TY  - THES
A1  - Seitz, Nicola
T1  - Bee demise and bee rise: From honey bee colony losses to finding measures for advancing entire bee communities
T1  - Bienenschwund und Bienenaufschwung: Von Honigbienen-Kolonieverlusten zur Förderung von gesamten Bienengemeinschaften
N2  - My dissertation comprises three studies: (1) an assessment of honey bee colony losses in the USA between 2014 and 2015, (2) an exploration of the potential of reclaimed sand mines as bee habitat, and (3) an evaluation of native and non-native pollinator friendly plants in regard to their attraction to bees. While the first study focuses on honey bees, the latter two studies primarily take wild bees or entire bee communities in focus.

The study on honey bee colony losses was conducted within the framework of the Bee Informed Partnership (BIP, beeinformed.org) and aligns with the annual colony loss surveys which have been conducted in the USA since the winter of 2006/2007. It was the fourth year for which summer and annual losses were calculated in addition to winter losses. Among participants, backyard beekeepers were the largest group (n = 5690), although sideline (n = 169) and commercial (n = 78) beekeepers managed the majority (91.7 %) of the 414 267 surveyed colonies. Overall, 15.1 % of the estimated 2.74 million managed colonies in the USA were included in the study. Total honey bee colony losses (based on the entirety of included colonies) were higher in summer (25.3 %) than in winter (22.3 %) and amounted to 40.6 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Average colony losses per beekeeper or operation were higher in winter (43.7 %) than in summer (14.7 %) and amounted to 49 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Due to the dominance of backyard beekeepers among participants, average losses per operation (or unweighted loss) stronger reflected this smaller type of beekeeper. Backyard beekeepers mainly named colony management issues (e.g., starvation, weak colony in the fall) as causes for mortality, while sideline and commercial beekeepers stronger emphasized parasites or factors outside their control (e.g., varroa, nosema, queen failure).

The second study took place at reclaimed sand mines. Sand mines represent anthropogenically impacted habitats found worldwide, which bear potential for bee conservation. Although floral resources can be limited at these habitats, vegetation free patches of open sandy soils and embankments may offer good nesting possibilities for sand restricted and other bees. We compared bee communities as found in three reclaimed sand mines and at adjacent roadside meadows in Maryland, USA, over two years. Both sand mines and roadsides hosted diverse bee communities with 111 and 88 bee species, respectively. Bee abundances as well as richness and Shannon diversity of bee species were higher in sand mines than at roadsides and negatively correlated with the percentage of vegetational ground cover. Species composition also differed significantly between habitats. Sand mines hosted a higher proportion of ground nesters, more uncommon and more ‘sand loving’ bees similar to natural sandy areas of Maryland. Despite the destruction of the original pre-mining habitat, sand mines thus appear to represent a unique habitat for wild bees, particularly when natural vegetation and open sand spots are encouraged. Considering habitat loss, the lack of natural disturbance regimes, and ongoing declines of wild bees, sand mines could add promising opportunities for bee conservation which has hitherto mainly focused on agricultural and urban habitats.

The third study was an experimental field study on pollinator friendly plants. Bees rely on the pollen and nectar of plants as their food source. Therefore, pollinator friendly plantings are often used for habitat enhancements in bee conservation. Non-native pollinator friendly plants may aid in bee conservation efforts, but have not been tested and compared with native pollinator friendly plants in a common garden experiment. In this study, we seeded mixes of 20 native and 20 non-native pollinator friendly plants in two separate plots at three sites in Maryland, USA. For two years, we recorded flower visitors to the plants throughout the blooming period and additionally sampled bees with pan traps. A total of 3744 bees (120 species) were sampled in the study. Of these, 1708 bees (72 species) were hand netted directly from flowers for comparisons between native and non-native plants. Depending on the season, bee abundance and species richness was either similar or lower (early season and for richness also late season) at native plots compared to non-native plots. Additionally, the overall bee community composition differed significantly between native and non-native plots. Furthermore, native plants were associated with more specialized plant-bee visitation networks compared to non-native plants. In general, visitation networks were more specialized in the early season than the later seasons. Four species (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, and Xylocopa virginica) out of the five most abundant bee species (also including Apis mellifera) foraged more specialized on native than non-native plants. Our study showed that non-native plants were well accepted by a diverse bee community and had a similar to higher attraction for bees compared to native plants. However, we also demonstrated alterations in foraging behavior, bee community assemblage, and visitation networks. As long as used with caution, non-native plants can be a useful addition to native pollinator friendly plantings. This study gives a first example of a direct comparison between native and non-native pollinator friendly plants.
N2  - Meine Dissertation umfasst drei Studien: (1) eine Erfassung von Honigbienen-Kolonieverlusten in den USA zwischen 2014 und 2015, (2) die Erforschung des Potenzials renaturierter Sandminen als Habitat für Bienen und (3) eine Evaluierung nativer sowie standortfremder bestäuberfreundlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Attraktivität für Bienen. Während die erste Studie Honigbienen im Fokus hat, verschiebt sich der Fokus der zwei weiteren Studien hin zu Wildbienen bzw. gesamten Bienengemeinschaften.

Die Studie zu Honigbienenkolonieverlusten wurde im Rahmen des Bee Informed Partnerships (BIP, beeinformed.org) durchgeführt und reiht sich ein in die seit dem Winter 2006/2007 jährlich durchgeführten Untersuchungen in den USA. Es ist das vierte Jahr in dem Sommer- und Jahresverluste zusätzlich zu den Winterverlusten kalkuliert wurden. Unter den Teilnehmern bildete die Gruppe der Hobby-Imker den größten Anteil (n = 5690), obwohl nebenberufliche (n = 169) und kommerzielle (n = 78) Imker den Großteil (91,7 %) der 414 267 begutachteten Bienenvölkern bzw. Kolonien hielten. Insgesamt enthielt die Studie 15,1 % der auf 2,74 Mio. geschätzten Gesamtzahl an gehaltenen Bienenvölkern in den USA. Die Gesamtverluste an Honigbienenvölkern (basierend auf der Gesamtheit der erfassten Völker) waren im Sommer mit 25,3 % höher als im Winter mit 22,3 % und bezifferten sich auf 40,6 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Durchschnittliche Kolonieverluste pro Imkerbetrieb waren höher im Winter (43,7 %) als im Sommer (14,7 %) und betrugen 49 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Aufgrund der hohen Anzahl an Hobby-Imkern unter den Teilnehmern reflektieren die durchschnittlichen Kolonieverluste pro Imkerbetrieb (oder ungewichtete Verluste) v.a. die Situation dieser kleineren Imkerbetriebe. Hobby-Imker nannten als Gründe für die Honigbienenmortalität hauptsächlich Probleme des Koloniemanagements (z.B. Verhungerung, schwache Völker im Herbst), während nebenberufliche und kommerzielle Imker stärker Faktoren betonten, die außerhalb ihrer Kontrolle lagen (z.B. Varroamilben, Nosemasporen, Versagen der Königin).

Die zweite Studie fand in renaturierten Sandminen statt. Sandminen sind weltweit zu findende anthropogen veränderte Landschaften, die ein Potenzial für Bienenschutz haben. Obwohl florale Ressourcen in diesen Habitaten limitiert sein können, könnten die vegetationsfreien Flecken auf offenen Sandböden und Böschungen gute Nistplätze für auf Sand spezialisierte und andere Bienen bieten. Wir haben Bienengemeinschaften aus drei renaturierten Sandminen sowie jeweils nahe gelegenen bepflanzten Straßenrändern in Maryland, USA verglichen. Sowohl die Sandminen als auch die Straßenränder enthielten vielfältige Bienengemeinschaften mit 111 (Sandminen) und 88 (Straßenränder) Bienenarten. Bienenabundanz, Artenreichtum und Shannon Diversität waren höher in den Sandminen als an den Straßenrändern und korrelierten negativ mit dem Anteil an vorhandener Bodenvegetation. Darüber hinaus unterschied sich die Artzusammensetzung signifikant zwischen den beiden Habitattypen. Sandminen enthielten einen größeren Anteil an Bodennistern, mehr seltene Arten und mehr sandliebende Arten, ähnlich natürlicher sandiger Gebiete in Maryland. Trotz der Zerstörung des ursprünglichen prä-Minen Habitats, scheinen Sandminen daher ein einzigartiges Bienenhabitat für Wildbienen darzustellen, besonders wenn die natürliche Besiedlung von Vegetation und offene Sandflächen gefördert werden. Im Hinblick auf Habitatverluste, auf das Fehlen von natürlichen Landschaftsstörungen und auf den weiterschreitenden Rückgang an Wildbienen, könnten Sandminen eine vielversprechende Möglichkeit für Bienenschutz darstellen, der sich bisher stark auf landwirtschaftliche und urbane Habitate konzentrierte.

Bei der dritten Studie handelt es sich um eine experimentelle Feldstudie zu bestäuberfreundlichen Pflanzen. Bienen sind auf Pollen und Nektar von Pflanzen als Nahrungsquelle angewiesen. Aus diesem Grund werden bestäuberfreundliche Pflanzen oft für Habitatverbesserungen im Rahmen von Bienenschutzmaßnahmen gepflanzt. Standortfremde bestäuberfreundliche Pflanzen können dabei die Bienenschutzmaßnahmen unterstützen, wurden aber bisher nicht in einem Common Garden Experiment zusammen mit nativen bestäuberfreundlichen Pflanzen getestet bzw. verglichen. In dieser Studie haben wir Saatgutmischungen mit jeweils 20 nativen und 20 standortfremden Pflanzen in zwei separaten Plots in drei Gebieten in Maryland, USA ausgesät. Zwei Jahre lang protokollierten wir über die gesamten Blühzeiträume hinweg Pflanzenbesucher und sammelten Bienen mit Farbschalen. Insgesamt erfassten wir 3744 Bienen (120 Arten), von denen 1708 Individuen (72 Arten) per Hand direkt von den Blüten gesammelt wurden für die Vergleiche zwischen nativen und standortfremden Pflanzen. Abhängig von der Saison waren Bienenabundanz und Artenreichtum entweder ähnlich oder niedriger (frühe Saison und für Artenreichtum auch späte Saison) in nativen Plots verglichen mit den standortfremden Plots. Zusätzlich unterschied sich die Zusammensetzung der Bienengemeinschaft signifikant zwischen nativen und standortfremnden Pflanzen. Darüber hinaus waren die Bienen-Pflanzen-Besuchs-Netzwerke nativer Pflanzen spezialisierter als die Besuchs-Netzwerke standortfremder Pflanzen. Im Allgemeinen waren die Besuchs-Netzwerke in der frühen Saison spezialisierter als in der späten Saison. Vier Arten (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, und Xylocopa virginica) der fünf am häufigsten vorkommenden Arten (zusätzlich auch Apis mellifera) fouragierten spezialisierter auf nativen Pflanzen als auf standortfremden Pflanzen. Unsere Studie zeigte, dass standortfremde Pflanzen weitläufig von einer artenreichen Bienengemeinschaft angenommen wurden und eine ähnliche bis höhere Attraktivität für Bienen aufwiesen verglichen mit nativen Pflanzen. Allerdings demonstrierten wir auch Änderungen im Fouragierverhalten, in der Zusammensetzung der Bienengemeinschaft und in den Besuchs-Netzwerken. Insgesamt kann ein vorsichtiger Einsatz standortfremder Pflanzen eine sinnvolle Ergänzung zu nativen bestäuberfreundlichen Anpflanzungen sein. Diese Studie stellt ein erstes Beispiel eines direkten Vergleichs von nativen und standortfremden bestäuberfreundlichen Anpflanzungen dar.
KW  - Biene
KW  - Wildbienen
KW  - Renaturierung <Ökologie>
KW  - Naturschutz
KW  - Honigbienen
KW  - exotische Pflanzen
KW  - Sandminen
KW  - Pflanzen-Bienen-Netzwerke
KW  - bestäuberfreundliche Pflanzen
KW  - wild bees
KW  - honey bees
KW  - sand mine
KW  - pollinator friendly plants
KW  - plant-bee visitation networks
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184180
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TY  - THES
A1  - Schneider, Felicitas Maria Hannelore
T1  - Vergleichende Evaluierung verschiedener Ansätze des Memory Enhancement bei neurodegenerativen Prozessen
T1  - Comparative evaluation of different approaches of memory enhancement in neurodegenerative disease
N2  - Angesichts des dramatischen, weltweiten Anstiegs der Prävalenz von Demenzerkrankungen und der aktuellen, unzureichenden Therapieansätze ist die Bereitstellung neuer, wirkungsvoller Behandlungsoptionen von größter Bedeutung. Technologische, pharmakologische und verhaltensbasierte Verfahren des Memory Enhancement könnten zur Lösung dieses Problems beitragen: Hierzu zählt die Stammzelltransplantation, die in mehreren Tierstudien zu einer Verbesserung der Gedächtnisfunktion führte. Zudem wird seit Längerem an einer Impfung gegen die Alzheimer-Krankheit mittels β-Amyloid-Antikörpern geforscht. Ein weiterer therapeutischer Ansatz für die Alzheimer-Krankheit besteht in der optogenetischen Stimulation spezifischer hippocampaler Engramm-Zellen, durch die bei einem Maus-Modell verloren gegangene Erinnerungen wiederhergestellt werden konnten. Unkonventionelle Pharmazeutika wie Erythropoetin führten in Tierstudien und bei Patienten mit neuropsychiatrischen Erkrankungen zu einer Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten und des Gedächtnisses. Eine Modifikation der Ernährung und der Einsatz von Pro- und Präbiotika beeinflussen das Gedächtnis über eine Manipulation der Darm-Hirn-Achse. Verhaltensbasierte Maßnahmen wie körperliche Aktivität und der Einsatz von Mnemotechniken stellen effektive Ansätze des Memory Enhancement dar, welche bereits heute von gesunden Individuen implementiert werden können. Für die Anwendung von Augmented Reality (AR) konnten kognitionsfördernde Wirkungen beim Lernen neuroanatomischer Themen und dem Zusammenbau von Objekten nachgewiesen werden. Besonders vielversprechend stellt sich die Entwicklung einer Gedächtnisprothese dar, durch die vergessene Informationen bei Personen mit stattgehabtem Schädel-Hirn-Trauma und apoplektischem Insult reaktiviert werden könnten. Memory Enhancement ist prinzipiell bereits heute bei gesunden und kranken Individuen anwendbar und verspricht wirksame zukünftige Präventions- und Therapieoptionen. Ein realer Einsatz in der klinischen Praxis ist in naher Zukunft jedoch noch nicht zu erwarten.
N2  - Due to the worldwide increasing prevalence of dementia and the current, inadequate therapeutic approaches, it is very important to develop new, effective treatment options. Technological, pharmacological and behavior-based methods of memory enhancement could help to solve this problem: This includes stem cell transplantation, which has led to an improvement in memory function in several animal studies. In addition, research into vaccination against Alzheimer's disease using β-amyloid antibodies has been done for several years. Another therapeutic approach for Alzheimer's disease is the optogenetic stimulation of specific hippocampal engram cells, through which lost memories could be restored in a mouse model. Unconventional pharmaceuticals such as erythropoietin have improved cognitive skills and memory in animal studies and in patients with neuropsychiatric disorders. A diet modification and the use of probiotics and prebiotics affect memory by manipulating the gut-brain axis. Behavioral approaches such as physical activity and the use of mnemonics represent effective approaches of memory enhancement that healthy individuals can already implement today. The application of augmented reality (AR) was associated to cognition-promoting effects when learning neuroanatomical topics and assembling objects. The development of a memory prosthesis seems to be particularly promising and could be used to reactivate forgotten information in people with traumatic brain injury and apoplectic insult. In principle, memory enhancement can already be used today in healthy and diseased individuals and promises effective future prevention and therapy options. However, a real use in clinical practice cannot be expected in the near future.
KW  - Neurodegeneration
KW  - Langzeitgedächtnis
KW  - Alzheimerkrankheit
KW  - memory enhancement
KW  - neuroenhancement
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207562
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TY  - THES
A1  - Götz, Ralph
T1  - Super-resolution microscopy of plasma membrane receptors and intracellular pathogens
T1  - Hochauflösende Mikroskopie von Plasmamembran Rezeptoren und intrazellulären Pathogenen
N2  - Humans tend to believe in what they can see with their own eyes. Hence, visualization methods like microscopy have always been extremely popular since their invention in the 17th century. With the advent of super-resolution microscopy, the diffraction limit of ~200 - 250 nm could be overcome to enable more detailed insights into biological samples. Especially the single molecule localization microscopy method dSTORM offers the possibility of quantitative bioimaging. Hereby, the repetitive photoswitching of organic dyes in the presence of thiols is exploited to enable a lateral resolution of 20 nm. Another, recently introduced super-resolution method is expansion microscopy (ExM) which physically expands the sample to increase the resolution by the expansion factor from four to even twenty. To enable this, the sample is embedded into a hydrogel, homogenized using an unspecific proteinase and expanded in distilled water. Within this thesis, both methods were used to shed light on plasma membrane receptor distributions and different bacterial and fungal pathogens. In the first part of this thesis dSTORM was used to elucidate the “Receptome”, the entirety of all membrane receptors, of the cell line Jurkat T-cells and primary T-cells. Within this project we could successfully visualize and quantify the distribution of the plasma membrane receptors CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD20, CD28, CD45, CD69 and CD105 with receptor densities ranging from 0.8 cluster/µm² in case of CD20 and 81.4 cluster/µm² for the highly abundant CD45 in activated primary T-cells at the basal membrane. Hereby, we could also demonstrate a homogeneous distribution of most receptors, while only few were clustered. In the case of CD3-clusters were detected in Jurkat T-cells and in primary activated T-cells, but not in naïve ones, demonstrating the activation of this receptor. This was followed by the application of dSTORM to three different clinical projects involving the receptors CD38, BCMA and CD20 which are immunotherapeutic targets by monoclonal antibodies and CAR T-cells. In the first two projects dSTORM was applied to determine the receptor upregulation upon exposure of various drugs to MM1.S cells or primary multiple myeloma patient cells. This increase in membrane receptor expression can subsequently enhance the efficacy of therapies directed against these receptors. Within the CD20-project, the superior sensitivity of dSTORM compared to flow cytometry could be demonstrated. Hereby, a substantially higher fraction of CD20-positive patient cells was detected by dSTORM than by flow cytometry. In addition, we could show that by dSTORM CD20-positive evaluated cells were eradicated by immunotherapeutic CAR T-cell treatment. These studies were followed by whole cell super-resolution imaging using both LLS-3D dSTORM and 10x ExM to exclude any artifacts caused by interactions with the glass surface. In 10x ExM signal amplification via biotinylated primary antibodies and streptavidin ATTO 643 was essential to detect even single antibodies directed against the heterodimer CD11a with standard confocal microscopes. Albeit probably not quantitative due to the process of gelation, digestion and expansion during the ExM protocol, even some putative dimers of the receptor CD2 could be visualized using 10x ExM-SIM, similar to dSTORM experiments. Within the second part of this thesis, expansion microscopy was established in bacterial and fungal pathogens. ExM enabled not only an isotropic fourfold expansion of Chlamydia trachomatis, but also allowed the discrimination between the two developmental forms by the chlamydial size after expansion into reticulate and elementary bodies. Hereafter, a new α-NH2-ω-N3-C6-ceramide was introduced enabling an efficient fixation and for the first time the use of lipids in both, 4x and 10x ExM, termed sphingolipid ExM. This compound was used to investigate the ceramide uptake and incorporation into the cell membrane of Chlamydia trachomatis and Simkania negevensis. For Chlamydia trachomatis the combined resolution power of 10x ExM and SIM even allowed the visualization of both bacterial membranes within a distance of ~30 nm. Finally, ExM was applied to the three different fungi Ustilago maydis, Fusarium oxysporum and Aspergillus fumigatus after enzymatic removal of the fungal cell wall. In case of Ustilago maydis sporidia this digestion could be applied to both, living cells resulting in protoplasts and to fixed cells, preserving the fungal morphology. This new protocol could be demonstrated for immunostainings and fluorescent proteins of the three different fungi.
N2  - Menschen neigen schon immer dazu, vor allem das zu glauben, was sie mit eigenen Augen sehen können, weswegen mikroskopische Methoden seit ihrer Erfindung im 17. Jahrhundert schon immer sehr beliebt waren. Mit der Einführung der hochauflösenden Mikroskopie konnte das Auflösungslimit von ~200 - 250 nm durchbrochen werden, was genauere Einblicke in biologische Proben ermöglichte. Insbesondere die Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie Methode dSTORM bietet hierbei die Möglichkeit der quantitativen Bildgebung. Sie nutzt das wiederholte Schalten organischer Farbstoffe in Anwesenheit von Thiolen, was eine Auflösung von bis zu 20 nm möglich macht. Eine weitere kürzlich entwickelte hochauflösende Mikroskopiemethode ist die Expansionsmikroskopie (ExM), in welcher die Probe isotrop vier- bis sogar zwanzigfach vergrößert wird, womit sich auch die Auflösung um diesen Faktor vergrößert. Um dies zu ermöglichen, wird die Probe in ein Hydrogel eingebettet, mittels einer unspezifischen Proteinase homogenisiert und in destilliertem Wasser expandiert. Innerhalb dieser Arbeit wurden beide Methoden genutzt, um sowohl die Verteilung von Plasmamembran Rezeptoren als auch unterschiedliche bakterielle und pilzliche Pathogene zu beleuchten Im ersten Teil dieser Arbeit wurde dSTORM genutzt, um das „Rezeptom“, die Gesamtheit aller Membranrezeptoren, sowohl von Jurkat T-Zellen als auch von primären Patientenzellen zu entschlüsseln. In dieser Arbeit konnten die Rezeptoren CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD11a, CD20, CD28, CD45, CD69 und CD105 erfolgreich visualisiert und quantifiziert werden, welche Dichten von 0,8 Cluster pro µm² im Falle von CD20 und 81,4 Cluster pro µm² für den stark exprimierten Rezeptor CD45 in aktivierten primären T-Zellen auf der basalen Membran aufwiesen. Hierbei konnten wir für einen Großteil der Rezeptoren eine homogene Verteilung nachweisen, wohingegen nur wenige andere Rezeptoren Cluster zeigten. Für CD3 konnten sowohl in Jurkat T-Zellen als auch in aktivierten primären Zellen Cluster detektiert werden, was auf deren Aktivierung hinweist, wohingegen CD3 in naiven Zellen homogen verteilt war. Im Weiteren wurde dSTORM im Rahmen von drei klinischen Fragestellungen angewandt, in welche die Rezeptoren CD38, BCMA und CD20 involviert waren, die in Immuntherapien mit monoklonalen Antikörpern oder auch CAR T-Zellen adressiert werden. In den beiden erstgenannten Projekten wurde dSTORM genutzt, um die Erhöhung der Rezeptoren-Expression nach Zugabe verschiedener Medikamente sowohl in der Zelllinie MM1.S als auch in primären Zellen von Patienten mit multiplen Myelomen zu bestimmen. Durch das CD20-Projekt hingegen wurde die überlegene Sensitivität von dSTORM gegenüber der Durchflusszytometrie unter Beweis gestellt. Hier konnte verglichen mit der Durchflusszytometrie eine deutlich höhere CD20-positive Fraktion in Patientenzellen detektiert werden, welche nach Behandlung mit CD20 CAR T-Zellen eliminiert wurde. Hierauf folgte hochauflösende Bildgebung ganzer Zellen sowohl mit LLS-3D dSTORM als auch 10x ExM, um Interaktionen mit der Glasoberfläche ausschließen zu können. Bei 10x ExM wurde eine Signalamplifikation mittels Biotin und Streptavidin ATTO 643 benötigt, wonach sogar einzelne Antikörper, welche gegen den Heterodimer CD11a gerichtet waren, an einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop detektiert werden konnten. Obwohl dies aufgrund der Prozesse von Gelierung, Verdau und Expansion während des ExM-Protokolls vermutlich nicht quantitativ ist, konnten sogar mutmaßliche Dimere des Rezeptors CD2 mit 10x ExM-SIM visualisiert werden, welche ähnlich in dSTORM Experimenten auftraten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Expansionsmikroskopie für bakterielle und pilzliche Pathogene eingesetzt. ExM ermöglichte nicht nur eine isotrope vierfache Expansion von Chlamydia trachomatis, sondern auch die Unterscheidung der beiden Entwicklungsformen, der Retikulär- und Elementarkörperchen, aufgrund der Größe der einzelnen Chlamydien. Anschließend wurde ein neues α-NH2-ω-N3-C6-Ceramid eingeführt, was eine effiziente Fixierung und zum ersten Mal die Nutzung von Lipiden in 4x und 10x ExM ermöglichte, was wir Sphingolipid ExM nannten. Diese Verbindung wurde genutzt, um die Ceramid-Aufnahme und den -Einbau in die Zellmembran von Chlamydia trachomatis und Simkania negevensis zu untersuchen. Im Falle von Chlamydia trachomatis wurde die hohe Auflösung von 10x ExM mit SIM kombiniert, was die Visualisierung beider bakterieller Membranen in einem Abstand von ~30 nm ermöglichte. Hiernach wurde ExM bei den drei unterschiedlichen Pilzen Ustilago maydis, Fusarium oxysporum und Aspergillus fumigatus nach enzymatischen Verdau der pilzlichen Zellwand angewandt. Im Falle von Ustilago maydis Sporidien konnte der Verdau sowohl an lebenden Zellen, was in Protoplasten resultierte, als auch an fixierten Zellen verwendet werden, was die Morphologie erhielt. Mittels dieses neuen Protokolls konnten sowohl Immunfärbungen als auch fluoreszierende Proteine der drei genannten Pilze expandiert werden.
KW  - Mikroskopie
KW  - Microscopy
KW  - Super-resolution microscopy
KW  - Hochauflösende Mikroskopie
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207165
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TY  - THES
A1  - Thelen, David
T1  - Erstellung eines genregulatorischen Netzwerkes zur Simulation der Entstehung von Zahnhartsubstanz
T1  - Construction of a gene regulatory network to simulate the formation of dental hard tissue
N2  - In this dissertation, the author describes the creation of a basic bioinformatic model of human enamel maturation. Supported by the interactions found in the KEGG Pathway database, we were able to establish a gene regulatory network (GRN) that focuses primarily on the signal transduction pathways apoptosis, cell cycle, hedgehog signaling pathway, MAP kinase pathway, mTOR signaling pathway, Notch signaling pathway, TGF-β signaling pathway and Wnt signaling pathway. We extended this through further verified interactions and implicated the tooth-specific genes AMELX, AMELY, AMBN, ENAM and DSPP.  In the subsequent simulation of the network by the simulation tool Jimena, six stable states could be identified. These are examined in more detail and juxtaposed with results of a GEO dataset. The long-term goal is to draw conclusions about the odontogenesis of humans through consistent optimization of the bioinformatics network.
N2  - In dieser Dissertation beschreibt der Autor die Erstellung eines grundlegenden bioinformatischen Modelles der menschlichen Zahnschmelzreifung. Mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank wurde ein genregulatorisches Netzwerk (GRN) erstellt, welches maßgeblich auf den Signaltransduktionswegen Apoptose, Zellzyklus, Hedgehog-Signalweg, MAP-Kinase-Weg, mTOR-Signalweg Notch-Signalweg Signalweg, TGF-β-Signalweg und Wnt-Signalweg basiert. Im Weiteren wurde dieses Netzwerk durch zahlreiche verifizierte Wechselwirkungen erweitert und die zahnspezifischen Gene AMELX, AMELY, AMBN, ENAM und DSPP implementiert. In der anschließenden Simulation des Netzwerks mit dem Simulations-Tool Jimena konnten sechs stabile Zustände identifiziert werden. Diese wurden genauer untersucht und den Erkenntnissen eines GEO-Datensatzes gegenübergestellt. Langfristiges Ziel ist es, durch konsequente Optimierung des bioinformatischen Netzwerks Rückschlüsse auf die Odontogenese des Menschen zu ziehen.
KW  - Universität Würzburg. Lehrstuhl für Bioinformatik
KW  - Boolesches Netz
KW  - Zahnentwicklung
KW  - Amelogenese
KW  - Genregulation
KW  - genregulatorisches Netzwerk
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204068
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TY  - THES
A1  - Zimmermann, Henriette
T1  - Antigenic variation and stumpy development in \(Trypanosoma\)  \(brucei\)
T1  - Antigene Variation und Stumpy Entwicklung in \(Trypanosoma\)  \(brucei\)
N2  - The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to persist within its mammalian host. Trypanosomes evade the hosts' immune system by antigenic variation of their surface coat, consisting of variant surface glycoproteins (VSGs). Out of a repertoire of thousands of VSG genes, only one is expressed at any given time from one of the 15 telomeric expression sites (ES). The VSG is stochastically exchanged either by a transcriptional switch of the active ES (in situ switch) or by a recombinational exchange of the VSG within the active ES. However, for infections to persist, the parasite burden has to be limited. The slender (sl) bloodstream form secretes the stumpy induction factor (SIF), which accumulates with rising parasitemia. SIF induces the irreversible developmental transition from the proliferative sl to the cell cycle-arrested but fly-infective stumpy (st) stage once a concentration threshold is reached. Thus, antigenic variation and st development ensure persistent infections and transmissibility. A previous study in monomorphic cells indicated that the attenuation of the active ES could be relevant for the development of trypanosomes. The present thesis investigated this hypothesis using the inducible overexpression of an ectopic VSG in pleomorphic trypanosomes, which possess full developmental competence. These studies revealed a surprising phenotypic plasticity: while the endogenous VSG was always down-regulated upon induction, the ESactivity determined whether the VSG overexpressors arrested in growth or kept proliferating. Full ES-attenuation induced the differentiation of bona fide st parasites independent of the cell density and thus represents the sole natural SIF-independent differentiation trigger to date. A milder decrease of the ES-activity did not induce phenotypic changes, but appeared to prime the parasites for SIF-induced differentiation. These results demonstrate that antigenic variation and development are linked and indicated that the ES and the VSG are independently regulated. Therefore, I investigated in the second part of my thesis how ES-attenuation and VSG-silencing can be mediated. Integration of reporters with a functional or defective VSG 3'UTR into different genomic loci showed that the maintenance of the active state of the ES depends on a conserved motif within the VSG 3'UTR. In situ switching was only triggered when the telomere-proximal motif was partially deleted, suggesting that it serves as a DNA-binding motif for a telomere-associated protein. The VSG levels seem to be additionally regulated in trans based on the VSG 3'UTR independent of the genomic context, which was reinforced by the regulation of a constitutively expressed reporter with VSG 3' UTR upon ectopic VSG overexpression.
N2  - Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt, um in seinem Säugetierwirt zu überleben. Die Grundlage der Immunevasion ist die antigene Variation des Oberflächenmantels, der aus dem variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) besteht. Von mehreren tausend VSG-Genen wird zu jedem Zeitpunkt nur ein einziges aus einer der 15 telomerischen Expressionsstellen (ES) exprimiert. Das VSG kann entweder durch einen transkriptionellen Wechsel der aktiven ES (in situ Wechsel) oder durch einen rekombinatorischen Wechsel des VSG-Gens innerhalb der aktiven ES stochastisch ausgetauscht werden. Damit jedoch eine langanhaltende Infektion des Wirts möglich wird, muss gleichzeitig der Parasitenbefall begrenzt werden. Mit ansteigender Parasitämie akkumuliert der 'stumpy induction factor' (SIF), welcher von der 'slender' (sl) Blutstromform sekretiert wird. Sobald ein Schwellenwert in der SIF-Konzentration erreicht ist, wird die irreversible Differenzierung der proliferativen sl in die zellzyklusarretierte 'stumpy'(st) Form eingeleitet, welche infektiös für den Fliegenvektor ist. Somit stellen antigene Variation und st- Differenzierung das Persistieren der Infektion und die Übertragung des Parasiten sicher. Eine frühere Arbeit mit monomorphen Zellen deutete darauf hin, dass die Attenuierung der aktiven ES eine Rolle für die Differenzierung der Trypanosomen spielen könnte. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Dissertation untersucht, indem in pleomorphen Zellen mit vollständiger Entwicklungskompetenz ein ektopisches VSG induzierbar überexprimiert wurde. Diese Studien offenbarten eine erstaunliche phänotypische Plastizität: während das endogene VSG nach Induktion runter reguliert wurde, arretierten die VSG-Überexpressoren in Abhängigkeit von der ES-Aktivität entweder im Wachstum oder teilten sich weiter. Die vollständige ES-Attenuierung löste die Differenzierung zu echten st Zellen unabhängig von der Zelldichte aus und ist somit der bisher einzige natürliche SIF-unabhängige Differenzierungsauslöser. Eine mildere Abnahme der ES-Aktivität verursachte keinen Phänotyp, scheint aber die Zellen auf die SIF-induzierte Differenzierung vorzubereiten. Diese Ergebnisse zeigen, dass antigene Variation und Differenzierung verbunden sind und deuteten an, dass die ES und das VSG unabhängig voneinander reguliert werden. Daher habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation untersucht, wie ES-Attenuierung und VSG-Stilllegung vermittelt werden können. Die Integration eines Reporters mit funktioneller oder defekter VSG 3'UTR an verschiedenen Orten im Genom zeigte, dass die Aufrechterhaltung der ES-Aktivität von einem konservierten Motiv in der VSG 3'UTR abhängig ist. Ein in situ Wechsel wurde nur ausgelöst, wenn Teile des Telomer-proximalen Motiv deletiert wurden, was nahelegt, dass das Motiv auf DNA-Ebene von einem Telomerbindeprotein erkannt wird. Die VSG-Level scheinen unabhängig vom genomischen Kontext zusätzlich in trans basierend auf der VSG 3'UTR reguliert zu werden, was durch die Regulation eines konstitutiv exprimierten Reporters mit VSG 3'UTR nach VSG-Überexpression bekräftigt wurde.
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Genexpression
KW  - Entwicklung
KW  - Parasit
KW  - VSG
KW  - antigenic variation
KW  - monoallelic expression
KW  - stumpy development
KW  - differentiation
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146902
ER  - 
TY  - THES
A1  - Michel, Konstanze
T1  - Die kardiale Bedeutung des Hormons C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) und dessen Guanylylcyclase B (GC-B) Rezeptor
T1  - The cardiac role of the C-type natriuretic peptide (CNP) and its guanylyl cyclase B (GC-B) receptor
N2  - In der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden die kardialen Effekte des C-Typ natriuretischen Peptids (CNP) an wildtypischen Mäusen (Studie 1) und an einem neuen genetischen Mausmodell, mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des Guanylyl-Cyclase B (GC-B) Rezeptors (Studie 2) untersucht.
In Studie 1 wurden die Wirkungen von exogenem, synthetischem CNP auf eine durch Druckbelastung-induzierte Herzinsuffizienz in wildtypischen Mäusen (C57Bl6 Hintergrund) untersucht. Dafür wurde CNP parallel zu einer operativen transversen Aortenkonstriktion (TAC) über osmotische Minipumpen in einer Dosierung von 50 ng/kg/min über 14 Tage appliziert. Die 14 Tage TAC führten zu einer ausgeprägten Linksherzhypertrophie. Diese wurde durch exogenes CNP auf zellulärer (verringerte Kardiomyozytenflächen) und molekularer (verringerte BNP mRNA Expression) Ebene signifikant gehemmt. Auch die durch TAC-induzierte linksventrikuläre Dilatation wurde durch exogenes CNP fast vollständig verhindert. Diese kardialen protektiven Effekte von CNP traten ohne eine wesentliche Veränderung des arteriellen Blutdrucks auf. Mögliche mechanistische Ursachen für die schützende Wirkung von CNP könnte die PKG-abhängige Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin sein. Eine gesteigerte Phosphorylierung von Titin an der elastischen N2B-Domäne verringert die Steifigkeit der Kardiomyozyten und verbessert somit deren Relaxationsfähigkeit (Hudson 2011). Die erhöhten linksventrikulären Volumina nach TAC (end-diastolische und end-systolische Volumina) wurden möglicherweise durch eine erhöhte Steifigkeit der Kardiomyozyten provoziert. Dies könnte durch den akuten IL-6 mRNA Anstieg nach TAC begünstigt werden, da Kruger et al. einen Zusammenhang zwischen passiver Steifigkeit der Kardiomyozyten und IL-6-Expression postulierten (Kotter 2016, Kruger 2009). Diese Veränderungen wurden durch exogenes CNP verhindert. Es ist wahrscheinlich, dass die CNP-induzierte Phosphorylierung von Titin an Serin 4080 in die Relaxationsfähigkeit der Kardiomyozyten und somit die diastolische Funktion des linken Ventrikels verbesserte.

Aufgrund dieser Beobachtungen wurde in Studie 2 untersucht, ob auch endogenes CNP als parakrines Hormon im Herzen eine TAC-induzierte Herzhypertrophie und die kontraktile Funktion von Kardiomyozyten bei einer hypertensiven Herzerkrankung beeinflussen kann. Dafür wurde ein neues genetisches Mausmodell mit einer Kardiomyozyten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors generiert (CM GC-B KO). Da vorangegangene Studien in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die basale CNP-Expression im Herzen sehr gering ist, nach 3-tägiger TAC aber akut ansteigt und nach 14-tägiger TAC wieder abfällt, haben wir CM GC-B KO Mäuse und deren Geschwister-Kontrolltiere an beiden Zeitpunkten nach TAC untersucht. Die TAC führte Genotyp-unabhängig zu einem Anstieg der kardialen Nachlast nach 3 Tagen und weiter nach 14 Tagen. Diese Druckbelastung provozierte eine progressive, signifikante Linksherzhypertrophie.
Allerdings reagierten die CM GC-B KO Mäuse im Vergleich zu den Kontrolltieren bereits nach 3-tägiger TAC mit einer ausgeprägten Kardiomyozyten-Hypertrophie. Zudem beobachteten wir nach 3-tägiger TAC in den Knockout-Mäusen eine Abnahme der Ejektionsfraktion und gleichzeitig eine signifikante Zunahme der beiden linksventrikulären Volumina (end-diastolische und end-systolische Volumen). Diese frühe linksventrikuläre Dilatation wurde in den Kontrolltieren nicht beobachtet. Daraus schlussfolgerten wir, dass endogenes kardiales CNP, dessen Expression zu frühen Zeitpunkten nach Druckbelastung ansteigt, das Herz vor kontraktiler Dysfunktion und Dilatation schützen kann. Um mögliche Mechanismen für die protektive Wirkung von endogenem CNP zu erklären, untersuchten wir die IL-6 mRNA Expression sowie die Titin-Phosphorylierung im Herzen. Der akute Anstieg der IL-6 mRNA Expression nach 3-tägiger TAC in den CM GC-B KO Mäusen korreliert mit der verminderten Phosphorylierung von Titin an der PGK-spezifischen Phosphorylierungsstelle (Serin 4080). Somit könnte der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg zu einer Inhibition pro-inflammatorischer Gene beitragen, da der akute IL-6 mRNA Anstieg in den Kontrollen nicht beobachtet wurde. Auch die gesteigerte NOX4 Expression 3 Tage nach TAC, könnte zu der frühen dilatativen Kardiomyopathie in den Knockout-Mäusen beigetragen haben. Die verringerte STAT3 Aktivierung in den CM GC-B KO Mäusen würde laut Literatur zu vermehrter Apoptose führen, indem pro-apoptotische Gene wie Bcl oder Bax vermehrt transkribiert werden. Auch die erhöhte Cxcl-1 mRNA Expression in den Knockout-Mäusen deutet zusammen mit dem IL-6 Anstieg auf vermehrte Entzündungsreaktionen 3 Tage nach TAC hin. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit darauf hin, dass der CNP/GC-B/cGMP-Signalweg in frühen Stadien einer erhöhten kardialen Druckbelastung und der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie entgegenwirken kann. Die Phosphorylierung des sarkomerischen Proteins Titin und die Hemmung der Expression pro-inflammatorischer Zytokine (speziell IL-6) könnten zu diesem protektiven Effekt beitragen.
N2  - Here we investigated cardiac effects of c-type natriuretic peptide (CNP) in wildtype mice (study 1) and in a newly generated mouse model with cardiomyocyte-specific deletion of the guanylyl cyclase B (GC-B) receptor (study 2).
In study 1 the effects of exogenous, synthetic CNP were investigated in wildtype mice (C57Bl6 background) after heart failure induced by pressure overload. Therefore, additionally to transverse aortic constriction (TAC) CNP (50 ng/kg/min) was administered via osmotic minipumps for 14 days. TAC provoked progressive heart hypertrophy. The TAC-induced hypertrophy was accompanied by enlarged cardiomyocyte areas and increased left ventricular mRNA levels of BNP. CNP significantly reduced cardiomyocyte areas and mRNA levels of BNP. Also, the TAC-induced left ventricular dilatation was almost prevented through synthetic CNP. These cardiac protective effects of CNP were accompanied by increased phosphorylation of the sarcomeric protein titin. Titin plays a critical role in maintaining the sarcomere structure and elasticity and thereby influences myocyte contraction and especially relaxation. The left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were significantly increased after TAC.
The increased left-ventricular (end-diastolic and end-systolic) volumes after TAC are maybe provoked by an increased cardiomyocyte stiffness. The acute rise in IL-6 mRNA levels after TAC may favour these change, since Kruger et al postulate a relationship between passive cardiomyocyte stiffness and IL-6 expression. These changes were prevented by exogeneous CNP. Presumably, the CNP induced phosphorylation of titin on Serin 4080 within its elastic domain improves the cardiomyocyte relaxation and therefore the left-ventricular diastolic function.
Because of these observations, we investigated in study 2, whether endogenous CNP as a paracrine hormone can affect TAC-induced hypertrophy and contractile function of cardiomyocytes. Therefore, we generated a new genetic mouse model with a cardiomyocyte specific deletion of the GC-B receptor (CM GC-B KO). Since previous studies in our group demonstrated that cardiac baseline expression levels of CNP are very low, but they markedly increased 3 days after TAC and decline to baseline levels 14 days after TAC, CM GC-B KO mice and control littermates were investigated at both timepoints after TAC.

TAC resulted in increased cardiac afterload after 3 days, and more after 2 weeks, which was similar in both genotypes. Pressure overload provoked a progressive and significant cardiac hypertrophy, shown by the increased heart weight/body weight ratios, and were confirmed by histology. More severe myocyte hypertrophy was shown 3 days after TAC in CM GC-B KO mice, compared with control mice. Left ventricular contractile functions were also investigated by invasive catheterization in anesthetized mice. Notably, while in control mice subjected to TAC the LV ejection fraction was only mildly decreased, the KO mice reacted with a very marked and early decrease of the ejection fraction at three days after TAC, which tend to improve later on. Even more, the left ventricular end-diastolic and end-systolic volumes were markedly increased in the KO mice 3 days after TAC, indicating left ventricular dilatation. Again, this acute dilatation seems to reverse or improve at later stages. Such changes were not observed in control mice. To clarify possible downstream signalling pathways mediating these protective effects of CNP, we investigated titin-phosphorylation and IL-6 expression after 3 days of TAC. The acute increased IL-6 mRNA expression correlates well with the diminished phosphorylation of titin (serin 4080) in CM GC-B KO mice. Also, the increased NOX4 expression 3 days after TAC, could be one of the reasons of the early dilatation in KO mice. The diminished phosphorylation of STAT3 in CM GC-B KO mice may induce apoptosis by transcription of Bcl or Bax genes. Also, the increased mRNA expression of Cxcl-1 and IL-6 after 3 days of TAC can lead to more inflammation the hearts of the KO mice. In summary, these results show, that the CNP/GC-B/cGMP pathway can prevent cardiac dilatation in early stages. The phosphorylation of titin and the inhibition of the pro-inflammatory cytokines can contribute to this protective effects of CNP in the heart.
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Peptide
KW  - Kardiomyopathie
KW  - C-Typ natriuretisches Peptid
KW  - Guanylylcyclase B Rezeptor
KW  - kardiale Hypertrophie
KW  - c-type natriuretic peptide
KW  - guanylyl cyclase B receptor
KW  - cardiac hypertrophy
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200211
ER  - 
TY  - THES
A1  - Klepsch, Maximilian Andreas
T1  - Small RNA-binding complexes in Chlamydia trachomatis identified by Next-Generation Sequencing techniques
T1  - Identifizierung von kleinen RNA-bindenden Komplexen in Chlamydia trachomatis mittels Hochdurchsatz- Sequenziertechniken
N2  - Chlamydia infect millions worldwide and cause infertility and blinding trachoma. Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) is an obligate intracellular gram-negative pathogen with a significantly reduced genome. This bacterium shares a unique biphasic lifecycle in which it alternates between the infectious, metabolically inert elementary bodies (EB) and the non-infections, metabolically active replicative reticular bodies (RB).
One of the challenges of working with Chlamydia is its difficult genetic accessibility. In the present work, the high-throughput method TagRNA-seq was used to differentially label transcriptional start sites (TSS) and processing sites (PSS) to gain new insights into the transcriptional landscape of C. trachomatis in a coverage that has never been achieved before. Altogether, 679 TSSs and 1067 PSSs were detected indicating its high transcriptional activity and the need for transcriptional regulation. Furthermore, the analysis of the data revealed potentially new non-coding ribonucleic acids (ncRNA) and a map of transcriptional processing events. Using the upstream sequences, the previously identified σ66 binding motif was detected.
In addition, Grad-seq for C. trachomatis was established to obtain a global interactome of the RNAs and proteins of this intracellular organism. The Grad-Seq data suggest that many of the newly annotated RNAs from the TagRNA-seq approach are present in complexes. Although Chlamydia lack the known RNA-binding proteins (RBPs), e.g. Hfq and ProQ, observations in this work reveal the presence of a previously unknown RBP. 
Interestingly, in the gradient analysis it was found that the σ66 factor forms a complex with the RNA polymerase (RNAP). On the other hand, the σ28 factor is unbound. This is in line with results from previous studies showing that most of the genes are under control of σ66. The ncRNA IhtA is known to function via direct base pairing to its target RNA of HctB, and by doing so is influencing the chromatin condensation in Chlamydia. This study confirmed that lhtA is in no complex. On the other hand, the ncRNA ctrR0332 was found to interact with the SNF2 protein ctl0077, a putative helicase. Both molecules co-sedimented in the gradient and were intact after an aptamer-based RNA pull-down. The SWI2/SNF2 class of proteins are nucleosome remodeling complexes. The prokaryotic RapA from E. coli functions as transcription regulator by stimulating the RNAP recycling. This view might imply that the small ncRNA (sRNA) ctrR0332 is part of the global regulation network in C. trachomatis controlling the transition between EBs and RBs via interaction with the SNF2 protein ctl0077.
The present work is the first study describing a global interactome of RNAs and proteins in C. trachomatis providing the basis for future interaction studies in the field of this pathogen.
N2  - Chlamydien verursachen jährlich Millionen Neuinfektionen weltweit und können zu Spätschäden wie Unfruchtbarkeit und Erblindung führen. Chlamydien sind obligat intrazelluläre, gram-negative Pathogene mit einem stark reduzierten Genom. Sie besitzen einen einzigartigen biphasischen Lebenszyklus, bei dem der Erreger zwischen den metabolisch inaktiven, infektiösen Elementarkörperchen (EBs) und den nicht infektiösen, metabolisch aktiven und replikativen Retikularkörperchen (RBs) alterniert.
Eine Problemantik beim Arbeiten mit Chlamydien ist die Schwierigkeit der gezielten genetischen Manipulation des Pathogens. 
In der vorliegenden Arbeit wurde die Hochdurchsatz-Sequenziermethode TagRNA-Seq genutzt, um die transkriptionelle Organisation von Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) zu analysieren und besser zu verstehen. Transkriptionelle Start Stellen (TSS) und Prozessierungsstellen (PSS) werden dabei unterschiedlich markiert, sodass eine zuverlässigere und genauere Auflösung erreicht wird als bisher durch in anderen Studien verwendete Methoden. Insgesamt konnten so 679 TSSs und 1067 PSSs detektiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Transkriptom von C. trachomatis weitaus aktiver ist als bisher angenommen und eine Regulation auf transkriptioneller Ebene bedarf. Die Methode erlaubte zudem die Identifizierung von potenziell neuen nicht-kodierende RNAs sowie die Kartierung von transkriptionellen Prozessierungsereignissen. Unter Verwendung der 5’-upstreamliegenden Sequenzen konnte außerdem das in anderen Bakterien bereits bekannte σ66-Bindemotiv detektiert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde zudem die Methode Grad-Seq in C. trachomatis etabliert, um ein globales Interaktom für RNAs (engl. ribonucleic acid) und Proteine des intrazellulären Organismus zu erstellen. 
Für viele der im TagRNA-Seq Ansatz identifizierten und neu annotierten RNAs konnte so eine Komplexbildung beobachtet werden. Dies deutet auf das Vorhandensein eines bislang unbekanntes RNA-Bindeprotein (RBP) hin, da Chlamydien keines der bekannten RBPs, z.B. Hfq oder ProQ, besitzen.
Die Gradienten-Analyse ergab, dass der σ66-Faktor in einem Komplex mit der RNA-Polymerase (RNAP) vorliegt und dass der σ28-Faktor ungebunden ist. Diese Beobachtung entspricht den Ergebnissen vorheriger Studien, die zeigten das die meisten Gene durch σ66 kontrolliert werden. Die Daten bestätigen außerdem, dass IhtA, eine ncRNA (engl. non-coding ribonucleic acid), die über direkte Basenpaarbindung mit ihrem Ziel-RNA von hctB interagiert, nicht in einem Komplex vorliegt. Für die ncRNA ctrR0332 hingegen konnte das SNF2-Protein ctl0077 als Interaktionspartner identifiziert werden. Beide Moleküle co-sedimentieren im Gradienten und konnten mittels eines Aptamer-basierenden RNA Pull-Downs in intakter Form isoliert werden. Die Klasse der SWI2/SNF2-Proteine gehört zu den Nukleosomen-Remodeling-Komplexen. In Prokaryoten konnte für das in E. coli vorkommende RapA, welches ebenfalls zu den SWI2/SNF2-Proteinen zählt, die Funktion eines Transkriptionsregulators nachgewiesen werden, indem die RNAP-Wiederverwertung stimuliert wird. Dies könnte bedeuten, dass die ncRNA ctrR0332 ebenfalls Teil eines globalen Regulationsnetzwerks ist, welches durch Interaktion mit dem SNF2-Protein ctl0077 die Transition zwischen dem RB- und EB-Stadium reguliert. 
In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals ein globales Interaktom von RNAs und Proteinen in C. trachomatis erstellt werden, welches als Grundlage für zukünftige Interaktionsstudien des Pathogens genutzt werden kann.
KW  - High throughput screening
KW  - Small RNA
KW  - Chlamydia trachomatis
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199741
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hartlieb, Heiko
T1  - Functional analysis of Mushroom body miniature’s RGG-box and its role in neuroblast proliferation in Drosophila melanogaster
T1  - Funktionelle Analyse der RGG-Box von Mushroom body miniature und deren Rolle in der Neuroblastenproliferation in Drosophila melanogaster
N2  - Development of the central nervous system in Drosophila melanogaster relies on neural stem cells called neuroblasts. Neuroblasts divide asymmetrically to give rise to a new neuroblast as well as a small daughter cell which eventually generates neurons or glia cells. Between each division, neuroblasts have to re-grow to be able to divide again. In previous studies, it was shown that neuroblast proliferation, cell size and the number of progeny cells is negatively affected in larvae carrying a P-element induced disruption of the gene mushroom body miniature (mbm). This mbm null mutation called mbmSH1819 is homozygously lethal during pupation. It was furthermore shown that the nucleolar protein Mbm plays a role in the processing of ribosomal RNA (rRNA) as well as the translocation of ribosomal protein S6 (RpS6) in neuroblasts and that it is a transcriptional target of Myc. Therefore, it was suggested that Mbm might regulate neuroblast proliferation through a role in ribosome biogenesis.
In the present study, it was attempted to further elucidate these proposed roles of Mbm and to identify the protein domains that are important for those functions. Mbm contains an arginine/glycine rich region in which a di-RG as well as a di-RGG motif could be found. Together, these two motifs were defined as Mbm’s RGG-box. RGG-boxes can be found in many proteins of different families and they can either promote or inhibit protein-RNA as well as protein-protein interactions. Therefore, Mbm’s RGG-box is a likely candidate for a domain involved in rRNA binding and RpS6 translocation. It could be shown by deletion of the RGG-box, that MbmdRGG is unable to fully rescue survivability and neuroblast cell size defects of the null mutation mbmSH1819. Furthermore, Mbm does indeed rely on its RGG-box for the binding of rRNA in vitro and in mbmdRGG as well as mbmSH1819 mutants RpS6 is partially delocalized. Mbm itself also seems to depend on the RGG-box for correct localization since MbmdRGG is partially delocalized to the nucleus. Interestingly, protein synthesis rates are increased in mbmdRGG mutants, possibly induced by an increase in TOR expression. Therefore, Mbm might possess a promoting function in TOR signaling in certain conditions, which is regulated by its RGG-box. Moreover, RGG-boxes often rely on methylation by protein arginine methyltransferases (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) to fulfill their functions. Mbm might be symmetrically dimethylated within its RGG-box, but the results are very equivocal. In any case, Dart1 and Dart5 do not seem to be capable of Mbm methylation.
Additionally, Mbm contains two C2HC type zinc-finger motifs, which could be involved in rRNA binding. In an earlier study, it was shown that the mutation of the zinc-fingers, mbmZnF, does not lead to changes in neuroblast cell size, but that MbmZnF is delocalized to the cytoplasm. In the present study, mbmZnF mutants were included in most experiments. The results, however, are puzzling since mbmZnF mutant larvae exhibit an even lower viability than the mbm null mutants and MbmZnF shows stronger binding to rRNA than wild-type Mbm. This suggests an unspecific interaction of MbmZnF with either another protein, DNA or RNA, possibly leading to a dominant negative effect by disturbing other interaction partners. Therefore, it is difficult to draw conclusions about the zinc-fingers’ functions.
In summary, this study provides further evidence that Mbm is involved in neuroblast proliferation as well as the regulation of ribosome biogenesis and that Mbm relies on its RGG-box to fulfill its functions.
N2  - Die Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster beruht auf neuronalen Stammzellen genannt Neuroblasten. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und bringen dabei sowohl einen neuen Neuroblasten als auch eine kleinere Tochterzelle hervor, die wiederum letztlich Neuronen oder Gliazellen generiert. Zwischen jeder Zellteilung müssen die Neuroblasten wieder auf ihre ursprüngliche Größe wachsen, sodass sie zur erneuten Teilung in der Lage sind. In vorhergehenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl die Proliferation der Neuroblasten, deren Zellgröße als auch die Anzahl ihrer Tocherzellen reduziert ist in Larven, die eine P-Element-induzierte Unterbrechung des Gens mushroom body miniature (mbm) tragen. Diese mbm-Nullmutation, genannt mbmSH1819, ist homozygot letal während des Puppenstadiums. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das nucleoläre Protein Mbm eine Rolle in der Prozessierung ribosomaler RNA (rRNA), sowie der Translokation des ribosomalen Proteins S6 (RpS6) in Neuroblasten erfüllt und dass seine Transkription durch Myc reguliert wird. Daher wurde geschlussfolgert, dass Mbm die Proliferation von Neuroblasten durch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese regulieren könnte.
In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, weitere Hinweise auf diese möglichen Funktionen von Mbm zu finden und die Proteindomänen zu identifizieren, die dafür benötigt werden. Mbm beinhaltet einen Arginin/Glycin-reichen Abschnitt, der ein di-RG sowie ein di-RGG Motiv enthält. Diese beiden Motive wurden zusammen zu Mbms RGG-Box definiert. RGG-Boxen finden sich in vielen Proteinen verschiedener Familien und sie können sich sowohl verstärkend als auch inhibierend auf Protein-RNA- sowie Protein-Protein-Interaktionen auswirken. Somit stellt Mbms RGG-Box einen vielversprechenden Kandidaten dar für eine Proteindomäne, die in die rRNA-Bindung sowie die Translokation von RpS6 involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mbm mit deletierter RGG-Box (MbmdRGG) nicht in der Lage ist, die Überlebensfähigkeit und die Neuroblastengröße der Nullmutation mbmSH1819 vollständig zu retten. Des Weiteren benötigt Mbm die RGG-Box, um rRNA in vitro zu binden und in mbmdRGG sowie mbmSH1819 Mutanten konnte eine partielle Delokalisation von RpS6 beobachtet werden. Die korrekte Lokalisation von Mbm selbst scheint auch von der RGG-Box abzuhängen, da MbmdRGG teilweise in den Nukleus delokalisiert ist. Interessanterweise ist außerdem die Proteinsyntheserate in mbmdRGG Mutanten erhöht, was möglicherweise in einer Erhöhung der TOR-Expression begründet ist. Somit könnte Mbm unter bestimmten Bedingungen eine verstärkende Funktion im TOR-Signalweg erfüllen, die durch seine eigene RGG-Box reguliert wird. Des Weiteren sind RGG-Boxen hinsichtlich ihrer Funktion häufig von der Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) abhängig. Mbm könnte innerhalb seiner RGG-Box symmetrisch dimethyliert sein, allerdings sind die Ergebnisse in dieser Hinsicht sehr zweifelhaft. Jedenfalls scheinen Dart1 und Dart5 nicht imstande zu sein, Mbm zu methylieren.
Außerdem beinhaltet Mbm zwei Zink-Finger-Motive des C2HC-Typs, die in die Bindung von rRNA involviert sein könnten. Eine vorhergehende Studie konnte zeigen, dass die Mutation der Zink-Finger, mbmZnF, zwar nicht zu einer Veränderung der Neuroblastengröße führt, allerdings, dass MbmZnF ins Zytoplasma delokalisiert vorliegt. In der vorliegenden Studie wurden die mbmZnF Mutanten in die meisten Experimente mit einbezogen. Allerdings sind die Ergebnisse rätselhaft, da mbmZnF-mutierte Larven sogar eine geringere Überlebensrate zeigen als die mbm Nullmutanten und da MbmZnF eine stärkere Bindungsaffinität zu rRNA zeigt als wildtypisches Mbm. Dies weist auf eine unspezifische Interaktion zwischen MbmZnF und einem anderen Protein, RNA oder DNA hin, was einen dominant-negativen Effekt auslösen könnte, indem andere Interaktionspartner gestört werden. Somit gestaltet es sich schwierig, Schlussfolgerungen zur Funktion der Zink-Finger zu ziehen.
Zusammengefasst liefert die vorliegende Studie weitere Anhaltspunkte, dass Mbm in der Neuroblastenproliferation sowie der Regulation der Ribosomenbiogenese involviert ist und dass Mbm seine RGG-Box benötigt, um seine Funktionen zu erfüllen.
KW  - Taufliege
KW  - Neuroblast
KW  - Gehirn
KW  - Entwicklung
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - brain development
KW  - neuroblast proliferation
KW  - mushroom body miniature
KW  - Gehirnentwicklung
KW  - Neuroblastenproliferation
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199674
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kurz, Andreas
T1  - Correlative live and fixed cell superresolution microscopy
T1  - Korrelative hochauflösende Mikroskopie an lebenden und fixierten Zellen
N2  - Over the last decade life sciences have made an enormous leap forward. The development of complex analytical instruments, in particular in fluorescence microscopy, has played a decisive role in this. Scientist can now rely on a wide range of imaging techniques that offer different advantages in terms of optical resolution, recording speed or living cell compatibility. With the help of these modern microscopy techniques, multi-protein complexes can be resolved, membrane receptors can be counted, cellular pathways analysed or the internalisation of receptors can be tracked. However, there is currently no universal technique for comprehensive experiment execution that includes dynamic process capture and super resolution imaging on the same target object. In this work, I built a microscope that combines two complementary imaging techniques and enables correlative experiments in living and fixed cells. With an image scanning based laser spot confocal microscope, fast dynamics in several colors with low photodamage of the cells can be recorded. This novel system also has an improved resolution of 170 nm and was thoroughly characterized in this work. The complementary technique is based on single molecule localization microscopy, which can achieve a structural resolution down to 20-30 nm. Furthermore I implemented a microfluidic pump that allows direct interaction with the sample placed on the microscope. Numerous processes such as living cell staining, living cell fixation, immunostaining and buffer exchange can be observed and performed directly on the same cell. Thus, dynamic processes of a cell can be frozen and the structures of interest can be stained and analysed with high-resolution microscopy. Furthermore, I have equipped the detection path of the single molecule technique with an adaptive optical element. With the help of a deformable mirror, imaging functions can be shaped and information on the 3D position of the individual molecules can be extracted.
N2  - Im letzten Jahrzehnt hat der Bereich der Lebenswissenschaften einen enormen Sprung nach vorne gemacht. Maßgeblich dafür waren die Entwicklung von komplexen Analysegeräten insbesondere in der Fluoreszenz Mikroskopie. Die Anwender können nun auf eine Vielzahl von Bildgebungstechniken zurückgreifen die unterschiedliche Vorzüge hinsichtlich optischer Auflösung, Aufnahmegeschwindigkeit oder Lebend Zell Kompatibilität bieten. Mithilfe dieser modernen Mikroskopietechniken lassen sich beispielsweise Multiproteinkomplexe auflösen, Membranrezeptoren zählen, zelluläre Signalwege analysieren oder die Internalisierung von Rezeptoren verfolgen. Für eine umfassende Experimentdurchführung, die Erfassung dynamischer Prozesse sowie superhochauflösende Bildgebung an ein und demselben Zielobjekt beinhalten, gibt es derzeit keine einheitliche Technik. In dieser Arbeit habe ich ein Mikroskop aufgebaut, das zwei komplementäre Bildgebungstechniken vereint und korrelative Experimente von lebend zu fixierten Zellen ermöglicht. Mit einem Image Scanning basierten Konfokal Mikroskop können schnelle Dynamiken in mehreren Farben mit geringer Photoschädigung der Zellen aufgenommen werden. Dieses neuartige System weist zudem eine Auflösungsverbesserung von 170 nm auf und wurde im Rahmen der Arbeit ausführlich charakterisiert. Die komplementäre Technik basiert auf der Einzel-Molekül Lokalisations Mikroskopie, mit der sich eine strukturelle Auflösung von bis zu 20 nm erreichen lässt. Desweiteren habe ich eine Mikrofluidpumpe implementiert, die eine direkte Interaktion mit der auf dem Mikroskop platzierten Probe erlaubt. Zahlreiche Prozesse wie Lebend-Zell Färbung, Lebend-Zell Fixierung, Immuno-Färbung und Puffertausch können damit direkt an der gleichen Zelle beobachtet und durchgeführt werden. So können dynamische Prozesse einer Zelle sozusagen eingefroren werden und die Strukturen von Interesse gefärbt und mit höchstauflösender Mikroskopie analysiert werden. Desweiteren habe ich den Detektionspfad der Einzel-Molekül Technik mit einem adaptiven optischen Element ausgestattet. Mithilfe eines deformierbaren Spiegels lässt sich so Abbildungsfunktion formen und Information zur 3D Position der einzelnen Moleküle gewinnen.
KW  - Einzelmolekülmikroskopie
KW  - Adaptive Optik
KW  - Image-Scanning Microscope
KW  - Correlative microscopy
KW  - Adaptive Optics
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199455
ER  - 
TY  - THES
A1  - Beliu, Gerti
T1  - Bioorthogonale Tetrazin-Farbstoffe für die Lebendzell-Markierung und hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie
T1  - Bioorthogonal tetrazine-dyes for live-cell labeling and super-resolution fluorescence microscopy
N2  - Der genetische Code beschreibt die Ver- und Entschlüsselung der Erb-information für das universelle Prinzip der Proteinbiosynthese aus einzelnen Aminosäuren. Durch Erweiterung des genetischen Codes lassen sich unna-türliche Aminosäuren (uAA) mit einzigartigen biophysikalischen Eigenschaf-ten ortsspezifisch in Proteine einführen und ermöglichen die spezifische Ma-nipulation von Proteinen. 
Die Click-Reaktion zwischen der unnatürlichen Aminosäure TCO*-Lysin und Tetrazin besitzt eine außergewöhnliche Reaktionskinetik (≥800 M-1s-1) und ermöglicht eine spezifische und bioorthogonale Markierung von Bio-
¬molekülen unter physiologischen Bedingungen. 
Im Fokus dieser Arbeit stand zunächst die Markierung von Membran-
¬rezeptoren durch Click-Chemie in lebenden Zellen sowie die Untersuchung der Wechselwirkung 22 bekannter und neuartiger Tetrazin-Farbstoff-
Konjugate. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit von bioorthogonalen Click-Reaktionen für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch Erweiterung des genetischen Codes in Proteine aus der Klasse der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluR), TNF-Rezeptoren oder Mikrotubu-li-assoziierten Proteinen (MAP) wurde ortspezifisch die unnatürliche Amino-säure TCO*-Lysin eingeführt und dadurch die Fluoreszenzmarkierung durch Tetrazin-Farbstoffe ermöglicht. Die direkte chemische Kopplung von TCO an Liganden wie Phalloidin und Docetaxel, welche spezifisch das Aktin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli-Filamente binden können, ermöglichte zudem die Click-Färbungen von fixierten und lebenden Zellen ohne genetische Ver-änderungen der Zielproteine. 	
Des Weiteren wurden die spektroskopischen Eigenschaften von 22 Tetrazin-Farbstoffen, verteilt über den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich, untersucht. Ein charakteristisches Kennzeichen der Click-Reaktion mit Tet-razin-Farbstoffen ist dabei ihre Fluorogenität. Das Tetrazin fungiert nicht nur als reaktive Gruppe während der Click-Reaktion mit Alkenen, sondern führt in vielen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten zur Fluoreszenzlöschung. Während bei grün-absorbierenden Farbstoffe vor allem FRET-basierte Löschprozesse dominieren, konnte photoinduzierter Elektronentransfer (PET) vom angeregten Farbstoff zum Tetrazin als Hauptlöschmechanismus bei rot-absorbierenden Oxazin- und Rhodamin-Derivaten identifiziert 
werden. 
Die effiziente und spezifische Markierung aller untersuchten Tetrazin-
Farbstoffe ermöglichte die Visualisierung von Aktin-Filamenten, Mikrotubuli und Membranrezeptoren sowohl durch konventionelle Fluoreszenzmikrosko-pie als auch durch hochauflösende Verfahren, wie z.B. dSTORM, auf Ein-zelmolekülebene. Die unterschiedliche Zellpermeabilität von 
Tetrazin-Farbstoffen kann dabei vorteilhaft für die spezifische intra- und extrazelluläre Markierung von Proteinen in fixierten und lebenden Zellen genutzt werden.
N2  - The genetic code describes the encoding and decoding of genetic infor-mation for the universal principle of protein biosynthesis from individual amino 
acids. By expanding the genetic code, unnatural amino acids (uAA) with unique biophysical properties can be introduced site-specifically into pro-teins and enable the selective manipulation of proteins. 
The click reaction of the unnatural amino acid TCO*-lysine and tetrazine has an extraordinary reaction kinetic (≥800 M-1s-1) enabling the specific and bioorthogonal labeling of biomolecules under physiological conditions. 
The main focus of this work was the labeling of membrane receptors by click chemistry in living cells and the investigation of the interaction of 22 known and novel tetrazine dye conjugates. In addition, the applicability of bioorthogonal click reactions for high-resolution fluorescence microscopy was investigated. 
For this purpose, the unnatural amino acid TCO*-lysine was introduced site-specifically via genetic code expansion into proteins from the class of iono-tropic glutamate receptors (iGluR), TNF receptors or microtubule-
associated proteins (MAP), thereby enabling fluorescence labeling with 
tetrazine dyes. The direct chemical coupling of TCO to ligands such as 
phalloidin and docetaxel, which can specifically bind the actin cytoskeleton or microtubule filaments, allowed click staining of fixed and living cells 
without genetic modifications of the target proteins. 	
Furthermore, the spectroscopic properties of 22 tetrazine dyes spanning the entire visible wavelength range were investigated. A hallmark of the click reaction using tetrazine dyes is their fluorogenicity. Thus, the tetrazine not only functions as a reactive group during the click reaction with alkenes, but also leads to fluorescence quenching in many tetrazine-dye conjugates. While FRET-based quenching processes dominate in green-absorbing dyes, 
photoinduced electron transfer (PET) from excited dye to tetrazine has been identified as the main quenching mechanism in red-absorbing oxazine and rhodamine derivatives. 
The efficient and specific labeling of all investigated tetrazine dyes facilitates the visualization of actin filaments, microtubules and membrane receptors by conventional fluorescence microscopy as well as by super-resolution 
microscopy techniques, e.g. dSTORM, also at single molecule level. The 
different cell permeability of tetrazine dyes can be used advantageously for the specific intra- and extracellular labeling of proteins in fixed and living cells.
KW  - Hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Tetrazin
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189628
ER  -