TY - THES A1 - Mronz, Markus T1 - Die visuell motivierte Objektwahl laufender Taufliegen (Drosophila melanogaster) - Verhaltensphysiologie, Modellbildung und Implementierung in einem Roboter T1 - Visually motivated object choice in walking fruit flies (Drosophila melanogaster) – behavioural physiology, modelling and implementation in a robot N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden offene Fragen zur Objektwahl, zur Objektbeibehaltung und zur Aufgabe von Zielobjekten bei laufenden Taufliegen (Drosophila melanogaster) untersucht. Die Erkenntnisse zur Objektwahl wurden als kybernetisches Modell formuliert, auf einem eigens dafür konstruierten, autonom navigierenden Roboter mit Kameraauge implementiert und dessen Verhalten bei verschiedenen Landmarkenkonstellationen quantitativ mit dem Orientierungsverhalten laufender Fliegen verglichen. Es war bekannt, dass Drosophila in einer Wahlsituation zwischen unterschiedlich weit entfernten Objekten eine ausgeprägte Präferenz für nahe Objekte zeigt, wobei die Entfernung über das Ausmaß der retinalen Bildverschiebung auf dem Auge (Parallaxe) erfasst wird. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob die Parallaxe streng aus der Eigenbewegung der Fliege resultieren muss oder ob Eigenbewegung der Objekte Nähe vortäuschen und deren Attraktivität erhöhen kann. Es wurde gezeigt, dass die Präferenz für ein Objekt bei Drosophila umso größer wird, je mehr Bewegung dessen Abbild auf der Retina erzeugt; die relative Verschiebung des Objektabbildes muss dabei nicht mit der Eigenbewegung der Fliege gekoppelt sein. Überraschenderweise verschwand die Präferenz für nahe Objekte, wenn eine zusammenstehende Gruppe aus einer nahen und mehreren fernen Objekten präsentiert wurden, solange sie zusammen einen Sehwinkel von weniger als etwa 90° einnahmen. Diese Beobachtung ist konform mit einer Vorstellung, wonach Bewegung über größere Augenbereiche integriert und nicht einzelnen Objekten zugeordnet wird. Obwohl Drosophila bei gleichem Präsentationsort auf der Retina die größere parallaktische Bewegung bevorzugte, wurden bei gleicher Entfernung dennoch frontalere gegenüber lateraleren Objekten bevorzugt. Es wird postuliert, dass der frontale und der caudale Sehbereich eine Verstärkung erfahren, die die physikalisch bedingt geringere Parallaxe überkompensiert. Laufende Fliegen reagieren verzögert auf die Präsentation eines Objekts; dies wird im Sinne einer zeitlichen Bewegungsintegration interpretiert. Die darauf folgende Richtungsänderung hängt vom Präsentationswinkel des Objektes ab. Erscheint das Objekt frontolateral, findet eine Hinwendung statt, erscheint es caudolateral, kommt es bevorzugt zur Abwendung. Eine weitere wichtige kognitive Leistung der Fliege ist das Aufgeben eines zuvor ausgewählten Ziels, wenn sich dieses Ziel während des Anlaufs als unerreichbar herausstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Fliegen mit stark reduzierten Pilzkörpern erheblich mehr Zeit benötigen als wildtypische Fliegen, um vom gewählten Zielobjekt abzulassen. Dieser dem Perseveranzverhalten bei Parkinson-kranken Menschen ähnliche Phänotyp wurde unabhängig von der Methode der Ausschaltung der Pilzkörper gefunden. Die Dauer der Perseveranz nahm mit zunehmender Attraktivität des Zielobjekts, d. h. mit abnehmender Distanz, zu. Es wird vorgeschlagen, dass die Pilzkörper für die Evaluierung von eingehender sensorischer Information oder für Entscheidungsfindungen im Allgemeinen benötig werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Minimalmodell für die visuelle Orientierung nach Landmarken entwickelt. Das Modell beinhaltet eine zeitliche Integration des optischen Flusses in einem frontolateralen und einem caudolateralen Kompartiment pro Auge. Je nachdem, in welchem Kompartiment eine festgesetzte Schwelle zuerst erreicht wird, kommt es entweder zu einer Hin- (frontolateral) oder zu einer Abwendungsreaktion (caudolateral). Eine Gewichtungsfunktion kompensiert die geringe parallaktische Verschiebung in diesen Sehregionen. Das Modell wurde in einem mobilen Roboter mit Kameraauge implementiert und mit dem visuellen Orientierungsverhalten der Fliege quantitativ verglichen. Der Roboter war in der Lage, viele Aspekte der Landmarkenwahl von laufenden Fliegen erfolgreich zu reproduzieren und fliegenähnliches, autonomes Orientierungsverhalten unter verschiedenen Landmarkenkonfigurationen zu zeigen. N2 - The present study addresses open questions regarding visual orientation behaviour of walking fruit flies (Drosophila melanogaster), in particular how they choose near over far objects and how they maintain or adaptively abandon their choice. The findings led to a cybernetic model, suitable to autonomously control a mobile robot with panoramic vision, which was constructed, built and quantitatively compared to fly behaviour during this study. For a wide range of landmark constellations the robot exhibits fly-like orientation behaviour. Drosophila is known to choose, with a high probability, the nearest of several similar objects first. Distance to objects is measured by the extent of the retinal shift of their images on the eye (parallax motion). The present study asked whether parallax motion needs to directly result from the fly’s self-motion or whether motion of objects can increase their attractiveness because they appear to be closer to the fly. The data show that flies prefer objects the more, the larger the shift of the object image becomes on the retina. This is independent of the source of the retinal shift, object motion or self-motion of the fly. Surprisingly, the preference for near objects disappeared when a near object was presented together with several distant objects within a viewing angle of less then 90°. This observation led to the assumption that motion parallax is spatially integrated over larger areas of the eye and not seen as an entity of the single object. Physically, the extent of parallax motion caused by a stationary object on the retina of a walking fly depends not only on the distance but also on the angle under which it is seen. Although Drosophila prefers the larger amount of visual motion at a given presentation angle, it clearly prefers frontal over lateral objects. In order to account for the preference for frontal objects an amplification of the frontal and caudal eye regions is postulated which would otherwise receive less parallax motion. It turned out that walking flies respond only delayed to the presentation of a single object. This delay is consistent with the idea of temporal integration of parallax motion in order to judge distance. Astonishingly, the following course change depends on the viewing angle of the object. If an attractive object is shown in the frontolateral eye region the flies turn towards it. If it appears in the caudolateral part of the retina the flies preferentially turn away from it. Among the key abilities of animals must be the ability to give up on a once chosen target object if that object turns out to be inaccessible. The present study proves that flies with a strong reduction in mushroom body volume need considerably more time to give up on an object. The phenotype resembles the perseverance behaviour of humans suffering from Parkinson’s disease and was found regardless of the methods of interference with the mushroom bodies. The duration of the erroneously continued approach in flies with a strong reduction in mushroom body volume increases with decreasing distance between platform rim and landmark. In the absence of landmarks the defective flies behave normally, suggesting that mushroom bodies are involved in the evaluation of incoming sensory stimuli or in more general decision making processes. Modelling and implementation. Based on the findings outlined above a minimal model for landmark orientation has been established. The minimal model is based on a temporal integration of visual motion in four compartments, a frontolateral and a caudolateral compartment per eye. Depending on which compartment reaches a certain threshold first, a turning response will be elicited either towards (frontolateral compartment) or away from the target object (caudolateral compartment). Frontal and caudal eye regions naturally receive less parallax motion than lateral eye regions. To compensate for the small amount of parallax motion in the respective eye regions a weighting function has been introduced. The algorithm was finally implemented on a mobile robot equipped with a fish-eye lens mounted on camera allowing for panoramic vision. The behaviour of the robot was measured and quantitatively compared to the orientation behaviour of walking fruit flies. The robot reproduced successfully many aspects of the fruit fly's landmark orientation behaviour and showed fly-like autonomous orientation behaviour in the presence of various landmark arrangements. KW - Taufliege KW - Bewegungssehen KW - Orientierung KW - Bewegungssehen KW - Insekt KW - Orientierung KW - Fliege KW - vision KW - motion KW - insect KW - orientation KW - fly Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11748 ER - TY - THES A1 - Riemensperger, Thomas T1 - Untersuchung prädiktiver Eigenschaften des dopaminergen Systems von Drosophila melanogaster mittels genetisch kodierter Calcium Sensoren T1 - Analysis of predictive features in the dopaminergic System of Drosophila melanogaster using genetically encoded Calcium Sensors N2 - Die Technik des optischen Imaging unter Verwendung DNA-codierter Sensoren ermöglicht es, Messungen neuraler Aktivitäten in genetisch definierten Populationen von Neuronen durchzuführen. In der Vielzahl der verschiedenen entwickelten Sensoren konnten die Calciumsensoren bisher das beste Verhältnis zwischen Signal und Rauschen und die beste zeitliche Auflösung aufzeigen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um zwei Typen von Sensoren, zum einen ratiometrische Sensoren, deren Signal auf einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) basiert, und zum anderen um zirkulär permutierte Sensoren, die auf einem modifizierten GFP-Molekül basieren, wobei das Signal auf einer veränderten Protonierung des Chromophors beruht. Beide Arten dieser Sensoren wurden schon erfolgreich zum Messen neuraler Aktivitäten in Nervensystemen verschiedener Tierarten verwendet. Ein Teil dieser Arbeit bestand darin, zu untersuchen, welche Sensoren sich für die Messung an einem lebenden Organismus am besten eignen. Hierfür wurden die Eigenschaften von vier verschiedenen FRET basierten Sensoren und zwei der zyklisch permutierten Sensoren nach Expression im zentralen Nervensystem von Drosophila charakterisiert. Die Sensoren wurden in Neuronen zweiter und dritter Ordnung des olfaktorischen Signalwegs exprimiert und ihre Antworten auf physiologische Duftstimulation oder artifiziell induzierte Depolarisation des Gehirns untersucht. Während die calciumabhängigen Signale der zyklisch permutierten Sensoren in der Regel größer waren als die der FRET basierten Sensoren, zeichneten sich letztere durch ein besseres Signal zu Rausch-Verhältnis aus, wenn Bewegungen der fluoreszierenden Strukturen nicht zu vermeiden waren. Dies war auch der ausschlaggebende Grund für die Verwendung eines FRET basierten Sensors im anschließenden Teil der Arbeit. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt untersucht, den die Paarung eines neutralen Stimulus mit einem bestrafenden Stimulus auf dopaminerge Neurone hat. Eine solche Paarung kann zu einer klassischen Konditionierung führen, einer einfachen Form des Lernens, in welcher das Tier einem ursprünglich neutralen Stimulus einen Wert zuordnet, und dadurch sein Verhalten dem Stimulus gegenüber ändert. Die olfaktorische klassische Konditionierung in Drosophila wird seit vielen Jahren intensiv untersucht, um die molekularen und neuronalen Grundlagen von Lernen und Gedächtnis zu charakterisieren. Dabei hat sich gezeigt, dass besonders die Pilzkörper von essentieller Bedeutung für die Ausbildung eines olfaktorischen Gedächtnisses sind. Während das olfactorische System bei Insekten bereits detailiert analysiert wurde, ist über die Neurone, die den bestrafenden Stimulus vermitteln, nur sehr wenig bekannt. Unter Anwendung des funktionellen optischen Calcium Imaging konnte im Rahmen der Arbeit gezeigt werden, dass die Projektionen von dopaminergen Neuronen im Bereich der Loben der Pilzkörper schwach auf die Präsentation eines Duftes, jedoch sehr stark auf eine Stimulation durch einen Elektroschock antworten. Nach mehrmaliger Paarung eines Duftes mit einem Elektroschock während eines Trainings, verlängert sich die Aktivität dieser dopaminergen Neurone auf den bestraften Duft hin im Test ohne Elektroschock drastisch, während die Antwort auf den Kontrollduft keine signifikanten Veränderungen aufweist. Während bei Säugetieren belohnende Reize bei appetitiven Lernvorgängen über dopaminerge Neurone vermittelt werden, spielen bei Drosophila diese Neurone offensichtlich eine Rolle bei der aversiven Konditionierung. Jedoch blieb, auch wenn sich die Rolle des Dopamins im Laufe der Evolution geändert zu haben scheint, die Fähigkeit dieses Neuronentyps, nicht nur auf einen eintreffenden verstärkenden Stimulus zu reagieren, sondern diesen auch vorhersagen zu können, zwischen Säugern und Drosophila erhalten. N2 - The technique of optical in vivo imaging using genetically encoded fluorescent sensors in transgenic animals has paved the way for real-time monitoring of spatio-temporal activity in the brain. Among the different fluorescent probes, the calcium sensors produce signals with the highest signal to noise ratio and the best temporal resolution. Basically these sensors can be split into two groups, those based on a FRET-effect between two modified green fluorescent proteins (GFPs) and those which make use of on a circular permutation of GFP. Both types have successfully been used for measuring neuronal activity in various species. One part of the present work was to test which of these different sensor types are best suited for an in vivo situation. For this, two members of the class of circularly permutated sensors and four members of the class of FRET based sensors were tested and compaired in Drosophila. Each sensor was expressed in second and third order neurons of the olfactory pathway and the calcium activity evoked by artificial depolarisation or physiological odour stimuli was recorded. Whereas the Calcium dependent change in signal intensity is substantially higher for the circularly permutated sensors, the FRET based sensors tested in this work showed a better signal to noise ratio when movement of the brain structures under investigation could not be prevented. For this reason a FRET based sensor was chosen to measure the activity of dopaminergic neuronsin a classical conditioning paradigm. In the second part of this work the effect of pairing a neutral stimulus with a negative reinforcer (in this case an electric shock) on the activity of dopaminergic neurons was investigated. The pairing of these two stimuli can lead to classical conditioning, a simple form of learning in which the animal assigns a value (positive or negative) to the formerly neutral stimulus. Olfactory classical conditioning in Drosophila melanogaster is a prime model for the analysis of the molecular and neuronal substrate of this type of learning and memory. In particular the mushroom bodies have been shown to be essential for olfactory memory formation. While the olfactory system of insects has been extensively characterized little is known about the neurons that mediate the reinforcing stimulus. Using the technique of optical calcium imaging it was possible to show that dopaminergic projections in the region of the mushroom body lobes responded weakly to odour presentations, but strongly to the stimulation by an electric shock. After pairing for several times one of two odours presented to the fly with an electric shock (training), the activity of the dopaminergic neurons to the punished odour is significantly prolonged in a test after the training. No change is observed after the training for the control odour that was not paired with the electric shock. Whereas in mammals rewarding stimuli are mediated by dopaminergic neurons, in Drosophila this catecholamine apparently plays a role in mediating aversive reinforcement. Even though the role of dopamine seems to have changed during evolution the capability of dopaminergic neurons to predict a reinforcing stimulus appears to be conserved between Drosophila and mammals. KW - Taufliege KW - Dopaminerge Nervenzelle KW - Calcium KW - Calcium imaging KW - Sensoren KW - Dopamin KW - Drosophila melanogaster KW - prädiktive Eigenschaften KW - Calcium imaging KW - Sensors KW - Dopamine KW - Drosophila melanogaster KW - predictive features Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19041 ER - TY - THES A1 - Hampel, Stefanie T1 - Funktionelle Analyse des Einflusses von putativen T-Beta-H-positiven Neuronen auf das ethanolinduzierte Verhalten von Drosophila melanogaster T1 - Functional analysis of putative TbH neurons involved in ethanol induced behavior of Drosophila melanogaster N2 - Es sollten neuronale Netzwerke in Drosophila melanogaster identifiziert werden, die in die Entwicklung von ethanolinduziertem Verhalten involviert sind. Mittels der Tyramin-beta-Hydroxylase (TbH) wird der letzte Schritt der Biosynthese von Oktopamin aus Tyramin gewährleistet. TbHM18 Mutanten entwickeln eine reduzierte Ethanoltoleranz und haben keine nachweisbaren Oktopamin Konzentrationen (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). Die molekulargenetische Ursache dieser Mutante wurde näher untersucht. Wahrscheinlich ist die Deletion von einem Teil des Intron 1, des Exon 2 und einem Teil des Intron 2 des TbH-Gens verantwortlich für den Verlust der Tyramin-beta-Hydroxylase. Die Deletion der kodierenden Sequenz führt jedoch nicht zu einem Leserasterschub in der Aminosäuresequenz. Demzufolge könnte ein verkürztes Protein hergestellt werden. Ferner gibt es zwei Transkripte des TbH-Gens, woraus eventuell zwei Proteine exprimiert werden könnten. Ein Protein wäre die Tyramin-beta-Hydroxylase und das andere könnte eine Dopamin-beta-Hydroxylase sein. Um möglicherweise spezifische putative Subsets von TH-positiven Neuronen zu markieren, wurden verschiedene GAL4-Treiberlinien mit Hilfe unterschiedlicher Fragmente der Promoterregion des TbH-Gens hergestellt. Mittels des GAL4/UAS Systems konnte die Neurotransmitterausschüttung in putativen TbH-positiven Neuronen der TbH-GAL4-Linien inhibiert werden. Auf diese Weise sollte die Funktion der putativen TbH-positiven Neurone während der Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz untersucht werden. Das Transgen Tetanustoxin wurde mit der 1.3TbH-GAL4 Treiberlinie in einem bestimmten Set von Neuronen exprimiert. Die Inhibition der Synaptobrevin-abhängigen Neurotransmission in den 1.3TH-GAL4-positiven Neuronen beeinflusst nicht das ethanolinduzierte Verhalten. Hingegen das Ausschalten der Erregbarkeit der Zellen mit Hilfe eines UAS-Kir2.1 Transgens resultiert in erhöhter Resistenz gegenüber Ethanol. Das heißt, dass Synaptobrevin-unabhängige zelluläre Mechanismen der Zellen notwendig sind, um ethanolinduziertes Verhalten zu regulieren. Die 1.3TbH-GAL4-Linie exprimiert in einem sehr spezifischen Subset von Neuronen GAL4, bzw. Effektoren. Insgesamt werden ≈ 10 Zellen detektiert. Davon liegen die Somata zweier Neurone caudal und projizieren in die Region der ersten und vierten Bande des Fächerförmigen Körpers. Weitere kleine Ansammlungen von acht Zellen können um den Ösophagus und im Bereich des Subösophagialganglion verzeichnet werden. Die mit GFP markierten Neurone exprimieren wahrscheinlich kein Oktopamin. Ferner resultierte die Inhibition der synaptischen Transmission von 6.2TbH-GAL4-positiven Neuronen, mit Hilfe von Tetanustoxin, in einer erhöhten Ethanolsensitivität. Ebenfalls zu einer ethanolinduzierten Verhaltensänderung führt die Inaktivierung der 6.2TbH-GAL4 Zellen mittels eines UAS-Kir2.1 Transgens. Dabei entwickeln die Fliegen eine erhöhte Ethanolresistenz. Somit wäre möglich, dass die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Resistenz über verschiedene zelluläre Mechanismen reguliert werden. Die 6.2TbH-GAL4-Linie ermöglicht die Transgen-Expression in 65-70 Neuronen. Diese innerverieren u.a. das Subösophagialganglion, den Ösophagus, den Ellipsoid Körper, das laterale und das dorso-laterale Protocerebrum. Fünf der Neurone, die sich durch die 6.2TbH-GAL4 Treiberlinie markieren lassen, exprimieren Oktopamin. Dazu gehört ein VUM-Neuron und vier große caudale Zellen. Eine weitere putativ oktopaminerge GAL4-Linie Tdc2-GAL4 wurde mit der UAS-Kir2.1 Effektorlinie gekreuzt und die Nachkommen im Inebriometer gemessen. Bei Inaktivierung der Erregbarkeit der Tdc2-positiven Neurone resultiert dies in einer erhöhten Ethanolsensitivität, hingegen in keiner Veränderung der Toleranz. Die reduzierten Levels an Oktopamin spielen dabei wahrscheinlich eine Rolle. Hingegen regulieren eventuelle neurosekretorische Zellen über andere Mechanismen die Ethanolresistenz, wie die 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 Fliegen zeigen. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Neuronencluster für verschiedene ethanolinduzierte Verhaltensantworten verantwortlich sind. Da wahrscheinlich neurosekretorische Zellen des PI die Ethanolresistenz beeinflussen (RODAN et al. 2002), hingegen den Zentralkomplex-innervierende Zellen eher für die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz notwendig sind (URIZAR et al. 2007). N2 - We wanted to identify neuronal networks in Drosophila melanogaster that are involved in the development of ethanol sensitivity and/or tolerance. The tyramine-beta-hydroxylase (TbH) catalyzes the last step in the biosynthesis of tyramine into octopamine. The TbHM18 mutant develdops a reduced ethanol tolerance, because they have no concentrations of octopamine in their bodies (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). We investigated the molecular reason of the mutant. Probably the deletion of a part of intron 1, exon 2 and a part of intron 2 of the TbH gene is responsible for the loss of the tyramine-beta-hydroxylase. The deletion of the coding sequence does not result in a frame shift of the aminoacid sequence and because of this a truncated protein could be expressed. Further there are two transcripts of the TbH gene, from that two proteins could be expressed. One protein could be the tyramine-beta-hydroxylase and the other, a dopamine-beta-hydroxylase. For possibly marking specific putative subsets of TbH-positive neurons, different GAL4 driver lines were generated with different promoter fragments out of the TbH gene. Via the GAL4/UAS system the neurotransmitter release could be inhibited in putative TbH-positive neurons. In this manner the function of the putative TbH-positive neurons should be analyzed during the development of ethanol sensitivity and tolerance. The transgene tetanustoxin was expressed in a specific subset of 1.3TbH-GAL4 positive neurons. The ethanol induced behaviour is not influenced by inhibition of synaptobrevin-dependent neurotransmission in 1.3TbH-GAL4 positive neurons. Blocking the excitability of cells by using a UAS-Kir2.1 transgene results in increased ethanol resistence. That means that synaptobrevin-independent cellular mechanisms of cells are necessary for regulating ethanol induced behaviour. The 1.3TbH-GAL4 line expresses GAL4 in a very specific subset of neurons as well as effectors. All in all about 10 cells can be detected. Two somata of these cells are located caudal which project to the first and fourth layer of the fanshaped body. Eight more cells are localized frontal around the esophagus and in the subesophagial region. Probably the GFP-marked neurons do not express octopamine. Furthermore the inhibition of synaptic transmission with tetanustoxin of 6.2TbH-GAL4 positive neurons results in an increased ethanol sensitivity. Also the inactivation of 6.2TbH-GAL4 cells with an UAS-Kir2.1 transgene leads to an ethanol-induced change of behaviour and there the flies develop an increased ethanol resistence. It could be possible that the development of ethanol sensitivity and tolerance is regulated by different cellular mechanisms. The 6.2TbH-GAL4 line enables transgene expression in 65-70 neurons. These are innervating for example the SOG, esophagus, ellipsoid body, lateral and the dorsolateral protocerebrum. Five of these 6.2TbH-GAL4 driven neurons express octopamine, which include four big caudal cells and probably one VUM-neuron. An additional putative octopaminergic GAL4-line, the Tdc2-GAL4 line was crossed to the UAS-Kir2.1 effector line and the offspring measured for ethanol sensitivity and tolerance in the inebriometer. Inactivation of the excitability of the Tdc2-positive neurons results in an increased ethanol sensitivity, but on the other hand to no change of ethanol tolerance. The reduced octopamine levels do probably play a role in this. However the potential neurosecretory cells regulate the ethanol resistence by different mechanisms, like 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 flies show. The inhibition of neurotransmission with three other TbH-GAL4 lines (600TbH-GAL4, 4.6TbH-GAL4, 6.6TbH-GAL4) show no divergence of ethanol-induced behaviour compared to wildtype flies. There, the specific expression pattern of 600TbH-GAL4 line includes five cells in the pars intercerebralis and a brain surrounding glia layer. Further the 6.6TbH-GAL4 line enables expression of effector genes in eight cells and in a surrounding layer of the brain as well. The expression of 600TbH-GAL4 line and 6.6TbH-GAL4 line do not overlap with the octopaminergic expression pattern of our colocalization studies. The expression of UAS- effector genes driven by 4.6TbH-GAL4 line can be provided in approxymatly 67 neurons of the adult brain. With this GAL4-line the structures of the ellipsoid body, antennal lobes, pars intercerebralis and a big commissur are innervated. Seven cells can be detected caudal, but the region that they are projecting to is unknown. It could be shown that different clusters of neurons are responsible for several ethanol-induced behavioural responses. Because neurosecretory cells of the pars intercerebralis seem to influence the ethanol resistance (RODAN et al. 2002), but central complex- innervating cells are necessary rather for the development of ethanol sensitivity and tolerance (URIZAR et al. 2007). KW - Taufliege KW - TbH KW - Drosophila melanogaster KW - Ethanol KW - TbH KW - Drosophila melanogaster KW - Ethanol Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25600 ER - TY - THES A1 - Mentzel, Benjamin Tobias T1 - Biochemische und phänotypische Untersuchungen zur Funktion der p21-aktivierten Kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster T1 - Biochemical and phenotypic analysis of the p21-activated kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist das Drosophila melanogaster Protein DPAK3, ein Vertreter der hochkonservierten Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK). DPAK3 und seine Homologen aus anderen Insektenarten und C. elegans können aufgrund eines Vergleichs der Proteinsequenz und struktureller Merkmale in eine eigenen Untergruppe 1* innerhalb der Gruppe 1 der PAK-Proteine eingeordnet werden. Das Genom von Drosophila kodiert noch für zwei weitere PAK-Proteine, das zur Gruppe 1 gehörende DPAK1 und das Gruppe 2 PAK-Protein Mbt. Wie die klassischen Gruppe 1 PAK-Proteine bildet DPAK3 im inaktiven Zustand Dimere. DPAK3 interagiert mit den GTP-gebundenen Formen der RhoGTPasen Rac1, Rac2 und Cdc42. Durch die Bindung dieser Proteine geht DPAK3 aus dem dimeren in den monomeren Zustand über und seine Kinaseaktivität wird durch diese Bindung gesteigert. DPAK3 ist für die Ausbildung der korrekten Morphologie kultivierter Drosophila Zellen erforderlich und beeinflußt die Regulation des Aktinzytoskeletts. Weiterhin konnte CK2beta, die regulatorische Untereinheit der Casein Kinase 2, als neuer Regulator von p21-aktivierten Kinasen identifiziert werden. Das Genom von Drosophila besitzt drei Transkriptionseinheiten, die für CK2beta', CK2betatestes und fünf verschiedene Isoformen von CK2beta kodieren. Eine vergleichende Analyse zeigt, daß alle CK2beta-Proteine mit DPAK1, DPAK3 und in geringerem Maß auch mit Mbt interagieren und in der Lage sind, die Aktivität der PAK-Proteine in vitro zu hemmen. Die Bindung von CK2beta an DPAK3 wird, wie bei allen anderen Serin- / Threoninkinasen, die bisher als Interaktionspartner von CK2beta identifiziert wurden, über die Kinasedomäne von DPAK3 vermittelt. Die Bildung des aus zwei katalytischen CK2a und zwei CK2beta Untereinheiten bestehenden CK2-Holoenzyms hängt von der Fähigkeit von CK2beta ab, Dimere zu bilden. Es konnte gezeigt werden, daß die Bildung eines b-b Dimers für die Interaktion mit und Regulation von DPAK3 nicht erforderlich ist. In vivo wurden die bisher bekannten Dpak3 Allele untersucht, wobei kein gesichertes Nullallel identifiziert werden konnte. Durch enzymatisch katalysierte Rekombination wurde eine neue Deletion hergestellt, die das komplette Leseraster von Dpak3 entfernt. Mit Hilfe von genetischen Mosaiken wurde die Rolle von DPAK3 in der Augenentwicklung untersucht. Durch den Verlust der Genfunktion von Dpak3 wird die Ausbildung der korrekten Struktur der Komplexaugen nur leicht beeinträchtigt. Bei der Analyse einer Dpak1 Mutante wurde dasselbe Ergebnis erzielt. Gleichzeitiger Verlust der Genfunktion von Dpak1 und Dpak3 hingegen führt zu massiven strukturellen Defekten. DPAK1 und DPAK3 erfüllen somit zumindest teilweise redundante Funktionen in der Augenentwicklung. Es wird Gegenstand zukünftiger Studien sein müssen, die gemeinsamen und getrennten Funktionen dieser PAK-Proteine in Drosophila aufzuklären. N2 - Subject of this work is the Drosophila melanogaster protein DPAK3, a member of the highly conserved family of p21-activated kinases. Based on the comparison of the amino acid sequence and structural features, DPAK3 and its homologues from other insect species and C. elegans can be assigned to a distinct subgroup 1* within the group 1 PAK proteins. The genome of Drosophila encodes for two additional PAK proteins, DPAK1 and Mbt, which belong to the group 1 and group 2 p21-activated kinases, respectively. Like the classical group 1 PAK proteins, DPAK3 forms dimers in its inactive conformation. DPAK3 binds to and is activated by the Rho GTPases Rac1, Rac2 and Cdc42. The interaction with these proteins leads to the disruption of the DPAK3 dimer and an increase in the kinase activity of DPAK3. DPAK3 is necessary for the development of the normal morphology of cultured Drosophila cells and influences the regulation of the actin cytoskeleton. CK2b the regulatory subunit of casein kinase 2 was identified as a new regulator of p21 activated kinases. The genome of Drosophila possesses three different transcriptional units that encode the proteins CK2b', CK2btestes and five different isoforms of CK2b. A comparative analysis shows that all CK2b proteins interact with DPAK1, DPAK3 and Mbt and negatively regulate the activity of these kinases in vitro. CK2b binds to the kinase domain of DPAK3 which is consistent with previous results obtained from other serine/threonine kinases interacting with CK2b. The CK2 holoenzyme consists of two catalytically active CK2a subunits and two regulatory CK2b subunits. My results show that the ability of CK2b to form dimers, which is essential for the formation of the CK2 holoenzyme, is not necessary for the regulation of p21 activated kinases. The analysis of the available Dpak3 alleles in vivo revealed the necessity to create a new bona fide loss of function allele. To accomplish this goal, a new deletion which removes the entire Dpak3 open reading frame was created by enzymatically catalysed recombination. Genetic mosaics were used to study the role of DPAK3 in eye development. The morphology of the complex eyes was only slightly impaired by the loss of Dpak3 function. The same result was obtained when analysing Dpak1 mutants, but removal of the gene function of both Dpak1 and Dpak3 leads to massive structural defects. This shows that Dpak1 and Dpak3 have at least partially redundant functions in eye development. Further studies will be necessary to reveal the common and distinct functions of these p21-activated kinases in Drosophila. KW - Taufliege KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30290 ER - TY - THES A1 - Porps, Patrick T1 - Erhöhte Lebenserwartung und Resistenz gegenüber oxidativem Stress in Maus-Prion-Protein (PrP)-exprimierenden Drosophila melanogaster T1 - Increased lifespan and resistance against oxidative stress in Drosophila melanogaster expressing the murine prion protein (PrP) N2 - Übertragbare spongiforme Enzephalopathien (TSE) wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind fortschreitende neurodegenerative Erkrankungen, die nach langer Inkubationszeit zum Tod führen. Die protein only-Hypothese besagt, dass das infektiöse Agens „Prion“ teilweise oder vollständig aus dem zellulären Prion-Protein (PrPC) besteht und nach Infektion des Organismus die Konversion von PrPC in die pathogene Isoform (PrPSc) verursacht. Die der Krankheit zugrunde liegenden neuropathologischen Mechanismen und die physiologische Funktion von PrPC sind bisher unbekannt. Es wurden jedoch eine neuroprotektive Funktion oder eine mögliche Rolle im Zusammenhang mit der oxidativen Stress Homöostase postuliert. In dieser Arbeit wurden transgene Drosophila melanogaster-Linien als Modell zur Untersuchung der Funktion von PrPC etabliert. Unter Verwendung des Expressionssystems UAS/GAL4 exprimierten die Fliegen entweder wildtypisches PrP (wt-PrP) oder eine trunkierte, krankheits-assoziierte Mutante PrPΔ32-134 (tr-PrP), der die potentielle neuroprotektive Octarepeat-Domäne entfernt wurde. Wt-PrP transgene Fliegen zeigten nach Vergleich mit Kontrolllinien eine signifikante, um 20% erhöhte allgemeine Lebenserwartung. Obwohl die Expression von tr-PrP in Drosophila zu keinen nachweisbaren neuropathologischen Veränderungen führte, wurde die Lebensspanne um 8% reduziert. Ko-Expression von wt-PrP und tr-PrP konnte diesen Effekt nicht komplementieren, was eine chronische Toxizität der trunkierten Form nahelegt, die in diesem Zusammenhang der Neuroprotektion übergeordnet ist. Da Lebenserwartung und Stressresistenz eng miteinander korrelieren, wurden die Fliegen den reaktiven Sauerstoffspezies Wasserstoffperoxid, Sauerstoff und Paraquat ausgesetzt, um auf drei unabhängigen Wegen oxidativen Stress zu induzieren. In der Tat vermittelt wt-PrP eine signifikante Stressresistenz, wohingegen tr-PrP-exprimierende Tiere eine normale Anfälligkeit offenbarten, die jedoch teilweise durch Ko-Expression beider PrP-Formen komplementiert werden konnte. Hier erscheint die protektive Funktion von wt-PrP der Toxizität der Deletionsmutante übergeordnet zu sein. Diese Daten belegen eine wichtige Funktion des Prion-Proteins bezüglich der Abwehr von oxidativem Stress. Essentiell ist dabei die Kupfer-bindende Octarepeat-Domäne, durch die möglicherweise Fenton-ähnliche Reaktionen, die bei der Sauerstoff-Radikalsynthese eine wichtige Rolle spielen, inhibiert werden könnten. Konsistent damit ist die Beobachtung des Verlusts der erworbenen Stressresistenz nach Expression der Octarepeat-losen Mutante tr-PrP und die signifikante Reduktion der Lebenserwartung über einen bislang unaufgeklärten Mechanismus. Das Drosophila PrP-Modell bietet die Möglichkeit, die physiologische Funktion von PrP detailliert zu untersuchen. Außerdem ist die Identifizierung unbekannter PrP-Interaktionspartner ermöglicht, um Signaltransduktionswege des PrP und die zugrunde liegenden neurodegenerativen Mechanismen aufzuklären. N2 - Transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal progressive neurodegenerative disorders. The protein only hypothesis proposes that the infectious agent designated prion consists partly or entirely of the host cellular prion protein (PrPC) and, when the prion is introduced into the organism, causes the conversion of PrPC into the pathogenic isoform PrPSc. However, the disease underlying neuropathogenic mechanisms and the physiological function of PrPC still remain unknown, although a neuroprotective function or a role in oxidative stress homeostasis has been postulated previously. In this work transgenic Drosophila melanogaster lines were evaluated as a model for studying the function of PrPC. By using the bipartite expression system UAS/GAL4 either wild-type PrP (wt-PrP) or a truncated disease associated variant PrPΔ32-134 (tr-PrP) lacking the putative neuroprotective octarepeat domain were utilized. Wt-PrP transgenic flies displayed an approximately 20% increase in average lifespan compared to controls. Although expression of tr-PrP in Drosophila did not induce any obvious neuropathology, it significantly reduced the lifespan by 8%. Co-expression of wt-PrP and tr-PrP did not complement this phenotype, indicating a chronic toxicity of the truncated PrP that is overriding the neuroprotection. Since extended lifespan and stress resistance are closely associated, flies were exposed to the reactive oxygen species (ROS) hydrogen peroxide, oxygen and Paraquat as three independent treatments to provoke oxidative stress. Interestingly, wt-PrP confered resistance to ROS-induced stress, whereas tr-PrP transgenic flies showed normal susceptibility, which was partly rescued by co-expression of wt-PrP. In this regard PrP presence in its physiological compartment, the central nervous system, is sufficient to maintain the described beneficial effects. These findings suggest that PrP is involved in oxidative stress homeostasis by a mechanism that requires the copper binding octarepeat domain. This function might be responsible for the inhibition of Fenton-like reactions which are known to play an important role in oxygen radical synthesis. Consistent with this theory is the observation that ectopic expression of the octarepeat deletion mutant tr-PrP reduces both acquired stress resistance and lifespan by an unrelated, yet unknown mechanism. The Drosophila PrP model provides the possibility to investigate the physiological function of PrP in more detail. It is likewise considerable to identify unknown ligands of PrP in order to uncover PrP signal transduction pathways or neuropathogenic mechanisms. KW - Prion KW - Prionprotein KW - Oxidativer Stress KW - Taufliege KW - PrP KW - prion KW - prion protein KW - drosophila melanogster KW - oxidative stress KW - longevity KW - stress resistance Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36171 ER - TY - THES A1 - Kroiß, Matthias T1 - Reinigung und funktionelle Charakterisierung des SMN-Komplexes von Drosophila melanogaster T1 - Purification and functional characterization of the SMN-complex in Drosophila melanogaster N2 - Die Zusammenlageurng spleißosomaler UsnRNPs erfolgt beim Menschen und anderen Vertebraten durch den makromolekularen SMN-Komplex. Dieser besteht aus insgesamt neun Proteinen, genannt SMN und Gemin2-8. In dieser Arbeit wurde die Evolution dieser molekularen Maschine untersucht. Dazu wurden die Genome mehrerer Modellorganismen bioinformatisch nach Orthologen von SMN und seinen Komplexpartnern durchsucht. Es zeigte sich, dass SMN und Gemin2 die Kernkomponenten des Komplexes darstellen. Von diesen ausgehend kamen weitere Komponenten im Laufe der Evolution hinzu und zwar blockweise, wie es ihrer physischen Assoziation im humanen Komplex entspricht. Um diese Befunde einer biochemischen Überprüfung zu unterziehen, wurde ein neues Affinitätsepitop, das TagIt-Epitop, entwickelt. Nach stabiler Transfektion von Drosophila Schneider2-Zellen konnte das Fusionsprotein effizient exprimiert und der Drosophila-SMN-Komplex nativ aufgereinigt werden. Die massenspektrometrische Untersuchung des Komplexes zeigte, dass SMN und Gemin2 seine einzigen stöchiometrischen Komponenten sind. Dies ist in eindrucksvoller Übereinstimmung mit den bioinformatischen Daten. Der aufgereinigte Komplex lagert in vitro Sm-Proteine mit der entsprechenden UsnRNA zum UsnRNP-core-Komplex zusammen. Diese Ergebnisse ließen sich nach rekombinanter Rekonstitution des SMN/Gemin2-Dimers rekapitulieren. Dabei zeigte sich, dass der SMN-Komplex die unkoordinierte Bindung der Sm-Proteine an „falsche“ RNAs verhindert. Folglich genügen SMN und Gemin2 zur Zusammenlagerung des Sm-core-Komplexes, während die übrigen Gemine weitere Funktionen im Kontext der UsnRNP-Biogenese spielen könnten. Aus evolutionsbiologischer Sichtweise ist der SMN-Komplex aus Drosophila ein eindrückliches Beispiel, wie die Vereinfachung eines biochemischen Prozesses zur Kompaktierung des Genoms beitragen kann. N2 - In vertebrates, assembly of spliceosomal UsnRNPs is mediated by the SMN-complex, a macromolecular entity composed of the proteins SMN and Gemins 2-8. In this study, the evolution of this machinery has been investigated using complete genome assemblies of multiple model organisms. The SMN-complex has gained complexity in evolution by a block-wise addition of Gemins onto an ancestral core complex composed of SMN and Gemin2. In contrast to this overall evolutionary trend to higher complexity in metazoans, orthologs of most Gemins are missing in dipterans. In order to challenge these findings by biochemical means, I have developed a novel affinity epitope suitable for use in transfected Drosophila Schneider2-cells. Using protein mass spectrometry, the composition of the Drosophila SMN-complex has been determined. In accordance with the bioinformatic data, it consists of the core components SMN and Gemin2 only. Purified complex mediates assembly of UsnRNP core complexes in a manner very similar to its vertebrate counterpart. These results were recapitulated after recombinant reconstitution of the dSMN/dGemin2-dimer, demonstrating that the Drosophila complex also prevents mis-assembly of Smproteins onto non-target RNAs. Hence, only a minority of Gemins is required for the assembly reaction per se, whereas others may serve additional functions in the context of UsnRNP biogenesis. From a more general point of view, the evolution of the SMN-complex is an interesting example of how the simplification of a biochemical process contributes to genome compaction. KW - Taufliege KW - Epitop KW - Antikörper KW - Biochemische Evolution KW - SMN-Komplex KW - Spinale Muskelatrophie KW - Affinitätsreinigung KW - Epitop-Tag KW - SMN-complex KW - spinal muscular atrophy KW - affinity purification KW - epitope tagging Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28840 ER - TY - THES A1 - Franz, Mirjam T1 - Analyse der Hangover Funktion während der Entwicklung von Ethanol-induziertem Verhalten T1 - Analysis of the Hangover function during the development of ethanol-induced behaviour N2 - Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden. N2 - The development of ethanol tolerance is an indicator for a possible alcohol addiction. However the correct molecular mechanism of ethanol tolerance development is not known. The model organism Drosophila allows molecular and phenotypic observations of several mutants with altered ethanol tolerance (Scholz et al., 2000). HangAE10 mutants develop reduced ethanol tolerance because of defects in the cellular stress response (Scholz et al., 2005). For a better understanding of molecular mechanisms or signaling pathways, HANG putative target genes were identified, characterized and the protein function was analyzed on cellular level. The Hangover protein has 16 zinc finger domains, two of them are found in RNA modifying proteins (Scholz et al., 2005; Nelissen et al., 1991). This striking protein structure argues for an interaction of HANG with nucleic acids. In immunohistochemical studies with an ectopically expressed Hangover protein neither colocalization with DNA nor detectable Hangover binding on polytene chromosomes was observed. The ectopic expression of HANG in salivary glands shows a speckled protein distribution in the nucleus, which is similar to the expression pattern in RNA modifying proteins (Spector, 2001). Therefore colocalization studies of HANG with markers for RNA modifying proteins were performed. However no interaction with nucleoli was found. Certain factors of the splicing machinery also show no colocalization with Hangover. Since the studies were done with ectopically expressed protein, the results do not necessarily reflect the wild type behavior of HANG, as the interaction partner is not expressed in a comparable amount. RNA binding to specific parts of the Hangover protein was detected by in vitro experiments. Furthermore wild type expression of Hangover in neuronal cells shows the typical speckled distribution of RNA modifying proteins. These results suggest a RNA regulating function of HANG. In cDNA microarray experiments dunce was identified as a putative target gene of Hangover (Klebes and Scholz, unpublished data). The gene dunce encodes a phosphodiesterase that specifically hydrolyses cAMP (Davis and Kiger, 1981). The 14 dnc transcripts can be divided into four groups based on their length and function (http://flybase.org/; Qiu et al., 1993). To confirm the results of the cDNA microarray experiments, semiquantitative RT-PCRs were performed to analyze the differences in dnc transcript levels between wild type and hangAE10 mutants for each dnc group. A reduced amount of dncRMRA transcripts was observed in hangAE10 mutants. On the basis of these results the dncRMRA transcript specific dncΔ143 mutant was generated (Saratsis, 2006) and tested on behavioral level. Behavioral analysis of dnc1 and dncΔ143 mutants showed reduced ethanol tolerance and defects in the cellular stress response. For rescue experiments of reduced ethanol tolerance in hangAE10 and dncΔ143 mutants in specific dncRMRA neurons, the promotor dncRMRA-GAL4 line was generated (Saratsis, 2006). In-situ hybridization studies suggested that the expression pattern of dncRMRA-GAL4 reflects the endogenous expression of the dncRMRA transcripts. For unambiguous results colocalization studies with a specific DncRMRA antibody has to be done. The dncRMRA-GAL4 line shows a broad expression pattern, with transgene expression in about every 200th cell in the brain. It innervates the antennal lobes, parts of the mushroom body and regions of the central complex. The reduced ethanol tolerance in dncΔ143 mutants was rescued to wild type level by expressing UAS-dnc with the promotor dncRMRA-GAL4 line. Whereas the reduced ethanol tolerance in hangAE10 mutants was advanced by expressing UAS-hang with the same GAL4 line. This demonstrates that both mutants involve the same set of neurons for developing ethanol tolerance and probably act in the same signaling pathway. Expression studies showed that dncRMRA lies downstream of hang. The attempt to rescue the reduced ethanol tolerance in hangAE10 flies by expressing dnc using dncRMRA-GAL4 line did not advance the tolerance in these flies. An obvious explanation is that HANG does not only regulate dunce but also other genes and these regulation defects in hangAE10 mutants cannot be reversed by dnc expression. Due to the sensitivity of the UAS/ GAL4 system towards heat it was impossible to rescue the cellular stress response defects in dncΔ143 and hangAE10 mutants. The rescue of the dncΔ143 tolerance phenotype resulted in the assumption that cAMP regulation has an important function in the development of ethanol tolerance. The effect of cAMP on ethanol induced behavior should be tested by expression of cAMP regulating proteins in dncRMRA specific neurons. There the overexpression of dunce should result in an increase and the overexpression of rutabaga should lead to a decrease in cAMP levels. However, for both experiments there was neither a change in ethanol sensitivity nor in ethanol tolerance. An explanation would be that changes in cAMP concentration could be balanced by feedback loops between Dunce and Rutabaga. For a decisive conclusion the cAMP concentration in these flies has to be measured. Overexpressing pka-c, a gene that encodes the catalytic subunit of PKA in dncRMRA specific cells, leads to a higher resistance towards ethanol. This shows that the modulation of cAMP level by Dunce and Rutabaga has no effect on ethanol induced behavior in dncRMRA specific cells. Whereas the intensity of cAMP mediated signaling processes result in behavioral changes. Several mutants of the cAMP signaling pathway are impaired in olfactory learning and memory. Therefore dnc1, dncΔ143 and hangAE10 mutants were tested in this paradigm. Dnc1 as well as dncΔ143 flies showed reduced performance indices two and 30 minutes memory. After 180 minutes the performance index of dncΔ143 mutants was not significantly different from wild type whereas dnc1 mutants still had a reduction in comparison to wild type. Thus, dncΔ143 mutants have defects in short-term memory whereas short-term memory of hangAE10 mutants is not affected. However it is not known how hangAE10 flies will perform for mid-term and long-term memory formation. Similar to memory formation there exist different phases of tolerance development. To detect, if the long-term or the short-term form of tolerance is affected, the kinetic of tolerance development was investigated for dncΔ143 and hangAE10 mutants. In dncΔ143 mutants the first phase of tolerance development is defective, whereas in hangAE10 mutants the early and the late phase seem to be affected. Thus a part of the reduced tolerance in hangAE10 and the complete reduction in dncΔ143 mutants could be due to defects in the same signaling pathway regulated via cAMP. The variable results for the development of short-term memory in both mutants indicate that memory formation in dncΔ143 and hangAE10 mutants is independent of ethanol tolerance development and is regulated by different cAMP signaling pathways. KW - Taufliege KW - Tachyphylaxie KW - Alkohol KW - Erfahrungsorientiertes Lernen KW - Drosophila KW - Ethanoltolerance KW - dunce KW - hangover Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35591 ER - TY - THES A1 - Völler, Thomas T1 - Visualisierung und Manipulation neuronaler Aktivitäten im Gehirn von Drosophila melanogaster T1 - Visualization and manipulation of neuronal activity in the brain of Drosophila melanogaster N2 - In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivität entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repräsentation der Duftidentität und der Duftintensität untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente führten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivitätsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivitätsmuster der präsentierten Düfte zeigten interessanterweise einen hohen Ähnlichkeitsgrad, wohingegen andere unähnlich waren. In höheren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzkörper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilität der duftevozierten Aktivitätsmuster vor, was generelle Interpretationen unmöglich macht und höchstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zulässt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie prä- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erhöhung der Konzentration der verschiedenen präsentierten Düfte über einen Bereich von mindestens drei Größenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzkörper-Calyx und der Pilzkörper-Loben ist diese Konzentrationsabhängigkeit weniger deutlich ausgeprägt und im Falle der Loben nur für bestimmte Düfte detektierbar. Eine Bestätigung des postulierten „sparsed code“ der Duftpräsentation in den Pilzkörpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was möglicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellauflösung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabhängigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verstärkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz für einen aversiven Reiz führte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Gedächtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz für einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Gedächtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren. N2 - In this work two different techniques were used to determine the functions of various neurons in the brain of Drosophila melanogaster. First, by using in vivo calcium imaging and the calcium indicator cameleon odor-evoked neuronal activity was monitored along the olfactory pathway. How are odor identity and odor intensity represented in the fruit fly brain? To investigate this question we improved and standardized the data processing and data analysis. The experiments reveal that calcium activity patterns elicited by different odors are distinguishable in the antennal lobe. Interestingly, the patterns evoked by some odors show a high degree of similarity whereas those of other odors show less similarity in this analyzed neuropile. In higher brain centers like the region of the terminal aborizations of the projection neurons and the mushroom body Kenyon cells the odor evoked activity patterns are highly variable allowing no general interpretations but only comparison of patterns within fruit flies. Furthermore this work demonstrates an odor concentration dependent activity in the olfactory receptor neurons as well as pre- and postsynaptically in the projection neurons. In the Kenyon cells of the mushroom body calyx this concentration dependency is less clear and in the mushroom body lobes it seems that there is a concentration dependency only for specific odors. So far we have no evidence for the postulated so called “sparsed code” of odor representation in the mushroom body which might be due to limited resolution of the technique used in this work. In the second part of my work we used the light-dependent cation channel channelrhodopsin-2 and asked the question whether specific modulatory neurons mediate the reinforcing properties of a rewarding or punishing stimulus. Light-induced activation of dopaminergic neurons expressing channelrhodopsin-2 caused aversive associative memory formation in an aversiv olfactory conditioning paradigm for Drosophila larvae. Conversely, the artificial activation of octopaminergic/tyraminergic neurons by channelrhodopsin-2 induced appetitive associative memory. The conclusion is that dopaminergic neurons trigger aversive odor learning whereas octopaminergic/tyraminergic neurons trigger appetitive odor learning. KW - Taufliege KW - Calcium KW - Calciumkonzentration KW - Calcium-bindende Proteine KW - Klassische Konditionierung KW - Drosophila KW - in-vivo Calcium-Imaging KW - Cameleon KW - Channelrhodopsin KW - Light-activation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35589 ER - TY - THES A1 - Schubert, Alice T1 - Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D mit Identifizierung von Interaktionspartnern in Drosophila melanogaster T1 - Immunohistochemical and functional characterisation of the serine/arginine protein kinase SRPK79D with identification of interaction partners in Drosophila melanogaster N2 - Auf der Suche nach Mutanten mit einer vom Wildtyp abweichenden Verteilung des Aktive Zone-Proteins Bruchpilot wurde die Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D identifiziert. Hier zeigte sich, dass die Mutation im Srpk79D-Gen zu einer Agglomeration von Bruchpilot in den larvalen segmentalen und intersegmentalen Nerven führt. In der vorliegenden Arbeit sollte die SRPK79D genauer charakterisiert werden. Nach Präadsorptionen und Affinitätsreinigungen von in einer früheren Arbeit erzeugten Antiseren, gelang es die Lokalisation der überexprimierten SRPK79D-GFP-Isoformen zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass keines der Antiseren die endogene Kinase im Western Blot oder immunhistocheimisch detektieren konnte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Expression der SRPK79D in einer geringen Konzentration erfolgt. Es war jedoch möglich die endogene SRPK79D-PC-Isoform mittels einer Immunpräzipitation soweit anzureichern, dass sie im Western Blot nachweisbar war. Für die SRPK79D-PB-Isoform gelang dies allerdings nicht. Anhand von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten konnte gezeigt werden, dass die panneural überexprimierte SRPK79D-PC-GFP-Isoform an die Aktiven Zone transportiert wird und dort mit Bruchpilot, sowie den Interaktionspartnern von Bruchpilot Liprin-α und Rab3 kolokalisiert. Außerdem liegt sie diffus im Zytoplasma von neuronalen Zellkörpern vor. In adulten Gehirnen lokalisiert die transgen überexprimierte SRPK79D-PC-GFP im Fanshaped body, Ringkomplex und in neuronalen Zellkörpern. Die panneural überexprimierte SRPK79D-PB-GFP-Isoform liegt im larvalen und adulten Gehirn lokal im Zytoplasma der Perikaryen akkumuliert vor und wird nicht an die Aktive Zone transportiert. Das PB-Antiserum erkennt im adulten Gehirn neuronale Zellkörper und das Neuropil in der Calyxregion der Pilzkörper. Immunhistochemische Färbungen von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten mit verschiedenen Antikörpern gegen neuronale Proteine belegen, dass die Agglomerate in der Srpk79D-Mutante für Bruchpilot spezifisch sind. Es konnten bisher keine weiteren Komponenten der Agglomerate detektiert werden. Auch ein genereller axonaler Defekt konnte durch Färbungen gegen CSP, Synaptotagmin und Experimenten mit dem Mitochondrienfarbstoff MitoTracker® FM Green ausgeschlossen werden. Die quantitative Auswertung der Präparate zeigte, dass die Morphologie der synaptischen Boutons und die Zahl der Aktiven Zonen durch die Mutation im Srpk79D-Gen nicht beeinflusst werden. Um gesicherte Kenntnis darüber zu erlangen, ob die Mutation im Srpk79D-Gen die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsexperimente durchgeführt. Es konnte sowohl für das hypomorphe Srpk79DP1-Allel, als auch für die Nullmutante Srpk79DVN eine nahezu vollständige Rettung des Agglomerat-Phänotyps mit der panneural exprimierten SRPK79D-PF- oder der SRPK79D-PB-Isoform erreicht werden. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass beide Isoformen der SRPK79D in der Lage sind den Bruchpilot-Agglomerat-Phänotyp zu retten, die Rettung der Verhaltensdefizite jedoch alle Isoformgruppen benötigen. Um zu untersuchen, ob der Agglomerations-Phänotyp der Srpk79D-Mutanten auf einer Überexpression des Bruchpilotgens oder auf Fehlspleißen seiner prä-mRNA beruht, wurden Immunpräzipitationen, semiquantitative RT-PCRs und Real Time-PCRs durchgeführt. Ausgehend von den Ergebnissen kann eine mögliche Überexpression bzw. Spleißdefekte von Bruchpilot weitgehend ausgeschlossen werden. Die simultane Überexpression von SRPK79D und Bruchpilot konnte den Phänotyp der Bruchpilot-Überexpression nicht retten. Anhand der stimulated emission depletion-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die gebildeten Agglomerate das charakteristische Donut-förmige Muster der T-bars zeigen und wahrscheinlich als fusionierte Ketten von T-bars in den larvalen Nerven vorliegen. Beim in vivo Imaging Versuch konnte demonstriert werden, dass das verkürzte Bruchpilot-D3-Strawberry in die Bruchpilot-Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante eingebaut wird und dass größere Agglomerate unbewegt im Nerv verharren. Der anterograde und retrograde Transport kleinerer Agglomerate konnte verzeichnet werden. Bei CytoTrap-Yeast-two-hybrid-Experimenten konnten für die SRPK79D-PB Isoform vier potentielle Interaktionspartner identifiziert werden: das Hitzeschockprotein Hsp70Bbb, die mitochondriale NADH-Dehydrogenase mt:ND5, das large ribosomal RNA Gen in Mitochondrien und das am Spleißen beteiligte Protein 1.3CC/Caper. Die Sequenzierung zeigte, dass nur das letzte Exon von Caper im pMyr-Vektor vorliegt. Der für die PC-Isoform durchgeführte CytoTrap-Versuch ergab nur Temperatur-Revertanten. SR-Proteinkinasen phosphorylieren die RS-Domäne von SR-Proteinen und sind dadurch an der Regulation des konstitutiven und alternativen Spleißens beteiligt. Somit stellen die acht identifizierten SR-Proteine in Drosophila potentielle Interaktionspartner der SRPK79D dar. Die durch RNAi-vermittelte Reduktion von sieben SR-Proteinen führte zu keiner Agglomeration von Bruchpilot. Jedoch führte die RNAi-vermittelte Reduktion des SR-Proteins Spleißfaktor 2 (SF2) zu kleineren Bruchpilot-Agglomeraten in den axonalen Nerven. SF2 ist selbst kein Bestandteil der Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante. Die Überexpression von SF2 führt wahrscheinlich zu einem axonalen Transportdefekt, wie die Färbung gegen das Cysteine string protein zeigte. Weiterhin führt die Überexpression zu einer Akkumulation von SF2 in larvalen Axonen und im adulten Gehirn der Fliegen. SF2 ist nicht nur in Zellkernen sämtlicher Zellen nachweisbar, sondern es konnte auch ein spezifisches Signal im subsynaptischen Retikulum der Postsynapse detektiert werden, wie die Färbungen gegen Disc large bestätigten. N2 - In a Screen for mutations which affect the distribution of the active zone protein Bruchpilot, the serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) was identified. A mutation in the Srpk79D gene leads to conspicuous agglomeration of Bruchpilot in the larval segmental and intersegmental nerves. The aim of this thesis was to characterize the function of SRPK79D and to identify its interaction partners. The isoform specific antisera which were generated in an earlier PhD thesis recognized only the pan-neuraly overexpressed GFP-tagged SRPK79D isoforms in Western blots and immunhistochemical stainings. After preabsorption and affinity purification the antisera could uncover the localization of the overexpressed SRPK79D-GFP. Without enrichment of the endogenous SRPK79D concentration seems to be too low to be detected with the antisera. However, the endogenous SRPK79D-PC isoform could be detected in a Western blot after immunoprecipitation, but not the SRPK79D-PB isoform. The panneural overexpressed SRPK79D-PC-GFP isoform co-localizes with Bruchpilot as well as with the Bruchpilot interaction partners Liprin-α and Rab3 at active zones and showed a diffuse pattern in the cytoplasm of neuronal cell bodies. In adult brains the panneural overexpressed SRPK79D-PC isoform is detectable in the fanshaped body, ring complex and neuronal cell bodies. The panneural overexpressed SRPK79D-PB isoform is not present at the active zone but is detectable in larval and adult CNS accumulating in discrete spots in the cytoplasm of neuronal cells. The panneural overexpressed SRPK79D-PB isoform is also present in the neuronal cell bodies and calyces of the mushroom body. Larval dissections followed by stainings with different antibodies against synaptic proteins showed that the agglomerates in the Srpk79D mutants are quite specific for Bruchpilot. No other components of the agglomerates could be revealed until now. General impairments of axonal transport could be excluded by stainings against cysteine string protein (CSP), Synaptotagmin, and experiments with the dye MitoTracker® Green FM. These synaptic proteins are uniformly distributed along the larval nerves. The quantification of boutons revealed that the basic synaptic structure is not altered in Srpk79D-mutants. Stainings on frozen head sections of null mutant Srpk79D revealed a spot like Bruchpilot accumulation in the antennal nerves. The mutation of Srpk79D causes behavioral deficits in adult flies as well as a shortened life span. In order to test if expression of either isoform (SRPK79D-PC/PF or –PB) is able to rescue the obtained phenotypes, rescue experiments were performed. A nearly complete rescue of the agglomerate phenotype was achieved with both SRPK79D isoforms. Rescue experiments for the observed behavioral phenotype in the null mutant background did not significant by improve the defect, neither when using the pannreural driver lines elav-GAL4 nor the newly generated nSyb-GAL4. Alkaline Phosphatase treatment followed by 1D- or 2D-gelelecrophoresis could not detect a possible phosphorylation of SRPK79D. Also the vesicle-associated protein Synapsin showed a normal isoform pattern which indicates that Synapsin is not a substrate for SRPK79D. In experiments to detect overexpression or splicing defects of the active zone protein Bruchpilot as possible cause for the agglomeration phenotype in mutant Srpk79D animals, immunoprecipitations, semiquantitative RT-PCRs and Real Time-PCRs were performed. The results showed that overexpression or splicing deficits could be largely excluded. In stainings with the new Bruchpilot antisera N-Term and D2 the staining pattern did not differ from the nc82 staining showing that the PF isoform of Bruchpilot is not forming separate agglomerates in Srpk79DVN mutants. The overexpression of D2-4 and D1-3, truncated Bruchpilot proteins without either the N- or C-terminus, respectively, showed an agglomeration of the corresponding proteins in larval and adult CNS. However the overexpression of D1-3 is not affecting the endogenous Bruchpilot distribution. The simultaneous overexpression of SRPK79D and Bruchpilot could not rescue the phenotype caused by Bruchpilot overexpression. With the stimulated emission depletion microscope the pattern of the Bruchpilot agglomerates in the Srpk79DVN mutant revealed electron-dense donut-shaped structures in larval nerves, presumably fused T-bars. With in vivo imaging experiments anterograde as well as retrograde movement of D3-labeled agglomerates in the Srpk79DVN mutant was observed whereas large agglomerates are immobile. To identify substrates or interaction partners of SRPK79D the Yeast-two-hybrid screen CytoTrap was performed. The CytoTrap screen for the SRPK79D-PB isoform identified four interaction partners: the heat shock protein Hsp70Bbb, the mitochondrial NADH-Dehydrogenase mt:ND5, the large ribosomal RNA gene in mitochondria and 1.3CC/Caper. Caper is involved in splicing via the spliceosome. Sequencing revealed that the pMyr vector includes only the last exon of Caper. The performed CytoTrap for the RC-Isoform detected only temperature revertants. The RNAi mediated knock down of each of the eight known SR proteins in Drosophila showed that seven of them do not produce a phenotype whereas the reduction of SF2 leads to Bruchpilot agglomerates in larval nerves. The SR-Protein SF2 is not included in the agglomerates of the Srpk79D mutant but showed expression in nuclei of all cell types. The overexpression of SF2 leads to an agglomeration of SF2 in the larval nerves probably due to an impairment of general axonal transport. SF2 is not only a nuclear protein; it is also associated with post synaptic structures. KW - Taufliege KW - Serin KW - Arginin KW - Proteinkinasen KW - RNS-Spleißen KW - Genmutation KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK79D KW - Serin-Arginin Proteinkinase KW - Spleißen KW - Bruchpilot KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK79D KW - serine-arginine protein kinase KW - splicing KW - Bruchpilot Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53841 ER - TY - THES A1 - Gruber, Franz Andreas T1 - Untersuchung zur Regulation der Expression des zuckerkonditionierten Verhaltens bei Drosophila melanogaster T1 - Analysing the regulation of the expression of sugar-conditioned behaviour in Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit habe ich die Regulation der Expression des zuckerbelohnten Verhaltens durch den Fütterungszustand bei Drosophila melanogaster untersucht. Die Fliegen können während einer Trainingsphase mit Hilfe einer Zuckerbelohnung auf einen bestimmten Duft konditioniert werden. Nach dem Training können die Fliegen dann auf das olfaktorische Gedächtnis getestet werden. Die Bereitschaft das zuckerkonditionierte Gedächtnis im Test zu zeigen wird vom Fütterungszustand kontrolliert, wie ich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Arbeiten demonstrierte (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008). Nur nicht gefütterte Fliegen exprimieren das Gedächtnis, während Fütterungen bis kurz vor dem Test eine reversibel supprimierende Wirkung haben. Einen ähnlichen regulatorischen Einfluss übt der Futterentzug auch auf die Expression anderer futterbezogener Verhaltensweisen, wie z.B. die naive Zuckerpräferenz, aus. Nachdem ich den drastischen Einfluss des Fütterungszustands auf die Ausprägung des zuckerkonditionierten Verhaltens gezeigt bzw. bestätigt hatte, habe ich nach verhaltensregulierenden Faktoren gesucht, die bei einer Fütterung die Gedächtnisexpression unterdrücken. Als mögliche Kandidaten untersuchte ich Parameter, die zum Teil bereits bei verschiedenen futterbezogenen Verhaltensweisen unterschiedlicher Tierarten als „Sättigungssignale“ identifiziert worden waren (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). Dabei stellte sich heraus, dass weder die „ernährende“ Eigenschaft des Futters, noch ein durch Futteraufnahme bedingter Anstieg der internen Glukosekonzentration für die Suppression des zuckerkonditionierten Gedächtnisses notwendig sind. Die Unterdrückung der Gedächtnisexpression kann auch nicht durch Unterschiede in den aufgenommenen Futtermengen, die als verhaltensinhibitorische Dehnungssignale des Verdauungstrakts wirken könnten, oder mit der Stärke des süßen Geschmacks erklärt werden. Die Suppression des zuckerbelohnten Verhaltens folgte den Konzentrationen der gefütterten Substanzen und war unabhängig von deren chemischen Spezifität. Deshalb wird die Osmolarität des aufgenommenen Futters als ein entscheidender Faktor für die Unterdrückung der zuckerkonditionierten Gedächtnisexpression angenommen. Weil nur inkorporierte Substanzen einen Unterdrückungseffekt hatten, wird ein osmolaritätsdetektierender Mechanismus im Körper 67 postuliert, wahrscheinlich im Verdauungstrakt und/oder der Hämolymphe. Die Hämolymphosmolarität ist als „Sättigungssignal“ bei einigen wirbellosen Tieren bereits nachgewiesen worden (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Deshalb habe ich mit Hilfe genetischer Methoden und ohne die Fliegen zu füttern, versucht über einen künstlich induzierten Anstieg der Trehaloseund Lipidkonzentrationen die Osmolarität der Hämolymphe in Drosophila zu erhöhen. Eine solche konzentrationserhöhende Wirkung für Lipide und die Trehalose, dem Hauptblutzucker der Insekten, ist bereits für das adipokinetische Hormon (AKH), das von Zellen der Corpora cardiaca exprimiert wird, nachgewiesen worden (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). Es stellte sich heraus, dass die künstliche Stimulierung AKH-produzierender Neurone das zuckerkonditionierten Verhalten temporär, reversible und selektiv unterdrückt. Gleiche Behandlungen hatten keinen Effekt auf ein aversiv konditioniertes olfaktorisches Gedächtnis oder ein naives Zuckerpräferenzverhalten. Wie aus dieser Arbeit hervorgeht, stellt wahrscheinlich die Osmolarität des Verdauungstrakts und der Hämolymphe oder nur der Hämolymphe ein physiologisches Korrelat zum Fütterungszustand dar und wirkt als unterdrückendes Signal. Dass Fütterungen das zuckerkonditionierte Verhalten und die Zuckerpräferenz supprimieren, die künstliche Stimulation AKH-produzierender Zellen aber selektiv nur die zuckerbelohnte Gedächtnisexpression unterdrückt, deutet auf mindestens zwei unterschiedliche „Sättigungssignalwege“ hin. Außerdem macht es deutlich wie uneinheitlich futterbezogene Verhaltensweisen, wie das zuckerbelohnte Verhalten und die naive Zuckerpräferenz, reguliert werden. N2 - In this work I investigated the regulation of the expression of the sugar conditioned behavior by feeding states in Drosophila melanogaster. During the training flies are able to associate an odor with a sugar reward. During the test these flies have the opportunity to show their odor memory. In accordance with previous findings (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008), I also showed that the readiness to express sugar conditioned memory is controlled by the feeding state. The memory was only displayed by starved flies, whereas feedings of the flies until the test cause a reversible and temporary suppression of conditioned behavior. Feeding states similarly influence the expression of other food-related behaviors like sugar preference. After I have showed/confirmed the drastic influence of feeding state on sugar conditioned behavior, I tried to search for factors which suppress the memory expression of conditioned flies during feeding. Therefore I verified physiological parameters as promising candidates which have already been identified as “satiation-signals” for different food-related behaviors through the animal kingdom (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). As the results revealed, neither the nutritional value of the available food nor an increase of the internal glucose-concentrations were necessary for suppressing conditioned behavior. Furthermore differences in sweet taste and in the amount of the ingested food, which likely serve as volumetric signals of the digestive system, were not critical determinants for inhibition of the memory expression. Because suppression followed the concentration of the substances independent of the chemical specificity, I conclude that the osmolarity of the ingested food is a critical factor for inhibition of sugar conditioned behavior. Only ingested substances were suppressive. Therefore an internal osmolarity-detecting mechanism is postulated, most probably in the digestive system or the hemolymph. Hemolymph-osmolarity has already been shown as a “satiation-signal” for some invertebrates (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Thus I tried to increase the hemolymph-osmolarity by an artificially induced rise of the concentration of lipids and trehalose, the main blood sugar of insects. A concentration-increasing effect such like this has already been shown for the adipokinetic hormone (AKH), which is expressed in cells of the corpora cardiaca (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). I demonstrated that an artificial stimulation of AKH69 producing neurons induces the suppression of sugar conditioned behavior, but leaves aversive conditioned behavior and naïve sugar preference unchanged. This work indicates that the osmolarity of the digestive system and the hemolymph or only of the hemolymph serves as (a) physiological correlate(s), which signals suppression. Feeding induced inhibition of the expression of sugar conditioned behavior and naïve sugar preference, whereas the artificial stimulation of AKH-producing cells selectively inhibited sugar rewarded memory expression alone. Thus I assume at least two separable “satiation”-pathways. Moreover these results demonstrate the non-uniform regulation of different food-related behaviors like sugar conditioned behavior and naïve sugar preference. KW - Taufliege KW - Futterentzug KW - Klassische Konditionierung KW - Konditionierung KW - Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Osmolarität KW - Drosophila melanogaster KW - zuckerkonditioniertes Verhalten KW - klassische Konditionierung KW - Futterentzug KW - Drosophila melanogaster KW - sugar-conditioned behaviour KW - classical conditioning KW - food deprivation KW - starvation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48802 ER -