TY - THES A1 - Vona, Barbara C. T1 - Molecular Characterization of Genes Involved in Hearing Loss T1 - Molekulare Charakterisierung der in Hörstörungen involvierten Genen N2 - The auditory system is an exquisitely complex sensory organ dependent upon the synchronization of numerous processes for proper function. The molecular characterization of hereditary hearing loss is complicated by extreme genetic heterogeneity, wherein hundreds of genes dispersed genome-wide play a central and irreplaceable role in normal hearing function. The present study explores this area on a genome-wide and single gene basis for the detection of genetic mutations playing critical roles in human hearing. This work initiated with a high resolution SNP array study involving 109 individuals. A 6.9 Mb heterozygous deletion on chromosome 4q35.1q35.2 was identified in a syndromic patient that was in agreement with a chromosome 4q deletion syndrome diagnosis. A 99.9 kb heterozygous deletion of exons 58-64 in USH2A was identified in one patient. Two homozygous deletions and five heterozygous deletions in STRC (DFNB16) were also detected. The homozygous deletions alone were enough to resolve the hearing impairment in the two patients. A Sanger sequencing assay was developed to exclude a pseudogene with a high percentage sequence identity to STRC from the analysis, which further solved three of the six heterozygous deletion patients with the hemizygous, in silico predicted pathogenic mutations c.2726A>T (p.H909L), c.4918C>T (p.L1640F), and c.4402C>T (p.R1468X). A single patient who was copy neutral for STRC and without pathogenic copy number variations had compound heterozygous mutations [c. 2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) and c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. It has been shown that STRC has been previously underestimated as a hearing loss gene. One additional patient is described who does not have pathogenic copy number variation but is the only affected member of his family having hearing loss with a paternally segregating translocation t(10;15)(q26.13;q21.1). Twenty-four patients without chromosomal aberrations and the above described patient with an USH2A heterozygous deletion were subjected to a targeted hearing loss gene next generation sequencing panel consisting of either 80 or 129 hearing-relevant genes. The patient having the USH2A heterozygous deletion also disclosed a second mutation in this gene [c.2276G>T (p.C759F)]. This compound heterozygous mutation is the most likely cause of hearing loss in this patient. Nine mutations in genes conferring autosomal dominant hearing loss [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21 and twice in MYO1A (DFNA48)] and four genes causing autosomal recessive hearing loss were detected [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3), and USH2A]. Nine normal hearing controls were also included. Statistical significance was achieved comparing controls and patients that revealed an excess of mutations in the hearing loss patients compared to the control group. The family with the GRHL2 c.1258-1G>A mutation is only the second family published worldwide with a mutation described in this gene to date, supporting the initial claim of this gene causing DFNA28 hearing loss. Audiogram analysis of five affected family members uncovered the progressive nature of DFNA28 hearing impairment. Regression analysis predicted the annual threshold deterioration in each of the five family members with multiple audiograms available over a number of years. N2 - Das Gehör als komplexes Sinnesorgan ist für eine einwandfreie Funktion abhängig von der Synchronisation zahlreicher Prozesse. Durch die extreme genetische Heterogenität wird die molekulare Charakterisierung einer erblich bedingten Schwerhörigkeit erschwert, da hunderte genomweit verteilter Gene eine zentrale und unersetzliche Rolle beim Hören spielen. Die vorliegende Studie untersucht dieses Forschungsgebiet auf genomweiter Ebene und auf der Basis von Einzelgenen, um genetische Mutationen zu ermitteln, die eine entscheidende Rolle bei der menschlichen auditiven Wahrnehmung besitzen. Diese Arbeit beginnt mit einer Studie an 109 Personen unter Zuhilfenahme von hochauflösenden SNP-Arrays. In dieser Studie wurde eine 6,9 Mb heterozygote Deletion auf Chromosom 4q35.1q35.2 bei einem syndromalen Patienten identifiziert, die eine Übereinstimmung mit einem Chromosom 4q-Deletionssyndrom aufwies. Bei einem weiteren Patienten wurde eine 99,9 kb heterozygote Deletion der Exons 58-64 in USH2A nachgewiesen. Zwei homozygote Deletionen und fünf heterozygote Deletionen in STRC (DFNB16) wurden ebenfalls detektiert. Die homozygoten Deletionen waren ausreichend, um die Schwerhörigkeit bei beiden Patienten zu klären. Ein Sanger-Sequenzierungs-Assay wurde entwickelt, um ein Pseudogen mit einer hohen prozentualen Sequenzidentität zu STRC von der Analyse auszuschließen. Dadurch konnten drei der sechs heterozygoten Deletionspatienten mit hemizygot in silico vorhergesagten pathogenen Mutationen, c.2726A>T (p.H909L), c.4918 C>T (p.L1640F) und c.4402C>T (p.R1468X), aufgeklärt werden. Ein Patient, der eine kopieneutrale STRC Variation und keine pathogenen Kopienzahlvariationen besaß, zeigte eine compound heterozygote Mutation [c.2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) und c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. Es wurde gezeigt, daß die Beurteilung von STRC als Hörstörungsgen bisher unterschätzt wurde. Zusätzlich wird ein Patient beschrieben, der keine pathogenen Kopienzahlvariationen aufwies, aber das einzige Familienmitglied mit einer Schwerhörigkeit und einer paternalen segregierten Translokation t(10;15)(q26.13;q21.1) war. Vierundzwanzig Patienten ohne Chromosomenstörungen und der oben beschriebene Patient mit einer USH2A heterozygoten Deletion wurden mit einem Next Generation Sequencing Panel bestehend aus entweder 80 oder 129 für das Hören relevanter Gene untersucht. Der Patient mit einer USH2A heterozygoten Deletion zeigte eine zweite Mutation in diesem Gen [c.2276G>T (p.C759F)]. Diese compound heterozygote Mutation ist die wahrscheinlichste Ursache für die Schwerhörigkeit des Patienten. Neun Mutationen in Genen, die zu einem autosomal dominanten Hörverlust führen [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21], sowie zwei MYO1A (DFNA48) Mutationen und Mutationen in vier weiteren Genen, verantwortlich für autosomal rezessive Schwerhörigkeit [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3) und USH2A], konnten identifiziert werden. Neun normal hörende Kontrollen waren ebenfalls in diese Studie einbezogen worden. Durch einen Vergleich der Kontrollen mit den Patienten konnte eine statistische Signifikanz erreicht werden, die einen Überschuss an Mutationen bei der Patientengruppe gegenüber der Kontrollgruppe aufzeigte. Die Familie mit einer GRHL2 c.1258-1G>A Mutation ist die erst zweite Familie weltweit, die mit einer Mutation in diesem Gen publiziert worden ist. Dies unterstützt die initiale Behauptung, dass dieses Gen für eine DFNA28 Schwerhörigkeit verantwortlich ist. Die Audiogrammanalyse von fünf der betroffenen Familienmitglieder lässt eine voranschreitende Natur der DFNA28 Hörschädigung erkennen. Eine jährliche Verschlechterung der Hörschwelle bei jedem der fünf Familienmitglieder konnte eine Regressionsanalyse anhand von Audiogrammen, die über eine Anzahl von Jahren zur Verfügung standen, vorhersagen. KW - Hearing loss KW - Molekularbiologie KW - Hörverlust Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98031 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-112170 ER - TY - THES A1 - Schneider [geb. Hansmann], Tamara T1 - Epigenetische Effekte der in vitro-Maturation von Eizellen auf DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene im Modellorganismus Bos taurus T1 - Epigenetic effects of in vitro maturation of oocytes on DNA methylation profiles of developmentally important genes in the model organism Bos taurus N2 - Assistierte Reproduktionstechniken (ARTs) zur Behandlung von Infertilität werden mit einer erhöhten Häufigkeit von epigenetischen Aberrationen während der Gametogenese und der frühen Embryonalentwicklung in Verbindung gebracht, speziell durch eine Beeinträchtigung von geprägten Genen. Die in vitro-Maturation (IVM) von Eizellen ist eine ART, die bereits routinemäßig zur Reproduktion von ökonomisch wertvollen Zuchttieren wie dem Hausrind (Bos taurus) eingesetzt wird. IVM-Oozyten weisen jedoch eine verringerte Entwicklungs-kompetenz zum Blastozystenstadium dar, welche möglicherweise auf eine beeinträchtigte epigenetische Regulation zurückzuführen ist. Von allen bekannten epigenetischen Mechanismen ist die DNA-Methylierung die meist untersuchte DNA-Modifikation. In dieser Arbeit wurden zur Klärung der Frage nach den Auswirkungen der IVM auf die DNA-Methylierung geprägter als auch nicht geprägter Gene Oozyten des Hausrinds analysiert. Diese Tierart weist eine ähnliche Präimplantations-entwicklung und Tragezeit wie der Mensch auf und wird daher zunehmend als Modell zum Studium der humanen Keimzell- und Embryonalentwicklung herangezogen. Im Gegensatz zu Mensch und Maus gibt es bislang nur wenig Information über bovine geprägte Gene. Das erste Ziel der hier dargestellten Forschungsarbeiten war daher die Identifizierung und Charakterisierung der bovinen differenziell methylierten Regionen (DMRs) der drei geprägten Genorte von IGF2/H19, SNRPN und PEG3, welche mit Imprintingdefekten des Menschen und/oder im Mausmodell assoziiert werden. Die hier erstmalig erfolgte Beschreibung von mehreren intergenischen DMRs mittels Bisulfitsequenzierung und Pyrosequenzierung belegt die Existenz und evolutionäre Konservierung der IGF2/H19-Imprintingkontrollregion (ICR) beim Rind. Der geprägte Zustand der IGF2/H19-ICR sowie der bovinen Gene SNRPN und PEG3 wurde durch den Nachweis differenzieller Methylierung in plazentalen und somatischen Geweben sowie in Spermien und parthenogenetischen Embryonen bestätigt. Die beobachteten Methylierungsprofile waren typisch für genomische Prägung. Die direkte Bisulfitsequenzierung nach vorangegangener Limiting Dilution (LD) erlaubt die Analyse von Methylierungsmustern einzelner Allele (DNA-Moleküle) von einigen wenigen oder auch nur einer einzigen Zelle (El Hajj et al., 2011). In einem ersten LD-Versuch an bovinen Oozyten wurden die drei vorab charakterisierten und geprägten Gene hinsichtlich möglicher epigenetischer Veränderungen untersucht, welche durch verschiedene IVM-Bedingungen und -Medien (TCM und mSOF) hervorgerufen werden könnten. Die Gesamtrate von Methylierungsfehlern einzelner CpG-Stellen sowie die von ganzen Allelen (Imprintingfehlern) unterschied sich nicht wesentlich zwischen den beiden IVM-Gruppen und der in vivo-Gruppe. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die gängigen IVM-Protokolle keinen oder nur einen geringfügigen Einfluss auf diese entscheidenden epigenetischen Markierungen haben. IVM-Oozyten präpuberaler Kälber weisen eine herabgesetzte Entwicklungskompetenz im Vergleich zu IVM-Oozyten aus adulten Tieren auf. Aus diesem Grund wurde in einem zweiten LD-Versuchsansatz die Promotormethylierung von drei entwicklungsrelevanten, nicht geprägten Genen (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) nach ovarieller Stimulation mit FSH und/oder IGF1 untersucht. Sowohl ungereifte als auch in vitro-gereifte Oozyten präpuberaler und adulter Kühe zeigten eine deutliche, unbeeinträchtige Hypomethylierung der drei Genpromotoren ohne jegliche Unterschiede zwischen den verschiedenen Alterstypen der Spendertiere oder deren Behandlung. Weder das Alter, die hormonelle Stimulation noch die IVM scheinen somit einen Einfluss auf den Methylierungsstatus dieser drei Gene zu haben. Zusammenfassend spiegelte sich die reduzierte Entwicklungsfähigkeit von IVM-Eizellen aus adulten und präpuberalen Kühen nicht in abnormalen Methylierungsmustern der untersuchten geprägten und ungeprägten Gene wider. Dies lässt auf eine generelle Stabilität der etablierten DNA-Methylierungsprofile in Oozyten schließen. Aus diesem Grund müssen andere epigenetische Mechanismen als die DNA-Methylierung wie beispielsweise ncRNAs oder Histonmodifikationen zur Reduktion der Entwicklungskompetenz von präpuberalen und IVM-Oozyten beitragen. Diese Veränderungen behindern mutmaßlich die zytoplasmatische Reifung der Eizelle, welche wiederum zu einer späteren Beeinträchtigung der Entwicklung der Zygote und des Embryos führt. N2 - Infertility treatments by assisted reproductive technologies (ARTs) are associated with an increased incidence of epigenetic aberrations during gametogenesis and early embryo-genesis, specifically in imprinted genes. In vitro-maturation (IVM) of oocytes is an ART which is routinely applied for reproduction of agriculturally and economically important species like cattle (Bos taurus). However, IVM oocytes exhibit a reduced developmental competence to the blastocyst stage which may be caused by an impaired epigenetic regulation. Of all known epigenetic mechanisms DNA-methylation is the most studied DNA-modification. In this thesis, bovine oocytes have been analyzed in order to investigate the impact of IVM on the DNA-methylation of imprinted and non-imprinted genes. Because this species exhibits a similar preimplantation development and gestation length as humans, it is increasingly being used as a model for human germ-cell and embryo development. In contrast to humans and mice, only little information on bovine imprinted genes is available. Thus, the first attempt of the research presented here was to identify and characterize the bovine differentially methylated regions (DMRs) of the three imprinted loci, namely IGF2/H19, SNRPN and PEG3 which are each associated with imprinting defects in humans and/or the mouse model. The first description of several intergenic DMRs by bisulfite sequencing and pyrosequencing proved the existence of an intergenic IGF2/H19 imprinting control region (ICR) in the bovine. The imprinted status of the IGF2/H19-ICR as well as the bovine genes SNRPN and PEG3 was confirmed by differential methylation consistent with genomic imprinting in placental and somatic bovine tissues, in sperm and parthenogenetic embryos. Limiting Dilution (LD) Bisulfite Sequencing (El Hajj et al., 2011) followed by direct bisulfite sequencing allows the analysis of methylation profiles of individual alleles (DNA molecules) from only a few or even single cells. In a first approach using LD, the three characterized imprinted regions were analyzed to determine putative epigenetic alterations in bovine oocytes cultured with different types of IVM conditions and media (TCM and mSOF). The total rate of individual CpG and entire allele methylation errors did not differ significantly between the two IVM and the in vivo group, indicating that current IVM protocols have no or only marginal effects on these critical epigenetic marks. The developmental capacity of IVM oocytes from prepubertal calves is reduced compared with their IVM oocyte counterparts from adult animals. Therefore, in a second LD approach, the promoter methylation of three developmentally important, non-imprinted genes (SLC2A1, PRDX1, ZAR1) has been studied in IVM oocytes from prepubertal cattle after ovarial stimulation with FSH and/or IGF1. Both immature and in vitro matured prepubertal and adult oocytes showed unimpaired hypomethylation of the three gene promoters without differences between the different ages of donors and treatments. Thus, neither age nor hormonal treatment or IVM seem to influence the methylation status of these three genes. In conclusion, the reduced developmental capacity of IVM oocytes from adult and prepubertal cattle were not associated with aberrant methylation patterns of the investigated imprinted and non-imprinted genes suggesting a general stability of established DNA-methylation marks in oocytes. Therefore, epigenetic mechanisms other than DNA-methylation such as ncRNAs or histone modifications might confer to the reduced developmental competence of prepubertal and IVM oocytes. These factors are supposed to interfere with cytoplasmic maturation of the oocyte leading to an impaired development of the zygote and embryo rather than to influence nuclear maturation of the oocyte. KW - Epigenetik KW - DNA-Methylierung KW - Epigenetik KW - DNA-Methylierung KW - Bos taurus KW - Oozyten KW - Rind KW - DNS KW - Oozyte KW - Extrakorporale Befruchtung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98888 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Michael T1 - Charakterisierung inaktivierender posttranslationaler Modifikationen des GC-A-Rezeptors für das atriale natriuretische Peptid (ANP) T1 - Characterization of inactivating post-translational modifications of the GC-A receptor for the atrial natriuretic peptide (ANP) N2 - Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Darüber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazelluläre Domäne der GC-A wird intrazellulär, durch die katalytische Domäne des Rezeptors, der sekundäre Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erhöhte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors führen. Der Verlust der Funktionsfähigkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellulär lokalisierten Aminosäuren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung möglicher Interaktionspartner in vivo könnte der Grundstein für neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine kürzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminosäuren verkürzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellulären Domänen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellulären Domäne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdomäne befindet. Oberflächenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfläche von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen präsentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellulären cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die Fähigkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpräzipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression für GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus für die Verringerung der Sensitivität des GC-A-Rezeptors gegenüber ANP darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer Überexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es ermöglicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu können um danach Analysen zu posttranslationalen Veränderungen und möglichen Interaktionspartnern durchzuführen. Zunächst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zusätzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz für die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingefügt. Die Expression und Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsfähigkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpräzipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an Mäusen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpräzipitationen, überprüft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, Überexpression des Rezeptors. Dieser konnte über das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsfähigkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die Überexpression funktionsfähiger GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie schützt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer Überexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern ähnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des Überexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkanälen TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die Möglichkeit die Epitope und das murine Überexpressionsmodell auch zukünftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren. N2 - Atrial natriuretic peptide (ANP) is released from cardiac atrialand less ventricular myocytes in response to increased volume or pressure load. It has crucial local functions preventing pathological cardiac hypertrophy and fibrosis. Besides this ANP has a critical endocrine role in the maintenance of arterial blood pressure and blood volume. The physiological actions of this cardiac hormone are mediated through the transmembrane receptor guanylyl cyclase A (GC-A). Upon binding of ANP to the extracellular domain of the receptor the intracellular catalytic domain produces the second messenger cGMP. Patients with hypertensive cardiac hypertrophy and congestive heart failure show markedly increased levels of ANP but the protective, GC-A mediated effects are markedly blunted. Several in vitro studies have shown that chronic treatment of GC-A expressing cells with its ligand or growth hormones, i.e. Angiotensin II, lead to desensitization of the receptor by dephosphorylation of specific intracellular amino acids. Understanding the mechanisms of these posttranslational modifications and possible involved proteins in vivo may help to design new therapeutic approaches restoring GC-A activity in heart failure patients. In the first part of this study a novel isoform of GC-A (GC-AΔLys314-Gln330) was characterized. This isoform was found ubiquitiously within the murine organism and is the result of differential splicing of exon 4. The resulting deletion of a 51-bp sequence is predicted to delete 17 amino acids in the membrane-distal part of the extracellular domain. Molecular modelling of the extracellular domain auf GC-A wt and the isoform suggested that the deletion does not directly alter the ligand binding domain of the receptor. Cell biotinylation assays and cell fractionation of transiently transfected HEK 293 cells showed, that the isoform is predominantly expressed and localized within the membrane of these cells. However functional studies in transfected HEK 293 cells using FRET and cGMP-RIA to measure intracellular cGMP formation demonstrated that ANP-induced cGMP formation was totally abolished for GC-AΔLys314-Gln330. Binding studies with 125I-ANP revealed that the isoform does not bind ANP. Co-immunoprecipitation experiments showed the ability of the isoform to form heterodimers with the wild type receptor, thereby inhibiting the ANP-induced intracellular cGMP formation. In vivo studies with Angiotensin II resulted in enhanced mRNA expression of GC-AΔLys314-Gln330 in the lungs of Angiotensin II treated mice. Notably the ANP-mediated formation of cGMP by isolated membranes of the lung was significantly reduced. Therefore it can be assumed that alternative splicing of GC-A might be a regulatory mechanism inhibiting the ANP/GC-A signaling pathway. Angiotensin II-induced alternative splicing of the GC-A gene may thus represent a novel mechanism for reducing the sensitivity of GC-A for it‘s ligand. In the second part of this study transgenic mice with a cardiomyocyte specific overexpression of an epitope tagged GC-A were generated to enable enrichment and purification of the receptor from the heart for biochemical analyses. First a FLAG-tagged GC-A receptor was modified by inserting an additional HA-tag and a restriction site for the protease of tobacco etch virus (TEV). The expression and function of the modified receptor was verified using whole cell stimulation and FRET to determine cGMP formation and IP experiments to test the elution with the protease of TEV. The expression levels and localization of GC-A in cardiomyocytes were analyzed using cell fractionation and immunoprecipitation experiments which showed a clear overexpression within the membranes of cardiomyocytes. It was possible to enrich and purify the GC-A from isolated cardiomyocytes using the HA-tag. Two cardiac hypertrophy studies using chronic administration of Angiotensin II were performed to verify the overexpression of a functional GC-A receptor. Based on the literature it was postulated that transgenic mice are potentially protected from hypertension induced cardiac hypertrophy. Despite verified overexpression of GC-A within the cardiomyocytes of transgenic animals no differences, compared to their littermates, could be found for the relevant hypertrophy parameters. However by using the mice with overexpression of the HA-tagged GC-A we could verify an interaction of GC-A with the cation channels TRPC3 and TRPC6 in vivo. Therefore this model might be a useful tool to identify more interaction partners and posttranslational modifications of the GC-A receptor. KW - Guanylatzyklase KW - Überexpression KW - RNS-Spleißen KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Atriales natriuretisches Peptid KW - guanylyl cylcase A KW - ANP KW - GC-A KW - Angiotensin II Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97959 ER -