TY  - THES
A1  - Schäfer, Rolf
T1  - Aktivierung von Caspasen in AKR-2B Mausfibroblasten
T1  - Activation of caspases in AKR-2B mouse fibroblasts
N2  - In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivitäten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. Während des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die überlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand für mindestens weitere 48h unbeeinflußt, benötigen aber zum Überleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt für eine Apoptose typische morphologische Veränderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller für den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivität bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivitäten lieferte Hinweise zur Identität der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivität wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivitäten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivität wird zum größten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinitätsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine während des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivität bietet die beste Grundlage für eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt für den mitochondrial-vermittelten Weg, für dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase führt, ist Ziel gegenwärtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, schützen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identität dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es möglicherweise dieser Weg, der zum Überleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten während des Serumentzugs wesentlich beiträgt.
N2  - In the work presented here, the essential involvement of caspases in the cell death of AKR 2B-fibroblasts could be proved as well as their activities could be characterized. Confluent AKR 2B-fibroblasts, a good characterized and subcloned cell line, rapidly disintegrate after serum deprivation. Dying of the cells ceases after 6 hours with a survival of 50 per cent. These surviving cells remain uneffected for additional 48 hours which is dependent on neo-protein biosynthesis. During cell death AKR 2B-fibroblasts show morphological changes characteristically for apoptosis, even though typical features like oligonucleosomal DNA fragmentation is absent. Using different approaches the expression of mRNA of all known caspases, which are believed to be involved in apoptosis essentially, was successfully detected in AKR 2B-fibroblasts. Caspases-1, -2, -3, -6 and -9 were constitutively expressed as zymogens. With the exception of Caspase-9, the processing into their active subunits induced by serum removal could not be detected. At least their considerable importance during cell death of AKR cells could be proved by using specific caspase inhibitors and by determination of their specific activity. The characterization of that activity gave some hints for the identity of activated caspases. Beside constutive VEIDase and IETDase activities, a DEVDase reaches its maximum 3 hours after the onset of apoptosis. The present mixture of caspase activity is dominated by this DEVDase, which seems to be represented by just one enzyme, as shown by affinity labeling and 2D-SDS-PAGE. Determinations of KM- and Ki-values lead to the conclusion, that this enzyms has typical effector caspase characteristics, like caspase-3. Cleavage of lamins during cell death of the fibroblasts indicate that a caspase-6 became active. However, the known characteristics of caspase-6 are different of that found in AKR 2B cells, so that it may play just a minor role in the caspase mixture. Established repeated purification steps by chromatography, offers best conditions for protein sequencing and identification of the active caspase. The involvement of the receptor mediated pathway could be excluded by an overexpression of CrmA , a cowpox virus derived Caspase inhibitor; also there are no hints for an involvement of the mitochondria mediated pathway, except of caspase-9 cleavage. Pathways which lead to DEVDase activation are of major interests in present and future. Stimulation of signal pathways by PDGF-BB, TPA, Forskolin and 8Br-cAMP and others agents protect the fibroblasts from death. The stimulated pathways converge in one point up stream of effector-caspase activation. The identification of this point and its regulatory properties is a future goal, which will maybe lead to an understanding of processes responsible for surviving of 50 per cent of AKR 2B-Mausfibroblasten during serum removal.
KW  - Maus
KW  - Fibroblast
KW  - Apoptosis
KW  - Proteasen
KW  - AKR-2B Fibroblasten
KW  - Apoptose
KW  - Anisomycin
KW  - Caspase
KW  - Serumentzug
KW  - DEVDase
KW  - AKR-2B fibroblasts
KW  - apoptosis
KW  - anisomycin
KW  - caspase
KW  - serum deprivation
KW  - DEVDase
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1950
ER  - 
TY  - THES
A1  - Leimeister, Cornelia
T1  - Identifizierung und Charakterisierung von Genen für die Entwicklung der Nieren und des Urogenitalsystems
T1  - Identification and characterization of genes involved in development of the kidney and the urogenital system
N2  - Das Studium der Nierenentwicklung gibt Einblicke in generelle entwicklungsbiologische Prozesse wie induktive Wechselwirkungen, mesenchymale Kondensation, mesenchymale-epitheliale Umformung, Determinierung von Zellschicksal sowie Differenzierung und damit auch in die Entstehung congenitaler Fehlbildungen. Nach Induktion durch die Ureterknospe entstehen aus dem metanephrogenen Mesenchym die funktionellen Einheiten der Niere - die Nephrone - und das Nierenstroma. Diesen morphogenetischen Prozessen liegen komplexe regulatorische Veränderungen in der Genexpression zugrunde, die bislang nicht im Detail aufgeklärt sind. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifizierung bekannter und insbesondere neuer Gene, die durch Induktion im metanephrogenen Mesenchym reguliert werden. Mit Hilfe der ddPCR und Transfilter-Organkulturen wurde die Genexpression von induziertem versus nicht-induziertem Mesenchym aus Mäuse-Nierenanlagen untersucht. Einzelne Kandidaten wurden auf differenzielle Expression durch Northern Blot Analyse überprüft und für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Als eines der bekannten Gene wurde sFRP2 als im metanephrogenen Mesenchym induziert bestätigt und durch in situ Hybridisierung ganzer Mäuseembryonen und Paraffinschnitte näher untersucht. Es zeigt eine spezifische und dynamische Expression während der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe, die mit den Expressionsmustern von sFRP1 und sFRP4 verglichen wurde. Die detailierte Genexpressionsanalyse der sFRP-Familie in der murinen Embryonalentwicklung sollte als Grundlage für funktionelle Studien dieser erst kürzlich entdeckten neuen Genfamilie dienen. Erste Untersuchungen der ddPCR-Produkte C0-5, J6-3 und M2-4 zeigten, daß es sich um neue Gene handelt, die unterschiedliche Expressionsmuster in der Niere zeigen. Während C0-5 dynamisch in Epithelzellen von Ureter und Nephronvorläufern exprimiert ist, markiert J6-3 Stromazellen und M2-4 ist bereits im kondensierenden Mesenchym, später aber auch in den epithelialen Derivaten nachweisbar. Die Isolierung und Analyse der dem C0-5-ddPCR-Fragment entsprechenden cDNA zeigte, daß sie für ein kollagenartiges Protein codiert, welches beim Menschen in der Nähe des EWS-Gens auf Chromosom 22q12 liegt. Darüber hinaus wurde eine neue zu hairy und dem E(spl)-Komplex verwandte Genfamile identifiziert. Aufgrund ihrer Verwandtschaft und einem charakteristischen YRPW-Tetrapeptid wurden sie als Hey-Gene bezeichnet für: "hairy- und E(spl)-verwandt mit YRPW-Motiv". Sie zeigen gegenüber hairy/E(spl) oder den entsprechenden Vertebraten-Homologen der Hes-Genfamilie veränderte DNA- und Protein-Bindungseigenschaften. Darüber hinaus korrelieren ihre Expressionsmuster häufig mit Genen des Delta-Notch-Signaltransduktionsweg, was auf eine Beteiligung der Hey-Gene an Zelldeterminierung und Bildung von Zellgrenzen hinweist. Diese Vermutung konnte durch die Analyse von Dll1-Knockout-Mäusen für die Somitogenese ansatzweise bestätigt werden. Die Kombination von Transfilter-Organkultur mit ddPCR erwies sich als geeignet, um transkriptionell regulierte Gene des metanephrogenen Mesenchyms zu identifizieren. Expressions- und Sequenzanalyse vor allem der neuen Gene deutet auf ihre Beteiligung an der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe hin, die nun im Einzelnen untersucht werden muß. Mehr als 50 weitere Kandidaten für neue Gene bilden eine breite Basis zur weiteren Erforschung molekularer Grundlagen der Nierenentwicklung.
N2  - Studies on kidney development provide insights into general processes of embryogenesis like inductive interactions, mesenchymal condensation, mesenchymal-epithelial interactions, cell fate determination as well as differentiation and thereby into the basis of congenital malformations. Once induced by the ureteric bud, the metanephrogenic mesenchyme gives rise to the functional units of the kidney - the nephrons - and the renal stroma. These morphogenetic processes rely on complex regulatory changes in gene expression, which to date are not understood in detail. The present thesis aimed to identify known and primarily novel genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Gene expression of induced versus uninduced mesenchyme from murine kidney anlagen was compared using ddPCR together with transfilter organ culture. Several candidates were assayed for differential expression by northern blot hybridization and selected for further characterization. As one of the known genes, sFRP2 was verified to be induced within the metanephrogenic mesenchyme. In situ hybridization of whole-mount mouse embryos and paraffin sections revealed specific and dynamic expression patterns for sFRP2 as well as for the related genes sFRP1 and sFRP4 in the developing kidney and other tissues. The detailed sFRP gene expression analysis was performed to guide functional studies for this recently identified novel gene family. Preliminary investigations of the ddPCR products C0-5, J6-3 and M2-4 revealed that they are all derived from novel genes with distinct expression patterns during kidney development. While C0-5 expression dynamically switches from the ureteric bud to the nephron precursors and the collecting system, J6-3 specifies the stromal cell lineage and M2-4 is already detectable in the condensing mesenchyme with subsequent expression in epithelial derivatives. Isolation and analysis of the C0-5 cDNA resulted in the identification of a collagen-like protein in mice and humans that is located upstream of the EWS gene of the human chromosome 22q12. Additionally, a novel gene family related to hairy and the E(spl)-complex genes has been identified. Because of this relationship and a characteristic YRPW tetrapeptide they were designated as Hey genes for "hairy and E(spl) related with YRPW motif". Compared to hairy/E(spl) or the mammalian Hes proteins they show novel features of DNA-binding and protein interaction. Moreover, their expression patterns frequently correlate with those of members of the Delta-Notch signaling pathway suggesting that Hey genes may participate in this pathway in cell fate decisions and boundary formation. Analysis of Dll1 knockout mice partly confirmed this assumption for Hey1 and Hey2 during somitogenesis. This screen has shown that transfilter organ culture in combination with ddPCR is a powerful tool to identify genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Expression and sequence analysis of the novel genes implies a function during development of the kidney and other tissues that can now be studied in further detail. The collection of more than 50 additional candidates for novel genes regulated during nephrogenesis provides a rich resource for future analysis of the networks governing kidney development
KW  - Niere
KW  - Entwicklung
KW  - Molekulargenetik
KW  - Niere
KW  - Urogenitalsystem
KW  - Differential Display PCR
KW  - Entwicklung
KW  - In situ Hybridisierung
KW  - Somitogenese
KW  - Neurogenese
KW  - Mesenchym
KW  - Maus
KW  - Delta
KW  - kidney
KW  - urogenital system
KW  - differential display PCR
KW  - development
KW  - in situ hybridization
KW  - somitogenesis
KW  - neurogenesis
KW  - mesenchyme
KW  - mouse
Y1  - 1999
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1690
ER  - 
TY  - THES
A1  - Engelhardt, Stefan
T1  - Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren
T1  - Characterization of cardiac beta-adrenergic receptors through the use of transgenic mouse models
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann.
KW  - Beta-Rezeptor
KW  - Maus
KW  - Transgene Tiere
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Transgene Mäuse
KW  - beta-adrenerge Rezeptoren
KW  - Hypertrophie
KW  - Fibrose
KW  - Na/H-Austauscher
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - transgenic mice
KW  - cardiac hypertrophy
KW  - fibrosis
KW  - Na/H-exchanger
KW  - heart failure
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181950
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TY  - THES
A1  - Große-Wilde, Anne
T1  - Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL (mTRAIL-R)
T1  - Cloning, molecular characterization and konditional inactivation of a murine death receptor for TRAIL (mTRAIL-R)
N2  - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.
N2  - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological function of TRAIL. In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified. Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R deficient mice. The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy.
KW  - Maus
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor
KW  - Apoptosis
KW  - TRAIL
KW  - Rezeptor
KW  - Apoptose
KW  - Klonierung
KW  - 2D-Gel-Analyse
KW  - konditionale Knockout-Maus
KW  - TRAIL
KW  - receptor
KW  - apoptosis
KW  - cloning
KW  - 2D gel analysis
KW  - conditional knockout mouse
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-559
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TY  - THES
A1  - Schuh, Kai
T1  - Erzeugung und Analyse NF-ATp-defizienter Mäuse
T1  - Generation and Analysis of NF-ATp-deficient Mice
N2  - Ziel dieser Arbeit war es, NF-AT1-Gen-defiziente Mauslinien zu erzeugen und die Folgen dieser genetischen Manipulation in vivo zu untersuchen. Die Untersuchung sollte die durch die Gendefizienz erwarteten Mängel während der Entwicklung (Embryogenese) und, im Besonderen, die Auswirkungen auf das Immunsytem und die Entwicklung und Differenzierung der T-Zellen aufzeigen. Zur Untersuchung der genomischen Organisation des Maus-NF-AT1-Gens wurde eine genomische l-Phagen-DNA-Bibliothek "gescreent" (durchgeführt von Dr. E. Jankevics, Universität von Riga, Lettland), die entsprechenden l-Phagen, die das NF-AT1-Gen enthielten, isoliert und die DNA präpariert. Nach Analyse der klonierten Phagen (Subklonierung und Sequenzierung) wurde eine Restriktionskarte der entsprechenden Bereiche erstellt und der "targeting-vector" erstellt. Der "targeting-vector" wurde durch Elektroporation in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) eingebracht und die Integration in das Genom ("Homologe Rekombination") durch Southern Blotting- bzw. PCR-Analyse untersucht. Manipulierte ES-Zellklone wurden in C57Bl/6-Blastozysten injiziert, diese in scheinschwangere Ammentiere transferiert und die Nachkommen nach Geburt anhand der Fellfarben klassifiziert. Nachkommen mit einem hohen Anteil hellen Fells wurden mit C57 Bl/6-Tieren verpaart und die Integration des manipulierten Zellklons in die Keimbahn wurde anhand der wildtypischen Fellfarbe und Genotypisierung nachgewiesen. Bezüglich des manipulierten NF-ATp-Gens heterozygote F1-Tiere wurden miteinander verpaart, um eine homozygote NF-ATp-defiziente Mäuse zu erhalten. Die Deletion des NF-ATp-Proteins wurde durch in Western-Blotting-Experimenten und EMSAs ("electrophoretic mobility shift assays") nachgewiesen. Die NF-ATp-/--Tiere zeigten keine augenscheinlichen Veränderungen während der Entwicklung und, bei jungen Tieren, keine offensichtlichen Veränderungen bei der Entwicklung des Immunsystems. In älteren Tieren (> 6 Wochen) war eine Hyperproliferation der Zellen des Immunsystems zu beobachten, was mit einer Splenomegalie, einer verstärkten Bildung von Keimzentren in lymphatischen Organen, vergrößerten Lymphknoten und einer verlangsamten Involution des Thymus einherging. Weitergehende Untersuchungen der Ursache dieser hyperproliferativen Erkrankung offenbarten eine verminderte klonale Deletion nach Aktivierung. Die Ursachen dieses überraschenden Effekts sind wahrscheinlich vielfältig, da NF-AT-Faktoren an der Regulation der Expression vieler Gene beteiligt sind, u.a. des Apoptose-assoziierten CD95-Liganden. Da sich bezüglich der IL-2-Expression keine Unterschiede zwischen NF-ATp-defizienten Tieren und Kontrollen zeigten, jedoch eine erhöhte IL-2-Konzentration im Medium kultivierter NF-ATp-defizienter T-Zellen beobachtet wurde, wurde die Bindung von NF-ATp an putative NF-AT-Bindungssequenzen des CD25-Promotors, die transkriptionelle Aktivierung des Promotors mittels Luciferase-Assays und die Expression der IL-2R-alpha-Kette (CD25) untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß (1.) NF-ATp an zwei Regionen des CD25-Promotors bindet, (2.) der CD25-Promotor durch NF-ATp transkriptionell stark stimuliert wird und (3.) T-Zellen NF-ATp-defizienter Tiere nach Stimulation eine verminderte CD25-Expression zeigen. In NF-ATp-defizienten Tieren war die Expression von CD25 moderat reduziert, was eine Erklärung für den abgeschwächten Phänotyp dieser Tiere - im Vergleich zu IL-2- oder CD25-defizienten Tieren - sein kann. Die hyperproliferativen Erkrankungen dieser verschiedenen Mauslinien weisen auf eine Beteiligung der NF-AT-/IL-2-/IL-2R-Signalwege nicht nur während der T-Zell-Aktivierung hin, sondern auch auf eine Beteiligung an Signalwegen, die zur anschließenden Inaktivierung und Apoptose der T-Lymphozyten nötig sind.
N2  - Aim of this work was the generation of NF-ATp-deficient mice and to investigate the effects of this genetic manipulation in vivo. The investigation included observation of defects during embryogenesis and, in particular, effects on development and differentiation of T cells of the immune system. To characterize the genomic organisation of the NF-ATp gene, a genomic DNA library was screened (done by E. Jankevics, PhD, University of Riga, Latvia), the NF-ATp gene containing phages isolated and analyzed (subcloning and sequencing). A restriction map was made, necessary for construction of the targeting vector. The targeting vector was brought into E14.1 embryonic stem cells by electroporation and integration through "homologous recombination" was confirmed by Southern blotting and PCR analysis. Successfully manipulated ES cell clones were injected in C57 Bl/6 blastocystes, injected blastocystes transferred into pseudo-pregnant foster mice, and the offsprings classified according to coat colour. Offsprings showing a high level of fair coat colour were mated to C57Bl/6 inbreed animals, integration of the manipulated cell clone into germline was verified by wild-type coat colour and genotyping. Heterozygous animals were crossbred to obtain homozygous NF-ATp-deficient animals. Loss of NF-ATp protein was confirmed in Western blotting assays and EMSAs. NF-ATp-deficient mice showed no obvious changes in embryogenesis and no differences in the development of the immune system. Older Animals (> 6 weeks) developed a hyperproliverative disorder of lymphatic cells going along with splenomegalie, enlarged lymph nodes and retarted involution of the thymus. Further investigations revealed a normal activation but reduced clonal deletion of T cells after activation. This may be due to different causes, since NF-AT factors are involved in the regulation of many genes, e.g. the apoptosis-associated CD95 ligand. Phenotypical similarities with interleukin 2- (IL-2) or IL-2 receptor- (IL-2R) deficient mice and, in contrast, the observation of elevated IL-2 levels in supernatants of cultivated NF-ATp-deficient T cells, suggested a role of NF-ATp in the regulation of the IL-2/IL-2R system. Since no difference in IL-2 expression between NF-ATp-/--mice and controls was observed, binding of NF-ATp to putative NF-AT concensus sequences of the CD25 (IL-2R alpha chain) promoter, transcriptional activation by NF-ATp, and expression of CD25 were investigated. It was demonstrated that (1) NF-ATp binds to two regions of the CD25 promoter, (2) that NF-ATp is a stimulator of the CD25 promoter, and (3) T cells of NF-ATp-deficient mice display a decreased expression of CD25 after stimulation, compared to wild-type controls. The expression of CD25 is moderately decreased in NF-ATp-deficient mice, proposing an explanation for the "weak phenotype" of NF-ATp-/--mice, compared to IL-2- or IL2R-deficient mice. The hyperprolifertive disorders of these different mouse lines are pointing towards a participation of NF-AT-/IL-2-/IL-2R signaling not only in activation of T cells, but also in pathways necessary for subsequent inactivation.
KW  - Maus
KW  - Induzierte Mutation
KW  - T-Lymphozyt
KW  - T-Zellen
KW  - NF-AT
KW  - knock-out
KW  - Mäuse
KW  - T cells
KW  - NF-AT
KW  - knock-out
KW  - mice
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117
ER  -