektioniert werden. In diesen Mutanten sind Gene ausgeknockt, deren Produkte hauptsächlich wichtige Funktionen in der Nährstoffbereitstellung, in der Energiesynthese und im Metabolismus inne haben. Mit der Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM steht ein molekulares Werkzeug zur Verfügung, welches für die Identifzierung neuer targets für sowohl Breitband- als auch Spezies-spezifische Antiinfektiva eingesetzt werden kann und welches unbekannten Proteinen eine biologische Funktionen zuweisen kann.
N2  - Using insertion-duplication-mutagenesis IDM, that has been established in this work, it is possible to mutate the genome of pathogenic bacteria and to generate a mutant bank. This bank can be screened in a high throughput format on genes that are relevant under certain conditions for the infectious potential and the survival of these germs. IDM is based on a conditionally replicating vector which integrates into the chromosome under non-permissive replication conditions via homologous recombination after having cloned a gene bank from the host organism into it. The vector integration causes a knockout of the respective gene. In contrast to transposon mutagenesis, the IDM approach has the advantage that the whole genome is mutated and that no mutation hot spots occur. Furthermore, after having screened the mutant bank, the mutated gene locus can be identified very quickly by applicating PCR: excision of the vector is induced and the cloned, homologous fragment is sequenced. Integration of the vector into the chromosome and therefore the gene knockout is very stable even without any selection so that the mutants can be examined in the cell culture and animal model. In this work IDM has been applicated successfully to Salmonella enterica Servovar typhimurium and Listeria monocytogenes. Application of IDM to S. typhimurium aimed to identify genes whose products are essential for the survival of that Gram negative germ in rich medium under laboratory conditions. Starting with 14.000 S. typhimurium fragment-bank clones, induction of integration of the vector led to the identification of 262 clones for which the mutation resulted in a lethal phenotype. For 116 of the 262 respective proteins, this is the first data that assigns to these proteins an essential function for viability of S. typhimurium. Amongst them are proteins that are homologue to proteins of other clinically relevant germs, as well as proteins that are Salmonella specific. Most of the identified proteins are involved in information storage and processing (transcription, translation, DNA repair etc.), but many are proteins of unknown function. The essentiality of the identified genes could be confirmed by construction of conditionally lethal mutants. Hence, IDM is the first mutagenesis approach that reached to define the essential gene-set of S. typhimurium for survival in rich medium. Based on the IDM data it could be estimated at 511 genes, that means at 11 % of the whole genome. The application of IDM to L. monocytogenes focussed on the identification of genes that play an important role for the survival of that Gram-positive bacterium in the cytosol of eucaryotic cells. Until now 720 of the 1491 L. monocytogenes mutants have been screened on a attenuated replication behaviour in Caco-2 cells and 69 mutants have been selected. These mutants harbour mutations in genes whose products mainly hold important functions in nutrient uptake, energy synthesis and metabolism. The insertion-duplication-mutagenesis IDM has proven to be a suitable molecular tool that can be used for the identification of novel targets for both broad spectrum and species-specific antibiotics and that can assign a biological function to unknown proteins.
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Insertionsmutagenese
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - essentielle Gene
KW  - Mutagenese
KW  - Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM
KW  - essential genes
KW  - mutagenesis
KW  - insertion duplication mutagenesis IDM
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10003
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rapp, Ulrike
T1  - Achieving protective immunitity against intracellular bacterial pathogens : a study on the efficiency of Gp96 as a vaccine carrier
T1  - Immunisierung gegen intrazelluläre Bakterien mit Hilfe von HSP-Fusionsproteinen
N2  - Protective vaccination against intracellular pathogens using HSP fusion proteins in the listeria model.
N2  - Impfschutz gegen intrazelluläre Pathogene durch Immunisierung mit HSP-Fusionsproteinen im listerien Modell.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Immunisierung
KW  - Hitzeschock-Proteine
KW  - Hitzeschockproteine
KW  - Immunsierung
KW  - Intrazelluläre Pathogene
KW  - Heat Shock Proteins
KW  - Immunization
KW  - Intracellular Pathogens
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9096
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lalic-Mülthaler, Mio
T1  - Molekularbiologischer Nachweis und Immunologie des P60-Proteins, sowie In-vitro-Transkription PrfA-abhängiger bzw. -unabhängiger Gene von Listeria monocytogenes
T1  - Molecular biologycal detection and immunology of the P60-protein and in vitro-transcription of PrfA-dependent and -independent genes of Listeria monocytogenes
N2  - Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).
N2  - Listeria monocytogenes, a Gram positive, optionally intracellular bacterium is capable of causing heavy infections of the central nervous system in immunocompromised humans. Due to its ubiquitous occurrence, as well as its high resistance to preservation methods there is a great interest in its rapid identification and differentiation towards the apathogenen species of Listeria. Due to the preserved and variable domains P60 as an essential housekeeping gene represents a promising target in order to establish ge-nus- and species-specific detection systems. An immunogenic map of the P60 of L. innocua and L. monocytogenes was generated by EPITOP-SPOT-mapping. Furthermore CD4-T-cells specific for P60 were hereby characterized and for one of them the epitope was exactly determined. Transfer experiments with these T-cells and booster infections with L. monocytogenes and/or L. innocua showed that L. innocua alone is not capable of establishing an immune protection against L. monocytogenes, while in vitro and in vivo it was sufficient to maintain an existing immunity through stimulating memory T-cells by cross-reactive epitopes. In vitro-transcription from Phly, PplcA and PactA occurs strictly PrfA-dependent while that of Piap, PprfA1/2 and, unexpectedly, also from Pmpl is PrfA-independent. It requires – except with PprfA - high concentrations of ATP but not GTP. In order to ensure an efficient tran-scription, the first three initiating nucleotides have to be available in higher concentration. RNAP separated over a heparin column after preparation from L. monocytogenes either exposed to heat shock treatment at 48°C (RNAP48), shifted to MEM (RNAPMEM), or cultured directly in BHI (RNAPBHI) showed different activity profiles with the promoters mentioned above. Therefore actA and hly may require an alternative sigma factor (not Sigma-43) for their optimal transcription.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Immunreaktion
KW  - Molekularbiologie
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - innocua
KW  - P60
KW  - PrfA
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - innocua
KW  - P60
KW  - PrfA
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8760
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pilgrim, Sabine
T1  - Entwicklung eines "DNA-Delivery"-Systems auf der Basis von Virulenz-attenuierten Listerien
T1  - Development of a DNA delivery system using virulence-attenuated Listeria strains
N2  - Virulenz-attenuierte Bakterien sind geeignete Vektoren für den Transport von Vakzine-DNA in das Zytosol von Antigen-präsentierenden Zellen ("DNA delivery"). In dieser Arbeit wurde dazu das intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes verwendet, welches sich im Zytosol von Zellen vermehrt und fortbewegt. Ausgestattet mit einer intrazellulären Lysis-Kassette kann Listeria in vitro effektiv Plasmid-DNA in das Zytosol verschiedener Zelltypen freisetzen. Zur Virulenz-Attenuierung wurde das Gen iap im Chromosom des Bakteriums deletiert. Der daraus resultierte Stamm, in Folgenden als iap bezeichnet, erwies sich als hoch attenuiert im Modell der murinen Listeriose. Diese Attenuation konnte auf einen Defekt in der Beweglichkeit der Bakterien innerhalb von Wirtszellen zurückgeführt werden, da sich bei diesem Stamm das Protein ActA, das essentiell für die Aktin-basierte Motilität von L. monocytogenes ist, fehlerhaft auf der Oberfläche der Bakterien anordnet. Zusätzlich konnte demonstriert werden, dass iap in der Zellteilung beeinträchtigt ist und deshalb eine veränderte Morphologie aufweist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein so genanntes "Balanced-lethal" System etabliert. Dazu wurde das essentielle Gens trpS im Chromosom deletiert, während gleichzeitig eine trpS-Expressions-Kassette auf einem Vakzine-Plasmid inseriert wurde. Dieses System gewährleistet, dass das Trägerbakterium dieses Plasmid weder in vitro noch in vivo verliert. Dies ist besonders wichtig im Hinblick auf eine bakteriolytische Lysis-Kassette, welche ebenfalls auf diesem Plasmid kodiert ist. Es wurden verschiedene Lysis-Kassetten, die alle aus einem Listeria-spezifischen Phagenlysin und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor zusammengesetzt waren, miteinander verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass die für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen wirksamste Phagenlysin-Kassette (PactA-ply118) die Bakterien in vitro nur partial abtötet, während sie in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führt. Unter Verwendung dieses "DNA delivery" Systems wurden Mäuse oral mit Listerien infiziert, die ein DNA-Vakzine-Plasmid zur Expression des Leishmania Antigens KMP-11 trugen. Dabei konnte bei 27 % aller Tiere, die zweimal mit diesen Listerien infiziert worden sind, eine KMP-11 spezifische, proliferative Immunantwort gemessen werden. Listerien, die einen Defekt in ihrer Motilität besitzen (delta-iap, delta-actA), erwiesen sich darin beeinträchtigt, Plasmid-DNA im Zytosol von Zellen freizusetzen. Anhand dieser Stämme konnte gezeigt werden, dass die Fähigkeit von L. monocytogenes, sich innerhalb von Zellen zu bewegen und in benachbarte Zellen einzudringen eine wichtige Voraussetzung für einen effizienten Transfer von Plasmid-DNA in vitro darstellt.
N2  - Virulence-attenuated bacteria are useful carriers to introduce a DNA vaccine into antigen presenting cells (DNA delivery). To this end, the intracellular bacterium Listeria monocytogenes was used in this work, which is able to replicate and spread inside host cells. Hence Listeriae are able to efficiently release plasmid DNA within the cytosol in vitro when they are provided with a cytosolic lysis cassette. The expression of the antigen by the cell leads to the presentation of antigenic epitopes on the cell's major histocompatibilty complex (MHC) class I molecules, due to the antigen being endogenous. This stimulates the activation of CD8+ T cells which are important for clearance of tumours, parasites and virus infected cells. In order to create a virulence-attenuated carrier strain the gene iap was deleted in the chromosome of the bacterium. The resulting strain, designated as iap, was shown to be highly attenuated in mice. This was due to a defect of the intracellular motility since ActA, a protein which is necessary for actin-based motility of Listeria, was localised incorrectly at the bacterial surface. Additionally, it was demonstrated that iap is impaired in cell division which leads to an altered cell morphology. In this work a so-called balanced-lethal plasmid system was established. The essential gene trpS was deleted from the chromosome of L. monocytogenes and a trpS transcription unit was inserted in a vaccine DNA plasmid thus ensuring that no plasmid loss happens in vitro and also within the host organism. This is in particular important in terms of a bacteriolytic lysis cassette which is also encoded by the plasmid. Different lysis cassettes were tested consisting of a Listeria-specific phage lysin and an intracellular promoter of Listeria. The cassette PactA-ply118 was found the be most effective due to its DNA delivery capacity but it mediates only a partial lysis of the intracellular bacteria. However, this cassette leads to a high attenuation of Listeria in mice. Using this DNA delivery system mice were orally infected with Listeria harbouring a KMP-11 expression plasmid. 27 % of animals infected twice exhibited a specific proliferative response to the leismanial antigen KMP-11. Listeriae with a defect in their spreading capacity (delta-iap, delta-actA) were impaired in the cytosolic release of plasmid DNA. With these strains it was demonstrated, that spreading is an important prerequisite for L. monocytogenes to be an efficient DNA delivery carrier in vitro.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Gentransfer
KW  - Listeria
KW  - Gentransfer
KW  - Vakzinierung
KW  - p60
KW  - "Balanced-lethal" Plasmid-System
KW  - Listeria
KW  - DNA delivery
KW  - vaccine
KW  - p60
KW  - balanced-lethal plasmid system
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4754
ER  - 
TY  - THES
A1  - Raffelsbauer, Diana
T1  - Identification and characterization of the inlGHE gene cluster of Listeria monocytogenes
T1  - Identifizierung und Charakterisierung des inlGHE-Genclusters von Listeria monocytogenes
N2  - In the present study, a new gene cluster of Listeria monocytogenes EGD containing three internalin genes was identified and characterized. These genes, termed inlG, inlH and inlE, encode proteins of 490, 548 and 499 amino acids, respectively, which belong to the class of large, surface-bound internalins. Each of these proteins contains a signal peptide, two regions of repeats (Leucine-rich repeats and B repeats), an inter-repeat region and a putative cell wall anchor sequence containing the sorting motiv LPXTG. PCR analysis revealed the presence of the inlGHE gene cluster in most L. monocytogenes serotypes. A similar gene cluster termed inlC2DE localised to the same position on the chromosome was described in a different L. monocytogenes EGD isolate. Sequence comparison of the two clusters indicates that inlG is a new internalin gene, while inlH was generated by a site-specific recombination leading to an in-frame deletion which removed the 3'-terminal end of inlC2 and a 5'-portion of inlD. The genes inlG, inlH and inlE seem to be transcribed extracellularly and independent of PrfA. To study the function of the inlGHE gene cluster several in-frame deletion mutants were constructed which lack the genes of the inlGHE cluster individually or in combination with other inl genes. When tested in the mouse model, the inlGHE mutant showed a significant reduction of bacterial counts in liver and spleen in comparison to the wild type strain, indicating that the inlGHE gene cluster plays an important role in virulence of L. monocytogenes. The ability of this mutant to invade non-phagocytic cells in vitro was however two- to three-fold higher than that of the parental strain. To examine whether deletion of the single genes from the cluster has the same stimulatory effect on invasiveness as deletion of the complete gene cluster, the single in-frame deletion mutants inlG, inlH and inlE were constructed. These mutants were subsequently reverted to the wild type by introducing a copy of the corresponding intact gene into the chromosome by homologous recombination using knock-in plasmids. To determine a putative contribution of InlG, InlH and InlE in combination with other internalins to the entry of L. monocytogenes into mammalian cells, the combination mutants inlA/GHE, inlB/GHE, inlC/GHE, inlA/B/GHE, inlB/C/GHE, inlA/C and inlA/C/GHE were constructed. Transcription of the genes inlA, inlB and inlC in these mutants was studied by RT-PCR. Deletion of inlGHE enhances transcription of inlA and inlB, but not of inlC. This enhancement is not transient but can be observed at different time-points of the bacterial growth curve. Deletion of inlA also increases transcription of inlB and vice-versa. In contrast, the amounts of inlA and inlB transcripts in the single deletion mutants inlG, inlH and inlE were similar to those from the wild type.
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues Gencluster von Listeria monocytogenes EGD mit drei Internalingenen identifiziert und charakterisiert. Diese als inlG, inlH und inlE bezeichneten Gene codieren für Proteine mit 490, 548 bzw. 499 Aminosäuren, die zur Klasse der großen, oberflächengebundenen Internaline gehören. Jedes dieser Proteine enthält ein Signalpeptid, zwei Repeat-Regionen (Leucin-reiche Repeats und B-Repeats), eine Inter-Repeat-Region, und eine mögliche Zellwandankersequenz mit dem Motiv LPXTG. PCR-Analyse zeigte das Vorkommen des inlGHE-Genclusters in den meisten L. monocytogenes-Serotypen. Ein ähnliches, als inlC2DE bezeichnetes Gencluster wurde in der gleichen Position auf dem Chromosom eines anderen L. monocytogenes EGD Isolats beschrieben. Ein Sequenzvergleich beider Clusters zeigte, dass inlG ein neues Internalingen ist, während inlH durch eine in-frame-Deletion vom 3'-Ende von inlC2 und einem 5'-Teil von inlD entstanden ist. Die Gene inlG, inlH und inlE werden vorwiegend extrazellulär und PrfA-unabhängig transkribiert. Um die Funktion des inlGHE-Genclusters zu untersuchen, wurden verschiedene in-frame-Deletionsmutanten hergestellt, aus denen die Gene des inlGHE-Clusters entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Internalingenen deletiert wurden. Im Maumodell zeigte eine inlGHE-Mutante nach oraler Infektion eine signifikante Reduktion der Bakterienzahl in der Leber und Milz, die auf eine wichtige Rolle des inlGHE-Genclusters in der Virulenz von L. monocytogenes hindeutet. Die Fähigkeit dieser Mutante, in nicht-phagocytische Zellen in vitro einzudringen, ist zwei bis dreifach höher als die des Wildtyp-Stammes. Um zu untersuchen, ob die Deletion von Einzelgenen des inlGHE-Genclusters einen ähnlichen stimulatorischen Effekt auf die Invasivität ausübt wie die Deletion des kompletten Genclusters, wurden die Einzeldeletionsmutanten inlG, inlH and inlE hergestellt. Diese Mutanten wurden anschließend zum Wildtyp revertiert, indem eine Kopie des entsprechenden intakten Gens durch homologe Rekombination ins Chromosom mit Hilfe von Knock-in-Plasmiden eingeführt wurde. Um eine mögliche Rolle von InlG, InlH und InlE in Verbindung mit anderen Internalinen bei der Aufnahme von L. monocytogenes in Säugerzellen zu untersuchen, wurden die Mutanten inlA/GHE, inlB/GHE, inlC/GHE, inlA/B/GHE, inlB/C/GHE, inlA/C and inlA/C/GHE hergestellt. Die Transkription der Gene inlA, inlB and inlC in diesen Mutanten wurde durch RT-PCR untersucht. Deletion von inlGHE erhöht die Transkription von inlA und inlB, aber nicht die von inlC. Diese Erhöhung ist nicht vorübergehend sondern kann zu verschiedenen Zeitpunkten der Wachstumskurve beobachtet werden. Deletion von inlA verstärkt ebenfalls die Transcription von inlB und umgekehrt. Im Gegensatz dazu waren die Mengen an inlA- und inlB-Transkripten in den Einzeldeletionsmutanten inlG, inlH and inlE ähnlich wie die des Wildtyps.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Molekulargenetik
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Virulenz
KW  - Internalin
KW  - inlGHE
KW  - Invasion
KW  - Leucin-reiche repeat protein
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - virulence
KW  - internalin
KW  - inlGHE
KW  - invasion
KW  - leucine-rich repeat protein
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180595
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pfeuffer, Thilo
T1  - Interaktion des Proteins ActA von Listeria monocytogenes mit dem Wirtszellprotein LaXp180
T1  - Interaction of Listeria monocytogenes ActA with the host cell protein LaXp180
N2  - Listeria monocytogenes, ein fakultativ intrazellulärer Krankheitserreger, besitzt die Fähigkeit, Wirtszellen zu penetrieren, sich in ihnen zu vermehren, sich intrazellulär zu bewegen und auch benachbarte Zellen direkt zu infizieren. Die intrazelluläre Fortbewegung erfolgt durch Polymerisation von zellulärem Aktin, wodurch charakteristische Aktinschweife an einem Pol der Bakterien entstehen. Der einzige bakterielle Faktor, der für die Aktinpolymerisation notwendig ist, ist das Oberflächenprotein ActA. ActA allein ist aber nicht in der Lage, Aktin zu polymerisieren, sondern kann dies nur in Assoziation mit Proteinen der Wirtszelle. Die einzigen bisher bekannten Wirtszellproteine, die direkt mit ActA interagieren, sind das Phosphoprotein VASP und der Arp2/3-Komplex. VASP bindet an den zentralen prolinreichen Bereich von ActA und beschleunigt durch die Rekrutierung von Profilin den Prozeß der Aktinpolymerisation. Der Arp2/3-Komplex interagiert mit dem N-terminalen Bereich von ActA und initiiert die eigentliche Aktin-Polymerisation. Um weitere eukaryotische, mit ActA interagierende Proteine (AIPs) zu isolieren, wurde über einen "Yeast Two-Hybrid"-Test mit ActA als Köder eine embryonale Maus-cDNA-Genbank getestet. Dabei wurden drei verschiedene AIPs identifiziert, von denen eines identisch mit dem humanen Protein LaXp180 (auch "CC1" genannt) ist. LaXp180 ist ein 180 kDa Protein mit über 50 theoretischen Phosphorylierungsstellen in der N-terminalen Hälfte, während die C-terminale Hälfte "coiled-coil"-Strukturen ausbilden kann. Darüberhinaus enthält LaXp180 eine Kern-Lokalisations-Sequenz und ein Leucin-Zipper-Motiv. Die Bindung von LaXp180 an ActA wurde in vitro unter Verwendung von rekombinantem His6-Tag-LaXp180 und rekombinantem ActA bestätigt, da rekombinantes ActA nur an einer Ni-Agarose-Säule gebunden wurde, wenn diese vorher mit His6-Tag-LaXp180 beladen war. Über RT-PCR konnte zum ersten Mal die Expression LaXp180-spezifischer mRNA in verschiedenen Säugerzellen nachgewiesen und mit einem polyklonalen anti-LaXp180-Serum durch Immunopräzipitation erstmals ein 194 kDa großes Protein in Säugerzellextrakten detektiert werden. Die intrazelluläre Lokalisation von LaXp180 wurde über Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Immunfluoreszenzfärbungen von Fibroblasten mit dem anti-LaXp180-Serum zeigten eine starke Färbung der Zellkerne und definierter Bereiche direkt neben den Kernen, während das restliche Zytoplasma schwach gefärbt war. Über Immunfluoreszenzmikroskopie mit dem anti-LaXp180-Serum an mit L. monocytogenes infizierten Zellen konnte gezeigt werden, daß LaXp180 mit der Oberfläche vieler, aber nicht aller intrazellulärer, ActA-exprimierender Listerien kolokalisiert. Dagegen wurde nie eine Kolokalisation mit intrazellulären, aber ActA-defizienten Mutanten beobachtet. Darüberhinaus ist LaXp180 asymmetrisch auf der Bakterienoberfläche verteilt und schließt sich gegenseitig mit der F-Aktin-Polymerisation aus. LaXp180 ist ein putativer Bindungspartner von Stathmin, einem 19 kDa Phosphoprotein, das die Mikrotubuli-Dynamik reguliert. Über Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, daß auch Stathmin mit intrazellulären, ActA-exprimierenden L. monocytogenes kolokalisiert.
N2  - Listeria monocytogenes, a facultative intracellular pathogen, is able to penetrate and to multiply in host cells, to move intracellularly and to infect neighbouring cells directly. Intracellular movement is caused by the polymerisation of host cell actin leading to the generation of characteristic actin tails at one pole of the bacterium. The only bacterial factor necessary for actin polymerisation is the surface protein ActA. However, ActA itself is unable to polymerize actin, and can only do so in association with host cell proteins. So far the only known host cell proteins directly interacting with ActA are the phosphoprotein VASP and the Arp2/3 complex. VASP binds to the central proline-rich repeat region of ActA and accelerates actin polymerisation by the recruitment of profilin. The Arp2/3 complex interacts with the N-terminal domain of ActA and initiates the actin polymerisation process. To identify additional eukaryotic ActA-interacting proteins (AIPs), an embryonic mouse cDNA library was screened in a yeast two-hybrid approach using ActA as bait. Three different AIPs were isolated, one of which was identical to the human protein LaXp180 (also called "CC1"). LaXp180 is a 180 kDa protein with more than 50 theoretical phosphorylation sites in the N-terminal part. The C-terminal part is able to form coiled-coil structures. Furthermore, LaXp180 contains a nuclear localisation sequence and a leucine-zipper motif. Binding of LaXp180 to ActA was demonstrated in vitro using recombinant histidine-tagged LaXp180 and recombinant ActA. Recombinant ActA was retained on a Ni-agarose column after prior loading of the column with histidine-tagged LaXp180. Using RT-PCR, the expression of LaXp180 specific mRNA in different mammalian cells was demonstrated for the first time. A protein with a molecular weight of 194 kDa was detected in cell extracts by immunoprecipitation with a polyclonal anti-LaXp180 antiserum. The intracellular localisation of LaXp180 was analysed by immunofluorescence microscopy. Immunofluorescence staining of fibroblasts with the anti-LaXp180 serum showed a strong staining of the nuclei and of defined regions next to the nuclei as well as a weak staining of the rest of the cytoplasm. Fluorescence microscopy with the anti-LaXp180 antiserum of cells infected with L. monocytogenes revealed colocalisation of LaXp180 with the bacterial surface of a subset of intracellular, ActA-expressing listeriae. In contrast, colocalisation with intracellularly growing but ActA-deficient mutants was never observed. Furthermore, LaXp180 binding to intracellular L. monocytogenes was asymmetrical and mutually exclusive with F-actin polymerisation on the bacterial surface. LaXp180 is a putative binding partner of stathmin, a 19 kDa phosphoprotein regulating microtubule dynamics. Using immunofluorescence, colocalisation of stathmin with intracellular, ActA-expressing L. monocytogenes was also demonstrated.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Virulenz
KW  - Actin
KW  - Wirtszelle
KW  - Molekularbiologie
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - ActA
KW  - LaXp180
KW  - Stathmin
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - ActA
KW  - LaXp180
KW  - Stathmin
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1859
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ng, Eva Yee Wah
T1  - How did Listeria monocytogenes become pathogenic?
T1  - Wie wurde Listeria monocytogenes pathogen ?
N2  - Listeriae are Gram positive, facultative, saprophytic bacteria capable of causing opportunistic infections in humans and animals. This thesis presents three separate lines of inquiries that can lead to the eventual convergence of a global view of Listeria as pathogen in the light of evolution, genomics, and function. First, we undertook to resolve the phylogeny of the genus Listeria with the goal of ascertaining insights into the evolution of pathogenic capability of its members. The phylogeny of Listeriae had not yet been clearly resolved due to a scarcity of phylogenetically informative characters within the 16S and 23S rRNA molecules. The genus Listeria contains six species: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, and L. grayi; of these, L. monocytogenes and L. ivanovii are pathogenic. Pathogenicity is enabled by a 10-15Kb virulence gene cluster found in L. seeligeri, L. monocytogenes and L. ivanovii. The genetic contents of the virulence gene cluster loci, as well as some virulence-associated internalin loci were compared among the six species. Phylogenetic analysis based on a data set of nucleic acid sequences from prs, ldh, vclA, vclB, iap, 16S and 23S rRNA genes identified L. grayi as the ancestral branch of the genus. This is consistent with previous 16S and 23S rRNA findings. The remainder 5 species formed two groupings. One lineage represents L. monocytogenes and L. innocua, while the other contains L. welshimeri, L. ivanovii and L. seeligeri, with L. welshimeri forming the deepest branch within this group. Deletion breakpoints of the virulence gene cluster within L. innocua and L. welshimeri support the proposed tree. This implies that the virulence gene cluster was present in the common ancestor of L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri and L. welshimeri; and that pathogenic capability has been lost in two separate events represented by L. innocua and L. welshimeri. Second, we attempted to reconstitute L. innocua of its deleted virulence gene cluster, in its original chromosomal location, from the L. monocytogenes 12 Kb virulence gene cluster. This turned out particularly difficult because of the limits of genetic tools presently available for the organism. The reconstitution was partially successful. The methods and approaches are presented, and all the components necessary to complete the constructs are at hand for both L. innocua and the parallel, positive control of L. monocytogenes mutant deleted of its virulence gene cluster. Third, the sequencing of the entire genome of L. monocytogenes EGDe was undertaken as part of an EU Consortium. Our lab was responsible for 10 per cent of the labor intensive gap-closure and annotation efforts, which I helped coordinate. General information and comparisons with sister species L. innocua and a close Gram positive relative Bacillus subtilis are presented in context. The areas I personally investigated, namely, sigma factors and stationary phase functions, are also presented. L. monocytogenes and L. innocua both possess surprisingly few sigma factors: SigA, SigB, SigH, SigL, and an extra-cytoplasmic function type sigma factor (SigECF). The stationary phase genes of L. monocytogenes is compared to the well-studied, complex, stationary phase networks of B. subtilis. This showed that while genetic competence functions may be operative in unknown circumstances, non-sporulating Listeria opted for very different approaches of regulation from B. subtilis. There is virtually no overlap of known, stationary phase genes between Listeria and Gram negative model organism E. coli.
N2  - Listerien sind Gram-positive, fakultativ intrazelluläre, saprophytische Bakterien, die in der Lage sind, bei Mensch und Tier opportunistische Infektionen hervorzurufen. Die vorliegende Arbeit veranschaulicht drei unterschiedliche Versuchsansätze, die schließlich hinsichtlich Evolution, Genom- und Funktionsanalysen zur Konvergenz der globalen Sichtweise von Listeria als pathogener Mikroorganismus führen können. Zunächst wurden phylogenetische Analysen durchgeführt, die einen Einblick in die Evolution des pathogenen Potentials von Mitgliedern der Gattung Listeria geben sollten. Aufgrund mangelnder phylogenetischer Informationen bezüglich der 16S und 23S rRNAs war eine genaue phylogenetische Entschlüsselung der Gattung Listeria jedoch nicht möglich. Die Gattung Listeria umfaßt sechs verschiedene Spezies: L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri und L. grayi, wobei L. monocytogenes und L. ivanovii zu den pathogenen Bakterien zählen. Die Pathogenität wird hierbei durch ein 10-15 kb großes Virulenzgencluster determiniert, das in L. monocytogenes, L. ivanovii sowie in L. seeligeri vorzufinden ist und neben einigen Virulenz-assoziierten Internalin-Genen zum genetischen Vergleich der sechs verschiedenen Spezies herangezogen wurde. Die im Rahmen der phylogenetischen Analysen untersuchten Nukleinsäuresequenzen der Gene prs, ldh, vclA, vclB, iap sowie die der 16S und 23S rRNA-Gene deuteten darauf hin, daß L. grayi dem gemeinsamen Vorläufer der Gattung Listeria am nächsten steht, was mit den bisher verfügbaren 16S und 23S rRNA-Daten übereinstimmt. Die verbleibenden fünf Spezies bilden zwei Gruppen, die sich zum einen aus L. monocytogenes und L. innocua und zum anderen aus L. welshimeri, L. ivanovii und L. seeligeri zusammensetzen. Die Positionen der im Virulenzgencluster von L. innocua und L. welshimeri identifizierten Deletionen bestätigen den hier vorgeschlagenen Stammbaum, was darauf hindeutet, daß im gemeinsamen Vorfahren von L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri und L. welshimeri das Virulenzgencluster vorhanden war und daß das pathogene Potential in L. innocua bzw. in L. welshimeri durch zwei unabhängige Ereignisse verloren ging. Weiterhin wurde versucht, das 12 kb-Virulenzgencluster von L. monocytogenes in der ursprünglichen Lokalisation in das Chromosom der Spezies L. innocua, die eine Deletion des Virulenzgenclusters aufweist, zu integrieren. Dieser Ansatz erwies sich aufgrund der derzeit limitierten Methodik zur genetischen Manipultation dieses Organismus als sehr problematisch und führte bisher nur teilweise zum Erfolg. Die angewandten Strategien zur Klonierung der erforderlichen Konstrukte, die zur Erstellung der beschriebenen L. innocua-Mutante und einer L. monocytogenes-Mutante mit Deletion des Virulenzgenclusters erforderlich sind, werden vorgestellt. Der dritte Schwerpunkt der Arbeit befaßte sich mit der vollständigen Sequenzierung des Genoms von L. monocytogenes EGDe, die im Rahmen eines EU-Konsortiums durchgeführt wurde. Unser Labor war zu 10 Prozent an der Lückenschließung zwischen den Sequenz-Contigs sowie an der Annotierung beteiligt, für deren Koordinierung ich verantwortlich war. Vergleiche der Genomsequenzen von L. monocytogenes, L. innocua und dem verwandten Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis werden vorgestellt, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Genen für Sigma-Faktoren und Stationärphase-Funktionen liegt. Sowohl L. monocytogenes und L. innocua enthalten mit SigA, SigB, SigH und einem extrazytoplasmatischen Sigma-Faktor, SigECF, überraschend wenige Sigma-Faktoren. Die Stationärphase-Gene von L. monocytogenes werden mit dem gut untersuchten, sehr komplexen Stationärphase-System von B. subtilis verglichen. Dies zeigte, daß, obwohl genetische Kompetenz unter nicht bekannten Umständen eine Rolle spielen könnten, in Listeria völlig unterschiedliche Mechanismen der Genregulation wirksam sind. Es ist keinerlei Überlappung mit den bekannten Stationärphase-Genen des Gram-negativen Modellorganismus Escherichia coli festzustellen.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Virulenz
KW  - Evolution
KW  - Molekulargenetik
KW  - Pathogenität
KW  - Phylogenic
KW  - Genom
KW  - Listeria
KW  - Evolution von Pathogenen
KW  - Evolution von Virulenz
KW  - Phylogenie von Listeria
KW  - bakterielle Pathogenese
KW  - listeria
KW  - evolution of pathogens
KW  - evolution of virulence
KW  - phylogeny of listeria
KW  - bacterial pathogenesis
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1752
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kolb-Mäurer, Annette
T1  - Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Listeria monocytogenes
T1  - Interaction of human dendritic cells with Listeria monocytogenes
N2  - Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger.
N2  - Dendritic cells (DC) activate naive CD4+ and CD8+ lymphocytes and are therefore critical for the initiation of an immune response against microorganisms. In this work the interaction between DC and L. monocytogenes was examined. Immature DC show a very efficient uptake of L. monocytogenes. Phagocytosis was much higher in the presence of human plasma than with plasma free media or media with fetal calf serum (FCS). However, the addition of immunoglobulins showed a concentration dependent increase in phagocytosis comparable with the addition of human plasma. Human plama contains antibodies against the listerial surface protein p60. By using a iap-deletion mutant it was shown that antibodies against p60 are the main opsonin for the uptake of L. monocytogenes into DC. Because no difference in the uptake of this deletion mutant in the presence or absence of human plasma was observed; antibodies against p60 appear to be resonsible for the efficient uptake of L. monocytogenes and other apathogenic Listeria strains. A major portion of internalized bacteria is found in membrane-bound phagosomes and rarely free in the cytosol. Most of the bacteria that were taken up by DC were killed very efficiently in the phagosome. Interestingly, infection with L. monocytogenes caused maturation of the immature DC into mature DC. This effect appeared to be largely mediated by listerial lipoteichoic acid. Although L. monocytogenes infection is known to induce death in other cell types, DC were relatively resistant and only 20 per cent of infected DC underwent cell death. Uptake, maturation and resistance to apoptosis suggest that DC are essentiel antigen presenting cell (APC) for L. monocytogenes immunity. Thus these observations into the interaction of L. monocytogenes with human DC provide an important into the pathogenesis of Listeria infection as well as providing a basis for Listeria-based vaccination strategies.
KW  - Mensch
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Listeria monocytogenens
KW  - Apoptose
KW  - dendritic cell
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - apoptosis
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1638
ER  - 
TY  - THES
A1  - Greiffenberg, Lars
T1  - Interaktion von Listeria monocytogenes mit Endothelzellen
T1  - Interaction of Listeria monocytogenes with endothelial cells
N2  - Listeria monocytogenes überwindet endotheliale Barrieren, um eine Meningitis oder Encephalitis auszulösen. Das Hindurchtreten durch diese Barriere könnte über die Invasion von Endothelzellen durch Listerien aus dem Blut und anschließender Freisetzung der Bakterien ins Gehirn erfolgen. In den ersten Infektionsmodellen, in denen gezeigt wurde, daß Listerien in der Lage sind Endothelzellen zu invadieren, wurden humane, makrovaskuläre Nabelschnurendothelzellen (HUVEC) verwendet. Die für die Ausbildung der Blut-Hirn-Schranke verantwortlichen mikrovaskulären Hirnendothelzellen (BMEC) unterscheiden sich aber deutlich von den makrovaskulären HUVEC. In der vorliegenden Arbeit wurde die Interaktion von L. monocytogenes mit HUVEC und mit humanen BMEC (HBMEC) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß L. monocytogenes HBMEC effizient invadieren kann. Nach der Aufnahme und dem Entkommen der Bakterien aus dem Phagosom bilden sie Aktinschweife aus, mit deren Hilfe sie sich im Zytoplasma frei bewegen können. Listerien sind in der Lage, sich in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden zu vermehren und über eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle in benachbarte Zellen zu gelangen. Mit einem Listerien-Stamm, der das grün-fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert, konnte der Infektionsverlauf in HBMEC über einen Zeitraum von 20 Stunden in Echtzeit verfolgt werden. Hierbei zeigte sich, daß auch stark infizierte HBMEC sich nicht vom Untergrund ablösen oder lysieren und somit gegenüber intrazellulären Listerien sehr widerstandsfähig sind. Wie rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HBMEC-Monolayern nach einer Infektion mit L. monocytogenes erkennen ließen, adhärieren Listerien an HBMEC, indem sie einen engen Kontakt mit Mikrovilli auf HBMEC eingehen. Mit Listerien infizierte HBMEC bilden wenige Stunden nach der Infektion Membranausstülpungen aus, in denen sich Listerien befinden. Diese Ausstülpungen sind mit der Zelle nur noch über sehr dünne Membranschläuche verbunden. Um herauszufinden, welche Listerienproteine an der Aufnahme von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC beteiligt sind, wurden verschiedene Deletionsmutanten auf ihre Invasivität in HUVEC und HBMEC getestet. In Gegenwart von 20 Prozent Humanserum wurden HUVEC in einer von den Oberflächenproteinen InlA, InlB und ActA unabhängigen Weise von L. monocytogenes invadiert. Wurde das Gen, welches für den positiven Regulationsfaktor PrfA kodiert, deletiert, reduzierte dies die Invasionsrate beträchtlich. Listerienstämme mit einer Deletion im für InlB kodierenden Gen sind unfähig, HBMEC zu invadieren. Neben InlG und ActA spielt auch PrfA eine entscheidende Rolle bei der Invasion von L. monocytogenes in HBMEC. Die Adhäsion von L. monocytogenes an HBMEC ist von InlB unabhängig. Auch die apathogene und nicht-invasive Art L. innocua bindet an HBMEC. Humanserum hemmt die Invasion von L. monocytogenes in HBMEC, nicht aber in HUVEC. Während sich die Invasionsraten von L. monocytogenes in HUVEC durch Zentrifugation bei der Infektion erhöhen ließen, hatte die Zentrifugation keine Auswirkung auf die Invasivität von L. monocytogenes in HBMEC. Neben diesen konnten in dieser Arbeit noch weitere Infektionsparameter gefunden werden, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von L. monocytogenes in HUVEC und HBMEC haben. Im Zellüberstand von HUVEC konnten bis zu 6 Stunden nach einer Infektion mit L. monocytogenes große Mengen an IL-8 nachgewiesen werden. Während eine Infektion von HUVEC mit L. monocytogenes die Expression von IL-6-spezifischer mRNA schwach induzierte, war keine vermehrte Expression von MCP-1- und VCAM-1-spezifischer mRNA feststellbar. Indem Caco-2-Zellen und HBMEC auf gegenüberliegenden Seiten eines Filters bis zur Konfluenz kultiviert wurden, konnte ein in-vitro-Modell des choroid plexus etabliert werden. Wenige Stunden nach der Infektion von HBMEC mit L. monocytogenes befanden sich auch in den Caco-2-Zellen Listerien. Wie elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden konnte, waren diese Listerien durch die Filterporen in die Epithelzellen gelangt. Der Mechanismus, dem diese Ausbreitung zugrunde liegt, ist noch unbekannt.
N2  - Listeria monocytogenes cross endothelial barriers to cause meningitis or encephalitis. Passage through the barrier may be achieved by invasion of endothelial cells by Listeria from the blood stream followed by release of the bacteria into the brain. Internalization of L. monocytogenes by endothelial cells has been previously demonstrated using macrovascular human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model system. However, brain microvascular endothelial cells (BMEC) which form the blood brain barrier, are strikingly different from the macrovascular HUVEC. Therefore, in this investigation, the interaction of L. monocytogenes with HUVEC and human BMEC (HBMEC) was studied. It was found that L. monocytogenes efficiently invades HBMEC. After invasion and escape from the phagosome the bacteria induce the formation of actin tails which allows them to move intracellularly. Once within the HBMEC, L. monocytogenes are able to multiply over a period of at least 20 hours and enter neighbouring cells by cell-to-cell spread. Using a green fluorescent protein-expressing L. monocytogenes strain, this process of infection was followed in real time. It was shown that heavily infected HBMEC do not detach from the tissue culture dish and do not lyse, indicating that they are highly resistant to intracellular L. monocytogenes. Scanning electron microscopy studies of infected HBMEC-monolayers showed adherent Listeria in close contact with surface microvilli. Listeria-infected HBMEC shows bacteria-containing membrane protrusions within a few hours after infection. These protrusions are connected with the cell suface via thin stalk-shaped membrane connections. To determine which listerial proteins are responsible for the uptake of L. monocytogenes in HUVEC and HBMEC, different deletion mutants of L. monocytogenes were tested with respect to their effect on the efficiency of invasion. It was found that L. monocytogenes invades HUVEC in the presence of 20 per cent human serum independently of InlA, InlB, and ActA. However, deletion of the gene encoding the positive virulence regulatory factor PrfA results in a strong inhibition of invasion. Listeria-strains with a deletion in the InlB encoding gene are unable to invade HBMEC. Moreover, InlG, ActA, and also PrfA play important roles in invasion of HBMEC by L. monocytogenes. Adherence of L monocytogenes to HBMEC is independent of InlB. Even the nonpathogenic and noninvasive species L. innocua adheres to HBMEC. Human serum was shown to inhibit the uptake of L. monocytogenes by HBMEC but not by HUVEC. Centrifugation of Listeria onto the cells enhanced the invasion of HUVEC, but had no effect on invasion of HBMEC. In addition to these differences, other parameters were identified which have different effects on the invasiveness of L. monocytogenes for HUVEC and HBMEC. High amounts of IL-8 could be detected in the supernatants of Listeria-infected HUVEC within 6 hours. Additionally, a weak induction of IL-6 specific mRNA could be detected during infection of HUVEC, but mRNA-expression specific for MCP-1 and VCAM-1 was not altered. Using HBMEC and Caco-2 cells, an in-vitro-model of the choroid plexus was developed by growing each cell type on either side of porous membrane filters. A few hours after infection of HBMEC with L. monocytogenes, bacteria were found in the underlying Caco-2 cells. In transmission electron microscopic studies it could be shown that Listeria reached the epithelial cells via the filter pores. The mechanism for this spreading is so far unknown.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Virulenz
KW  - Blut-Hirn-Schranke
KW  - Molekularbiologie
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - humane mikrovaskuläre Hirnendothelzellen
KW  - Blut-Hirn-Schranke
KW  - HUVEC
KW  - HBMEC
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - human brain microvascular endothelial cells
KW  - blood-brain-barrier
KW  - HUVEC
KW  - HBMEC
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1340
ER  -