TY - THES A1 - Zunker, Katrin T1 - Untersuchungen zur Rolle der Mikrosatelliteninstabilität in hereditären Melanomen von Xiphophorus sowie zur Integrität von Elementen der Zellzykluskontrolle/DNA-Reparatur T1 - Genomic stability in hereditary malignant melanoma of Xiphophorus N2 - Die Bedeutung der genomischen Instabilität in humanen melanocytischen Läsionen ist Gegenstand vieler dermatologischer Studien und bis heute ungeklärt. Ist die Mikrosatelliteninstabilität bloße Begleiterscheinung der unkontrolliert proliferierenden Tumorzellen oder wird ihr ein pathogenetischer Mechanismus zuteil? In Fischen der Gattung Xiphophorus können durch klassische Kreuzungsexperimente melanocytische Läsionen verschiedener Malignitätsgrade induziert werden. Diese Läsionen sind auf Grund ihres genetisch kontrollierten Hintergrundes eindeutig definiert und reproduzierbar - und damit im Vorteil gegenüber der unsicheren Klassifikation humaner Hautläsionen. In der vorliegenden Arbeit wurde hauptsächlich der Frage nachgegangen, ob MIN+ ein obligates molekulares Ereignis für die Progression von Melanomen bis zum terminalen Stadium darstellt. Dieser Fragestellung wurde unter Verwendung PCR-basierter Mikrosatellitenanalysen sowie Multilocus DNA-Fingerprint Analysen nachgegangen. 23 Tumoren unterschiedlicher Malignität wurden im Vergleich zum tumorfreien Normalgewebe desselben Fisches an 12 Genloci unbekannter chromosomaler Lokalisation auf Mikrosatelliteninstabilität untersucht. Es wurde insgesamt eine Zahl von 263 informativen Loci erzielt, von denen sich nur 20 ( = 7.6%) als instabil erwiesen. Mittels der Multilocus-Fingerprint Analysen wurden 8 Melanome und deren korrespondiere Normalgewebe mit drei Sonden hybridisiert. Nur einer von 12 analysierbaren MLFPs zeigte eine genetische Aberration in Form einer Deletion einer einzelnen Bande im Tumorgewebe. Mit diesem Ergebnis wurde das in der Mikrosatellitenanalyse erhaltene Resultat einer nicht signifikanten Mikrosatelliteninstabilität im Xiphophorus-Melanom-Modell System bestätigt. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Abwesenheit eines MIN+-Phänotypen in den Melanomen von Xiphophorus darauf hinweist, daß der Erwerb von MIN weder ein notwendiges Kriterium für die Initiation eines Tumors noch für seine Progression darstellt. Ein anderer Pfad der Tumorinitiation ist die direkte Schädigung oder der Verlust von Tumorsuppressorgenen, von in Mismatch Repair involvierten Genen oder durch die Transformation von Proto-Onkogenen zu Onkogenen. In dieser Arbeit wurde die Expression von drei Genen, die in der Regulation des Zellzyklus Schlüsselrollen spielen (rb, p53, cdkn2a), sowie einer Komponente des MMR-Systems (MSH2) auf RNA-Ebene untersucht. Ihre Expressionsstärke wurde in folgenden Geweben miteinander verglichen: Maligne Melanome, benigne Läsionen, tumorfreie Kontrollgewebe und die Xiphophorus-Melanomzellinie (PSM). MSH2 und p53 wurden in allen untersuchten Geweben auf gleichem Niveau exprimiert. Die vergleichende Expressionsanalyse des vermeintlichen "melanoma susceptibility gene" cdkn2a im Melanom-Modell und der PSM-Zellinie bestätigte die bereits vorbeschriebene Überexpression des Zellzyklusinhibitors in malignen Melanomen von Xiphophorus-Hybriden. Die Untersuchung des Expressionsmusters von Rb in den oben genannten Geweben ergab eine verminderte Transkription dieses Gens in malignen Melanomen. Eine mögliche Interpretation dieses Ergebnisses wäre, einen Defekt in Rb oder pRB zu Grunde zu legen und die Hochregulation von cdkn2a entsprechend einer negativen Rückkopplungsschleife als physiologische Konsequenz anzusehen. N2 - Microsatellite instability is a feature of many tumours and is indicative of a generalized genomic instability of cancer cells. Whether this phenomenon is essential for tumorigenesis and whether it is an early or late step is still a matter of debate. In the Xiphophorus melanoma model, the primary steps leading to tumour formation are known and include overexpression of a mutationally altered epidermal growth factor receptor and the resulting defects in signalling. We have analysed the late stages of melanoma progression for microsatellite instability. Although several types of microsatellite allele alteration in DNA from tumours relative to DNA from non-tumour tissue were found, the frequency was rather low (7.6%). Thus, although the tumours show a wide range of malignancy and agressiveness, genomic instability that becomes apparent as microsatellite instability does not appear to be an obligatory step for melanoma progression. KW - Mikrosatellit KW - Melanom KW - Fisch KW - genetischer Fingerabdruck KW - Zellzykluskontrolle KW - Microsatellite KW - genomic stability KW - fish KW - hereditary melanoma KW - cell cycle control Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21736 ER - TY - THES A1 - Jenett, Arnim T1 - The Virtual Insect Brain Protocol : development and application of software for the standardization of neuroanatomy T1 - Das Virtual Insect Brain Protocol N2 - Since the fruit fly Drosophila melanogaster entered the laboratories as a model organism, new genetic, physiological, molecular and behavioral techniques for the functional analysis of the brain rapidly accumulated. Nowadays this concerted assault obtains its main thrust form Gal4 expression patterns that can be visualized and provide the means for manipulating -in unrestrained animals- groups of neurons of the brain. To take advantage of these patterns one needs to know their anatomy. This thesis describes the Virtual Insect Brain (VIB) protocol, a software package for the quantitative assessment, comparison, and presentation of neuroanatomical data. It is based on the 3D-reconstruction and visualization software Amira (Mercury Inc.). Its main part is a standardization procedure which aligns individual 3D images (series of virtual sections obtained by confocal microscopy) to a common coordinate system and computes average intensities for each voxel (volume pixel). The VIB protocol facilitates direct comparison of gene expression patterns and describes their interindividual variability. It provides volumetry of brain regions and helps to characterize the phenotypes of brain structure mutants. Using the VIB protocol does not require any programming skills since all operations are carried out at a (near to) self-explanatory graphical user interface. Although the VIB protocol has been developed for the standardization of Drosophila neuroanatomy, the program structure can be used for the standardization of other 3D structures as well. Standardizing brains and gene expression patterns is a new approach to biological shape and its variability. Using the VIB protocol consequently may help to integrate knowledge on the correlation of form and function of the insect brain. The VIB protocol provides a first set of tools supporting this endeavor in Drosophila. The software is freely available at http://www.neurofly.de. N2 - Seitdem die Taufliege Drosophila melanogaster als Modellorganismus Einzug in die Forschung erhalten hat, sammeln sich mehr und mehr genetische, physiologische und molekulare Techniken für die Funktionsanalyse des Gehirns an. Diese beruhen heutzutage meist auf Gal4 Expressionsmustern, die sichtbar gemacht werden können und eine gezielte Manipulierung von definierten Zellgruppen ermöglichen. Um Ergebnisse verschiedener Untersuchungen miteinander in Beziehung setzen zu können, muss man jedoch die typische Anatomie der zugrunde liegenden Expressionsmuster kennen. Diese Arbeit beschreibt das Virtual Insect Brain (VIB) Protokoll, eine Software für die Darstellung, die quantitative Einschätzung und den Vergleich von neuroanatomischen Daten, sowie einige exemplarische Anwendungen des VIB Protokolls. Die Software basiert auf der 3D-Rekonstruktions- und der Visualisierungs-Software Amira (Mercury Inc.). Sein Hauptbestandteil ist ein Normierungverfahren, das 3D-Bild-Stapel (Folgen virtueller Schnittbilder, erhalten durch konfokale Mikroskopie) auf ein gemeinsames Koordinatensystem abbildet und für jedes Voxel (dreidimensionaler Bildpunkt) die durchschnittliche Intensität berechnet. Das VIB Protokoll erleichtert dadurch den direkten Vergleich von Expressionsmustern und beschreibt ihre interindividuelle Variabilität. Es liefert volumetrische Messungen zu definierten Gehirnregionen und hilft, die durch Mutation entstehenden Veränderungen der Gehirnstruktur zu erkennen. Das Verwenden des VIB Protokolls erfordert keinerlei Programmierkenntnisse, da alle Vorgänge auf einer selbsterklärenden graphischen Benutzeroberfläche ausgeführt werden können. Obgleich das VIB Protokoll für die Normierung der Neuroanatomy von Taufliegen entwickelt worden ist, kann die Programmstruktur auch für die Normierung anderer 3D-Strukturen benutzt werden. Gehirne und Expressionsmuster zu standardisieren ist ein neuer Ansatz die Variabilität der Neuroanatomie zu hinterfragen. Bei konsequenter Verwendung kann das VIB Protokoll helfen Wissen über Form und Funktion des Insektengehirns zu miteinander zu vernetzen. Das VIB Protokoll liefert einen ersten Satz Werkzeuge, die diese Bemühung in der Taufliege ermöglichen. Die Software kann kostenfrei von http://www.neurofly.de herunter geladen werden. KW - Taufliege KW - Gehirn KW - Neuroanatomie KW - Software KW - Drosophila melanogaster KW - Standardgehirn KW - Neuroanatomie KW - VIB KW - standardization KW - software Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22297 ER - TY - JOUR A1 - Poethke, Hans J. A1 - Pfenning, Brenda A1 - Hovestadt, Thomas T1 - The relative contribution of individual and kin selection to the evolution of density-dependent dispersal rates N2 - Questions: What are the relative contributions of kin selection and individual selection to the evolution of dispersal rates in fragmented landscapes? How do environmental parameters influence the relative contributions of both evolutionary forces? Features of the model: Individual-based simulation model of a metapopulation. Logistic local growth dynamics and density-dependent dispersal. An optional shuffling algorithm allows the continuous destruction of any genetic structure in the metapopulation. Ranges of key variables: Depending on dispersal mortality (0.05-0.4) and the strength of environmental fluctuations, mean dispersal probability varied between 0.05 and 0.5. Conclusions: For local population sizes of 100 individuals, kin selection alone could account for dispersal probabilities of up to 0.1. It may result in a ten-fold increase of optimal dispersal rates compared with those predicted on the basis of individual selection alone. Such a substantial contribution of kin selection to dispersal is restricted to cases where the overall dispersal probabilities are small (textless 0.1). In the latter case, as much as 30% of the total fitness of dispersing individuals could arise from the increased reproduction of kin left in the natal patch. KW - dispersal rate KW - dynamics KW - environmental correlation KW - evolutionary modelling KW - genetics KW - individual-based model KW - kin competition Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48225 ER - TY - JOUR A1 - Hovestadt, Thomas A1 - Mitesser, Oliver A1 - Elmes, Graham A1 - Thomas, Jeremy A. A1 - Hochberg, Michael E. T1 - An Evolutionarily Stable Strategy model for the evolution of dimorphic development in the butterfly Maculinea rebeli, a social parasite of Myrmica Ant Colonies N2 - Caterpillars of the butterfly Maculinea rebeli develop as parasites inside ant colonies. In intensively studied French populations, about 25% of caterpillars mature within 1 year (fast-developing larvae [FDL]) and the others after 2 years (slow-developing larvae [SDL]); all available evidence indicates that this ratio is under the control of egg-laying females. We present an analytical model to predict the evolutionarily stable fraction of FDL (pESS). The model accounts for added winter mortality of SDL, general and kin competition among caterpillars, a competitive advantage of SDL over newly entering FDL (priority effect), and the avoidance of renewed infection of ant nests by butterflies in the coming season (segregation). We come to the following conclusions: (1) all factors listed above can promote the evolution of delayed development; (2) kin competition and segregation stabilize pESS near 0.5; and (3) a priority effect is the only mechanism potentially selecting for. However, given the empirical data, pESS is predicted to fall closer to 0.5 than to the 0.25 that has been observed. In this particular system, bet hedging cannot explain why more than 50% of larvae postpone growth. Presumably, other fitness benefits for SDL, for example, higher fertility or longevity, also contribute to the evolution of delayed development. The model presented here may be of general applicability for systems where maturing individuals compete in small subgroups. KW - delayed development KW - growth dimorphism KW - evolutionarily stable strategy (ESS) KW - ant-butterfly interaction KW - social parasitism Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48165 ER - TY - JOUR A1 - Mitesser, Oliver A1 - Weissel, Norbert A1 - Strohm, Erhard A1 - Poethke, Hans-Joachim T1 - Adaptive dynamic resource allocation in annual eusocial insects: Environmental variation will not necessarily promote graded control N2 - Background: According to the classical model of Macevicz and Oster, annual eusocial insects should show a clear dichotomous "bang-bang" strategy of resource allocation; colony fitness is maximised when a period of pure colony growth (exclusive production of workers) is followed by a single reproductive period characterised by the exclusive production of sexuals. However, in several species graded investment strategies with a simultaneous production of workers and sexuals have been observed. Such deviations from the "bang-bang" strategy are usually interpreted as an adaptive (bet-hedging) response to environmental fluctuations such as variation in season length or food availability. To generate predictions about the optimal investment pattern of insect colonies in fluctuating environments, we slightly modified Macevicz and Oster's classical model of annual colony dynamics and used a dynamic programming approach nested into a recurrence procedure for the solution of the stochastic optimal control problem. Results: 1) The optimal switching time between pure colony growth and the exclusive production of sexuals decreases with increasing environmental variance. 2) Yet, for reasonable levels of environmental fluctuations no deviation from the typical bang-bang strategy is predicted. 3) Model calculations for the halictid bee Lasioglossum malachurum reveal that bet-hedging is not likely to be the reason for the graded allocation into sexuals versus workers observed in this species. 4) When environmental variance reaches a critical level our model predicts an abrupt change from dichotomous behaviour to graded allocation strategies, but the transition between colony growth and production of sexuals is not necessarily monotonic. Both, the critical level of environmental variance as well as the characteristic pattern of resource allocation strongly depend on the type of function used to describe environmental fluctuations. Conclusion: Up to now bet-hedging as an evolutionary response to variation in season length has been the main argument to explain field observations of graded resource allocation in annual eusocial insect species. However, our model shows that the effect of moderate fluctuations of environmental conditions does not select for deviation from the classical bang-bang strategy and that the evolution of graded allocation strategies can be triggered only by extreme fluctuations. Detailed quantitative observations on resource allocation in eusocial insects are needed to analyse the relevance of alternative explanations, e.g. logistic colony growth or reproductive conflict between queen and workers, for the evolution of graded allocation strategies. KW - Insekten KW - Fitness KW - Evolution KW - Sozialität KW - resource allocation KW - fitness KW - evolution KW - eusociality KW - insect Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45412 ER - TY - THES A1 - Link, Stefanie T1 - Molekulare Charakterisierung des Filamentösen Hämagglutinins von Bordetella holmesii T1 - Molecular characterization of the filamentous hemagglutinin of Bordetella holmesii N2 - Zur Gattung Bordetella zählen derzeit neun verschiedene Arten Gram-negativer Bakterien. Der strikt humanpathogene Keim B. pertussis ist der Erreger des Keuchhustens und stellt das wohl wichtigste Mitglied der Gattung dar. B. holmesii gehört zu den sogenannten neuen Bordetella-Arten und wurde 1995 erstmals von Weyant et al. beschrieben. In den letzten Jahren gewann B. holmesii als humanpathogener Keim, der Keuchhusten-ähnliche Erkrankungen verursacht, zunehmend an Bedeutung. Mit Ausnahme des BvgAS-Systems (Gerlach et al., 2004) konnten in B. holmesii bislang keine für die „klassischen“ Bordetella-Arten bekannten Virulenzfakoren nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein zum Filamentösen Hämagglutinin homologer Faktor in B. holmesii identifiziert. Der fhaB-Locus aus B. holmesii unterscheidet sich deutlich von dem der anderen Bordetella-Arten, da die fhaB-Sequenz in B. holmesii (fhaBBH) stromaufwärts von einem putativen Membranprotein und stromabwärts von einem IS1001-ähnlichen IS-Element flankiert wird. Sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene weist das fhaBBH-Gen die größte Ähnlichkeit zu dem fhaB-Homolog aus B. avium auf, was die Vermutung bestärkt, dass B. holmesii phylogenetisch im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Durch in silico-Analysen der FhaBBH-Aminosäuresequenz konnte eine N-terminale Signalpeptiddomäne sowie eine TPS-Domäne identifiziert werden. Dies lässt vermuten, dass FHABH an die bakterielle Oberfläche transportiert und möglicherweise sekretiert wird. Anhand von in silico-Analysen wurde zudem ein KGD-Motiv, nicht jedoch eine Heparinsulfat- und eine Kohlenhydratbindedomäne im FhaBBH identifiziert. Das KGD-Motiv könnte das RGD-Motiv im FHA der „klassischen“ Bordetella-Arten bei der Erkennung von Rezeptoren ersetzen. In Zellkultur-Experimenten konnte die Adäsionsfähigkeit von B. holmesii G7702 an A549-Zellen nachgewiesen werden. Eine fhaB-Deletionsmutante des entsprechenden Stammes zeigte dagegen eine signifikant niedrigere Adhäsionsrate an die menschlichen Lungenepithelzellen. Somit konnte gezeigt werden, dass FHA in B. holmesii eine Rolle als Adhäsionsfaktor spielt. Die im Vergleich zum Wildtyp stark verringerte Adhäsionsrate der bvgA-Mutante von B. holmesii G7702 lässt zudem auf die Beteiligung weiterer Adhäsionsfaktoren an der Wirtszelladhäsion in B. holmesii und deren Regulation durch das BvgAS-Systems schließen. Die Regulationsstudien haben gezeigt, dass die fhaB-Transkription in B. holmesii über zwei konstitutiv aktive Promotoren und einen bvg-abhängigen Promotor erfolgt. In vitro ist phosphoryliertes BvgABH in der Lage, spezifisch an die fhaB-upstream-Region aus B. holmesii zu binden. Innerhalb der fhaBBH-upstream-Region wurden drei putative BvgA-Bindestellen BS2-4 identifiziert, die Ähnlichkeiten zu inverted repeat-Anordnungen der BvgA-Konsensussequenz 5’- T/A T T C C/T T A -3’ aufweisen. Basierend auf den Ergebnissen der in vitro-Binde- und in vivo-Expressionsstudien zur Charakterisierung der einzelnen putativen BvgABH-Bindestellen wird ein Modell für die BvgABH-Bindung innerhalb des fhaB-Promotors in B. holmesii vorgeschlagen. Demnach wird zunächst die primäre BvgABH-Bindestelle BS2 mit der höchsten Affinität von BvgABH-P gebunden, wobei für BvgABH-P eine Dimerisierung angenommen wird. Anschließend bindet ein zweites BvgABH-P-Dimer an die als sekundäre Bindestelle bezeichnete BS3-Region, die sich stromabwärts von BS2 befindet. Eine möglicherweise darauf folgende unspezifische Anlagerung von zwei weiteren BvgABH-P-Dimeren an den 37 bp großen DNA-Abschnitt zwischen BS2 und BS3 ist, ebenso wie die Besetzung der niedrigaffinen Bindestelle BS4 durch ein weiteres BvgABH-P-Dimer, hauptsächlich auf kooperative Protein-Protein-Wechselwirkungen zurückzuführen. Das an BS4 gebundene BvgABH-P-Dimer befindet sich am weitesten stromabwärts und könnte zusammen mit der RNA-Polymerase die Initiation der Transkription gewährleisten. Ergebnisse aus den in vitro-Bindestudien sowie die unterschiedliche Zusammensetzung und Anordnung der putativen BvgA-Bindestellen der fhaB-Promotoren aus B. holmesii und B. pertussis deuten auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Promotoren hin. So scheint der fhaB-Promotor aus B. holmesii, im Vergleich zum fhaB-Promotor aus B. pertussis, erst bei höheren Konzentrationen an phosphoryliertem BvgA gebunden und somit aktiviert zu werden. In B. holmesii wird vermutlich die konstitutive FHA-Synthese nach BvgAS-Stimulation durch die bvg-abhängige fhaBBH-Expression unterstützt, um eine erfolgreiche Infektion des Wirtes zu gewährleisten. N2 - The Bordetella genus which are Gram-negative bacteria include nine species. The most important member of this genus is Bordetella pertussis, a strictly human pathogen and the agent of whooping cough. B. holmesii belongs to the so-called new Bordetella species and has been described for the first time in 1995 by Weyant et al.. Over time it has emerged as an important pathogen, which can cause pertussis-like disease in humans. Except for the bvgAS locus no “classical” virulence factors have been detected in B. holmesii so far. Here it was possible to identify a fhaB-homologous gene in B. holmesii G7702 (fhaBBH). The fhaBBH upstream region was found to contain an open reading frame, orfMP, encoding an putative membrane protein, which is also present in B. bronchiseptica and B. parapertussis. An IS1001-like IS element is located downstream of fhaB in B. holmesii (Karin Schmitt, personal communication). Thus the fhaB locus of B. holmesii exhibits significant differences compared to that of the B. bronchiseptica cluster and the other “new” Bordetella species. Sequence alignments indicated, that fhaB of B. holmesii is most similar to the homologue of B. avium on DNA as well as on protein level. This suggests a phylogenetic position of B. holmesii near B. avium. FhaBBH contains an N-terminal signal peptide domain, which in general is necessary for the sec-depending transport of proteins through the cytoplasmic membrane. Furthermore, a so-called TPS domain could be identified inside the FhaB of B. holmesii, suggesting the transport of FHABH to the bacterial surface and possibly secretion. Sequence analysis of FhaBBH also revealed a KGD motif, but no heparin binding and no carbohydrate binding site could be identified. Possibly the KGD motif could replace the RGD motif of “classical” FHA in receptor recognition. Cell culture experiments demonstrated that B. holmesii G7702 is able to adhere to A549 cells and that filamentous haemagglutinin plays a role as adhesion factor in B. holmesii. Thus the strain B. holmesii G7702 fhaB-, in which fhaBBH is deleted, exhibited a significantly lower adhesion rate compared to the wildtype strain. Furthermore, for the strain B. holmesii G7702 bvgA::kan, which cannot produce BvgA, a significant lower adhesion rate compared to B. holmesii G7702 and B. holmesii G7702 fhaB- could be observed. This leads to the assumption that fhaB expression in B. holmesii depends on BvgASBH. The adhesion behaviour of B. holmesii G7702 bvgA::kan also shows that in addition to FHA other adhesion factors, which are presumably regulated by the BvgASBH system, seem to be involved in host cell adhesion of B. holmesii. The regulation studies indicated, that fhaB transcription in B. holmesii can occur from three different promotors, two of which are constitutive (P1 and P2) and one which is under the control of the BvgASBH system (P3). In vitro, the phosphorylated form of BvgABH is able to bind to the fhaB upstream region of B. holmesii specifically. Inside the fhaB upstream region of B. holmesii, three putative BvgABH binding sites could be identified. These regions, named BS2-4, exhibit similarities to “inverted repeat” structures of the BvgA consensus sequence 5’- T/A T T C C/T T A -3’. Based on the in vitro and in vivo results concerning the characterization of the putative BvgABH binding sites, a model for BvgABH binding inside the fhaBBH upstream region was developed. According to that, BvgABH-P binds as a dimer first to the primary binding site BS2 with a high affinity. After that a second BvgABH-P dimer binds to BS3 inside the secondary binding region, which is located downstream of BS2. A possibly subsequent unspecific binding of two additional BvgABH-P dimers to the region between BS2 and BS3 and the occupation of BS4 results exclusively from cooperative protein-protein interactions. The BvgABH-P dimer, which binds to BS4, is located downstream and presumably interacts with the RNA polymerase in order to initiate fhaBBH transcription. Results from in vitro binding studies as well as the divergent structure and localisation of BvgA binding sites inside the fhaB promotors of B. holmesii and B. pertussis suggest a differential regulation of these two promotors. For activation of fhaB promotor of B. holmesii, higher concentrations of phosphorylated response regulator seem to be necessary compared to that for fhaB promotor activation in B. pertussis. Presumably in B. holmesii the constitutive fhaBBH expression is supported by the bvg-dependent fhaBBH expression as a result of a BvgASBH stimulating signal in order to guarantee successful infection of the host. KW - Bordetella KW - Adhäsine KW - Molekularbiologie KW - Bordetella holmesii KW - Filamentöses Hämagglutinin KW - BvgAS-System KW - Bordetella holmesii KW - filamentous hemagglutinin KW - bvgAS system Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23049 ER - TY - THES A1 - Wittmann, Stefanie T1 - LOH- und Expressionsanalysen zur Identifikation neuer prognostischer Marker in Wilms Tumoren T1 - LOH and expression analyses for the identification of new prognostic markers in Wilms tumors N2 - Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, zählt zu den im Kindesalter am häufigsten auftretenden malignen Tumoren und entsteht meist unilateral (90 – 95 %) und sporadisch (98 – 99 %). Leider sind bis heute die molekularen Ursachen, die zur Entwicklung dieser Tumoren führen nur unzureichend aufgeklärt. So werden bisher nur drei Gene mit dem Auftreten von WT in Verbindung gebracht: WT1, CTNNB1 und WTx. Während WT1 und CTNNB1 jeweils Mutationsraten von etwa 10 – 15 % aufweisen, die zudem häufig gemeinsam vorliegen, werden für WTx Mutationsraten von etwa 30 % beobachtet. Die genetischen Alterationen der anderen Tumoren sind noch immer komplett unbekannt. Ziel dieser Arbeit war aus diesem Grund die Identifikation von relevanten Regionen und Genen, die an der Entstehung bzw. dem klinischen Fortschreiten von Wilms Tumoren beteiligt sind. Zusätzlich sollten weitere Untersuchungen zur Einschätzung ihres prognostischen Potenzials dienen. In einem ersten Ansatz wurden die Chromosomenbereiche 11q und 16q in einer großen Anzahl von Wilms Tumoren auf LOH (=loss of heterozygosity), d.h. den (partiellen) Verlust von genetischem Material, untersucht. In beiden Fällen wurden erhöhte LOH-Raten von etwa 20 % beobachtet, jedoch war keine Eingrenzung der relevanten Regionen möglich, da Allelverluste nicht stets ab einem bestimmten Marker beobachtet wurden. Ein Vergleich mit der Histologie ergab signifikante Assoziationen der Allelverluste mit anaplastischen und Mischtyp-Tumoren (nur für LOH 11q), wohingegen kaum LOHs in epithelialen und stromareichen Tumoren festgestellt wurden. Somit scheinen auf 11q und 16q Gene vorzuliegen, die einerseits die Differenzierung in Epithel und Stroma begünstigen oder andererseits ein blastemreiches und anaplastisches Erscheinungsbild verhindern. Jedoch könnte auch die Assoziation von bestimmten Subtypen mit LOH 11q und 16q auf eine Entstehung aus unterschiedlichen Zellen hindeuten. Weiterhin war das Auftreten von LOH, v.a. wenn jeweils der komplette Chromosomenarm betroffen war, mit einem erhöhten Rezidiv- und Sterberisiko (nur LOH 11q) verbunden. Somit konnte gezeigt werden, dass LOH-Untersuchungen auf 11q und 16q zur Identifikation von Hochrisikopatienten für die Entwicklung von Rezidiven bzw. erhöhter Mortalität eingesetzt werden können, wodurch eine individuelle Anpassung der Therapiemaßnahmen ermöglicht wird. In einem zweiten Ansatz wurden eine Reihe von bereits publizierten potenziellen Markergenen in einer großen Anzahl von Wilms Tumoren mit Hilfe der Realtime RT-PCR auf ihre Relevanz überprüft. Allen diesen Genen wurde zuvor eine Funktion bei der histologischen Klassifikation der Tumoren bzw. bei der Vorhersage bestimmter klinischer Verläufe zugeschrieben. Die univariate Analyse diente der Beurteilung der Relevanz einzelner Gene, wohingegen die multivariate Analyse zur Bestimmung von prognostischen Genkombinationen eingesetzt wurde. Anschließend erfolgte die Validierung mittels eines zweiten und unabhängigen Tumorsatzes. Auch wenn viele der bereits publizierten Marker und in der ersten Analyse erhaltenen Assoziationen in einem weiteren und unabhängigen Tumorsatz nicht verifizierbar waren, konnten dennoch einige frühere Ergebnisse repliziert und die Relevanz der entsprechenden Gene nachgewiesen werden. Neben der Verbindung der Repression von HEY2 und TRIM22 mit Hochrisikotumoren bzw. einer höheren Sterbewahrscheinlichkeit fanden sich schwach signifikante Assoziationen auch für die verminderte Expression von TRIM22 und VEGF mit der Histologie. Ebenso waren erhöhte Level von TERT und die Repression von TRIM22 mit der Entwicklung eines Rezidivs verbunden. Vor allem aber die Korrelation der Repression von HEY2 und VEGF sowie einer Überexpression von CA9 mit Rezidiven, Tumoren hoher Malignität oder primären Metastasen verweisen auf die Notwendigkeit, besonders die Hypoxie- und Angiogenese-Signalkaskaden in Wilms Tumoren zu untersuchen, um deren Einfluss v.a. auf das Fortschreiten und die Ausbreitung der Tumoren zu evaluieren. Auch wenn die multivariate Analyse nicht zu relevanten Genkombinationen führte, konnte hier dennoch eine schwache Assoziation der verminderten Expression von TOP2A und TRIM22 mit primären Metastasen oder einer erhöhten Mortalität, sowie der Überexpression von TERT mit der Rezidivbildung bestätigt werden. Interessanterweise stellte sich die Histologie, die derzeit das Hauptkriterium für die Risikoklassifikation darstellt, weder als geeigneter prognostischer Marker für die Beurteilung des Rezidiv- noch des Sterberisikos heraus. Somit sollten Realtime RT-PCR Analysen in Zukunft als weiterer Faktor zur Beurteilung des Rezidiv- und Sterberisikos eingesetzt werden, um eine individuelle Anpassung der Therapie zu ermöglichen. Basierend auf den Ergebnissen der Realtime RT-PCR Analyse wurde der Einfluss der Expression ausgewählter Gene auf Primärkulturen, die aus nativem Wilms Tumormaterial gewonnen wurden, untersucht. Nach der Überexpression von HEY2, EGR1, MYCN und TRIM22 wurden bei allen Zellen hohe Sterberaten beobachtet, v.a. bei HEY2 und EGR1. Leider konnte weder für HEY2 noch für EGR1 der Grund hierfür aufgeklärt werden, allerdings war bei EGR1 weder die Apoptose noch die Seneszenz beteiligt. Im Gegensatz hierzu wurde die Apoptose als entscheidender Mechanismus bei MYCN und v.a. TRIM22 ermittelt. Außerdem scheint bei MYCN ein großer Anteil an Zellen in die Seneszenz einzutreten. Auch wenn diese ersten Untersuchungen an Primärkulturen von Wilms Tumoren eindeutig die Relevanz dieser Gene für die Entwicklung bzw. das Fortschreiten der Tumoren bestätigten, so sind trotz alledem weitere Experimente v.a. in einer größeren Anzahl genetisch unterschiedlicher Primärkulturen nötig, um das endgültige Potenzial dieser Gene aufzuklären. N2 - Wilms tumor (WT), also called Nephroblastoma, belongs to the most common malignant tumors occurring in childhood. Most of these Wilms tumors develop unilaterally (90 – 95 %) and sporadically (98 – 99 %). Unfortunately, only little is known about the molecular background underlying their development with only three genes known so far: WT1, CTNNB1 and WTx. Mutations in WT1 and CTNNB1 occur only in a minor fraction of Wilms tumors of about 10 - 15 % and are often associated with each other, while mutations in WTx can be found in about 30 % of tumors. The genetic alterations of the other tumors are completely unknown. Hence, the aim of this thesis was to identify important regions and genes that are involved in Wilms tumor formation and/or progression and to further characterize their potential as markers for the prediction of certain clinical outcomes. First, chromosome arms 11q and 16q were screened for LOH (= loss of heterozygosity), which means the (partial) loss of the genome in a cell, in a large cohort of Wilms tumors. In both regions LOH rates of about 20 % were detected, but since allele losses did not always start at the same marker in the different tumors it was not possible to delimit any relevant subregions. Since there were significantly higher rates of allele loss in anaplastic and mixed-type (only 11q) tumors and almost no allele loss in epithelial and stromal tumors, 11q and 16q must contain genes that either facilitate the epithelial and stromal differentiation of cells or hamper the appearance of blastemal and anaplastic phenotypes. Otherwise, the obvious possibility to discriminate these histological subtypes by allele loss on 11q and 16q might be explained by a development from different precursor cells. Higher rates of LOH could also be linked to higher risks for relapse and death (11q only), especially when the whole chromosome arms were involved. Therefore, investigation of LOH on 11q and 16q may help to adjust the therapeutic regimens by identifying high-risk patients for relapse and death. A second approach was to reinvestigate the expression of a number of published marker genes in a larger set of Wilms tumors with a uniform method, the realtime RT-PCR. All of the genes were suggested to facilitate classification and/or prediction of certain clinical outcomes. Univariate analysis was performed to screen for relevant genes, followed by multivariate analysis to search for predictive gene combinations. Finally, validation of associations found in the first cohort was performed in a second and independent tumor set. Unfortunately, many of the previously published markers as well as associations of the first tumor set could not be verified in a new and independent tumor set. Nevertheless, it was possible to replicate the results of a number of genes and evidence their prognostic relevance. These included the repression of HEY2 and TRIM22 for high-risk tumors or mortality. Weaker correlations were verified for the repression of TRIM22 and VEGF with the histological risk and for overexpression of TERT and repression of TRIM22 with later relapse. Since the weaker expression of HEY2 and VEGF as well as the overexpression of CA9 was significantly linked to relapse, high malignant tumors or metastasis the hypoxia / angiogenesis pathways should be investigated in Wilms tumors especially with regard to the progression and spreading of tumors. Finally, multivariate analysis substantiated a weak association of repression of TOP2A and TRIM22 with metastasis or death and of overexpression of TERT with subsequent relapse. Most interestingly, histology, the current gold standard used for prediction of risks for relapse and death, could not be verified as potent prognostic factor for neither of them. Hence, realtime RT-PCR analyses can aid in stratification of tumors and prediction of relapse and death risks to intensify therapy for high-risk patients on one hand and to reduce therapy and side-effects in low-risk patients on the other hand. Based on the results of the realtime RT-PCR analyses the expression of several genes was ascertained in primary cell cultures cultivated from native Wilms tumor material. Overexpression of MYCN, TRIM22 and especially HEY2 and EGR1 by viral transduction resulted in high rates of cell death. Unfortunately, the underlying mechanism of death could be determined neither for HEY2 nor for EGR1, though for EGR1 the involvement of apoptosis and senescence could be excluded. In contrast, death in MYCN and especially in TRIM22 overexpressing cells could be attributed to high rates of apoptosis. Furthermore, a large fraction of MYCN cells seem to enter cell senescence and stop to proliferate. These results clearly corroborate the proposed relevance of the investigated genes in the development and/or progression of Wilms tumors. Nevertheless, further experiments in different primary cell cultures of Wilms tumors are necessary to clarify the real potential of these genes. KW - Nephroblastom KW - Real time quantitative PCR KW - LOH 11q KW - LOH 16q KW - lentivirale Transduktion KW - nephroblastoma KW - LOH 11q KW - LOH 16q KW - quantitative RT-PCR KW - lentiviral transduction Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24891 ER - TY - THES A1 - Robubi, Armin T1 - RAF Kinases: Pathway, Modulation and Modeling T1 - RAF Kinase: Signalweg, Modulation und Modellierung N2 - The Ras/RAF/MEK/ERK cascade is a central cellular signal transduction pathway involved in cell proliferation, differentiation, and survival where RAF kinases are pivotal kinases implicated in cancer. The development of specific irreversible kinase inhibitors is a rewarding but difficult aim. CI-1033 was developed to irreversibly inhibit erbB receptor tyrosine kinases by reacting to the Cys113 residue (p38alpha MAP kinase numbering) of the kinase domain. In this study we tried a similar approach to target the RAF oncoproteins which posses a similar cysteine at position 108 in the hinge region between the small n-lobe and the large c-lobe of the kinase domain. A novel synthetic approach including a lyophilization step allowed us the synthesis of a diphenyl urea compound with an epoxide moiety (compound 1). Compound 1 possessed inhibitory activity in vitro. However our time kinetics experiments and mass spectroscopic studies clearly indicate that compound 1 does not react covalently with the cysteine residue in the hinge region. Moreover, in cell culture experiments, a strong activation of the RAF signaling pathway was observed, an effect which is known from several other RAF kinase inhibitors and is here reported for the first time for a diphenyl urea compound, to which the clinically used unspecific kinase inhibitor BAY 43-9006 (Sorafinib, Nexavar) belongs. Although activation was apparently independent on B- and C-RAF hetero-oligomerization in vitro, in vivo experiments support such a mechanism as the activation did not occur in starved knockout cells lacking either B-RAF or C-RAF. Furthermore, we developed a mathematical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade demonstrating how stimuli induce different signal patterns and thereby different cellular responses, depending on cell type and the ratio between B-RAF and C-RAF. Based on biochemical data for activation and dephosphorylation, we set up differential equations for a dynamical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade. We find a different signaling pattern and response result for B-RAF (strong activation, sustained signal) and C-RAF (steep activation, transient signal). We further support the significance of such differential modulatory signaling by showing different RAF isoform expression in various cell lines and experimental testing of the predicted kinase activities in B-RAF, C-RAF as well as mutated versions. Additionally the effect of the tumor suppressor DiRas3 (also known as Noey2 or ARHI) on RAF signaling was studied. I could show that DiRas3 down-regulates the mitogenic pathway by inhibition of MEK, a basis for a refined model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade. N2 - Die Ras/RAF/MEK/ERK Kaskade ist ein zentraler zellulärer Signalweg, der bei der Regulierung der Proliferation, Differenzierung und Überleben der Zelle eine entscheide Rolle spielt. Dabei kommt den RAF Kinasen eine Schlüsselrolle bei der Tumorgenese zu. Die Entwicklung von spezifischen irreversiblen Kinasehemmern stellt einen attraktiven, jedoch schwierigen Ansatz zur Tumorsupression dar. CI-1033 wurde erfolgreich mit dem Ziel entwickelt, ErbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen irreversibel zu inhibieren, indem es kovalent mit dem Cys113 (p38alpha MAP Kinase Nummerierung) in der Kinase-Domäne reagiert. In dieser Arbeit wird ein vergleichbarer Ansatz gegen die RAF-Onkoproteine verfolgt, die einen analogen Cystein-Rest in der Position 108 aufweisen. Dieser ist in der Hinge-Region zwischen dem kleinen n-lobe und dem großen c-lobe der Kinase-Domäne lokalisiert. Ein neuer synthetischer Ansatz, der einen Lyophilisierungsschritt mit einschloss, erlaubte hierfür die Synthese einer Diphenylharnstoff-Verbindung mit einer Epoxidgruppe (Verbindung 1). Verbindung 1 zeigt in vitro tatsächlich eine inhibitorische Aktivität gegen RAF-Kinasen. Jedoch zeigen unsere zeitkinetischen Experimente, sowie unsere massenspektrometrischen Analysen, dass Verbindung 1 keine kovalente Bindung mit dem Cystein-Rest in der Hinge-Region bildet. Außerdem stellten wir in Zellkulturexperimenten eine starke Aktivierung des RAF-induzierten Signalweges fest; ein Effekt, der bereits für andere RAF-Kinase-Inhibitoren beschrieben wurde, jedoch hier erstmalig auch für eine Diphenylharnstoff-Verbindung, zu der auch BAY 43-9006 (Sarafinib, Nexavar) gehört. BAY 43-9006 ist ein unspezifischer, für die Behandlung von Krebs zugelassener, Kinase Inhibitor. Obwohl die Aktivierung in vitro scheinbar unabhängig von einer Heterooligomerisierung von B-RAF und C-RAF war, unterstützen in vivo Experimente einen solchen Mechanismus, da in gehungerten knockout Zellen, in denen B-RAF oder C-RAF fehlte, keine Aktivierung beobachtet werden konnte. Des Weiteren zeigten wir in einem mathematischen Modell, wie abhängig vom B-RAF/C-RAF-Verhältnis verschiedene Zellantworten durch unterschiedliche Stimuli induzierbar werden. Basierend auf biochemischen Daten über Aktivierung und Dephosphorylierung sowie auf den Differentialgleichungen unseres Rechenmodells fanden wir eine unterschiedliche Signalkinetik für B-RAF (starke Aktivierung, anhaltendes Signal) und C-RAF (schwache Aktivierung, transientes Signal). Die Bedeutung dieser differenzierten Signalmodifikation wurde auch durch unterschiedliche Expression der RAF Isoformen in verschiedenen Zelllinien und durch die experimentelle Messung der Kinaseaktivität von B- und C-RAF sowie mutierte Formen überprüft. Zusätzlich wurde der Effekt des Tumorsupressorproteins DiRas3 (auch bekannt als Noey2 oder ARHI) auf den RAF-Signalweg untersucht. Wir konnten zeigen, dass DiRas3 den mitogenen Signalweges durch Inhibierung der mitogen-aktivierten Proteinkinase Kinase (MEK) negativ reguliert, eine Basis für ein verfeinertes Modell der Ras/RAF/MEK/ERK Kaskade. KW - Systembiologie KW - RAf KW - BAY 43-9006 KW - Sorafinib KW - Nexavar KW - DiRas3 KW - Noey2 KW - ARHI KW - Diphenylharnstoff KW - Krebs KW - Melanom KW - Kinase Inhibitor KW - RAF KW - BAY 43-9006 KW - Sorafinib KW - Nexavar KW - DiRas3 KW - Noey2 KW - ARHI KW - diphenyl urea KW - cancer KW - melanoma KW - kinase inhibitor Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26953 ER - TY - THES A1 - Höfling, Christine T1 - Gentherapie bei Fanconi Anämie T1 - gene therapy in fanconi anemia N2 - Unter Fanconi Anämie versteht man eine rezessiv vererbbare Multisystem-Erkrankung, die einhergeht mit erhöhter spontaner Chromosomenbrüchigkeit, sowie erhöhter Anfälligkeit für toxische Substanzen, wie Mitomycin C (MMC) oder Diepoxybutan (DEB).Gentherapeutische Versuche scheitern bei FA letztlich daran, dass bei fortgeschrittener aplastischer Anämie (= Knochenmarkversagen) die Gewinnung der zur erfolgreichen Transduktion erforderlichen Mengen an CD34 positiven Stamm-Blutzellen schwierig bis unmöglich ist. Die Fortschritte bei den Fremdspender-Transplantationen lassen erwarten, dass zukünftig nahezu alle FA-Patienten mit dieser Therapieform mit guten Erfolgsaussichten behandelt werden können. Insofern ist auch zu erwarten, dass die Option einer somatischen Gentherapie - trotz vielversprechenden Ergebnissen - zukünftig wieder an Bedeutung verlieren wird. N2 - Fanconi anemia (FA) is an inherited autosomal recessive disease, which is accompanied by increased spontaneous chromosomal breackage, and increased susceptibility to DNA-crosslinking agents such as mitomycin C (MMC) or diepoxybutane (DEB).There are various treatment options to improve life expectancy and quality of life of Fanconi anemia patients. Therapeutic options include administration of androgens or growth factors, hematopoietic stem cell transplantation (HSCT), but also somatic gene therapy. Gene therapy experiments at FA fail in advanced aplastic anemia (bone marrow failure) because getting the necessary quantities of CD34 positive blood stem cells for successful transduction is difficult, if not impossible. With further improvements, HSCT will become the treatment of choice, even though this does not eliminate the life-long thread of solid tumors in FA-patients. KW - Gentherapie KW - Fanconi-Anämie KW - Deutschland / Stammzellgesetz KW - Stammzelltransplantation KW - gene therapy KW - fanconi anemia KW - stem cell transplantation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26363 ER - TY - THES A1 - Aichinger, Eric T1 - Risikoberechnung bei der Muskeldystrophie Duchenne und der Muskeldystrophie Becker T1 - Risk estimation in families with Duchenne muscular dystrophy or Becker muscular dystrophy N2 - Risikoberechnung in Familien mit Muskeldystrophie Duchenne oder Muskeldystrophie Becker. Unter Berücksichtigung eines Keimzellmosaiks, heterogener Neumutationsraten und der Möglichkeit homozygot betroffener Frauen. N2 - Risk estimation in families with Duchenne muscular dystrophy or Becker muscular dystrophy. Regarding germline mosaicism, specific mutation rates and homozygote affected women. KW - Risikoberechnung KW - Duchenne KW - Becker KW - Keimzellmosaik KW - Mutationsrate KW - Risk estimation KW - Duchenne KW - Becker KW - germline mosaicism KW - mutation rate Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27000 ER -