TY - THES A1 - Sisario, Dmitri Jonas T1 - Bildbasierte Analyse von Säugetierzellen unter dem Einfluss von osmotischem Stress, überkritischen elektrischen Feldern und ionisierender Strahlung T1 - Image-based analysis of mammalian cells subjected to osmotic stress, supracritical electric fields and ionizing radiation N2 - Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die kurz nach Elektroporation eintretende hämolytische Zellbewegung von humanen Erythrozyten erstmals quantitativ untersucht, um den zu Grunde liegenden Mechanismus aufzuklären. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Bewegung aus dem Ausstoß von unter Druck stehendem Zytosol resultierte. Durch weitere Experimente wurde die Beteiligung des Nicht-Muskel-Myosins NMIIA am Aufbau des zytosolischen Überdrucks nachgewiesen. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein molekular-mechanischer bisher unbekannter NMII-basierter Mechanismus der rapiden Ghostbildung beschrieben. Diese Erkenntnis könnte biomedizinische Relevanz besitzen, da der Abbau von Erythrozyten in der Milz die Transformation zu Hb-armen Ghosts voraussetzt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem Hirntumor Glioblastoma multiforme (GBM), dessen Rezidiv hauptsächlich auf Strahlenresistenz und Zellinvasion zurückzuführen ist. Deshalb wurde mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) die Nanostruktur des DSB-Markers Histon γH2AX und des DNA-Reparaturfaktors DNA-PKcs in bestrahlten GBM-Zellen analysiert. Anhand von dSTORM-Rekonstruktionen wurde erstmals gezeigt, dass die beiden Proteine kaum Kolokalisation im Nanometerbereich aufweisen. Zunehmend wird die anomale Expression von Membrantransportern aus der SLC-Familie mit der Migration von Krebszellen in Verbindung gebracht. Der finale Abschnitt befasste sich daher mit der subzellulären Lokalisierung der Transporterproteine SLC5A1 und SLC5A3 in GBM-Zellen, um ihre Beteiligung an der Zellmigration nachzuweisen. Dabei wurde erstmals gezeigt, dass der Leitsaum der untersuchten GBM-Zellen deutliches SLC5A1- und SLC5A3-Signal aufwies. Basierend auf diesen Befunden wurden den Transportern unterschiedliche Aufgaben bei der zellmigrativen lokalen Volumenregulation zugeschrieben. Somit ergänzen SLC5A1 und SLC5A3 das migrationsassoziierte Krebszell-Transportom. N2 - The unique properties of the highly specialized, enucleated mammalian erythrocytes allows them to withstand enormous mechanical stress. However, because their membrane area is limited, they display high osmotic fragility towards hypotonic shocks. In contrast, the much more complex tumor cells are not only capable of tolerating a wide range of osmotic stresses, but they frequently display considerable chemo- and even radioresistance. Because of these intriguing properties, both cell types have been the subject of intensive biophysical and biomedical research for decades. However, despite the long history of erythrocyte research, the apparently self-propelled motion of red blood cells that occurs in the course of hemolysis is a largely unknown phenomenon. In the first part of this doctoral thesis, the electroporation-triggered hemolytic cell motion of human erythrocytes was examined quantitatively for the first time in order to elucidate the underlying mechanism of this phenomenon. Using fluorescence and videomicroscopic analyses, the two main phases of electrohemolysis were identified. The first, prehemolytic phase was characterized by an efflux of low-molecular cytosolic solutes via electropores, accompanied by transient, osmotic cell shrinkage. Once the influx of extracellular solutes predominated, swelling to the critical cell volume started, apparent from the loss of discoid morphology. The second, hemolytic phase was characterized by a sudden cell acceleration to a peak velocity of ~35 µm/s, ~1 second of rapid and linear movement, gradual volume reduction and transformation to a hemoglobin-depleted, transparent ghost. The results of this work suggest that this rapid linear motion results from a cell contraction-driven expulsion of the pressurized hemoglobin (Hb)-rich cytosol through a single hemolytic hole. ... KW - Erythrozyt KW - Glioblastom KW - Zellmigration KW - DNS-Doppelstrangbruch KW - Hb-Jet Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246772 ER - TY - THES A1 - Schubert, Jonathan T1 - Bildgebende Zweifarben-Einzelmolekül-PET-Fluoreszenzspektroskopie am molekularen Chaperon Hsp90 T1 - Two-color single-molecule PET fluorescence imaging spectroscopy on the molecular chaperone Hsp90 N2 - Im Forschungsfeld der Proteindynamik häufen sich in den letzten Jahren Untersuchungen an einzelnen Molekülen. Damit können molekulare Ereignisse, die in konventioneller Spektroskopie durch stochastische Prozesse unentdeckt bleiben, durch direkte Beobachtung identifiziert und analysiert werden, was zu tieferem mechanistischem Verständnis des untersuchten Systems beitragen kann. Die Implikation des molekularen Chaperons Hsp90 in die korrekte Faltung und Aktivierung einer Vielzahl davon abhängiger Klientenproteine machen es zu einem zentralen Knotenpunkt der zellulären Proteinhomöostase, allerdings ist der Mechanismus seiner breiten Klientenerkennung und -prozessierung bisher nur lückenhaft untersucht. Mit der Erkenntnis, dass Hsp90 ATP abhängig große, ratenlimitierende Umstrukturierungen erfährt, wurden Reportersysteme entwickelt, die auf dem Förster-Resonanzenergietransfer mit einer räumlichen Auflösung von ca. 2-10 nm basieren. Diese dokumentieren einen Klammerschluss des Chaperons und prognostizieren einen intermediatbbasierten Konformations-Zyklus. Details über den Mechanismus der Umstrukturierungen wurden mit der Entwicklung von Reportersystemen ermittelt, die auf dem photoinduzierten Elektronentransfer zwischen der Aminosäure Tryptophan und einem organischen Farbstoff basieren. Die Technik beruht auf kontaktinduzierter Fluoreszenzlöschung und damit verbundenen digitalen Intensitätsübergängen, dabei ermöglicht die räumliche Sensitivität von < 1 nm die Beobachtung von lokalen Umstrukturierungen. In Hsp90 wurden damit mittels konventioneller Spektroskopie drei kritische lokale Umlagerungen untersucht und daraus ein Modell mit heterogenen apo-Konformationen sowie ein kooperativer Konformationszyklus abgeleitet, der dem intermediatbasierten Modell gegenübersteht. Im Rahmen dieser Dissertation wurde anhand des Hsp90-Chaperons eine Methode entwickelt, die eine bildgebende PET Fluoreszenzspektroskopie von mehreren Umstrukturierungen gleichzeitig an einzelnen Molekülen erlaubt. Ein umfangreiches Farbstoffscreening führte zur Identifizierung eines Farbstoffpaars, das die PET-basierte simultane Aufzeichnung zweier Konformations-Koordinaten ermöglicht. Über verschiedene Modifikationen des Chaperons konnten einzelmolekültaugliche Oberflächen hergestellt werden, auf denen zweifach markierte Hsp90-Proteine immobilisiert sind. Fluoreszenzintensitätszeitspuren einzelner Chaperone und entsprechende Kontrollkonstrukte bestätigen qualitativ den Erfolg der Methode, für die quantitative Analyse wurde eine Routine in der Programmiersprache Python entwickelt, mit welcher kinetische Informationen ermittelt werden konnten. Diese legen eine enge wechselseitige Abhängigkeit der drei lokalen Elemente nahe, wobei der Großteil der Konformationsübergänge zweier simultan aufgezeichneter Umstrukturierungen Synchronität innerhalb von zwei Sekunden zeigt. Im Vergleich zur Hydrolyse von einem ATP in mehreren Minuten deutet das auf eine enge Kopplung hin. Weiter konnte eine Beschleunigung der Dynamiken durch aromatische Modifikation des N-Terminus von Hsp90 beobachtet werden, zudem erlaubt der Einzelmolekülansatz die Verwendung des nativen Nukleotids ATP, wodurch auch die lokalen Öffnungsdynamiken zugänglich werden. Die zur Bestimmung der Zeitkonstanten durchgeführte Analyse unterstützt die Ansicht heterogener apo-Zustände und einer einheitlich geschlossenen Konformation. Die bildgebende Zweifarben-Einzelmolekül-PET-Spektroskopie konnte insgesamt zu einem Komplement der Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie entwickelt werden, um damit lokale Konformationsdynamiken zu untersuchen. Der bildgebende Ansatz erlaubt eine einfache Implementierung in einen experimentellen Einzelmolekül-FRET Aufbau bei gleichzeitiger Erweiterung der beobachteten Koordinaten und wird so zu einem breit anwendbaren Werkzeug multidimensionaler Dynamikuntersuchungen einzelner Proteine. N2 - Over the past years, the number of investigations of single molecules has risen in the field of protein dynamics studies. Direct observation of molecular events that are obscured by stochastic processes in bulk measurements can provide a deeper mechanistic understanding of the systems under study. The molecular chaperone Hsp90, as being involved in the correct folding and activation of client proteins, thereby acting at late-stage folding, is a central node of cellular protein homeostasis. The mechanistic understanding of its broad client recognition and processing capability still remains elusive. The discovery of large conformational changes that drive the chaperone through a rate limiting conformational cycle as a reaction of ATP binding led to the development of reporter systems that probe the global rearrangement. As the reporters are based on Förster resonance energy transfer, they are active on a spatial scale of 2-10 nm and report on the molecular clamp closure. The predicted conformational cycle implicates several intermediate states. Details of the underlying rearrangements were obtained by the development of reporter systems based on photoinduced electron transfer between the amino acid tryptophan and an organic dye. As the technique relies on contact-induced quenching of fluorescence, which is accompanied by digital intensity transitions, the resulting spatial resolution of < 1 nm enables probing of local conformational rearrangements. In bulk experiments, three critical local dynamics were probed in Hsp90, leading to the assumption of heterogeneous apo conformations and an associated cooperative cycle which faces the intermediate-based model. Within the scope of this doctoral thesis, two color single-molecule PET fluorescence imaging spectroscopy was developed using the Hsp90 chaperone to study multiple conformational rearrangements simultaneously on individual proteins. Extensive dye screening identified a dye pair suitable for the PET-based investigation of two different conformational coordinates simultaneously. Modifications on the chaperone protein enabled the immobilization of double-labeled Hsp90 molecules on glass surfaces that are suited for single-molecule studies. Fluorescence intensity time traces of single chaperones and related control constructs validated qualitatively the success of the method. For quantitative analysis, a routine was developed in the programming language Python to obtain kinetic information. Derived kinetics pointed to a close interdependence between the three local elements. Furthermore, the majority of state transitions of rearrangements studied at the same time occurred simultaneously within a two-second window, thereby suggesting synchronicity. Compared to the hydrolysis of one ATP molecule taking minutes, this suggests a tight coupling of motions. Further, an aromatic modification of the Hsp90 N-Terminus resulted in accelerated local dynamics. Besides investigating the dynamics accompanying clamp closure, clamp opening kinetics also became accessible through the use of native nucleotide ATP. The analysis performed as part of the determination of time constants supports the view of a heterogeneous apo and a uniformly closed conformation. Two-color single-molecule PET fluorescence imaging spectroscopy was developed into a technique complement to single-molecule FRET spectroscopy that enables the probing of local conformational dynamics in immobilized proteins. The imaging approach allows for easy implementation in a single-molecule FRET setup while expanding the observed coordinates, making the PET-based technique a widely applicable tool for multidimensional dynamics studies of single proteins. KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Einzelmolekülspektroskopie KW - Hitzeschock-Proteine KW - Proteinsynthese KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - photoinduced electron transfer KW - Hsp90 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244938 ER - TY - THES A1 - Fischer, Andreas T1 - Biochemische Charakterisierung der basischen Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren Hey1 und Hey2 sowie Untersuchung ihrer Rolle während der Herz- und Gefäßentwicklung T1 - Biochemical characterisation of the basic helix-loop-helix transcription factors Hey1 and Hey2 and analysis of their role in cardiovascular development N2 - Die Entwicklung eines vielzelligen Organismus aus einer befruchteten Eizelle ist nur durch komplexe zelluläre Regulationsmechanismen möglich. Dabei spielt der Notch-Signaltransduktionsweg eine zentrale Rolle während der Determination von Zellschicksalen und der Zelldifferenzierung. Die primären Zielgene der Notch-Signalkaskaskade bei Vertebraten sind die Hes- sowie die kürzlich identifizierten Hey-Gene. Die Hey-(hairy and E(spl) related with YRPW motif)-Gene kodieren drei hairy/E(spl)/Hes-verwandte basische Helix-Loop-Helix-Transkriptionsfaktoren, die durch eine Orange-Domäne und einen charakteristischen Carboxyterminus gekennzeichnet sind. Während der Embryonalentwicklung werden die Hey-Gene dynamisch in zahlreichen Geweben exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, neue Hey-Interaktionsproteine aus embryonalen Genbanken zu isolieren, die Bindung an weitere bHLH-Transkriptionsfaktoren zu überprüfen und ihre DNA-Bindung zu analysieren. Um die physiologische Hey2-Funktion zu ergründen, wurden Hey2-Knockoutmäuse untersucht. In einem ersten Versuch wurde eine neue Screeningmethode erprobt, bei der Proteinexpressionsfilter mit markierten Hey1-Peptiden nach interagierenden Proteinen durchsucht wurden. Hierbei sind 53 Proteine isoliert worden, jedoch konnte nach eingehenderen Untersuchungen kein relevanter Bindungsspartner beschrieben werden. Für weitere Analysen unter mehr physiologischen Bedingungen wurde das Yeast Two-Hybrid Verfahren für Hey1 und Hey2 etabliert. Das Screening von murinen embryonalen cDNA-Genbanken mit verschiedenen Hey1-Fragmenten führte zur Isolation von mehreren hundert Klonen. Die interessantesten Kandidaten wurden weiteren biochemischen Tests unterzogen, wobei jedoch keine neuen Interaktionspartner verifiziert werden konnten. Mit gezielten direkten Yeast Two-Hybrid und GST-Pulldown Assays für vermutete Kandidaten konnte jedoch die Interaktion von Hey1 bzw. Hey2 mit den bHLH-Proteinen E2-2, E2-5, MyoD und c-hairy1 nachgewiesen werden. Außerdem wurde festgestellt, dass Hey1 und Hey2 Homodimere und Hey1/Hey2-Heterodimere bilden. Die stärkste Interaktion wurde mit dem in der Somitogenese rhythmisch exprimierten c-hairy1-Protein beobachtet. Da Hey2 und c-hairy1 im präsomitischen Mesoderm und in den Somiten coexprimiert werden und starke Heterodimere ausbilden, erscheint es wahrscheinlich, dass beide Proteine gemeinsam die Transkription nachgeschalteter Gene steuern. Diese Interaktionsstudien zeigten außerdem erstmals, dass die Orange-Domäne entscheidend an der Bildung der Dimere beteiligt ist, da durch sie die Dimerisierung in vivo deutlich verstärkt wurde. Schließlich konnte gezeigt werden, dass Hey1 und Hey2, im Gegensatz zu den übrigen hairy-Proteinen, nicht mit dem Corepressor Groucho/TLE1 interagieren. Electrophoretic Mobility Shift Assays ergaben, dass die Hey1- und Hey2-Proteine an eine E(spl)-spezifische E-Box DNA-Sequenz (CACGTG) binden. Auch die interagierenden bHLH-Proteine c-hairy1, E2-2 und E2-5 binden als Homodimere an diese DNA-Sequenz. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Hey2-Genfunktion an Hey2-Knockoutmäusen untersucht. Etwa 80 % der homozygoten Mäuse starben wenige Tage nach der Geburt. Sie zeigten eine massive Hypertrophie der Herzventrikel, die wahrscheinlich die Todesursache darstellt. Die lacZ-Expression der untersuchten Organe entsprach der Hey2-Expression im Wildtyp. Es fiel dabei auf, dass es postnatal zu einer Herunterregulation der Hey2-Transkription kommt. Mit Elektrokardiogrammen wurden keine Reizleitungsstörungen bei neugeborenen Hey2-Knockoutmäusen festgestellt. Interessanterweise konnte mit Arteriographien ausgeschlossen werden, dass die Ventrikelhypertophie Folge einer Aortenstenose wie bei der gridlock (zf-Hey2)-Mutante im Zebrafisch ist. Vielmehr führt eine homozygote Hey2-Deletion zu einer Kardiomyopathie in Kombination mit verschiedenene Herzfehlern. Untersuchungen der Hey1- und HeyL-Expression in Hey2-Knockoutembryonen mittels RNA in situ Hybridisierungen zeigten keine Veränderungen im Vergleich mit dem Wildtyp. Daraus kann gefolgert werden, dass Hey1 und HeyL zumindest dort, wo sie nicht mit Hey2 coexprimiert sind, die Hey2-Funktionen nicht kompensieren können. Weitere Erkenntnisse über die Funktionen der Hey-Gene werden sicherlich die Studien an den Doppelknockoutmäusen ergeben. Die bisherigen Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Hey-Gene essentiell für die murine Herzentwicklung sind. Weitere Untersuchungen müssen nun zeigen, welche Rolle diese Gene bei der Entstehung von kongenitalen Herzfehlern des Menschen spielen. N2 - The development from a single fertilized oocyte to a multicellular organism requires complex cellular regulatory mechanisms. During this process the Notch signalling pathway plays a crucial role in determining cell fate and differentiation. Primary target genes of the Notch signalling cascade in vertebrates are Hes and the recently identified Hey genes. Hey (hairy and E(spl) related with YRPW motif) genes encode three hairy/E(spl)/Hes related basic helix-loop-helix transcription factors characterised by an Orange domain and a conserved carboxyterminus. During embryonic development Hey genes are dynamically expressed in various tissues. The goal of this study was to isolate novel Hey-interacting proteins from embryonic cDNA libraries, to analyse the binding to other bHLH transcription factors and to examine their DNA-binding properties. To elucidate the physiological role of Hey2, Hey2 knockout mice were analysed. First, a new screening method was used to identify Hey1-binding proteins from protein expression filters hybridised with labelled Hey1 peptides. Out of 53 candidates isolated no relevant interaction partner could be verified after more detailed examination. For further analysis under more physiological conditions the yeast-two hybrid system was established for Hey1 and Hey2. Screening of murine embryonic cDNA libraries with different Hey1 fragments led to the identification of several hundred clones. The most interesting ones were further analysed with biochemical assays, but no novel interaction partner could be verified. With direct yeast-two hybrid and GST-pulldown assays of candidate proteins an interaction of Hey1 and Hey2 with the bHLH proteins E2-2, E2-5, MyoD and c-hairy1 was found. Furthermore, it could be shown that Hey1 and Hey2 can form homodimers as well as Hey1/Hey2 heterodimers. However, the strongest interaction was seen with c-hairy1, which is dynamically expressed during somitogenesis. Hey2 and c-haiy1 are coexpressed in the presomitic mesoderm and in somites and their strong interaction suggests that both proteins together regulate the transcription of target genes. These interaction studies showed for the first time that the Orange domain is important for dimer formation in vivo, because it strongly increased binding strength. Furthermore, it could be shown that Hey1 and Hey2 do not interact with the corepressor Groucho/TLE1, which is in contrast to all other hairy-related proteins. Electrophoretic mobility shift assays revealed that Hey1 and Hey2 proteins are able to bind an E(spl)-specific E-box DNA sequence (CACGTG). The interacting bHLH proteins c-hairy1, E2-2 and E2-5 could also bind to this sequence as homodimers. The aim of the second part of this study was to examine Hey2-lacZ knockout mice. About 80 % of the homozygous mice died within a few days after birth. They exhibited massive ventricular hypertrophy as the most likely cause of death. Expression of lacZ in the organs analysed was comparable to Hey2 in wildtype. It became clear that Hey2 transcription is downregulated postnatally. Electrocardiography showed no conduction failure or arrythmia in newborn knockouts. Interestingly, it could be ruled out by angiography that ventricular hypertrophy is caused by aortic coarctation as seen in the gridlock (zf-Hey2) zebrafish mutant. However, loss of Hey2 leads to cardiomyopathy combined with various cardiac structural defects. Hey1 and HeyL expression in Hey2 knockout embryos was not altered as shown by RNA in situ hybridisation. Therefore, it can be concluded that Hey1 and HeyL can not compensate Hey2 function, at least in organs where they are not coexpressed. A better understanding of the Hey genes will be achieved by studying double knockout mice. This work clearly shows that Hey genes are essential for murine heart development. Further analysis will reveal if these genes also play a role in congenital heart disease in humans. KW - Hey1 KW - Hey2 KW - Transkriptionsfaktoren KW - Herz KW - Gefäße KW - Hey1 KW - Hey2 KW - transcription factors KW - heart KW - vessels Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6086 ER - TY - THES A1 - Mentzel, Benjamin Tobias T1 - Biochemische und phänotypische Untersuchungen zur Funktion der p21-aktivierten Kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster T1 - Biochemical and phenotypic analysis of the p21-activated kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist das Drosophila melanogaster Protein DPAK3, ein Vertreter der hochkonservierten Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK). DPAK3 und seine Homologen aus anderen Insektenarten und C. elegans können aufgrund eines Vergleichs der Proteinsequenz und struktureller Merkmale in eine eigenen Untergruppe 1* innerhalb der Gruppe 1 der PAK-Proteine eingeordnet werden. Das Genom von Drosophila kodiert noch für zwei weitere PAK-Proteine, das zur Gruppe 1 gehörende DPAK1 und das Gruppe 2 PAK-Protein Mbt. Wie die klassischen Gruppe 1 PAK-Proteine bildet DPAK3 im inaktiven Zustand Dimere. DPAK3 interagiert mit den GTP-gebundenen Formen der RhoGTPasen Rac1, Rac2 und Cdc42. Durch die Bindung dieser Proteine geht DPAK3 aus dem dimeren in den monomeren Zustand über und seine Kinaseaktivität wird durch diese Bindung gesteigert. DPAK3 ist für die Ausbildung der korrekten Morphologie kultivierter Drosophila Zellen erforderlich und beeinflußt die Regulation des Aktinzytoskeletts. Weiterhin konnte CK2beta, die regulatorische Untereinheit der Casein Kinase 2, als neuer Regulator von p21-aktivierten Kinasen identifiziert werden. Das Genom von Drosophila besitzt drei Transkriptionseinheiten, die für CK2beta', CK2betatestes und fünf verschiedene Isoformen von CK2beta kodieren. Eine vergleichende Analyse zeigt, daß alle CK2beta-Proteine mit DPAK1, DPAK3 und in geringerem Maß auch mit Mbt interagieren und in der Lage sind, die Aktivität der PAK-Proteine in vitro zu hemmen. Die Bindung von CK2beta an DPAK3 wird, wie bei allen anderen Serin- / Threoninkinasen, die bisher als Interaktionspartner von CK2beta identifiziert wurden, über die Kinasedomäne von DPAK3 vermittelt. Die Bildung des aus zwei katalytischen CK2a und zwei CK2beta Untereinheiten bestehenden CK2-Holoenzyms hängt von der Fähigkeit von CK2beta ab, Dimere zu bilden. Es konnte gezeigt werden, daß die Bildung eines b-b Dimers für die Interaktion mit und Regulation von DPAK3 nicht erforderlich ist. In vivo wurden die bisher bekannten Dpak3 Allele untersucht, wobei kein gesichertes Nullallel identifiziert werden konnte. Durch enzymatisch katalysierte Rekombination wurde eine neue Deletion hergestellt, die das komplette Leseraster von Dpak3 entfernt. Mit Hilfe von genetischen Mosaiken wurde die Rolle von DPAK3 in der Augenentwicklung untersucht. Durch den Verlust der Genfunktion von Dpak3 wird die Ausbildung der korrekten Struktur der Komplexaugen nur leicht beeinträchtigt. Bei der Analyse einer Dpak1 Mutante wurde dasselbe Ergebnis erzielt. Gleichzeitiger Verlust der Genfunktion von Dpak1 und Dpak3 hingegen führt zu massiven strukturellen Defekten. DPAK1 und DPAK3 erfüllen somit zumindest teilweise redundante Funktionen in der Augenentwicklung. Es wird Gegenstand zukünftiger Studien sein müssen, die gemeinsamen und getrennten Funktionen dieser PAK-Proteine in Drosophila aufzuklären. N2 - Subject of this work is the Drosophila melanogaster protein DPAK3, a member of the highly conserved family of p21-activated kinases. Based on the comparison of the amino acid sequence and structural features, DPAK3 and its homologues from other insect species and C. elegans can be assigned to a distinct subgroup 1* within the group 1 PAK proteins. The genome of Drosophila encodes for two additional PAK proteins, DPAK1 and Mbt, which belong to the group 1 and group 2 p21-activated kinases, respectively. Like the classical group 1 PAK proteins, DPAK3 forms dimers in its inactive conformation. DPAK3 binds to and is activated by the Rho GTPases Rac1, Rac2 and Cdc42. The interaction with these proteins leads to the disruption of the DPAK3 dimer and an increase in the kinase activity of DPAK3. DPAK3 is necessary for the development of the normal morphology of cultured Drosophila cells and influences the regulation of the actin cytoskeleton. CK2b the regulatory subunit of casein kinase 2 was identified as a new regulator of p21 activated kinases. The genome of Drosophila possesses three different transcriptional units that encode the proteins CK2b', CK2btestes and five different isoforms of CK2b. A comparative analysis shows that all CK2b proteins interact with DPAK1, DPAK3 and Mbt and negatively regulate the activity of these kinases in vitro. CK2b binds to the kinase domain of DPAK3 which is consistent with previous results obtained from other serine/threonine kinases interacting with CK2b. The CK2 holoenzyme consists of two catalytically active CK2a subunits and two regulatory CK2b subunits. My results show that the ability of CK2b to form dimers, which is essential for the formation of the CK2 holoenzyme, is not necessary for the regulation of p21 activated kinases. The analysis of the available Dpak3 alleles in vivo revealed the necessity to create a new bona fide loss of function allele. To accomplish this goal, a new deletion which removes the entire Dpak3 open reading frame was created by enzymatically catalysed recombination. Genetic mosaics were used to study the role of DPAK3 in eye development. The morphology of the complex eyes was only slightly impaired by the loss of Dpak3 function. The same result was obtained when analysing Dpak1 mutants, but removal of the gene function of both Dpak1 and Dpak3 leads to massive structural defects. This shows that Dpak1 and Dpak3 have at least partially redundant functions in eye development. Further studies will be necessary to reveal the common and distinct functions of these p21-activated kinases in Drosophila. KW - Taufliege KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30290 ER - TY - THES A1 - Kläckta, Christian T1 - Biochemische und –physikalische Charakterisierung von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten N2 - Die vorliegende Dissertation beschreibt detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von rekombinanten Porinen aus den beiden pathogenen Bakterien Nocardia farcinica und Vibrio cholerae sowie von nativen Porinen aus drei Streptomyces Arten. Für die beiden pathogenen Vertreter sind bereits impermebable Zellwandstrukturen beschrieben worden (Daffe et al., 1993; Rodriguez-Torres et al., 1993). Für Streptomyces Arten ist keine vergeichbare, definierte äußere Zellwandbarriere bekannt. Im Fall von S. griseus konnten dennoch undefinierte, kovalente Lipidverknüpfungen mit der Peptidoglykanschicht nachgewiesen werden (Kim et al., 2001). Daher besteht die Notwendigkeit des Transports von Nährstoffen und anderer Moleküle auch bei Streptomyces Arten durch porenformende Proteine, so genannte Porine. Unter Porinen versteht man wassergefüllte Kanäle, die in zwei Klassen unterteilt werden können: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Allgemeine Diffusionsporen filtern entsprechend der molekularen Masse der gelösten Substrate und weisen ein lineares Verhältnis zwischen Translokationsrate und Substratkonzentrationsgradient auf. Dagegen kann der Transport bestimmter Substanzen durch spezifische Porine mit einer Substrat-Bindestelle im Kanal durch die Michaelis-Menten-ähnliche Kinetik beschrieben werden. Diese Kanäle ermöglichen den schnellen Influx bestimmter Klassen von Substraten. N2 - This thesis describes detailed biochemical and biophysical investigations of recombinant porins of both pathogenic bacteria Nocardia farcinica and Vibrio cholerae besides native porins of three Streptomyces strains. For both pathogenic strains used in this work impermeable cell-wall structures have already been described (Daffe et al., 1993; Rodriguez-Torres et al., 1993). However, there is little known about cell-wall composition in Streptomyes strains yet. It was shown that Streptomyces griseus contains lipids that are covalently linked to the peptidoglycan layer (Kim et al., 2001). Therefore it is conceivable that the transport of nutrients and other molecules across the outer membrane of Streptomyces strains is also enabled by pore-forming proteins, so called porins. Porins are water-filled channels which can be subdivided into two different classes, general diffusion pores and substrate-specific porins. General diffusion pores sort mainly according to the molecular mass of the solutes and show a linear relation between translocation rate and solute concentration gradient. Specific porins with a substrate-binding site inside the channel exhibit Michaelis-Menten-like kinetics for the transport of certain solutes and are responsible for the rapid uptake of different classes of solutes. KW - Porine KW - Mycolata KW - Bakterien KW - Porins KW - mycolata KW - bacteria Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38910 ER - TY - THES A1 - Bertram, Helge T1 - Bioinformatische Identifikation von Domänenunterschieden bei Parasit und Wirt am Beispiel der Malaria T1 - Bioinformatic identification of domain differences in parasite and host using malaria as an example N2 - Diese Arbeit untersucht zelluläre Netzwerke mit dem Ziel, die so gewonnenen Einsichten medizinisch beziehungsweise biotechnologisch zu nutzen. Hierzu müssen zunächst Proteindomänen und wichtige regulatorische RNA Elemente erkannt werden. Dies geschieht für regulatorische Elemente in Nukleinsäuren am Beispiel von Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylococcus aureus, wobei sich solche Elemente in viel versprechender Nähe zu exprimierten Sequenzen finden lassen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Noch bedeutsamer als Ziele zur Medikamentenentwicklung gegen Parasiten sind Domänenunterschiede in Struktur und Sequenz bei Proteinen (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Ihre Identifikation wird am Beispiel eines potentiellen Transportproteins in Plasmodium falciparum exemplarisch dargestellt. Anschließend wird das Zusammenwirken von regulatorischen Elementen und Domänen in Netzwerken betrachtet (einschließlich experimenteller Daten). Dies kann einerseits zu allgemeineren Schlussfolgerungen über das Netzwerkverhalten führen, andererseits für konkrete Anwendungen genutzt werden. Als Beispiel wählten wir hier Redoxnetzwerke und die Bekämpfung von Plasmodien als Verursacher der Malaria. Da das gesamte Redoxnetzwerk einer lebenden Zelle mit Methoden der pH Wert Messung nur unzureichend zu erfassen ist, werden als alternative Messmethode für dieses Netzwerk Mikrokristalle der Glutathionreduktase als Indikatorsystem nach digitaler Verstärkung experimentell genutzt (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). Um komplexe Redoxnetzwerke auch bioinformatisch zu modulieren, werden Verfahren der metabolischen Fluxanalyse vorgestellt und verbessert, um insbesondere ihrer Verzahnung besser gerecht zu werden und solche Netzwerke mit möglichst wenig elementaren Flussmoden zutreffend beschreiben zu können. Die Reduktion der Anzahl von Elementarmoden bei sehr großen metabolischen Netzwerken einer Zelle gelingt hier mit Hilfe unterschiedlicher Methoden und führt zu einer vereinfachten Darstellungsmöglichkeit komplexer Stoffwechselwege von Metaboliten. Dabei dient bei jeder dieser Methoden die biochemisch sinnvolle Definition von externen Metaboliten als Grundlage (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). Allgemeiner werden Verfahren der Proteindomänenklassifikation sowie neue Strategien gegen mikrobielle Erreger betrachtet. In Bezug auf automatisierte Einteilung von Proteinen in Domänen wird ein neues System von Taylor (2002b) mit bekannten Systemen verglichen, die in unterschiedlichem Umfang menschlichen Eingriffs bedürfen (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). Außerdem wurde neben einer Arbeit über die verschiedenen Methoden aus den Daten eines Genoms Informationen über das metabolische Netzwerk der Zelle zu erlangen (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11) auch eine Übersicht über die Schwerpunkte der Bioinformatik in Würzburg zusammengestellt (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Schließlich wird beschrieben, wie die Pathogenomik und Virulenz von Bakterien der bioinformatischen Analyse zugänglich gemacht werden können (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). Im letzten Teil wird die metabolische Fluxanalyse zur Identifikation neuer Strategien zur Bekämpfung von Plasmodien dargestellt: Beim Vergleich der Stoffwechselwege mit Glutathion und Thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles und Mensch geht es darum, gezielte Störungen im Stoffwechsel des Malariaerregers auszulösen und dabei den Wirt zu schonen. Es ergeben sich einige interessante Ansatzpunkte, deren medizinische Nutzung experimentell angestrebt werden kann. N2 - The objective of this thesis is to obtain information, which may be advantageous for biotechnical and medical purposes. In order to achieve this aim it is first necessary to identify protein domains and essential regulatory RNA elements. In case of regulatory RNA elements this is accomplished by investigating Iron Responsive Elements (IREs) in Staphylocuccus aureus as a model. In this case these elements are found in much promising vicinity to open reading frames coding for proteins (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Even more significant for the purpose of developing pharmaceuticals against parasites are differences of structure and sequence in protein domains (T. Dandekar, F. Du, H. Bertram (2001) Nonlinear Analysis 47(1): 225-34). Their identification is shown in a potential transport protein in Plasmodium falciparum. Subsequently the interaction of regulatory elements and domains in networks is considered (including experimental data). The resulting observations may lead to general conclusions concerning network reaction, as well as specific applications. Our example and field of interest are redox networks and Plasmodia causing malaria. It is not possible to cover the redox network state of a living cell using only pH measurements. Therefore small crystals of glutathione reductase are employed as a more suitable indicator, whose signal is digitally amplified (H. Bertram, M. A. Keese, C. Boulin, R. H. Schirmer, R. Pepperkok, T. Dandekar (2002) Chemical Nanotechnology Talks III - Nano for Life Sciences). In order to bioinformatically modulate complex redox networks techniques of metabolic flux analysis are presented. They are also improved particularly to advance the understanding of interdependences and to facilitate the correct comprehension of such networks with as few elementary flux modes as possible. In this thesis the reduction of the number of elementary modes of large and intertwined metabolic networks succeeds with various methods. This leads to a simpler model of complex metabolic functions. For each of the methods used in this process the biochemically justified definition of external and internal metabolites constitutes the basis (T. Dandekar, F. Moldenhauer, S. Bulik, H. Bertram, S. Schuster (2003) Biosystems 70(3): 255-70). In a more general sense methods of protein domain classification and new strategies for the control of microbial pathogens are considered. In reference to automated classification of protein domains a new system by Taylor (2002b) is compared with traditional systems, which require a varying degree of human intervention (H. Bertram, T. Dandekar (2002) Chemtracts 15: 735-9). In addition different methods of acquiring information on the cellular metabolic network from genomic data is discussed (H. Bertram, T. Dandekar (2004) it 46(1): 5-11). Furthermore a survey of the main fields of bioinformatic research in Würzburg is given (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum 1-2: 26-7). Finally it is outlined how pathogenicity and virulence of bacteria may be made accessible to bioinformatic analysis (H. Bertram, S. Balthasar, T. Dandekar (2003) Bioforum Eur. 3: 157-9). In the conclusion metabolic flux analysis is used for the identification of new strategies in the battle against Plasmodia: The comparison of metabolic pathways with glutathione and thioredoxin in Plasmodium falciparum, Anopheles and man aims at raising planned dysfunctions in the metabolism of Plasmodium or Anopheles without harming the human host. Valuable suggestions for medical applications and pharmacological targets are obtained. KW - Plasmodium falciparum KW - Domäne KW - Klassifikation KW - Bioinformatik KW - Redoxsystem KW - Glutathion-Reductase KW - Malariamücke KW - Mensch KW - Stoffwechselweg KW - Malaria KW - metabolische Fluxanalyse KW - Glutathionreduktase KW - Iron Responsive Elements KW - Proteindomänenklassifikation KW - malaria KW - metabolic fluxanalysis KW - glutathione reductase KW - iron responsive elements KW - classification of protein domains Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17188 ER - TY - THES A1 - Pischimarov, Jordan Ivanov T1 - Bioinformatische Methoden zur Identifizierung und Klassifizierung somatischer Mutationen in hämatologischen Erkrankungen T1 - Bioinformatics approaches for the detection and classification of somatic mutations in hematological malignancies N2 - Die Sequenzierungstechnologien entwickeln sich stetig weiter, dies ermöglicht eine zuvor nicht erreichte Ausbeute an experimentellen Daten und auch an Neuentwicklungen von zuvor nicht realisierbaren Experimenten. Zugleich werden spezifische Datenbanken, Algorithmen und Softwareprogramme entwickelt, um die neu entstandenen Daten zu analysieren. Während der Untersuchung bioinformatischer Methoden für die Identifizierung und Klassifizierung somatischer Mutationen in hämatologischen Erkrankungen, zeigte sich eine hohe Vielfalt an alternativen Softwaretools die für die jeweiligen Analyseschritte genutzt werden können. Derzeit existiert noch kein Standard zur effizienten Analyse von Mutationen aus Next-Generation-Sequencing (NGS)-Daten. Die unterschiedlichen Methoden und Pipelines generieren Kandidaten, die zum größten Anteil in allen Ansätzen identifiziert werden können, jedoch werden Software spezifische Kandidaten nicht einheitlich detektiert. Um eine einheitliche und effiziente Analyse von NGS-Daten durchzuführen war im Rahmen dieser Arbeit die Entwicklung einer benutzerfreundlichen und einheitlichen Pipeline vorgesehen. Hierfür wurden zunächst die essentiellen Analysen wie die Identifizierung der Basen, die Alignierung und die Identifizierung der Mutationen untersucht. Des Weiteren wurden unter Berücksichtigung von Effizienz und Performance diverse verfügbare Softwaretools getestet, ausgewertet und sowohl mögliche Verbesserungen als auch Erleichterungen der bisherigen Analysen vorgestellt und diskutiert. Durch Mitwirken in Konsortien wie der klinischen Forschergruppe 216 (KFO 216) und International Cancer Genome Consortium (ICGC) oder auch bei Haus-internen Projekten wurden Datensätze zu den Entitäten Multiples Myelom (MM), Burkitt Lymphom (BL) und Follikuläres Lymphom (FL) erstellt und analysiert. Die Selektion geeigneter Softwaretools und die Generierung der Pipeline basieren auf komparativen Analysen dieser Daten, sowie auf geteilte Ergebnisse und Erfahrungen in der Literatur und auch in Foren. Durch die gezielte Entwicklung von Skripten konnten biologische und klinische Fragestellungen bearbeitet werden. Hierzu zählten eine einheitliche Annotation der Gennamen, sowie die Erstellung von Genmutations-Heatmaps mit nicht Variant-Calling-File (VCF)-Syntax konformen Dateien. Des Weiteren konnten nicht abgedeckte Regionen des Genoms in den NGS-Daten identifiziert und analysiert werden. Neue Projekte zur detaillierten Untersuchung der Verteilung von wiederkehrender Mutationen und Funktionsassays zu einzelnen Mutationskandidaten konnten basierend auf den Ergebnissen initiiert werden. Durch eigens erstellte Python-Skripte konnte somit die Funktionalität der Pipeline erweitert werden und zu wichtigen Erkenntnissen bei der biologischen Interpretation der Sequenzierungsdaten führen, wie beispielsweise zu der Detektion von drei neuen molekularen Subgruppen im MM. Die Erweiterungen, der in dieser Arbeit entwickelten Pipeline verbesserte somit die Effizienz der Analyse und die Vergleichbarkeit unserer Daten. Des Weiteren konnte durch die Erstellung eines eigenen Skripts die Analyse von unbeachteten Regionen in den NGS-Daten erfolgen. N2 - The sequencing technologies, while still being under further development, render it possible to develop novel experiments and allow the generation of larger amounts of utilizable data. At the same time novel software tools, databases and algorithms are developed to analyze these larger amounts of data. The analysis of somatic mutations in hematological malignancies showed that a high variety of alternative software tools can be used for different analysis steps. Furthermore there is currently no standardized procedure for the efficient identification and analysis of mutations in NGS data. The different pipeline and methods are, for the most part, able to identify the same mutation candidates, however there are software specific candidates which are not called by all pipelines. The scope of this dissertation was therefore to develop a user-friendly pipeline which is able to call candidate mutations uniformly and efficiently. For this purpose necessary analysis steps including base calling, alignment generation and variant calling were investigated. Furthermore available software tools were tested and evaluated regarding their efficiency and performance. Possible improvements of these software tools and previously performed analysis are explained and discussed in this work. NGS data sets of the different cancer entities multiple myeloma (MM), Burkitt lymphoma (BL) and follicular lymphoma (FL) were generated and analyzed within the framework of cooperate projects like the International Cancer Genome Consortium (ICGC) and the Clinical Research Group 216 (KFO) as well as for internal projects. The development of the pipeline and selection of suitable software tools is based on the comparative analysis of the generated data sets, as well as previously described results and experiences in literature and forums. The selective development of certain python scripts enabled the evaluation of novel biological and clinical questions by standardizing gene names in the annotation step, generating heat- maps of non-standardized VCF-files as well as the identification and analysis of uncovered regions in NGS data sets. This work and the obtained results thereby provide the groundwork for further projects e.g. the analysis of the distribution of recurrent mutations or the functional analysis of specific mutation candidates. This extensions of the developed pipeline with python scripts helped to improve the efficiency and comparability of the NGS data. The interpretation of the NGS data with the extended script for example led to the discovery of three distinct molecular subgroups in MM. Furthermore the generation of the novel python scripts helped to analyze uncovered regions in the NGS data sets.  KW - Pipeline-Rechner KW - somatische Mutationen KW - Sequenzierung KW - Bioinformatik KW - Identifizierungspipeline KW - Next Generation Sequencing KW - Variantcalling KW - Bioinformatic KW - somatic mutations KW - DNS-Sequenz KW - Somatische Mutation Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147773 ER - TY - THES A1 - Rotzer, Diana T1 - Biologische Charakterisierung der Rezeptoren für Transforming Growth Faktor-ß T1 - Biological charakterization of the receptors for Transforming Growth Factor-ß N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) reguliert eine Vielzahl zellulärer Funktionen, wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Über membrangebundene Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren werden TGF-ß Signale durch Phosphorylierung an Smad-Proteine, die intrazellulären Signaltransduktoren, weitergeleitet, die im Kern die Transkription spezifischer Gene modulieren. Obwohl die drei TGF-ß Isoformen, TGF-ß1, -ß2 und -ß3, äußerst homologe Proteine sind, unterscheiden sich die Phänotypen ihrer Genknockouts stark. Variabilität und Spezifität können auf vielerlei Arten und Ebenen der TGF-ß Signalübertragung erreicht werden. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternativ gespleißte Variante des TGF-ß Typ II Rezeptors (TßRII), TßRII-B, charakterisiert. Dieser Rezeptor ist, im Gegensatz zum bisher bekannten TßRII, in der Lage alle drei TGF-ß Isoformen hochaffin zu binden und in Abwesenheit eines unterstützenden Typ III Rezeptors (TßRIII) Signale über den Smad-Pathway weiterzuleiten. TßRII-B ist außerdem fähig ligandenabhängig mit den verschiedenen TGF-ß Rezeptortypen zu Oligomerisieren. Erste Hinweise auf Besonderheiten der TGF-ß2 Bindung an TßRII-B wurden mittels verschiedener zellbiologischer Ansätzen gewonnen. Aus Untersuchungen zur gewebespezifischen Expression des Rezeptors geht hervor, daß TßRII-B, im Vergleich zu TßRII, ein distinktes Expressionsmuster aufweist und v.a. in TGF-ß2-beeinflußten Geweben nachgewiesen werden kann. In diesen Erkenntnissen spiegelt sich die Bedeutung dieses Rezeptors für eine TGF-ß Isoform-spezifische Signalübertragung wider. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von TGF-ß und seinen Rezeptoren bei der Entstehung von Tumoren. B-Zellen einiger Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (B-CLL), der häufigsten Form adulter Leukämie in westlichen Ländern, zeigen Resistenz gegenüber TGF-ß-vermittelter Wachstumsinhibierung und ein verändertes Expressionsmuster der TGF-ß Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche. In dieser Arbeit wird die Identifizierung und Charakterisierung zweier Mutationen innerhalb der putativen Signalpeptidsequenz des TGF-ß Typ I Rezeptors (TßRI) in B-Zellen TGF-ß resistenter CLL-Patienten beschrieben. Hierbei handelt es sich um einen Aminosäure-Austausch (L12Q) und eine ‚in-frame‘ Alanin-Deletion (A8) innerhalb einer aus 9 Alaninen bestehenden Sequenz. Es konnte gezeigt werden, daß diese Mutationen zwar keinen Einfluß auf Oberflächenexpression und Komplexbildungseigenschaften des TßRI haben, jedoch TGF-ß stimulierte Reportergeninduktion verringern, was eine kausale Beziehung bei der Entwicklung TGF-ß resistenter B-CLL-Zellen vermuten läßt. Ein Auftreten von Mutationen innerhalb der 9-Alanin-Sequenz des TßRI korreliert mit TGF-ß Insensitivität von B-CLL Zellen. Obwohl noch weitere Studien benötigt werden, um den präzisen molekularen Mechanismus zu verstehen, der zu TGF-ß Resistenz in B-CLL Zellen führt, kann spekuliert werden, daß TßRI Mutationen das Voranschreiten von B-CLL und evtl. anderen Tumorarten unterstützen. Gezieltes Screenen nach TßRI Signalpeptidsequenz Mutationen könnte demnach als prognostischer Indikator für Tumorprogression eingesetzt werden. N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) regulates a variety of cellular functions like proliferation, differentiation and apoptosis. It signals through membrane-bound serine/threonine kinase receptors, which upon stimulation phosphorylate Smad proteins, the intracellular signaltransducers, and thereby trigger their nuclear translocation and transcriptional activity. Although the three mammalian TGF-ß isoforms, TGF-ß1, -ß2 and –ß3, are highly homologous proteins, the phenotypes of their genknockouts reveal striking differences. Variability and specificity can be achieved on different levels of the TGF-ß signaltransduction. In this work an alternatively spliced variant of the TGF-ß type II receptor (TßRII), TßRII-B, is characterized, which in contrast to TßRII binds and mediates signaling of all TGF-ß isoforms. This signaling occurs via the Smad pathway and is independent of any supporting type III receptor (TßRIII). Therefore interaction and oligomerization of TßRII-B with the TGF-ß isoforms as well as the different TGF-ß receptor types was analyzed in detail. Furthermore we defined the characteristics of TGF-ß2 binding to TßRII-B. Expression studies demonstrate that TßRII-B expression is restricted to cells originating from tissues where the TGF-ß2 isoform has a predominant role. All that reflects the importance of this receptor splice-variant in TGF-ß isoform-specific signaling. The second part of this work focuses on the role of TGF-ß and its receptors in tumor development. B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common lymphoid cancer in Western societies, and is also currently incurable. B-cells from some B-CLL patients are resistant to the growth inhibitory effects of TGF-ß and show a different expression pattern of TGF-ß receptors at their cell surface. In this work the identification and characterization of two mutations within the putative signal sequence of the tßrI gene in B-cells from TGF-ß resistant B-CLL patients is described. Thereby a single aminoacid substitution (L12Q) is accompanied by an ‘in frame’ single alanine deletion within an 9-alanine stretch. It could be shown that this mutations do not mediate the apparent loss of functional TßRI in TGF-ß resistant B-CLL, but they attenuate reporter gene induction stimulated by TGF-ß, suggesting a causal relationship in the development of TGF-ß resistant B-CLL. The appearance of mutations within the 9-alanine stretch of the TßRI correlated with and predicted for B-CLL patient insensitivity to TGF-ß. Although more studies are needed to ascertain the precise molecular mechanism leading to TGF-ß resistance in B-CLL cells, it is tempting to speculate that these TßRI mutations may promote the progression of B-CLL and other cancers from their indolent to active states. This suggests that screening for TßRI signal sequence mutations can be employed as a prognostic indicator of B-CLL patient sensitivity to TGF-ß. KW - Transforming growth factor beta KW - Rezeptor KW - TGF-ß Rezeptoren KW - TßRII-B KW - chronische lymphatische Leukämie KW - Tumorgenese KW - TGF-ß receptors KW - TßRII-B KW - chronic lymphocytic Leukemia KW - tumorigenesis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180907 ER - TY - THES A1 - Löschberger, Anna T1 - Biologische Referenzstrukturen und Protokolloptimierung in der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie mit dSTORM T1 - Biological model structures and optimization of protocols in super-resolution fluorescence microscopy with dSTORM N2 - Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Sie ermöglicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herkömmlichen Methoden höhere Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverlässigkeit erst noch überzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Auflösungsvermögen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filamentöse Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar ist, als Modellstruktur für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie eingeführt. Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernhüllen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgelöst. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgelöst werden. Die Daten eigneten sich außerdem für eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln. Darüber hinaus wurden Zweifach-Färbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ansätze für Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardmäßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral überlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch für 3D-Messungen mit den Ansätzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernhülle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Krümmung des Zellkerns über die gefärbten Kernporen dargestellt. dSTORM-Messungen können nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erhältliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellulärer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM möglich sind. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernhüllen zuerst mit dSTORM hochaufgelöst und danach für die EM präpariert. Anschließend wurden zugehörige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine können somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Auflösung dargestellt werden. Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpräparation voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Prämisse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. Während bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zelluläre Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerstört werden, schützt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Präparationen werden unter Umständen erstmals in der Hochauflösung sichtbar. Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine mögliche DNA-Cross-Linking-Fähigkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolekülinformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt über die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunfähig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - lässt sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinität zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht. N2 - Localization microscopy is a new and promising imaging technique, which provides detailed insights into cellular organization and structural composition of cells with high spatial resolution. Due to the challenging preparation of samples and demanding imaging procedure, its potential and reliability had to be proven. Until recently the resolution has been shown mainly on microtubules, whose structure is already visible in confocal images. This thesis introduced the nuclear pore complex (NPC) as a more demanding model structure for super-resolution fluorescence microscopy as the structure of NPCs can not be resolved with conventional fluorescence microscopy. For this purpose nuclear envelopes of Xenopus laevis oocytes were highly resolved with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy). With this localization microscopy method it was further possible to resolve the eightfold symmetry of nuclear pore complexes with light microscopy for the first time. In addition the central channel could be resolved with a diameter of about 40 nm. Furthermore, the localizations were used for single particle averaging, a well known image analysis method from electron microscopy, to calculate an average structure. Double staining of NPCs was used to check the potential of two-color imaging with dSTORM. Beside the common way of sequential imaging with two clearly spectrally separated dyes, a spectral demixing approach with spectrally overlapping dyes was applied. Labeling the nuclear envelope was also suitable for 3D measurements using two different approaches, i.e. biplane and astigmatism. In this case, labeled NPCs of Xenopus laevis A6-cells were used to illustrate the bending of the nucleus. dSTORM can be applied not only in fixed but also in living cells. Immobile proteins such as H2B or lamin C are especially suitable for this approach. Using fusion proteins with SNAP-Tag or Halo-Tag, it was shown that photoswitching of commercially available organic dyes is possible in an endogenous cellular environment and thus enabeling dSTORM in living cells. Another aspect of this work covers correlative microscopy using dSTORM and scanning electron microscopy (SEM). Therefor nuclear envelopes of Xenopus laevis were first imaged with dSTORM and then prepared for SEM. After that, corresponding areas were imaged with SEM. The resulting correlative images showed clearly that - assuming one has appropriate samples - dSTORM and SEM can be fairly combined. This way specifically labeled proteins can be imaged with nearly molecular resolution in the context of their structural environment. Since the quality of localization microscopy strongly depends on sample preparation, ongoing developments of labeling protocols are required. On this premise an optimized labeling protocol called ClickOx was developed. ClickOx clearly preserves the fine structure of actin filaments and the fluorescence of fluorescent proteins when using copper-catalyzed azide-alkine-cycloaddition. Whereas fine cellular structures such as actin filaments are affected by reactive oxygen species (ROS) under standard clicking procedures, the new protocol, which contains an enzymatic oxygen scavenger, protects proteins and thus cellular structures from reactions with ROS. This demonstrates the importance of further developing even so called "well established" protocols, because some side effects may appear only in super-resolution. Another aspect adressed the influence of D1 on chromatin organization. Hints for a possible DNA cross-linking ability of D1 were collected using different microscopic approaches. The single-molecule information of dSTORM measurements was used to analyse chromatin aggregation induced by D1 expression. The results indicate that wildtype D1 can cross-link DNA with its AT-hooks. Consequently the loss-of-function mutant R10xG is unable to aggregate chromatin. Furthermore FRAP experiments were performed to demonstrate that only "true" AT-hooks in D1 have a strong affinity to chromatin, but not the so called "potential" AT-hooks. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Chromatin KW - Kernporen-Komplex KW - Click-Chemie KW - Korrelative Mikroskopie KW - Lokalisationsmikroskopie KW - dSTORM KW - super-resolution KW - Hochauflösung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102630 ER - TY - THES A1 - Brüning, Tanja T1 - Biomechanik des Wachslaufens bei Crematogaster (Decacrema)-Partnerameisen von Macaranga-Bäumen T1 - Biomechanics of waxrunning in Crematogaster (Decacrema) ant-partners of Macaranga-trees N2 - Durch die vorliegende Arbeit konnte die große Bedeutung biomechanischer Faktoren für die Ökologie und Evolution von Insekten-Pflanzen-Interaktionen, am Beispiel des Ameisenpflanzen-Mutualismus’ Crematogaster (Decacrema)-Macaranga aufgezeigt werden. Viele Macaranga-Ameisenpflanzen besitzen Sproßachsen mit einem Überzug epikutikulärer Wachskristalle. Nur die Ameisenpartner wachsbereifter Pflanzen können sich problemlos auf den Oberflächen ihrer Wirtspflanzen fortbewegen. Durch die rutschigen, wachsbereiften Sproßachsen werden generalistische Ameisenarten ferngehalten und damit die wachslaufenden Ameisenpartner vor Fraßfeinden und Konkurrenz geschützt. Die Wachsbarrieren fördern zudem die Wirtsspezifität innerhalb dieser Ameisen-Pflanzen-Symbiose und funktionieren so als ökologischer Isolationsmechanismus. Die mechanische Barrierefunktion der Wachsbereifung birgt eine Vielzahl ökologischer Konsequenzen für beide Mutualismuspartner. Ziel dieser Arbeit war es, die proximaten Einzelmechanismen dieser ökologisch wichtigen Barriere aufzuklären, d. h. die Ursache der Rutschigkeit wachsbereifter Macaranga-Oberflächen und den Mechanismus der Wachslauffähigkeit der spezialangepaßten Crematogaster (Decacrema)-Ameisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mehrere Mechanismen der Rutschigkeit wachsbereifter Macaranga-Sproßoberflächen für Insekten aufgezeigt werden. Durch die Fortbewegung von Insekten auf epikutikulären Wachskristallen werden Kristalle aus ihrem Verbund herausgebrochen und kontaminieren die Insektentarsen. Auf der Oberfläche der Haftorgane (Arolien) werden die Wachskristalle durch die Haftflüssigkeit partiell angelöst. Hierdurch entsteht ein amorpher Schmierfilm, der wahrscheinlich zu einer Verschlechterung der Haftleistung führt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß unabhängig vom Abbrechen der Kristalle und der Kontamination der Tarsen auch die Mikrorauhigkeit der Macaranga-Oberflächen zu einer Rutschigkeit der Sproßachse führen kann. Sie besitzt einen entscheidenden Einfluß auf die Haft- und Lokomotionsfähigkeit von Insekten. Die Rauhigkeit von Oberflächen führt zu einer Reduzierung der effektiven Kontaktfläche des Aroliums und verringert dadurch die Haftkräfte von Insekten. Die genannten Mechanismen der Rutschigkeit schließen sich nicht gegenseitig aus, sondern können einen synergistischen, bzw. additiven Effekt haben. Bei der Untersuchung der Wachslauffähigkeit der spezialisierten Macaranga-Partnerameisen zeigte sich, daß der unterschiedliche Lauferfolg verschiedener Crematogaster (Decacrema)-Morphospezies nicht auf einer größeren Haftung beruht, sondern vor allem auf einer günstigeren Laufkinematik der Wachsläufer. Durch morphometrische Untersuchungen an acht Crematogaster (Decacrema)-Arten konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, daß Wachsläufer längere Beine haben als Nichtwachsläufer. Diese längeren Beine können zu einem mechanischen Vorteil beim Klettern auf senkrechten Oberflächen führen, da sie zum einen ein weiteres Herumgreifen um den Ast ermöglichen und zum anderen aufgrund des längeren Hebelarms die auf die Vorderbeine wirkenden Zugkräfte reduzieren. Amputationsexperimente zeigten eindeutig, daß die prätarsalen Krallen entscheidend für das Laufen auf wachsbereiften Macaranga-Oberflächen sind, die prätarsalen Haftorgane (Arolien) hingegen nicht. Es ist zu vermuten, daß die Krallen durch das Eintauchen der Krallenspitzen in die Wachskristallschicht Halt finden, wodurch sie theoretisch auf senkrechten Oberflächen jeden Durchmessers Halt finden können. Obwohl quantitative Unterschiede in der Krallenmorphologie (Höhe, Länge und Krümmungsdurchmesser) zwischen Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern und -Nichtwachsläufern nachgewiesen werden konnten, bleibt unklar, ob diese überhaupt eine Rolle für die unterschiedliche Wachslauffähigkeit spielen oder ob eher das Bewegungsmuster während des Einsatzes der Krallen entscheidend ist. Auch bei Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern kommt es zu einem Abbrechen von Wachskristallen und einer Kontamination der Tarsen. Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufer zeigen im Vergleich zu -Nichtwachsläufern ein bisher nicht in der Literatur beschriebenes, Putzverhalten der Vorderbeine. Dieses Putzverhalten ist zeitsparend und effektiv in die Lokomotion der Tiere eingebunden und schließt selektiv nur die Reinigung der laufoberflächenkontaktierenden Tarsussegmente ein. Die hier beschriebenen Unterschiede in Morphologie, Kinematik und Verhalten zwischen Crematogaster (Decacrema)-Wachsläufern und -Nichtwachsläufern bringen funktionelle Vorteile der Wachsläufer auf den von ihnen besiedelten, wachsbereiften Macaranga-Pflanzenoberflächen mit sich. Die epikutikuläre Wachsbereifung kann als biomechanischer Schlüsselmechanismus angesehen werden, der im Rahmen der Evolution zu diesen vielschichtigen Veränderungen geführt hat. Die vorliegende Arbeit konnte zugrundeliegende biomechanische Faktoren, die auf beiden Seiten des Mutualismus’ eine Rolle spielen, aufklären. N2 - The present study illustrates the significance of biomechanical factors in the ecology and evolution of insect-plant interactions on the example of the ant-plant mutualism between Crematogaster (Decacrema) ants and -Macaranga trees. Many Macaranga ant-plants possess stems which are covered by epicuticular wax crystals. Only ant partners of waxy plants can move without any difficulty on the surfaces of their host plants. The slippery stems keep away generalist ant species and protect the waxrunning ants from predators and competitors and functions as an ecological isolation mechanism. The mechanical barrier function of the epicuticular wax crystal layer has several ecological consequences for both mutualistic partners. The goal of this study was to clarify the proximate mechanisms underlying this ecologically important barrier. In particular, I investigated why waxy Macaranga surfaces are slippery and how specially adapted Crematogaster (Decacrema) ants are capable of climbing the slippery waxy stems. In this study, several mechanisms underlying the slipperiness of waxy Macaranga stem surfaces were discovered. When moving on waxy stems, insects detach crystals from the compound structure and contaminate their tarsi. The adhesive secretion leads to a partial dissolution of the crystals on the surface of the adhesive pad (arolium). The resulting amorphous substance presumably results in reduced attachment. I showed that independent of detaching wax crystals and tarsal contamination, the slipperiness of the stem surface can also be caused by the microscopic surface roughness of waxy Macaranga surfaces. Microroughness has a major influence on adhesive and locomotive abilities of insects, because it reduces the adhesive pads’ effective contact area and their attachment forces. These mechanisms of slipperiness listed above do not exclude each other, but may have a synergistic or additive effect. The investigation of the waxrunning behaviour suggests that the difference in waxrunning capacity between Crematogaster (Decacrema) morphospecies does not rely on superior adhesion but on morphological and kinematic adaptations. Morphometric analysis of eight Crematogaster (Decacrema) species showed that waxrunners have longer legs than non-waxrunners. Longer legs may be a mechanically advantageous for vertical climbing, because on the one hand a branch can be encompassed further as well as the detachment forces acting on front legs can be reduced by having a larger lever arm. Kinematic analysis of climbing ants demonstrated that this effect is enhanced by the fact that waxrunners spread their legs more out during climbing. Furthermore, during vertical climbing of waxy surfaces the experimentally proved increased distance between front and hind legs of waxrunners can enhance the ant’s stability on these surfaces. Amputation experiments clearly showed that the pretarsal claws are crucial for running on waxy Macaranga surfaces. In contrast, adhesive pads were seldom in contact with the surface, and if so, with only little contact area. In addition, no effect of attachment enhancement could be demonstrated for adhesive pads. It can be assumed that claws attach by inserting their tips into the wax crystal layer, so that the ants are theoretically capable of attaching to any vertical surface, no matter which diameter the object has. Although I found quantitative differences in claw morphology (height, length and radius of curvature) between Crematogaster (Decacrema) waxrunners and non-waxrunners, it is still unclear if these parameters play a role for waxrunning ability or whether the movement pattern during claw usage is the decisive factor. Even Crematogaster (Decacrema) waxrunners break off wax crystals and have contaminated tarsi. I found that only the Crematogaster (Decacrema) waxrunners show a yet undocumented front leg grooming behaviour. This grooming behaviour is time saving and integrated effectively into the running pattern. The described differences in morphology, kinematics and behaviour between waxrunning und non-waxrunning Crematogaster (Decacrema) ants result in a functional advantage of waxrunners on their waxy host plants. The epicuticular wax layer represents a biomechanical key mechanism which has lead to complex changes during evolution. The presented study was able to clarify underlying biomechanical factors on both sides of this ant-plant mutualism. KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - Mutualismus KW - Kutikularwachs KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - Wachslaufen KW - Mutualismus KW - Crematogaster KW - Macaranga KW - waxrunning KW - mutualism Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21772 ER -