TY  - JOUR
A1  - Linsenmair, Karl Eduard
T1  - Allokation elterlicher Investition beim Bienenwolf Philantus triangulum (Hymenoptera: Sphecidae)
T1  - Allocation of parental investment in the beewolf Philantus triangulum (Hymenoptera: Sphecidae)
N2  - No abstract available
KW  - Zoologie
KW  - Biene
KW  - Bienenwolf
Y1  - 1991
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78191
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TY  - THES
A1  - Knaf, Tobias
T1  - Spezifische Bindung von Aluminium und Eisen an den kationenselektiven Kanal MppA von Microthrix parvicella
T1  - Specific binding of aluminium and iron ions to a cation-selective cell wall channel of Microthrix parvicella
N2  - Schwermetallsalze wie beispielsweise Aluminium- oder Eisensalze werden in der Abwasserbehandlung zur Prävention und Bekämpfung von Blähschlamm, Schwimmschlamm und Schaumbildung verwendet. Dadurch kann eine Verbesserung der Schlammabsetzeigenschaften im Nachklärbecken erreicht werden. Übermäßiges Wachstum des grampositiven Bakteriums Microthrix parvicella gilt dabei als Hauptursache von Schlammabsetzproblemen und kann ebenfalls durch die Dosierung von schwermetallhaltigen Flockungs- und Fällungsmitteln vermieden werden. Da diese Verbindungen in Wasser gelöst sind, müssen sie die Außenmembran bestimmter Bakterien passieren. Nur der Einbau von wassergefüllten Kanälen erlaubt den gelösten Salzen das Passieren der durch hydrophobe Fettsäuren aufgebauten zusätzlichen Permeabilitätsbarriere. In dieser Arbeit wurden wassergefüllten Kanäle von Microthrix parvicella isoliert, aufgereinigt und mit Hilfe der Black-Lipid-Bilayer-Technik charakterisiert. Ergänzend wurde der Einfluss und der Durchlass der Flockungs- und Fällungsmittel in Titrationsexperimenten untersucht. Dabei konnte ein wassergefüllter Kanal, der die Bezeichnung MppA erhielt, gefunden werden, welcher eine Leitfähigkeit von 600 pS in 1 M Kaliumchlorid und eine Bindestelle für mehrwertige Kationen wie Eisen oder Aluminium zeigte. Die Bindung dieser mehrwertigen Kationen führte zu einer Änderung der Ionenselektivität. Ohne Bindung mehrwertiger Kationen zeigte der Kanal eine leichte Kationenselektivität. Nach der Bindung wechselte die Ionenselektivität zu einer Anionenselektivität, was auf eine spezifische Ladungsverteilung im Kanal hinweist. Der Kanal MppA zeigte gleichwertige Bindekonstanten für Aluminium und Eisen. Beide Metalle werden als Fällungs- und Flockungsmittel in Kläranlagen zum Verhindern von Schwimm- und Blähschlamm verwendet. Frühere Arbeiten offenbarten bereits, dass hauptsächlich der Aluminiumanteil entscheidend für die Wirkung dieser Mittel ist. Diese Beobachtungen in Verbindung mit den Ergebnissen dieser Arbeit führten zu der Annahme, dass Eisen und Aluminium eine kompetitive Bindung an der Bindestelle im Kanalinneren zeigen könnten. So könnte in manchen Fällen Aluminium anstelle des sonst als Spurenelement benötigten Eisens durch den Kanal transportiert werden und in Enzym-Substrat-Komplexen eingebaut werden. Dadurch könnten toxische Effekte auftreten, die letztlich ein Absterben des Organismus zur Folge hätten. Für die Bindung der Metallsalze konnte zusätzlich eine pH-Abhängigkeit beobachtet werden. Nur eine Zugabe von Metalllösungen mit einem pH-Wert kleiner 6 führte zu einer Bindung im Kanal. Die Zugabe von Metalllösungen mit einem pH-Wert größer 6 zeigte keinen Effekt auf die Leitfähigkeit des Kanals. Diese Ergebnisse bestätigen die auf Kläranlagen und in vorherigen Arbeiten getätigte Beobachtung, dass der pH-Wert für die Wirksamkeit der Verbindungen entscheidend ist. In dieser Arbeit konnte jedoch erstmals gezeigt werden, dass der pH-Wert direkt die Bindung der Metallsalze beeinflusst.
N2  - Heavy metal salts like aluminium or iron compounds are used in waste water treatment plants to prevent bulking sludge, floating sludge and foaming and for this reason to enhance the settleability of the sludge flocs in the secondary clarifier. Excessive growth of the Gram-positive bacterium Microthrix parvicella is one of the main origins of sludge settlement problems and can be avoided by the dosage of heavy metal salts containing flocculation and precipitations agents as well. As these agents are dissolved in water, they have to pass the outer membrane of certain bacteria. Only the incorporation of water-filled channels into the membrane allows the solutes to pass this second permeability barrier build out of hydrophobic fatty acids. In this study, the water-filled channels of Microthrix parvicella were characterized with black lipid bilayer assays and the influence and the pass through of the flocculation and precipitations agents were investigated in titration experiments. A water-filled channel called MppA with a conductance of 600 pS in 1 M potassium chloride could be found which has a binding site for polyvalent cations like iron or aluminium. The binding of polyvalent cations to the binding site inside the channel led to a switch in the ion selectivity. Without binding of polyvalent cations, the channel showed slight cation selectivity. After the binding the selectivity switched to an anion selectivity indicating a special charge distribution in the channel. The channel MppA which was found in Microthrix parvicella showed same binding constants for aluminium and iron. Both metals are used as precipitation and flocculation agents and to prevent bulking sludge and floating sludge in waste water treatment plants. Other former works revealed already that only the aluminium part is decisive for the effect of these agents. These observations in addition to the results of this work led to the suggestion that iron and aluminium show a competitive binding to the binding site. In some cases aluminium might be transported through the channel and incorporated to some enzyme-substrate-complexes instead of the iron which usually acts as a micronutrient. This could lead to toxic effects and the dieback of the organism. A pH-dependency could be found for the binding of the metal salts. Only the addition of metal solutions with a pH lower than 6 led to a binding. The addition of solutions with pH-values higher than 6 showed no effect to the conductivity of the channel. These results confirm the observation done on waste water treatment plants and in other former studies that the pH value is generally decisive for the effect of the agents. But this work could show for the first time that the pH directly affects the binding of the metal salts.
KW  - Aluminium
KW  - Eisen
KW  - Porin
KW  - Microthrix parvicella
KW  - MppA
KW  - Zellwandkanal
KW  - aluminium
KW  - iron
KW  - cell wall channel
KW  - porin
KW  - Microthrix parvicella
KW  - Fadenbakterien
KW  - Abwasserreinigung
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77011
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TY  - THES
A1  - Hillebrand, Frank
T1  - Der Einfluss des PI3-Kinase Signalwegs auf die  Regulation des alternativen HIV-1 prä-mRNA Spleißens
T1  - The influence of the PI3-kinase pathway on the regulation of of alternative HIV-1 pre-mRNA splicing
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von HIV-1 basierten Minigenkonstrukten und der proviralen NL4-3 DNA die Einflüsse der PI3K Signalwegmodulation auf das alternative Spleißen der HIV-1 prä-mRNA sowie auf die Virus Replikation untersucht. Mittels RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition im Falle der HIV-1 basierten Minigenkonstrukte in einer erhöhten Abundanz ungespleißter bzw. intronhaltiger mRNAs resultierte, während im Kontext des Virus die Induktion alternativer Tat Transkriptvarianten nachgewiesen werden konnte. Als Folge der Inhibition des PI3K Signalwegs kam es zu einem vermehrten Einschluss der HIV-1 Leader Exone2/2b und 3. Da der Einschluss dieser Exone durch die hnRNP A/B- und F/H-abhängigen Silencer Elemente ESSV und GI2-1 negativ reguliert wird, wurde vermutet, dass die PI3K Inhibition mit der Funktionalität dieser spleißregulatorischen Aktivität interferiert. Unterstützt wurde diese Hypothese durch Replikationsexperimente mit ESSV und GI2-1 Mutanten in Gegenwart und Abwesenheit des PI3K-Inhibitors. Zusätzlich wurde auch der Einfluss des Inhibitors unter Überexpressionsbedingungen von hnRNP H auf das alternative HIV-1 Spleißen analysiert. In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition ein verändertes hnRNP H Spleißmuster bedingt sowie die SR-Protein Phosphorylierung und Expression beeinflusst. Des Weiteren war es im Verlauf der vorliegenden Arbeit möglich, eine Interferenz der PI3K Modulation mit der Virus Replikation nachzuweisen. Die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase lies hier nur eine sehr geringe Virus Produktion zu während die PI3K Inhibition diese auf ca. die Hälfte reduzierte. Weiterführende Experimente zeigten, dass die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase den nuklearen Export Rev-abhängiger HIV-1 mRNAs zu blockieren scheint. Darüber hinaus beeinflusste die PI3K Inhibition neben dem alternativen HIV-1 Spleißen auch die virale Transkription sowie die zelluläre Translation. Zusammen könnten diese Effekte die reduzierte virale Replikation erklären. Der PI3K Signalweg spielt somit eine zentrale Rolle bei dem alternativen HIV-1 Spleißen und der viralen Replikation und bietet so die Möglichkeit der Entwicklung neuer Ansätze einer antiviralen Therapie.  
N2  - In this thesis outgoing from HIV-1 based minigenes and the proviral NL4-3 DNA the influences of the PI3K signaling modulation on the alternative HIV-1 pre-mRNA splicing and also the viral replication were investigated. By performing RT-PCR analysis it could be shown that in the case of the minigene experiments the PI3K inhibition displayed an increased amount of unspliced or intron containing mRNAs, while the production of alternative Tat variants was demonstrated in the context of the virus. As a result of the PI3K inhibition an increased inclusion of the HIV-1 leader exons2/2b and 3 was observed. Because the inclusion of these exons is negatively regulated by the hnRNP H/F- and hnRNP A/B-dependent silencere elements ESSV and GI2-1, it was suggested that the PI3K inhibition interferes with the functionality of this splicing regulatory activity. Replication experiments either with GI2-1 or ESSV mutants in the presence or absence of the PI3K-Inhibitior supported this hypothesis. In addition, the influence of the inhibitor on the alternative HIV-1 splicing was analyzed under hnRNP H overexpression conditions. Furthermore, it was shown that the hnRNP H splicing pattern as well as the SR-protein phosphorylation and expression were altered as a consequence of the PI3K inhibition. During this thesis an interference of the PI3K modulation with the viral replication was also shown. The overexpression of the activated Akt kinase nearly prevented viral production while the PI3K inhibition reduced viral production by half. In further experiments it was shown that the overexpression of the activated Akt kinase seems to block the nuclear export of Rev-dependent HIV-1 mRNAs. In addition, beside the effect on the viral splicing pattern the PI3K inhibition also showed an influence on the viral transcription and the cellular translation suggesting that the sum of all these effects could contribute to the reduced virus production. These findings demonstrate that the PI3K signaling pathway has indeed a central influence on the alternative HIV-1 splicing as well as on the viral replication and may offer a new approach for antiviral therapy.
KW  - RNS-Spleißen
KW  - HIV
KW  - Phosphatidylinositolkinase <Phosphatidylinositol-3-Kinase>
KW  - PI3K/Akt pathway
KW  - HIV-1
KW  - alternative splicing
KW  - Phosphatidylinositol-3-Kinase
KW  - PI3K/Akt Signalweg
KW  - alternatives Spleißen
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76914
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TY  - THES
A1  - Hokema, Anna
T1  - Beeinflussung der Genexpression verschiedener Gene durch Xmrk in Pigmentzelltumoren bei Oryzias latipes
T1  - The effect of Xmrk on the gene expression of various genes in pigment cell tumors in oryzias latipes
N2  - Ziel dieser Arbeit ist es ein besseres Verständinis der molekularen Prozesse der Melanomentstehung und Tumorprogression zu gewinnen. Hierfür wurde ein Tiermodell transgener Medakas (Oryzias latipes) verwendet, welche als stabiles Transgen das Konstrukt mitf::xmrk besitzen. Diese Fische entwickelten Pigmentzelltumore, welche für eine Microarrayanalyse herangezogen wurden. Aus diesem Microarraydatensatz wurden 11 Gene ausgewählt, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurden. Beobachtungen haben ergeben, dass sich bei transgenen Medakas, welche Xmrk exprimieren, verschiedene pigmentierte Hauttumore entwickeln. Diese Tumore wurden je nach ihrem verschiedenen Histiotyp klassifiziert und untersucht. Um einen Eindruck zu gewinnen, wie Xmrk die Transkription verschiedener Gene, welche in der Krebsentstehung und –progression eine wichtige Rolle spielen, beeinflusst, wurden pigmentierte Hauttumore transgener Medakas, so wie zu Vergleichszwecken hyperpigmentierte Haut transgener Medakas und Lymphome und gesunde Organe von Wildtyp-Medakas, untersucht. Mit Hilfe von Real-time-PCR’s wurden die folgenden Gene untersucht: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 und ZFAND5. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Expression der Gene GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 von Xmrk beeinflusst wird, während dies für die Gene G6PC, GAMT, SPP1 und TACC2 nicht zutrifft. Im Vergleich zu gesunder Haut werden GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 in Tumoren höher exprimiert. Die Gene G6PC, GAMT, NID1, SPP1 und TACC2 werden dagegen verglichen mit gesunder Haut unverändert oder niedriger exprimiert. Die Bedeutung der erhöhten Genexpression lässt sich in vielen Fällen zurzeit nur theoretisch erfassen. Eine höhere Expression von SLC24A5 beispielsweise lässt vermuten, dass ein Zusammenhang zwischen der Melaninproduktion und der Zellproliferation besteht. Die Überexpression von GM2A weist dagegen auf eine Rolle von GM2A als Tumormarker hin. Dahingegen scheint die erniedrigte Expression von GAMT und G6PC Auskunft über den veränderten Stoffwechsel in Tumoren zu geben. Um diese Ergebnisse zu bestätigen und zu entschlüsseln wie genau Xmrk die Expression der getesteten Gene beeinflusst, sind allerdings noch weitere funktionelle Studien nötig. Generell kommt man zu dem Schluss, dass die Genexpression sich in jedem Tumor unterscheidet. Daher scheint jeder Tumor seinen eigenen Evolutionsweg zu beschreiten.
N2  - Target of this work is to get a better understanding in melanomagenesis and tumorprogression. Therefore a model of transgenic medakas (Oryzias latipes) was used, wich had the construct mitf::Xmrk as a stable, integrated transgen. Those fishes developed pigmentcelltumors that, wich where used in a microarrayanalysis. Of the results of this microarray 11 genes where chosen and analysed in this study. Those transgenic medakas which got xmrk injected, but without a tumorsuppresorgen, developed various pigmented kinds of skin cancer. Those tumors were analysed equally to their histiotyps. To get an idea, how Xmrk effects the transcription of several genes, which play an important role in tumor development and progression, pigmented skin cancer of transgenic medakas and for comparison, hyper pigmented skin of transgenic medakas and also lymphoma and healthy organs where tested. The following genes where tested by real-time-PCR: G6PC, GAMT, GM2A, MAPK3, NID1, SLC24A5, SPP1, PDIA4, RASL11B, TACC2 and ZFAND5. It was noticed that the expression of the genes GM2A, MAPK3, NID1, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 und ZFAND5 gets modified by Xmrk. In contrast the genes G6PC, GAMT, SPP1 and TACC2 didn't. In comparison to healthy skin GM2A, MAPK3, PDIA4, RASL11B, SLC24A5 and ZFAND5 got higher expressed in tumors. Indeed the expression level of the genes G6PC, GAMT, NID1, SPP1 and TACC2 is the same or even lower than in healthy skin. The meaning of the higher gen expression can currently just be theoretically conceived. The higher expression of SLC24A5 for example leads to guess that there is a link between the production of melanin and cell proliferation. The overexpression of GM2A shows that GM2A plays maybe a role as an tumor marker. However the lower expression of G6PC and GAMT gets references about the metabolism in cancer. To fix this results and get an better understanding how Xmrk affects the expression of this genes, additional funktional studies are necessary. The result is that gene expression differs in each tumor. A common conclusion is not possible. It appears that each tumor goes its own evolutionary way.
KW  - Japankärpfling
KW  - Melanom
KW  - Hauttumor
KW  - Genexpression
KW  - Real time quantitative PCR
KW  - Onkogen
KW  - Xmrk
KW  - Xmrk
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75616
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TY  - THES
A1  - Göhler, Antonia
T1  - Untersuchung Karbohydrat-bindender Proteine mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung
T1  - Studying carbohydrate binding proteins with high temporal and spatial resolution
N2  - Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine.
N2  - The human genome encodes 30,000 to 40,000 proteins of which the majority have covalently linked carbohydrates at the amino acids asparagine, serine, hreonine and hydroxylysine. These so called glycoproteins are embedded in the extracellular matrix and presented on cell surfaces. Glycoproteins are important membrane proteins, which are involved in cell-cell or cell-matrix interactions, protein folding or missfolding and the regulation of immune responses. The glycan chains harbour ideal properties for high-density storage of biological information; they are the basis of the sugar code. To translate its structural information into physiological effects the interplay with endogenous lectins is important. Lectins, among them the family of galectins, translate the sugarbased information into biosignaling. Galectins are carbohydrate-binding proteins that bind β-galactosides. They share a core sequence consisting of 130 amino acids, and a β-sandwich fold with two antiparallel β-sheets. Structurally, they are divided into three groups: proto-types exist as non-covalent dimers of two carbohydrate-recognition domains (CRD). The chimera-types have a lectin and a non-lectin domain and tandem-repeat-types contain of two different CRDs covalently linked by a short peptide. They are differentially expressed by various normal and pathological tissues. Due to the documented relation between lectins and different diseases (tumour growth, immune responses) it is important to study structural properties and their cross-linking ability in solution, especially in view of their intrafamily diversification. Therefore different spectroscopic techniques are used. Intrinsic and extrinsic fluorophores allow fluorescent measurements with high spatial and temporal resolution. Combining FCS and anisotropy measurements structural information about lectins, glycoproteins and their relations are monitored. For prototype galectins the hydrodynamic radius decrease upon ligand binding. Tandemrepeat- and chimera-types do not change their dimensions whereas their diffusion constants, measured with FCS, scale anomalous with the molar mass. Anisotropy measurements are carried out in parallel. Since an intrinsic fluorophore of the protein (tryptophan) is exploited, no labelling is necessary. With the help of this technique I am able to show that different binding constants and kinetics of the binding process within the galectin-family are caused by various conformational dynamics. Comparing hGal1 and cG-1B, the oxidation processes reveal differences despite of structural and binding similarities. These two techniques are very sensitive and applicable to study structural characteristics of galectins. Cross-linking between galetins and glycoproteins on the cell surface have been proposed to function as an „on-off“-switch that regulates cell proliferation, differentiation and immune responsiveness. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) provide an opportunity to study the spatial organization and cross-linking ability of hGal-1 interacting with β-galactose specific receptors on the cell surface of neuroblastoma cells. Alexa647, which can be switched reliable between an on- and a very stable off-state, is used as specific galectin marker. Measurements are done on a standard widefield setup and a spot analysis of single molecules in order to resolve clustering and cross-linking of galectins with a spatial resolution of better than 50 nm. The mean cluster size of hGal-1 molecules on the cell surface of neuroblastoma cells is 81±7 nm. The cluster diameter is independent of the protein concentration, a starting point or minimal galectin density for cluster formation is needed and the specificity of the CRDs for galactosides is underlined. Monomeric hGal-1 molecules show a different binding behaviour. On the one hand there are less localizations detectable and on the other hand I find very densly labelled, spherically shaped cells. This can maybe interpreted as hGal1-induced apoptosis. Existing labeling strategies limitate the value of super-resolution microscopy. The bioorthogonal click-chemistry creates a new field for labeling and visualizing biomolecules in vivo without the requirement of genetic manipulation. By hijacking a cell’s biosynthetic machinery, a metabolic precursor functionalized with a bioorthogonal chemical tag is incorporated into target biomolecules, including glycans, lipids, proteins and nucleic acids. Because of this I combine click-chemistry and the super-resolution technique dSTORM for specific labelling of metabolized sugar molecules. The cluster formation of sugar molecules on living and fixed cells in the presence of copper is being studied. Copper has no negative influence on the living cells. The mean square displacement decode cluster movement and determine cluster diameters in the range of 40 - 250 nm. In summary, we show that a combination of various temporal and spatial highresolution fluorescence techniques can be used advantageously to obatin new insights into the biology of galectins.
KW  - Fluoreszenz
KW  - Glykoproteine
KW  - Fluoreszenzspektroskopie
KW  - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
KW  - Anisotropie
KW  - dSTORM-Mikroskopie
KW  - Galektine
KW  - Fluorescence
KW  - Microscopy
KW  - anisotropy
KW  - glycoproteins
KW  - galectins
KW  - fluorescence correlation spectroscopy
KW  - dSTORM
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76665
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TY  - THES
A1  - Scheller, Katharina
T1  - Charakterisierung und Anwendung von humanen, primären mikrovaskulären Endothelzellen mit erweiterter Proliferationsfähigkeit
T1  - Characterization and application of human primary microvascular endothelial cells with extended proliferation capacity
N2  - Das Arbeitsgebiet Tissue Engineering befasst sich mit der Klärung der Mechanismen, die der Funktionen verschiedener Gewebearten zu Grunde liegen sowie mit der Entwicklung alternativer Strategien zur Behandlung von Organversagen bzw. Organverlusten. Einer der kritischsten Punkte im Tissue Engineering ist die ausreichende Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff. Bioartifizielle Gewebe mit einer Dicke von bis zu 200 µm können mittels Diffusion ausreichend versorgt werden. Für dickere Transplantate ist die Versorgung der Zellen alleine durch Diffusion jedoch nicht gegeben. Hierfür müssen Mechanismen und Strategien zur Prävaskularisierung der artifiziellen Gewebekonstrukte entwickelt werden, damit die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung aller Zellen, auch im Inneren des Transplantates, von Anfang an gewährleistet ist. Eine wichtige Rolle bei der Prävaskularisierung spielt die Angiogenese. Dabei ist die Wahl einer geeigneten Zellquelle entscheidend, da die Zellen die Basis für die Angiogenese darstellen. Mikrovaskuläre Endothelzellen (mvEZ) sind maßgeblich an der Angiogenese beteiligt. Das Problem bei der Verwendung von humanen primären mvEZ ist ihre geringe Verfügbarkeit, ihre limitierte Proliferationskapazität und der schnelle Verlust ihrer typischen Endothelzellmarker in-vitro. Der Aufbau standardisierter in-vitro Testsysteme ist durch die geringe Zellausbeute auch nicht möglich. Die upcyte® Technologie bietet hierfür einen Lösungsansatz. In der vorliegenden Arbeit konnten upcyte® mvEZ als Alternative zu primären mvEZ generiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen eine erweiterte Proliferationsfähigkeit aufweisen und im Vergleich zu primären mvEZ durchschnittlich 15 zusätzliche Populationsverdopplungen leisten können. Dadurch ist es möglich 3x104-fach mehr upcyte® mvEZ eines Spenders zu generieren verglichen mit den korrespondierenden Primärzellen. Die gute und ausreichende Verfügbarkeit der Zellen macht sie interessant für die Standardisierung von in-vitro Testsystemen, ebenso können die Zellen zur Prävaskularisierung von Transplantaten eingesetzt werden. Upcyte® mvEZ zeigen zahlreiche Primärzellmerkmale, die in der Literatur beschrieben sind. Im konfluenten Zustand zeigen sie die für primäre mvEZ spezifische pflastersteinartige Morphologie. Darüber hinaus exprimieren upcyte® mvEZ typische Endothelzellmarker wie CD31, vWF, eNOS, CD105, CD146 und VEGFR-2 vergleichbar zu primären mvEZ. Eine weitere endothelzellspezifische Eigenschaft ist die Bindung von Ulex europaeus agglutinin I Lektin an die alpha-L-Fucose enthaltene Kohlenhydratstrukturen von mvEZs. Auch hier wurden upcyte® Zellen mit primären mvEZ verglichen und zeigten die hierfür charkteristischen Strukturen. Zusätzlich zu Morphologie, Proliferationskapazität und endothelzellspezifischen Markern, zeigen upcyte® mvEZ auch mehrere funktionelle Eigenschaften, welche in primären mvEZ beobachtet werden können, wie beispielsweise die Aufnahme von Dil-markiertem acetyliertem Low Density Lipoprotein (Dil-Ac-LDL) oder die Fähigkeit den Prozess der Angiognese zu unterstützen. Zusätzlich bilden Sphäroide aus upcyte® mvEZ dreidimensionale luminäre Zellformationen in einer Kollagenmatrix aus. Diese Charakteristika zeigen den quasi-primären Phänotyp der upcyte® mvEZs. Upcyte® mvEZ stellen darüber hinaus eine neuartige mögliche Zellquelle für die Generierung prävaskularisierter Trägermaterialien im Tissue Engineering dar. In der vorliegenden Arbeit konnte die Wiederbesiedlung der biologisch vaskularisierte Matrix (BioVaSc) mit upcyte® mvEZ vergleichbar zu primären mvEZ gezeigt werden. Der Einsatz von upcyte® mvEZ in der BioVaSc stellt einen neuen, vielversprechenden Ansatz zur Herstellung eines vaskularisierten Modells für Gewebekonstrukte dar, wie beispielsweise einem Leberkonstrukt. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass upcyte® mvEZ vergleichbar zu primären mvEZs sind und somit eine geeignete Alternative für die Generierung prävaskulierter Trägermaterialien und Aufbau von in-vitro Testsystemen darstellen. Darüber hinaus wurde ein neues, innovatives System für die Generierung einer perfundierten, mit Endothelzellen wiederbesiedelten Matrix für künstliches Gewebe in-vitro entwickelt.
N2  - The scope of tissue engineering includes researching mechanisms underlying the function of different types of tissue, as well as the development of alternative strategies for the treatment of organ failure or organ loss. One of the critical aspects of tissue engineering is the adequate supply of cells with nutrition and oxygen. Bioartificial tissue up to a thickness of 200µm can be supplied sufficiently via diffusion. For thicker transplants, the supply of cells, only via diffusion is not sufficient. For this purpose, mechanisms and strategies for pre-vascularization of artificial tissue constructs need to be developed in order to ensure the supply of nutrition and oxygen to the inside of a transplant from the beginning. An important part of pre-vascularization is angiogenesis. Thereby, the selection of a suitable cell source is crucial, as these cells form the basis of angiogenesis. Microvascular endothelial cells (mvEC) are an important part of angiogenesis. Using human primary mvEC is critical due to the quick loss of their endothelial cell marker in-vitro but their limited availability and capacity of proliferation presents a problem. Additionally, the number of cells is also not sufficient for setup a standardized in-vitro test system. Upcyte® technology provides an approach to solving this problem. This work focused on the generation of upcyte® mvEC as alternative to primary mvEC. It was shown that cells treated with upcyte® technology have an enhanced capability of proliferation, resulting in 15 additional population doublings, compared to primary mvEC. Thus, it is possible to generate 3x104-fold more upcyte® mvEC from one donor compared to corresponding primary cells. The sufficient cell availability is important for the standardization of in-vitro test systems, as well as the usage for pre-vascularization of transplants. Upcyte® mvEC show many primary cell-like characteristics, which are described in literature. In the confluent state, upcyte® mvEC show a primary cell-specific cobblestone-like morphology. Furthermore, upcyte® mvEC express typical endothelial cell markers, such as CD31, vWF, eNOS, CD105, CD146 and VEGFR-2, at a similar level to primary mvEZ. An additional endothelial cell-specific attribute is the linkage of Ulex europaeus agglutinin I lectin to carbohydrate-structures of mvEC, which contain alpha-L-fucose. These data showed that there was a good comparison between the characteristics of upcyte® and primary mvEC. In addition to morphology, proliferation capacity and endothelial cell-specific markers, upcyte® mvEC showed functional characteristics, which are also observed in primary mvEC. Examples include the uptake of Dil-marked acetylated low density lipoprotein (Dil-Ac-LDL) and the ability to support the process of angiogenesis. In addition, spheroids formed from upcyte® mvEC formed three dimensional luminal cell formations in a collagen matrix. These characteristics show the quasi-phenotype of upcyte® mvEC. Upcyte® mvEC also represents a new promising cell source for the generation of pre-vascularized scaffolds in the tissue engineering context. The use of upcyte® mvEC in BioVaSc represents a promising new approach for producing a model for vascularized tissue constructs, such as a liver constructs. In summary, this work focussed on the development of upcyte® mvEC which were shown to be comparable to primary mvEC and therefore represent a sufficient and reliable alternative cell source for the generation of pre-vascularized scaffolds and the construction of in-vitro test systems. Moreover, a new and innovative system for the generation of a perfusable, endothelialized matrix for artificial tissue in-vitro has been developed.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Angiogenese
KW  - Endothelzellen
KW  - Tissue Engineering
KW  - Angiogenese
KW  - Endothelial cells
KW  - tissue engineering
KW  - angiogenesis
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76577
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jahn, Daniel
T1  - Die Bedeutung von verkürzten Spleißvarianten des Lamin A-Gens für die Meiose und für die Pathogenese von Laminopathien
T1  - The Role of truncated A-Type Lamins for Meiosis and for the Pathogenesis of Laminopathies
N2  - Die Lamina ist ein dichtes Netzwerk aus Intermediär-Filamenten, den Laminen, an der nucleoplasmatischen Seite der inneren Kernmembran. Hier interagieren Lamine sowohl mit Transmembran-Proteinen der Kernhülle als auch mit dem Chromatin. Diese Wechselwirkungen mit Interaktionspartnern verschiedener zellulärer Kompartimente macht die Lamina, neben einer Gerüststruktur mit wichtigen mechanische Aufgaben, auch zu einer zentralen Schnittstelle von Signalwegen, die eine intrazelluläre Kommunikation zwischen Nucleus und Cytoplasma ermöglichen. Die Lamina ist somit ein entscheidender Regulator der funktionellen Organisation des Chromatins und der differentiellen Genexpression. Das Expressionsmuster der Lamine während der Spermatogenese von Säugern unterscheidet erheblich von der Lamin-Expression somatischer Zellen und weist einige Besonderheiten auf. Dies schließt unter anderem die spezifische Expression der verkürzten A-Typ Lamin-Spleißvariante C2 während der meiotischen Phase der Spermatogenese ein. Diese und andere Beobachtungen deuteten bereits länger darauf hin, dass der speziellen Zusammensetzung der Lamina und vor allem dem meiosespezifischen Lamin C2 während der Gametogenese im männlichen Organismus eine entscheidende Rolle zukommen könnte. Neuere Studien im Mausmodell bekräftigen diese Hypothese und leisten darüber hinaus einen entscheidenden Betrag dazu, die Funktion der Lamina während der Meiose auf molekularer Ebene präzise zu definieren. Im deutlichen Gegensatz zu den weitreichenden Kenntnissen zur Situation in Männchen lagen zu Beginn der vorliegenden Arbeit keine Daten über die Zusammensetzung der Lamina in weiblichen Keimzellen vor. Konsequenterweise existierten auch keine funktionellen Untersuchungen zur Relevanz der Lamina für die Oogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden diese reproduktionsbiologisch hoch interessanten Fragestellungen detailliert untersucht. Dabei zeigte sich unter anderem, dass Lamin C2 auch in weiblichen Keimzellen spezifisch während der Meiose exprimiert wird. Durch Studien an einer Lamin C2-defizienten Mauslinie wurde die Funktion von Lamin C2 in der Meiose in Weibchen genau untersucht. Dabei wurde eine erhebliche Beeinträchtigung der strukturellen Paarung der homologen Chromosomen und der homologen Rekombination in Lamin C2-defizienten Weibchen festgestellt. Da die genannten Prozesse Schlüsselereignisse für die korrekte Segregation der Homologen in späteren Stadien der Meiose sind, deuten die erzielten Ergebnisse auf eine erhebliche qualitative Beeinträchtigung der reifen Gameten in Lamin C2-defizienten Weibchen hin. Ein weiterer zentraler Aspekt der Arbeit war die Analyse der molekularen Eigenschaften des meiosespezifischen Lamin C2 in vitro. Diese Experimente definieren wichtige Unterschiede hinsichtlich seiner Polymerisationseigenschaften im Vergleich zu Laminen somatischer Zellen und tragen, zusammen mit anderen Studien, dadurch erheblich dazu bei, die Funktion von Lamin C2 in der Meiose im mechanistischen Sinne besser zu verstehen. Zudem deckt die vorliegende Arbeit erstmals einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Lamina-Zusammensetzung und der Qualität der Keimzellen weiblicher Säuger auf und ermöglicht dadurch zukünftige Studien zur Rolle der Lamine in der Oogenese, die möglicherweise auch für die menschliche Fertilität sehr interessant sein könnte. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Beschreibung einer trunkierten A-Typ Lamin-Spleißvariante in einer Mauslinie, die bislang als A-Typ Lamin-defizient angesehen wurde (Lmna-/-). Die durchgeführten Untersuchungen besitzen vor allem dadurch hohe Relevanz, dass die untersuchte Lmna-/- Mauslinie seit Jahren als das wichtigste Modell zur funktionellen Untersuchung der A-Typ Lamine gilt und bereits in einer Vielzahl von Publikationen eingesetzt wurde. In den hierzu durchgeführten Versuchen konnte das in der Lmna-/- Mauslinie persistierende A-Typ Lamin mittels diverser methodischer Ansätze als C-terminale Deletionsmutante definiert werden, der die Exons 8-11 der insgesamt 12 Exons des Lmna-Gens fehlen. Daher wurde diese Lamin A-Mutante als Lamin AΔ8-11 bezeichnet. Die Konsequenzen der C-terminalen Deletion für die physiologischen Eigenschaften des Lamin Adelta8-11 sowie die Auswirkungen seiner Expression in der Lmna-/- Mauslinie auf aktuelle Modellvorstellungen zur Funktion der A-Typ Lamine und zur Entstehung Lamin-assoziierter, humaner Erkrankungen (Laminopathien) werden in der Arbeit ausführlich diskutiert.
N2  - The nuclear lamina is a dense meshwork of intermediate filament proteins termed lamins that lines the nucleoplasmatic face of the inner nuclear membrane. By its interactions with both integral membrane proteins and chromatin the lamina constitutes a cellular hub at the nucleo-cytoplasmatic interface that serves both structural and regulatory functions. With regard to this, lamins have been implicated in basic cellular processes such as transcription, signaling and chromatin organization and are therefore currently considered as major regulators of differential gene expression. Compared to somatic cells, nuclear lamina composition of male mammalian meiocytes is remarkably different. This includes the specific temporal expression of the short A-type lamin splice variant lamin C2 at meiotic stages of male germ cell development. Several lines of evidence indicated that meiosis-specific lamin C2 could serve an essential role for meiosis in males. Recently, this hypothesis has found strong support by in vivo studies in lamin C2-deficient males and these studies substantially contributed to the precise definition of lamin C2 function on a molecular level. In contrast to this, nuclear lamina subtype composition in female meiocytes has never been analyzed and, consequently, its contribution to the formation of viable gametes in females remained elusive. In the present study, these issues have systematically been addressed. Here, detailed immunohistochemical analyses demonstrate that, as in the male, female germ cells (oocytes) undergoing prophase I of meiosis specifically express lamin C2. Following functional studies performed in lamin C2-deficient mice disclosed a pivotal role of lamin C2 for central meiotic processes in females. These include the requirement of lamin C2 for precise pairing of the homologous chromosomes that occurs in meiotic prophase I as well as its contribution to the timely and efficient progression of homologous recombination events in oocytes. Since accurate segregation of paternal chromosomes during first meiotic division is known to be critically dependent on both precise homologous pairing and recombination, these data point to an as yet unanticipated role of lamin C2 for the development of viable gametes in females. Moreover, detailed in vitro experiments were performed to analyze the molecular properties of meiosis-specific lamin C2 compared to somatic lamin variants. This revealed distinct properties of lamin C2 that are compatible with models suggesting that this short lamin variant significantly modifies the structural properties of the nuclear envelope (NE) of mammalian meiocytes. These structural modifications, in turn, are considered to facilitate dynamic repositioning of NE-attached meiotic telomeres which, besides homologous pairing and recombination, is a further most central and evolutionarily conserved hallmark of meiotic prophase I with an essential relevance for accurate genome haploidization. Thus, together with other important observations made in the lamin C2-deficient mouse model, the data presented in this thesis significantly contribute to our understanding of lamin C2 function on a molecular level. The second part of the study is based on a rather unexpected finding in another lamin-deficient mouse model. This finding concerns the Lmna-/- mouse line that was established in 1999 by Sullivan and others by gene targeting of the Lmna gene encoding A-type lamins. Since then, these mice have frequently been used in a multitude of important studies that aimed to analyze various different aspects of A-type lamin function. This thesis now provides compelling evidence that, unexpectedly and contradicting previous reports, a truncated lamin A mutant persist in the Lmna-/- mouse line that was considered as completely devoid of A-type lamins thus far. By the use of various technical approaches, including detailed mass spectrometry, the presented data precisely define the lamin A variant present in Lmna-/- mice (designated lamin Adelta8-11) as a C-terminal lamin deletion mutant that lacks domains with known important functions for protein interactions and posttranslational processing. Based on these findings, implications for the interpretation of previous reports using Lmna-/- mice as well as for our current models of A-type lamin function and the pathophysiology of lamin-associated disorders in humans (laminopathies) are considered in the discussion of the thesis.
KW  - Meiose
KW  - Kernhülle
KW  - Lamine
KW  - Gamet
KW  - Laminopathie
KW  - meiosis . nuclear envelope
KW  - lamins
KW  - gamete
KW  - laminopathy
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74123
ER  - 
TY  - THES
A1  - Oberländer, Uwe
T1  - Untersuchung der immunstimulatorischen Effekte von Neuromelanin (NM) auf dendritische Zellen und deren Bedeutung in der Pathogenese von Morbus Parkinson
T1  - Investigation of immunostimulatory effects of Neuromelanin on dendritic cells and relevance for Parkinsons disease
N2  - Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein.
N2  - Background: The degeneration of neuromelanin (NM)-containing dopaminergic cells in the substantia nigra (SN) and a resulting reduction in striatal dopamine is a key feature in Parkinsons´s Disease (PD). Increased anti-melanin antibodies in sera of Parkinson patients had been shown recently, suggesting that NM may act as an autoantigen in PD. In this work it was asserted that NM is being recognized by dendritic cells (DCs), the major cell type for inducing T- and B-cell responses in vivo. This recognition of NM by DCs is a prerequisite to trigger an autoimmune response directed against NM-associated structures. Methods: Murine dendritic cells (mDC), generated from bone marrow, were treated with NM of SN from human subjects or with synthetic dopamine melanin (DAM) after both melanins were tested free of endotoxin contamination. Phagocytosis was documented with confocal microscopy. The expression of MHC II and CD86 was analyzed by flow cytometry. Concentrations of inflammatory cytokines TNF- and interleukin IL-6 were determined by ELISA. Finally the function of activated mDCs was tested by allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR). Results: NM was phagocytized effectively by mDCs, which subsequently developed a mature phenotype (CD86high/MHC IIhigh). In addition, NM-activated mDCs secreted the proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-. Finally, they potently triggered T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction, showing that mDC activation was functional to induce a primary T cell response. On the contrary, DAM, which lacks the protein and lipid components of NM but mimics the dopamine-melanin backbone of NM, had only very little effect on mDC phenotype and function. Discussion: NM is recognized by DCs in vitro and triggers their maturation. If this process occurs in vivo, it would allow DCs to transport and present SN antigens to the adaptive immune system, thus leading to autoimmmunity in susceptible individuals. This finding offers a rationale for an autoimmune-based pathomechanism of PD with NM as the initial trigger.
KW  - Parkinson-Krankheit
KW  - Melanin
KW  - dendritische Zellen
KW  - Autoimmunität
KW  - Parkinson
KW  - Neuromelanin
KW  - dendritische Zellen
KW  - Autoimmunität
KW  - Parkinsons Disease
KW  - Neuromelanin
KW  - dendritic cells
KW  - Autoimmunity
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73684
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mihlan, Sabrina [geb. Jasper]
T1  - Identifikation von Zonula Occludens 2 (ZO-2) als neuen LASP-1 Interaktionspartner und Aufklärung der LASP-1/ZO-2 Kern-Zytosol Translokation
T1  - Identification of zonula occludens 2 (ZO-2) as a new LASP-1binding partner and the elucidation of LASP-1/ZO-2 nucleo-cytoplasmatic shuttling
N2  - LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor.
N2  - LASP-1 (LIM and SH3 protein) is ubiquitously expressed at basal levels, but was found to be pathophysiologically overexpressed in several cancer entities. LASP-1 exhibits one LIM domain, two actin binding domains and one SH3 domain. On the one hand, LASP-1 is predominantly localized at focal contacts, lamellopodia and membrane ruffles, on the other hand a nuclear localization is observed. LASP-1 works as actin-binding scaffolding protein and is essential for migration and proliferation. Silencing of LASP-1 by RNA- interference in various cancer cell lines results in a strong inhibition of proliferation and migration. However, in tumor cells, an additional striking nuclear localization of the protein was observed, which significantly correlates with tumor size and a poor long term survival of the patients. Therefore, LASP-1 might act additionally as transcription factor or transcriptional co-factor In this work, a novel LASP-1 binding partner, zonula occludens protein 2 (ZO-2), was identified and its role in the signal transduction pathway of LASP-1 nucleo-cytoplasmic shuttling was established. Upon LASP-1 phosphorylation at Ser-146 by activated cAMP-dependent protein kinase A (PKA), LASP-1 binding to Zyxin and F-actin decreases and the protein detaches, in complex with ZO-2, from the plasma membrane and translocates into the nucleus. These results were confirmed by nuclear and cytosolic separation assays. Pull-down assays with mutants revealed that ZO-2 binds with its proline-rich sequence (amino acids 1103-1121) to the SH3 domain in LASP-1. LASP-1 exhibits no nuclear localization signal and requires ZO-2 to shuttle into the nucleus. In situ proximity ligation assay confirmed the direct binding between LASP-1 and ZO-2 and visualized the shuttling. Inhibition of the nuclear export system by Leptomycin B results in an accumulation of both proteins in nuclei. Nuclear export is regulated by the newly identified nuclear export signal in LASP-1 (amino acids 70-77) and mediated by CRM1. Finally LASP-1 relocalizes to focal contacts. This new identified pathway serves presumably as a signal transductor from the focal contacts to the nucleus for gene regulation.
KW  - Tumorzelle
KW  - Skleroproteine
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Überexpression
KW  - Zellkern
KW  - Kern-Zytosoltranslokation
KW  - ZO-2
KW  - Phosphorylierung
KW  - LASP-1
KW  - nuclear cytosolic translocation
KW  - ZO-2
KW  - phosphorylation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73442
ER  - 
TY  - THES
A1  - Vogel, Benjamin
T1  - Organisation von Chromatin durch HMGA1 Proteine
T1  - Organisation of chromatin through HMGA1 proteins
N2  - HMGA1 Proteine sind kleine, basische, Nicht-Histon Proteine, die in Lösung keine Struktur aufweisen, durch drei AT-Haken, als DNA-Bindungsmotive, gekennzeichnet sind und präferentiell an die kleine Furche der DNA binden. Als differenziell exprimierte Architekturelemente des Chromatins erfüllen sie wichtige Funktionen bei der Regulation DNA abhängiger Prozesse in Zellen und während Entwicklungsprozessen. Aberrante Expressionen führen zu Entwicklungsdefekten und Krebs. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von HMGA1 Proteinen auf die Organisation des Chromatins untersucht. Als Modell diente dabei zunächst die Differenzierung von C2C12 Muskelvorläuferzellen. Wie in einer früheren Arbeit gezeigt wurde, ist die Herunterregulation von HMGA1a essentiell für den Eintritt von C2C12 Zellen in die Myogenese. Eine konstante Überexpression von HMGA1a-eGFP hingegen verhindert die Muskeldifferenzierung durch Beeinflussung der Expression myogenesespezifischer Gene und Etablierung einer stabilen Chromatinstruktur. Wie in der vorliegenden Arbeit herausgefunden wurde, nimmt die differenzielle HMGA1a Expression nicht nur Einfluss auf die Expression muskelspezifischer Gene, sondern auch auf die globale Zusammensetzung des Chromatins durch eine reduzierte Expression von H1 Histonen und einer aberranten Expression von HMGB1, HMGN1 und HP1 Proteinen. HMGA1a wurde zusammen mit ORC Proteinen eine Funktion bei der Definition von Replikationsursprüngen in eukaryotischen Zellen zugesprochen. ORC Proteine wurden auch als Komponenten des Heterochromatins und als Interaktionspartner von HP1α identifiziert. Hier konnte mit Hilfe von Co-Immunpräzipitationen, Pull-down Assays und Verdrängungsexperimenten gezeigt werden, dass HMGA1 ein weiterer, direkter Interaktionspartner von ORC Proteinen im Heterochromatin ist und zusammen mit HP1α kooperiert. Pull-down-, Verdrängungs- und siRNA-Experimente zeigten zudem, dass HMGA1 zwar nicht direkt mit HP1α interagiert, die Kooperation der Proteine über ORC aber dennoch wichtig für die Aufrechterhaltung der Heterochromatinsstruktur ist. Damit erweisen sich HMGA1 Proteine als wichtige Stabilisierungsfaktoren des Heterochromatins. Bislang ging man davon aus, dass HMGA1 Moleküle linear, also eindimensional, an ein DNA Molekül binden. Das Vorhandensein von drei DNA-Bindungsmotiven und die eher struktur- als sequenzabhängige Bindung an die DNA lassen vermuten, dass HMGA1 Proteine auch gleichzeitig an benachbarte DNA-Stränge, also auch dreidimensional, binden könnten. Bekräftigt wurde diese Vermutung durch die Bildung von Chromatinaggregaten in Zellen die HMGA1a-eGFP überexprimierten. Dies wurde mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie (dSTORM) analysiert. Um das Potential einer DNA-Quervernetzung durch HMGA1 Proteine nachzuweisen, wurde eine neue Methode entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen DNA Cross-linking Assays wurde nachgewiesen, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind, zwei individuelle DNA Stränge zu vernetzen. Zudem wurde eine neue Domäne in HMGA1 entdeckt die maßgeblich zum Cross-linking beiträgt. Elektronenmikroskopische Analysen bestätigten, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind Kreuzungen und Schleifen in DNA Molekülen zu erzeugen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass HMGA1 Proteine im Zellkern ein DNA Gerüst bilden können, das Einfluss auf die zelltypische Chromatinorganisation nimmt und dadurch DNA abhängige Prozesse beeinflusst. In wie weit eine HMGA1 induzierte DNA Quervernetzung in vivo zum Beispiel in Chromozentren von C2C12 Zellen oder in Krebszellen, in denen HMGA1 Proteine stark überexprimiert sind, eine Rolle spielen, müssen künftige Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass HMGA1 Proteine die Chromatinstruktur auf drei Ebenen organisieren können: Durch Beeinflussung der Chromatinzusammensetzung durch Veränderung der Expression von Chromatinproteinen, durch Interaktion mit anderen Architekturelementen des Chromatins und durch Organisation eines potentiellen DNA Gerüsts.
N2  - HMGA1 proteins are small basic non-histone proteins characterized by three DNA binding domains, the AT-hooks, which bind to the minor groove of DNA. As differentially expressed architectural chromatin proteins, they perform important functions in the regulation of DNA dependent processes and in development. Aberrant expression leads to developmental defects and cancer. In this thesis the influence of HMGA1 proteins on chromatin organization is investigated. Initially C2C12 myogenic precursor cells were studied, which can be differentiated to myotubes. Previously it had been shown that down-regulation of HMGA1 proteins is crucial for the initiation of myogenic differentiation. Constant over-expression of HMGA1a-eGFP prevents myogenic differentiation by influencing the expression of myogenic genes and by the establishment of a stable chromatin structure. Here it was shown that the differential HMGA1 expression does not only influence the expression of myogenic specific genes but also affects total chromatin composition. This was shown by reduced and aberrant expression of chromatin proteins such as histone H1, HMGB1, HMGN1 and HP1 proteins. Recently it was demonstrated that HMGA1 together with ORC proteins function in origin definition in eukaryotic cells. ORC proteins were also identified as components of heterochromatin and direct interaction partners of HP1α. Here, it was shown by co-immunoprecipitation, pull-down assays, siRNA and displacement experiments that HMGA1 proteins can interact with ORC proteins directly and that they can cooperate with HP1α in heterochromatin. It could be shown that HP1α indeed does not directly interact with HMGA1 but together with ORC proteins is relevant for heterochromatin maintenance. Thus HMGA1 proteins turned out to be important stabilizers of heterochromatin. Until recently it was thought that HMGA1 proteins bind DNA collinearly. In principle the three independent DNA binding AT-hooks of HMGA1 also suggest a concomitant binding to neighboring DNA strands, which could lead to a three dimensional stabilization of DNA. This assumption was affirmed by the occurrence of chromatin aggregates in HMGA1a-eGFP overexpressing cells, which was analyzed by confocal and high resolution (dSTORM) microscopy. By using a newly developed DNA cross-linking assay, which allows the analysis of a DNA crosslinking capability of a protein, it was proven that HMGA1 proteins can bind two individual DNA fibers simultaneously. Furthermore a novel domain in HMGA1 proteins was discovered which is significantly involved in the DNA cross-linking. Electron microscopic analyses confirmed that HMGA1 proteins can specifically generate crossings and loops in DNA molecules. These results support the assumption that HMGA1 proteins can create a DNA scaffold that has influence on cell typical chromatin organization and possibly also affects DNA dependent processes. To what extent HMGA1 induced DNA cross-linking plays a role in vivo, for example in the organization of chromocenters of C2C12 cells or in cancer cells, where HMGA1 proteins are over-expressed, will need to be elucidated in further experiments In summary, this work shows, that HMGA1 proteins influence chromatin structure and composition by affecting the expression of chromatin proteins, by interacting with other architectural chromatin proteins or by producing a higher organization of chromatin on its own.
KW  - Chromatin
KW  - HMG-Proteine
KW  - HMGA1
KW  - Chromatin
KW  - dSTORM
KW  - HMGA1
KW  - Chromatin
KW  - dSTORM
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65295
ER  - 
TY  - THES
A1  - Philippi, Nicole
T1  - Modellierung von Signalwegen in verschiedenen biologischen Systemen
T1  - Modeling of signaling pathways in different biological systems
N2  - Die Apoptose der Leberzellen ist abhängig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellulären Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener äußerer Einflüsse und natürlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzustände anzunehmen. Die verschiedenartigen Einflüsse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzustände. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzustände, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst verändert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellulären Netzwerkes und seiner verschiedenen Zustände dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabhängig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer Übereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-Möglichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso berücksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsmöglichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazelluläre Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten.
N2  - Apoptosis of liver cells is dependent on external signals such as components of the extracellular matrix and cell-cell-contacts, which are processed by a variety of numerous nodes of which several are examined here for their system effects. Despite different input interferences and presumably also due to natural selecti- on, the system nevertheless appears to be optimized to adopt a small number of clear and distinguishable states, and the various inputs and crosstalk mechanisms only optimize the best choice between them. For the model described within this work, two nonapoptotic and two apoptotic states are found, although the degree of activation at a node can differ widely until the absolute system state is altered (Philippi et al., BMC Systems Biology, 2009) [1]. The model is still a simplification of the complete cellular network and its different states, and operates independently of detailed kinetic data and parameters for individual nodes. Nevertheless, it allows modeling the readout of apoptosis after FasL stimulation with qualitative agreement and includes crosstalks from collagen/integrin signa- ling, the effect of genetic deletion of Bid and the consequences of viral infection. The second part of this work deals with other applications using this method. Semi-quantitative models are used for hormonal signaling in plants, viral infec- tions and intra-cellular communication. The simulated results fit to the experi- mental data provided.
KW  - Systembiologie
KW  - Modellierung
KW  - Bioinformatik
KW  - Apoptose
KW  - Systems Biology
KW  - Modeling
KW  - Bioinformatics
KW  - Apoptosis
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57690
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gätschenberger, Heike
T1  - Die Expression humoraler und zellulärer Immunreaktionen bei Drohnenlarven und adulten Drohnen der Honigbiene (Apis mellifera)
T1  - Expression of humoral and cellular immune reactions of dronelarvae and adult drones of the honey bee (Apis mellifera)
N2  - Soziale Insekten wie die Honigbiene (Apis mellifera) besitzen ein breites Spektrum an Abwehrmechanismen gegen Pathogenbefall, sowohl auf der Ebene der Kolonie (soziale Immunität) als auch auf der Stufe des Individuums (angeborenes Immunsystem). Die Hauptaufgabe der relativ kurzlebigen Drohnen besteht in der Begattung von Jungköniginnen. Daher stellte sich die Frage, ob auch die Drohnen ähnlich den Arbeiterinnen mit energieaufwendigen Immunreaktionen auf Infektionen reagieren. Wie im Folgenden beschrieben, konnte ich nachweisen, dass Drohnen eine ausgeprägte Immunkompetenz besitzen. Das angeborene Immunsystem setzt sich aus humoralen und zellulären Abwehrreaktionen zusammen. Bei der humoralen Immunantwort werden bestimmte evolutionär konservierte Signalkaskaden aktiviert, an deren Ende die Expression einer Vielzahl von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und immunspezifischen Proteinen (IRPs) steht. Zur Analyse der humoralen Immunantwort wurden von mir zum einen Hemmhoftests durchgeführt, um die gesamte antimikrobielle Aktivität der Haemolymphe nach artifizieller Infektion zu ermitteln und zum anderen spezifische AMPs bzw. IRPs identifiziert. Hierzu wurden die Haemolymphproteine in ein- oder zwei-dimensionalen Polyacrylamidgelen aufgetrennt und ausgewählte Proteinbanden bzw. -spots mittels nano HPLC/Massenspektrometrie analysiert. Die Hauptkomponenten des zellulären Immunsystems sind Wundheilung, Phagozytose, Einkapselung und Nodulation. In meiner Arbeit habe ich zum ersten Mal Noduli bei infizierten Drohnen nachweisen können. Frisch geschlüpfte adulte Drohnen (1d) weisen ein breites Spektrum an Immunreaktionen auf, das sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten umfasst. Nach Infektion mit dem Gram-negativen Bakterium E.coli und verschiedenen bakteriellen Zellwandbestandteilen wie Lipopolysaccharid (LPS), Peptidoglycan (PGN) und 1,3ß-Glucan (Bestandteil von Pilzzellwänden), werden die AMPs Hymenoptaecin, Defensin 1 und Abaecin induziert. Desweiteren exprimieren junge adulte Drohnen eine Reihe hochmolekularer immunspezifischer Proteine (IRPs) wie z.B. Carboxylesterase (CE 1), eine Serinprotease, die möglicherweise an der Prozessierung der Prophenoloxidase beteiligt ist, ein Peptidoglycan-interagierendes Protein (PGRP-S2) und zwei Proteine unbekannter Funktion, IRp42 und IRp30. Parallel zu bekannten bienenspezifischen AMPs wurde ein animales Peptidtoxin (APT) in Drohnenlarven, adulten Drohnen und adulten Hummeln nach E.coli Infektion in der Haemolymphe nachgewiesen. Von dem als OCLP 1 (ω-conotoxin-like protein 1) benannten Peptid war bereits bekannt, dass es in Fischen paralytische und damit toxische Effekte auslöst. Meine Beobachtungen lassen vermuten, dass es sich bei OCLP 1 um ein Peptidtoxin mit antimikrobiellen Eigenschaften und damit um eine neue Klasse von AMPs handelt. Die allgemeine humorale Immunkompetenz scheint während der gesamten Lebensspanne adulter Drohnen (~ 7 Wochen) konstant zu bleiben, wie durch die gleichbleibende antimikrobielle Aktivität im Hemmhoftest gezeigt wurde. Junge Drohnen reagieren auf eine E.coli Infektion mit der Bildung zahlreicher Noduli (~1000 Noduli/Drohn), die vor allem entlang des Herzschlauches zu finden sind. Diese zelluläre Immunantwort nimmt mit dem Alter der Drohnen ab, so dass bei 18 d alten Drohnen nur noch rund 10 Noduli/Drohn gefunden werden. Auf der anderen Seite nimmt die phagozytotische Aktivität bei älteren Drohnen scheinbar zu. In einer Reihe von parallel laufenden Versuchsreihen konnte ich eindrucksvoll zeigen, dass zelluläre Immunreaktionen wie Phagozytose und Nodulation unmittelbar nach bakterieller Infektion einsetzen. Hierbei erreicht die Nodulibildung 8-10 h p.i. eine Plateauphase, wohingegen die humorale Immunantwort erst 6 h p.i. schwach einsetzt, danach stetig zunimmt und noch 72 h p.i. nachweisbar ist. Es ist mir gelungen, eine Methode zur künstlichen Aufzucht von Drohnenlarven zu etablieren. Diese ermöglichte konstante und sterile Versuchsbedingungen zur Untersuchung der Immunreaktionen von Larven. Nach Infektion mit E.coli reagieren Drohnenlarven mit einer starken Aktivierung ihrer humoralen Immunantwort durch die Expression von AMPs, jedoch werden keine hochmolekularen IRPs wie in adulten Drohnen hochreguliert. Zudem ist die Nodulibildung in Larven nur schwach ausgeprägt. Völlig unerwartete Beobachtungen wurden beim Studium der Immunkompetenz von Drohnenpuppen gemacht. Nach Injektion lebender E.coli Zellen in Drohnenpuppen stellte ich eine dramatische Veränderung im Aussehen der Puppen fest. Die Puppen verfärbten sich gräulich schwarz. Genauere Untersuchungen haben dann gezeigt, dass die Drohnenpuppen, wie auch die der Arbeiterinnen, offensichtlich keine zelluläre Abwehrreaktion aktivieren können und die humorale Immunantwort nur sehr schwach ausfällt und viel zu spät einsetzt.
N2  - Social insects like honey bees (Apis mellifera) possess a wide range of defence mechanisms against pathogens on the colony level (social immunity) as well as on the individual level (innate immunity). In early summer, honey bee colonies consist of about 50.000 workers, a few hundred drones and one queen. The main task of the short-lived drones is to mate with a virgin queen. This raises a question: do drones, similar to workers mount an energy-intense immune reaction to fend off infections? In my thesis I could show that drones exhibit an effective immune competence. The innate immune response is composed of a humoral and a cellular component. In the humoral immune response, evolutionally conserved signalling pathways are activated and lead to the induced synthesis of antimicrobial peptides (AMPs) and immune responsive proteins (IRPs). In order to analyse the humoral immune response, I conducted inhibition zone assays as well as one- and two-dimensional gelelectrophoresis. Afterwards, HPLC/MS was performed in order to identify specific protein spots. Wound healing, phagocytosis, encapsulation and nodulation are the principal components of the cellular immune system. In my work, I could show nodulation reactions in infected drones for the first time. Newly emerged drones (1d) respond to infections with a wide range of immune reactions, including humoral and cellular defence mechanisms. The AMPs hymenoptaecin, defensin 1 and abaecin are induced after infection with gram-negative E.coli, bacterial cell wall components like lipopolysaccharides (LPS), peptidoglycan (PGN) and 1,3ß-glucan (cell wall component of fungi). In addition, young drones express some high molecular immune responsive proteins (IRPs) like carboxylesterase (CE 1), a serine protease, that is potentially part of the prophenoloxidase activating system, further a peptidoglycan recognition protein (PGRP-S2) and with IRp30 and IRp42 two proteins of unknown function. IRp42 possibly belongs to the glycin-rich proteins (GRP) because of its glycin–rich regions. Glycin-rich proteins are known to participate in host defence in plants. IRp30 is a leucine-rich repeat containing protein with a C-terminal leucine zipper, which is common among Hymenopterans. Therefore it is possible for IRp30 to interact with other proteins, like cell wall structures of pathogens. I detected the bee-specific lysozyme 2 in the haemolymph of adult drones after septic infection. It belongs to the chicken (c)-type lysozymes like lysozyme 1, which are potentially active against gram-positive and gram-negative bacteria and fungi in insects. After E.coli infection, an animal peptide toxin (APT) was detected simultaneously to the known AMPs in the haemolymph of larvae, adult drones and adult bumble bees. It is known that this peptide, called OCLP 1 (ω-conotoxin-like protein 1), triggers paralytic and thus toxic effects in fish. My observations suggest that OCLP 1 is probably a peptide toxin with antimicrobial characteristics, and thus could belong to a new class of AMPs. Throughout their whole life (~ 7 weeks), adult drones maintain their immune competence. This was shown by the continuous antimicrobial activity of drone haemolymph in inhibition zone assays. After E.coli infection, young drones react with nodule formation (~1000 noduli/drone), which are mostly attached to the dorsal vessel. With increasing age, this type of cellular immune response weakens, so that 18d old drones only produce 10 noduli/drone. On the other hand, the phagocytic activity seems to increase in older drones In an array of parallel tests, I showed the immediate onset of the cellular immune reactions phagocytosis and nodulation upon septic infections. Nodule formation reaches a plateau 8-10 h p.i., whereas humoral immune response just begins to start 6 h p.i., continuously rises and is still measurable 72 h p.i.. I succeeded in establishing a method for rearing honey bee drone larvae artificially. This enabled constant and sterile conditions for the testing of immune reactions in larvae. A strong activation of humoral immunity with the expression of AMPs resulted from E.coli infection, yet no immune responsive proteins were induced like in adult drones. Moreover, nodule formation in larvae is weak. While studying immune competence of drone pupae, I made a surprising observation. There is a dramatic change in the physical appearance of drone pupae after injecting living E.coli bacteria. They change colour to a greyish black. Precise examinations revealed that there is no cellular immune response in drone pupae as well as in worker pupae, only a weak humoral immune reaction which is initiated too late.
KW  - Humorale Immunität
KW  - Zelluläre Immunität
KW  - Drohne
KW  - Biene
KW  - Apis mellifera
KW  - Drohnen
KW  - humorales und zelluläres Immunsystem
KW  - Apsi mellifera
KW  - drones
KW  - humoral and cellular Immune reactions
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71960
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krüger, Beate
T1  - Integration und Kombination bioinformatischer Methoden in Biotechnologie, synthetischer Biologie und Pharmaindustrie
T1  - Intgration and combination of bioinformatical methods in biotechnology, synthetic biology and pharmaceutical industry
N2  - Die Bioinformatik ist eine interdisziplinäre Wissenschaft, welche Probleme aus allen Lebenswissenschaften mit Hilfe computergestützter Methoden bearbeitet. Ihr Ziel ist es, die Verarbeitung und Interpretation großer Datenmengen zu ermöglichen. Zudem unterstützt sie den Designprozess von Experimenten in der Synthetischen Biologie. Die synthetische Biologie beschäftigt sich mit der Generierung neuer Komponenten und deren Eigenschaften, welche durch die Behandlung und Manipulation lebender Organismen oder Teilen daraus entstehen. Ein besonders interessantes Themengebiet hierbei sind Zweikomponenten-Systeme (Two-Component System, TCS). TCS sind wichtige Signalkaskaden in Bakterien, welche in der Lage sind Informationen aus der Umgebung in eine Zelle zu übertragen und darauf zu reagieren. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Beurteilung, Nutzung und Weiterentwicklung von bioinformatischen Methoden zur Untersuchung von Proteininteraktionen und biologischen Systemen. Der wissenschaftliche Beitrag der vorliegenden Arbeit kann in drei Aspekte unterteilt werden: - Untersuchung und Beurteilung von bioinformatischen Methoden und Weiterführung der Ergebnisse aus der vorhergehenden Diplomarbeit zum Thema Protein-Protein-Interaktionsvorhersagen. - Analyse genereller evolutionärer Modifikationsmöglichkeiten von TCS sowie deren Design und spezifische Unterschiede. - Abstraktion bzw. Transfer der gewonnenen Erkenntnisse auf technische und biologische Zusammenhänge. Mit dem Ziel das Design neuer Experimente in der synthetischen Biologie zu vereinfachen und die Vergleichbarkeit von technischen und biologischen Prozessen sowie zwischen Organismen zu ermöglichen. Das Ergebnis der durchgeführten Studie zeigte, dass Zweikomponenten-Systeme in ihrem Aufbau sehr konserviert sind. Nichtsdestotrotz konnten viele spezifische Eigenschaften und drei generelle Modifikationsmöglichkeiten entdeckt werden. Die Untersuchungen ermöglichten die Identifikation neuer Promotorstellen, erlaubten aber auch die Beschreibung der Beschaffenheit unterschiedlicher Signalbindestellen. Zudem konnten bisher fehlende Komponenten aus TCS entdeckt werden, ebenso wie neue divergierte TCS-Domänen im Organismus Mycoplasma. Eine Kombination aus technischen Ansätzen und synthetischer Biologie vereinfachte die gezielte Manipulation von TCS oder anderen modularen Systemen. Die Etablierung der vorgestellten zweistufigen Modul-Klassifikation ermöglichte eine effizientere Analyse modular aufgebauter Prozesse und erlaubte somit das molekulare Design synthetischer, biologischer Anwendungen. Zur einfachen Nutzung dieses Ansatzes wurde eine frei zugängliche Software GoSynthetic entwickelt. Konkrete Beispiele demonstrierten die praktische Anwendbarkeit dieser Analysesoftware. Die vorgestellte Klassifikation der synthetisch-biologischen und technischen Einheiten soll die Planung zukünftiger Designexperimente vereinfachen und neue Wege für sinnverwandte Bereiche aufzeigen. Es ist nicht die Hauptaufgabe der Bioinformatik, Experimente zu ersetzen, sondern resultierende große Datenmengen sinnvoll und effizient auszuwerten. Daraus sollen neue Ideen für weitere Analysen und alternative Anwendungen gewonnen werden, um fehlerhafte oder falsche Ansätze frühzeitig zu erkennen. Die Bioinformatik bietet moderne, technische Verfahren, um vertraute, aber oft mühsame experimentelle Wege durch neue, vielversprechende Ansätze zur Datenstrukturierung und Auswertung großer Datenmengen zu ergänzen. Neue Sichtweisen werden durch die Erleichterung des Testprozederes gefördert. Die resultierende Zeitersparnis führt zudem zu einer Kostenreduktion.
N2  - The field of Bioinformatics is an interdisciplinary science focusing on the application of computer science to solve problems in different areas of life sciences. Its scope is to handle and interpret an immense quantity of data and to support computer-aided design approaches of synthetic biological experiments. Synthetic biology deals with the generation of new components and biological characteristics created by manipulation of living organisms or parts of them. Of particular interest are two-component systems (TCS). TCS describe simple and important signalling cascades in bacteria which transfer information from the environment into the cell as a reaction to changes in the environment. The present thesis is focused on the assessment, applicability and enhancement of bioinformatical methods in order to facilitate analysis of protein interactions and biological systems. The scientific efforts within the thesis can be divided into three aspects: - Analysis and assessment of bioinformatical methods and enhancement of results from the preceding diploma thesis dealing with protein-protein interaction predictions. - Analysis of general evolutionary modification possibilities within TCS as well as specific differences and design for the identification of a common approach. - Abstraction and transfer of the results to technical and biological contexts in order to simplify synthetic biological design experiments. Establishment of comparable vocabulary for both, technical and biological processes as well as different organisms. The outcome of this thesis revealed that TCS structure is very conserved but that it nevertheless contained some very specific characteristics. New promotor sites were discovered whilst additionally allowing the analysis of the signal binding sites. Missing elements from known TCS could be discovered and a completely new diverged TCS domain in the organism Mycoplasma could be identified as well as three general modification possibilities for TCS. The combination between technological approaches and synthetic biology simplifies the systematic manipulation of TCS or other modular systems. The established two-staged module classification simplifies the analysis of modular processes and thereby the molecular design of synthetical-biological questions. Concrete examples showed the functionality and usefulness of the classification. A freely accessible software GoSynthetic provided easy access and application of the developed toolbox. Not only new concrete scientific findings were provided by the given thesis but also a general approach to identify and analyse TCS and even to create similar analytic procedures. The established classification of biological and technical modules will ease the design of future experiments and reveals new pportunities applicable to similar scientific areas. It is not the task of Bioinformatics to replace experiments but to analyse the resulting huge amounts of data meaningfully and efficiently. Hence, new ideas for further analysis and alternative cases need to be generated which may finally help to identify erroneous approaches earlier. Bioinformatics offers modern technical methods to amend familiar and sometimes exhausting experimental procedures with promising new approaches for data structuring and analysis of immense quantities of data. New perceptions are encouraged and speedier progress is possible without increasing the experimental coasts.
KW  - Biotechnologie
KW  - Synthetische Biologie
KW  - Bioinformatik
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Zweikomponentensystem <Molekularbiologie>
KW  - Zweikomponenten-System
KW  - Pharmazeutische Industrie
KW  - biotechnology
KW  - synthetic biology
KW  - bioinformatic
KW  - two-component system
KW  - vaccinia virus
KW  - gene ontology
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70702
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schülein, Christina
T1  - Die Regulation von Fbw7 durch PI3K-abhängige Phosphorylierung und Charakterisierung eines konditionalen Usp28-Knockout-Mausmodells
T1  - Regulation of Fbw7 by PI3K-dependent phosphorylation and Characterization of a Usp28 conditional knockout mouse
N2  - Das Proto-Onkoprotein Myc ist an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer Vielzahl humaner Tumore entscheidend beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde Serin 227 in Fbw7 als Ziel für eine PI3K-abhängige Phosphorylierung identifiziert. Diese Phosphorylierung führt zur Stabilisierung von Fbw7 und steigert die Fähigkeit von Fbw7, Substratproteine zu ubiquitinieren und abzubauen. Um die Bedeutung von Usp28 in der Myc-induzierten Tumorentstehung und in der normalen Gewebehomöostase zu untersuchen, wurde ein konditionales Knockout-Mausmodell für Usp28 charakterisiert. Mäuse mit einer Keimbahndeletion von Usp28 sind lebensfähig, fertil und phänotypisch unauffällig. Weder in Organen der Usp28-negativen Tiere, noch in entsprechenden murinen embryonalen Fibroblasten kann eine Destabilisierung von Myc festgestellt werden. Allerdings zeigen Fibroblasten mit heterozygotem Usp28-Verlust einen Proliferationsdefekt und in Eμ-Myc-Lymphomen dieses Genotyps werden tendenziell niedrigere Myc-Proteinmengen gefunden. Das tumorfreie Überleben ist bei den Eμ-Myc; Usp28 +/- Tieren verlängert.
N2  - The proto-oncoprotein Myc is involved in the genesis and maintenance of a large fraction of human tumors. In this work, I identified serine 227 in Fbw7 as a target for PI3K-dependent phosphorylation. The phosphorylation leads to stabilization of Fbw7 and enhances its ability to promote ubiquitination and degradation of its substrates. To investigate the role of Usp28 in Myc-dependent tumorigenesis and in tissue homeostasis I characterized a Usp28 conditional knockout mouse model. Mice with a germline deletion of Usp28 are viable, fertile and phenotypically normal. No decrease in Myc protein levels could be detected in organs or embryonic fibroblasts of Usp28- knockout mice. Surprisingly, embryonic fibroblasts with a heterozygous Usp28 deletion showed a proliferative defect and Eμ-Myc lymphomas of this genotype showed a tendency to reduced Myc protein levels, corresponding to a longer tumorfree survival of these animals.
KW  - Myc
KW  - Phosphorylierung
KW  - Ubiquitinierung
KW  - Fbw7
KW  - Usp28
KW  - Deubiquitinierung
KW  - Knockout-Maus
KW  - PI3K
KW  - Fbw7
KW  - Usp28
KW  - deubiquitination
KW  - knockout mouse
KW  - PI3K
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70963
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dippacher, Sonja
T1  - Morphologische und molekularbiologische Untersuchungen zur Bedeutung der Serin-Threonin-Proteinkinase SRPK79D in Drosophila melanogaster
T1  - Morphological and molecular biological investigations on the role of serine threonine kinase SRPK779D in Drosophila melanogaster
N2  - Die intakte Signalübertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsfähige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Veränderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der präsynaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- Färbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser übergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschlüsseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform für eine Affinitätsreinigung eines PB-Antikörpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine für eine Affinitätsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuführen, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer für die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde für die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivität dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu können. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form Ähnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte“ T-bars oder wie zerstörte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell ähnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant häufiger vorkommen und auch einen signifikant höheren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antikörpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten darüber hinaus, dass in den Aggregaten das vollständige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskulärer Synapsen in Drosophila, der vesikuläre Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. Während Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen präsynaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D für die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen ähnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelmäßig zu beobachtenden Vesikel ähneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine dafür typischen Vesikelmarker.
N2  - Intact signal transmission in an animal’s nervous system requires a properly localized and functional synapse between two neurons or between neuron and muscle. This dissertation is part of the investigation of a Drosophila melanogaster mutant which displays alterations in the distribution of a synaptic active zone protein. An important result of the present study is the documentation of an ectopic formation of active zone structural elements in this mutant. Analyses carried out in the laboratories of E. Buchner and S. Sigrist contributed to the characterization of the protein Bruchpilot (BRP), a constituent of the T-bar, the characteristic presynaptic ribbon in Drosophila. Searching for interaction partners of BRP, a serine-arginine-protein specific kinase was identified that apparently regulates T-bar assembly (Nieratschker et al., 2009). There are four kinase isoforms. Knocking out two of these isoforms (SRPK79D-RB and -RE) results in accumulations of BRP-immunoreactive aggregates in the larval ventral nerves (Nieratschker, 2008). Further studies were designed to identify the function and molecular signalling pathways of the kinase SRPK79D. One objective of the present experiments was to produce purified PB-protein in order to enable affinity-purification of an antibody against this isoform of the kinase for subsequent specific immunohistochemical localization analyses. Although production of the antigen was successful, the amount of protein produced was too low to allow efficient affinity purification. An attempt to show the expression pattern of the kinase in Drosophila embryos with in-situ hybridization resulted in production of a SRPK79D specific RNAprobe, however, the probe sensitivity was not high enough to yield conclusive results for mRNA localization. Ultrastructural analyses of the BRP-ir aggregates in the larval ventral nerves, on the other hand, yielded definite and conclusive results. These aggregates corresponded to extensive intraaxonal electron-dense, ribbon-like structures surrounded by vesicles. These electron-dense structures were differently shaped and resembled accumulations of regularly shaped, clotted or dysmorphic T-bars, which in subsequent immuno-electronmicroscopic analyses carried out by another investigator were proven to contain BRP (Nieratschker et al., 2009). An important result of the present study was the observation that similar intraaxonal aggregates were occasionally also present in wild type nerves, however, the aggregates found in the mutants were significantly more frequent and of significantly larger size than those observed in wild-type larvae. Moreover, double-immunostaining using BRP-antibodies recognizing specifically the C- and the N-terminal part of the protein, respectively, provided evidence that the complete BRP protein is localized in the aggregates. Since electron microscopy had showed that numerous vesicles were associated with the electron dense aggregates, we tested whether the vesicular glutamate transporter (DVGlut), a marker protein for synaptic vesicles of motoneurons in Drosophila, could be localized in BRP-ir aggregates. While colocalization of BRP and DVGlut was observed at the presynaptic active zones, no colocalization of the synaptic vesicle marker was observed in the BRP-ir aggregates in the larval nerves. In conclusion, the results provide evidence that the kinase SRPK79D is required for the prevention of ectopic formation of BRP-containing ribbon-like structures in larval ventral nerves. These structures include vesicles resembling synaptic vesicles, which however do not display immunoreactivity for a typical synaptic vesicle marker protein.
KW  - Bruchpilot
KW  - BRP
KW  - Serin-Threonin-Kinase
KW  - SR-Protein Kinase
KW  - aktive Zone
KW  - Cytomatrix der aktiven Zone
KW  - Elektronenmikroskopie
KW  - Ultrastruktur
KW  - Bruchpilot
KW  - SR-Protein Kinase
KW  - aktive Zone
KW  - Cytomatrix der aktiven Zone
KW  - Ultrastruktur
KW  - Bruchpilot
KW  - synaptic active zone cytomatrix
KW  - SR protein kinase
KW  - ultrastructure
KW  - electron microscopy
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70937
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schramm, Sabine
T1  - SYCE3, ein neues Synaptonemalkomplexprotein: Expression, funktionelle Analyse und Bindungspartner
T1  - SYCE3, a novel synaptonemal complex protein:Expression, functional analysis and binding partners
N2  - Der Synaptonemalkomplex ist eine evolutionär hoch konservierte Struktur. Er wird spezifisch während der Prophase I der Meiose ausgebildet und ist essentiell für die Segregation der homologen Chromosomen während der Meiose und auch für die Entstehung genetischer Vielfalt. Der Synaptonemalkomplex ist eine proteinöse Struktur, deren Aufbau dem einer Leiter ähnelt. Dabei werden die Leiterholme als Lateralelemente bezeichnet. Sie bestehen unter anderem aus den Proteinen SYCP2 und SYCP3 und assoziieren mit dem Chromatin der homologen Chromosomen. Die Stufen der Leiter bestehen hingegen aus Transversalfilamenten, deren Hauptkomponente parallele Homodimere des meiosespezifische Proteins SYCP1 sind. Dabei wird ein SYCP1 Dimer mit seinem C-Terminus in den Lateralelementen verankert und kann über seine N-terminale Domäne eine schwache Interaktion mit der N-terminalen Domäne eines gegenüberliegenden SYCP1 Dimers eingehen. Um diese Bindung zu stabilisieren werden Proteine des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes benötigt: Während SYCE1 durch seine Interaktion mit SYCP1 die N-terminale Assoziation zweier gegenüberliegender SYCP1 Dimere stabilisiert, verknüpfen die zwei anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE2 und Tex12 lateral benachbarte SYCP1 Filamente und breiten so das SYCP1 Netzwerk entlang der chromosomalen Achsen aus. Dieser Prozess wird als Synapse bezeichnet und stellt eines der Schlüsselereignisse der Meiose dar. Fehler während dieses Prozesses führen meist zu Aneuploidie der entstehenden Gameten oder zum Abbruch der Meiose und somit zu Infertilität des betroffenen Organismus. In dieser Arbeit wurde mit SYCE3 ein neues Protein des murinen Synaptonemalkomplexes charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass SYCE3 meiosespezifisch in Männchen und Weibchen exprimiert wird und Bestandteil des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ist. Hierbei zeigt es dasselbe Verteilungsmuster wie SYCP1 und SYCE1 und kann mit beiden Proteinen interagieren. Eine zusätzliche Interaktion konnte zwischen SYCE3 und SYCE2 nachgewiesen werden. Durch Untersuchungen an entsprechenden Knockout Mausmodellen konnte in dieser Arbeit außerdem gezeigt werden, dass SYCE3 in Abwesenheit von SYCP1 nicht an die chromosomalen Achsen rekrutiert werden kann. Die Ausbildung der Lateralelemente und auch die Anwesenheit der anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE1 und SYCE2 sind hingegen für die Anlagerung von SYCE3 an die chromosomalen Achsen nicht essentiell. Somit steht SYCE3 hinsichtlich seiner Bedeutung für die Paarung und die Synapse der homologen Chromosomen hierarchisch offenbar über den bisher beschriebenen Zentralelementproteinen SYCE1, SYCE2 und Tex12. Die funktionelle Bedeutung von SYCE3 für die Synapse der homologen Chromosomen und für den korrekten Ablauf der homologen Rekombination wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Herstellung und die Charakterisierung einer Syce3-/- Maus detailliert untersucht: Dabei führte der Knockout von SYCE3 zur Infertilität in beiden Geschlechtern, die gleichzeitig mit einer signifikanten Reduktion der Größe der entsprechenden Hoden und Ovarien im Vergleich zum Wildtyp einherging. Weitere Untersuchungen ergaben zudem, dass es in Syce3 defizienten Tieren zu einem Abbruch der Meiose kommt. Dabei hatte das Fehlen von SYCE3 keinen Einfluss auf die Ausbildung der Axialelemente. Die Initiation der Synapse hingegen war sowohl in Oocyten als auch in Spermatocyten in Abwesenheit von SYCE3 stark gestört. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass das Fehlen von SYCE3 Einfluss auf die homologe Rekombination nimmt: Zwar können sich frühe (DNA Doppelstrangbrüche) und intermediäre (Transitionsknoten) Rekombinationsereignisse in der Abwesenheit von SYCE3 ausbilden, die Prozessierung zu späten Rekombinationsstrukturen (Rekombinationsknoten) und die damit einhergehende Ausbildung von Crossing-over Strukturen fand jedoch nicht statt. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das neue Synaptonemalkomplexprotein SYCE3 essentiell für die Fertilität von Mäusen ist. Durch den Knockout von Syce3 kann die Synapse zwischen den Homoligen nicht initiiert werden und es findet kein Crossing-over statt. Im Assembly Prozess des Synaptonemalkomplexes agiert SYCE3 oberhalb der anderen zentralelementspezifischen Proteine und unterhalb von SYCP1.
N2  - The synaptonemal complex is an evolutionary highly conserved structure. It assembles specifically during prophase I of meiosis and is essential for the segregation of homologous chromosomes and thus represents a major determinant of the genetic diversity of sexually reproducing organisms. The synaptonemal complex is a proteinacious, ladder-like structure. The ladder beams are termed lateral elements and are composed of the meiosis-specific proteins SYCP2 and SYCP3 which are associated with the chromatin of the homologs. The rungs are made up of transverse filaments mainly consisting of the meiosis-specific protein SYCP1. SYCP1 forms parallel homodimers that are anchored via their C-termini to the lateral elements and interact in a head-to-head fashion with an opposing SYCP1 homodimer. For stabilizing this interaction additional proteins are essential. These are components of the so-called central element of the synaptonemal complex: while SYCE1 stabilizes the N-terminal association of opposing SYCP1 homodimers, the two other central element specific proteins SYCE2 and Tex12 connect adjoined SYCP1 filaments and thus elongate the SYCP1 network along the homologs. This process is termed synapsis and is a key feature of meiosis. Errors occurring during this process frequently lead to aneuploidy of the resulting gametes or cause meiotic arrest and infertility. Within the scope of this study a novel protein of the murine synaptonemal complex, we named SYCE3, was characterized. SYCE3 is exclusively expressed during male and female meiosis and is a component of the central element. Its expression pattern resembles that of SYCP1 and SYCE1 and it is able to interact with both of these proteins. Additionally, an interaction between SYCE3 and SYCE2 could be verified. In the context of this dissertation it was found that loading of SYCE3 to the chromosomal axis requires SYCP1. In contrast, chromosome loading of SYCE3 was independent of lateral element assembly and of the presence of the other central element specific proteins, SYCE1, SYCE2 and Tex12. The second thematic complex addressed in this thesis was the relevance of SYCE3 for synapsis and homologous recombination. To this end a Syce3-/- mouse was generated. Syce3-/- mice are infertile and both testes and ovaries are characterized by a significant reduction in size compared to wild-type littermates. Furthermore, depletion of SYCE3 had no influence on the assembly of axial elements and in males alignment of homologs was not affected. However, Syce3-/- oocytes and spermatocytes were unable to initiate synapsis between homologous chromosomes. In addition, homologous recombination was analyzed in the scope of this study and the obtained data strongly points to a central role of SYCE3 during this process: while early (DNA double-strand breaks) and intermediate (transition nodules) recombination events could take place in the absence of SYCE3, structures indicating late recombination events (recombination nodules) and sites of homologous recombination (crossovers) failed to develop. Taken together, this thesis clearly demonstrates that the novel synaptonemal complex protein SYCE3 is essential for fertility in mice. Deletion of Syce3 blocks initiation of synapsis and formation of crossovers. During synaptonemal complex assembly, SYCE3 acts downstream of SYCP1, but upstream of other central element proteins (SYCE1, SYCE2 and Tex12).
KW  - Meiose
KW  - Molekularbiologie
KW  - Fertilität
KW  - Synaptonemalkomplex
KW  - Meiosis
KW  - Synaptonemal complex
KW  - fertility
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70903
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wende, Elisabeth Sophie
T1  - Untersuchungen zur Rolle der melanominduzierenden Rezeptortyrosinkinase Xmrk bei der Migration melanozytärer Zellen
T1  - A role for the melanoma-inducing receptor tyrosine kinase Xmrk in the migration of melanocytic cells
N2  - Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalitätsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieansätze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist amöboid und unabhängig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden möglicherweise einen Proteinkomplex, der für FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform für die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen.
N2  - Malignant melanoma is a tumor of the skin with increasing incidence and high mortality rates. As the biomolecular events underlying melanoma development are poorly understood, specific therapeutics for this disease are few. The Xiphophorus system is suitable for studying melanoma development. In this model, presence of the RTK Xmrk is sufficient to initiate melanoma formation by activating proliferative and anti-apoptotic pathways and interfering with differentiation. This work demonstrates that Xmrk is also able to induce migration of the melanocytic cell line Melan a-Hm. Cells transformed by Xmrk migrate in amoeboid fashion, independently of MAPK or PI3K pathways. However, kinases FAK and Fyn are involved in Melan a-Hm migration, possibly as a signal-integrating protein complex similar to the role that has been described for FAK and Src in various systems. The results from this work serve to extend the Xiphophorus model to other aspects of melanoma development and may help to better understand the molecular basis of melanoma.
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - Melanom
KW  - Zellmigration
KW  - Src-Proteine
KW  - Xiphophorus
KW  - fokale Adhäsionskinase (FAK)
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70945
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TY  - THES
A1  - Schriefer, Eva-Maria
T1  - Molekulare und biochemische Charakterisierung der β-Laktamasen von Yersinia enterocolitica und deren Sekretionsverhalten
T1  - Molecular and biochemical characterization of β-lactamases in Yersinia enterocolitica and their secretion behaviour
N2  - In dieser Arbeit wurden zwei Aspekte der Yersinia β-Laktamasen bearbeitet: (1) Charakterisierung der β-Laktamasen hinsichtlich β-Laktam-Antibiotikaresistenz, Sekretion und Thermostabilität. (2) Untersuchung der Sekretionsfähigkeit von verschiedenen thermostabilen β Laktamasen über das Yersinia T3SS. Im ersten Teil wurden β Laktamase-Deletionsmutanten im Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm WA-314 hergestellt, um den Einfluss der chromosomalen β Laktamasen auf die in vitro-Resistenz zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass WA-314 konstitutiv BlaA produziert und BlaA somit – unter nicht-induzierbaren Bedingungen – der dominante Faktor in der in vitro-Resistenz gegenüber Penicillinen mit erweitertem Wirkungsspektrum (z.B. Ampicillin) und Cephalosporinen der 1. Generation (z.B. Cefazolin) ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die zweite chromosomale β Laktamase AmpC (BlaB) unter Zugabe von subinhibitorischen Konzentrationen von Imipenem stark induziert wird. Keine der β Laktamasen ist in der Lage, in vitro-Resistenz gegenüber Carbapenemen und Monobactamen zu vermitteln. Die Konstruktion und Bestimmung der in vitro Antibiotika-Empfindlichkeit der β Laktamase-Deletionsmutanten dient als Grundlage für nachfolgende Untersuchungen im Mausinfektionsmodell. Weiterhin wurden die Transporteigenschaften beider β Laktamasen untersucht. In Gram-negativen Bakterien sind reife β Laktamasen im Periplasma lokalisiert und müssen somit nach der Synthese im Cytosol über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Bis auf drei Ausnahmen (β Laktamasen aus Mycobacterium smegmatis, M. tuberculosis und Stenotrophomonas maltophila) sind bisher nur Sec-abhängige β Laktamasen beschrieben worden. Mittels Fusionsproteinen bestehend aus β Laktamase-Signalpeptiden und GFP konnte in dieser Arbeit eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei Yersinia BlaA um ein Tat-Substrat handelt, bei Yersinia AmpC hingegen um ein Sec-Substrat. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine Tat-abhängige β Laktamase bei einer Bakterienart aus der Familie der Enterobacteriaceae nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die β Laktamase BlaA nicht diffus im Periplasma, sondern auf bestimmte Bereiche im Periplasma lokalisiert verteilt ist. Allerdings konnte die Art der Lokalisierung bisher nicht genau spezifiziert werden. Die cytosolische Faltung und die Tat-abhängige Translokation von BlaA lassen vermuten, dass eine besondere Thermostabilität von BlaA vorliegt. Deshalb wurde das BlaA-Enzym hinsichtlich seiner Thermostabilität und temperaturabhängigen enzymatischen Aktivität untersucht. Im Vergleich zur E. coli β Laktamase TEM-1 und der hitzestabilen TEM-1-Variante MEGA zeigte BlaA eine erhöhte Thermostabilität und einen starken Anstieg der Aktivität in einem Temperaturbereich zwischen 30 °C und 45 °C. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob die charakterisierten Yersinia β Laktamasen als Reporterkonstrukte zur Untersuchung des Typ III Sekretionssystems (T3SS) geeignet sind. Y. enterocolitica besitzt ein pYV Virulenzplasmid, auf dem der vollständige Satz der Gene für das Ysc-T3SS und die Effektor-Yops (Yersinia outer protein) lokalisiert sind. Injektion der Yops in eukaryotische Zielzellen ermöglicht das extrazelluläre Überleben der Yersinien im Wirtsorganismus. Bei YopE handelt es sich um ein gut charakterisiertes Effektor-Yop, dessen N Terminus fusioniert an den reifen Teil der β Laktamase TEM-1 bereits vielfach als Reporterkonstrukt eingesetzt wurde. Unter Verwendung des fluoreszierenden β Laktamase-Substrats CCF4-AM kann die Translokation von YopEi-TEM-1 in Zielzellen in Zellkultur-Experimenten und im Mausinfektionsmodell visualisiert werden. In dieser Arbeit sollte deshalb die T3SS-Sekretionsfähigkeit von YopE-β Laktamase-Fusionsproteinen in Abhängigkeit von der „Schmelztemperatur“ (temperaturabhängige Stabilität, TM) untersucht werden. Yop-Substrate werden im ungefalteten Zustand (YscN wirkt dabei vermutlich als ATP-abhängige „Unfoldase“) über das Ysc-„Injektisom“ transloziert. YopEi-TEM-1 wird effizient sekretiert und transloziert (TM (TEM-1) = 50,8 °C). YopE-Fusionsproteine mit thermostabilen TEM-1 Varianten, YopEi-RLT bzw. YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60,4 °C; TM (MEGA) = 69,2 °C) werden hingegen nur schwach bzw. nicht sekretiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Sec-abhängige β Laktamase AmpC als YopE-Fusionsprotein (YopEi-AmpC) effizient T3SS-abhängig sekretiert und transloziert werden kann; das native Tat-Substrat BlaA (YopEi-BlaA) kann jedoch weder sekretiert noch transloziert wird. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die ATPase YscN nicht in der Lage ist, BlaA und die thermostabilen TEM-1-Varianten zu entfalten und über das T3SS zu sekretieren und zu translozieren. RLT und MEGA können hingegen mithilfe ihrer nativen Signalsequenz über das Sec-System (und somit im ungefalteten Zustand) transloziert werden.
N2  - In this work, two aspects concerning the Yersinia β lactamases have been processed: (1) Characterization of the β lactamases in regard of β lactam antibiotic resistance, secretion and thermostability. (2) Analysis of the secretability of different thermostable β lactamases via the Yersinia T3SS. In the first part of this work we described the β lactam sensitivity pattern of the highly mouse pathogenic Y. enterocolitica strain WA 314 by creating a set of β lactamase deletion mutants and their subsequent characterization in vitro. In accordance to previous studies on biovar 1B, serovar O:8 strains, WA 314 produces both enzymes BlaA and AmpC (BlaB) and latter one is inducible using subinhibitory concentrations of imipenem. BlaA is dominant in providing in vitro-resistance towards extended-spectrum β lactams (e.g. ampicillin) and 1st generation cephalosporins (e.g. cefazolin). None of the β lactamases is able to mediate in vitro-resistance towards carbapenems and monobactams. The construction of β lactamase deletion mutants and their in vitro-characterization is the basis for their subsequent analysis within a murine infection model. Furthermore, we investigated the export mechanism of both β lactamases. In Gram-negative bacteria β lactamases are localized in the periplasmic space to be able to cleave the amide bond of the β lactam ring resulting in inactivation of the antibiotic. Proteins are translocated across the inner membrane either via the general secretory pathway (Sec system) or via the twin arginine pathway (Tat system). To date, only three β lactamases have been described as Tat-dependently translocated namely BlaC from Mycobacterium tuberculosis, BlaS from M. smegmatis and L2 from the plant pathogen Stenotrophomonas maltophila. In silico studies and experimental approaches lead to the assumption that the majority of β lactamases is translocated in a Sec-dependent manner. Analysis of β lactamase signal sequence-GFP fusion proteins revealed that Yersinia AmpC is a Sec-substrate whereas Yersinia BlaA is a Tat-substrate. Thus, BlaA of Y. enterocolitica is the first reported β lactamase within the family of Enterobacteriaceae which is secreted by the Tat system. Interestingly, closely related blaA genes are widely distributed within all Y. enterocolitica biovars and several environmental Yersinia species. It is generally accepted that Tat-dependent substrates rapidly fold in the cytoplasma. To compare the BlaA protein stability with that of the Sec-dependent β-lactamases of the TEM-1 family we determined thermal unfolding transitions and temperature dependent enzymatic activities. In contrast to TEM-1 β lactamase, BlaA shows an entire different activity profile with steep increase of activity in the temperature range of 30 °C to 45 °C and steep decrease between 50 °C to 60 °C. In the second part, the Yersinia β lactamases AmpC and BlaA characterized in this work were tested for suitablility as reporter constructs for analyzing the Ysc-T3SS. Y. enterocolitica harbors a pYV virulence plasmid which encodes genes for components of the Ysc-T3SS secretion machinery and the effector Yops (Yersinia outer protein). Injection of Yops into the eukaryotic host cell enables the extracellular survival of Yersinia within the host organism. YopE is a well described effector Yop and YopE-β lactamase (TEM-1) fusion proteins have been successfully applied to analyze translocation of YopE in cell culture experiments and in the murine mouse infection model by using the fluorescent β lactamase substrate CCF4-AM. In this work, we aimed to analyze the T3SS-dependent secretability of YopE-β-lactamase fusion proteins in dependency on the melting temperature (temperature dependent stability, TM). It has been described that Yop substrates are translocated in an unfolded conformation via the Ysc-“injectisom” (YscN has been discussed as an ATP-dependent unfoldase). YopEi-TEM-1 is efficiently secreted and translocated (TM (TEM-1) = 50.8 °C). However, YopE fusion proteins with heat stable TEM-1 variants, YopEi-RLT and YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60.4 °C; TM (MEGA) = 69.2 °C), were weakly secreted or secretion is completely abolished, respectively. Furthermore we could show that a YopE fusion protein with the Sec-dependent β lactamase AmpC (YopEi-AmpC) is efficiently secreted and translocated via the T3SS. In contrast, the Tat-dependent β lactamase BlaA (YopEi-BlaA) can neither be secreted nor translocated T3SS-dependently. A putative explanation for that observation would be that the ATPase YscN is unable to unfold BlaA and the heat stable TEM-1 variants and therefore secretion and translocation is prevented. Interestingly, native RLT and MEGA β lactamases can be translocated in an unfolded conformation via the Sec system.
KW  - Yersinia enterocolitica
KW  - Lactamase <beta->
KW  - Typ III Sekretionssystem
KW  - Yersinia enterocolitica
KW  - beta-lactamase
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69580
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TY  - THES
A1  - Keidel, Kristina
T1  - Charakterisierung des Hfq-Regulons in Bordetella pertussis und Bordetella bronchiseptica
T1  - Characterisation of the Hfq regulon in Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica
N2  - Bordetellen sind Gram-negative Kokkobazillen, die phylogenetisch zu den β-Proteobakterien zählen und in der Familie der Alcaligenaceae eingeordnet sind. Der bedeutendste Vertreter der Gattung, die nach heutigem Kenntnisstand neun Arten umfasst, ist Bordetella pertussis, der Erreger des Keuchhustens. Der Keim ist obligat humanpathogen und besitzt zahlreiche Virulenzfaktoren, um die Epithelzellen des Respirationstraktes zu besiedeln und zu zerstören, wodurch es zu dem charakteristischen Krankheitsverlauf kommt. Neben B. pertussis werden noch B. bronchiseptica und B. parapertussis dem sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zugeteilt. Alle Vertreter des B. bronchiseptica-Clusters sind in der Lage, bei verschiedenen Wirtsspezies respiratorische Erkrankungen mit unterschiedlichem Schweregrad auszulösen. Dabei weist B. bronchiseptica ein breiteres Wirtsspektrum auf und kann Atemwegserkrankungen in einer Vielzahl von Säugetieren auslösen, wohingegen B. parapertussis vornehmlich Schafe und Menschen infiziert und bei letzteren eine schwächere Form des Keuchhustens bewirkt. Das Hfq-Protein wurde ursprünglich als Wirtsfaktor identifiziert, welcher für die Replikation des RNA-Phagen Qβ in Escherichia coli benötigt wird (host factor for Qβ oder HF-1). Es ist in Struktur und Funktion homolog zu den Sm-Proteinen aus Eukaryoten, die am Splicing von mRNAs involviert sind. Die Beteiligung des Hfq-Proteins an regulatorischen Vorgängen, die durch kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) vermittelt werden, wurde erstmals in einer Studie zum Mechanismus der rpoS-Regulation durch die kleine regulatorische RNA OxyS ersichtlich. Seitdem konnte für eine Vielzahl an sRNAs gezeigt werden, dass sie an Hfq gebunden vorliegen und die Hilfe des Proteins bei der post-transkriptionellen Kontrolle ihrer Ziel-mRNAs benötigen. In dieser Hinsicht übernimmt Hfq die Rolle eines RNA-Chaperons, indem es trans-kodierte sRNAs stabilisiert und die Basenpaarung mit ihren Ziel-mRNAs fördert. Dabei beeinflusst die Bindung der sRNA-Regulatoren an ihre Ziel-mRNAs deren Translation, sowohl aktivierend als auch inhibierend. Bislang wurden Hfq-Homologe in der Hälfte aller sequenzierten Gram-positiven und Gram-negativen Bakterienarten gefunden. Eine BLAST-Analyse ergab, dass B. pertussis und B. bronchiseptica Homologe zum Hfq-Protein aufweisen und diese in der veröffentlichten Genomsequenz bereits als Hfq-Protein annotiert sind. Fokus dieser Arbeit war weitestgehend, die Funktion des Hfq-Proteins in B. pertussis und vergleichend in B. bronchiseptica zu charakterisieren. Mittels Primer Extension-Analyse konnte zunächst der Startpunkt des hfq-Transkripts in B. pertussis und B. bronchiseptica unter logarithmischen Wachstumsbedingungen bestimmt werden. Dieser Startpunkt war zudem unter stationären Wachstumsbedingungen und nach Hitzestress aktiv, was in Diskrepanz zur Beobachtung in E. coli steht. Ferner konnte festgestellt werden, dass die hfq-Transkription nach Induktion verschiedener Stressformen in beiden Organismen erhöht war. Nach Generierung der jeweiligen Δhfq-Mutanten in beiden Organismen wurden diese charakterisiert. Die B. pertussis Δhfq-Mutante zeigte ein deutliches Wachstumsdefizit gegenüber dem Wildtyp, im Gegensatz zu B. bronchiseptica Δhfq, die sich im Wachstum wie der Wildtyp verhielt. Beide Mutanten zeigten sich sensitiver gegenüber H2O2-Stress als der Wildtyp, nicht jedoch gegenüber weiteren oxidativen Stressbedingungen oder Membranstress induzierenden Substanzen. Die Δhfq-Mutante in B. pertussis war zudem in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt, was jedoch nicht für B. bronchiseptica Δhfq galt. Da Hfq an sRNA-mRNA-Interaktionen, welche die Translation der mRNAs beeinflussen, beteiligt ist, sollte über 2D-Gelelektrophorese das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica bestimmt werden. Auffällig war, dass viele periplasmatische Transport-bindeproteine von der Δhfq-Mutation betroffen waren. Es zeigten sich aber auch Stoffwechselenzyme und wichtige Housekeeping-Faktoren, wie z. B. der Elongationsfaktor EF-Tu und das Chaperon GroEL, in der Δhfq-Mutante dereguliert. Generell scheint das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica nur einen kleinen Teil des gesamten Proteoms auszumachen. Zudem ist das Hfq-regulierte Proteom variabel zwischen verschiedenen Wachstumsbedingungen, aber auch zwischen den beiden Organismen trotz der engen Verwandtschaft. Die Expression ausgewählter Virulenzfaktoren zeigte keinen Unterschied zwischen Δhfq-Mutante und B. pertussis-Wildtyp.
N2  - Bordetellae are Gram-negative coccobacilli phylogenetically belonging to the β-group of proteobacteria and therein to the family of Alcaligenaceae. The most prominent member of the genus comprising nine species so far is Bordetella pertussis, the etiological agent of whooping cough. This organism is an obligatory human pathogen and expresses a variety of virulence factors in order to colonize and destroy the epithelial cells of the respiratory tract causing the characteristic symptoms of the disease. In addition to B. pertussis, B. bronchiseptica and B. parapertussis are assigned to the so-called B. bronchiseptica-cluster. All members of the B. bronchiseptica-cluster have the ability to cause respiratory symptoms with varying severity. B. bronchiseptica exhibits a broad host range causing respiratory symptoms in a variety of mammals, whereas B. parapertussis infects sheep and humans causing a milder form of whooping cough in the latter. The Hfq protein was originally identified as a host factor necessary for the replication of the RNA-phage Qβ in Escherichia coli (host factor for Qβ or HF-1). It is functionally and structurally homologous to Sm-proteins involved in splicing of mRNAs in eukaryotes. The involvement of Hfq in regulatory processes caused by small non-coding RNAs (sRNAs) was first recognized in a study on the mechanism of rpoS-regulation by the small regulatory RNA OxyS. Since then a variety of sRNAs were shown to be bound to Hfq and require its help for post-transcriptional control of their target-mRNAs. In this regard, Hfq functions as an RNA-chaperone by stabilizing trans-encoded sRNAs and their basepairing to target-mRNAs. Binding of the sRNA-regulators to their target-mRNAs thereby either activates or inhibits their translation. To date Hfq homologues were identified in half of all sequenced Gram-positive and Gram-negative bacterial species. BLAST analysis revealed that B. pertussis and B. bronchiseptica possess an Hfq homologue which has already been annotated as such in the published genome sequence. The main focus of this work was to characterize the function of the Hfq protein in B. pertussis as well as in B. bronchiseptica. By primer extension analysis we could identify the start of the hfq-transcript in B. pertussis and B. bronchiseptica under logarithmic growth conditions. This transcriptional start site was also active under stationary growth conditions and after heat shock which is discrepant from the observations in E. coli. Furthermore, it could be shown that the hfq-transcription was elevated in both B. pertussis and B. bronchiseptica under various stress conditions. Δhfq-mutants were established and characterized in both organisms. The Δhfq-mutant of B. pertussis exhibited a pronounced growth deficit in comparison to the wildtype whereas the Δhfq-mutant of B. bronchiseptica showed the same growth properties as the wildtype. Both Δhfq-mutants expressed a higher sensitivity to stress caused by H2O2 compared to the wildtype. However, there was no increased sensitivity of the Δhfq-mutants to other oxidative stress agents or membrane stress inducing agents. Furthermore, the Δhfq-mutant of B. pertussis but not the Δhfq-mutant of B. bronchiseptica was impaired in its ability to form biofilms. Since Hfq is involved in sRNA-mRNA-interactions affecting the efficient translation of mRNAs, the Hfq-regulated proteome of B. pertussis and B. bronchiseptica was determined by 2D-gelelectrophoresis. Strikingly, a variety of periplasmic binding proteins involved in transport were affected by the Δhfq-mutation. In addition, enzymes of various metabolic pathways and important housekeeping factors, such as elongation factor EF-Tu and the protein chaperone GroEL, were deregulated in the Δhfq-mutant. The Hfq-regulated proteome comprises generally only a small part of the complete proteome in B. pertussis and B. bronchiseptica. Furthermore, this Hfq-regulated proteome differs between certain growth conditions as well as between the two closely related organisms. No difference could be observed in the expression of selected virulence factors between B. pertussis Δhfq and wildtype.
KW  - Bordetella pertussis
KW  - Bordetella bronchiseptica
KW  - Regulon
KW  - Hfq
KW  - Bordetella pertussis
KW  - Bordetella bronchiseptica
KW  - regulon
KW  - Hfq
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66677
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TY  - THES
A1  - Azzami, Klara
T1  - Antibakterielle und antivirale Abwehrreaktionen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Honigbiene (Apis mellifera)
T1  - Antibacterial and antiviral defence reactions in different developmental stages of the honey bee (Apis mellifera)
N2  - Das angeborene Immunsystem von Insekten besteht aus einer humoralen Komponente, einer zellulären Komponente und dem Prophenoloxidase-aktivierenden System. Fast alle Erkenntnisse über das angeborene Immunsystem stammen von Arbeiten mit Modellorganismen wie z.B. Drosophila oder Anopheles gambiae. Wie genau das Immunsystem der Honigbiene (Apis mellifera) funktioniert, ist jedoch noch relativ unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die unterschiedlichen Immunreaktionen aller drei Entwicklungsstadien der Honigbiene nach artifizieller Infektion mit Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien (Escherichia coli und Micrococcus flavus) und dem Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) untersucht und verglichen. Eine E. coli-Injektion zeigt bei Larven und adulten Arbeiterinnen nur wenig Auswirkung auf das äußere Erscheinungsbild und die Überlebensrate. In beiden Entwicklungsstadien wird die humorale Immunantwort stark induziert, erkennbar an der Expression der antimikrobiellen Peptide (AMPs) Hymenoptaecin, Defensin1 und Abaecin. Zusätzlich werden allein in Jungbienen nach bakterieller Infektion vier weitere immunspezifische Proteine exprimiert. Unter anderem eine Carboxylesterase (CE1) und das Immune-Responsive Protein 30 (IRp30). Die Expression von CE1 und IRp30 zeigt dabei den gleichen zeitlichen Verlauf wie die der AMPs. In Jungbienen kommt es zudem nach E. coli-Injektion zu einer raschen Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe, was auf eine Aktivierung der zellulären Immunantwort schließen lässt. Ältere Bienen und Winterbienen zeigen eine stärkere Immunkompetenz als Jungbienen. Selbst nicht-infizierte Winterbienen exprimieren geringe Mengen der immunspezifischen Proteine IRp30 und CE1. Die Expression von IRp30 kann dabei durch Verwundung oder Injektion von E. coli noch gesteigert werden. Eine weitere Besonderheit ist die im Vergleich zu Jungbienen raschere Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe bis hin zur vollständigen Eliminierung. Die Reaktion von Puppen auf eine bakterielle Infektion war völlig unerwartet. Nach Injektion von E. coli-Zellen kommt es innerhalb von 24 h p.i. zu einem tödlichen Kollaps, der sich in einer Graufärbung des gesamten Puppenkörpers äußert. Da keine Expression von AMPs nachzuweisen war, wird die humorale Immunantwort offensichtlich nicht induziert. Auch die zelluläre Immunantwort scheint nicht aktiviert zu werden, denn es konnte keine Abnahme an lebenden E. coli-Zellen beobachtet werden. Aufgrund dieser fehlenden Immunreaktionen vermehrt sich E. coli im Hämocoel infizierter Puppen und scheint damit deren Tod herbeizuführen. Nach viraler Infektion wurden in allen drei Entwicklungsstadien der Honigbiene gänzlich andere Reaktionen beobachtet als nach bakterieller Infektion. Bei dem verwendeten Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) handelt es sich um ein Picorna-ähnliches Virus, dessen Vermehrung in der Hämolymphe über die massive Synthese der Capsidproteine verfolgt werden kann. Eine Injektion von sehr wenigen ABPV-Partikeln ins Hämocoel hat dramatische Auswirkungen auf Larven. Nach Virusinjektion kommt es innerhalb weniger Stunden zu einer raschen Virusvermehrung und schon 24 h p.i. zum Tod, häufig begleitet von einer Schwarzfärbung der gesamten Larve. Kurz vor dem Ableben kommt es neben dem Abbau hochmolekularer Speicherproteine zur Expression zahlreicher Proteine, die u.a. an der Translation oder dem Schutz vor oxidativem Stress beteiligt sind. Auf Jungbienen hat eine ABPV-Infektion keine so dramatischen Auswirkungen wie auf Larven. Sie zeigen lediglich Zeichen von Paralyse, zudem überleben sie länger bei höheren injizierten Partikelzahlen, die Virusvermehrung ist langsamer und es kommt zu keiner starken Veränderung des Hämolymph-Proteinmusters. Es konnte gezeigt werden, dass es in ABPV-infizierten Larven oder adulten Bienen zu keiner erkennbaren Aktivierung des humoralen Immunsystems in Form von exprimierten AMPs kommt. Zudem scheint die humorale Immunantwort auch nicht unterdrückt zu werden, denn nach gleichzeitiger Injektion von E. coli und ABPV kommt es neben der Expression viraler Capsidproteine auch zur Expression von AMPs. Zusätzlich konnte in Jungbienen nach Infektion mit ABPV eine zelluläre Immunantwort in Form von Nodulation ausgeschlossen werden. Ältere Bienen scheinen nicht nur mit bakteriellen Infektionen, sondern auch mit einer ABPV-Infektion besser zurechtzukommen. Bei einer Menge an ABPV-Partikeln, die in Jungbienen spätestens 72 h p.i. zum Tod führt, ist in Winterbienen eine Virusvermehrung erst ab 96 h p.i. erkennbar und diese beeinträchtigt die Überlebensrate kaum. Puppen sind einer Virusinfektion genauso schutzlos ausgeliefert wie einer Bakterieninfektion. Es kommt zwar zu keiner starken Änderung des äußeren Erscheinungsbildes, jedoch bleiben Puppen in ihrer Entwicklung komplett stehen. Das Virus muss sich daher stark vermehren, allerdings nicht überwiegend - wie bei Larven und adulten Bienen - in der Hämolymphe.
N2  - The innate immune system of insects comprises of a humoral component, a cellular component and the prophenoloxidase-activating system. Almost all knowledge about the innate immune system derives from model organisms like Drosophila or Anopheles gambiae. The exact mechanisms of the innate immune system of the honey bee (Apis mellifera) have yet to be discovered. This work investigates and compares the immune reactions of all three developmental stages of the honey bee after artificial infection with Gram-negative (Escherichia coli) and the Acute bee paralysis virus (ABPV). After injection of E. coli neither a change in the outer appearance nor a significant reduction of the survival rate of larvae or adult worker bees can be observed. In both developmental stages, a strong induction of the humoral immune response visible by the expression of the antimicrobial peptides (AMPs) hymenoptaecin, defensin1 and abaecin occurs. However, bacterial challenge of young adult worker bees leads to the expression of additional immune-specific proteins: a carboxylesterase (CE1) and the immune-responsive protein (IRp30). The expressions of CE1 and IRp30 show the same time course as the expression of AMPs. Furthermore, after injection of E. coli-cells into the haemocoel of young adult worker bees a fast decrease of living bacteria in the haemolymph could be observed. Older bees show a stronger immune competence in many ways. In winter bees even non-infected individuals express constitutively low amounts of the immune-responsive proteins IRp30 and CE1. The expression of IRp30 can still be enhanced by wounding or injection of E. coli. Moreover, older bees display a drastic reduction of living bacteria in the haemolymph as compared to young adult worker bees resulting in an almost complete elimination. Pupae in contrast react surprisingly different to a bacterial challenge. Injection of living E. coli-cells leads to a deadly collapse within 24 h p.i. accompanied by a colour change of the whole pupal body from white to grey. Since no visible expression of AMPs could be detected, the humoral immune response obviously was not induced. The same appears to be true for the cellular immune response, as no decrease in living E. coli-cells was observed upon infection. Because of this lack of humoral and cellular immune reactions, E. coli can proliferate in the haemocoel of infected pupae and potentially cause their death. All three developmental stages of the honey bee show completely different reactions to a viral infection than to a bacterial challenge. The Acute bee paralysis virus (ABPV) used in this study is a picorna-like virus with a positive, single-stranded RNA-genome and a non-enveloped protein capsid. Its proliferation in the haemocoel can be monitored by a massive synthesis of capsid proteins in the haemolymph. In contrast to a bacterial challenge, injection of only a few ABPV-particles into the haemocoel has tremendous effects on larvae. Injection of viral particles leads to a strong viral multiplication within hours and to death 24 h p.i. often accompanied by a colour change of the whole larva from pale-white to black. In addition to a visible degradation of high-molecular storage proteins shortly before the larvae die, the expression of proteins involved in translation or protection against oxidative stress can be observed. Young adult worker bees do not show such a tremendous reaction as larvae to a viral infection. They just display signs of paralysis. In contrast to larvae, young adult worker bees show better survival rates for higher numbers of injected virus-particles, the viral multiplication proceeds slower and there is no strong visible change of the haemolymph protein pattern. It could be demonstrated that no expression of AMPs and therefore no detectable activation of the humoral immune system by the virus occurs. But the humoral immune reponse also does not seem to be suppressed, since a simultaneous injection of E. coli and ABPV leads to the expression of viral capsid proteins in concert with the expression of AMPs. Additionally, nodulation, a prominent cellular immune response of young adult worker bees to bacterial infection, is likewise not initiated by ABPV-infection. Older bees apparently are not only capable of better fighting a bacterial infection, but also in surviving an ABPV-infection. Injection of an amount of viral particles leading to death of young adult worker bees within 72 h p.i., only leads to just detectable amounts of virus in winter bees 96 h p.i.. At the same time, the survival rate is not more impaired than after E. coli-injection. Pupae are as susceptible to a viral infection as to bacterial challenge. Although there is no strong visible change in the outer appearance, the pupaes’ development ceases within 3 d p.i.. This is possibly due to a strong multiplication of the virus, but obviously not mainly in the haemolymph, as it can be observed in larvae and adult bees as well.
KW  - Biene
KW  - Akute Paralyse <Bienenkrankheit>
KW  - Immunsystem
KW  - Akutes Bienen Paralyse Virus
KW  - angeborenes Immunsystem
KW  - honey bee
KW  - Acute bee paralysis virus
KW  - innate immune system
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66452
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TY  - THES
A1  - Schmull, Sebastian
T1  - Charakterisierung der pathogenetisch-relevanten Rolle von SF1 beim Nebennierenrindenkarzinom
T1  - Characterisation of the pathogenetic-relevant role of SF1 in adrenocortical carcinoma
N2  - Tumore der Nebennieren stellen häufige Tumore dar, welche bei mindestens 3 % der Population über 50-Jähriger vorkommen. Im Gegensatz dazu ist das Nebennierenrindenkarzinom mit einer Inzidenz von 1-2 Einwohner pro Million ein sehr seltener Tumor. Da seine Prognose allerdings ungünstig, und diese maßgeblich davon abhängt wie fortgeschritten der Tumor bei Diagnosestellung ist, ist es wichtig, dass die richtige Diagnose frühzeitig gestellt wird. Bis heute ist kein zuverlässiger immunhistochemischer Nebennierenrindenkarzinom-spezifischer Marker etabliert um das Nebennierenrindenkarzinom von anderen retroperitonealen Tumoren zu differenzieren. Sasano et al. schlug bereits 1995 erstmalig den Transkriptionsfaktor Steroidogenic Factor 1 (SF1) als Marker zur Differenzierung von Nebennierenrinden- und Nicht-Nebennierenrindentumoren vor. Allerdings wurde die diagnostische Wertigkeit bisher nur in sehr kleinen Fallserien mit insgesamt nur 17 Nebennierenrindenkarzinomen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die SF1 Protein-Expression bei 163 Nebennierenrindenkarzinomen, 52 Nebennierenrinden-Adenomen, 12 normalen steroidogenen Geweben (6 Nebennieren und 6 Ovare), sowie 73 Nicht-Steroidtumoren immunhistochemisch untersucht. Hierbei zeigte sich, das SF1 bei 158 von 161 evaluierbaren Nebennierenrindenkarzinomen und bei allen Proben von normalen und gutartigen Geweben (n=64) nachweisbar war. Im Gegensatz dazu war keine der 73 Nicht-Steroidgeweben SF1 positiv, so dass die diagnostische Genauigkeit extrem gut ist (Sensitivität: 98.6 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value jeweils 100 % und 97.3 %). In einem zweiten Schritt wurde untersucht ob die Protein-Expression von SF1 beim Nebennierenrindenkarzinom auch prognostische Bedeutung hat. Hierbei zeigte sich, dass Patienten mit Tumoren mit starker SF1 Färbung (30 %) ein deutlich schlechteres tumorstadium-adjustiertes Rezidiffreies- und Gesamt-Überleben haben als Patienten mit geringer SF1 Expression (hazard ratio: 2.45). Zusätzlich zu den immunhistochemischen Untersuchungen wurden FISH Analysen durchgeführt. Hierbei zeigte sich allerdings keine signifikante Korrelation zwischen SF1 Gendosis und der SF1 Protein-Expression, so dass zu vermuten ist, dass SF1 maßgeblich auf Transkriptions- und Translationsebene reguliert wird. In einem Versuch diese Frage zu beantworten wurden zwei mutmaßliche SF1 Interaktionspartner, FATE1 und DAX1, genauer immunhistochemisch untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass FATE1 bei 62 von 141 evaluierbaren Nebenierenrindenkarzinomen und 12 von 62 normalen und gutartigen Geweben nachweisbar war. Im Gegensatz hierzu waren alle 9 Nicht-Steroidgewebe FATE1 negativ. Dies zeigt, das FATE1 nicht zur Diagnostik nutzbar ist (Sensitivität: 61 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value 100 % bzw. 14 %). Die DAX1 Analyse zeigte, dass alle 20 normalen und gutartigen Gewebe eine positive DAX1 Färbereaktion zeigten. Von 126 Nebennierenrindenkarzinomen waren 71 DAX1 positiv. Von den 8 untersuchten Nicht-Steroidgeweben waren 6 DAX1 positiv. Diese Ergebnisse belegen, dass auch DAX1 keine diagnostische Genauigkeit besitzt (Sensitivität: 56 %, Spezifität: 25 %, positive und negative predictive value 92 % bzw. 4 %). Die Untersuchung der prognostischen Fähigkeiten von FATE1 und DAX1 zeigte, dass Patienten mit Tumoren mit starker FATE1 Färbung (39 %) ein schlechteres tumorstadium-adjustiertes Gesamt- aber nicht Rezidiffreies-Überleben haben als Patienten mit niedriger FATE1 Protein-Expression (hazard ratio: 2.01). Weiterhin wurde deutlich, dass DAX1 keine deutlichen prognostischen Fähigkeiten besitzt. Zusammenfassend läßt sich aus der vorliegenden Arbeit folgern, das SF1 aktuell der beste diagnostische Marker zur Diagnose von Tumoren der Nebennierenrinde ist und damit Eingang in die histopathologische Routine-Diagnostik von Nebennierentumoren finden wird. Zusätzlich ist die SF1 Expression ein sehr guter prognostischer Marker beim Nebennierenrindenkarzinom, wobei sich die prognostische Aussage durch zusätzliche Färbung von FATE1 und DAX1 nur unwesentlich verbessern läßt.
N2  - Adrenal tumors are common tumors which are present in at least 3 % in the human population over their 5th decade. However, adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare malignancy which shows an approximate anual incidence of 1-2 per million. Prognosis of ACC is generally poor and depends strongly on the tumor stage. Thus, early and correct diagnosis is important. Until now, no reliable immunohistochemical ACC-specific marker has been established for its differentiation from other retroperitoneal tumors. Already in 1995, Sasano et al. suggested the transcription factor Steroidogenic Factor 1 (SF1) as useful marker for differentiation of adrenocortical and non-adrenocortical tumors. Up to now, SF1's value as diagnostic marker for ACC was investigated only in small series of in a total of 17 samples. In our work, SF1 expression was investigated by immunohistochemistry in 163 ACC, 52 adrenocortical adenomas, 12 normal steroidogenic tissues (6 adrenal glands and 6 ovaries), as well as 73 non-steroidogenic tumors. SF1 protein expression was shown in 158 of a total of 161 evaluable ACC, as well as all normal and benign steroidogenic tissues. In contrast, no SF1 protein was detectable in the non-steroidogenic tumors. Thus, SF1 protein expression is a highly specific diagnostic tool (sensitivity: 98.6 %, specificity: 100 %, positive and negative predictive value: 100 % and 97.3 %, respectively). In a second step, SF1 protein expression was investigated as a prognostic tool in ACC. As shown by us, ACCs presenting strong SF1 immunoreactivity (30 %) showed a strong correlation with overall and recurrence-free patients survival than ACCs presenting low SF1 protein expression (hazard ratio: 2.45). Moreover, FISH analyses were performed which revealed no significant correlation of SF1 gene dosis and SF1 protein expression, suggesting a regulatory mechanism at transcriptional and translational level. To investigate the hypothesis, we investigated two putative interaction partners of SF1, namely FATE1 and DAX1 protein, by immunohistochemistry. FATE1 protein was expressed in 62 of a total of 141 evaluable ACC as well as 12 of a total of 62 normal and benign steroidogenic tissues. In contrast, all non-steroidogenic tissues were FATE1 negative (n=9). Thus, FATE1 is no valuable diagnostic tool (sensitivity: 61 %, specificity: 100 %, positive and negative predictive value: 100 % and 14 %, respectively). DAX1 immunohistochemistry showed that all normal and benign steroidogenic tissues (n=20) were DAX1 positive as well as 71 of a total of 126 ACC samples. Furthermore, 6 out of a total of 8 non-steroidogenic tissues stained DAX1 positive, showing that DAX1 protein is no diagnostic tool (sensitivity: 50 %, specificity: 25 %, positive and negative predictive value: 92 % and 4 %, respectively). Investigation of the prognostic value of FATE1 and DAX1 revealed that patients with tumors characterized by strong FATE1 immunoreactivity (39 %) had a worse outcome in overall but not recurrence-free survival than patients showing low FATE1 expression (hazard ratio: 2.01). DAX1 protein expression has no prognostic value in ACC. In summary, we showed that SF1 is currently the best available diagnostic marker for differentiation of adrenocortical tumors from other retroperitoneal tumors, and that it will be suitable for histopathological diagnostic routine. Furthermore, SF1 expression is a well-suited prognostical tool in adrenocortical carcinoma which is only marginally enhanced by subsequent staining of FATE1 and DAX1 protein.
KW  - Nebennierenrindenkrebs
KW  - Biomarker
KW  - Ereignisdatenanalyse
KW  - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
KW  - Immuncytochemie
KW  - Adrenocortical carcinoma
KW  - Biomarker
KW  - Survival analysis
KW  - Fluorescence in situ hybridization
KW  - Immunohistochemistry
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66398
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TY  - THES
A1  - Heddergott, Niko
T1  - Zellbiologische Aspekte der Motilität von Trypanosoma brucei unter Berücksichtigung der Interaktion mit der Mikroumwelt
T1  - Cell biological aspects of motility of Trypanosoma brucei in consideration of the interaction with the microenvironment
N2  - Trypanosomen sind Protozoen, die Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen, die unbehandelt infaust verlaufen. Die Zellen sind hoch motil, angetrieben von einem einzelständigen Flagellum, welches entlang des Zellkörpers angeheftet ist. Selbst in Zellkultur hören Trypanosomen niemals auf sich zu bewegen und eine Ablation funktioneller Bestandteile des Flagellarapparates ist letal für Blutstromformen. Es wurde gezeigt, dass Motilität notwendig ist für die Zellteilung, Organellenpositionierung und Infektiosität. Dies macht Trypanosomen zu besonders geeigneten Modellorganismen für die Untersuchung der Motilität. Dennoch ist erstaunlich wenig über die Motilität bei Trypanosomen bekannt. Dies gilt auch noch genereller für die Protozoen. Unlängst ist dieses Gebiet allerdings in den Fokus vieler Arbeiten gerückt, was bereits erstaunliche, neue Erkenntnisse hervorgebracht hat. Doch Vieles ist noch nicht abschliessend geklärt, so z.B. wie der Flagellarschlag genau reguliert wird, oder wie sich der Schlag des Flagellums entlang des Zellkörpers ausbreitet. Die vorliegende Arbeit befasst sich besonders mit den Einflüssen, die die Mikroumgebung auf die Motilität von Blutstromform-Trypanosomen ausübt. In ihrem natürlichen Lebensraum finden sich Trypanosomen in einer hoch komplexen Umgebung wieder. Dies gilt sowohl für den Blutkreislauf, als auch für den Gewebezwischenraum in ihrem Säugerwirt. Die hohe Konzentration von Zellen, Gewebeverbänden und extrazellulären Netzwerken könnte man als Ansammlung von Hindernissen für die Fortbewegung auffassen. Diese Arbeit zeigt dagegen, dass der Mechanismus der Bewegung eine Adaptation an genau diese Umweltbedingungen darstellt, so z.B. an die Viskosität von Blut. Es wird auch ein Bewegungsmodell vorgestellt, das erläutert, worin diese Adaption besteht. Dies erklärt auch, warum die Mehrheit der Zellen einer Trypanosomenkultur eine ungerichtete Taumel-Bewegung aufweist in nieder-viskosem Medium, das keine solchen “Hindernisse” enthält. Die Zugabe von Methylcellulose in einer Konzentration von ca. 0,5% (w/v) erwies sich als geeigneter Ersatz von Blut, um optimale Bedingungen für gerichtetes Schwimmen von Blutstromform Trypanosomen zu erreichen. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit unterschiedliche Arten von Hindernissen, wie Mikroperlen (Beads) oder molekulare Netzwerke, sowie artifizielle, geordnete Mikrostrukturen verwendet, um die Interaktion mit einer festen Matrix zu untersuchen. In deren Anwesenheit war sowohl die Schwimmgeschwindigkeit, als auch der Anteil an persistent schwimmenden Trypanosomen erhöht. Zellen, die frei schwimmend in Flüssigkeiten vorkommen (wie Euglena oder Chlamydomonas), werden effizient durch einen planaren Schlag des Flagellums angetrieben. Trypanosomen hingegen mussten sich evolutionär an eine komplexe Umgebung anpassen, die mit einer zu raumgreifenden Welle interferieren würde. Der dreidimensionale Flagellarschlag des, an die Zelloberfläche angehefteten, Flagellums erlaubt den Trypanosomen eine effiziente Fortbewegung durch die Interaktion mit Objekten in jedweder Richtung gleichermassen. Trypanosomen erreichen dies durch eine hydrodynamisch verursachte Rotation ihres Zellkörpers entlang ihrer Längsachse, entgegen dem Uhrzeigersinn. Der Einfluss der Mikroumgebung wurde in früheren Untersuchungen bisher vernachlässigt, ist zum Verständnis der Motilität von T. brucei jedoch unerlässlich. Ein weiterer, bisher nicht untersuchter Aspekt der Beeinflussung der Motilität durch die Umwelt sind hydrodynamische Strömungseffekte, denen Trypanosomen im kardiovaskulären System ausgesetzt sind. Diese wurden in dieser Arbeit mittels Mikrofluidik untersucht. Um unser Verständnis der Motilität von Trypanosomen von 2D, wie üblich in der Motilitätsanalyse mittels Lebend-Zell-Mikroskopie, auf drei Dimensionen auszudehnen, wurde als bildgebendes Verfahren auch die Holographie eingesetzt. Mikrofluidik und Holographie sind beides aufkommende Techniken mit großem Anwendungspotential in der Biologie, die zuvor noch nie für die Motilitätsanalyse von Trypanosomen eingesetzt worden waren. Dies erforderte daher interdisziplinäre Kooperationen. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit auch ein vollständig automatisiertes und Software-gesteuertes Fluoreszenzmikroskopiesystem entwickelt, das in der Lage ist, einzelne Zellen durch entsprechende Steuerung des Mikroskoptisches autonom zu verfolgen und somit eine Bewegungsanalyse in Echtzeit ermöglicht, ohne weitere Benutzerinteraktion. Letztendlich konnte dadurch auch die Bewegung der schlagenden Flagelle und des gesamten Zellkörpers mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung mittels Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie aufgeklärt werden.
N2  - Trypanosomes are protozoa causing fatal diseases in livestock and man. The cells show vivid motility, driven by a single flagellum that runs along the cell body, attached to the cell surface. Even in cell culture, trypanosomes never stop moving and ablation of functional components of the flagellum is lethal for bloodstream-forms. Motility has been shown to be essential for cell division, organelle positioning and infectivity. This renders trypanosomes valuable model organisms for studying motility. But, surprisingly little is known about motility in trypanosomes, as well as in protozoa, in general. Recently, motility of trypanosomes therefore has gotten into the spotlight of interest which brought some new insights, but many essential points are still a matter of debate, for example how the flagellar beat is regulated or how it is propagated along the cell body. In this work, the effects of the micro-environment of blood-stream form trypanosomes on motility were investigated. In their natural habitat, trypanosomes find themselves in a crowded environment. This is not only the case in the blood circulatory system, but also in extra-tissue space. The high concentration of cells and extra-cellular networks might be regarded as a kind of obstacle to cellular motion. This work shows that the mode of motility of bloodstream form trypanosomes instead is adapted to the viscosity of blood. Also a mechanistic model is presented which elucidates how this adaptation works. This also explains why most trypanosomes are tumbling in low-viscous cell culture medium, lacking other cellular components. Addition of Methylcellulose at a concentration of about 0.5% (w/v) was found to be a potent substitute for blood, providing optimal conditions for trypanosome motility. Also different types of obstacles like beads and molecular networks, as well as arranged pillar microstructures were used as a tool to mimic interaction with a solid matrix. In presence of these, the swimming speed as well as the percentage of persistent swimming cells was increased. Cells inhabiting an open-ranged environment (like Euglena or Chlamydomonas) are efficiently propelled by a planar flagellar wave. Trypanosomes in contrast, had to evolutionary adapt to a crowded environment, which would infer with any extensive planar wave. The three-dimensional flagellar beat of the attached flagellum allows trypanosomes to harness any rigid matrix for effective propulsion, in all directions equally. Trypanosomes achieve this by a rotational counter-clockwise motion of their whole cell body. Another environmental aspect for trypanosome motility that had not been studied before is the influence of hydrodynamic flow, which trypanosomes are subjected to, when swimming in the blood circulatory system. For studying this, in this work, the motilty of trypanosomes was analyzed in microfluidic devices. To extend our understanding of trypanosomal motility from 2D, like in standard microscopy based live-cell imaging analysis, to 3D, a imaging technique known as holography was used, in addition. Microfluidics as well as Holography both are emerging, high-potential techniques in biology, which had not been used for the motility analysis of trypanosomes before and establishing this therefore only got possible due to interdisciplinary collaborations. In addition, a custom fully automated, software-controlled, fluorescence microscopic system was developed in this work, which is able to track and follow single cells for motility analysis in real-time without the need for user input. The motion of the flagellar beat and the cell itself was investigated at high spatio-temporal resolution using highspeed fluorescence microscopy.
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Motilität
KW  - Blutviskosität
KW  - Hochgeschwindigkeitsmikroskopie
KW  - Mikrofluidik
KW  - Mikroumwelt
KW  - Mikrostrukturen
KW  - Trypanosomen
KW  - Blut
KW  - Trypanosoma
KW  - motility
KW  - blood
KW  - microfluidics
KW  - microenvironment
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56791
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TY  - THES
A1  - Winkel, Karoline
T1  - Synaptonemalkomplexprotein SYCP1: Bindungspartner, Polymerisationseigenschaften und evolutionäre Aspekte
T1  - Synaptonemal complex protein SYCP1: binding partners, polymerization properties and evolutionary aspects
N2  - Synaptonemal Komplexe (SC) sind evolutionär konservierte, meiosespezifische, proteinöse Strukturen, die maßgeblich an Synapsis, Rekombination und Segregation der homologen Chromosomen beteiligt sind. Sie zeigen eine dreigliedrige strickleiter-artige Organisation, die sich aus i) zwei Lateralelementen (LE), an die das Chromatin der Homologen angelagert ist, ii) zahlreichen Transversalfilamenten (TF), welche die LE in einer reißverschlussartigen Weise miteinander verknüpfen, und iii) einem zentralen Element (CE) zusammensetzt. Die Hauptproteinkomponenten der Säuger-SC sind das Transversalfilamentprotein SYCP1 und die Lateralelementproteine SYCP2 und SYCP3. Wie sich die SC-Struktur zusammenfügt war bisher nur wenig verstanden; es war nicht bekannt wie die TF innerhalb der LE-Strukturen verankert sind und dabei die homologen Chromosomen verknüpfen. Aufgrund dessen wurde die Interaktion zwischen den Proteinen SYCP1 und SYCP2 untersucht. Mit der Hilfe verschiedenster Interaktionssysteme konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von SYCP1 mit SYCP2 interagieren kann. Aufgrund der Bindungsfähigkeit zu beiden Proteinen, SYCP1 und SYCP3, kann angenommen werden, dass SYCP2 als Linker zwischen diesen Proteinen fungiert und somit möglicherweise das fehlende Bindungsglied zwischen den Lateralelementen und Transversalfilamenten darstellt. Obwohl die SC-Struktur in der Evolution hochkonserviert ist, schien dies nicht für seine Protein-Untereinheiten zuzutreffen. Um die Struktur und Funktion des SC besser verstehen zu können, wurde ein Vergleich zwischen den orthologen SYCP1 Proteinen der evolutionär entfernten Spezies Ratte und Medaka erstellt. Abgesehen von den erheblichen Sequenzunterschieden die sich in 450 Millionen Jahren der Evolution angehäuft haben, traten zwei bisher nicht identifizierte Sequenzmotive hervor, CM1 und CM2, die hochgradig konserviert sind. Anhand dieser Motive konnte in Datenbankanalysen erstmals ein Protein in Hydra vulgaris nachgewiesen werden, bei dem es sich um das orthologe Protein von SYCP1 handeln könnte. Im Vergleich mit dem SYCP1 der Ratte zeigten die Proteine aus Medaka und Hydra, neben den hoch konservierten CM1 und CM2, vergleichbare Domänenorganisationen und im heterologen System zudem sehr ähnliche Polymerisationseigenschaften. Diese Ergebnisse sprechen für eine evolutionäre Konservierung von SYCP1.
N2  - Synaptonemal complexes (SCs) are evolutionarily conserved, meiosis-specific proteinaceous structures critically involved in synapsis, recombination and segregation of homologous chromosomes. They show a tripartite ladder-like organization including i) two lateral elements (LEs), to which the chromatin of the homologs is attached, ii) numerous transverse filaments (TFs), that link the two lateral elements in a zipper-like way, and iii) a central element (CE). Major protein components of mammalian SCs are the transverse filaments protein SYCP1, and the lateral element proteins SYCP2 and SYCP3. How SCs become assembled was poorly understood; in particular it was not known how TFs assemble at the plane of LEs to interconnect the homologous chromosomes. Therefore, I have investigated possible interactions between SYCP1 and SYCP2. Using different interaction traps, I was able to show that the C-terminus of SYCP1 interacts with SYCP2. Because of its binding to both, SYCP1 and SYCP3, it can be proposed that SYCP2 acts as a linker between these proteins and therefore would be the missing connecting piece between LEs and TFs. Although the SC-structure is conserved in evolution this appears not to be the case for its protein components. For a better understanding of the conserved SC structure und function, I compared ortholog SYCP1 proteins of evolutionary distant species, namely rat and medaka fish. Despite of the sequence-differences that accumulated during 450 million years of evolution, sequence identity was highest at the level of two previously unidentified motifs (CM1 & CM2). Utilizing these motifs in a database analysis a protein of Hydra vulgaris could be found for the first time. It can be proposed that this protein is the orthologous of SYCP1. Besides the highly conserved motifs the proteins of medaka and hydra show quite similar domain organization and polymerization properties in comparison with rat SYCP1. These results suggest an evolutionary conservation of SYCP1.
KW  - Meiose
KW  - Chromosom
KW  - Evolution
KW  - Synaptonemalkomplex
KW  - Strukturproteine
KW  - Meiosis
KW  - Synaptonemal complex
KW  - Chromosomes
KW  - Structural proteins
KW  - Evolution
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43955
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TY  - THES
A1  - Heisig, Julia
T1  - Identifizierung neuer Zielgene der Hey bHLH Transkriptionsfaktoren
T1  - Identification of novel target genes of Hey bHLH transcription factors
N2  - Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen.
N2  - During embryonic development, the Notch signaling pathway plays a central role in cell fate specification, proliferation and communication between neighboring cells. Hey basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors are targets of the Notch signaling pathway and show crucial functions in cardiovascular development. Hey2 knock out (KO) mice and Hey1/HeyL double knock out mice (DKO) exhibit incomplete formation of the septum and valves in heart development and defects in the differentiation of blood vessels. The aim of this study was to find new target genes of the Hey proteins to further clarify their function during organ development and to get more insight into the phenotypes of the Hey KO mice. Towards this goal, a combination of microarray analysis and chromatin immunoprecipitation (ChIP) was chosen to get an overview of genes directly regulated by Hey proteins in a cell culture model of HEK293 cells overexpressing doxycycline-inducible Flag-tagged Hey1 or Hey2. Microarray analysis revealed approximately 100 target genes that were downregulated up to 5-fold by both Hey1 and Hey2. Interestingly, 15 genes were upregulated more than 2-fold by Hey2. ChIP with αFlag antibody confirmed direct interaction of Hey1 and Hey2 with the proximal promotor regions of 4 downregulated target genes (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Overexpression of mutant Hey1 proteins with deletion of the DNA-binding basic domain or single amino acid exchanges in the basic domain (3 arginine to lysine), failed to downregulate Hey1 target genes. Additionally, ChIP assay demonstrated that the binding of the Hey mutants to the promotor regions of HEY1, BMP2, KLF10 or FOXC1 is abolished, suggesting an essential role for the basic domain in DNA binding and function of the Hey proteins. We then utilized ChIP-PET in conjunction with highthroughput sequencing to perform a genome-wide screen for Hey1 and Hey2 binding sites in HEK293 cells. 1453 and 4288 target genes were identified for Hey1 and Hey2, respectively, of which 1147 genes were targets of both Hey1 and Hey2. Although the binding sites were located upstream and downstream of coding sequences, or even in exons and introns, 55 % and 49 % of all binding sites for Hey1 and Hey2, respectively, were located in proximal promoter regions between -0.5 kb and the first exon. An in silico binding motif analysis suggests a repetitive GC-rich sequence for Hey binding which is probably located in CpG islands, indicating a direct regulation of the transcriptional machinery by the Hey proteins. A comparison of the target genes from microarray analysis and ChIP-PET sequencing data demonstrates a large number of downregulated genes with binding sites that are directly bound by the Hey proteins. While 60 % of Hey2 downregulated genes contain binding sites, only 20 % of upregulated genes have binding sites for Hey2, invoking a repressor function for Hey proteins. To investigate, whether the Hey proteins regulate different target genes in a cell type specific manner, embryonic stem cells (ES cells) were generated which also overexpress doxycycline-inducible Hey1 or Hey2. These ES cells could be differentiated efficiently into cardiomyocytes and thus could also be used for gene expression analysis after induction of Hey overexpression. Microarray analysis of ES cells and cardiomyocytes resulted in more up- than downregulated genes in comparison to HEK293 cells. The overlap of common regulated genes in HEK293, ES cells and cardiomyocytes was very low. Only two Hey2 target genes were regulated more than 2-fold in both HEK293 and ES cells (Hes1, Zic2). This disparity indicates a narrow cell-type specific gene regulation by Hey proteins. Gene ontology analysis of all target genes demonstrated interactions of Hey proteins with different signaling pathways (e.g. TGFβ, Id or Wnt signaling), which are all indispensable for early developmental processes. These results show that Hey proteins influence and modulate gene expression levels in different signaling pathways in a cell-type specific manner. These data provide new possibilities for future research efforts to elucidate the role of Hey proteins in early organ development.
KW  - Gen notch
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Embryonalentwicklung
KW  - Kardiovaskuläres System
KW  - bHLH
KW  - Hey
KW  - Chromatinimmunpräzipitation
KW  - Microarray
KW  - bHLH
KW  - Hey
KW  - Chromatin Immunoprecipitation
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65053
ER  - 
TY  - THES
A1  - Götz, Andreas
T1  - Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stämmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus
T1  - Replication of enteroinvasive Escherichia coli and Salmonella enterica Serovar Typhimurium strains in epithelial cells with particular examination of the carbon metabolism
N2  - Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus.
N2  - Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells.
KW  - Escherichia coli
KW  - Intrazellulärraum
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Vermehrung
KW  - Kohlenstoffstoffwechsel
KW  - Salmonella
KW  - Salmonella enterica
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Salmonellose
KW  - Escherichia coli
KW  - Shigella
KW  - Infektion
KW  - Bakterielle Infektion
KW  - sifA
KW  - enteroinvasive
KW  - CaCo-2 cell
KW  - 13C-isotopologue profiling
KW  - microinjection
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292
ER  - 
TY  - THES
A1  - Göb, Eva
T1  - Die Kernhülle in Keimzellen: Strukturelle Besonderheiten, dynamische Prozesse und die Umgestaltung des Zellkerns während der Spermatogenese der Maus
T1  - The nuclear envelope in germ cells: structural peculiarities, dynamic processes und the reorganization of the cell nucleus during murine spermatogenesis
N2  - Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten.
N2  - The nuclear envelope is a double membranous structure enclosing the most typical eukaryotic feature, the cell nucleus. It is composed of an inner and an outer nuclear membrane as well as a nucleoplasmic lamina which is closely connected to the inner nuclear membrane by a number of associated proteins. Thus, besides just separating nuclear and cytoplasmic structures the nuclear envelope is functionally involved in many regulatory processes; i.e. controlling of the genomic activity, nucleo- and cytoplasmic signal transduction and, importantly, nuclear positioning and maintenance of nuclear architecture. Evidence emerges that the nuclear envelope also plays a fundamental role in the differentiation process of germ cells, gametogenesis, likely being responsible for yet unexplained human infertility. In order to expand the knowledge concerning impact and functions of the nuclear envelope for the mammalian germ line selected components and special characteristics of the germ cell nuclear envelope have been investigated in this thesis. Thus, this might help to understand germ line specific dynamic, morphological and other essential processes - particularly in course of meiotic and postmeiotic differentiation in male mice. Of great interest was lamin C2, a meiosis-specific A-type lamin essential for accurate meiosis and fertility of male mice. It has been shown that the targeted depletion of lamin C2 results in a severely defective meiosis and consequently in complete male infertility. Lamin C2-deficient male mice exhibit serious defects concerning pairing and synapsis of the homologous chromosomes. Thus, these mice are characterized by apoptotic spermatocytes and the complete absence of postmeiotic stages. It has been proposed that telomere movements along the nuclear periphery during prophase I might promote homologous but prevent heterologous chromosome association. Lamin C2 in turn is suggested to facilitate those meiotic telomere migrations by providing local flexibility to the telomeres attached to the nuclear envelope. Given that loss of lamin C2 causes decelerated telomere movements and defective homologous pairing afterwards, the situation in lamin C2-deficient spermatocytes could be explained. Another central focus was the investigation of potential LINC complexes in differentiating and morphologically reorganizing postmeiotic cells. LINC complexes are proteinaceous structures formed by SUN-proteins at the inner and nesprins at the outer nuclear membrane that tether the cell nucleus to the surrounding cytoskeleton. Since this structural property is suggested to influence nuclear morphology and shaping, LINC complexes appear to be good candidates for participating in mammalian sperm head shaping. Detailed analysis of LINC complex components relevant for spermiogenesis revealed that two novel uniquely assembled LINC complexes are established in the male post meiotic germ line. Moreover, those LINC complexes were shown to polarize to opposite cell poles in differentiating spermatids probably linking to specialized cytoskeletal elements. Therefore, a model for the LINC complex mediated shaping and elongation of the mammalian sperm head has been proposed in this thesis. Together, the functional analysis of lamin C2 as well as the identification of novel LINC complexes described in this thesis substantiates the fundamental role of the nuclear envelope for entire spermatogenesis.
KW  - Spermatogenese
KW  - Kernhülle
KW  - Lamina
KW  - Maus
KW  - Meiose
KW  - meiosis
KW  - spermiogenesis
KW  - nuclear envelope
KW  - lamina
KW  - LINC complex
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56839
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seubert, Carolin
T1  - Onkolytische Virotherapie : Virus-vermittelte Expression von MCP-1 oder ß-Galaktosidase in Vaccinia-Virus-kolonisierten Tumoren führt zu einer erhöhten Tumorregression
T1  - Oncolytic virotherapy : The virus encoded coexpression MCPI and beta galactosidase in vaccinia virus colonized tumor xenografts resulted in enhanced tumor rejection
N2  - Ungeachtet der enormen Entwicklung in Krebsdiagnostik und -Therapie in den letzten Jahren, sind vollständige Heilungsaussichten weiterhin gering und die aktuellen Behandlungsmethoden oftmals mit schwerwiegenden Nebeneffekten verbunden. Aufgrund dessen sind alternative Behandlungsmethoden unbedingt erforderlich und führten zu einer zunehmenden Bedeutung des Vaccinia-Virus als onkolytisches Virus in der Krebstherapie. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei mögliche Therapieansätze zur Verstärkung der onkolytischen Effekte in humanen Tumormodellen untersucht. Die Kombination einer gene-directed enzyme prodrug Therapie (GDEPT) mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus GLV 1h68 sollte zur Selektivitätssteigerung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren, cytotoxisch-aktiven Drugs führen. Darüber hinaus diente das für MCP-1 codierende Vaccinia-Virus GLV-1h80, zielend auf eine Cytokin-vermittelten Immuntherapie, als Vektor zur spezifischen Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks. Im Zuge der GDEPT wurde in dieser Arbeit ein, durch enzymatische Deglykosylierug aktivierbares Prodrug, basierend auf dem cytotoxischem Antibiotikum Duocarmycin SA verwendet. Durch eine Infektion mit GLV-1h68 und einer resultierenden Expression des aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase, sollte eine Umwandlung des Prodrugs in ein cytotoxisches Drug erfolgen. In vitro Infektionsstudien zeigten ein nahezu identisches Replikationsverhalten des Vaccinia-Virus GLV-1h68 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h43 in humanen GI-101A-Brustkrebszellen. Die Expression der beiden Reporter-Gene Ruc-GFP sowie ß-Galaktosidase konnten auf Protein-Ebene und mittels RT-PCR nach Infektion mit GLV-1h68 nachgewiesen werden. GLV-1h43-Infektion von GI-101A-Zellen führte zu GFP-Expression, jedoch nicht zur Expression des Enzyms ß Galaktosidase. Untersuchung der Enzym-Aktivität in Zelllysaten und Zellkultur-Überständen zeigten nach Infektion mit GLV 1h68 steigende Menge zellulär assoziierter und freier ß-Galaktosidase. Des Weiteren wurde durch Koinkubation von GI-101A-Zellen mit Virus-freien, ß Galaktosidase-haltigen Zelllysaten bzw. –überständen und Prodrug eine Aktivierung des Prodrugs durch das Virus codierte Enzym nachgewiesen. Diese Koinkubation führte zur Abtötung der Zellen. Nach Inkubation mit Proben mock- oder GLV 1h43-infizierter Zellen konnte keiner Veränderung der Proliferationsrate von GI-101A-Zellen gefunden werden. Kombinierte Behandlung von GI 101A-Zellen mit Viren des Stammes GLV 1h68 und Prodrug führte zu starken Synergieeffekten bei der Abtötung der Zellen und wies einen Bystander Effekt der Kombinationstherapie nach. Dieser konnte in 4 weiteren humanen und 2 Hunde-Brustkrebszellen bestätigt werden. Der erzielte Bystander-Effekt zeigt, dass es nach Virus-induzierter ß-Galaktosidase-Expression in GLV 1h68-infizierten Zellen zu einer enzymatischen Spaltung des Prodrugs in das cytotoxische seco-Analogon des Antibiotikums Duocarmycin SA kommt. Durch die Membrangängigkeit des Drugs konnte auch in angrenzenden uninfizierten Zellen eine Wirkung erzielt werden. Anhand von Expressionsanalysen an Apoptose-assoziierten Proteinen, wie PARP und Caspasen, wurde eine Wirkung des Prodrugs über den intrinsischen Apoptose-Signalweg nachgewiesen. In athymischen Nude-Mäusen durchgeführte Replikationsanalysen und X-Gal-Färbungen GLV 1h68 infizierter Tumore nach Prodrug-Behandlung zeigten, dass GLV-1h68 ungeachtet der simultanen Behandlung mit Prodrug im Tumorgewebe repliziert und es nicht zur Anreicherung lacZ-negativer Virusmutanten kommt. Es konnten, durch Prodrug-Behandlung und einer simultanen Expression aktiver ß Galaktosidase, starke synergistische Effekte und eine signifikante Steigerung der Tumorregression erzielt werden. Da die Kombinationstherapie zu keinerlei Unterschieden in Gewicht und Gesundheitszustand behandelter Versuchstiere führte, konnte eine systemische Toxizität außerhalb des Tumorgewebes ausgeschlossen werden. Verschiedene Zelllinien weisen Unterschiede in ihrer Sensitivität gegenüber der onkolytischen Aktivität von Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf. Während einige Zelllinien trotz Virus-Behandlung unverändertes Proliferationsverhalten zeigen (non- oder poor-responder), führt diese Behandlung in anderen Zelllinien zu einer vollständigen Tumorregression (responder). In Anbetracht dieser Unterschiede wurden in dieser Arbeit die Effekte einer induzierten Expression des murinen Chemokins MCP-1 in GI-101A-Tumoren (responder) und HT29-CBG-Tumoren (poor-responder) untersucht. MCP-1 zeichnet sich durch seine chemotaktischen Eigenschaften gegenüber mononukleärer Zellen aus und führt zu pleiotropen Tumor-Effekten. Replikationsstudien am Virus GLV-1h80 und des als Kontrollvirus dienenden rVACV GLV-1h68 zeigten, dass aus der Expression des Fremd-Gens mcp-1 sowohl in vitro als auch in vivo keinerlei negativen Effekte auf das Replikationsverhalten in humanen GI-101A- und HT29-CBG-Zellen resultieren. Durch Real-time Monitoring der GFP-Expression im Tumorgewebe lebender Tiere konnte zunächst eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende Signalstärke beobachtet werden, welche dann 42 dpi an Intensität verlor. Toxizität und schädliche Nebeneffekte durch Infektion mit den beiden rVACV konnten anhand der viralen Titer in den Organen der Maus ausgeschlossen werden. Die Titer wiesen auf eine ausschließlich auf das Tumorgewebe begrenzte Replikation der Viren nach Injektion in Tumor-tragende Tiere hin. Die Expression des Chemokins MCP-1 wurde sowohl auf transkriptioneller als auch auf translationeller Ebene in GLV-1h80-inifzierten Zellen und im Tumorgewebe GLV 1h80-injizierter Mäuse nachgewiesen. Nach Infektion mit GLV-1h80 konnte eine mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression gezeigt werden. Dabei wurde zudem deutlich, dass nicht nur eine GLV-1h80-Infektion in vivo zu einer Zunahme der intratumoralen MCP-1-Expression führte, sondern eine Vaccinia-Virus-Infektion allein einen Anstieg des Chemokins zu bewirken vermag. Eine Quantifizierung durch ELISA machte Konzentrationsunterschiede von MCP-1 zwischen den Tumormodellen GI-101A und HT29-CBG deutlich. Sowohl in vitro als auch in vivo führte ein GLV-1h80-Infektion zu deutlich niedrigeren Konzentrationen im HT29-CBG-Kolon-Adenokarzinommodell. Ein Nachweis murinen MCP-1 in Blutseren Tumor-tragender Tiere zeigte eine für therapeutische Effekte erwünschte systemische Freisetzung des intratumoral durch die Infektion mit GLV-1h80 gebildeten Chemokins MCP-1. Durch immunhistologische Untersuchungen GLV-1h80-infizierter Zellen und Tumoren konnte diese, mit dem Infektionsverlauf zunehmende MCP-1-Expression bestätigt werden. Die funktionelle Aktivität des rekombinanten Proteins wurde anhand TNF-&#945;-spezifischer ELISA-Analysen überprüft. Dabei zeigte sich eine erhöhte Expression dieses proinflammatorischen Cytokins in GI-101A-Tumoren nach Infektion mit GLV-1h80. Dagegen konnte keine Steigerung der Expression im HT29-CBG-Tumorgewebe nachgewiesen werden. Ein Nachweis des durch proinflammatorische Immunzellen exprimierten Oberlflächenproteins CD14 zeigte ebenfalls einen Anstieg nach Infektion mit GLV-1h80. Auch diese veränderte Expression blieb im poor-Responder-Modell HT29-CBG aus. Die steigende intratumorale Expression der beiden Proteine in GI-101A-Tumoren nach GLV 1h80-Infektion lässt auf eine Zunahme pro-inflammatorischer Immunzellen, basierend auf einer Virus-induzierten MCP-1-Expression schließen. Ein Monitoring der Tumorprogression nach Implantation von GI 101A-Zellen und Injektion der rVACV GLV-1h80 und GLV-1h68 bzw. einer PBS-Injektion führte nach einer anfänglichen Zunahme des Tumorwachstums schließlich bei beiden Viren zu einer Tumorregression. Jedoch konnte durch die GLV-1h80-vermittelte MCP-1-Expression eine Verstärkung der onkolytischen Effekte erzielt werden, welche sich durch eine signifikante Abnahme des Tumorvolumens zeigte. Im HT29-CBG-Modell führten die therapeutischen Effekte durch rVACV GLV-1h80 zwar zu keiner Regression des Tumors, jedoch zeigte sich auch in diesem humanen Tumormodell eine Verstärkung der onkolytischen Effekte nach GLV-1h80-Infektion im Vergleich zu einer GLV 1h68-Behandlung. Durch die GLV-1h80-induzierte Expression des Chemokins MCP-1 konnte somit eine Hemmung des Tumorwachstums auch im poor-Responder-Modell HT29-CBG erzielt werden. Sowohl die Verwendung eines ß-Galaktosidase-aktivierbaren Prodrugs im Zuge einer GDEPT, als auch die Beeinflussung des intratumoralen Chemokin-Netzwerks durch Expression des Chemokins MCP-1 führten in dieser Arbeit zu positiven Synergismus-Effekten in der onkolytischen Virustherapie. Durch künftige Konstruktion eines rVACV, welches sowohl die Expression des Chemokins MCP-1, als auch des prodrug-aktivierenden Enzyms ß-Galaktosidase im Tumorgewebe induziert, könnte in Kombination mit einer Prodrug-Behandlung eine zusätzliche Verstärkung der Effekte erzielt und möglicherweise eine erfolgreiche Virustherapie in bisher schwach ansprechenden poor- bzw. non-Responder-Modellen ermöglicht werden.
N2  - Irrespective of enormous developments in cancer diagnostics and therapy in the last few years, complete recovery from cancer still occurs rarely. Moreover, conventional therapy is attendant on unspecific side effects. Consequently, novel, well-tolerated and more efficient therapies are required in order to reduce the number of cancer-related deaths. Among several strategies to improve currently applied treatments, the use of oncolytic viruses may turn out to be a highly promising therapeutic approach. In this thesis two different therapeutic approaches were investigated to enhance oncolytic effects of vaccinia virus in human xenografts. First, the lacZ-carrying oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 was used in combination with a ß-galactosidase activatable prodrug to increase selectivity of a cytotoxic drug. Second, based on a cytokine-mediated immunotherapy, MCP-1-encoding vaccinia virus GLV-1h80 was used as a vector with a specific impact on the intratumoral chemokine network. In the first approach, an enzymatic activatable prodrug, based on a cytotoxic seco-analogue of the antibiotic duocarmycin SA was used for gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT). An activation of the cytotoxic prodrug was to be achieved by infection with GLV 1h68 and the resulting expression of the prodrug activating enzyme ß-galactosidase. Cell culture experiments revealed a comparable replication rate of GLV-1h68 and of the control virus strain GLV-1h43 lacking the lacZ gene insert. Expression of the reporter genes Ruc-GFP and ß-galactosidase after infection of GI-101A cells with GLV-1h68 was proven on the protein level and by RT-PCR. Infection of cells with GLV-1h43 resulted in GFP-expression only, confirming the absence of lacZ in GLV-1h43. Analysis of ß-galactosidase concentrations in cell lysates and supernatants revealed an increase of the enzyme during infection of GLV 1h68. Activation of the prodrug by the virus-encoded enzyme was achieved by co incubation of GI-101A-cells with virus-depleted, ß-galactosidase-containing cell lysates or supernatants and prodrug. This co-incubation resulted in killing of GI-101A cells. Conversely, incubation with samples obtained from mock- or GLV-1h43-infected cells and prodrug did not change overall survival of GI-101A-cells. In order to find out whether an additional effect could be achieved in neighboring uninfected cells, called bystander effect, GLV-1h68-infected cells were treated with prodrug. This experiment demonstrated strong synergistic effects in terms of cell killing. Similar results were obtained with 4 other human and with 2 canine breast cancer cell lines. The achieved bystander effect reveiled that upon GLV-1h68 infection the virus-mediated ß-galactosidase-expression resulted in enzymatic cleavage of the prodrug and release of the cytotoxic drug. Furthermore it proved the ability of the activated drug to penetrate cell membranes. Expression analysis on apoptosis-associated proteins, e.g. PARP and caspases, revealed induction of apoptosis via the intrinsic pathway after prodrug activation in GLV-1h68-infected cells. In vivo replication analysis and X-Gal staining of GLV 1h68-infected tumors revealed that GLV-1h68 can replicate within tumor tissue and no enrichment of mutants in lacZ occured, regardless of simultaneous prodrug treatment. Thus, prodrug treatment and expression of ß galactosidase resulted in synergistic effects leading to significantly enhanced tumor regression. Since no sign of malaise or weight loss was observed in prodrug-treated mice when compared to the respective control mice, we concluded that no toxic side effects occurred and active ß-galactosidase released from the tumor was negligible. Different human cell lines reveal varied sensitivity to the oncolytic activity of vaccinia virus GLV-1h68, some cell lines continue growth (non- or poor-responder), while others show complete regression (responder). Considering these differences, the second aspect of this thesis was the analysis of the chemokine MCP-1 in GI-101A-xenografts (responder) and in the poor-responding HT29-CBG tumors. MCP-1 is characterized by chemotactic properties against mononuclear cells and has pleiotropic effects on cancer. Replication studies on GLV 1h80 and the control virus strain GLV-1h68 revealed that expression of the inserted mcp-1-gene had no negative effects on viral replication in vitro as well as in vivo in human GI-101A- or HT-29 CBG-cells. Real-time monitoring of GFP-expression in tumors of infected mice showed increasing amounts of GFP in tumors during the infection process until 21 dpi, followed by a decrease in intensity to 42 dpi. By determining the viral titers in organs of infected mice, toxicity and harmful side effects resulting from infection with both virus strains were excluded. The viral titers demonstrate, that viral replication occurs exclusively in tumor tissue. Expression of MCP-1 in GLV-1h80-infected cells and tumors was detected on transcriptional as well as on translational level. The concentration of the chemokine increased during infection of GLV-1h80. Additionally, the increase of intratumoral MCP-1-concentrations was not only limited on GLV-1h80-infected tumors. On the contrary, vaccinia virus infection itself resulted in increasing amounts of this chemokine. Quantifying MCP-1-expression by ELISA assay revealed differences in concentrations between tumors derived from GI-101A and HT-29-CBG cells. In case of the HT-29-CBG coloncarcinoma, infection with GLV-1h80 resulted in lower concentrations of MCP 1 in vitro as well as in vivo. Confirmation of murine MCP-1 in blood samples of tumor-bearing mice revealed a systemic release of intratumoral MCP-1 predicated on the infection with GLV-1h80. This systemic release is required for therapeutic effects. The increased expression of MCP-1 in GLV-1h80-infected cells and tumors during infection was verified by immunohistochemical analysis. Functional activity of the recombinant protein was checked by a TNF-&#945;-specific ELISA assay, demonstrating increased expression of this proinflammatory cytokine in GI-101A tumors after infection with GLV-1h80. In contrast, no increase was observed in HT-29 CBG tumors. Likewise, the quantification of proinflammatory expressed surface protein CD14 showed higher concentrations in GI-101A-tumors after GLV-1h80-infection. Again, this increase was missing in xenografts of poor-responder HT-29-CBG. The increased expression of these two proteins in GI-101A xenografts after GLV-1h80-infection suggested an accumulation of proinflammatory immune cells, resulting from virus-mediated MCP 1-expression. Moreover, monitoring of tumor progression after implantation of GI-101A cells revealed an initially swelling of the tumors, followed by enhanced tumor regression after infection with GLV-1h80, as well as after GLV 1h68-infection. However, GLV-1h80-mediated MCP-1 expression resulted in an enhancement of oncolytic effects, followed by significant reduced tumor volumes compared to GLV-1h68-colonized tumors. In case of HT-29-CBG tumors MCP-1 induced indeed no regression of tumors. However, even in this poor-responding tumors oncolytic effects could be amplified by GLV 1h80 infection. Hence, inhibition of tumor growth in poor-responder model HT-29-CBG could be achieved by GLV-1h80-induced expression of the chemokine MCP-1. Taken together, both, the use of a ß galactosidase activatable prodrug in GDEPT and the modulation of the intratumoral chemokine network by expression of MCP-1 resulted in positive synergistic effects during oncolytic virus therapy. Future construction of a recombinant VACV, co expressing the prodrug-activating enzyme ß galactosidase as well as MCP-1 in tumor tissue has the potential to induce even stronger synergistic effects and might also lead to a more efficient treatment of up to now poor- or non-responding tumors.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Chemokine
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Therapie
KW  - Galactosidase <beta->
KW  - MCP-1
KW  - Krebstherapie
KW  - ß-Galaktosidase
KW  - Enzym
KW  - MCP-1
KW  - cancer therapy
KW  - ß-galactosidase
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48083
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reiß, Cora
T1  - Einfluss von Defekten des Mismatch Reparatur Proteins MLH1 (Mut L Homolog 1) auf Fertilität und Tumorgenese im Mausmodell
T1  - Impact of defects of the mismatch repair protein MLH1 (Mut L Homolog 1) on fertility and tumogenesis in mice
N2  - Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polypösen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erhöhten Resistenz gegenüber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA schädigenden Agenzien. Mäuse, die ein Null Allel für das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zusätzlich sind Mlh1-/- Mäuse durch einen meiotischen Phänotyp charakterisiert, der zu Sterilitäten in beiden Geschlechtern führt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranfälligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die häufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Domänen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten Mäusen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zelluläre Antwort auf DNA Schäden. Hierzu gehörte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- Mäusen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R Mäusen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante Mäuse zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen können. Darüber hinaus sind Mlh1G67R/G67R Mäuse, aufgrund der fehlenden Bindungsfähigkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachytän Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivität von MLH1 für die Fertilität in Säugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Phänotyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 für die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu können, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie führte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorprädispositions Phänotyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und naïve periphere TZellen beschränkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist im Vergleich zu Mlh1-/- Mäusen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in frühen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorläuferzellen impliziert.
N2  - Mutations in the human DNA mismatch repair (MMR) gene Mlh1 are associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome, HNPCC) and a significant proportion of sporadic colorectal cancer. Furthermore, MMR defects have also been observed in sporadic and hereditary lymphoid malignancies. In cells the inactivation of MLH1 results in the accumulation of somatic mutations in the genome and an increased resistance to the genotoxic effects of a variety of DNA damaging agents. Mice carrying a null allele for the MMR gene Mlh1 show a strong tumor predisposition phenotype. They are preferentially prone to the development of lymphomas of B- and T-cell origin and to a lesser extent gastrointestinal tumors. Additionally Mlh1-/- mice are characterized by a meiotic phenotype leading to male and female sterility. To study the effect of Mlh1 missense mutations on cancer susceptibility, we generated a mouse line carrying the recurrent MLH1G67R mutation that is located in one of the ATP-binding domains of MLH1. Although the MLH1G67R mutation resulted in DNA repair deficiency in homozygous mutant mice, it did not affect the MMR-mediated cellular response to DNA damage, including the apoptotic response of epithelial cells in the intestinal mucosa to cisplatin, which was defective in Mlh1-/- mice but remained normal in Mlh1G67R/G67R mice. Similar to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice displayed a strong cancer predisposition phenotype. However, in contrast to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice developed significantly fewer intestinal tumors, indicating that Mlh1 missense mutations can affect MMR tumor suppressor functions in a tissue-specific manner. In addition, Mlh1G67R/G67R mice were sterile because of the inability of the mutant Mlh1G67R protein to interact with meiotic chromosomes at pachynema, demonstrating that the ATPase activity of MLH1 is essential for fertility in mammals. These studies demonstrate that the Mlh1G67R mutation differentially affects the biological functions associated with MLH1 with distinct phenotypic effects. To study the role of MLH1 for lymphomagenesis in more detail, we generated a new mouse model carrying a conditional Mlh1 allele (Mlh1flox/flox). Mating of these mice with EIIa-Cre recombinase transgenic mice allowed the constitutive inactivation of MLH1 and the resulting Mlh1Δex4/Δex4 mouse line displays complete MMR deficiency and a cancer predisposition phenotype similar to Mlh1-/- mice. For T-cell specific MMR inactivation we combined the Mlh1flox/flox allele with the Lck-Cre Transgene. In the resulting Mlh1TΔex4/TΔex4 mice, MLH1 inactivation is limited to double positive and single positive thymocytes and naïve peripheral Tcells. The development of T-cell lymphomas in Mlh1TΔex4/TΔex4 mice is significantly reduced compared to Mlh1-/- mice implicating that MMR functions either at very early stages during Tcell development or even earlier in lymphoid precursor cells to suppress lymphomagenesis.
KW  - Colonkrebs
KW  - Genmutation
KW  - DNS-Reparatur
KW  - MLH1
KW  - HNPCC
KW  - Mutation
KW  - Mausmodell
KW  - Tumor
KW  - MLH1
KW  - HNPCC
KW  - mutation
KW  - mousemodell
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53626
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ulbrich, Jannes
T1  - Integrierung und biochemische Charakterisierung ektoper BMP Rezeptoren in Zellmembranen
T1  - The integration and biochemical characterization of ectopic BMP receptors in cell membranes
N2  - BMPs vermitteln ihre zellulären Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranständiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfläche sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivität der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zugänglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinität zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen ermöglichten. Die BMP Rezeptorektodomänen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodomänen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt.
N2  - BMPs elicit their cellular functions via recruitment and activation of specific receptor serin/threonine receptor kinases. The precise mechanisms leading to receptor activation and the composition of a functional signal transducing complex on the cell surface has been investigated intensively over the last decades. The dimeric nature of all BMPs, the promiscuity of both, the ligands and the receptors and the different receptor conformations on the cell surface (PFC, BISC) hamper the experimental accessibility of this protein family. To study the membrane anchorage's influence of the receptors on their affinity towards single ligands, different methods were evaluated that enabled us to couple the receptor ectodomains in a quantitative manner to plasma membranes. The BMP receptor ectodomains were, among other techniques, lipidated in a lysine specific way or coupled as hexahistidine fusion proteins to membrane integrated chelating lipids.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - BMPs
KW  - BMP Rezeptoren
KW  - Proteinmodifikationen
KW  - Protein Lipidierungen
KW  - NTA Lipide
KW  - BMP
KW  - BMP receptos
KW  - protein modifications
KW  - protein lipidations
KW  - NTA lipids
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55462
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Judith
T1  - Die Rolle der HectH9/Mcl1-Interaktion in der Myc-induzierten Apoptose und Auswirkungen der Myc V394D-Mutation auf die von c-Myc gesteuerten Tumorgenese in einem transgenen Mausmodell
T1  - Role of the HectH9/Mcl1 interaction in Myc-induced apoptosis and Impact of the Myc V394D mutation in c-Myc-driven murine lymphomagenesis
N2  - Während der Entstehung von Tumoren können zwei Mechanismen auftreten, die beide von der Aktivität der Onkogene abhängig sind und die Tumorgenese einschränken. Für das Onkogen Myc ist gezeigt, dass es sowohl Apoptose als auch unter bestimmten Umständen Seneszenz auslösen kann und damit sein eigenes onkogenes Potential limitiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich mich mit diesen Tumor-suppressiven Mechanismen in zwei unabhängigen Teilprojekten beschäftigen. Eine erhöhte Expression von Myc steigert die Proliferation der Zellen, induziert aber gleichzeitig Doppelstrangbrüche an der DNA. Durch den dadurch entstandenen Schaden wird die DNA-Schadensantwort ausgelöst, die zum Beispiel zur Phosphorylierung von H2A.X durch die Kinasen Atm und Atr führt. Ein weiteres putatives Zielprotein dieser Kinasen ist HectH9, das abhängig vom DNA-Schaden das mitochondriale Protein Mcl1 ubiquitiniert und es damit für den proteasomalen Abbau markiert. Im ungestressten Zustand interagiert das in der mitochondrialen Membran lokalisierte Protein Mcl1 mit proapoptotischen Proteinen und hält deren inerten Status aufrecht. Die Reduktion der Mcl1-Mengen ist essentiell, um die proapoptotischen Proteine zu aktivieren, dadurch die Freisetzung von Zytochrom C aus dem Mitochondrium zu veranlassen und damit den Prozess der Apoptose einleiten zu können. Anhand der in dieser Arbeit dokumentierten Daten bietet sich Mcl1 als potentielles Zielprotein für pharmazeutisch Strategien zur Therapie Myc-induzierter Tumore an. Im Idealfall erhöht eine verstärkte Reduktion seiner Proteinmengen die zelluläre Apoptose und verringert somit das Tumorwachstum. Im murinen T-Zell-Lymphom wird die Myc-abhängige Tumorgenese durch eine Mutation der Proteinsequenz von Myc verlangsamt. Diese Mutation unterbindet die Bindung von Myc zu Miz1 und verhindert dadurch die Repression von Zielgenen. Abhängig von der Interaktion von Myc zu Miz1 gelingt die Inhibition der Transkription des Zellzyklusinhibitors p15Ink4b. Die Interaktion von Myc und Miz1 ist essentiell um die TGFbeta-abhängige Seneszenz zu umgehen. Darüber hinaus ist Myc direkt an der Repression von TGFbeta beteiligt. Entgegen der bisher verwendeten Modelle konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Myc unabhängig von Miz1 zu den Promotoren der reprimierten Zielgene rekrutiert wird und die Bindung der beiden Proteine offensichtlich nur für die Transrepression essentiell ist.
N2  - Apoptosis and senescence are two distinct mechanisms that are induced by oncogenes to limit their oncogenic potential during tumorigenesis. Their appearance seems to be dependent on the specific oncogene. For a long time it is known that the oncogene Myc is a strong inducer of apoptosis. Latest results revealed, that Myc is also able to induce senescence, to prevent transformed cells from proliferating. Within the framework of my PhD I concentrated on both tumor suppressive mechanisms in two independent particular projects. Increased expression and activity of Myc enhances cell proliferation and thereby induces DNA double strand breaks. This damage activates a DNA damage response which leads to Atm/Atr mediated phosphorylation of H2A.X. A further target of the kinases Atm and Atr is HectH9 which ubiquitinates the mitochondrial protein Mcl1 in a DNA damage dependent manner. The ubiquitination of Mcl1 labels this protein for proteasomal degradation. In unstressed cells Mcl1 is located in the mitochondrial membrane where it interacts with proapoptotic members of the Bcl2 family inhibiting their activity. The reduction of Mcl1 protein is essential for the activation of proapoptotic proteins at the mitochondrium allowing release of cytochrome c as initial step in apoptosis. Myc mediated tumorigenesis is limited by using a mutant form of Myc as driving oncogene. This mutation inhibits interaction of Myc to its binding partner Miz1. The interaction of Myc and Miz1 is required to repress target genes like p21Cip1 and p15Ink4b. In vivo experiments demonstrate that Myc and Miz1 need to bind to each other to bypass TGFbeta-dependent senescence. This process is dependent on elevated levels of Myc consequently reduction to physiological levels of the protein induces apoptosis and senescence in a TGFbetadependent mannerIn addition, there is evidence that Myc is directly involved in the repression of Tgfbeta. In contrast to established models of repression by the Myc/Miz1 complex, it was shown, that Myc is recruited to and binds target DNA independently of Miz1. Therefore, I suggest that interaction of both proteins is essential only at the step of transcriptional initiation.
KW  - Myc
KW  - Apoptosis
KW  - DNS-Schädigung
KW  - Transforming Growth Factor beta
KW  - T-Zell-Lymphom
KW  - Seneszenz
KW  - Ubiquitinierung
KW  - Miz1
KW  - p15Ink4b
KW  - senescence
KW  - ubiquitination
KW  - Miz1
KW  - p15Ink4b
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55789
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wölke, Stefan
T1  - Funktionelle Analyse von bakteriellen W-xxx-E Rho GTPasen GEF Mimetika mittels Typ 3 Sekretionssystems von Yersinia enterocolitica
T1  - Functional analysis of bacterial W-xxx-E Rho GTPase GEF mimetics using the type 3 secretion system of Yersinia enterocolotica
N2  - Die zellulären Rho GTPasen kontrollieren und regulieren zentrale elementare Zellvorgänge wie Phagozytose, Migration und epitheliale Integrität. Aufgrund ihrer zentralen Stellung, interagiert eine Vielzahl von bakteriellen Cytotoxinen und Modulinen mit den Rho GTPasen und wirken so als Pathogenitätsfaktoren. Die zur W-xxx-E Familie gehörenden Effektoren IpgB1 und IpgB2 von Shigella und Map von E. coli (Pathotypen EHEC und EPEC) werden über ein Typ 3 Sekretionssystem (T3SS) in Wirtszellen injiziert und wirken als Rac1, RhoA bzw. Cdc42 GEF Mimetikum. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effektor Funktionen von IpgB1 IpgB2 und Map mit Hilfe des Yersinia (Ysc)-T3SS untersucht, was zur Etablierung der „Yersinia-Toolbox“ führte. Damit können heterologe Effektoren isoliert im physiologischen Kontext der Erreger-Zell-Interaktion zellbiologisch untersucht werden unter Vermeidung von simultaner Injektion redundanter oder unbekannter Effektoren. Zur Etablierung der Yersinia-Toolbox wurden zunächst die Gene für die Rho GTPasen modulierenden Shigella Effektoren IpgB1 und IpgB2 sowie der E. coli (EHEC)-Effektor Map mit unterschiedlich langen Gensequenzen der N-terminalen Bereiche des Yersinia-Effektorproteins YopE fusioniert (Hybridproteine: YopEi-X:i = 18, 53 bzw. 138 Aminosäurereste, X = IpgB1, IpgB2 bzw. Map). In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Hybridproteine YopE53-X und YopE138-X (X=IpgB1, IpgB2, Map) in den Kulturüberstand sezerniert bzw. in Zielzellen injiziert wurden. In einem weiteren Schritt konnte die zellbiologische Aktivität der heterologen Proteine fluoreszenzmikroskopisch durch Aktinzytoskelettumlagerungen gezeigt werden. So wurden „Membrane Ruffles“ (Rac1-Aktivierung) durch YopE138-IpgB1, Stressfasern (RhoA-Aktivierung) durch E138-IpgB2 und „Mikrospikes“ (Cdc42-Aktivierung) durch YopE138-Map nachgewiesen. Invasionstudien zeigten, dass YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) die Yersinia-Invasion induzierte, wohingegen YopEi-IpgB2 die Invasionsrate der Stämme WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i=53, 138) verglichen mit dem Stamm WA (pT3SS) reduziert war. Durch Kombination verschiedener Yersinia-Toolbox-Stämme konnte im Co-Infektionsmodell mit HeLa-Zellen gezeigt werden, dass (1) die YopE138-IpgB1 vermittelte Invasion durch YopE138-IpgB2 signifikant inhibiert werden kann, was auf eine antagonistische Wirkung zwischen IpgB1 und IpgB2 schließen lässt, dass (2) YopT ebenfalls die IpgB1 vermittelte Invasionsrate reduziert (inhibitorische Wirkung auf Rac1), und dass (3) YopE als GAP für RhoG/Rac1 (bevorzugt RhoG) praktisch nicht die IpgB1-vermittelte Invasion hemmt. Durch Klonierung der YopE138-IpgB1 und YopE138-IpgB2 kodierenden Fusionsgene in zwei kompatible Plasmidvektoren konnten die Hybridproteine simultan transloziert werden und die Co-Infektionsergebnisse bestätigt werden. In der Literatur ist beschrieben, dass die Ysc-Translokationspore YopB/YopD Rho-abhängig Membranporen-bedingte Zellschädigungen verursacht (LDH-Freisetzung, PI-Kernfärbung). Mit der Yersinia-Toolbox konnte mit dem Stamm WA (pT3SS) Zytoplasmamembranschädigung / Zytotoxizität nachgewiesen werden, nicht aber mit den Stämmen WA (pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 oder Map. Co-Infektionen jedoch zeigen, dass vermehrt LDH bei der Infektion mit WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB1) detektiert wurde, wohingegen dieser Effekt von YopE138-IpgB2 in einer Co-Infektion von WA (pT3SS) + WA (pT3SS, pE138-IpgB2) inhibiert wurde. Auch hier wurde der Antagonismus zwischen IpgB1 und IpgB2 erneut sichtbar. Diese Befunde widersprechen publizierten Daten, die eine RhoA-Aktivierung/Aktinpolymerisierung mit verstärkter Porenbildung in einen Zusammenhang bringen. Rho GTPasen sind beteiligt an der Erhaltung der polarisierten Eipthelzellschichtintegrität über Adhäsionskomplexbildung. Mittels Infektion von polarisierten MDCK-Zellschichten mit verschiedenen Yersinia-Stämmen und Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes/Resistenz (TER) konnte gezeigt werden, dass die Ysc-T3SS vermittelte Injektion von YopE138-IpgB1 (Rac1-Aktivierung) oder YopE138-Map (Cdc42-Aktivierung) zur Abnahme der TER und damit Schädigung der Zellschichtintegrität führt, wogegen bei YopE138-IpgB2-Injektion der TER-Wert unverändert blieb. Um bakterielle Rho GTPasen-modulierende Effektorproteine detailliert untersuchen zu können und um die Rolle von Rho GTPasen im Mausinfektionsmodell mit Yersinia enterocolitica und Salmonellen zu bestimmen, wurden Mäuse mit deletierten Genen für RhoA, Rac1 bzw. Cdc42 in Makrophagen hergestellt.
N2  - Phagocytosis, migration and regulation of epithelial integrity are central cellular aspects that are controlled by the cellular Rho GTPases. In this regard, Rac1, RhoA and Cdc42 have important regulatory roles mediating various cytoskeletal rearrangements in many cell types including epithelial cells as well as professional phagocytes. Because of the central role of the Rho GTPases in cellular integrity and function, bacterial cytotoxins and modulins targeting these cellular switches are very efficient pathogenicity factors. Recently, the T3SS effectors, IpgB1, IpgB2 of Shigella and Map of E. coli (pathotype EHEC/EPEC) were assembled in one protein family sharing the common motif W-xxx-E. Members of this protein family are described to act as GEF mimics for the cellular Rho GTPases. In this study the effector functions of IpgB1, IpgB2 and Map were analyzed with the Yersinia (Ysc)-T3SS which led to the development of the “Yersinia-Toolbox”. Yersinia enterocolitica is very suitable to be used as “T3SS-Toolbox” because (1) a plasmid solely carrying the DNA fragment encoding the Ysc-T3SS without T3SS-effectors is available, (2) in difference to Salmonella and E. coli (EPEC/EHECH) the Ysc-T3SS-effector genes of Yersinia are not localized on the chromosome and (3) heterologous proteins fused to the Ysc-T3SS-effector YopE are secreted and translocated into cells. This allows the analysis of single heterologous effectors without simultanous injection of other (unknown/redundant) T3SS-effectors in a physiological context during the interaction of Yersinia with cells. To develop the Yersinia-Toolbox, the genes of the GTPase modulating effectors IpgB1, IpgB2 of Shigella and Map of E. coli (EHEC) were fused to different long sections of the N-Terminus of the Yersinia-Ysc-T3SS-effector YopE (hybrid proteins: YopEi-X: i = 18, 53 or 138 amino acid residues, X = IpgB1, IpgB2 or Map). This study demonstrates the secretion to the culture supernatent and the injection into target cells of the hybrid proteins YopE53-X and YopE138-X (X = IpgB1, IpgB2 and Map). Furthermore, cell biologic activity was detected for the YopE-X hybrid proteins by fluorescence microscopy as membrane ruffles (Rac1 activation), stress fibres (RhoA activation) and micro spikes (Cdc42 activation) occurred after injection of YopE138-IpgB1,.YopE138-IpgB2 and YopE138-Map, in respective. Invasion studies showed that YopEi-IpgB1 (i = 53, 138) induced invasion of Yersinia, whereas YopEi-IpgB2 reduced invasion of the strains WA (pT3SS, pEi-IpgB2) (i = 53, 138) compared to the strain WA (pT3SS). Combination of different Yersinia-Toolbox strains in the co-infection model with HeLa cells showed that (1) YopE138-IpgB2 reduced the YopE138-IpgB1 induced invasion suggesting an antagonism between IpgB1 and IpgB2, (2) YopT also reduced the YopE138-IpgB1 induced invasion (inhibitory function on Rac1) and (3) that YopE as GAP for RhoG/Rac1 (predominantly RhoG) did not inhibit the YopE138-IpgB1 induced invasion. Because of the construction of two different compatible plasmids carrying the genes for either YopE138-IpgB1 or YopE138-IpgB2, simultanous translocation of the hybrid proteins of one single strain was possible. These studies confirmed the results of the co-infection studies. It has been reported that the Ysc translocation pore YopB/YopD induces Rho dependent membrane pores in cells which leads to cellular damage (LDH release, PI-staining of the nucleus). In this study cellular damage / cytotoxicity was detected after an infection of HeLa cells with the Yersinia-Toolbox strain WA (pT3SS). In contrast to that no cytotoxicity was detected after an infection of HeLa cells with the Yersinia-Toolbox strains WA (pT3SS, pE138-X) X = IpgB1, IpgB2 and Map. Additionally, co-infections with the strains WA (pT3SS) and WA (pT3SS, pE138-IpgB1) resulted in an increased LDH release whereas a co-infection with the strains WA (pT3SS) and WA (pT3SS, pE138-IpgB2) led to the decrease of LDH release compared to single infections with WA (pT3SS), again suggesting an antagonism between IpgB1 and IpgB2. These results are contrary to published data, which suggest a correlation between RhoA activation dependent actin polymerisation and pore formation. The cellular Rho GTPases are involved in the maintenance of epithelial integrity of polarized cells. Infections of polarized MDCK cell layers with different Yersinia-Toolbox strains resulted in a decrease of the transepithelial electric resistance (TER) indicating a damage of the epithelial integrity after injection of YopE138-IpgB1 or YopE138-Map. The TER value was not altered after injection of YopE138-IpgB2 indicating an intact epithelial integrity. To study bacterial Rho GTPase modulating proteins in more detail and to get a deeper insight to the role of Rho GTPases in the murine infection model with Yersinia enterocolitica and Salmonella, mice with gene deletions for RhoA, Rac1 or Cdc42 in macrophages were constructed.
KW  - Actin
KW  - Yersinia enterocolitica
KW  - Shigella flexneri
KW  - EHEC
KW  - CRE
KW  - Knockout <Molekulargenetik>
KW  - Guanosintriphosphatasen
KW  - T3SS
KW  - Rho GTPasen
KW  - GEF
KW  - GAP
KW  - Mimetika
KW  - Proteinsekretion
KW  - T3SS
KW  - Rho GTPases
KW  - GEF
KW  - GAP
KW  - Mimics
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55010
N1  - die Arbeit wurde hauptsächlich am Max-von-Pettenkofer-Inst. der LMU München als externe Dissertation erstellt und vom Lehrstuhl für Mikrobiologie der Fakultät für Biologie an der Universität Würzburg betreut.
ER  - 
TY  - CHAP
A1  - Fiala, Brigitte
A1  - Maschwitz, Ulrich
A1  - Tho, Yow Pong
T1  - The association between Macaranga trees and ants in South-east Asia
N2  - No abstract available
KW  - Macaranga
Y1  - 1991
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54752
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Fiala, Brigitte
T1  - Bäume & Ameisen : Partnerschaften im südostasiatischen Regenwald
N2  - No abstract available
KW  - Baum
KW  - Ameisen
KW  - Regenwald
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54741
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jauch, Mandy
T1  - Die Serin/Arginin Proteinkinase 79D (SRPK79D) von Drosophila melanogaster und ihre Rolle bei der Bildung Aktiver Zonen von Synapsen
T1  - The serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) of Drosophila melanogaster and its role in the formation of active zones of synapses
N2  - Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf.
N2  - Synapses as sites of communication between neurons contain specialized regions termed active zones (AZs) which are composed of a highly complex network of proteins comprising the exocytotic machinery for neurotransmitter release and vesicle recycling. In Drosophila the Bruchpilot (BRP) protein is an important building block of the T-shaped ribbons („T-bars“) at presynaptic active zones. By screening for mutations affecting the tissue distribution of Bruchpilot, a P-transposon insertion in the Srpk gene at the position 79D has been identified (Srpk79D, CG11489). This gene codes for a kinase which shows high homology to the mammalian family of serine/arginine protein kinases (SRPKs). Members of this family have an evolutionarily highly conserved bipartite kinase domain in common which is separated by a non-conserved spacer sequence. SRPKs phosphorylate SR proteins, an evolutionarily highly conserved family of serine/arginine-rich splicing factors that control the processes of constitutive and alternative splicing. Mutation of the Srpk79D gene caused by the P-element insertion (Srpk79DP1) or by a deletion in the gene (Srpk79DVN null mutant) leads to conspicuous accumulations of BRP in larval and adult axons. This thesis shows that these BRP accumulations at the ultrastructural level correspond to extensive axonal agglomerates of electron-dense ribbons surrounded by clear vesicles. Using immuno electron microscopy, these accumulation were characterized as BRP immuno-reactive structures. To prevent the assembly of BRP containing agglomerates in axons and to maintain intact brain function the SRPK79D seems to be expressed only at low levels because the endogenous kinase was not detectable using various antibodies. It was shown in other thesis that the expression of the PB, PC or PF isoform of the four possible SRPK79D variants resulting from two alternative transcription start sites in exon one and three, respectively, and alternative splicing of exon seven is sufficient to rescue the phenotype of BRP accumulation in the Srpk79DVN null-mutant background. Cloning of the cDNA for the SRPK79D-PE isoform into a UAS vector has been started in order to characterize the ability of this isoform to rescue the BRP-phenotype. It seems as if the formation of axonal BRP agglomerates is not due to BRP overexpression in the affected neurons as was shown by reduced expression of the BRP protein in the Srpk79DVN null-mutant background which still leads to BRP agglomerates. The overall amount of Bruchpilot protein in adult heads of the Srpk79DVN null mutant is not clearly altered compared to wild type. No clear alteration was observed between Srpk79DVN null-mutant and wild-type flies comparing the expression of different presynaptic proteins like Synapsin, Synapse-associated protein of 47 kDa (Sap47), and Cysteine string protein (CSP). The experiment does not point towards altered splicing of the corresponding pre-mRNAs. Each of the seven known SR proteins of Drosophila is a potential target protein of the SRPK79D. Pan-neuronal knock-down experiments for the three SR proteins SC35, X16/9G8, and B52/SRp55 investigated in this thesis by RNA interference did not show an effect on the tissue distribution of BRP. It was shown that the Srpk79DVN null mutation has no additive effect on the knock-down of the BRP protein regarding the flight ability of the respective animals because the double mutants showed similar values of non-flyers as each of the single mutants with either null mutation of the Srpk79D gene or knock-down of BRP. Presumably, Bruchpilot and the SR protein kinase 79D are part of the same signaling pathway. Performing double fluorescence stainings with antibodies against BRP and the CAPA peptides it was shown that Bruchpilot is also present in the median and transverse nerve system (MeN/TVN) of Drosophila containing the neurohaemal organs. These organs are responsible for storage and release of neuropeptide hormones. In contrast to the larval segmental and intersegmental nerves of the Srpk79DVN null mutant which show characteristic BRP agglomerates, mutation of the Srpk79D gene does not affect the distribution of BRP in the axons of the Va neurons which form the MeN/TVN system. The staining pattern of BRP in these nerves does not show clear alterations in the Srpk79DVN null mutant compared to wild type. The finding that BRP is present in the median and transverse nerve system opens the field for speculation of a role for the Bruchpilot protein not only in the neurotransmitter exocytosis but also in the release of neuropeptides.
KW  - Taufliege
KW  - Serin
KW  - Arginin
KW  - Proteinkinasen
KW  - Synapse
KW  - Genexpression
KW  - Aktive Zone
KW  - Serin/Arginin Proteinkinase
KW  - SRPK
KW  - Bruchpilot
KW  - Drosophila
KW  - Synapse
KW  - Motorische Endplatte
KW  - Nervenzelle
KW  - Neurotransmitter
KW  - active zone
KW  - serine/arginine protein kinase
KW  - SRPK
KW  - Bruchpilot
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53974
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schubert, Alice
T1  - Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D mit Identifizierung von Interaktionspartnern in Drosophila melanogaster
T1  - Immunohistochemical and functional characterisation of the serine/arginine protein kinase SRPK79D with identification of interaction partners in Drosophila melanogaster
N2  - Auf der Suche nach Mutanten mit einer vom Wildtyp abweichenden Verteilung des Aktive Zone-Proteins Bruchpilot wurde die Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D identifiziert. Hier zeigte sich, dass die Mutation im Srpk79D-Gen zu einer Agglomeration von Bruchpilot in den larvalen segmentalen und intersegmentalen Nerven führt. In der vorliegenden Arbeit sollte die SRPK79D genauer charakterisiert werden. Nach Präadsorptionen und Affinitätsreinigungen von in einer früheren Arbeit erzeugten Antiseren, gelang es die Lokalisation der überexprimierten SRPK79D-GFP-Isoformen zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass keines der Antiseren die endogene Kinase im Western Blot oder immunhistocheimisch detektieren konnte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Expression der SRPK79D in einer geringen Konzentration erfolgt. Es war jedoch möglich die endogene SRPK79D-PC-Isoform mittels einer Immunpräzipitation soweit anzureichern, dass sie im Western Blot nachweisbar war. Für die SRPK79D-PB-Isoform gelang dies allerdings nicht. Anhand von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten konnte gezeigt werden, dass die panneural überexprimierte SRPK79D-PC-GFP-Isoform an die Aktiven Zone transportiert wird und dort mit Bruchpilot, sowie den Interaktionspartnern von Bruchpilot Liprin-α und Rab3 kolokalisiert. Außerdem liegt sie diffus im Zytoplasma von neuronalen Zellkörpern vor. In adulten Gehirnen lokalisiert die transgen überexprimierte SRPK79D-PC-GFP im Fanshaped body, Ringkomplex und in neuronalen Zellkörpern. Die panneural überexprimierte SRPK79D-PB-GFP-Isoform liegt im larvalen und adulten Gehirn lokal im Zytoplasma der Perikaryen akkumuliert vor und wird nicht an die Aktive Zone transportiert. Das PB-Antiserum erkennt im adulten Gehirn neuronale Zellkörper und das Neuropil in der Calyxregion der Pilzkörper. Immunhistochemische Färbungen von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten mit verschiedenen Antikörpern gegen neuronale Proteine belegen, dass die Agglomerate in der Srpk79D-Mutante für Bruchpilot spezifisch sind. Es konnten bisher keine weiteren Komponenten der Agglomerate detektiert werden. Auch ein genereller axonaler Defekt konnte durch Färbungen gegen CSP, Synaptotagmin und Experimenten mit dem Mitochondrienfarbstoff MitoTracker® FM Green ausgeschlossen werden. Die quantitative Auswertung der Präparate zeigte, dass die Morphologie der synaptischen Boutons und die Zahl der Aktiven Zonen durch die Mutation im Srpk79D-Gen nicht beeinflusst werden. Um gesicherte Kenntnis darüber zu erlangen, ob die Mutation im Srpk79D-Gen die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsexperimente durchgeführt. Es konnte sowohl für das hypomorphe Srpk79DP1-Allel, als auch für die Nullmutante Srpk79DVN eine nahezu vollständige Rettung des Agglomerat-Phänotyps mit der panneural exprimierten SRPK79D-PF- oder der SRPK79D-PB-Isoform erreicht werden. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass beide Isoformen der SRPK79D in der Lage sind den Bruchpilot-Agglomerat-Phänotyp zu retten, die Rettung der Verhaltensdefizite jedoch alle Isoformgruppen benötigen. Um zu untersuchen, ob der Agglomerations-Phänotyp der Srpk79D-Mutanten auf einer Überexpression des Bruchpilotgens oder auf Fehlspleißen seiner prä-mRNA beruht, wurden Immunpräzipitationen, semiquantitative RT-PCRs und Real Time-PCRs durchgeführt. Ausgehend von den Ergebnissen kann eine mögliche Überexpression bzw. Spleißdefekte von Bruchpilot weitgehend ausgeschlossen werden. Die simultane Überexpression von SRPK79D und Bruchpilot konnte den Phänotyp der Bruchpilot-Überexpression nicht retten. Anhand der stimulated emission depletion-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die gebildeten Agglomerate das charakteristische Donut-förmige Muster der T-bars zeigen und wahrscheinlich als fusionierte Ketten von T-bars in den larvalen Nerven vorliegen. Beim in vivo Imaging Versuch konnte demonstriert werden, dass das verkürzte Bruchpilot-D3-Strawberry in die Bruchpilot-Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante eingebaut wird und dass größere Agglomerate unbewegt im Nerv verharren. Der anterograde und retrograde Transport kleinerer Agglomerate konnte verzeichnet werden. Bei CytoTrap-Yeast-two-hybrid-Experimenten konnten für die SRPK79D-PB Isoform vier potentielle Interaktionspartner identifiziert werden: das Hitzeschockprotein Hsp70Bbb, die mitochondriale NADH-Dehydrogenase mt:ND5, das large ribosomal RNA Gen in Mitochondrien und das am Spleißen beteiligte Protein 1.3CC/Caper. Die Sequenzierung zeigte, dass nur das letzte Exon von Caper im pMyr-Vektor vorliegt. Der für die PC-Isoform durchgeführte CytoTrap-Versuch ergab nur Temperatur-Revertanten. SR-Proteinkinasen phosphorylieren die RS-Domäne von SR-Proteinen und sind dadurch an der Regulation des konstitutiven und alternativen Spleißens beteiligt. Somit stellen die acht identifizierten SR-Proteine in Drosophila potentielle Interaktionspartner der SRPK79D dar. Die durch RNAi-vermittelte Reduktion von sieben SR-Proteinen führte zu keiner Agglomeration von Bruchpilot. Jedoch führte die RNAi-vermittelte Reduktion des SR-Proteins Spleißfaktor 2 (SF2) zu kleineren Bruchpilot-Agglomeraten in den axonalen Nerven. SF2 ist selbst kein Bestandteil der Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante. Die Überexpression von SF2 führt wahrscheinlich zu einem axonalen Transportdefekt, wie die Färbung gegen das Cysteine string protein zeigte. Weiterhin führt die Überexpression zu einer Akkumulation von SF2 in larvalen Axonen und im adulten Gehirn der Fliegen. SF2 ist nicht nur in Zellkernen sämtlicher Zellen nachweisbar, sondern es konnte auch ein spezifisches Signal im subsynaptischen Retikulum der Postsynapse detektiert werden, wie die Färbungen gegen Disc large bestätigten.
N2  - In a Screen for mutations which affect the distribution of the active zone protein Bruchpilot, the serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) was identified. A mutation in the Srpk79D gene leads to conspicuous agglomeration of Bruchpilot in the larval segmental and intersegmental nerves. The aim of this thesis was to characterize the function of SRPK79D and to identify its interaction partners. The isoform specific antisera which were generated in an earlier PhD thesis recognized only the pan-neuraly overexpressed GFP-tagged SRPK79D isoforms in Western blots and immunhistochemical stainings. After preabsorption and affinity purification the antisera could uncover the localization of the overexpressed SRPK79D-GFP. Without enrichment of the endogenous SRPK79D concentration seems to be too low to be detected with the antisera. However, the endogenous SRPK79D-PC isoform could be detected in a Western blot after immunoprecipitation, but not the SRPK79D-PB isoform. The panneural overexpressed SRPK79D-PC-GFP isoform co-localizes with Bruchpilot as well as with the Bruchpilot interaction partners Liprin-α and Rab3 at active zones and showed a diffuse pattern in the cytoplasm of neuronal cell bodies. In adult brains the panneural overexpressed SRPK79D-PC isoform is detectable in the fanshaped body, ring complex and neuronal cell bodies. The panneural overexpressed SRPK79D-PB isoform is not present at the active zone but is detectable in larval and adult CNS accumulating in discrete spots in the cytoplasm of neuronal cells. The panneural overexpressed SRPK79D-PB isoform is also present in the neuronal cell bodies and calyces of the mushroom body. Larval dissections followed by stainings with different antibodies against synaptic proteins showed that the agglomerates in the Srpk79D mutants are quite specific for Bruchpilot. No other components of the agglomerates could be revealed until now. General impairments of axonal transport could be excluded by stainings against cysteine string protein (CSP), Synaptotagmin, and experiments with the dye MitoTracker® Green FM. These synaptic proteins are uniformly distributed along the larval nerves. The quantification of boutons revealed that the basic synaptic structure is not altered in Srpk79D-mutants. Stainings on frozen head sections of null mutant Srpk79D revealed a spot like Bruchpilot accumulation in the antennal nerves. The mutation of Srpk79D causes behavioral deficits in adult flies as well as a shortened life span. In order to test if expression of either isoform (SRPK79D-PC/PF or –PB) is able to rescue the obtained phenotypes, rescue experiments were performed. A nearly complete rescue of the agglomerate phenotype was achieved with both SRPK79D isoforms. Rescue experiments for the observed behavioral phenotype in the null mutant background did not significant by improve the defect, neither when using the pannreural driver lines elav-GAL4 nor the newly generated nSyb-GAL4. Alkaline Phosphatase treatment followed by 1D- or 2D-gelelecrophoresis could not detect a possible phosphorylation of SRPK79D. Also the vesicle-associated protein Synapsin showed a normal isoform pattern which indicates that Synapsin is not a substrate for SRPK79D. In experiments to detect overexpression or splicing defects of the active zone protein Bruchpilot as possible cause for the agglomeration phenotype in mutant Srpk79D animals, immunoprecipitations, semiquantitative RT-PCRs and Real Time-PCRs were performed. The results showed that overexpression or splicing deficits could be largely excluded. In stainings with the new Bruchpilot antisera N-Term and D2 the staining pattern did not differ from the nc82 staining showing that the PF isoform of Bruchpilot is not forming separate agglomerates in Srpk79DVN mutants. The overexpression of D2-4 and D1-3, truncated Bruchpilot proteins without either the N- or C-terminus, respectively, showed an agglomeration of the corresponding proteins in larval and adult CNS. However the overexpression of D1-3 is not affecting the endogenous Bruchpilot distribution. The simultaneous overexpression of SRPK79D and Bruchpilot could not rescue the phenotype caused by Bruchpilot overexpression. With the stimulated emission depletion microscope the pattern of the Bruchpilot agglomerates in the Srpk79DVN mutant revealed electron-dense donut-shaped structures in larval nerves, presumably fused T-bars. With in vivo imaging experiments anterograde as well as retrograde movement of D3-labeled agglomerates in the Srpk79DVN mutant was observed whereas large agglomerates are immobile. To identify substrates or interaction partners of SRPK79D the Yeast-two-hybrid screen CytoTrap was performed. The CytoTrap screen for the SRPK79D-PB isoform identified four interaction partners: the heat shock protein Hsp70Bbb, the mitochondrial NADH-Dehydrogenase mt:ND5, the large ribosomal RNA gene in mitochondria and 1.3CC/Caper. Caper is involved in splicing via the spliceosome. Sequencing revealed that the pMyr vector includes only the last exon of Caper. The performed CytoTrap for the RC-Isoform detected only temperature revertants. The RNAi mediated knock down of each of the eight known SR proteins in Drosophila showed that seven of them do not produce a phenotype whereas the reduction of SF2 leads to Bruchpilot agglomerates in larval nerves. The SR-Protein SF2 is not included in the agglomerates of the Srpk79D mutant but showed expression in nuclei of all cell types. The overexpression of SF2 leads to an agglomeration of SF2 in the larval nerves probably due to an impairment of general axonal transport. SF2 is not only a nuclear protein; it is also associated with post synaptic structures.
KW  - Taufliege
KW  - Serin
KW  - Arginin
KW  - Proteinkinasen
KW  - RNS-Spleißen
KW  - Genmutation
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - SRPK79D
KW  - Serin-Arginin Proteinkinase
KW  - Spleißen
KW  - Bruchpilot
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - SRPK79D
KW  - serine-arginine protein kinase
KW  - splicing
KW  - Bruchpilot
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53841
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmitt, Karin
T1  - Charakterisierung des BvgAS1,2-Regulons von Bordetella petrii
T1  - Characterization of the BvgAS1,2 regulon of Bordetella petrii
N2  - Die Gattung Bordetella, die phylogenetisch in die Gruppe der β-Proteobakterien eingeordnet und zur Familie der Alcaligenaceae gezählt wird, umfasst nach heutigem Wissenstand neun Gram-negative Arten. Die klassischen Bordetella-Arten B. pertussis, B. parapertussis und B. bronchiseptica werden im sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zusammengefasst. Der strikt humanpathogene Erreger B. pertussis stellt als Verursacher des Keuchhustens das wohl bedeutendste Mitglied der Gattung dar. B. parapertussis ist der Verursacher von respiratorischen Erkrankungen in Menschen und Schafen, während B. bronchiseptica für Atemwegserkrankungen in verschiedenen Säugetieren verantwortlich gemacht wird. Zudem kann B. bronchiseptica für einen längeren Zeitraum in der Umwelt überleben. Die in den letzte Jahren identifizierten „neuen“ Bordetella-Arten, B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum und B. ansorpii, wurden alle human- oder tierassoziiert isoliert und besitzen unterschiedliches pathogenes Potential, das zum Teil noch näher untersucht werden muss. Eine Ausnahme stellt der aus einer anaeroben dechlorinierten Flusssediment-Anreicherungskultur isolierte Keim B. petrii dar. Dieser ist bis zum heutigen Zeitpunkt der einzige Umweltkeim der Gattung Bordetella (von Wintzingerode, Schattke et al. 2001). In evolutionärer Hinsicht ist B. petrii besonders interessant, da er sowohl für orthologe Gene einiger Virulenzfaktoren der pathogenen Bordetellen kodiert, als auch die typischen Eigenschaften eines Umweltkeims aufweist und somit als Bindeglied zu fungieren scheint. Ein solcher Virulenzfaktor ist das BvgAS-System, das in den pathogenen Bordetellen den Hauptregulator der Virulenzgenexpression darstellt, aber in B. petrii strukturell komplexer aufgebaut ist. Neben dem auf Aminosäureebene hoch konservierten Response Regulator bvgA, finden sich in B. petrii Gene für zwei Histidinkinasen, bvgS1 und bvgS2, sowie eine unabhängige hpt-Domäne. Eine periplasmatische Sensordomäne fehlt in beiden Kinasen, und nur in BvgS1 konnte eine PAS-Domäne identifiziert werden. In den letzten Jahren wurden zunehmend B. petrii-Isolate aus den verschiedensten Habitaten isoliert, wie z.B. das Schwammisolate R521 (Sfanos, Harmody et al. 2005) und das klinisches Isolat aus einem Patienten mit mandibulärer Osteomyelitis (Fry, Duncan et al. 2005). Im Rahmen dieser Arbeit wurde über einen PCR-Ansatz versucht, mit aus der Wildtypsequenz abgeleiteten Oligonukleotiden das BvgAS1,2-System der Isolate zu sequenzieren, aber nur im klinischen Isolat konnte ein orthologes Genfragment zum Response Regulator bvgA identifiziert werden. Ein Nachweis der Histidinkinasen sowie der hpt-Domäne schlug in allen untersuchten Isolaten fehl. Die vergleichenden Genomanalysen mittels DNA-Microarrays konnten aufgrund fehlender Hybridisierungen keine weiteren Gemeinsamkeiten und Unterschiede auf DNA-Ebene zwischen den Isolaten und B. petrii DSM 12804 aufzeigen. B. petrii ist ein hoch variabler Umweltkeim, der sich an verschiedene Lebensbedingungen anpassen kann. Dies konnte auch durch die Isolation dreier phänotypisch unterscheidbare Varianten während eines Langzeitwachstumsversuches gezeigt werden (Lechner 2008). Durch die Genomsequenzierung von B. petrii DSM 12804 konnten wenigsten sieben genomischen Inseln beschrieben werden (Gross, Guzman et al. 2008), die durch unterschiedliche Exzision für die Entstehung der Varianten und daraus resultierend für die Variabilität in B. petrii verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Größe der einzelnen genomischen Inseln im Genom von B. petrii durch vergleichende Genomanalysen mittels DNA-Microarrays, mit Ausnahme von GI1, GI5 und GI6, im Vergleich zu den bioinformatischen Vorhersagen bestätigt werden. Diese Inseln zeigten in den Microarray-Analysen eine Vergrößerung bzw. Verkleinerung im Vergleich zu den zuvor beschrieben putativen Grenzen. Die große Instabilität des Genoms von B. petrii DSM 12804 konnte in dieser Arbeit auch durch Microarray-Analysen einzelner Klone aufgezeigt werden, die unterschiedliche Variationen im Bereich der genomischen Inseln aufwiesen. In den Analysen von B. petrii 12804 ΔbvgA bzw. ΔbvgAS konnten zusätzlich zu den gezielten Manipulation im BvgAS1,2-Lokus weitere Deletionen im Bereich von bpet0196-0200, bpet4219-4235 und bpet4176 detektiert werden. Die Re-Integration dieser Genbereiche nach Klonierung einer BvgA-Komplementationsmutante deutet auf eine extrachromosomale plasmid-ähnliche Struktur dieser Bereiche hin. Dies konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend bestätigt werden und bleibt weiter zu untersuchen. Im Verlauf der evolutionären Entwicklung der Bordetellen wurde das BvgAS-System, das ursprünglich für die Adaption an Umweltbedingungen mit verschiedenen Sauerstoff-konzentrationen und/oder Temperaturen zuständig war, mit der Regulation der Expression der Virulenzgene verknüpft (von Wintzingerode, Gerlach et al. 2002). In den Transkriptomanalysen zur Untersuchung der Funktionalität des BvgAS1,2-Systems in B. petrii konnte aufgezeigt werden, dass die Temperatur ein wichtiger Signalgeber für die Expression des Flagellen- und Chemotaxisoperons ist. In B. bronchiseptica wird die Motilität, bei Temperaturen unter 25°C, negativ durch das BvgAS-System reguliert. Auch in B. petrii konnte in den Untersuchungen eine negative Regulation der Flagellen- und Chemotaxisgene durch das BvgAS1,2-System unter diesen Bedingungen detektiert werden. Ob aber in B. petrii die gleiche hierarchische Struktur zur Regulation der Motilität besteht wie in B. bronchiseptica, bleibt zu untersuchen. Im Verlauf der Untersuchungen konnte dem BvgAS-Zwei-Komponentensystem in B. petrii auch eine Funktion im Energiestoffwechsel eingeräumt werden, um auf wechselnde Sauerstoffbedingungen reagieren zu können. Die Messung des Sauerstoffgehaltes der Umgebung und damit eine Regulation der aeroben bzw. anaeroben Atmung erfolgt in B. petrii wahrscheinlich ebenfalls über das BvgAS1,2-System. Die in der Histidinkinase BvgS1 vorhergesagte PAS-Domäne scheint laut den Analysen für diesen Vorgang von großer Bedeutung zu sein. Desweiteren scheint das System auch die Zusammensetzung der Cytochromoxidase zur optimalen Anpassung an aerobe, mikroaerophile und anaerobe Bedingungen zu regulieren.
N2  - The genus Bordetella phylogenetically grouped within the beta-subclass of Proteobacteria and belonging to the family of the Alcaligenaceae comprises to date nine gram negative species. The classical Bordetella species B. pertussis, B. parapertussis and B. bronchiseptica are integrated in the so called B. bronchiseptica-cluster. The obligate human pathogen B. pertussis, as the agent of whooping cough, is the most important member of the genus. B. parapertussis is the agent of respiratory diseases in humans and sheep, whereas B. bronchiseptica causes respiratory diseases in various mammalian species. In addition, B. bronchiseptica has the ability to survive in the environment for a certain period of time. The in recent years identified “new” Bordetella species, B. avium, B. hinzii, B. holmesii, B. trematum and B. ansorpii, have all been isolated in association with humans and animals and exhibit different pathogenic potential, which partly have to be examined further. An exception is the species B. petrii, which was isolated from an anaerobic dechlorinating bioreactor culture enriched by river sediment. Up to date B. petrii represents the first environmental isolate of the genus Bordetella (von Wintzingerode, Schattke et al. 2001). B. petrii encodes both for several orthologous genes to virulence factors of the pathogenic Bordetellae and also shows the typical features of environmental bacteria, it might represent some sort of evolutionary missing link. A putative virulence factor is the BvgAS-systems, which demonstrates to be the master regulator for virulence gene expression in the pathogenic Bordetellae, but in B. petrii this system built-on in a much more complex way. In B. petrii could be identified a response regulator bvgA, which is conserved on amino acid level, two histidine kinase genes, bvgS1 and bvgS2, and a separate gene for the hpt-domain. A periplasmatic sensing domain is missing in both kinases and a PAS-domain could only identified in BvgS1. In the recent years an increasing number of B. petrii isolates could be isolated from various habitats, for example the sponge isolate R521 (Sfanos, Harmody et al. 2005) and the clinical isolate from a patient with mandibular osteomyelitis (Fry, Duncan et al. 2005). In this work a PCR approach, with oligonucleotides derived from the B. petrii wildtyp sequence, was used to sequence the BvgAS1,2-system of the isolates but only in the clinical isolate an orthologous gene fragment of the Response Regulator bvgA could be identified. A detection of the histidine kinases or the hpt-domain failed in all investigated isolates. The comparative genome analysis with DNA-microarrays showed no further similarities and differences between the isolates and B. petrii DSM 12804 because of missing hybridization. B. petrii is a highly variable environmental bacterium capable of adapting to different living conditions. This could be demonstrated by isolation of three phenotypically distinguishable variants during a long-term growth experiment (Lechner 2008). By genome sequencing of B. petrii DSM 12804, at least seven genomic islands could be described (Gross, Guzman et al. 2008), which are responsible for the development of variants and therefore for the variability of B. petrii by different excision. During this study, the size of each genomic island of B. petrii could be confirmed by comparative genome analysis with DNA-microarrays with the exception of GI1, GI5 und GI6 compared to bioinformatic predictions. These islands showed an extension and reduction in the microarray analysis, respectively. The high instability of the genome of B. petrii DSM 12804 could also be demonstrated by microarray analysis of individual clones in this doctorate, which show variations in the area of the genomic island. The analysis of B. petrii 12804 ΔbvgA and ΔbvgAS, respectively, illustrate the specific manipulations in the BvgAS1,2 locus and additional deletions in the area of bpet0196-0200, bpet4219-4235 and bpet4176. The re-integration of these genes into genome after cloning of a BvgA complement thereupon points to that these areas build a plasmid structure. During this work this could not be confirmed and needs to be investigated exhaustively. In progress of the evolutionary development of the Bordetellae, the BvgAS-system, originally envolved in adaption to environmental conditions with different concentrations of oxygen and/or temperatures, was connected with the regulation of the virulence gene expression (von Wintzingerode, Gerlach et al. 2002). In the transcriptomic analysis to evaluate the functionality of the BvgAS1,2-system of B. petrii it could be proofed that the temperature is an important factor for the expression of the flagella and chemotaxis operon. In B. bronchiseptica, the motility is negatively regulated by the BvgAS-system by temperatures below 25°C. Also, a negative regulation of the flagella and chemotaxis genes was detected in the investigation of B. petrii under these conditions. If there is the same hierarchic structure of the regulation of the motility in B. petrii like in B. bronchiseptica may be investigated. During the investigations the BvgAS two-component-system of B. petrii could admit a function in the respiratory control to respond to changing oxygen conditions. The sensing of the environment´s oxygen content and a regulation of the aerobic and anaerobic respiration, respectively, can be awarded to the BvgAS1,2-system in B. petrii. The predicted PAS-domain in the histidine kinase BvgS1 are obviously important during this process according to the analysis. In addition, the system seems to regulate the composition of the cytochrome oxidase well for optimal adaption to aerobic, microaerophilic and anaerobic environmental conditions.
KW  - Bordetella
KW  - Bordetella bronchiseptica
KW  - Microarray
KW  - Nitratatmung
KW  - Motilität
KW  - Genregulation
KW  - Bordetella petrii
KW  - BvgAS-System
KW  - Microarray
KW  - B. petrii-Isolate
KW  - B. petrii-Varianten
KW  - Bordetella petrii
KW  - BvgAS system
KW  - microarray
KW  - isolates of B. petrii
KW  - variants of B. petrii
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53603
ER  - 
TY  - THES
A1  - Torlopp, Angela
T1  - Die Rolle von FGF in der frühen Kardiogenese und Proepikardiogenese im Hühnerembryo
T1  - The role of FGF signaling during early heart and proepicardium development in the chick embryo
N2  - In dieser Arbeit sollte die Funktion von FGF-Signalen im Herzfeld und in der Entwicklung des Proepikards im Hühnerembryo untersucht werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) sind eine große Gruppe von Signalmolekülen und in eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen involviert. Das Proepikard (PE), welches sich asymmetrisch auf dem rechten Sinushorn des Sinus venosus entwickelt, bildet die Grundlage des Koronargefäßsystems des Herzens. FGF-Liganden (FGF2, FGF10, FGF12) werden insbesondere in den epithelialen Zellen des Proepikards exprimiert, sowie an der sinomyokardialen Basis dieser embryonalen Progenitorpopulation. Die FGF-Rezeptoren (FGFR1, FGFR2, FGFR4) weisen ein ähnliches Expressionsmuster auf und deren Inhibition, durch spezifische Antagonisten, war der Ausgangspunkt für die funktionelle Analyse der proepikardialen FGF-Signalaktivität. Die Inhibition von FGF-Signalen in vitro führt zu einem verringerten Wachstum sowie einer erhöhten Apoptoserate in proepikardialen Explantaten, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der Ras/MAPK- als auch der PI3-Kinase-Signalweg, beides Bestandteile der FGF-Signaltransduktion, für das Wachstum und Überleben proepikardialer Zellen verantwortlich sind. Dagegen sind FGF-Signale nicht in die Etablierung proepikardialer Identität involviert, wie die Analyse der Expression etablierter proepikardialer Markergene wie TBX18, WT1 und TBX5 nach FGF-Inhibition zeigte. Dies konnte gleichfalls durch in vivo-Experimente gezeigt werden, in denen die rechtsseitige Inhibition von FGF zu einem retardierten Proepikardwachstum führte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die asymmetrische Apoptose in der sich transient entwickelnden linksseitigen Proepikardanlage auf eine frühe differentielle Expression von Apoptosegenen wie Caspase 2 zurückgeht. Diese asymmetrische Expression wird von FGF8 reguliert, wahrscheinlich als Teil eines frühen rechtsseitigen Signalweges, der Apoptose im rechten Sinushorn des kardialen Einflusstraktes verhindert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression der Hyaluronansynthase 2 (HAS2) in Abhängigkeit von FGF in der Herzfeldregion analysiert. Hyaluronansynthasen produzieren Hyaluronsäure, welches eine essentielle Komponente der extrazellulären Matrix ist. Es wurde in vivo gezeigt, dass die Expression von HAS2 im primären Herzfeld in gleicher Weise von FGF reguliert wird wie die des kardialen Transkriptionsfaktors NKX2.5. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass FGF während der frühen Entwicklung des Herzens und der Entstehung des Proepikards diverse Funktionen besitzt.
N2  - The aim of this study was the functional analysis of FGF signaling during early heart field formation and proepicardial development in the chick embryo. Fibroblast growth factors (FGF) belong to a large group of signaling molecules and play crucial roles in many different developmental processes. The proepicardium (PE) develops asymmetrically on the right sinus horn of the cardiac inflow tract and is the source of the coronary vasculature of the heart. FGF ligands (FGF2, FGF10, and FGF12) are specifically expressed in epithelial cells of the proepicardium as well as in the underlying inflow tract myocardium. FGF receptors (FGFR1, FGFR2, and FGFR4) display similar expression patterns in the proepicardium and their inhibition by specific antagonists was the entry point into the functional analysis of FGF signaling in proepicardial cells. The inhibition of FGF signaling in vitro leads to retarded outgrowth as well as increased apoptosis in proepicardial explants, which were cultured under serum free conditions. It was shown that both Ras/MAPK and PI3 kinase signaling as integral parts of FGF signaling transduction are responsible for growth and survival of proepicardial cells in this context. However, FGF signaling is not involved in the establishment of proepicardial identity as shown by the maintenance of expression of well-established proepicardial marker genes such as TBX18, WT1 and TBX5 after FGF inhibition. These findings were verified by in vivo experiments, showing that inhibition of FGF leads to retarded outgrowth of the proepicardium. Furthermore it was shown that asymmetric apoptosis in a transiently established left-sided PE-anlage is based on an early differential expression of apoptosis-inducing genes like Caspase 2. This asymmetric expression is regulated by FGF8 probably as part of an early right-sided signaling pathway, which prevents apoptosis in the right sinus horn of the cardiac inflow tract. In a second topic of this thesis the expression of the hyaluronan synthase 2 (HAS2) in the control of FGF signaling during early heart field formation was analyzed. Hyaluronan synthases are involved in the production of hyaluronic acid, which is an essential component of the extracellular matrix. The role of FGF signaling was tested in vivo and it is shown here, that the expression of HAS2 in the primary heart field is dependent on FGF as well as other cardiac marker genes such as the transcription factor NKX2.5. This thesis demonstrates that FGF has multiple roles during early heart development and formation of the proepicardium.
KW  - Huhn
KW  - Embryonalentwicklung
KW  - Fibroblastenwachstumsfaktor
KW  - Epikard
KW  - Hyaluronsäure
KW  - FGF
KW  - Wnt
KW  - Has2
KW  - Proepikard
KW  - Kardiogenese
KW  - Apoptose
KW  - Hühnerembryo
KW  - FGF
KW  - Wnt
KW  - Has2
KW  - proepicardium
KW  - cardiogenesis
KW  - apoptosis
KW  - chick embryo
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47695
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wegert, Jenny
T1  - WTX-Mutationsscreen und funktionelle Analyse des Retinsäure-Signalwegs in Wilms Tumoren
T1  - WTX-mutation screening and functional analysis of the retinoic acid signaling pathway in Wilms tumors
N2  - Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist einer der häufigsten bösartigen Tumoren im Kindesalter. Er entsteht aus embryonalem undifferenziertem Nierengewebe und tritt meist als unilateraler und sporadischer Tumor auf. In 10-15% der Wilms Tumoren finden sich WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen. Während diese schon länger als genetische Ursachen des Nephroblastoms bekannt sind, wurde erst kürzlich WTX als drittes Gen beschrieben, welches eine Rolle in der Tumorentstehung spielt. Für einen Großteil der WT ist die genetische Ursache jedoch unklar. Da die bisher publizierten WTX-Mutationsraten auf Untersuchungen kleiner Gruppen basieren und sich stark unterscheiden, sollten in dieser Arbeit WTX-, CTNNB1- und WT1-Mutationen in einem großen WT-Set bestimmt werden. Verluste genetischen Materials in der WTX-Region traten in 17% der Fälle auf und waren zwischen den Geschlechtern gleich verteilt. Die Sequenzierung von WT-Proben zeigte, dass nur 2% von WTX-Punktmutationen betroffen sind. In weiteren 11,5% der Proben konnte keine WTX-Expression nachgewiesen werden. Die WTX-Veränderungen traten z. T. gemeinsam mit WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen auf. Die unvollständige WTX-Deletion in einigen WT legte die Vermutung nahe, dass innerhalb eines Tumors eine Heterogenität in Bezug auf den WTX-Status möglich ist. Dieser Verdacht konnte durch die detaillierte Untersuchung verschiedener Regionen solcher Tumoren erhärtet werden: Hierzu wurden histologisch unterschiedliche Bereiche auf den Anteil einer WTX-Mutation bzw. eines WTX-LOH hin untersucht. Obwohl alle Regionen des jeweiligen Tumors einen kompletten LOH auf Chromosom 11 aufwiesen, waren die WTX-Veränderungen unterschiedlich stark ausgeprägt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass WTX-Veränderungen keine notwendigen und frühen Ereignisse in der Tumorentstehung sind, sondern erst später auftreten und nur einen Teil der Tumorzellen betreffen können. Die Vermutung, dass WTX-Mutationen keinen direkten Einfluss auf die Tumorentwicklung und prognose haben, wird durch das Fehlen eines signifikanten Zusammenhangs zwischen WTX-Deletion bzw. WTX-Expression und den klinischen Eigenschaften der WT gestützt. Um die Rolle von Genen, die potentiell an der Entstehung und Entwicklung des Nephroblastoms beteiligt sind, zu untersuchen oder mögliche neue Therapiestrategien zu überprüfen, sind in vitro-Modelle nötig. Da ein solches für Wilms Tumoren nicht etabliert ist, wurden Primärkulturen aus verschiedenen WT-Proben angelegt. Kulturen aus Tumorgewebe von 12 Patienten mit unterschiedlichen genetischen Veränderungen konnten als echte Tumorzellen validiert werden. Zwei Zelltypen ließen sich morphologisch und immunhistochemisch unterscheiden: Zum einen runde, langsam wachsende Zellen mit Epithelcharakter und zum anderen fibroblastenähnliche Zellen, welche weniger differenziert waren und häufig für viele Passagen kultiviert werden konnten. Somit wurde ein Set verschiedener WT-Primärkulturen etabliert, welches nun für in vitro-Experimente zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der WT-Entstehung oder zum Test neuer Therapieansätze eingesetzt werden kann. Frühere Microarray-Analysen deuteten auf eine Deregulation des Retinsäure (RA)-Signalwegs in fortgeschrittenen Wilms Tumoren hin. Diese Ergebnisse sollten in einem großen unabhängigen Proben-Set mittels Realtime-RT-PCR validiert werden. Eine Deregulation des RA-Signalwegs und die Überexpression von NMYC wurden für Tumoren der Hochrisikogruppe im Vergleich zu Tumoren mit geringem/mittlerem Risiko nachgewiesen. So stellte sich die Frage, ob Patienten mit fortgeschrittenem WT von einem Retinsäure-Einsatz in der Therapie profitieren könnten. Um dies zu beantworten, wurde der Effekt von verschiedenen Retinoiden auf WT-Primärkulturen untersucht. Die WT-Zellen wurden mit all-trans RA (ATRA), 9cisRA, dem synthetischen Retinoid Fenretinid (4HPR) und Kombinationen von ATRA bzw. 4HPR und einem HDAC-Inhibitor (SAHA) behandelt. Gene, welche in Hochrisiko-WT differenziell reguliert waren, wurden untersucht und zeigten nach RA-Behandlung eine entgegengesetzte Expression. In sechs der sieben verwendeten Primärkulturen wurde eine RA-vermittelte Proliferationsreduktion nachgewiesen. Für die Kombinationen von Retinoiden mit SAHA wurden keine synergistischen Effekte beobachtet. Während Fenretinid in den meisten Kulturen Apoptose induzierte, verursachten ATRA und 9cisRA morphologische Veränderungen, welche auf Differenzierungsvorgänge hindeuteten. Eine Microarray-Analyse ATRA-behandelter WT-Zellen zeigte die differenzielle Regulation vieler Gene, welche eine Rolle in der Bildung der extrazellulären Matrix oder bei Differenzierungsvorgängen von Knochen-, Knorpel-, Nerven- oder Muskelgewebe spielen. Diese Befunde bieten einen weiteren Hinweis darauf, dass Retinoide für den Einsatz in der Therapie des Nephroblastoms geeignet sein könnten.
N2  - Wilms tumor (WT) – or nephroblastoma – is one of the most common solid tumors in childhood. It arises from embryonal blastema and most frequently presents as a unilateral and sporadic tumor. Mutations in WT1 and CTNNB1 are well established as causal alterations in about 10-15 % of cases. Recently, WTX (Wilms tumor gene on the X-chromosome), a gene implicated in WNT signaling, has been identified as a third WT gene, but for the majority of nephroblastomas the genetic etiology is still unclear. Published WTX mutation rates in Wilms tumors are still based on smaller cohorts and differ significantly. Therefore, the WTX, CTNNB1 and WT1 mutation state was determined in a large set of 429 Wilms tumors. Genomic WTX alterations were identified in 17% of WT, equally distributed between males and females. Analysis of 104 WT samples for WTX point mutations revealed a frequency of only 2%. An additional 11,5% of tumor samples lacked expression of WTX mRNA. These WTX alterations can occur in parallel to WT1 or CTNNB1 mutations. Incomplete deletion of WTX in several cases suggested heterogeneity of WTX alterations in tumors and this was corroborated by analysis of different regions of such tumors. In cases with heterozygous point mutations or LOH, separate tumor fragments or microdissected regions with different histology were analyzed. Despite complete allele losses at chromosome 11 varying ratios of WTX mutation were detected. This suggests that WTX alteration is not an essential and early mutation needed to drive tumorigenesis, but rather a late event that may affect only a fraction of cells with unclear clinical relevance. This hypothesis is supported by the fact that there is no significant correlation between WTX deletion status or expression level and clinical parameters suggesting that WTX mutations apparently have little direct impact on tumor behavior and presentation. As there is no in vitro model for nephroblastoma that could be used to investigate genes playing a role in development and progression of WT or to test new treatment strategies, primary cultures were generated from fresh tumor tissue. Cultures from tumor samples of 12 patients with different genetic alterations could be validated as tumor derived cells. Two different cell types could be distinguished by immunohistochemistry and cell morphology: large round, slowly growing cells with epithelial characteristics and fibroblast-like cells that are less differentiated and some of which could be kept in culture for many passages before getting senescent. In this way a set of primary WT-cells could be established that is suitable for in vitro approaches to study mechanisms of nephroblastoma development or to test new therapy strategies. Prior microarray analyses suggested a deregulation of the retinoic acid (RA) pathway in advanced Wilms tumors. This should be validated in a large independent tumor set of 163 WT by realtime-RT-PCR. Deregulation of RA signaling and overexpression of NMYC was found in high risk tumors as opposed to tumors with low/intermediate risk and suggested a beneficial impact of retinoic acid on advanced nephroblastoma. To investigate whether retinoids could be employed as a novel therapeutic agent in WT primary WT-cells were treated with all-trans-RA (ATRA), 9cisRA, the synthetic retinoid fenretinide and combinations of retinoids and the HDAC inhibitor SAHA. Expression of genes deregulated in high risk tumors were analyzed and showed opposite changes upon treatment suggesting a positive effect of retinoids. For six of seven primary cultures tested cell growth was reduced upon retinoid administration. No additional synergistic effect could be observed for the combination of retinoids with the HDAC inhibitor SAHA. While fenretinide induced apoptosis in several cultures tested, ATRA and 9cisRA caused morphological changes suggesting differentiation upon treatment. Microarray analysis of ATRA treated WT-cells revealed differential expression of many genes involved in the formation of the extracellular matrix and osteogenic, neuronal or muscle differentiation processes. These findings provide further evidence of a potential utility of retinoids in Wilms tumor treatment.
KW  - Nephroblastom
KW  - Genmutation
KW  - Retinoesaeure
KW  - Signaltransduktion
KW  - Wilms Tumor
KW  - WTX
KW  - Primärkultur
KW  - Nephroblastoma
KW  - Wilms tumor
KW  - WTX
KW  - primary cell culture
KW  - retinoic acid
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52822
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ondrusch, Nicolai
T1  - Der Thiol:Disulfid-Redox Metabolismus und der Blaulichtrezeptor Lmo0799 von Listeria monocytogenes
T1  - The Thiol:Disulfide-Redox Metabolism and the Bluelight-Photoreceptor Lmo0799 of Listeria monocytogenes
N2  - Der Thiol-Redox-Metabolismus, der in allen lebenden Zellen zu finden ist, wirkt oxidativem Stress entgegen. Des Weiteren dient er auch der Aufrechterhaltung der intrazellulären Thiol:Disulfid-Balance, die wiederum für die Funktion vieler Proteine essentiell ist. Auch stellt er Reduktionsäquivalente für die Produktion von Desoxyribonucleotiden für die DNA-Synthese bereit und hilft oxidierte Proteine zu reparieren. Der Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus (TDRM) unterscheidet sich von anderen metabolischen Netzwerken dadurch, dass keine Kohlenstoff- oder Stickstoffbindungen verändert werden. In vielen Fällen beinhaltet er die reversible Oxidation zweier benachbarter Cysteinreste im entsprechenden Protein, was zur Ausbildung von Disulfidbrücken führt. Da ein totaler Ausfall der GSH-Synthese einen geringeren Effekt zu haben schien als ein teilweiser, wurden DNA-Microarray-Transkriptomanalysen der ΔgshF-Mutante durchgeführt. Es wurden rund 750 Gene als signifikant reguliert (p < 0,05, Fold-change <0,5 bzw. >2) identifiziert. Da die am stärksten regulierten Gene von besonderem Interesse waren, wurden die Ausschlussgrenzen auf <0,2 bzw. >5 –fach reguliert heraufgesetzt. Diese Parameter trafen auf 92 Gene zu, davon 41 durch GSH-Mangel herauf-regulierte (d.h. die mRNA-Menge war in der Mutante höher als im Wildtyp) und 51 herunter-regulierte. Auffällig war, dass die Expression vieler Gene, welche durch den Stress-Sigmafaktor SigB reguliert werden, bei Fehlen von GSH verändert war. Zu den am stärksten (sechs- bis elffach) herauf-regulierten Genen zählen lmo0135-7, sie codieren für einen putativen Oligopeptidtransporter. Die Vermutung lag nahe, dass dieser evtl. GSH aus dem Medium in die Zellen transportieren könnte. Man kann also davon ausgehen, dass GSH von Listeria aktiv aus dem Medium aufgenommen wird und dass die Effekte, die im Versuch ohne zusätzliches GSH auftreten, direkt auf das Fehlen von GSH zurückzuführen sind. Zusammengefasst zeigte sich, dass ein Ausfall der GSH-Synthese in Listeria keinen auffälligen Phänotyp zeigt. Es wurden jedoch sehr umfangreiche Veränderungen des Transkriptionsprofils beobachtet, offenbar konnten die Bakterien dadurch eine neue zelluläre Homöostase erreichen. Physiologische Mengen von GSH im Medium komplementierten den Ausfall der GSH-Synthese fast vollständig. Im Laufe dieser Analysen fiel das Augenmerk auf ein Gen mit unbekannter Funktion, lmo0799, das in der ΔgshF-Mutante als deutlich heraufreguliert identifiziert worden war. Eine nähere in-silico-Analyse ergab deutliche Homologien des Lmo0799 Proteins zu einem Blaulicht-photorezeptor, YtvA, von Bacillus subtilis. Da ein Zusammenhang mit dem TDRM aufgrund der Microarray-Analysen mehr als wahrscheinlich schien, richtete sich das Augenmerk verstärkt auf die Charakterisierung des putativen Blaulichtrezeptors Lmo0799. Es wurde eine In-Frame-Deletionsmutante in lmo0799 hergestellt, die mit Δlmo0799-Mutante bezeichnet wurde. Darin ist das ursprünglich 253 Aminosäuren (AS) große Genprodukt von lmo0799 auf sieben AS verkürzt, ohne den Promotor- oder Terminatorbereich bzw. umliegende Gene zu verändern. Parallel wurde begonnen, Versuche zum Einfluss von Licht (blau, λ=455nm bzw. rot, λ=625nm) in vivo und in vitro auf L. monocytogenes durchzuführen. Versuche mittels qRT-PCR wurden durchgeführt um die genaue Wirkweise von Lmo0799 näher aufzuklären. Dazu wurden Testgene aus verschiedenen Regulons ausgewählt und deren Transkription in Proben von Wildtyp und Δlmo0799-Mutante mit und ohne blauem bzw. rotem Licht sowie mit und ohne Salzstress gemessen. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Transkription von Genen des SigB-Regulons, das für die allgemeine Stressantwort in Listerien zuständig ist, durch Licht moduliert wurde. Die Wirkung von Blaulicht hing in hohem Maße von der Anwesenheit von Lmo0799 ab, welches wahrscheinlich eine Komponente des „Stressosoms“ von Listeria darstellt. Die Lichtregulation betraf auch die Internaline A und B, deren Transkription durch Belichtung stark erhöht wurde. Infektionsversuche mit blau belichteten bzw. dunkel gehaltenen Wildtyp- bzw. Δlmo0799-Bakterien an humanen Caco-2 Enterozyten zeigten, dass wildtypische Listerien nach Bestrahlung mit blauem Licht ihre Invasionsrate verdoppelten, während die Δlmo0799-Listerien auf Niveau der Dunkelkontrolle blieben. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass L. monocytogenes (und wohl auch die anderen Listeria-Arten) in Lmo0799 einen funktionalen Blaulichtrezeptor besitzt, der eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Stressreizen via SigB spielt und auch die Motilität und Virulenz moduliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch rotes Licht die Transkription zahlreicher durch Blaulicht regulierter Gene beeinflusst. Der molekulare Mechanismus konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr aufgeklärt werden.
N2  - The thiol-redox metabolism, which can be found in all living cells, counteracts oxidative stress. It also serves in maintaining a proper intracellular thiol:disulfide balance which is essential for many protein functions. It also provides reducing power for the production of deoxynucleotides and thus for DNA synthesis and helps in repairing oxidized proteins. The thiol-redox metabolism and other cellular processes are partially regulated by thiol-based regulatory switches. The thiol:disulfide-redox metabolism (TDRM) differs from other metabolic pathways in that no carbon- or nitrogenbonds are altered. In many cases it involves the reversible oxidation of two neighboring cysteines in the corresponding protein, leading to the formation of disulfide bonds. As a total deficiency in GSH synthesis seemed to have a lesser effect as a partial one, DNA microarray experiments were carried out with the ΔgshF mutant. As it turned out, a large number of genes was affected. Around 750 genes were identified to be differentially transcribed to a significant (p < 0.05, fold-change <0.5 or >2) extend. The focus was on the most differentially transcribed genes and therefore the threshold was set to < 0.2 or >5 – fold regulated, respectively. These parameters held true for 92 genes, of which 41 were up regulated by the lack of GSH (meaning the amount of mRNA of this gene is x-fold higher in the mutant than in the wildtype), and 51 were down regulated. First analyses showed that only few genes of the TDRM list fulfilled these parameters, among them trxB, perR and sod. Interestingly prfA-dependent virulence genes like hly, actA, plcB or inlA and inlB were among the genes down regulated most significantly. This was also confirmed by e.g. lecithinase assay. prfA itself was not differentially transcribed. Strikingly the expression of many SigB-regulated genes was altered when GSH was lacking. Among the genes up regulated the most (six- to elevenfold) were lmo0135-7, encoding a putative oligopeptide transporter. Probably it facilitates the uptake of GSH from the medium into the cell. Taken together, the results of this work show that a loss of GSH synthesis in Listeria does not result in a particular phenotype. However, extensive changes in the transcription profile were observed as a consequence of the lack of GSH, apparently the bacteria thus could establish a new cellular homeostasis. Physiological amounts of GSH in the medium can complement the loss of GSH synthesis almost completely. During these analyses a gene of unknown function, lmo0799, was noticed to be significantly up regulated in the ΔgshF mutant. A closer in silico analysis showed strong homologies of the Lmo0799 protein to a blue-light photoreceptor, YtvA from Bacillus subtilis. As there seemed to be a clear connection to the TDRM because of the microarray analysis, the focus shifted to the characterization of the putative blue light receptor Lmo0799. An in-frame deletion mutant in lmo0799 was obtained, which was designated Δlmo0799. In this mutant the 253 amino acid long gene product of lmo0799 was shortened to seven amino acids, without altering the promoter or terminator region or any surrounding gene, respectively. In parallel, experiments were started to investigate the influence of light (blue, λ=455nm or red, λ=625nm) on L. monocytogenes in vivo and in vitro. qRT-PCR experiments were carried out to give more detailed information on the mode of action of Lmo0799. Test genes from different regulons were selected and their transcription was tested in samples from wild type and the Δlmo0799 mutant, kept in the dark or irradiated with red or blue light, and plus/minus salt stress. It turned out that Lmo0799 is linked to the SigB regulon, responsible for the stress response in Listeria, suggesting that Lmo0799 is a component of the “stressosome”. It also became clear that the transcription of the Internalins A and B was stimulated by blue light. Infection assays with human Caco-2 enterocytes, using wild type and Δlmo0799 bacteria grown under NaCl-stress conditions and in the dark or with blue light, showed that the wild type doubles its invasion rate after illumination with blue light compared to the reference kept in the dark, while the Δlmo0799 mutant showed no increased invasiveness. In this work it could be demonstrated for the first time that L. monocytogenes possess a functional blue-light photoreceptor, Lmo0799, which plays a major role in relaying stress stimuli via SigB and which also modulates motility and virulence. Furthermore, it could be shown that also red light has an effect on the transcription of blue-light modulated genes. The underlying mechanism could not be elucidated in the framework of this thesis.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Thiole
KW  - Photorezeptor
KW  - Photorezeptor
KW  - Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus
KW  - Photoreceptor
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52612
ER  - 
TY  - THES
A1  - Salzmann, Steffen
T1  - Regulation der TNF-Rezeptor Signaltransduktion durch das Zytokin TWEAK
T1  - Regulation of the TNF-receptor signaltransduction through the cytokine TWEAK
N2  - Das pleiotrope Zytokin TNF (tumor necrosis factor) kann an den TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) und den TNF-Rezeptor 2 (TNFR2) binden und mit deren Hilfe seine biologischen Funktionen über verschiedene Signalwege, wie z.B. NFB- und MAPK-Aktivierung bzw. Apop¬toseinduktion, vermitteln. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des TNFR2 zur proteasomalen Degradation des Adaterproteins TRAF2 führt und dadurch die TNFR1-induzierte Apoptose verstärkt wird. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), das ebenfalls der TNF-Ligandenfamilie angehört und die Interaktion mit dessen Rezeptor Fn14 (fibroblast growth factor-inducible 14), der wie der TNFR2 zur Untergruppe der TRAF-bindenden Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie gehört, zeigten in verschiedenen Arbeiten auch eine TRAF2-degradierende Wirkung. In der vorliegenden Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass dies auch im Falle des TWEAK/Fn14-Systems mit einem verstärkenden Effekt auf die TNFR1-vermittelte Apoptose einhergeht. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass TWEAK zusätzlich auch die TNFR1-induzierte Nekrose verstärkt, die den Zelltod durch andere Mechanismen als bei der Apoptose induziert. Von anderen Arbeiten unserer Gruppe war bekannt, dass lösliches TWEAK (sTWEAK) und membranständiges TWEAK (mTWEAK) bezüglich der TRAF2-Depletion wirkungs¬gleich sind. Da der apoptotische Fn14-TNFR1-„crosstalk“ auf der Depletion von TRAF2-Komplexen beruht wurden auch keine signifikanten Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK in Bezug auf die Verstärkung der TNFR1-induzierten Apoptose beobachtet. Interessanter¬weise zeigte sich in der vorliegenden Arbeit jedoch, dass sTWEAK den klassischen NFB-Signalweg gar nicht bzw. nur schwach aktiviert, wohingegen mTWEAK diesen stark induziert. Bei der Aktivierung des alternativen NFB-Signalweges hingegen ließen sich keine Unterschiede zwischen sTWEAK und mTWEAK erkennen. Die Aktivierung eines Signalweges wird also durch die Oligomerisierung des Liganden nicht moduliert, demgegenüber aber erwies sich die Aktivierung eines anderen Signalweges als stark abhängig von der Liganden-Oligomerisierung. Vor dem Hintergrund, dass das Adapterprotein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) Heterotrimere mit TRAF2 bildet, wurde weiterhin untersucht, ob dieses Molekül einen Einfluss auf die Aktivität der TWEAK-induzierten Signalwege hat. Tatsächlich zeigte sich in TRAF1-exprimie¬renden Zellen eine Verstärkung der TWEAK-induzierten Aktivierung des klassischen NFB-Signalweges Zukünftige Studien müssen nun aufklären, inwieweit die hier gefundenen Mecha-nismen das Zusammenspiel von TNF und TWEAK in vivo bestimmen.
N2  - The pleiotropic cytokine TNF (tumor necrosis factor) binds to two receptors, TNF-receptor 1 (TNFR1) and TNF-receptor 2 (TNFR2). TNF elicits its biological functions through different signaling pathways, e.g. NFB- and MAPK-activation and induction of apoptosis. Previous studies revealed that activation of TNFR2 leads to protea¬somal degradation of the adaptor protein TRAF2 and enhanced TNFR1-induced apoptosis. TWEAK (tumor necrosis like weak inducer of apoptosis), a member of the TNF-ligand family and Fn14 which belongs like TNFR2 to the TRAF-binding subgroup of the TNF-receptor family, showed also a TRAF2-degrading effect. In the present thesis it is shown that this is also associated with an enhancement of TNFR1-mediated apoptosis. Furthermore, it was shown that TWEAK also amplifies TNFR1-induced necrosis, a form of cell death that is induced independently and by different mechanisms than apoptosis. In earlier studies in our group it was found that soluble TWEAK (sTWEAK) and membrane bound TWEAK (mTWEAK) have the same TRAF2-depleting effect. Because the apoptotic crosstalk of Fn14 and TNFR1 bases on the depletion of TRAF2-containing complexes, there were no significant differences observed between sTWEAK and mTWEAK concerning the enhancement of TNFR1-induced apoptosis. Interestingly, it was shown in this thesis that sTWEAK can activate the classical NFB pathway not or just weak, whereas mTWEAK can do this very efficiently. However there were no differences between sTWEAK and mTWEAK in the activa¬tion of the alternative NFB pathway. Thus the activation of one type of signaling pathway is therefore not modulated through ligand oligomerisation, but in contrast the activation of another pathway turned out to be strongly dependent of ligand oligomerisation. It is known that the adaptor protein TRAF1 (TNF-receptor-associated factor 1) builds heterotrimers with TRAF2. It was furthermore investiga-ted, whether this molecule has an influence on the activity of TWEAK-induced pathways. Actually there was increased activity in TWEAK-mediated classical NFB signaling observed in TRAF1-expressing cells. Further studies have to clarify to which extend the here found mechanisms affect the TNF-TWEAK interplay in vivo.
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor
KW  - Signaltransduktion
KW  - TNF
KW  - TWEAK
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52525
ER  - 
TY  - THES
A1  - Derrer, Bianca
T1  - Charakterisierung der Vitamin B6 Synthese und des Shikimatsyntheseweges im Malariaerreger Plasmodium ssp.
T1  - Characterisation of vitamin B6 synthesis and shikimate pathway in the malaria causing agents Plasmodium ssp.
N2  - Malaria ist eine schwerwiegende Krankheit, die jährlich über eine Million Menschen tötet. Die zunehmende Resistenzbildung gegenüber den verwendeten Medikamenten macht die Entwicklung neuer Antimalariamittel dringend notwendig. Daher sind die Vitamin B6 Synthese und der Shikimatweg von besonderem Interesse, da diese beiden Synthesewege nur im Parasiten und nicht im Menschen vorkommen. Unter der Voraussetzung, dass diese essentiell für den Parasiten sind, böten sie ideale Ansatzpunkte zur Entwicklung neuer Antimalariamittel. Voraus gegangene Studien haben gezeigt, dass Plasmodium falciparum in der Lage ist, PLP de novo mittels eines bifunktionalen Enzymkomplex, bestehend aus den Proteinen Pdx1 und Pdx2, zu synthetisieren. Pdx1 stellt dabei die eigentliche Synthase dar, während Pdx2 als Glutaminase-Partner das benötigte Ammoniumion für den heterocyclen Ring bereitstellt. Zusätzlich dazu verfügt der Parasit auch über einen salvage pathway um PLP zu „recyclen“, in dem der Pyridoxalkinase PdxK eine Schlüsselfunktion zufällt. Knockout Studien der pdx1 im Mausmalariasystem P. berghei haben gezeigt, dass PbPdx1 für eine optimale Entwicklung der Blutstadien benötigt wird, nicht jedoch für deren Überleben. Im Rahmen dieser Arbeit habe ich die Effekte eines pbpdxK(-) Knockouts in demselben System untersucht. Es konnte eine monoklonale Knockoutlinie generiert werden, was zeigte, dass PbPdxK nicht essentiell für das Überleben des Parasiten in den Blutstadien ist. Die Entwicklung während des Blutstadiums war von dem pbpdxK(-) Knockout nicht betroffen. Allerdings zeigte sich im Moskitostadium eine drastische Reduktion der Sporozoitenzahl sowohl in den Mitteldärmen als auch in den Speicheldrüsen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass PbPdxK essentiell für das Überleben der Sporozoiten ist. Daneben wurde versucht, die Gene pfpdx1, pfpdx2 sowie pfpdxK in P. falciparum 3D7 durch Verwendung der single cross over Strategie auszuschalten. Es konnte jedoch für keines der genannten Konstrukte eine Integration in die jeweiligen Genloci anhand von PCR-Analysen nachgewiesen werden. Ebenso scheiterte der Versuch, durch Rekombination eines komplementären Genabschnitts die Funktion des Gens zu rekonstituieren. Daher bleibt es unklar, ob pfpdx1, pfpdx2 und pfpdxK durch Knockout Strategien auszuschalten sind oder nur für Genmanipulationen nicht zugänglich sind. Die Kultivierung von P. falciparum 3D7 Parasiten in Vitamin B6 depletiertem Medium hatte keinen Effekt auf deren Wachstum. Eine anschließende Analyse der Proteinextrakte zeigte eine erhöhte Expression der PfPdxK, während sich das Expressionslevel der PfPdx1 nicht veränderte. Es scheint, dass der Parasit in der Lage ist Vitamin B6 Mangel durch vermehrte Nutzung des salvage pathways vollständig zu kompensieren. Frühere Arbeiten zeigten, dass der C-Terminus der Pdx1 in die Aktivität des PLP Synthasekomplexes involviert ist. Aus diesem Grund wurden verschiedene C-terminale Deletionsmutanten der PfPdx1 konstruiert und dabei bis zu 30 Aminosäuren entfernt. Diese Analysen ergaben, dass der C-Terminus vier verschiedene Funktionen besitzt: das Assembly der Pdx1 Untereinheiten zum Dodekamer, die Bindung des Pentosesubstrats Ribose 5-Phosphat, die Bildung des Intermediats I320 und schließlich die PLP Synthese. Diese unterschiedlichen Funktionen wurden durch verschiedene Deletionsvarianten identifiziert. Darüber hinaus waren alle Deletionsvarianten in der Lage, die Glutaminase Pdx2 zu aktivieren, was zeigt, dass das Dodekamer nicht Vorraussetzung für die Glutaminaseaktivität ist. Aufgrund der geringen PLP Syntheseaktivität in vitro wurde vermutet, dass der PfPdx1/PfPdx2 Komplex durch einen zusätzlichen Faktor aktiviert wird. Daher wurde versucht, mittels Yeast 2-Hybrid, basierend auf einer PCR-amplifizierten P. falciparum 3D7 cDNA-Bibliothek als bait und PfPdx1 als prey, einen Interaktionspartner zu identifizieren. Mehrere Klone wurden gewonnen, die alle einen Bereich des Mal13P1.540, einem putativen Hsp70 Proteins, enthielten. Jedoch scheiterten alle Versuche, die Protein-Protein-Interaktion mit rekombinant exprimierten Protein zu bestätigen. Ebenso war es nicht möglich, das vollständige Mal13P1.540 rekombinant zu exprimieren sowie dessen Lokalisation in vivo zu bestimmen. Daher bleibt die Interaktion von PfPdx1 und Mal13P1.540 ungeklärt. Neben der Vitamin B6 Biosynthese konnten auch einige Gene des Shikimatweges in Plasmodium identifiziert werden. In P. berghei konnten der C-terminale Teil der 3-Dehydroquinatsynthase (2) sowie die Shikimatkinase (5) und die 5-Enoylpyruvylshikimat 3-Phosphatsynthase (6) in einem open reading frame (ORF) identifiziert werden, der dieselbe genetische Organisation aufweisen wie der Arom-Komplex der Hefen. Mit Hilfe eines Komplementationsassay wurde die Funktionalität dieses ORFs überprüft. Dazu wurden S. cerevisiae BY4741Δaro1, ein Hefestamm ohne funktionalen Arom-Komplex, mit dem Pb2_6_5_ABC Fragment transformiert. Die so transformierten Hefen waren nicht in der Lage, auf Mangelplatten ohne aromatische Aminosäuren zu wachsen, was zeigte, dass das Pb2_6_5_ABC Konstrukt den BY4741Δaro1 Phänotyp nicht komplementieren konnte. Der Versuch, mit Hilfe des Baculovirussytems rekombiant exprimiertes Protein zu erhalten, verlief erfolglos. Ebenso war es nicht möglich, Teile des Proteins für Immunisierungen zu exprimieren. Daher bleibt die Funktionalität des Pb2_6_5_ABC Konstruktes ungeklärt.
N2  - Malaria is a serious burden of mankind causing over one million deaths a year. In view of the raising number of resistances to common drugs there is an urgent need for the development of new antimalarial drugs. In this respect, the vitamin B6 biosynthesis and the shikimate pathway are of particular interest, since these synthesis pathways are only present in the malarial parasites and not in their human host. Given their essentiality for the parasite, they would represent ideal targets for antimalarial drug development. Previous studies revealed that Plasmodium falciparum is able to produce PLP de novo through a bifunctional enzyme complex composed of the proteins Pdx1 and Pdx2, of which Pdx1 is the actual synthase and Pdx2 the glutaminase partner providing the nitrogen for the ring system. In addition, the parasites possess a salvage pathway for PLP, of which pyridoxal kinase, PdxK, is a key player. Knockout studies of the pdx1 in the rodent malaria system P. berghei showed, that pbpdx1 is required for the optimal development of parasite blood stages but is not essential for parasite survival. Here, I investigated the effect of a pbpdxK(-) knockout in the same system. A monoclonal knockout strain was obtained, indicating that PbPdxK is not essential for the survival of the parasite. Blood stages were not affected by the knockout. However, in the mosquito stages pbpdxK(-) showed a tremendous reduction of sporozoites numbers in the midgut and in the salivary glands, indicating that PbPdxK is essential for the survival of sporozoites. It was then also tried to knockout pfpdx1, pfpdx2 and pfpdxK in the P. falciparum 3D7 strain by using the single cross over strategy. However, no integration of the constructs in the corresponding gene locus could be detected by a PCR approach. Also an approach to complement the loss of endogenous gene function by generating a functional gene copy upon recombination failed. Thus, it remains unclear if pfpdx1, pfpdx2 and pfpdxK can be knocked out or are inaccessible for gene targeting in P. falciparum. Cultivation of P. falciparum 3D7 parasites in medium deficient of vitamin B6 showed no effect on the growth rate of the parasites. Analysis of protein extracts of these parasites revealed an upregulation of PfPdxK expression, whereas the level of PfPdx1 remained stable. Thus it seems that the parasite is fully able to compensate vitamin B6 malnutrition by the increased usage of the salvage pathway. Previous studies on the activity of the PLP synthase complex indicated that the C-terminal end of Pdx1 is involved in PLP formation. Therefore several C-terminal deletion mutants of PfPdx1 were constructed, removing up to 30 amino acids. These analyses revealed that the C-terminus has four distinct functionalities: assembly of the Pdx1 monomers, binding of the pentose substrate (ribose 5-phosphate), formation of the reaction intermediate I320, and finally PLP synthesis. Deletions of distinct C-terminal regions distinguish between these individual functions. All variants were able to activate the glutaminase PfPdx2, indicating that the dodecameric structure is not a prerequisite for Pdx2 activation. Due to the low PLP synthase activity in vitro it was assumed that the PfPdx1/PfPdx2 complex maybe activated by an additional protein. Hence a yeast 2-hybrid assay was performed, using PfPdx1 as prey and a PCR-amplified cDNA-library of P. falciparum 3D7 as bait. Several clones were detected on high stringency plates, containing all a region of Mal13P1.540, a putative Hsp70 protein. Trials to confirm protein-protein interaction with recombinantly produced proteins failed as well as protein expression of full length Mal13P1.540. It was also not possible to determine the localisation of Mal13P1.540 in vivo. Thus, an interaction of PfPdx1 with Mal13P1.540 could so far not be verified. Besides the vitamin B6 biosynthesis, some genes of the shikimate pathway were identified in Plasmodium. In P. berghei, the C-terminal part of the dehydroquinatesynthase (2) as well as the shikimate kinase (5) and 5-enoylpyruvylshikimate 3-phosphatesynthase (6) were found in a single open reading frame having the same organisation as the arom-complex of yeast. To proof the functionality of these genes a complementation assay with S. cerevisiae BY4741Δaro1 with the Pb2_6_5_ABC construct, comprising the above mentioned genes, was performed. However, transformded yeast strains were not able to grow on minimal media without aromatic amino acids, indicating that they were not able to produce chorismate. Recombinant expression of this constructs in the baculovirussystem did not yield any detectable protein. Expression of parts of this protein for immunisation was also not successful. Hence, the functionality of this protein remains to be established.
KW  - Plasmodium falciparum
KW  - Shikimisäure
KW  - Vitamin B6
KW  - Biosynthese
KW  - Shikimatsynthese
KW  - Plasmodium falciparum
KW  - Malaria
KW  - vitamin B6 synthesis
KW  - shikimate pathway
KW  - malaria
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51456
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hacker, Christian
T1  - Beteiligung des Major Vault Proteins an der Kernporenkomplexbildung
T1  - Involvement of the Major Vault Protein in nuclear pore complex formation
N2  - In die Kernmembran von Eukaryoten sind Kernporenkomplexe eingelagert. Diese stellen die einzige Verbindung zwischen dem Nukleo- und Zytoplasma dar und vermitteln den gerichteten Transport von Proteinen und Ribonukleoproteinpartikeln über die Kernhülle. Durch vorangehende Versuche unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass es experimentell möglich ist, die Bildung einer kontinuierlichen Doppelmembran von der Insertion der Kernporenkomplexe zu trennen (Ewald et al., 1997). Dabei spielen verschiedene im Extrakt enthaltene Membranfraktionen eine Rolle. Erst kürzlich wurden in unserer Arbeitsgruppe zwei unterschiedliche Membranfraktionen aus Xenopus Extrakt isoliert, die aufgrund ihrer Dichte als 40% und 30% Membranfraktion benannt wurden. Massenspektrometrische Untersuchungen zeigten, dass sich in der 30% Membranfraktion, welche für die Kernporenkomplexbildung verantwortlich zu sein scheint, das Major Vault Protein (MVP) befindet. MVP ist Hauptbestandteil der Vault-Komplexe, großer tonnenförmiger Ribonukleoproteinpartikel, denen bislang eine Vielzahl von zellulären Funktionen zugeordnet wurden, die meisten davon jedoch noch stark debattiert. Vaults könnten womöglich eine Rolle als Transporter über die Kernporenkomplexe spielen und wurden schon mehrfach mit dem Aufbau einer multiplen Arzneimittelresistenz in Verbindung gebracht. Die Beteiligung von MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe ist eine neue zelluläre Funktion und sollte deshalb in dieser Arbeit näher untersucht werden. In dieser Arbeit wurden zunächst die 40% und 30% Membranfraktionen auf ihr unterschiedliches Verhalten bei der Bildung der Kernhülle separat und in Kombination genauer untersucht. Dabei zeigte sich, dass die 40% Membranfraktion an Chromatin bindet und eine kontinuierliche Doppelmembran aufbaut. Die 30% Membranfraktion konnte alleine nicht an Chromatin binden, induzierte aber in der durch die 40% Membranfraktion gebildeten Doppelmembran den Aufbau von Kernporenkomplexen. Durch Immunfluoreszenzaufnahmen und ultrastrukturelle Untersuchungen wurde belegt, dass das an der 30% Membranfraktion assoziierte MVP für die Bildung von Kernporenkomplexen verantwortlich war. Ferner konnten wir zeigen, dass sowohl MVP als auch Vault-Partikel die de novo Insertion von Kernporenkomplexen in kontinuierliche Doppelmembranen induzieren konnten. Die molekularen Mechanismen der Kernporenkomplexbildung durch MVP wurden mit Hilfe von artifiziellen Lipidmembranen analysiert. Anhand von unilamellaren Liposomen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass MVP die Lipidstruktur beeinflussen und perforieren kann. Zudem löste MVP die Bildung von Poren in schwarzen Lipidmembranen aus und führte zur Messung von Strömen durch Einzelkanalmessungen über die entstandenen Poren. Um die bei dem Prozess der Kernporenkomplexbildung beteiligten Bindungspartner von MVP zu identifizieren, wurden mehrere Protein-Protein-Bindungsstudien durchgeführt. Unter den ermittelten MVP-Bindungspartnern ließen sich keine Nukleoporine mit dem Sequenzmotiv FXFG identifizieren, es ist jedoch nicht auszuschließen, dass MVP bei der Bildung der Kernporenkomplexe mit anderen Nukleoporinen interagiert. Da eine frühere Arbeit die Bedeutung von Mikrotubuli bei der Bildung der Kernporenkomplexe aufzeigte (Ewald et al., 2001), wurden in dieser Arbeit die Interaktionen der isolierten 40% und 30% Membranfraktionen und von MVP mit dem Mikrotubulinetzwerk näher analysiert. Dabei zeigte sich, dass nur die 30% Membranfraktion mit Mikrotubuli interagierte und eine Inhibition der Mikrotubulipolymerisation durch Colchizin den Einbau von Kernporenkomplexen verhinderte. Im Gegensatz dazu interagierten die 40% Membranvesikel nicht mit Mikrotubuli und daher hat eine Colchizin-induzierte Inhibition der Mikrotubulipolymerisation keinen Effekt auf den Aufbau einer kontinuierlichen Doppelmembran. Durch immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnte zudem gezeigt werden, dass die Lokalisation von MVP an der Kernhülle ebenfalls Abhängig von Mikrotubuli ist. Um zu demonstrieren, dass die MVP-induzierte Kernporenkomplexbildung im zellfreien System abhängig vom Transport von MVP zur Kernhülle ist, wurde die Zugabe von MVP zu porenlosen Kernen nach einer Colchizin-Behandlung analysiert. Hierbei konnte belegt werden, dass MVP Mikrotubuli auch benötigt, um die Bildung von Kernporenkomplexen in der Kernmembran zu initiieren. Da Mikrotubulifilamente im zellfreien System mit ihren Plus-Enden gegen die Chromatinoberfläche gerichtet sind, sollten für den gerichteten Transport zum Chromatin Motorproteine der Kinesin-Familie eine Rolle spielen. Durch die Inhibition von Mklp2, einem mitotischen Kinesin, konnte der Aufbau der Kernporenkomplexe durch MVP in porenlosen Kernen blockiert werden.
N2  - In eukaryotes, the nuclear envelope is normally interspersed with numerous nuclear pore complexes, which act as the only gateway between the nucleo- and cytoplasm. Nuclear pore complexes mediate the directed transport of proteins and ribonucleoproteinparticles through the nuclear envelope. Little is known about the assembly of these structures out of various subcomplexes. Interestingly, our group recently linked the Major Vault Protein (MVP) with the assembly of nuclear pore complexes. MVP is the main part of Vault-complexes, huge barrel-shaped ribonucleoproteinparticles with many cellular functions attached, many of them still in debate. Vaults possibly play a role as nuclear transporters and several works exist that connect them with the origin of multiple drug resistance. The involvement in the assembly of nuclear pore complexes depicts a novel cellular function of MVP and should therefore be analyzed in this project. Preceding work with the cell-free system based on Xenopus laevis egg extract showed that the building of a continuous double membrane could be separated from the insertion of nuclear pore complexes and could be assigned to different membrane fractions of the egg extract. (Ewald et al., 1997). Two different membrane fractions were isolated out of Xenopus egg extract and named 40% and 30% membrane fraction according to their density. Mass spectrometric analysis showed that the pore-inducing 30% membrane fraction contained MVP (Dissertation Friederike Vollmar). The first step in this project was the particularly examination of the different behaviour of the 40% and 30% membrane fraction during the formation of the nuclear envelope. Thereby, it could be demonstrated that the 40% membrane fraction binds to chromatin where it builds up a continuous double membrane. The 30% membrane fraction was not able to independently bind to chromatin, but induced the formation of nuclear pore complexes when added to the pore-free nuclei. Immunofluorescent and ultrastructural studies proved that the MVP-associated 30% membrane fraction is responsible in this process. MVP, as well as Vault-particles have the ability to induce the de novo insertion of nuclear pore complexes in continuous double membranes. Artificial lipid membranes were used to study the molecular mechanisms involving MVP during the process of nuclear pore complex assembly. By using unilamellar liposomes and electron microscopy it could be demonstrated that MVP affects and perforates the lipid structure. Furthermore, MVP induced the formation of pores in black lipid membranes and lead to the detection currents by single channel measurement. To identify MVP-binding partners that are involved in the process of nuclear pore complex formation, several protein-protein-interaction studies were performed. The studies showed that no nucleoporins with the sequence motive FXFG could be detected among the MVP-binding partners, but it cannot be ruled out that MVP interacts with other nucleoporins during the formation of nuclear pore complexes. As a previous study showed the importance of microtubules during the assembly of nuclear pore complexes (Ewald et al., 2001), this work analyzed the interactions of the isolated 40% and 30% membrane fraction and of MVP concerning the microtubule network. Thereby, it could be shown that only the 30% membrane fraction was able to interact with microtubules and the colchicines-induced inhibition of microtubule polymerisation prevented the insertion of nuclear pore complexes. In contrast, the 40% membrane vesicles did not interact with microtubules and the colchicine-induced inhibition of microtubule assembly had no effect on the constitution of a continuous double membrane. In the next step, immunofluorescence studies demonstrated that the nuclear localisation of MVP is also dependent on microtubules. To demonstrate that the MVP-induced formation of nuclear pore complexes also depends on the microtubule-driven transport of MVP towards the nuclear membrane, the addition of MVP to pore-free nuclei was monitored after colchicine treatment. Hereby, it could be shown that MVP also needed microtubules to initiate the assembly of nuclear pore complexes. As the plus-ends of microtubules are directed towards the chromatin surface in the cell-free system, the directed transport in the direction of chromatin should be mediated by motor proteins of the Kinesin family. The inhibition of Mklp2, a mitotic Kinesin, prevented the assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. The MVP-mediated de novo assembly of nuclear pore complex therefore is accomplished by the microtubule-transport of MVP via Mklp2.
KW  - Ribonucleoproteine
KW  - Kernhülle
KW  - Kernpore
KW  - Kernporenkomplex
KW  - Major Vault Protein
KW  - Vault
KW  - Kernhüllenbildung
KW  - Xenopus laevis
KW  - Nuclear pore complex
KW  - Major Vault Protein
KW  - Vault
KW  - Nuclear envelope assembly
KW  - Xenopus laevis
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51279
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Lambeets, Kevin
A1  - Vandegehuchte, Martijn L.
A1  - Maelfait, Jean-Pierre
A1  - Bonte, Dries
T1  - Integrating environmental conditions and functional life-history traits for riparian arthropod conservation planning
N2  - River banks are naturally disturbed habitats, in which local flood events and the landscape structure are expected to govern riparian species assemblages. Not solely effects of flooding per se, but also related changes in vegetation structure will affect species’ distribution. By elucidating the relationships between species’ occurrence and multivariate habitat conditions on a restricted spatial scale, insight into conservation strategies to preserve riparian species is gained. Ordination and grouping methods revealed important environmental and functional trait constraints on species composition of predatory riparian arthropod assemblages. Mainly flooding disturbance appeared to affect spider and carabid beetle species composition. Habitat affinity and dispersal ability were retained as important traits explaining similarity between arthropod assemblages. River banks similar in species composition differed in absolute and functional group species richness. Furthermore, Poisson regressions demonstrated the importance of variation in discharge regime, sediment composition and vegetation structure for the preservation of rare riparian arthropods. Whereas hygrophilic species benefited from increased vegetation cover, xerothermophilic specialists were favoured by increased flooding disturbance. In contrast to flight-active riparian carabids occurring throughout the river system, especially cursorial spiders are expected to go extinct under increased anthropogenic alterations of discharge regimes. We show the importance of a dynamic and evidence-based approach of river management on a local scale to preserve vulnerable riparian arthropods. In general, river restoration should generate the required heterogeneity in environmental conditions (e.g. dynamic processes) at the river bank level, thereby increasing the sustainability of riverine landscapes. More-over, we argue that the understanding of functional responses towards environmental factors results in general and widely applicable guiding concepts for species conservation.
KW  - Laufkäfer
KW  - Flussufer
KW  - carabid beetles
KW  - flooding disturbance
KW  - multi-species approach
KW  - lowland river banks
KW  - river restoration
KW  - spiders
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50148
ER  - 
TY  - THES
A1  - Breher, Stephanie
T1  - Die kardiale Funktion von Popdc1 in der Maus: Vom Gen zum Phän
T1  - The cardiac function of Popdc1 in mouse: From gene to phene
N2  - Die Popeye domain containing (Popdc)-Gene bilden eine evolutionär stark konservierte Genfamilie mit präferenzieller Expression im Herzen und in der Skelettmuskulatur. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Popdc1 in kardialen Myozyten in Glanzstreifen, lateralen Membranen und im T-Tubuli-System exprimiert wird und mit Ionenkanälen und anderen myozytären Membranproteinen wie Cav1.2, Caveolin 3 und NCX1 kolokalisiert ist. Im ventrikulären Reizleitungssystem ist die Expression von Popdc1 gegenüber dem ventrikulären Arbeitsmyokard erhöht, während Atrium und Sinusknoten nahezu äquivalente Expressionsdomänen aufweisen. Mithilfe von elektrophysiologischen Untersuchungen konnte bei den Popdc1-Nullmutanten eine stressinduzierte Sinusbradykardie festgestellt werden, die altersabhängig auftritt und auf Sinuspausen zurückzuführen ist. Histologische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme des Sinusknotenmarkers HCN4, zeigten einen Zellverlust im inferioren Teil des Sinusknotens. Popdc1 ist ein Transmembranprotein, das eine 150 Aminosäure umfassende, stark konservierte Popeye-Domäne aufweist. Für diese Domäne konnte auf struktureller Ebene eine Homologie zu zyklischen Nukleotid-Bindungsdomänen vorhergesagt und eine Bindung an cAMP und cGMP experimentell demonstriert werden. Es handelt sich bei den Popdc-Proteinen um einen neuen Zweig der Bindungsproteine für zyklische Nukleotidmonophosphate (cNMP). Die Bindungssequenz weist signifikante Unterschiede zu anderen bereits identifizierten cNMP-Bindungsproteinen auf. Weiterhin wurde die Interaktion von Popdc1 mit TREK1, einem Mitglied der Tandemporenkanäle untersucht. Es zeigte sich, dass Popdc1 nach Koexpression in Froschoozyten, den TREK1-Strom erhöht und dass die &#946;-adrenerge Inhibition des TREK1 Kanals durch Popdc1 verstärkt wird. Im Arbeitsmyokard, im kardialen Reizleitungssystem und in kotransfizierten Cos7-Zellen werden beide Proteine überlappend exprimiert. Diese Daten zeigen, dass Popdc1 eine wichtige Funktion bei der Regulation der Schrittmacheraktivität, der Aufrechterhaltung der Sinusknotenmorphologie und der Modulation von Ionenkanälen aufweist. Interessanterweise wurden von unserer Arbeitsgruppe bereits die gleichen Phänotypen für die Popdc2 Maus beschrieben, sodass die Popdc Genfamilie überlappende und redundante Funktionen aufweist.
N2  - The Popeye domain containing (Popdc) family is a highly evolutionary conserved gene family, which shows no homology to other genes. This family shows a preferential expression in the heart and skeletal muscle. In the present study it is shown that Popdc1 protein in the heart was predominantly localized to the intercalated disc, lateral membranes and T-tubularsystem, where it was co-localized with other cardiac membrane proteins such as Cav1.2, Caveolin 3 and NCX1. The expression of Popdc1-LacZ transgene as well as Popdc1 protein was elevated in the ventricular conduction system compared to the ventricular working myocardium. In contrast, expression in atrial tissue was equivalent to the expression in the sinus node. Electrophysiological measurements in Popdc1 null mutants revealed a stressinduced and age-dependent sinus bradycardia, which was due to an increase in sinus pauses and independent of the nature of stress. Histological examinations with the help of the sinus node marker HCN4 revealed structural alterations in the inferior part of the sinus node in 8 months old Popdc1-mice. Biochemical examinations of Popdc1 showed that Popdc1 is a transmembrane protein. The N-terminus is extracellular and glycosylated, while the Cterminus is intracellular and harbours a highly conserved 150 amino acid-long Popeye domain. For this domain, a predicted homology to cyclic nucleotide binding domains was observed. Binding of cAMP and cGMP was experimentally demonstrated and thus, the Popdc proteins constitute a novel branch of the cyclic nucleotide binding protein family. Furthermore interaction of Popdc1 with the tandem pore channel TREK1 was examined. After co-injection of Popdc1 the TREK1 current was increased in Xenopus oocytes. Furthermore, &#946;-adrenergic inhibition of TREK1 current was enhanced in the presence of Popdc1. In working myocardium, conduction tissue as well as in co-transfected Cos7 cells the two proteins showed a similar distribution. In conclusion, Popdc1 is involved in cardiac pacemaker activity, maintaining sinus node morphology and modulating ion channels that contribute to the setting of the membrane potential in cardiac myocytes. Interestingly, a highly similar phenotype was observed for the Popdc2 mouse mutant and therefore the Popdc gene family displays overlapping and redundant functions.
KW  - Sinusknoten
KW  - Genexpression
KW  - Elektrophysiologie
KW  - Popdc1
KW  - Transmembranprotein
KW  - Sinusknotenbradykardie
KW  - cAMP-Bindung
KW  - Popdc1
KW  - transmembrane protein
KW  - sinus bradycardia
KW  - cAMP binding
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37283
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heinecke, Kai
T1  - Die Dynamik der primären Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren
T1  - Dynamics of the primary recognition steps of BMP receptors
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) die Transforming Growth Factor &#946;-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im nächsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und fünf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuität in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen lässt. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ ähnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne sowie einer intrazellulären Kinasedomäne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellulären Domänen führt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene auslösen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilität der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass für die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden nötig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalität der verschiedenen Rezeptordomänen in der Signalübermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedomäne abhängig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abhängig ist.
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), together with Activins, Growth and Differentiation Factors (GDFs) and Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;), are secreted signalling proteins that belong to the Transforming Growth Factor &#946; superfamily. They play an important role in regulating the development, maintenance and regeneration of tissues and organs. Signalling of TGF&#946; superfamily members occurs by binding to two types of serine-/threonine kinase receptors termed type I and type II. First, the high affinity receptor (in case of BMP2 the type I receptor) is bound, and then the low affinity receptor is recruited into the signalling complex. The fact that there are only seven type-I and five type-II receptors are known implies a limited promiscuity in ligand-receptor interaction. The architecture of both receptor subtypes is quite similar, with a small extracellular ligand-binding domain, a single transmembrane domain and an intracellular kinase domain. Subsequent transphosphorylation of the intracellular receptor domains leads to phosphorylation of SMAD proteins, which then act as downstream mediators and activate gene transcription. The main part of this work was to analyze the initial steps in receptor complex formation and the mobility of TGF&#946;-superfamily receptors with fluorescence microscopy techniques. It could be shown that complex formation requires a certain ligand threshold concentration and shows an all-or-nothing switch-like behaviour. Furthermore, differences between different ligands using the same receptors could be visualized. The other parts of this work deal with the functionality of the different receptor domains in signal transduction, the analysis of high- and low-affinity binding sites on whole cells and the influence of the SMAD- and MAPK-pathways on alkaline phosphatase induction. It could be shown that the type of SMAD phosphorylation ist solely dependent on the type of the kinase domain, that there exist different receptor populations on a cell that are addressed by different ligand concentrations and that alkaline phosphatase induction is highly dependent on the time course of SMAD- and MAPK-pathway activation.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
KW  - Signaltransduktion
KW  - Signalkomplex
KW  - Rezeptormobilität
KW  - Rezeptor-Liganden-Interaktion
KW  - Physiologische Chemie
KW  - Molekulare Biophysik
KW  - Molekularbiologie
KW  - Signaling complex
KW  - receptor mobility
KW  - receptor-ligand-interaction
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gruber, Franz Andreas
T1  - Untersuchung zur Regulation der Expression des zuckerkonditionierten Verhaltens bei Drosophila melanogaster
T1  - Analysing the regulation of the expression of sugar-conditioned behaviour in Drosophila melanogaster
N2  - In dieser Doktorarbeit habe ich die Regulation der Expression des zuckerbelohnten Verhaltens durch den Fütterungszustand bei Drosophila melanogaster untersucht. Die Fliegen können während einer Trainingsphase mit Hilfe einer Zuckerbelohnung auf einen bestimmten Duft konditioniert werden. Nach dem Training können die Fliegen dann auf das olfaktorische Gedächtnis getestet werden. Die Bereitschaft das zuckerkonditionierte Gedächtnis im Test zu zeigen wird vom Fütterungszustand kontrolliert, wie ich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Arbeiten demonstrierte (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008). Nur nicht gefütterte Fliegen exprimieren das Gedächtnis, während Fütterungen bis kurz vor dem Test eine reversibel supprimierende Wirkung haben. Einen ähnlichen regulatorischen Einfluss übt der Futterentzug auch auf die Expression anderer futterbezogener Verhaltensweisen, wie z.B. die naive Zuckerpräferenz, aus. Nachdem ich den drastischen Einfluss des Fütterungszustands auf die Ausprägung des zuckerkonditionierten Verhaltens gezeigt bzw. bestätigt hatte, habe ich nach verhaltensregulierenden Faktoren gesucht, die bei einer Fütterung die Gedächtnisexpression unterdrücken. Als mögliche Kandidaten untersuchte ich Parameter, die zum Teil bereits bei verschiedenen futterbezogenen Verhaltensweisen unterschiedlicher Tierarten als „Sättigungssignale“ identifiziert worden waren (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). Dabei stellte sich heraus, dass weder die „ernährende“ Eigenschaft des Futters, noch ein durch Futteraufnahme bedingter Anstieg der internen Glukosekonzentration für die Suppression des zuckerkonditionierten Gedächtnisses notwendig sind. Die Unterdrückung der Gedächtnisexpression kann auch nicht durch Unterschiede in den aufgenommenen Futtermengen, die als verhaltensinhibitorische Dehnungssignale des Verdauungstrakts wirken könnten, oder mit der Stärke des süßen Geschmacks erklärt werden. Die Suppression des zuckerbelohnten Verhaltens folgte den Konzentrationen der gefütterten Substanzen und war unabhängig von deren chemischen Spezifität. Deshalb wird die Osmolarität des aufgenommenen Futters als ein entscheidender Faktor für die Unterdrückung der zuckerkonditionierten Gedächtnisexpression angenommen. Weil nur inkorporierte Substanzen einen Unterdrückungseffekt hatten, wird ein osmolaritätsdetektierender Mechanismus im Körper 67 postuliert, wahrscheinlich im Verdauungstrakt und/oder der Hämolymphe. Die Hämolymphosmolarität ist als „Sättigungssignal“ bei einigen wirbellosen Tieren bereits nachgewiesen worden (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Deshalb habe ich mit Hilfe genetischer Methoden und ohne die Fliegen zu füttern, versucht über einen künstlich induzierten Anstieg der Trehaloseund Lipidkonzentrationen die Osmolarität der Hämolymphe in Drosophila zu erhöhen. Eine solche konzentrationserhöhende Wirkung für Lipide und die Trehalose, dem Hauptblutzucker der Insekten, ist bereits für das adipokinetische Hormon (AKH), das von Zellen der Corpora cardiaca exprimiert wird, nachgewiesen worden (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). Es stellte sich heraus, dass die künstliche Stimulierung AKH-produzierender Neurone das zuckerkonditionierten Verhalten temporär, reversible und selektiv unterdrückt. Gleiche Behandlungen hatten keinen Effekt auf ein aversiv konditioniertes olfaktorisches Gedächtnis oder ein naives Zuckerpräferenzverhalten. Wie aus dieser Arbeit hervorgeht, stellt wahrscheinlich die Osmolarität des Verdauungstrakts und der Hämolymphe oder nur der Hämolymphe ein physiologisches Korrelat zum Fütterungszustand dar und wirkt als unterdrückendes Signal. Dass Fütterungen das zuckerkonditionierte Verhalten und die Zuckerpräferenz supprimieren, die künstliche Stimulation AKH-produzierender Zellen aber selektiv nur die zuckerbelohnte Gedächtnisexpression unterdrückt, deutet auf mindestens zwei unterschiedliche „Sättigungssignalwege“ hin. Außerdem macht es deutlich wie uneinheitlich futterbezogene Verhaltensweisen, wie das zuckerbelohnte Verhalten und die naive Zuckerpräferenz, reguliert werden.
N2  - In this work I investigated the regulation of the expression of the sugar conditioned behavior by feeding states in Drosophila melanogaster. During the training flies are able to associate an odor with a sugar reward. During the test these flies have the opportunity to show their odor memory. In accordance with previous findings (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008), I also showed that the readiness to express sugar conditioned memory is controlled by the feeding state. The memory was only displayed by starved flies, whereas feedings of the flies until the test cause a reversible and temporary suppression of conditioned behavior. Feeding states similarly influence the expression of other food-related behaviors like sugar preference. After I have showed/confirmed the drastic influence of feeding state on sugar conditioned behavior, I tried to search for factors which suppress the memory expression of conditioned flies during feeding. Therefore I verified physiological parameters as promising candidates which have already been identified as “satiation-signals” for different food-related behaviors through the animal kingdom (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). As the results revealed, neither the nutritional value of the available food nor an increase of the internal glucose-concentrations were necessary for suppressing conditioned behavior. Furthermore differences in sweet taste and in the amount of the ingested food, which likely serve as volumetric signals of the digestive system, were not critical determinants for inhibition of the memory expression. Because suppression followed the concentration of the substances independent of the chemical specificity, I conclude that the osmolarity of the ingested food is a critical factor for inhibition of sugar conditioned behavior. Only ingested substances were suppressive. Therefore an internal osmolarity-detecting mechanism is postulated, most probably in the digestive system or the hemolymph. Hemolymph-osmolarity has already been shown as a “satiation-signal” for some invertebrates (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Thus I tried to increase the hemolymph-osmolarity by an artificially induced rise of the concentration of lipids and trehalose, the main blood sugar of insects. A concentration-increasing effect such like this has already been shown for the adipokinetic hormone (AKH), which is expressed in cells of the corpora cardiaca (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). I demonstrated that an artificial stimulation of AKH69 producing neurons induces the suppression of sugar conditioned behavior, but leaves aversive conditioned behavior and naïve sugar preference unchanged. This work indicates that the osmolarity of the digestive system and the hemolymph or only of the hemolymph serves as (a) physiological correlate(s), which signals suppression. Feeding induced inhibition of the expression of sugar conditioned behavior and naïve sugar preference, whereas the artificial stimulation of AKH-producing cells selectively inhibited sugar rewarded memory expression alone. Thus I assume at least two separable “satiation”-pathways. Moreover these results demonstrate the non-uniform regulation of different food-related behaviors like sugar conditioned behavior and naïve sugar preference.
KW  - Taufliege
KW  - Futterentzug
KW  - Klassische Konditionierung
KW  - Konditionierung
KW  - Gedächtnis
KW  - Assoziatives Gedächtnis
KW  - Osmolarität
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - zuckerkonditioniertes Verhalten
KW  - klassische Konditionierung
KW  - Futterentzug
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - sugar-conditioned behaviour
KW  - classical conditioning
KW  - food deprivation
KW  - starvation
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48802
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fischer, Matthias
T1  - Der Einfluß der Ribosomale S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur
T1  - Der Einfluß der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf das Neuriten- und Synapsenwachstum in vivo und in Zellkultur
N2  - In dieser Arbeit sollte die Funktion der Ribosomalen S6 Kinase 2 (RSK2) auf neuronaler Ebene untersucht werden. Dahingehend gab es, z.B. auf Grund der Phänotypen von Fliegen und Mäusen mit Mutationen im entsprechenden Gen oder von Patienten mit Coffin-Lowry-Syndrom (CLS) nur Vermutungen. Es bestand letztlich die Hoffnung, einen Beitrag zur Aufklärung der Pathophysiologie des CLS zu leisten. Es stellte sich auf Grund von Experimenten sowohl in vivo als auch in vitro in verschiedenen Modellsystemen in dieser Arbeit heraus, daß RSK2 einen negativen Einfluß auf das Neuriten- und Synapsenwachstum hat. In kultivierten Motoneuronen führte der KO von RSK2 zu längeren Axonen und die Überexpression eines konstitutiv aktiven RSK2-Konstrukts zu kürzeren Axonen. In PC12-Zellen führte die Expression von konstitutiv aktiven RSK2 Konstrukten zur Verkürzung der Neuriten und die Expression eines Kinase-inaktiven RSK2 Konstrukts zu längeren Neuriten. In vivo war die neuromuskuläre Synapse bei RSK2-KO Mäusen vergrößert und hatte bei Drosophila rsk Mutanten mehr Boutons. Das RSK2-Protein ist in Motoneuronen der Maus und in überexprimierter Form in den Boutons der neuromuskulären Synapse bei Drosophila nachweisbar. Damit wurde zum ersten Mal die Funktion von RSK2 auf neuronaler Ebene beschrieben. Bezüglich des Mechanismus, wie RSK2 das Nervenwachstum beeinflußt gab es deutliche Hinweise, die dafür sprechen, daß RSK2 dies über eine in der Literatur schon häufiger beschriebene Hemmung der MAPK ERK1/2 erreicht. Für diese Hypothese spricht die Tatsache, daß die ERK-Phosphorylierung in murinen Motoneuronen und im Rückenmark embryonaler Mäuse der RSK2-Mutante erhöht ist und der Axonwachstumsdefekt durch eine Hemmung von MEK/ERK behoben werden kann. Auch ist die ERK-Phosphorylierung an der murinen Muskel-Endplatte in der Mutante erhöht. Zudem zeigen genetische Epistasis-Experimente in Drosophila, daß RSK die Bouton-Zahl über ERK/RL hemmt. RSK scheint also in Drosophila von der Funktion her der RSK2-Isoform in Wirbeltieren sehr ähnlich zu sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis ist die Beobachtung, daß RSK2 bei Motoneuronen keinen wesentlichen Einfluß auf das Überleben der Zellen in Gegenwart neurotropher Faktoren hat. Möglicherweise spielen hier redundante Funktionen der RSK Familienmitglieder eine Rolle. Ein bislang unerklärter Befund ist die reduzierte Frequenz spontaner Depolarisationen bzw. damit einhergehender Ca2+ Einströme bei RSK2-KO Motoneuronen in Zellkultur. Die Häufigkeit und Dichte von Ca2+-Kanälen und aktive Zonen Proteinen war in Motoneuronen nicht von der Anwesenheit des RSK2-Proteins abhängig. Im Hippocampus konnte außerdem das RSK2-Protein präsynaptisch in den Moosfaser-Boutons der CA3 Region nachgewiesen werden. Es befindet sich auch in den Pyramidenzellen, aber nicht in den Pyramidenzell-Dendriten in CA3. Bezüglich der Bedeutung dieser Befunde für die Aufklärung der Pathologie des CLS ist zu folgern, daß der neuro-psychologische Phänotyp bei CLS Patienten wahrscheinlich nicht durch reduziertes Überleben von Neuronen, sondern eher durch disinhibiertes Axonwachstum oder Synapsenwachstum bedingt ist. Dies kann grob sowohl für die peripheren als auch die zentralen Defekte gelten, denn die Synapsen im ZNS und am Muskel sind in ihrer molekularen Ausstattung z.B. im Bereich der Vesikel, der aktiven Zonen oder der Transmitterausschüttung sehr ähnlich. Weiterhin könnte eine veränderte synaptische Plastizität u.a. an der Moosfaser-Pyramidenzell-Synapse in der CA3 Region des Hippocampus eine Rolle bei den kognitiven und mnestischen Einschränkungen der Patienten spielen. Die Entdeckung, daß aktiviertes ERK bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt kann für die Entwicklung von Therapiestrategien eine wertvolle Erkenntnis sein.
N2  - In this thesis the function of the Ribosomal S6 Kinase 2 (RSK2) on the neuronal level should be investigated. Due to the phenotypes of flies and mice with mutations in the respective gene or of Coffin-Lowry-Syndrome (CLS) patients there existed only rough speculations. An aim was to make a contribution to the elucidaton of the pathophysiology of the CLS. In this thesis it could be shown by experiments in vivo as well as in vitro in different model systems, that RSK2 has a negative influence on neurite- and synapse growth. In cultivated motoneurons the KO of RSK2 increased the length of axons and the overexpression of a constitutive acitve RSK2-construct reduced axon length. In PC12 cells expression of constitutive active RSK2-constructs reduced neurite-length and expression of a kinase-dead RSK2-construct increased neurite-length. In vivo the size of the neuromuscular synapse of RSK2-KO mice and the bouton number at the Drosophila neuromuscular junction was increased. The RSK2-Protein could be found in mouse motoneurons and, if overexpressed, in boutons at the Drosophila neuromuscular junction. These results show for the first time, which function RSK2 has on the neuronal level. With respect to the mechanism, how RSK2 influences neurite growth, there was evidence, that RSK2 does this by inhibition of the MAPK ERK1/2. The latter has been described in literature before. Arguments for this are the findings, that ERKphosphorylation in mouse motoneurons and in embryonal spinal cord of the RSK2 mouse mutant is increased and that the axon-growth defect can be rescued by inhibition of MEK/ERK. Besides this, ERK-phosphorylation at the neuosmuscular endplate of RSK2-KO mice is increased. Moreover, genetic epistasis experiments in Drosophila show, that RSK inhibits bouton numbers via ERK/RL. So, Drosophila RSK seems to resemble, according to its function, the vertebrate RSK2-isoform. A further important result is the observation, that RSK2 has no effect on survival of motoneurons in the presence of neurotrophic factors. Possibly redundant functions of RSK family members are responsible for this. A so far unexplained finding is the reduced frequency of spontaneous depolarisations with concomitant Ca2+ Influx in cultured RSK2-KO Motoneurons. The amount and density of Ca2+ channels and active zone proteins was not dependent on the presence of the RSK2-Protein in motoneurons. In the hippocampus the RSK2-Protein could be found presynaptically in mossy-fiber boutons in the CA3 region. Moreover, it is localized in pyramidal cells, but not in the pyramidal cell dendrites in the CA3 region. With respect to the impact of these findings on the understanding of the CLS pathology, it is, according to the results of this thesis, probably not caused by reduced survival of neurons, but by disinhibited axon and synapse growth. This may account roughly for peripheral as well as central defects, because synapses in the central nervous system and at the muscle are very similar with respect to the molecular organization for example of vesicles, the active zone or transmitter release. Furthermore, a change in synaptic plasticity for example at the mossy-fiber pyramidal cell synapse in the CA3 region of the hippocampus could lead to the cognitive and mnestic deficits in CLS patients. The finding that activated ERK plays a role in the observed effects can guide the way for new therapeutic strategies.
KW  - Ribosom
KW  - Kinasen
KW  - Axon
KW  - Wachstum
KW  - RSK2
KW  - Motoneuron
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48341
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Weising, Kurt
A1  - Fiala, Brigitte
T1  - Botanische Eindrücke vom Bako-Nationalpark / Sarawak
N2  - No abstract available
Y1  - 1992
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-42947
ER  - 
TY  - THES
A1  - Deuchert, Thomas
T1  - Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase
T1  - Development of a experimental system for the investigation of the subcellular localisation of alpha-methylacyl-CoA racemase
N2  - Entwicklung eines experimentellen Systems zur Untersuchung der subzellulärenLokalisierung der Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase (AMACR) (Methode der retroviralen Transfektion von transformierten, embryonalen Mausfibroblasten)
N2  - Development of a experimental system for the investigation of the subcellular localisation of alpha-methylacyl-CoA racemase (amacr) (retroviral transfection of mouse fibroblasts)
KW  - Alpha-Methylacyl-CoA-Racemase
KW  - Peroxisom
KW  - AMACR
KW  - Racemase
KW  - Transfektion
KW  - localisation
KW  - amacr
KW  - racemase
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46495
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Linsenmair, Karl Eduard
T1  - Zur Lichtorientierung der Walzenspinnen (Arachnida, Solifugae)
N2  - No abstract available
Y1  - 1968
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46869
ER  -