TY  - JOUR
A1  - Brocher, Jan
A1  - Vogel, Benjamin
A1  - Hock, Robert
T1  - HMGA1 down-regulation is crucial for chromatin composition and a gene expression profile permitting myogenic differentiation
N2  - Background: High mobility group A (HMGA) proteins regulate gene transcription through architectural modulation of chromatin and the formation of multi-protein complexes on promoter/enhancer regions. Differential expression of HMGA variants has been found to be important for distinct differentiation processes and deregulated expression was linked to several disorders. Here we used mouse C2C12 myoblasts and C2C12 cells stably over-expressing HMGA1a-eGFP to study the impact of deregulated HMGA1 expression levels on cellular differentiation. Results: We found that induction of the myogenic or osteogenic program of C2C12 cells caused an immediate down-regulation of HMGA1. In contrast to wild type C2C12 cells, an engineered cell line with stable overexpression of HMGA1a-eGFP failed to differentiate into myotubes. Immunolocalization studies demonstrated that sustained HMGA1a-eGFP expression prevented myotube formation and chromatin reorganization that normally accompanies differentiation. Western Blot analyses showed that elevated HMGA1a-eGFP levels affected chromatin composition through either down-regulation of histone H1 or premature expression of MeCP2. RT-PCR analyses further revealed that sustained HMGA1a expression also affected myogenic gene expression and caused either down-regulation of genes such as MyoD, myogenin, Igf1, Igf2, Igfbp1-3 or up-regulation of the transcriptional repressor Msx1. Interestingly, siRNA experiments demonstrated that knock-down of HMGA1a was required and sufficient to reactivate the myogenic program in induced HMGA1a over-expressing cells. Conclusions: Our data demonstrate that HMGA1 down-regulation after induction is required to initiate the myogenic program in C2C12 cells. Sustained HMGA1a expression after induction prevents expression of key myogenic factors. This may be due to specific gene regulation and/or global effects on chromatin. Our data further corroborate that altered HMGA1 levels influence the expression of other chromatin proteins. Thus, HMGA1 is able to establish a specific chromatin composition. This work contributes to the understanding of how differential HMGA1 expression is involved in chromatin organization during cellular differentiation processes and it may help to comprehend effects of HMGA1 over-expression occurring in malign or benign tumours.
KW  - HMG-Proteine
KW  - High mobility group
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67914
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Teutschbein, Janka
A1  - Haydn, Johannes M.
A1  - Samans, Birgit
A1  - Krause, Michael
A1  - Eilers, Martin
A1  - Schartl, Manfred
A1  - Meierjohann, Svenja
T1  - Gene expression analysis after receptor tyrosine kinase activation reveals new potential melanoma proteins
N2  - Background: Melanoma is an aggressive tumor with increasing incidence. To develop accurate prognostic markers and targeted therapies, changes leading to malignant transformation of melanocytes need to be understood. In the Xiphophorus melanoma model system, a mutated version of the EGF receptor Xmrk (Xiphophorus melanoma receptor kinase) triggers melanomagenesis. Cellular events downstream of Xmrk, such as the activation of Akt, Ras, B-Raf or Stat5, were also shown to play a role in human melanomagenesis. This makes the elucidation of Xmrk downstream targets a useful method for identifying processes involved in melanoma formation. Methods: Here, we analyzed Xmrk-induced gene expression using a microarray approach. Several highly expressed genes were confirmed by realtime PCR, and pathways responsible for their induction were revealed using small molecule inhibitors. The expression of these genes was also monitored in human melanoma cell lines, and the target gene FOSL1 was knocked down by siRNA. Proliferation and migration of siRNA-treated melanoma cell lines were then investigated. Results: Genes with the strongest upregulation after receptor activation were FOS-like antigen 1 (Fosl1), early growth response 1 (Egr1), osteopontin (Opn), insulin-like growth factor binding protein 3 (Igfbp3), dual-specificity phosphatase 4 (Dusp4), and tumor-associated antigen L6 (Taal6). Interestingly, most genes were blocked in presence of a SRC kinase inhibitor. Importantly, we found that FOSL1, OPN, IGFBP3, DUSP4, and TAAL6 also exhibited increased expression levels in human melanoma cell lines compared to human melanocytes. Knockdown of FOSL1 in human melanoma cell lines reduced their proliferation and migration. Conclusion: Altogether, the data show that the receptor tyrosine kinase Xmrk is a useful tool in the identification of target genes that are commonly expressed in Xmrk-transgenic melanocytes and melanoma cell lines. The identified molecules constitute new possible molecular players in melanoma development. Specifically, a role of FOSL1 in melanomagenic processes is demonstrated. These data are the basis for future detailed analyses of the investigated target genes.
KW  - Melanoma
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67900
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Vainshtein, Yevhen
A1  - Sanchez, Mayka
A1  - Brazma, Alvis
A1  - Hentze, Matthias W.
A1  - Dandekar, Thomas
A1  - Muckenthaler, Martina U.
T1  - The IronChip evaluation package: a package of perl modules for robust analysis of custom microarrays
N2  - Background: Gene expression studies greatly contribute to our understanding of complex relationships in gene regulatory networks. However, the complexity of array design, production and manipulations are limiting factors, affecting data quality. The use of customized DNA microarrays improves overall data quality in many situations, however, only if for these specifically designed microarrays analysis tools are available. Results: The IronChip Evaluation Package (ICEP) is a collection of Perl utilities and an easy to use data evaluation pipeline for the analysis of microarray data with a focus on data quality of custom-designed microarrays. The package has been developed for the statistical and bioinformatical analysis of the custom cDNA microarray IronChip but can be easily adapted for other cDNA or oligonucleotide-based designed microarray platforms. ICEP uses decision tree-based algorithms to assign quality flags and performs robust analysis based on chip design properties regarding multiple repetitions, ratio cut-off, background and negative controls. Conclusions: ICEP is a stand-alone Windows application to obtain optimal data quality from custom-designed microarrays and is freely available here (see “Additional Files” section) and at: http://www.alice-dsl.net/evgeniy. vainshtein/ICEP/
KW  - Microarray
KW  - ICEP
KW  - IronChip Evaluation Package
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67869
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Schmid, Benjamin
A1  - Schindelin, Johannes
A1  - Cardona, Albert
A1  - Longair, Martin
A1  - Heisenberg, Martin
T1  - A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ
N2  - Background: Current imaging methods such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Confocal microscopy, Electron Microscopy (EM) or Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) yield three-dimensional (3D) data sets in need of appropriate computational methods for their analysis. The reconstruction, segmentation and registration are best approached from the 3D representation of the data set. Results: Here we present a platform-independent framework based on Java and Java 3D for accelerated rendering of biological images. Our framework is seamlessly integrated into ImageJ, a free image processing package with a vast collection of community-developed biological image analysis tools. Our framework enriches the ImageJ software libraries with methods that greatly reduce the complexity of developing image analysis tools in an interactive 3D visualization environment. In particular, we provide high-level access to volume rendering, volume editing, surface extraction, and image annotation. The ability to rely on a library that removes the low-level details enables concentrating software development efforts on the algorithm implementation parts. Conclusions: Our framework enables biomedical image software development to be built with 3D visualization capabilities with very little effort. We offer the source code and convenient binary packages along with extensive documentation at http://3dviewer.neurofly.de.
KW  - Visualisierung
KW  - Java 3D
KW  - ImageJ
KW  - framework
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67851
ER  - 
TY  - THES
A1  - Halder, Partho
T1  - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library
T1  - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek
N2  - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures.
N2  - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern.
KW  - Taufliege
KW  - Synapse
KW  - Proteine
KW  - Monoklonaler Antikörper
KW  - synaptische Proteine
KW  - monoklonale Antikörper
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - synaptic proteins
KW  - monoclonal antibodies
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325
N1  - korrigierte Ausgabe der Arbeit aus dem Jahr 2022 unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27020
ER  - 
TY  - THES
A1  - Duraphe, Prashant
T1  - Identification and characterization of AUM, a novel human tyrosine phosphatase
T1  - Identifizierung und Charakterisierung von AUM, einer neuen humanen Tyrosin-Phosphatase
N2  - Protein Phosphatasen werden aufgrund der Aminosäuresequenzen ihrer aktiven Zentren in drei große Familien unterteilt. In einer neu entdeckten Familie von Phosphatasen ist das aktive Zentrum durch die Sequenz DXDX(T/V) charakterisiert. Diese Aspartat-abhängigen Phosphatasen gehören zu der Superfamilie der Hydrolasen vom Haloazid Dehalogenase(HAD)-Typ, einer evolutionär konservierten und ubiquitär verbreiteten Enzymfamilie. Bislang konnten 58 menschliche HAD Enzyme durch Datenbankanalysen identifiziert werden. Ihre Funktionen sind jedoch nach wie vor nur rudimentär verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst das Komplement aller menschlichen HAD Phosphatasen durch Datenbank-Recherchen erfasst. Zusammen mit phylogenetischen Analysen gelang es, eine zum damaligen Zeitpunkt unbekannte, putative Phosphatase zu identifizieren, die eine vergleichsweise hohe Sequenz-Homologie zu der Zytoskelettregulierenden HAD Phosphatase Chronophin aufweist. Dieses neuartige Enzym wurde kloniert und mit biochemischen und zellbiologischen Methoden charakterisiert. Auf der Basis dieser Befunde bezeichnen wir dieses neuartige Protein als AUM (actin remodeling, ubiquitously expressed, magnesium-dependent HAD phosphatase).Mittels Northern blot, real-time PCR und Western blot Analysen konnte gezeigt werden, dass AUM in allen untersuchten menschlichen und murinen Geweben exprimiert wird. Die höchste Expression konnte in Hodengewebe nachgewiesen werden. Durch immunohistochemische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass AUM spezifisch in reifenden Keimzellen mit einem Expressionsmaximum zum Zeitpunkt der Spermiogenese exprimiert wird. Um die Substratpräferenz von AUM zu charakterisieren, wurde zunächst ein peptidbasierter in vitro Phosphatase-Substrat-Screen durchgeführt. Hierbei wurden 720 aus menschlichen Phosphoproteinen abgeleitete Phosphopeptide untersucht. Interessanterweise dephosphorylierte AUM ausschließlich Phosphotyrosin (pTyr)-enthaltende Peptide. Nur 17 pTyr-Peptide (~2% aller untersuchten Peptide) fungierten als AUM-Substrate. Diese Daten legen eine hohe Substratspezifität von AUM nahe. Zu den putativen AUM Substraten gehören Proteine, die in die Dynamik der Zytoskelett-Reorganisation sowie in Tyrosin Kinasevermittelte Signalwege eingebunden sind. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieses Phosphopeptid-Screens konnte mittels Phosphatase overlay assays sowie in Zellextrakten aus Pervanadat-behandelten HeLa Zellen demonstriert werden, dass AUM eine begrenzte Anzahl Tyrosin-phosphorylierter Proteinen dephosphorylieren kann.In zellulären Untersuchungen wurde die mögliche Rolle von AUM im Rahmen der durch den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ausgelösten Tyrosin-Phosphorylierung in einer Spermatogonien Zelllinie (GC-1 spg-Zellen) analysiert. So konnte nachgewiesen werden, dass die Überexpression von AUM zu einer moderaten Abnahme Tyrosin phosphorylierter Proteine nach EGF-Stimulation führte. Im Gegensatz dazu löste jedoch die durch RNAInterferenz vermittelte Depletion von endogenem AUM einen robusten Anstieg Tyrosinphosphorylierter Proteine aus, zu denen auch der EGF-Rezeptor selbst zählt. Zusätzlich zu dem EGF-Rezeptor wurde die Src-Kinase im Zuge des Phosphopeptid- Screens als mögliches AUM Substrat identifiziert. Daher wurden in vitro Kinase/Phosphatase-Assays mit gereinigtem Src und AUM durchgeführt. Mit diesem Ansatz konnte erstmals gezeigt werden, dass AUM in der Lage ist, die Src-Kinase zu aktivieren, während Src AUM phosphoryliert und die AUM Phosphatase-Aktivität blockiert. Diese Ergebnisse deuten auf eine gekoppelte, wechselseitige Regulation von AUM und Src hin. Obwohl die Details dieser Regulation derzeit noch unklar sind, zeigen unsere initialen Ergebnisse, dass AUM die Src-Aktivität unabhängig von seiner Phosphatase Aktivität steigert, während Src die AUM Phosphatase-Aktivität Kinase-abhängig vermindert. Auf zellulärer Ebene sind AUM-depletierte Zellen durch Veränderungen der Aktin- Zytoskelett-Dynamik und der Zelladhäsion charakterisiert. So weisen AUM-defiziente Zellen stabilisierte Aktin Streßfasern und vergrößerte fokale Adhäsionen auf. Weiterhin sind AUMdepletierte Zellen durch ein beschleunigtes spreading auf Fibronektin gekennzeichnet. Wir haben mit AUM ein bisher nicht beschriebenes Mitglied der Familie Aspartat-abhängiger Phosphatasen entdeckt. In dieser Arbeit ist es gelungen, AUM phylogenetisch, biochemisch und zellbiologisch zu charakterisieren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass AUM einen wichtigen, neuartigen Regulator der Src-vermittelten Zytoskelett-Dynamik im Rahmen der Zelladhäsion und Migration darstellt.
N2  - Protein phosphatases can be classified into at least three major families based on amino acid sequences at their active sites. A newly emerging phosphatase family contains the active site sequence DXDX(T/V), and belongs to the haloacid dehalogenase (HAD) superfamily of hydrolases, a ubiquitous and evolutionarily conserved enzyme family. Although the existence of 58 human HAD enzymes has been predicted by database analysis, our understanding of their biological functions remains rudimentary.By database mining amd phylogenetic analysis of human HAD phosphatases, we have found a marked increase in cell area of spreading cells, as well as accelerated cell spreading onfibronectin. Taken together, we have identified and characterized AUM as a novel member of the emerging family of aspartate-dependent protein tyrosine phosphatases. Our findings implicate AUM as an important regulator of Src-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion and migration. a previously unidentified enzyme with homology to Chronophin, a cytoskeletal regulatory HAD phosphatase. We have cloned and characterized this novel enzyme and named it AUM,for actin remodeling, ubiquitously expressed, magnesium-dependent HAD phosphatase. By Northern blot, real-time PCR and Western blot analysis, we show that AUM is broadly expressed in all major human and mouse tissues with highest levels found in testis. Using immunohistochemistry, we can show that AUM is specifically expressed in maturing germ cells and that its expression peaks during spermiogenesis. To characterize the substrate preference of AUM, we have conducted an in vitro phosphatase substrate screen with 720 phosphopeptides derived from human phosphorylation sites. AUM exclusively dephosphorylates phosphotyrosine (pTyr)-containing peptides. Furthermore, only 17 pTyr peptides (~2% of all pTyr peptides investigated) acted as AUM substrates, indicating a high degree of substrate specificity. Putative AUM substrates include proteins involved in cytoskeletal dynamics and tyrosine kinase signaling.In accordance with the phosphopeptide screen, phosphatase overlay assays employing whole-cell extracts of pervanadate-treated HeLa cells show that AUM dephosphorylates only a limited number of tyrosyl-phosphorylated proteins.The role of AUM for cellular signaling was investigated in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation in a spermatogonial cell line (GC-1 spg). The overexpression of AUM reduces, whereas the RNAi-mediated depletion of endogenous AUM increases EGF inducedtyrosine phosphorylation, including changes in the phosphorylation of the EGF receptor itself. Interestingly, in vitro kinase/phosphatase assays with purified Src and AUM indicate that AUM can activate Src, which in turn phosphorylates and inactivates AUM. Although it is at present unclear how Src and AUM regulate each other, our initial findings suggests that AUM enhances Src kinase activity independently of its phosphatase activity, whereas Src diminishes AUM phosphatase activity in a kinase dependent manner. On a cellular level, AUM-depleted cells are characterized by altered actin cytoskeletal dynamics and adhesion, as indicated by stabilized actin filaments, enlarged focal adhesions,a marked increase in cell area of spreading cells, as well as accelerated cell spreading on fibronectin. Taken together, we have identified and characterized AUM as a novel member of the emerging family of aspartate-dependent protein tyrosine phosphatases. Our findings implicate AUM as an important regulator of Src-dependent cytoskeletal dynamics during cell adhesion and migration.
KW  - Tyrosin
KW  - Phosphatase
KW  - Signal transduction
KW  - Cell adhesion
KW  - Actin cytoskeleton
KW  - Src
KW  - Spermatogenesis
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44256
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mishra, Dushyant
T1  - The content of olfactory memory in larval Drosophila
T1  - Olfaktorisches Gedächtnis in der Drosophila Larve
N2  - An animal depends heavily on its sense of smell and its ability to form olfactory associations as this is crucial for its survival. This thesis studies in two parts about such associative olfactory learning in larval Drosophila. The first part deals with different aspects of odour processing while the second part is concerned with aspects related to memory and learning. Chapter I.1 highlights how odour intensities could be integrated into the olfactory percept of larval Drosophila. I first describe the dose-effect curves of learnability across odour intensities for different odours and then choose odour intensities from these curves such that larvae are trained at intermediate odour intensity, but are tested for retention with either that trained intermediate odour intensity, or with respectively HIGHer or LOWer intensities. I observe a specificity of retention for the trained intensity for all the odours used. Further I compare these findings with the case of adult Drosophila and propose a circuit level model of how such intensity coding comes about. Such intensity specificity of learning adds to appreciate the richness in 'content' of olfactory memory traces, and to define the demands on computational models of olfaction and olfactory learning. Chapter I.2 provides a behaviour-based estimate of odour similarity using four different types of experiments to yield a combined, task-independent estimate of perceived difference between odour-pairs. Further comparison of these perceived differences to published measures of physico- chemical difference reveals a weak correlation. Notable exceptions to this correlation are 3-octanol and benzaldehyde. Chapter I.3 shows for two odours (3-octanol and 1-octene-3-ol) that perceptual differences between these odours can either be ignored after non-discriminative training (generalization), or accentuated by odour-specific reinforcement (discrimination). Anosmic Or83b1 mutants have lost these faculties, indicating that this adaptive adjustment is taking place downstream of Or83b expressing sensory neurons. Chapter II.1 of this thesis deals with food supplementation with dried roots of Rhodiola rosea. This dose-dependently improves odour- reward associative function in larval Drosophila. Supplementing fly food with commercially available tablets or extracts, however, does not have a 'cognitive enhancing' effect, potentially enabling us to differentiate between the effective substances in the root versus these preparations. Thus Drosophila as a genetically tractable study case should now allow accelerated analyses of the molecular mechanism(s) that underlie this 'cognitive enhancement' conveyed by Rhodiola rosea. Chapter II.2 describes the role of Synapsin, an evolutionarily conserved presynaptic phosphoprotein using a combined behavioural and genetic approach and asks where and how, this protein affects functions in associative plasticity of larval Drosophila. This study shows that a Synapsin-dependent memory trace can be pinpointed to the mushroom bodies, a 'cortical' brain region of the insects. On the molecular level, data in this study assign Synapsin as a behaviourally- relevant effector of the AC-cAMP-PKA cascade.
N2  - Das Überleben von Tieren ist in hohem Maße abhängig von ihrer Fähigkeit zu riechen und olfaktorische Gedächtnisse zu bilden. Meine Arbeit besteht aus zwei Abschnitten, in denen ich solche Prozesse anhand von Drosophila Larven untersuche. Im ersten Abschnitt beschreibe ich verschiedene Aspekte der Geruchsprozessierung, der zweite Abschnitt betrifft Gedächtnis- und Lernprozesse. Kapitel I.1 handelt davon, wie Geruchsintensitäten in die olfaktorische Wahrnehmung von Drosophila-Larven integriert sein könnten. Zuerst beschreibe ich die Lernbarkeit verschiedener Duftstoffe abhängig von ihren Intensitäten. Anhand dieser Dosis-Wirkungs-Kurven wähle ich dann eine niedrige, eine mittlere, und eine hohe Duft-Intensität. Ich trainiere Larven mit der mittleren Duft-Intensität und teste sie entweder mit dieser mittleren Intensität, oder mit der höheren, oder mit der niedrigen Duft-Intensität. Ich beobachte, dass der Gedächtnisabruf mit der trainierten Intensität für alle verwendeten Duftstoffe am besten ist. Außerdem vergleiche ich diese Ergebnisse mit denen von adulten Fruchtfliegen und schlage ein Schaltkreis-Modell vor, das erklärt, wie eine solche Kodierung der Intensität zustande kommen kann. Eine solche Spezifität für Intensitäten beim Lernen erweitert die bisher bekannte Fülle des ‚Inhalts’ von olfaktorischen Gedächtnisspuren und die Anforderungen an Computermodelle über Riechen und Geruchslernen. In Kapitel I.2 untersuche ich Ähnlichkeitsbeziehungen zwischen Duftpaaren anhand der Wahrnehmung von Larven. Ich verwende dazu vier verschiedene Typen von Lernexperimenten. Durch Kombination der Ergebnisse dieser vier Experimente erhalte ich eine aufgabenunabhängige Abschätzung der vom Tier wahrgenommenen Ähnlichkeiten zwischen Paaren von Duftstoffen. Ein Vergleich dieser wahrgenommenen Ähnlichkeiten mit veröffentlichten Messungen von physikalischen und chemischen Ähnlichkeiten ergibt eine schwache Korrelation. Eine erwähnenswerte Ausnahme zu dieser Korrelation ist das Duftpaar 3-Octanol und Benzaldehyd. Kapitel I.3 zeigt für zwei Duftstoffe (3-Octanol und 1-Octen-3-ol), dass die wahrgenommene Ähnlichkeit zwischen diesen beiden Duftstoffen abhängig ist von der Art des Trainings. Wenn die Tiere nicht-diskriminativ trainiert werden, werden die Düfte vom Tier generalisiert, während diskriminatives Training die wahrgenommene Unterschiede zwischen den Düften erhöht. Anosmische Or83b1-Mutanten haben diese Fähigkeiten verloren, was darauf hindeutet, das diese adaptive Anpassung in Nervenzellen stattfindet, die den Or83b-exprimierenden sensorischen Neuronen nachgeschaltet sind. In Kapitel II.1 untersuche ich die Auswirkung von Zugabe getrockneter Wurzeln der Pflanze Rhodiola rosea zum Fliegenfutter. Ich finde heraus, dass Rhodiola rosea dosisabhängig die olfaktorische Konditionierung von Drosophila-Larven verbessert. Die Zugabe von kommerziell verfügbaren Tabletten oder Extrakten zum Fliegenfutter hat keinen positiven Effekt auf solche „kognitiven“ Fähigkeiten, was uns möglicherweise erlaubt, zwischen den effektiven Substanzen der Wurzel und diesen Präparaten zu differenzieren. Drosophila als genetisch manipulierbarer Modellorganismus sollte uns nun weiterführende Analysen der molekularen Mechanismen erlauben, die dieser „kognitiven Verbesserung“ durch Rhodiola rosea zugrunde liegen. Kapitel II.2 beschreibe ich die Funktion von Synapsin, einem evolutionär konservierten präsynaptischen Phosphoprotein. Ich verwende dazu einen kombinierten verhaltensbasierten und genetischen Ansatz. Untersucht wird, wo und wie dieses Protein assoziative Plastizität im Gehirn von Drosophila-Larven beeinflusst. Diese Studie zeigt, dass eine Synapsin-abhängige Gedächtnisspur im Pilzkörper, einer „kortikalen“ Gehirnregion der Insekten, lokalisiert werden kann. Auf der molekularen Ebene zeigen die Ergebnisse dieser Studie Synapsin als einen im Verhalten wichtigen Effektor der AC-cAMP-Kaskade. * Many thanks to M. Schlayer, T. Niewalda and T. Saumweber for their help in this translation.
KW  - Drosophila
KW  - Insektenlarve
KW  - Geruchssinn
KW  - Lernen
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - Olfaktion
KW  - Neurogenetik
KW  - Speicher
KW  - Neurogenetics
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - Olfaction
KW  - Learning
KW  - Memory
KW  - Reinforcement
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66316
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmitt, Kathrin
T1  - Identification and Characterization of GAS2L3 as a Novel Mitotic Regulator in Human Cells
T1  - Die Identifizierung und Charakterisierung von GAS2L3 als neuer Regulator der Mitose in humanen Zellen
N2  - Precise control of mitotic progression is vital for the maintenance of genomic integrity. Since the loss of genomic integrity is known to promote tumorigenesis, the identification of knew G2/M regulatory genes attracts great attention. LINC, a human multiprotein complex, is a transcriptional activator of a set of G2/M specific genes. By depleting LIN9 in MEFs, a core subunit of LINC, Gas2l3 was identified as a novel LINC target gene. The so far uncharacterized Gas2l3 gene encodes for a member of the family of growth arrest specific 2 (GAS2) proteins, which share a highly conserved putative actin binding CH and a putative microtubule binding GAS2 domain. In the present study GAS2L3 was identified as a LINC target gene also in human cells. Gene expression analysis revealed that GAS2L3 transcription, in contrast to all other GAS2 family members, is highly regulated during the cell cycle with highest expression in G2/M. The GAS2L3 protein showed a specific localization pattern during the M phase: In metaphase, GAS2L3 localized to the mitotic spindle, relocated to the spindle midzone microtubules in late anaphase and concentrated at the midbody in telophase where it persisted until the end of cytokinesis. Overexpression of a set of different GAS2L3 deletion mutants demonstrated that the localization to the mitotic microtubule network is dependent on the C-terminus, whereas the midbody localization is dependent on full length GAS2L3 protein. Additionally, exclusive overexpression of the CH domain induced the formation of actin stress fibers, suggesting that the CH domain is an actin binding domain. In contrast, the GAS2 domain was neither needed nor sufficient for microtubule binding, indicating that there must be an additional so far unknown microtubule binding domain in the C-terminus. Interestingly, immunoblot analysis also identified the C-terminus as the domain responsible for GAS2L3 protein instability, partially dependent on proteasomal degradation. Consistent with its specific localization pattern, GAS2L3 depletion by RNAi demonstrated its responsibility for proper mitosis and cytokinesis. GAS2L3 depletion in HeLa cells resulted in the accumulation of multinucleated cells, an indicator for chromosome mis-segregation during mitosis. Also the amount of cells in cytokinesis was enriched, indicating failures in completing the last step of cytokinesis, the abscission. Strikingly, treatment with microtubule poisons that lead to the activation of the spindle assembly checkpoint (SAC) indicated that the SAC was weakened in GAS2L3 depleted cells. Although the exact molecular mechanism is still unknown, fist experiments support the hypothesis that GAS2L3 might be a regulator of the SAC master kinase BUBR1. In conclusion, this study provides first evidence for GAS2L3 as a novel regulator of mitosis and cytokinesis and it might therefore be an important guardian against tumorigenesis.
N2  - Der korrekte Verlauf durch die Mitose des Zellzyklus trägt entscheidend zur Aufrechterhaltung der genomischen Integrität bei. Da ein Verlust der genomischen Integrität die Tumorentstehung begünstigt, ist die Identifizierung neuer G2/M regulatorischer Gene ein Forschungsbereich, der großes Interesse weckt. Der humane Multiproteinkomplex LINC ist für die transkriptionelle Aktivierung einer Vielzahl G2/M spezifischer Gene verantwortlich. Durch die Depletion von LIN9 in MEFs, einer Kernkomponente von LINC, wurde Gas2l3 als ein neues Zielgen von LINC identifiziert. Das bisher uncharakterisierte Gas2l3 Gen codiert für ein der GAS2 (growth arrest specific 2) Familie zugehöriges Protein, deren Mitglieder sich durch eine hoch konservierte putative Aktin-bindende Domäne (CH) und eine putative Mikrotubuli-bindende Domäne (GAS2) auszeichnen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass GAS2L3 auch in humanen Zellen ein Zielgen von LINC ist. Die Transkription von GAS2L3 wies, im Gegensatz zu allen anderen GAS2 Familienmitgliedern, eine starke Regulation während des Zellzyklus auf, wobei die höchste Genexpression in der G2/M Phase vorlag. Das GAS2L3 Protein zeigte eine spezifische Lokalisation während der M Phase: In der Metaphase findet sich GAS2L3 an der mitotischen Spindel, wandert von dort an die Mikrotubuli der zentralen Spindel der Anaphase und konzentriert sich in der Telophase am Midbody, wo es bis zum Ende der Zytokinese verweilt. Der Einsatz unterschiedlicher Deletionsmutanten demonstrierte, dass die Lokalisation an die mitotischen Mikrotubuli vom C-Terminus abhängig ist, wohingegen die Lokalisation am Midbody von der gesamten Proteinsequenz abhängt. Die Ausbildung von Aktin-Streß-Filamenten nach alleiniger Überexpression der CH Domäne deutete darauf hin, dass die CH Domäne eine Aktin-bindende Domäne ist. Die GAS2 Domäne hingegen wurde weder für die Interaktion mit Mikrotubuli gebraucht, noch war sie alleine für diese ausreichend. Alle Daten weisen darauf hin, dass GAS2L3 eine bisher unbekannte Mikrotubuli-bindende Domäne im C-Terminus trägt. Interessanterweise ist der C-Terminus auch für die hohe Instabilität des GAS2L3 Proteins, die teilweise durch den Abbau im Proteasom verursacht wird, verantwortlich. Entsprechend der spezifischen Lokalisation zeigte die Depletion von GAS2L3 durch siRNA Transfektion dessen Wichtigkeit für den korrekten Verlauf der M Phase. GAS2L3 depletierte HeLa Zellen zeigten eine Anreicherung von multinukleären Zellen, welche ein Indikator für die fehlerhafte Verteilung der Chromosomen in der Mitose sind. Ein Hinweis auf Probleme im Beenden der Zytokinese stellte die erhöhte Anzahl von Zellen dar, die sich in der Zytokinese befanden. Eines der auffallendsten Merkmale war ein geschwächter mitotischer Spindelkontrollpunkt, den GAS2L3 depletierte Zellen nach der Behandlung mit den Kontrollpunkt aktivierenden Mikrotubuli-Giften aufwiesen. Auch wenn der exakte molekulare Mechanismus hierbei noch unbekannt ist, deuten erste Experimente darauf hin, dass GAS2L3 die Aktivität von BUBR1, einer essentiellen Kinase des mitotischen Spindelkontrollpunkts, beeinflusst. Alle Daten dieser Arbeit verdeutlichen die Wichtigkeit von GAS2L3 als einen neuen Regulator der Mitose und Zytokinese. Somit ist anzunehmen, dass die korrekte Funktion von GAS2L3 entscheidend zum Schutz vor Tumorentstehung beiträgt.
KW  - Mensch
KW  - Zelle
KW  - Mitose
KW  - Kernspindel
KW  - Kontrolle
KW  - Genregulation
KW  - Spindelkontrollpunkt
KW  - Zytokinese
KW  - Midbody
KW  - GAS2L3
KW  - LIN9
KW  - Zellzyklus
KW  - LIN9
KW  - GAS2L3
KW  - mitosis
KW  - cytokinesis
KW  - spindle assembly checkpoint
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52704
ER  - 
TY  - THES
A1  - Keidel, Kristina
T1  - Charakterisierung des Hfq-Regulons in Bordetella pertussis und Bordetella bronchiseptica
T1  - Characterisation of the Hfq regulon in Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica
N2  - Bordetellen sind Gram-negative Kokkobazillen, die phylogenetisch zu den β-Proteobakterien zählen und in der Familie der Alcaligenaceae eingeordnet sind. Der bedeutendste Vertreter der Gattung, die nach heutigem Kenntnisstand neun Arten umfasst, ist Bordetella pertussis, der Erreger des Keuchhustens. Der Keim ist obligat humanpathogen und besitzt zahlreiche Virulenzfaktoren, um die Epithelzellen des Respirationstraktes zu besiedeln und zu zerstören, wodurch es zu dem charakteristischen Krankheitsverlauf kommt. Neben B. pertussis werden noch B. bronchiseptica und B. parapertussis dem sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zugeteilt. Alle Vertreter des B. bronchiseptica-Clusters sind in der Lage, bei verschiedenen Wirtsspezies respiratorische Erkrankungen mit unterschiedlichem Schweregrad auszulösen. Dabei weist B. bronchiseptica ein breiteres Wirtsspektrum auf und kann Atemwegserkrankungen in einer Vielzahl von Säugetieren auslösen, wohingegen B. parapertussis vornehmlich Schafe und Menschen infiziert und bei letzteren eine schwächere Form des Keuchhustens bewirkt. Das Hfq-Protein wurde ursprünglich als Wirtsfaktor identifiziert, welcher für die Replikation des RNA-Phagen Qβ in Escherichia coli benötigt wird (host factor for Qβ oder HF-1). Es ist in Struktur und Funktion homolog zu den Sm-Proteinen aus Eukaryoten, die am Splicing von mRNAs involviert sind. Die Beteiligung des Hfq-Proteins an regulatorischen Vorgängen, die durch kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) vermittelt werden, wurde erstmals in einer Studie zum Mechanismus der rpoS-Regulation durch die kleine regulatorische RNA OxyS ersichtlich. Seitdem konnte für eine Vielzahl an sRNAs gezeigt werden, dass sie an Hfq gebunden vorliegen und die Hilfe des Proteins bei der post-transkriptionellen Kontrolle ihrer Ziel-mRNAs benötigen. In dieser Hinsicht übernimmt Hfq die Rolle eines RNA-Chaperons, indem es trans-kodierte sRNAs stabilisiert und die Basenpaarung mit ihren Ziel-mRNAs fördert. Dabei beeinflusst die Bindung der sRNA-Regulatoren an ihre Ziel-mRNAs deren Translation, sowohl aktivierend als auch inhibierend. Bislang wurden Hfq-Homologe in der Hälfte aller sequenzierten Gram-positiven und Gram-negativen Bakterienarten gefunden. Eine BLAST-Analyse ergab, dass B. pertussis und B. bronchiseptica Homologe zum Hfq-Protein aufweisen und diese in der veröffentlichten Genomsequenz bereits als Hfq-Protein annotiert sind. Fokus dieser Arbeit war weitestgehend, die Funktion des Hfq-Proteins in B. pertussis und vergleichend in B. bronchiseptica zu charakterisieren. Mittels Primer Extension-Analyse konnte zunächst der Startpunkt des hfq-Transkripts in B. pertussis und B. bronchiseptica unter logarithmischen Wachstumsbedingungen bestimmt werden. Dieser Startpunkt war zudem unter stationären Wachstumsbedingungen und nach Hitzestress aktiv, was in Diskrepanz zur Beobachtung in E. coli steht. Ferner konnte festgestellt werden, dass die hfq-Transkription nach Induktion verschiedener Stressformen in beiden Organismen erhöht war. Nach Generierung der jeweiligen Δhfq-Mutanten in beiden Organismen wurden diese charakterisiert. Die B. pertussis Δhfq-Mutante zeigte ein deutliches Wachstumsdefizit gegenüber dem Wildtyp, im Gegensatz zu B. bronchiseptica Δhfq, die sich im Wachstum wie der Wildtyp verhielt. Beide Mutanten zeigten sich sensitiver gegenüber H2O2-Stress als der Wildtyp, nicht jedoch gegenüber weiteren oxidativen Stressbedingungen oder Membranstress induzierenden Substanzen. Die Δhfq-Mutante in B. pertussis war zudem in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt, was jedoch nicht für B. bronchiseptica Δhfq galt. Da Hfq an sRNA-mRNA-Interaktionen, welche die Translation der mRNAs beeinflussen, beteiligt ist, sollte über 2D-Gelelektrophorese das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica bestimmt werden. Auffällig war, dass viele periplasmatische Transport-bindeproteine von der Δhfq-Mutation betroffen waren. Es zeigten sich aber auch Stoffwechselenzyme und wichtige Housekeeping-Faktoren, wie z. B. der Elongationsfaktor EF-Tu und das Chaperon GroEL, in der Δhfq-Mutante dereguliert. Generell scheint das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica nur einen kleinen Teil des gesamten Proteoms auszumachen. Zudem ist das Hfq-regulierte Proteom variabel zwischen verschiedenen Wachstumsbedingungen, aber auch zwischen den beiden Organismen trotz der engen Verwandtschaft. Die Expression ausgewählter Virulenzfaktoren zeigte keinen Unterschied zwischen Δhfq-Mutante und B. pertussis-Wildtyp.
N2  - Bordetellae are Gram-negative coccobacilli phylogenetically belonging to the β-group of proteobacteria and therein to the family of Alcaligenaceae. The most prominent member of the genus comprising nine species so far is Bordetella pertussis, the etiological agent of whooping cough. This organism is an obligatory human pathogen and expresses a variety of virulence factors in order to colonize and destroy the epithelial cells of the respiratory tract causing the characteristic symptoms of the disease. In addition to B. pertussis, B. bronchiseptica and B. parapertussis are assigned to the so-called B. bronchiseptica-cluster. All members of the B. bronchiseptica-cluster have the ability to cause respiratory symptoms with varying severity. B. bronchiseptica exhibits a broad host range causing respiratory symptoms in a variety of mammals, whereas B. parapertussis infects sheep and humans causing a milder form of whooping cough in the latter. The Hfq protein was originally identified as a host factor necessary for the replication of the RNA-phage Qβ in Escherichia coli (host factor for Qβ or HF-1). It is functionally and structurally homologous to Sm-proteins involved in splicing of mRNAs in eukaryotes. The involvement of Hfq in regulatory processes caused by small non-coding RNAs (sRNAs) was first recognized in a study on the mechanism of rpoS-regulation by the small regulatory RNA OxyS. Since then a variety of sRNAs were shown to be bound to Hfq and require its help for post-transcriptional control of their target-mRNAs. In this regard, Hfq functions as an RNA-chaperone by stabilizing trans-encoded sRNAs and their basepairing to target-mRNAs. Binding of the sRNA-regulators to their target-mRNAs thereby either activates or inhibits their translation. To date Hfq homologues were identified in half of all sequenced Gram-positive and Gram-negative bacterial species. BLAST analysis revealed that B. pertussis and B. bronchiseptica possess an Hfq homologue which has already been annotated as such in the published genome sequence. The main focus of this work was to characterize the function of the Hfq protein in B. pertussis as well as in B. bronchiseptica. By primer extension analysis we could identify the start of the hfq-transcript in B. pertussis and B. bronchiseptica under logarithmic growth conditions. This transcriptional start site was also active under stationary growth conditions and after heat shock which is discrepant from the observations in E. coli. Furthermore, it could be shown that the hfq-transcription was elevated in both B. pertussis and B. bronchiseptica under various stress conditions. Δhfq-mutants were established and characterized in both organisms. The Δhfq-mutant of B. pertussis exhibited a pronounced growth deficit in comparison to the wildtype whereas the Δhfq-mutant of B. bronchiseptica showed the same growth properties as the wildtype. Both Δhfq-mutants expressed a higher sensitivity to stress caused by H2O2 compared to the wildtype. However, there was no increased sensitivity of the Δhfq-mutants to other oxidative stress agents or membrane stress inducing agents. Furthermore, the Δhfq-mutant of B. pertussis but not the Δhfq-mutant of B. bronchiseptica was impaired in its ability to form biofilms. Since Hfq is involved in sRNA-mRNA-interactions affecting the efficient translation of mRNAs, the Hfq-regulated proteome of B. pertussis and B. bronchiseptica was determined by 2D-gelelectrophoresis. Strikingly, a variety of periplasmic binding proteins involved in transport were affected by the Δhfq-mutation. In addition, enzymes of various metabolic pathways and important housekeeping factors, such as elongation factor EF-Tu and the protein chaperone GroEL, were deregulated in the Δhfq-mutant. The Hfq-regulated proteome comprises generally only a small part of the complete proteome in B. pertussis and B. bronchiseptica. Furthermore, this Hfq-regulated proteome differs between certain growth conditions as well as between the two closely related organisms. No difference could be observed in the expression of selected virulence factors between B. pertussis Δhfq and wildtype.
KW  - Bordetella pertussis
KW  - Bordetella bronchiseptica
KW  - Regulon
KW  - Hfq
KW  - Bordetella pertussis
KW  - Bordetella bronchiseptica
KW  - regulon
KW  - Hfq
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66677
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Clauss, Gerd
A1  - Winkler, Christoph
A1  - Lohmeyer, Jürgen
A1  - Anders, Fritz
A1  - Schartl, Manfred
T1  - Oncofetal antigen in Xiphophorus detected by monoclonal antibodies directed against melanoma-associated antigens
N2  - Monoclonal antlbodies (MAbs) directed against Xiphophorus melanoma cells were deve(oped and tested by lndirect immunofluorescence and Immunoperoxidase staining for reactivity with a panel of I 5 allogeneic tissues and 12 allogeneic cell llnes. The reactivity of such MAbs was restricted to melanoma cells from tumor biopsies and melanoma-derived cell lines. ln addition, all embryonie cells of all histiotypes from developmental stages later than mld·organogenesis and from corresponding short term in vitro cultures reacted with these MAbs. ln contrast, normal tissues and organs from adult fish dlsplayed no reactivity, thus implying that the melanoma-associated antigens detected by the MAbs described are oncofetal antigens.
KW  - Physiologische Chemie
Y1  - 1990
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61784
ER  -