TY - THES A1 - Wenzel, Jens T1 - Regulation of TLR-induced macrophage responses by cytoskeleton-associated phosphoproteins T1 - Regulation der Antwort von Makrophagen auf TLR-Stimulation durch Zytoskelett-assoziierte Phosphoproteine N2 - Toll-like receptors (TLR) are pattern recognition receptors (PRR) by which macrophages (MØ) sense pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The recognition of lipopolysaccharide (LPS), the PAMP of gram negative bacteria, by TLR4 triggers signaling cascades and leads to the pro-inflammatory activation of the cells. A recent quantitative and kinetic analysis of the phosphoproteome of LPS-activated primary macrophages highlighted the cytoskeleton as a cell compartment with an enriched protein phosphorylation. In total 44 cytoskeleton-associated proteins were regulated by this post-translational modification and thus might be involved in the control and regulation of key macrophage functions like spreading, motility and phagocytosis. To investigate the control of cytoskeleton-associated cell functions by TLR4 activation, we first developed a method to quantitatively measure the spreading response of bone marrow MØ after stimulation with LPS. Fluorescence microscopy was used for cell imaging and visualisation of the MØ contact area. In collaboration with the Fraunhofer Institute Erlangen, we developed and validated a software tool for the semi-automated segmentation and quantitation of MØ fluorescence microscopy data, which allowed fast, robust and objective image analysis. Using this method, we observed that LPS caused time-dependent spreading, which was detectable after 1-2 h and maximal after 24 h. Next, the impact of genetic or pharmacological inhibition of known TLR signaling components was investigated. Deficiency in the adapter protein MYD88 strongly reduced spreading activity at the late time points, but had no impact early after LPS-stimulation. A similar effect was observed upon pharmacological inhibition of ERK1/2 signaling, indicating that ERK1/2 mediates MYD88-dependent MØ spreading. In contrast, MØ lacking the MAPK p38 were impaired in the initial spreading response but responded normally 8-24 h after stimulation. The genetic deletion of the MAPK phosphatases DUSP1 and DUSP16 resulted in impaired late spreading, corroborating the essential role for functional MAPK signaling in TLR4-driven MØ spreading. To identify the contribution of other cytoskeletal phosphoproteins to MØ spreading, siRNA knockdown of selected candidate genes in primary murine MØ was employed and combined with automated quantitative image analysis. These experiments revealed a functional role for the Myosins MYO1e and MYO1f in MØ spreading. These motor proteins are strongly phosphorylated in LPS-activated MØ. Because of their ability to simultaneously bind to actin filaments and cell membrane or other proteins, we investigated their role in phagocytosis, cytokine production and antigen presentation. Phagocytosis and killing of bacteria were not affected in Myo1e-/- macrophages. However, MYO1e plays a role in chemokine secretion and antigen presentation processes. MCP1 (CCL2) release was selectively increased in Myo1e-deficient MØ and dendritic cells (DC), while cytokine secretion was unaffected. Furthermore, macrophages and DCs lacking MYO1e showed lower levels of MHC-II on the cell surface. However, mRNA levels of CCL2 and of MHC-II were unaltered. These data suggest a role for MYO1e in the transport of selected chemokines and of MHC-II molecules to the cell surface. MHC-II-restricted antigen presentation assays revealed an impaired capacity of macrophages and DC lacking MYO1e to stimulate antigen-specific T cells, suggesting that the reduced MHC-II expression is functionally relevant. Taken together, in this study first a quantitative image analysis method was developed which allows the unbiased, robust and efficient investigation of the macrophage spreading response. Combination of this method with siRNA knockdown of selected cytoskeleton-associated phosphoproteins led to the identification of MYO1e and MYO1f as regulators of macrophage spreading. Furthermore, we identified MYO1e in MØ and DC to be essential for the intracellular transport of CCL2 and MHC-II to the cell surface and for optimal stimulation of antigen-specific CD4 T cells. N2 - Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Mustererkennungsrezeptoren (PRR) durch die Makrophagen (MØ) pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) erkennen. Die Erkennung von Lipopolysacchariden (LPS), dem PAMP gramnegativer Bakterien, durch TLR4 löst Signalkaskaden aus, die zu einer pro-inflammatorischen Aktivierung der Zellen führen. Eine quantitative und kinetische Analyse des Phosphoproteoms LPS-aktivierter primärer Makrophagen identifizierte das Zytoskelett als ein Zellkompartiment mit gesteigerter Proteinphosphorylierung. Insgesamt wurden 44 Zytoskelett-assoziierte Proteine identifiziert, die durch diese post-translationale Modifikation reguliert wurden und demzufolge an der Regulation wichtiger Zellfunktionen von Makrophagen wie Spreading, Motilität und Phagozytose beteiligt sein könnten. Um die Kontrolle Zytoskelett-vermittelter Zellfunktionen nach TLR4 Aktivierung zu untersuchen, entwickelten wir zunächst eine Methode zur quantitativen Messung der Spreadingantwort von Knochenmarksmakrophagen nach LPS Stimulation. Die Visualisierung der Zellen sowie ihrer Kontaktfläche erfolgte hierbei mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für eine schnelle, robuste und objektive Analyse der Fluoreszenzaufnahmen entwickelten und validierten wir in Kollaboration mit dem Fraunhofer Institut in Erlangen eine Software zur halbautomatischen Segmentierung und Quantifizierung der Kontaktfläche. Unter Verwendung dieser Methode konnte eine zeitabhängige LPS-induzierte Zunahme der Zellkontaktfläche beobachtet werden, die nach 1-2 Stunden detektierbar war und ein Maximum nach 24 Stunden erreichte. Durch den Einsatz pharmakologischer Inhibitoren sowie genetisch veränderter Zellen wurde anschließend der Einfluss bekannter TLR4-Signalwegkomponenten untersucht. Die genetische Defizienz des Adapterproteins MYD88 führte hierbei zu einer stark reduzierten Spreadingaktivität der Zellen während der späten LPS Stimulationsphase, wohingegen das initiale Spreading nicht beeinflusst wurde. Ein vergleichbarer Effekt konnte unter Verwendung eines pharmakologischen Inhibitors zur Hemmung des ERK1/2 Signalweges identifiziert werden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass ERK1/2 für die Weiterleitung des MYD88 vermittelten Spreading notwendig ist. Im Gegensatz dazu wurde in p38-defizienten Makrophagen ein beeinträchtigtes initiales Spreading beobachtet, wohingegen das späte Spreading nach 8 – 24 Stunden nicht beeinflusst war. Die genetische Deletion der MAPK Phosphatasen DUSP1 und DUSP16 resultierte ebenfalls in einer Minderung des späten Spreadings, ebenfalls ein Hinweis auf die essentielle Rolle funktioneller MAPK Signalwege. Um die Beteiligung weiter Zytoskelett-Phosphoproteine am Zellspreading zu identifizieren, wurde die Expression ausgewählter Kandidatengene in primären Makrophagen mittels spezifischer siRNA unterdrückt und das Zellspreading mit Hilfe der entwickelten Software quantifiziert. Diese Versuche zeigten eine funktionelle Rolle der Myosine MYO1e und MYO1f. Diese Motorproteine weisen ebenfalls eine starke Phosphorylierung nach LPS Stimulation auf. Aufgrund ihrer Eigenschaft simultan mit Aktinfilamenten und Zellmembranen sowie anderen Proteinen zu interagieren, untersuchten wir ihre Rolle während der Phagozytose, Zytokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Obwohl Myo1e defiziente Makrophagen keine Beeinträchtigung der Phagozytose oder Abtötung von Bakterien aufwiesen, spielte das Motorprotein eine wichtige Rolle in der Chemokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Interessanterweise war die Sekretion des Chemokins MCP1 (CCL2) in Myo1e-defizienten Makrophagen und dendritischen Zellen (DC) selektiv erhöht, während die Zytokinfreisetzung unbeeinträchtigt war. Des Weiteren wiesen Myo1e KO Makrophagen und DC eine reduzierte MHC-II Oberflächen-Expression auf, obwohl die MHC-II als auch die CCL2 Transkription auf mRNA Ebene nicht beeinflusst war. Diese Daten legen nahe, dass MYO1e während des Transports bestimmter Chemokine, sowie von MHC-II zur Zelloberfläche eine wichtige Rolle spielt. Zudem zeigten Myo1e KO Makrophagen und DC in einem MHC-II-abhängigen Antigenpräsentationsassay eine abgeschwächte Fähigkeit zur Antigen-spezifischen T-Zell Aktivierung, was die funktionelle Relevanz der reduzierten Expression von MHC-II nahelegt. Zusammenfassend wurde in dieser Studie zunächst eine Methode zur quantitativen Bildanalyse entwickelt, welche eine unvoreingenommene, robuste und effiziente Untersuchung des Spreadings von Makrophagen erlaubte. Die Kombination dieser Methode mit dem spezifischen siRNA Knockdown ausgewählter Zytoskelett-assoziierter Phosphoproteine führte zur Identifizierung von MYO1e und MYO1f als wichtige Regulatoren dieser Zellfunktion. Darüber hinaus konnte in Makrophagen und DC eine essentielle Rolle für MYO1e im intrazellulären Transport von CCL2 und MHC-II an die Zelloberfläche identifiziert werden, sowie dessen Notwendigkeit für eine vollständige Aktivierung antigen-spezifischer CD4 T Zellen. KW - Toll-like-Rezeptoren KW - Makrophage KW - Phosphoproteine KW - Zellskelett KW - macrophage KW - cytoskeleton KW - phosphorylation KW - TLR4 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98843 ER - TY - THES A1 - Gjorgjevikj, Maja T1 - IL-4 analogues with site-specific chemical modification as screening tools for foldamers T1 - IL-4-Muteine mit ortsspezifische chemische Modifikation als Screening-Tools für Foldamere N2 - The cytokine Interleukin-4 (IL-4) plays a crucial role in the pathophysiology and progression of asthma and other atopic diseases. Its activities are signaled into the cells upon binding to and signaling through a shared receptor complex composed of the subunits IL-4Rα and common γc. Another cytokine, Interleukin-13 shares many functions with IL-4. This can be explained by the fact that both, IL-4 and IL-13, can signal via a shared receptor complex comprising the IL-4R and the IL-13R1 subunit. Therefore, the IL-4Rα receptor subunit has become a highly promising drug target, since it mediates IL-4 and IL-13 responses and blocking IL-4Rα will abrogate IL-4 as well as IL-13 effector functions. Currently, an IL-4 based mutein (Pitrakinra), acting as a dual IL-4/IL-13 receptor antagonist is in clinical development. This work describes the generation and production of biologically active IL-4 muteins, which contain a single additional engineered cysteine. The introduction of a free thiol group allows site-specific chemical modification. The muteins were expressed in E. coli in insoluble form, refolded and purified. The thiol group of the mutein was protected as mixed disulfide with the tripeptide glutathione. A first attempt to chemically reduce the engineered cysteine residue failed, because the three native disulfide bonds of IL-4 exhibit a similar reactivity and chemical reduction of the native disulfide resulted in full deactivation and precipitation of the IL-4 protein. Therefore, an enzymatic approach was developed which specifically reduces the mixed disulfide bonds with an attached glutathion moiety and thus leaves the native structurally essential disulfide bonds unaltered. For optimization, four different IL-4 cysteine muteins with four cysteine residues introduced at positions close to the IL-4Rα binding site were tested and their reduction rates by glutaredoxin was determined. The enzymatic reduction occured at different rates for all four muteins indicating that accessibility is an important influence and must be determined individually for each mutant protein. After optimization of the pH value and particularly the reaction time, all muteins could be prepared with the engineered thiol group being released in reasonable yield. The proteins exhibiting the free thiol group were then modified by N-ethylmaleimide (NEM) or maleimido-PEG. The effects of these modifications at different positions on binding to IL-4R were measured employing SPR biosensor technology. In the second project of this study, foldamers, which represent a new class of stable, compactly folded biomolecules and can specifically interact with proteins and nucleic acids, were examined to identify their potential as new drugs to interfere with IL-4 activities. Fragment-based drug discovery offers great promise for providing new starting points for drug discovery and facilitates the lead optimization. As foldamers equipped with a thiol-group for tethering could not to be produced; only the effect of foldamers present in a synthesized foldamer library on the binding to IL-4R could be tested. Two libraries containing different foldamers based on aromatic amide were synthesized by Michael Grotz and Dr. Michael Deligny and tested in our lab for their capability to disrupt the ligand-receptor interaction of IL-4 and its receptor IL-4Rα [ECD] using surface plasmon resonance technology. None of the studied foldamers could specifically inhibit the IL-4/IL-4Rα interaction. Some foldamers showed non-specific binding. The study presented here shows the design and production of a potentially new type of IL-4 antagonists, which employ site-specific chemical modification to exert their antagonistic function. N2 - Das Zytokin Interleukin-4 (IL-4) spielt eine entscheidende Rolle in der Entstehung und Pathophysiologie von Asthma und anderen atopischen Krankheiten. Seine Aktivitäten können in die Zelle durch die Bindung an einen Rezeptorkomplex übertragen werden, welcher aus den Untereinheiten IL-4Rα und γc besteht. Interleukin-13 (IL-13), ein verwandtes Zytokin, und IL-4 besitzen viele gemeinsame Funktionen. Das kann dadurch erklärt werden, dass IL-4 wie auch IL-13 ihre Signale über einen gemeinsamen Rezeptorkomplex übertragen können, der aus der IL-4R und der IL-13R1 Untereinheit besteht. Die IL-4R Untereinheit ist ein vielversprechendes Zielmolekül für die Entwicklung von Pharmaka, da sie IL-4 und IL-13 Reaktionen vermittelt. Durch Blockieren von IL-4R werden die Aktivitäten von IL-4 sowie IL-13 unterdrückt. Ein IL-4 basiertes Doppelmutein (Pitrakinra), welches als Gegenspieler zu IL-4 und IL-13 Rezeptoren fungiert, befindet sich derzeit in der klinischen Entwicklung. In dieser Arbeit wird die Bildung und Produktion von biologisch aktiven IL-4 Muteinen mit einem einzelnen zusätzlich eingefügten Cysteinrest beschrieben. Die Einführung einer freien Thiol-Gruppe ermöglicht ortsspezifische chemische Modifizierungen. Ein „Tethering“ Ansatz sollte dann auch eine sehr schwach Bindung von thiol-reaktiven Verbindungen an IL-4 messbar machen. Die Muteine wurden in unlöslicher Form in E. coli exprimiert, zurückgefaltet und auf gereinigt. Dabei wurde die Thiolgruppe des Muteins als Disulfid mit dem Tripeptid Glutathion geschützt. Erste Versuche gezielt den eingeführten Cysteinrest selektiv chemisch zu reduzieren schlugen fehl, da die drei proteineigenen Disulfidbrücken von IL-4 eine ähnliche Reaktivität zeigten, und die Reduktion zur vollständigen Desaktivierung und Fällung des IL-4 Proteins führte. Daher wurde ein enzymatischer Ansatz entwickelt, der gezielt die Disulfidbrücke zum Glutathionrest reduziert und die proteineigenen strukturell essentiellen Disulfidbrücken unverändert lässt. Zur Optimierung wurden vier verschiedene IL-4 Cystein-Muteine mit Cysteinresten an verschiedenen Positionen nahe der IL-4Rα Bindungsstelle getestet und die Reduktionsgeschwindigkeit in Gegenwart von Glutaredoxin bestimmt. Die enzymatische Reduktion verlief für alle vier Muteine mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Dies deutet darauf hin, dass die Zugänglichkeit der Disulfidgruppe einen wichtigen Einfluss besitzt. Die Reduktionsbedingungen mussten daher für jedes Mutein neu bestimmt werden. Nach Optimierung des pH Wertes und insbesondere der Reaktionszeit konnten alle Muteine mit einer freien Thiolgruppe in angemessener Ausbeute erhalten werden. Die Proteine mit jeweils einer freien Thiolgruppe wurden daraufhin mit N-Ethylmaleinimid (NEM) oder Maleimido-PEG modifiziert. Die Effekte der Modifizierung an verschiedenen Positionen des IL-4 auf die Bindung an IL-4R wurden mit Hilfe der SPR-Spektroskopie (Oberflächen Plasmon Resonanz Spektroskopie) gemessen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion von Foldameren mit der IL-4Ra Rezeptorkette untersucht. Foldamere stellen eine neue Klasse von stabilen, kompakt gefalteten Biomolekülen dar, die möglicherweise spezifisch mit Proteinen und Nukleinsäuren wechselwirken können. Es sollten Vorversuche durchgeführt werden um zu sondieren, ob aus Foldameren Hemmstoffe für IL-4 und IL-13 entwickelt werden können. Da Foldamere mit einer Thiolgruppe zur Anbindung (Tethering) an IL-4 nicht hergestellt werden konnten, wurden zunächst nur nichtreaktive Foldamare aus einer synthetisierten Foldamer-Bibliothek getestet. Zwei Bibliotheken mit verschiedenen auf aromatischen Amiden basierenden Foldameren wurden von Michael Grotz und Dr. Michael Deligny synthetisiert und von mir mit Hilfe der SPR Spektroskopie auf ihre Fähigkeit getestet, die Ligand-Rezeptor Wechselwirkung von IL-4 und derIL-4Rα Rezeptoruntereinheit zu unterbinden. Keines der untersuchten Foldamere konnte die IL-4/IL-4Rα Wechselwirkung spezifisch hemmen. Einige Foldamere zeigten eine unspezifische Bindung. Die hier dargestellten Studien zeigen das Design und die Herstellung eines potentiell neuen Typs von Gegenspieler zu IL-4, welcher ortsspezifische chemische Modifikationen ausnutzt um seine antagonistische Funktion zu erfüllen. KW - Il 4 KW - Foldamere KW - Modifizierung KW - Foldamers KW - PEG chemical modification KW - Zutokin KW - chemische Modifizierung KW - SPR-Spektroskopie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113531 ER - TY - THES A1 - Axmacher, Franz T1 - Die SVM-gestützte Prädiktabilität der Bindungsspezifität ‎von SH3-Domänen anhand ihrer Aminosäuresequenz T1 - The SVM-based predictability of SH3-domain binding specificity by means of its amino-acid-‎sequence. ‎ N2 - Die Identifikation der Bindungsspezifitäten von Proteininteraktionsdomänen und damit letztlich auch ‎die Fähigkeit potentielle Bindungspartner dieser in vivo vorherzusagen bildet ein grundlegendes ‎Element für das Verständnis der biologischen Funktionen dieser Domänen. In dieser Arbeit wurde ‎untersucht, inwieweit solche Vorhersagen bezüglich der SH3-Domäne – als Beispiel für eine ‎Proteininteraktionsdomäne – mithilfe von Support-Vector-Machines (SVMs) möglich sind, wenn ‎diesen als Informationsquelle ausschließlich die innerhalb der Aminosäuresequenz der Domäne ‎konservierten Informationen zur Verfügung stehen. Um den SVM-basierten Klassifikator zu ‎trainieren und zu validieren, wurde ein Satz aus 51 SH3-Domänen verwendet, die zuvor ‎entsprechend ihrer Ligandenpräferenz in ein System aus acht verschiedenen Klassen eingeteilt ‎worden waren. Da die innerhalb der Aminosäuresequenzen konservierten Informationen in ‎abstrakte Zahlenwerte konvertiert werden mussten (Voraussetzung für mathematisch basierte ‎Klassifikatoren wie SVMs), wurde jede Aminosäuresequenz durch ihren jeweiligen Fisher-Score-‎Vektor ausgedrückt. Die Ergebnisse erbrachten einen Klassifikationserror, welcher weit unterhalb des ‎Zufallsniveaus lag, was darauf hindeutet, dass sich die Bindungsspezifität (Klasse) einer SH3-Domäne ‎in der Tat von seiner Aminosäuresequenz ableiten lassen dürfte. Mithilfe klassenspezifisch ‎emittierter, artifizieller Sequenzen, implementiert in den Trainingsprozess des Klassifikators, um ‎etwaigen nachteiligen Auswirkungen von Overfitting zu entgegenzuwirken, sowie durch ‎Berücksichtigung taxonomischer Informationen des Klassensystems während Training und ‎Validierung, ließ sich der Klassifikationserror sogar noch weiter senken und lag schließlich bei lediglich ‎‎35,29% (vergleiche Zufall: 7/8 = 87.50%). Auch die Nutzung von Feature Selections zur Abmilderung ‎Overfitting-bedingter, negativer Effekte lieferte recht vielversprechende Ergebnisse, wenngleich ihr ‎volles Potential aufgrund von Software-Beschränkungen nicht ausgenutzt werden konnte.‎ Die Analyse der Positionen im Sequence-Alignment, welche für den SVM- basierten Klassifikator am ‎relevantesten waren, zeigte, dass diese häufig mit Positionen korrelierten, von denen angenommen ‎wird auch in vivo eine Schlüsselrolle bei der Determination der Bindungsspezifität (Klasse) zu spielen. ‎Dies unterstreicht nicht nur die Reliabilität des präsentierten Klassifikators, es gibt auch Grund zur ‎Annahme, dass das Verfahren möglicherweise auch als Supplement anderer Ansätze genutzt werden ‎könnte, welche zum Ziel haben die Positionen zu identifizieren, die die Ligandenpräferenz in vivo ‎determinieren. Informationen, die nicht nur für ein besseres Verständnis der SH3-Domäne (und ‎möglicherweise auch anderer Proteininteraktionsdomänen) von grundlegender Bedeutung sind, ‎sondern auch aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse sein dürften.‎ N2 - Regarding protein-interaction-domains the identification of their binding specificities and ‎eventually ‎also the ability to predict potential binding partners for them in vivo constitutes a fundamental ‎element for the understanding of the biological functions of these domains. In this study it ‎was ‎investigated to what extent such predictions could be made for the SH3-domain – as an ‎example ‎for a protein-interaction-domain – when using support-vector-machines (SVMs) trained ‎exclusively ‎with the information conserved within the amino-acid-sequence of the domain. A set of ‎‎51 SH3-‎domains, pre-classified into a system of eight different classes according to their ligand ‎preference, was used to train and cross-validate the SVM-based classifier. To convert the ‎information ‎conserved within the amino-acid-sequences into abstract numeric values (a ‎prerequisite for a ‎mathematics-based classifier like SVMs) each sequence was represented by its ‎respective Fisher-‎score-vector. The results revealed a classification error level way below chance ‎level, indicating the ‎binding specificity (class) of an SH3-domain can indeed be inferred from its ‎amino-acid-sequence. ‎With the help of class-specific emitted, artificial sequences introduced into ‎the training process of the ‎classifier to counter adverse overfitting effects and by additionally ‎considering taxonomic ‎information of the class system during training and cross-validation, the ‎classification error level of ‎the classifier could be lowered even farther, eventually reaching a level ‎as low as 35.29% (compare ‎chance level: 7/8 = 87.50%). The use feature selections to counter ‎overfitting returned quite ‎promising results, too, however couldn't be exploited to its full potential ‎due to software limitations. ‎ The analysis of those positions in the sequence-alignment being most relevant for the SVM-‎based ‎classifier showed, they frequently correlated with positions considered to also play in vivo a ‎pivotal ‎role in binding specificity (class) determination of the SH3-domain. Not only does this ‎underline the ‎reliability of the presented classifier, it also gives reason to believe, the method could ‎possibly be ‎used as a supplement for other approaches trying to identify positions that determine ‎ligand ‎preference in vivo. Information, not only fundamental for a better understanding of the SH3-‎‎domain (and maybe also other protein-interaction-domains), but also likely to be of great interest ‎from a pharmacological point of view.‎ KW - Support-Vektor-Maschine KW - Alignment KW - Hidden-Markov-Modell KW - Kreuzvalidierung KW - Taxonomie KW - SH3-Domäne KW - Fisher-Score KW - Regularisierung KW - Feature-Selection KW - PyMOL KW - WebLogo KW - e1071 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113349 ER - TY - THES A1 - Vona, Barbara C. T1 - Molecular Characterization of Genes Involved in Hearing Loss T1 - Molekulare Charakterisierung der in Hörstörungen involvierten Genen N2 - The auditory system is an exquisitely complex sensory organ dependent upon the synchronization of numerous processes for proper function. The molecular characterization of hereditary hearing loss is complicated by extreme genetic heterogeneity, wherein hundreds of genes dispersed genome-wide play a central and irreplaceable role in normal hearing function. The present study explores this area on a genome-wide and single gene basis for the detection of genetic mutations playing critical roles in human hearing. This work initiated with a high resolution SNP array study involving 109 individuals. A 6.9 Mb heterozygous deletion on chromosome 4q35.1q35.2 was identified in a syndromic patient that was in agreement with a chromosome 4q deletion syndrome diagnosis. A 99.9 kb heterozygous deletion of exons 58-64 in USH2A was identified in one patient. Two homozygous deletions and five heterozygous deletions in STRC (DFNB16) were also detected. The homozygous deletions alone were enough to resolve the hearing impairment in the two patients. A Sanger sequencing assay was developed to exclude a pseudogene with a high percentage sequence identity to STRC from the analysis, which further solved three of the six heterozygous deletion patients with the hemizygous, in silico predicted pathogenic mutations c.2726A>T (p.H909L), c.4918C>T (p.L1640F), and c.4402C>T (p.R1468X). A single patient who was copy neutral for STRC and without pathogenic copy number variations had compound heterozygous mutations [c. 2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) and c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. It has been shown that STRC has been previously underestimated as a hearing loss gene. One additional patient is described who does not have pathogenic copy number variation but is the only affected member of his family having hearing loss with a paternally segregating translocation t(10;15)(q26.13;q21.1). Twenty-four patients without chromosomal aberrations and the above described patient with an USH2A heterozygous deletion were subjected to a targeted hearing loss gene next generation sequencing panel consisting of either 80 or 129 hearing-relevant genes. The patient having the USH2A heterozygous deletion also disclosed a second mutation in this gene [c.2276G>T (p.C759F)]. This compound heterozygous mutation is the most likely cause of hearing loss in this patient. Nine mutations in genes conferring autosomal dominant hearing loss [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21 and twice in MYO1A (DFNA48)] and four genes causing autosomal recessive hearing loss were detected [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3), and USH2A]. Nine normal hearing controls were also included. Statistical significance was achieved comparing controls and patients that revealed an excess of mutations in the hearing loss patients compared to the control group. The family with the GRHL2 c.1258-1G>A mutation is only the second family published worldwide with a mutation described in this gene to date, supporting the initial claim of this gene causing DFNA28 hearing loss. Audiogram analysis of five affected family members uncovered the progressive nature of DFNA28 hearing impairment. Regression analysis predicted the annual threshold deterioration in each of the five family members with multiple audiograms available over a number of years. N2 - Das Gehör als komplexes Sinnesorgan ist für eine einwandfreie Funktion abhängig von der Synchronisation zahlreicher Prozesse. Durch die extreme genetische Heterogenität wird die molekulare Charakterisierung einer erblich bedingten Schwerhörigkeit erschwert, da hunderte genomweit verteilter Gene eine zentrale und unersetzliche Rolle beim Hören spielen. Die vorliegende Studie untersucht dieses Forschungsgebiet auf genomweiter Ebene und auf der Basis von Einzelgenen, um genetische Mutationen zu ermitteln, die eine entscheidende Rolle bei der menschlichen auditiven Wahrnehmung besitzen. Diese Arbeit beginnt mit einer Studie an 109 Personen unter Zuhilfenahme von hochauflösenden SNP-Arrays. In dieser Studie wurde eine 6,9 Mb heterozygote Deletion auf Chromosom 4q35.1q35.2 bei einem syndromalen Patienten identifiziert, die eine Übereinstimmung mit einem Chromosom 4q-Deletionssyndrom aufwies. Bei einem weiteren Patienten wurde eine 99,9 kb heterozygote Deletion der Exons 58-64 in USH2A nachgewiesen. Zwei homozygote Deletionen und fünf heterozygote Deletionen in STRC (DFNB16) wurden ebenfalls detektiert. Die homozygoten Deletionen waren ausreichend, um die Schwerhörigkeit bei beiden Patienten zu klären. Ein Sanger-Sequenzierungs-Assay wurde entwickelt, um ein Pseudogen mit einer hohen prozentualen Sequenzidentität zu STRC von der Analyse auszuschließen. Dadurch konnten drei der sechs heterozygoten Deletionspatienten mit hemizygot in silico vorhergesagten pathogenen Mutationen, c.2726A>T (p.H909L), c.4918 C>T (p.L1640F) und c.4402C>T (p.R1468X), aufgeklärt werden. Ein Patient, der eine kopieneutrale STRC Variation und keine pathogenen Kopienzahlvariationen besaß, zeigte eine compound heterozygote Mutation [c.2303_2313+1del12 (p.G768Vfs*77) und c.5125A>G (p.T1709A)] in STRC. Es wurde gezeigt, daß die Beurteilung von STRC als Hörstörungsgen bisher unterschätzt wurde. Zusätzlich wird ein Patient beschrieben, der keine pathogenen Kopienzahlvariationen aufwies, aber das einzige Familienmitglied mit einer Schwerhörigkeit und einer paternalen segregierten Translokation t(10;15)(q26.13;q21.1) war. Vierundzwanzig Patienten ohne Chromosomenstörungen und der oben beschriebene Patient mit einer USH2A heterozygoten Deletion wurden mit einem Next Generation Sequencing Panel bestehend aus entweder 80 oder 129 für das Hören relevanter Gene untersucht. Der Patient mit einer USH2A heterozygoten Deletion zeigte eine zweite Mutation in diesem Gen [c.2276G>T (p.C759F)]. Diese compound heterozygote Mutation ist die wahrscheinlichste Ursache für die Schwerhörigkeit des Patienten. Neun Mutationen in Genen, die zu einem autosomal dominanten Hörverlust führen [ACTG1 (DFNA20/26); CCDC50 (DFNA44); EYA4 (DFNA10); GRHL2 (DFNA28); MYH14 (DFNA4A); MYO6 (DFNA22); TCF21], sowie zwei MYO1A (DFNA48) Mutationen und Mutationen in vier weiteren Genen, verantwortlich für autosomal rezessive Schwerhörigkeit [GJB2 (DFNB1A); MYO7A (DFNB2); MYO15A (DFNB3) und USH2A], konnten identifiziert werden. Neun normal hörende Kontrollen waren ebenfalls in diese Studie einbezogen worden. Durch einen Vergleich der Kontrollen mit den Patienten konnte eine statistische Signifikanz erreicht werden, die einen Überschuss an Mutationen bei der Patientengruppe gegenüber der Kontrollgruppe aufzeigte. Die Familie mit einer GRHL2 c.1258-1G>A Mutation ist die erst zweite Familie weltweit, die mit einer Mutation in diesem Gen publiziert worden ist. Dies unterstützt die initiale Behauptung, dass dieses Gen für eine DFNA28 Schwerhörigkeit verantwortlich ist. Die Audiogrammanalyse von fünf der betroffenen Familienmitglieder lässt eine voranschreitende Natur der DFNA28 Hörschädigung erkennen. Eine jährliche Verschlechterung der Hörschwelle bei jedem der fünf Familienmitglieder konnte eine Regressionsanalyse anhand von Audiogrammen, die über eine Anzahl von Jahren zur Verfügung standen, vorhersagen. KW - Molekularbiologie KW - Hearing loss KW - Hörverlust Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112170 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am: 09.07.2014 ER - TY - THES A1 - Hovhanyan, Anna T1 - Functional analyses of Mushroom body miniature (Mbm) in growth and proliferation of neural progenitor cells in the central brain of Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse des Mushroom body minature (Mbm) in das Wachstum und die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen im zentralen Gehirn von Drosophila melanogaster N2 - Zellwachstum und Zellteilung stellen zwei miteinander verknüpfte Prozesse dar, die dennoch grundsätzlich voneinander zu unterscheiden sind. Die Wiederaufnahme der Proliferation von neuralen Vorläuferzellen (Neuroblasten) im Zentralhirn von Drosophila nach der spät-embryonalen Ruhephase erfordert zunächst Zellwachstum. Der Erhalt der regulären Zellgröße ist eine wichtige Voraussetzung für die kontinuierliche Proliferation der Neuroblasten über die gesamte larvale Entwicklungsphase. Neben extrinsischen Ernährungssignalen ist für das Zellwachstum eine kontinuierliche Versorgung mit funktionellen Ribosomen notwendig, damit die Proteinsynthese aufrechterhalten werden kann. Mutationen im mushroom body miniature (mbm) Gen wurden über einen genetischen Screen nach strukturellen Gehirnmutanten identifiziert. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der funktionellen Charakterisierung des Mbm Proteins als neues nukleoläres Protein und damit seiner möglichen Beteiligung in der Ribosomenbiogenese. Der Vergleich der relativen Expressionslevel von Mbm und anderen nuklearen Proteinen in verschiedenen Zelltypen zeigte eine verstärkte Expression von Mbm in der fibrillären Komponente des Nukleolus von Neuroblasten. Diese Beobachtung legte die Vermutung nahe, dass in Neuroblasten neben generell benötigten Faktoren der Ribosomenbiogenese auch Zelltyp-spezifische Faktoren existieren. Mutationen in mbm verursachen Proliferationsdefekte von Neuroblasten, wirken sich jedoch nicht auf deren Zellpolarität, die Orientierung der mitotischen Spindel oder die Asymmetrie der Zellteilung aus. Stattdessen wurde eine Reduktion der Zellgröße beobachtet, was im Einklang mit einer Beeinträchtigung der Ribosomenbiogenese steht. Insbesondere führt der Verlust der Mbm Funktion zu einer Retention der kleinen ribosomalen Untereinheit im Nukleolus, was eine verminderte Proteinsynthese zur Folge hat. Interessanterweise wurden Störungen der Ribosomenbiogenese nur in den Neuroblasten beobachtet. Zudem ist Mbm offensichtlich nicht erforderlich, um Wachstum oder die Proliferation von Zellen der Flügelimginalscheibe und S2-Zellen zu steuern, was wiederum dafür spricht, dass Mbm eine Neuroblasten-spezifische Funktion erfüllt. Darüber hinaus wurden die transkriptionelle Regulation des mbm-Gens und die funktionelle Bedeutung von posttranslationalen Modifikationen analysiert. Mbm Transkription wird von dMyc reguliert. Ein gemeinsames Merkmal von dMyc Zielgenen ist das Vorhandensein einer konservierten „E-Box“-Sequenz in deren Promotorregionen. In der Umgebung der mbm-Transkriptionsstartstelle befinden sich zwei „E-Box“-Motive. Mit Hilfe von Genreporteranalysen konnte nachgewiesen werden, dass nur eine von ihnen die dMyc-abhängige Transkription vermittelt. Die dMyc-abhängige Expression von Mbm konnte auch in Neuroblasten verifiziert werden. Auf posttranslationaler Ebene wird Mbm durch die Proteinkinase CK2 phosphoryliert. In der C-terminalen Hälfte des Mbm Proteins wurden in zwei Clustern mit einer Abfolge von sauren Aminosäuren sechs Serin- und Threoninreste als CK2- Phosphorylierungsstellen identifiziert. Eine Mutationsanalyse dieser Stellen bestätigte deren Bedeutung für die Mbm Funktion in vivo. Weiterhin ergaben sich Evidenzen, dass die Mbm-Lokalisierung durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung gesteuert wird. Obwohl die genaue molekulare Funktion von Mbm in der Ribosomenbiogenese noch im Unklaren ist, unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die besondere Rolle von Mbm in der Ribosomenbiogenese von Neuroblasten um Zellwachstum und Proliferation zu regulieren. N2 - Cell growth and cell division are two interconnected yet distinct processes. Initiation of proliferation of central brain progenitor cells (neuroblasts) after the late embryonic quiescence stage requires cell growth, and maintenance of proper cell size is an important prerequisite for continuous larval neuroblast proliferation. Beside extrinsic nutrition signals, cell growth requires constant supply with functional ribosomes to maintain protein synthesis. Mutations in the mushroom body miniature (mbm) gene were previously identified in a screen for structural brain mutants. This study focused on the function of the Mbm protein as a new nucleolar protein, which is the site of ribosome biogenesis. The comparison of the relative expression levels of Mbm and other nucleolar proteins in different cell types showed a pronounced expression of Mbm in neuroblasts, particularly in the fibrillar component of the nucleolus, suggesting that in addition to nucleolar components generally required for ribosome biogenesis, more neuroblast specific nucleolar factors exist. Mutations in mbm cause neuroblast proliferation defects but do not interfere with cell polarity, spindle orientation or asymmetry of cell division of neuroblasts. Instead a reduction in cell size was observed, which correlates with an impairment of ribosome biogenesis. In particular, loss of Mbm leads to the retention of the small ribosomal subunit in the nucleolus resulting in decreased protein synthesis. Interestingly, the defect in ribosome biogenesis was only observed in neuroblasts. Moreover, Mbm is apparently not required for cell size and proliferation control in wing imaginal disc and S2 cells supporting the idea of a neuroblast-specific function of Mbm. Furthermore, the transcriptional regulation of the mbm gene and the functional relevance of posttranslational modifications were analyzed. Mbm is a transcriptional target of dMyc. A common feature of dMyc target genes is the presence of a conserved E-box sequence in their promoter regions. Two E-box motifs are found in the vicinity of the transcriptional start site of mbm. Gene reporter assays verified that only one of them mediates dMyc-dependent transcription. Complementary studies in flies showed that removal of dMyc function in neuroblasts resulted in reduced Mbm expression levels. At the posttranslational level, Mbm becomes phosphorylated by protein kinase CK2. Six serine and threonine residues located in two acidic amino acid rich clusters in the C-terminal half of the Mbm protein were identified as CK2 phosphorylation sites. Mutational analysis of these sites verified their importance for Mbm function in vivo and indicated that Mbm localization is controlled by CK2-mediated phosphorylation. Although the molecular function of Mbm in ribosome biogenesis remains to be determined, the results of this study emphasize the specific role of Mbm in neuroblast ribosome biogenesis to control cell growth and proliferation. KW - Taufliege KW - Mbm KW - Neuroblast KW - cell growth KW - proliferation KW - ribosome biogenesis KW - CK2 KW - Myc KW - Vorläuferzellen KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91303 ER - TY - THES A1 - Kaiser, Dorkas T1 - Termites and ants in BURKINA FASO (WEST AFRICA): taxonomic and functional diversity along land-use gradients; ecosystem services of termites in the traditional ZAÏ SYSTEM T1 - Termiten und Ameisen in Burkina Faso (West Africa): Taxonomische und funktionelle Diversität entlang Landnutzungs-Gradienten, Ökosystemdienste von Termiten im traditionellen Zai system N2 - The consequences of habitat change for human well-being are assumed to be especially extreme in Burkina Faso. The country is located in a highly drought-sensitive zone of West Africa, and small‐scale subsistence farmers may be especially affected if losses of biodiversity lead to changes in ecosystem functioning; many depend on more or less degraded lands for agricultural production. The overall aim of the present thesis consequently was to characterize the functional traits of soil-organisms which are crucial for a productive and balanced soil environment in the study region – termites and ants. They are true ecosystem engineers whose activity alters the habitat. Through soil-turnover in the course of constructing biogenic structures of varying size and nature (mounds, nests, galleries, soil-sheetings, foraging-holes), they bioturbate huge amounts of soil masses and exert massive effects on soil structure, positively influencing the fertility, stability, aeration and water infiltration rate into soils; and they provide habitats for other species. In sub-Saharan Africa, ants and termites are the only active soil macrofauna during the long dry season; in the sub-Sahel zone of Burkina Faso, termites even represent the only active, quantitatively remarkable decomposers all year round. Since no information was available about the actual diversity of the focal arthropods, I divided the thesis in two main parts: In the first part, a baseline study, I assessed the local termite and ant fauna, and investigated their quantitative and qualitative response to changing habitat parameters resulting from increasing human impact (‘functional response traits’). In the second and applied part, I addressed the impact of the biogenic structures which are important for the restoration of degraded soils (‘functional effect traits’). Two traditional agricultural systems characteristic for the study region were selected. Each system represented a land-use intensification gradient comprising four distinct habitats now differing in the magnitude of human intervention but formerly having the same initial state. The first disturbance gradient, the temporal cross-section of a traditional soil water conservation technique to restore degraded heavily encrusted, barren soil named Zaï in Ouahigouya (Yatenga province, sub-Sahel zone); the second disturbance gradient, an agriculture type using crop rotation and fallow as nutrient management techniques near Fada N’Gourma (Gourma province, North-Sudanese zone). No standard protocol existed for the assessment of termite and ant diversity in semi-arid (agro-) ecosystems; two widely accepted standard protocols provided the basis for the newly revised and combined rapid assessment protocol ‘RAP’: the ALL protocol for leaf litter ants of Agosti and Alonso (2000), and the transect protocol for termites in tropical forests of Jones and Eggleton (2000). In each study site, three to four replicate transects were conducted during the rainy seasons (2004—2008). The RAP-protocol turned out to be very effective to characterize, compare and monitor the taxonomic and functional diversity of termites and ants; between 70% and 90% of the estimated total species richness were collected on all levels (transects, habitats, regions). Together in both regions, 65 ant species (25 genera) and 39 termite species (13 genera) were collected. These findings represent the first records for Burkina Faso. The data indicate a high sensitivity of termites and ants to land-use intensification. The diversity strongly decreased with increasing anthropogenic impact in the North-Sudan region. In total, 53 ant species (23 genera) and 31 termite species (12 genera) were found. Very promising results concerning the recovery potential of the soil-arthropods’ diversity were gathered in the Zaï system. The diversity of both taxa strongly increased with increasing habitat rehabilitation – in total, 41 ant species (16 genera) and 33 termite species (11 genera) were collected. For both taxa significant differences could be noted in the shape of the density variations along the gradient. For instance termites: Fungus-growers showed the greatest adaptability to different management practices. The greatest variations between the habitats were observed in soil and grass-feeding termites. Whole functional groups were missing in heavily impacted habitats, e.g. soil-, grass-, and wood-feeders were absent in the degraded site in the sub-Sahel zone. Several environmental parameters could be identified which significantly explained a great part of the variations in the composition of the arthropods’ communities; they indicate the importance of the habitats’ structural complexity (vegetation structure) and concomitant effects on diurnal temperature and moisture fluctuations, the availability of food sources, and the soil-structure. The diversity of termites in the sub-Sahel region was strongly correlated with the crown-cover percentages, the topsoils’ sand-content, and the availability of litter; in the North-Sudan region with the cumulated woody plant basal area, the topsoils’ clay- and organic matter-content. The parameters identified for ant communities in the Zaï system, were the height of trees, the topsoils’ clay-content and air humidity; in the North-Sudan region the habitats’ crown-cover percentages, the quantity of litter and again the height of trees. In the second part of the thesis, I first rapidly assessed the (natural) variations in the amount of epigeal soil-structures along the two disturbance gradients in order to judge the relative importance of termites and ants for soil-turnover. The results illustrated impressively that a) in all study sites, termites were the main bioturbators while ant structures were of minor importance for soil turn-over; b) earthworms and grass-feeding termites contributed significantly to soil turn-over in the more humid North-Sudan region; and c) the bioturbated soil mass varied between seasons and years, however, the relative importance of the different taxa seemed to be fairly constant. In the sub-Sahel zone, fungus-growing Odontotermes and Macrotermes species fully take over the important function of bioturbation, leading to the transport of huge amounts of fine-textured soil material to the surface; with increasing habitat restoration, coarse fragments decreased in the upper horizons and became concentrated deeper along the soil profile. Consequently, in the applied part, I concentrated on the bioturbation activity of fungus-growing termites in the four main stages of the Zaï system: crusted bare soil (initial stage), millet field, young and old forest. In each of the four Zaï sites nine experimental blocks (each comprising four plots of 1m2) were used to stimulate the foraging activity of fungus-growing termites with different, locally available organic materials (Aristida kerstingii hay, Bombax costatum wooden blocks, compost and a control without any organic amendment). The experiment was conducted twice for the duration of four weeks (rainy season 2005, dry season 2006). The plots were regularly checked and the increase of the area covered by sheetings chronologically followed. After four weeks a) all sheeting-soil was collected, air dried and separately weighed according to the different genera, and b) the foraging-holes were counted and their diameter measured. Additionally, c) ponded water infiltration was measured in selected plots, and d) the physicochemical properties of sheeting-soil were analyzed. In case of complete consumption of the offered hay during the experimental 4-weeks-duration, the same procedure (a, b) was followed before adding new hay to the respective plot. The comparison between the different plots, sites and seasons revealed clearly that hay was the most attractive bait; for each gram of hay removed, Odontotermes brought about 12 g soil to the surface, Macrotermes 4 g. Odontotermes was the only genus attracted by organic material to the degraded area, and was therefore the decisive primary physical ecosystem engineer in the Zaï system, initiating the restoration process. The mass of soil bioturbated in the course of foraging increased strongly from the degraded, barren towards the most rehabilitated reforested site. Combining all 36 experimental plots per Zaï stage, Odontotermes bioturbated 31.8 tons of soil per hectare and month dry season in the degraded area, and 32.4 tons ha-1 mon-1 in the millet fields; both genera moved 138.9 tons ha-1 mon-1 in the young and 215.5 tons ha-1 mon-1 in the old Zaï forest. Few comparable figures were found in the literature. In northern Burkina Faso, both genera constructed 20 tons of sheetings ha-1 mon-1 after mulching with a straw-wood mixture (Mando & Miedema 1997), and in Senegal, around 10 tons ha-1 mon-1 were moved in heavily foraged plots (Rouland et al. 2003). Within a site, soil turn-over and the number of foraging holes created was always highest in hay, followed by compost, then by wood and in the end control. The fungus-growers’ foraging-activity was leading to an enormous increase in surface pore space – after one month of induced foraging activity in hay-plots, the median number of foraging-holes increased from 142 m-2 in the degraded site up to 921 m-2 in the old Zaï forest. The creation of subterranean galleries and macropores significantly increased the water infiltration rate by a mean factor 2–4. Laboratory analyses revealed that sheeting-soil differed strongly from the respective control soil as well as between the seasons, the food-type covered, and the two genera. Odontotermes-sheetings differed in more parameters than Macrotermes-sheetings, and dry season sheetings differed in more parameters (and more strongly) than rainy season sheetings. In the present study, soil organic matter, carbon and nitrogen contents were significantly increased in all dry season sheetings; in the rainy season mainly in those built on compost. Texture analysis pointed out that both genera used topsoil and soil from deeper horizons in varying mixture ratios, thereby supporting findings of Jouquet et al. (2006). To summarize, the present thesis contributes to a better understanding of the functional response traits of termites and ants to changing environmental parameters resulting from increasing human impact. The RAP-protocol represents an easy-to-learn and very effective method to representatively characterize, compare and monitor the taxonomic and functional diversity of termites and ants. The experiment has provided conclusive evidence of the importance of the consideration of fungus-growing termites (particularly Odontotermes and Macrotermes species) when aiming to restore infertile, degraded and crusted soils and to maintain a sustainable agricultural production in the Sahel‐Sudanese zone of West Africa. N2 - Die Folgen von Lebensraumveränderungen für die Lebensqualität der Bevölkerung sind vermutlich besonders extrem in Burkina Faso. Das Land liegt in einem für Dürren sehr anfälligen Gebiet von Westafrika. Die Kleinbauern, welche die Hauptproduzenten für Lebensmittel der Region sind, können besonders betroffen sein, wenn Verluste der biologischen Vielfalt zu Veränderungen in den Ökosystemfunktionen führen, da viele von degradierten Flächen für die landwirtschaftliche Produktion abhängen. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war daher, die funktionellen Merkmale derjenigen Bodenorganismen zu charakterisieren, die im Untersuchungsgebiet von entscheidender Bedeutung für ertragreiche und ausgewogene Böden sind: Termiten und Ameisen. Sie sind wahre Ökosystem‐Ingenieure, deren Aktivität den Lebensraum verändert. Durch Bodenumwälzung während des Baus von biogenen Strukturen unterschiedlicher Größe und Natur (Hügel, Nester, unterirdischer Gänge, Schutzschichten aus Erde, sogenannte „soil-sheetings“, Furagierlöcher, etc.) bewegen sie riesige Bodenmassen und haben enorme Auswirkungen auf die Bodenstruktur. Dies wirkt sich wiederrum positiv auf die Bodenfruchtbarkeit, die Stabilität, die Bodenbelüftung und die Wasserinfiltration aus, und bietet so auch Lebensraum für andere Arten. In den afrikanischen Ländern südlich der Sahara sind Ameisen und Termiten die einzige nennenswerte aktive Bodenmakrofauna während des gesamten Jahres. In der Sub-Sahelregion von Burkina Faso sind während der Trockenzeit Termiten die einzigen aktiven Primärzersetzer. Da keine Informationen über den Artenreichtum der Termiten- und Ameisen-Fauna in Burkina Faso vorlagen, setzte ich in der Dissertation zwei Schwerpunkte: Im ersten Teil, einer Grundlagenstudie, erfasste ich die lokale Termiten und Ameisenfauna in verschiedenen Landnutzungssystemen und untersuchte deren quantitative und qualitative Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen, die aus dem zunehmenden Einfluss des Menschen resultieren ("funktionelle Reaktionsmerkmale"). Im zweiten und anwendungsbezogenen Teil befasste ich mich mit dem Einfluss der für die Regeneration degradierter Böden wichtigen biogenen Strukturen ("funktionelle Wirkungsmerkmale"). Es wurden zwei für die Untersuchungsregion typische traditionelle Landwirtschafts-formen ausgewählt. Jede stellte einen Landnutzungsgradienten dar, der vier verschiedene Habitate umfasste, welche sich in der Stärke des anthropogenen Einflusses unterschieden, ursprünglich aber den gleichen Anfangszustand hatten. Der erste Nutzungsgradient in Ouahigouya (Provinz Yatenga, Sub-Sahel-Zone) – namens Zaï – war ein zeitlicher Querschnitt durch eine traditionelle Boden- und Wasserschutztechnik zur Regeneration stark verkrusteter, degradierter Böden. Der zweite Nutzungsgradient nahe der Stadt Fada N’Gourma (Provinz Gourma, Nord-Sudan Region) war ein Landwirtschaftstyp, der Fruchtfolge und Brachzeiten für das Nährstoffmanagement nutzte. Zur Erhebung der Termiten- und Ameisen-Diversität in semi-ariden (Agrar-) Ökosystemen existierte kein Standardprotokoll; zwei international akzeptierte Protokolle bildeten die Grundlage für das neu überarbeitete und kombinierte Protokoll „RAP“ zur schnellen Erhebung der Termiten- und Ameisenfauna: Das ALL-Protokoll für Ameisen der Laubstreuschicht von Agosti and Alonso (2000) und das Transektprotokoll für Termiten in tropischen Wäldern von Jones and Eggleton (2000). In meiner Untersuchung wurden zwischen 2004 und 2008 während der Regenzeit in jedem der Untersuchungsgebiete drei bis vier Transekte abgesammelt. Das RAP-Protokoll erwies sich als sehr effektive Methode, um die taxonomische und funktionelle Vielfalt von Termiten und Ameisen zu beschreiben, zu vergleichen und zu überwachen. Zwischen 70% und 90% der geschätzten Gesamtartenzahl wurden auf allen Ebenen (Transekte, Lebensräume, Regionen) gesammelt. Insgesamt wurden in beiden Regionen 65 Ameisenarten (25 Gattungen) und 39 Termitenarten (13 Gattungen) gesammelt. Dies sind bislang die ersten Nachweise für Burkina Faso. Die Daten weisen auf eine hohe Sensitivität von Termiten und Ameisen gegenüber einer Landnutzungsintensivierung hin. Mit zunehmendem anthropogenem Einfluss nahm die Artenvielfalt in der Nord-Sudanregion stark zu. Insgesamt wurden 53 Ameisenarten (23 Gattungen) und 31 Termitenarten (12 Gattungen) gefunden. Sehr vielversprechende Ergebnisse wurden bezüglich des Erholungspotenzials der Bodenarthropoden-Diversität im Zaï-System gesammelt; die Vielfalt beider Taxa nahm in mit zunehmender Lebensraumsanierung stark zu: Insgesamt wurden 41 Ameisenarten (16 Gattungen) und 33 Termitenarten (11 Gattungen) dieser Region gefunden. Entlang der Landnutzungsgradienten zeigten sich signifikante Unterschiede im Vorkommen von Termiten und Ameisen. So bewiesen bei Termiten beispielsweise die Pilzzüchter die größte Anpassungsfähigkeit an die unterschiedlichen Bewirtschaftungspraktiken. Die größten Unterschiede zwischen den Lebensräumen wurden bei den boden- und den grasfressenden Termiten beobachtet. In stark vom Menschen beeinflussten Lebensräumen fehlten ganze funktionelle Gruppen, beispielsweise kamen in der degradierten Fläche der Sub-Sahelregion weder Bodenfresser noch Grasfresser oder Holzfresser vor. Mehrere Umweltparameter wurden identifiziert, welche einen großen Teil der Veränderungen in der Zusammensetzung der Arthropoden-Gemeinschaften entlang der Gradienten signifikant erklärten; sie lassen auf eine große Bedeutung der strukturellen Habitat-Komplexität (Vegetationsstruktur) und den damit verbundenen mikroklimatischen Schwankungen (Temperatur- und Feuchtigkeit), der Nahrungsverfügbarkeit und der Bodenstruktur schließen. Die Termitenvielfalt in der Sub-Sahelzone korrelierte stark mit dem Überschirmungsgrad, dem Sandgehalt im Oberboden und der Verfügbarkeit von Streu. Ihre Vielfalt in der Nord-Sudanregion korrelierte stark mit der kumulierten Gehölzpflanzen-Grundfläche, dem Tongehalt und dem organischen Material im Oberboden. Die identifizierten Parameter für die Ameisen-Gemeinschaften im Zaï-System waren die Höhe der Bäume, der Sandgehalt im Oberboden und die Luftfeuchte. Ihre Vielfalt in der Nord-Sudanregion korrelierte stark mit dem Überschirmungsgrad, dem Trockengewicht der verfügbaren Streu und der Baumhöhe. Um die relative Bedeutung von Termiten und Ameisen für die Bodenumwälzung beurteilen zu können, erfasste ich im zweiten Teil der Arbeit zunächst die natürlichen Schwankungen im Trockengewicht der in jedem Untersuchungsgebiet oberirdisch vorhandenen biogenen Strukturen. Die Ergebnisse veranschaulichen eindrucksvoll, dass: 1. Termiten in allen Untersuchungsgebieten die Hauptumwälzer, Ameisenstrukturen dagegen von untergeordneter Bedeutung für die Bioturbation waren; 2. Regenwürmer und grasfressende Termiten in der regenreicheren Nord-Sudanregion wesentlich zur Bodenumwälzung beitrugen; 3. die Gesamtmasse der umgewälzten Erde von Jahr zu Jahr schwankte, die relative Bedeutung beider Taxa für die Bioturbation jedoch ziemlich konstant war; 4. in der Sub-Sahelzone die wichtige Funktion der Bodenumwälzung vollständig von pilzzüchtenden Macrotermes- und Odontotermes-Arten übernommen wird, die zusammen große Mengen von feinkörnigem Bodenmaterial an die Oberfläche transportieren. Dadurch sank mit zunehmender Habitat-Rehabilitation der Gehalt an grobkörnigem Bodenmaterial in den oberen Bodenschichten und reicherte sich zunehmend in den tieferen Horizonten an. Im anwendungsbezogen Teil der Arbeit konzentrierte ich mich daher auf die Bioturbationsleistung pilzzüchtender Termiten in den vier Hauptstadien des Zaï-Systems: der degradierten Fläche (Ausgangsstadium der vier Sukzessionsstadien), dem Hirsefeld, dem jungen und dem alten Zaï-Wald. In jedem dieser vier Sukzessionsstadien wurde die Furagiertätigkeit von pilzzüchtenden Termiten folgendermaßen angeregt: Es wurden neun Versuchsblöcke installiert, mit je vier Unterquadraten mit einer Fläche von 1 m2. Drei der Unterquadrate wurde mit unterschiedlichen, lokal verfügbaren organischen Materialien bedeckt (mit Aristida kerstingii Stroh, Bombax costatum Holz, Kompost), eines blieb als Kontrolle ohne organisches Material. Das vierwöchige Experiment wurde zweimal durchgeführt (Regenzeit 2005, Trockenzeit 2006). Dabei wurden die Untersuchungsflächen regelmäßig auf Termitenaktivität überprüft und die Zunahme der “soil-sheetings“ kartiert. Nach vier Wochen wurde: i. Die gesamte Termitenerde gesammelt, luftgetrocknet und für jede Gattung getrennt gewogen; ii. die Furagierlöcher gezählt und ihr Durchmesser vermessen; iii. in ausgewählten Flächen die Wasserinfiltrationsrate gemessen; iv. die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Sheeting-Erde analysiert. Sobald das Stroh in einem Unterquadrat abgetragen war, wurde nach den betreffenden Messungen (s. oben i. und ii.) neues aufgebracht. Der Vergleich der Ergebnisse beider Durchläufe zeigte deutlich, dass Stroh der attraktivste Köder war. Für jedes Gramm abgetragenes Stroh wurden von Odontotermes etwa 12 g, von Macrotermes etwa 4 g Erde an die Oberfläche gebracht. Odontotermes war die einzige Gattung, die in der degradierten Fläche von organischem Material angelockt wurde. Sie ist damit der entscheidende primäre physikalische Ökosystem-Ingenieur im Zaï-System, der den Restaurierungsprozess anstößt. Mit zunehmender Habitatsanierung nahm die Menge der umgewälzten Erde stark zu: In den 36 Unterquadraten der degradierten Fläche bewegte Odontotermes insgesamt 31,8 Tonnen Erde pro Hektar und Monat Trockenzeit, in denen der Hirsefelder insgesamt 32,4 Tonnen. Beide Gattungen zusammen bewegten im jungen Zaï-Wald insgesamt 138,9 Tonnen, im alten Wald 215,5 Tonnen Erde pro Hektar und Monat Trockenzeit. In jedem Sukzessionsstadium waren sowohl die Bodenumwälzung als auch die Anzahl der Furagierlöcher in den Versuchsflächen mit Stroh am größten, gefolgt von denen mit Kompost, dann denen mit Holz und zuletzt den Kontrollflächen. Die Furagiertätigkeit der pilzzüchtenden Termiten führte zu einer starken Zunahme der Makroporosität des Oberbodens. Nach einem Monat induzierter Fraßaktivität stieg im Mittel die Anzahl der Furagierlöcher pro Quadratmeter von 142 in der degradierten Fläche auf 921 Löcher im alten Zaï Wald. Die bei der Nahrungssuche gegrabenen Gänge und Löcher führten zu einem signifikanten Anstieg der Wasserinfiltrationsrate, im Mittel um den Faktor 2–4. Nur wenige vergleichbare Zahlen konnten in der Literatur gefunden werden. Bei den Untersuchungen von Mando and Miedema (1997) im Norden von Burkina Faso wälzten die beiden Gattungen nach Mulchen mit einem Holz-Stroh-Gemisch Sheetings mit einem Trockengewicht von insgesamt 20 Tonnen je Hektar und Monat Trockenzeit um. Im Senegal wurden in Versuchsflächen mit starker Furagieraktivität rund 10 Tonnen Erde bewegt (Rouland et al. 2003). Laboranalysen ergaben, dass sich Sheeting-Erde stark sowohl von der entsprechenden Kontroll-Erde unterschied als auch dem überdeckten Futtertyp und ebenso zwischen den beiden Gattungen. Dabei unterschied sich Sheeting-Erde von Odontotermes in mehr Parametern als Sheeting-Erde von Macrotermes, und Sheetings aus der Trockenzeit unterschieden sich in mehreren Parametern und in stärkerem Maße als Sheetings aus der Regenzeit. Der Gehalt an organischem Material, an Kohlenstoff und Stickstoff war in allen Trockenzeit-Sheetings deutlich erhöht, in der Regenzeit vor allem in Sheetings, die über Kompost gebaut wurden. Die Analyse der Korngrößenverteilung ließ darauf schließen, dass beide Gattungen Erde aus dem Oberboden und aus tieferen Horizonten in unterschiedlichen Mischungsverhältnissen nutzten. Dies bestätigt Beobachtungen von Jouquet et al. (2006). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Untersuchung zu einem besseren Verständnis der funktionellen Reaktionsmerkmale von Termiten und Ameisen auf sich ändernde Umweltparameter beiträgt, die aus dem zunehmenden Einfluss des Menschen resultieren. Das RAP-Protokoll erwies sich als eine einfach zu erlernende und sehr effektive Methode, um die taxonomische und funktionelle Vielfalt von Termiten und Ameisen in semi-ariden Savannen und Agrarökosystemen repräsentativ zu charakterisieren, zu vergleichen und zu überwachen. Das Experiment erbrachte schlüssige Beweise für die Bedeutung pilzzüchtender Termiten (insbesondere Odontotermes und Macrotermes-Arten) für die Sanierung vollständig degradierter und verkrusteter Böden, und für eine nachhaltige landwirtschaftliche Produktion in der Sub-Sahelzone in Westafrika. KW - Termiten KW - termites KW - Ameisen KW - Biodiversität KW - menschlicher Einfluss KW - ants KW - diversity KW - human impact Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107001 ER - TY - THES A1 - Kubisch (geb. Wiegand), Franziska T1 - Learning in botanical gardens: Investigating educational methods during an instruction about plants and water T1 - Lernen in Botanischen Gärten: Die Untersuchung von Lehrmethoden während einer Intervention über Pflanzen und Wasser N2 - The contribution of botanical gardens to out-of-school education should be larger than it is currently in Germany. In the curricula of all school types botany plays only a minor role, although plants form the base for all animal life on earth. To increase the attractiveness of botanical gardens for teachers, offers and programs should be created and conducted in didactically sensible manners and allow students an emotional approach towards the topics through trial and experiments. Therefore it is insufficient to conduct guided tours, which are still most common. Student-centered methods, like learning at workstations, or experimental courses, can lead to an improved retention of the contents learned at the out-of-school learning setting. There are, however, methodological differences even within learning at workstations. In the first part of my study I compared a student- (S) and a teacher-centered (T) type of learning at workstations (chapter III). My intention was to find out, which of both methods results in more positive emotions at the out-of-school learning location and a higher sustainable knowledge increase. Like in all three parts of my study, 8th grade students from so-called “Mittelschulen” and “Realschulen” from Lower Franconia participated in the programs. I evaluated them by using multiple-choice tests assessing the students' knowledge regarding the topic 'plants and water' (see Appendix), following a before-after / control-impact study design. The students' emotions were assessed using the intrinsic motivation inventory directly after the garden visit. Using generalized linear mixed models, I did not find a significant difference between either of the two approaches. A reason for this could be that the students could be practically active in both methods, which made them fairly similar. Given that there was a significant knowledge increase in both methods, and the effort to develop the teacher-centered learning at workstations was much lower, I would suggest to follow that method for educational work in botanical gardens. Students already have many predefined concepts regarding many topics, especially when these are important in everyday life. These concepts do often not match the scientific state-of-the-art. Still, students bring their so-called 'alternative conceptions' into visits to the botanical garden. According to theory, confronting them with their own conceptions in the light of scientific facts, should foster updating their concepts with scientifically correct additions. To investigate this method regarding my topic 'plants and water', I developed an intervention with experiments on the lotus effect, which also plays a role in everyday life (chapter IV). Topics like the surface tension of the water, which is also found in 6th grade curricula in German schools, were included. Prior to the intervention, I assessed the students' conceptions using questionnaires and used the three most frequent alternative conceptions to develop a multiple-choice test, which was also used in a before-after / control-impact design. A group of students was also confronted with their conceptions during an introductory talk (AC), whereas another was not (NAC). This was conducted in a way, that likely led to dissatisfaction of the students with their own concepts. The analysis of the questionnaires with the Mann-Whitney U test showed, however, no difference between the two groups directly following the treatment. Over longer time, however, the NAC group retained significantly more knowledge. Probably the students confronted with the alternative conceptions remembered the illustrations of these more easily than the scientifically correct view. For some botanical topics it is certainly helpful to include this conceptual change approach, but apparently not for the lotus effect. In this case it is most sensible to focus on the surface structure of water-repellent leaves and fruits, as we describe it in a publication in 'Unterricht Biologie'. For the practical work in botanical gardens I would suggest to rather assess the students' concepts and assumptions in the beginning of an intervention in a botanical garden, especially with respect to feasibility. In the third part of my study I concentrate on the application of concept maps (chapter V). This method of cross-linking old and newly acquired knowledge is effective, but not very common in Germany, neither in schools, nor in botanical gardens. One group of students followed exclusively a teacher-centered learning at workstations regarding 'plants and water' (NCM), a second group created concept maps directly after the treatment and a second directly before the retention test (CM). The first map was intended to be a means of consolidation, whereas the late map was rather focused on recapitulation of what was learned about six weeks ago. To evaluate that I used the same multiple-choice tests as I did for the first part. The CM group showed a significantly higher knowledge increase, over short and long time-scales, although these students did significantly worse in the pretest than those of the NCM group. Regarding genders, female students profited especially from the first concept map (consolidation), males rather from the second (recapitulation). From the results one can conclude that prominently weaker students benefit from this method. Additionally the gender-related results show that using concept maps multiple times can be beneficial for different types of learners. In every study there also was a control group (C), which only had to fill out the questionnaires at the same time as the participating students, to account for external factors (like media, etc.). Especially learning at workstations and concept maps are very appropriate to be conducted at the out-of-school learning location botanical garden and are likely to strongly increase learning success. It is beneficial to mix several methods to achieve the best results in different types of learners. Additionally, when methods in school are mixed with those of out-of-school learning, the education gets more open, practical and colorful. That all resulted in a substantial long-term knowledge gain of all participating students. N2 - Der Beitrag botanischer Gärten zur außerschulischen Bildung sollte größer sein, als er momentan in Deutschland ist, denn in den Lehrplänen aller Schularten spielt die Botanik eine sehr geringe Rolle, obwohl Pflanzen die Grundlage allen tierischen Lebens sind. Doch um diesen Lernort für Lehrer attraktiver zu machen, sollten die Programme und Angebote didaktisch aufbereitet sein und den Schülern durch Ausprobieren und Experimentieren einen emotionalen Zugang bieten. Hierfür genügt es nicht, Führungen und Lehrervorträge durchzuführen, welche noch immer zu hohen Prozentsätzen stattfinden. Schülerzentrierte Methoden, wie das Lernen an Stationen, oder experimentelle Praktika, können dazu führen, dass das am außerschulischen Lernort (ASL) Gelernte besser im Gedächtnis bleibt. Jedoch gibt es auch beim Lernen an Stationen methodische Unterschiede. Im ersten Teil meiner Studie habe ich eine schülerzentrierte (S) gegen eine lehrerzentrierte (T) Form des Lernens an Stationen gegeneinander getestet (siehe Kapitel III), um herauszufinden, welche der beiden Methoden zu positiveren Emotionen am ASL und einem erhöhten, anhaltenden Wissenszuwachs führt. Wie bei allen drei Teilen meiner Studie nahmen Schüler und Schülerinnen der 8. Jahrgangstufe von Mittel-und Realschulen aus Unterfranken teil. Evaluiert wurde mithilfe eines selbst entwickelten Multiple-Choice-Tests zum Wissen der Schüler und Schülerinnen zum Thema Wasser und Pflanzen (siehe Appendix 5). Dieser Test erfolgte als Vor- und Nachtest sowie als verzögerter Behaltenstest (retention). Die Emotionen der Schüler und Schülerinnen wurden über den IMI-Fragebogen (intrinsic motivation inventory) direkt nach dem Besuch im botanischen Garten einmalig erfragt. Weder beim Wissenstest, noch bei den Emotionen, ergab sich nach Auswertung mittels generalisierter gemischter linearer Modelle (GLMM) ein klares Signal für eine der beiden Methoden. Ein Grund könnte sein, dass bei beiden Formen des Lernens an Stationen die Schüler und Schülerinnen auch praktisch aktiv werden konnten, sich die Methoden somit sehr ähnelten. Da bei beiden Methoden insgesamt signifikant dazu gelernt wurde und das eher lehrerzentierte Lernen an Stationen nicht so aufwändig war in der Entwicklung wie das schülerzentrierte, würde ich den botanischen Gärten erstere Methode für die Bildungsarbeit empfehlen. Schüler und Schülerinnen haben zu vielen Themen, vor allem des Alltags, bereits ganz eigene Konzepte und Vorstellungen, die nicht unbedingt denen das aktuellen wissenschaftlichen Standes entsprechen. So kommen die Schüler und Schülerinnen natürlich auch mit diesen individuellen Konzepten in den botanischen Garten. Hier sollte nun auch auf diese sogenannten “alternativen Konzepte” eingegangen werden, da diese Konfrontation, laut Theorie, die Übernahme neuer, wissenschaftlich korrekter Bausteine in das bereits vorhandene Konzept fördern soll. Um bei dem Thema Wasser und Pflanzen zu bleiben und gleichzeitig ein alltagsrelevantes Thema anzusprechen, habe ich ein Praktikum und Experimente zum Lotuseffekt entwickelt und die Vorstellungen der Schüler und Schülerinnen dazu erfragt (siehe chapter IV). Hierbei spielten auch Themen wie die Oberflächenspannung von Wasser eine Rolle, was in Deutschland in der 6. Klasse angesprochen wird. Aus nicht korrekten Vorstellungen wurden die drei häufigsten ausgesucht und daraus ein Multiple-Choice-Test entwickelt, der ebenfalls als Vor-, Nach- und Behaltenstest fungierte. In einem einführenden Vortrag zum Lotuseffekt wurde ein Teil der Schüler und Schülerinnen (AC) zusätzlich mit diesen alternativen Vorstellungen konfrontiert, über Bilder und im Unterrichtsgespräch. Dies erfolgte in einer Art und Weise, sodass die Schüler und Schülerinnen mit der eigenen Vorstellung unzufrieden wurden. Eine zweite Gruppe wurde während des Vortrags nicht mit ihren alternativen Vorstellungen konfrontiert (NAC). Die Auswertung der Fragebögen über den Mann-Whitney U Test ergab keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen im Hinblick auf den kurzfristigen Wissenserwerb. Die Gruppe jedoch, welche nicht mit ihren alternativen Vorstellungen konfrontiert wurde (NAC), lernte langfristig im Vergleich zu der AC-Gruppe signifikant mehr dazu. Womöglich erinnerten sich die Schüler und Schülerinnen der AC-Gruppe nur noch an die Bilder der falschen und nicht an die der wissenschaftlich korrekten Vorstellung und wurden somit irritiert. Bei einigen botanischen Themen ist es sicherlich von Vorteil, die alternativen Vorstellungen der Schüler und Schülerinnen einzubringen, vielleicht nicht unbedingt beim Lotuseffekt. Hier sollte man sich, wie in einem von uns dazu verfassten Artikel in der Unterricht Biologie beschrieben sein wird, auf die Oberflächenstruktur von wasserabweisenden Blättern und Früchten beschränken. Für die pädagogische Arbeit in botanischen Gärten würde ich die mündliche Abfrage der Vorstellungen und Vermutungen der Schüler und Schülerinnen zu Beginn eines Programmes aus Gründen der besseren und schnelleren Umsetzbarkeit empfehlen. Im dritten Teil meiner Studie beschäftigte ich mich mit der Anwendung von Concept Maps (siehe Kapitel V). Diese Methode des Vernetzens von altem und neu erworbenem Wissen ist effektiv, aber weder in deutschen Schulen, noch in botanischen Gärten weit verbreitet. Eine Gruppe folgte ausschließlich dem lehrerzentrierten Lernen an Stationen zu Wasser und Pflanzen (NCM), eine zweite Gruppe erstellte direkt im Anschluss an das lehrerzentrierte Lernen an Stationen sowie direkt vor dem Behaltenstest eine Concept Map (CM). Die erste Map diente hierbei als Sicherungsform des gerade Gelernten und die späte Map als Wiederholung des vor circa sechs Wochen Gelernten. Als Evaluationsinstrument diente erneut der eigens entwickelte Multiple-Choice-Wissenstest aus der ersten Teilstudie. Die CM-Gruppe zeigte einen signifikant größeren Lernzuwachs, kurz- wie auch langfristig, im Vergleich zur NCM-Gruppe, obwohl die CM-Gruppe im Vortest signifikant schlechter war. Im Hinblick auf die Geschlechter haben die Mädchen vor allem von der ersten Sicherungs-Map und die Jungen mehr von der Wiederholungs-Map profitiert. Anhand der Ergebnisse kann man schlussfolgern, dass vor allem schwächere Schüler und Schülerinnen von dieser Methode profitieren. Außerdem zeigen die Ergebnisse zu den Geschlechtern, dass das mehrmalige Anwenden von Concept Maps unterschiedliche Lerntypen fördern kann. Bei jeder der drei Studien gab es eine Kontrollgruppe (C), die ausschließlich die Fragebögen im Abstand von sechs bis acht Wochen in der Schule beantworten musste. Dies diente dem Ausschließen von Vorkomnissen in der Öffentlichkeit und dem Umfeld der Schüler und Schülerinnen, was deren Wissen zu Wasser und Pflanzen und dem Lotuseffekt hätte erheblich steigern können. Vor allem das Lernen an Stationen sowie die Concept Maps lassen sich sehr gut am ASL botanischer Garten durchführen und können zu einem größeren Lernerfolg führen. Am besten spricht man hier die meisten Lerntypen an, wenn man während der Programme möglichst viele verschiedene Methoden anwendet. Dazu kommt, dass man neben den Methoden aus der Schule natürlich auch die des ASL einbringt und so der Unterricht automatisch anschaulicher, offener und praktischer wird. Dies alles hat dazu geführt, das alle Gruppen langfristig signifikant dazu gelernt haben. KW - Konstruktive Didaktik KW - Out-of-school learning settings KW - botanical gardens KW - conceptual change KW - learning at workstations KW - concept maps KW - Botanischer Garten KW - Lernort KW - Stationenarbeit Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111620 ER - TY - THES A1 - Huber, Annette T1 - Chlamydial deubiquitinase ChlaDUB1 as regulator of host cell apoptosis and new target for anti-chlamydial therapy T1 - Die chlamydiale Deubiquitinase ChlaDUB1 als Regulator der Wirtszellapoptose und neue Zielstruktur in der anti-chlamydialen Therapie N2 - Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that replicates inside a vacuole, the so-called inclusion. During replication by a biphasic life-cycle Chlamydia secrete via their type 3 secretion system various effector proteins into the inclusion lumen, the inclusion membrane or the host cell cytosol to form their favored replication niche. Chlamydia-infected cells are highly resistant against apoptosis since the replicative form of Chlamydia is non-infectious and premature cell death would cause complete loss of one Chlamydia generation. The bacteria block apoptosis by preventing mitochondrial outer membrane permeabilization. Various proteins with anti-apoptotic function are enriched in Chlamydia-infected cells such as Mcl-1, cIAP2, Survivin or HIF1α. The accumulation of these proteins is a result of increased gene expression and direct protein stabilization. However, the molecular mechanisms and involved bacterial effector proteins are mostly unknown. With this work the molecular mechanisms of Mcl-1 stabilization and the participation of chlamydial factors were investigated. Mcl-1 is a member of the Bcl-2 protein family and has an extremely short half-life causing its permanent ubiquitination and subsequent degradation by the 26S proteasome under normal homeostasis whilst Mcl-1 accumulation results in apoptosis inhibition. It was shown that during C. trachomatis infection Mcl-1 ubiquitination is reduced causing its stabilization albeit no cellular ubiquitin-proteasome-system components are involved in this process. However, C. trachomatis express the two deubiquitinases ChlaDUB1 and ChlaDUB2 which are mostly uncharacterized. With this work the expression profile, subcellular localization, substrates and function of the deubiquitinases were investigated. It was shown that ChlaDUB1 is secreted to the surface of the inclusion where it interacts with Mcl-1 which is accumulated in the proximity of this compartment. By utilization of infection experiments, heterologous expression systems and in vitro experiments a direct interaction of ChlaDUB1 and Mcl-1 was demonstrated. Furthermore, it was shown that Mcl-1 is deubiquitinated by ChlaDUB1 causing its stabilization. During replicative phase of infection, ChlaDUB2 seems to be accumulated in the chlamydial particles. However, ChlaDUB2 substrates could not be identified which would give an indication for the physiological role of ChlaDUB2. Since 2011, a protocol to transform C. trachomatis with artificial plasmid DNA is available. As part of this work the transformation of C. trachomatis with plasmid DNA suitable for the permanent or inducible protein overexpression on a routinely basis was established. In addition, the first targeted homologous recombination into the chlamydial genome to replace the ChlaDUB1 gene by a modified one was performed and validated. The targeted homologous recombination was also used to create a ChlaDUB1 knock-out mutant; however deletion of ChlaDUB1 seems to be lethal for C. trachomatis. Due to the fact that ChlaDUB1-lacking Chlamydia could not be obtained an inhibitor screen was performed and identified CYN312 as a potential ChlaDUB1 inhibitor. Application of CYN312 during infection interfered with chlamydial growth and reduced Mcl-1 quantity in infected cells. Furthermore, CYN312 treated Ctr-infected cells were significantly sensitized for apoptosis. Taken together, C. trachomatis secretes the deubiquitinase ChlaDUB1 to the surface of the inclusion where it deubiquitinates Mcl-1 causing its accumulation in infected cells resulting in apoptosis resistance. Application of the ChlaDUB1 inhibitor CYN312 interferes with Mcl-1 stabilization sensitizing infected cells for apoptosis. N2 - Chlamydia trachomatis ist ein obligat intrazelluläres Bakterium, welches sich in einer Vakuole, der sogenannten Inclusion vermehrt. Chlamydien durchlaufen einen zweiphasigen Entwicklungszyklus während welchem sie zu bestimmten Zeitpunkten der Infektion Effektorproteine mittels ihres Typ 3 Sekretionssystems in das Inclusionslumen, die Inclusionsmembran oder das Wirtszellzytoplasma sekretieren. Durch die Aktivität der Effektorproteine schaffen die Chlamydien die für sie favorisierten Bedingungen. Zusätzlich zeigen infizierte Zellen eine hohe Resistenz gegenüber Apoptose. Ein vorzeitiger Zelltod der Wirtszelle würde zum Verlust einer vollständigen Generation an Chlamydien führen, da die replizierende Form der Chlamydien nicht infektiös ist. Chlamydien hemmen die Wirtszellapoptose indem sie die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran verhindern. Es ist bekannt, dass mehrere anti-apoptotische Proteine wie Mcl-1, cIAP2, Survivin oder HIF1α während der Infektion mit Chlamydien zu bestimmten Zeitpunkten angereichert werden und für die Apoptoseinhibition wichtig sind. Allerdings sind die molekularen Mechanismen sowie die beteiligten bakteriellen Proteine weitestgehend unbekannt. Mit dieser Arbeit wurden die molekularen Mechanismen der Mcl-1 Stabilisierung sowie die darin involvierten chlamydialen Proteine untersucht. Mcl-1, ein Mitglied der Bcl-2 Proteinfamilie, ist ein extrem instabiles Protein welches unter normalen Bedingungen permanent ubiquitiniert und vom 26S Proteasom abgebaut wird; eine Anreicherung von Mcl-1 hingegen führt zur Apoptoseinhibierung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass während der Chlamydieninfektion Mcl-1 weniger ubiquitiniert wird was dessen Stabilisierung zur Folge hat. Es konnte jedoch keine Beteiligung von Komponenten des zellulären Ubiquitin-Proteasom-Systems festgestellt werden. C. trachomatis exprimiert zwei Deubiquitinasen welche weitestgehend uncharakterisiert sind. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es das Expressionsprofil, die Lokalisierung, Substrate und die Funktion der Deubiquitinasen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass ChlaDUB1 zur Oberfläche der Inclusion sekretiert wird und dort mit Mcl-1 interagiert, welches in diesem Kompartiment angereichert vorliegt. Unter Verwendung von Infektionsmodellen, heterologen Expressionssystemen sowie in vitro Experimenten konnte eine direkte Bindung beider Proteine sowie die spezifische Deubiquitinierung von Mcl-1 durch ChlaDUB1 gezeigt werden. Durch die permanente Deubiquitinierung mittels ChlaDUB1 wird Mcl-1 stabilisiert und im Bereich der Inclusionsoberfläche angereichert. Im Gegensatz zu ChlaDUB1 konnte ChlaDUB2 während der replikativen Phase der Infektion nicht im Zytoplasma sondern lediglich innerhalb der Bakterien detektiert werden. Außerdem konnten bislang keine Substrate für ChlaDUB2 identifiziert werden, welche auf die physiologische Funktion dieses Effektors schließen lassen könnten. Seit 2011 ist ein Protokoll für die Transformation von Chlamydien mit artifizieller Plasmid-DNA verfügbar. Als Teil dieser Arbeit wurde die routinemäßige Transformation von Chlamydien mit Plasmid-DNA zur permanenten und induzierbaren Proteinüberexpression etabliert. Außerdem konnte die erste gezielte homologe Rekombination ins chlamydiale Genom durchgeführt werden. Hierbei wurde das ChlaDUB1-Gen durch eine modifizierte Form ersetzt. Die Herstellung einer ChlaDUB1-Deletionsmutante mittels homologer Rekombination war jedoch nicht erfolgreich, da ChlaDUB1 vermutlich essentiell für C. trachomatis ist. Da ChlaDUB1-defiziente Chlamydien nicht generiert werden konnten, wurde ein Inhibitorscreen durchgeführt und CYN312 als ChlaDUB1-Inhibitor identifiziert. Die Anwendung von CYN312 während Infektionsversuchen zeigte eine deutliche Reduktion des Chlamydienwachstums sowie eine verminderte Mcl-1 Stabilisierung. Als Folge dessen waren Chlamydien-infizierte und mit CYN312 behandelte Zellen signifikant für die Apoptoseinduktion sensibilisiert. Mit der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass C. trachomatis die Deubiquitinase ChlaDUB1 während der Infektion an die Oberfläche der Inclusion sekretiert. Dort katalysiert ChlaDUB1 die Deubiquitinierung von Mcl-1 was dessen Anreicherung in infizierten Zellen und somit eine erhöhte Apoptoseresistenz zur Folge hat. Die Verwendung des ChlaDUB1-Inhibitors CYN312 verhindert die Mcl-1 Stabilisierung und sensibilisiert somit infizierte Zellen für Apoptose. KW - Chlamydia trachomatis KW - Apoptosis KW - Chlamydia trachomatis KW - Apoptosis KW - secreted effector protein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110013 ER - TY - THES A1 - Hondke, Sylvia T1 - Elucidation of WISP3 function in human mesenchymal stem cells and chondrocytes T1 - Aufklärung der WISP3 Funktion in humanen mesenchymalen Stammzellen und Chondrozyten N2 - WISP3 is a member of the CCN family which comprises six members found in the 1990’s: Cysteine-rich,angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) and the Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6).They are involved in the adhesion, migration, mitogenesis, chemotaxis, proliferation, cell survival, angiogenesis, tumorigenesis, and wound healing by the interaction with different integrins and heparan sulfate proteoglycans. Until now the only member correlated to the musculoskeletal autosomal disease Progressive Pseudorheumatoid Dysplasia (PPD) is WISP3. PPD is characterised by normal embryonic development followed by cartilage degradation over time starting around the age of three to eight years. Animal studies in mice exhibited no differences between knock out or overexpression compared to wild type litter mates, thus were not able to reproduce the symptoms observed in PPD patients. Studies in vitro and in vivo revealed a role for WISP3 in antagonising BMP, IGF and Wnt signalling pathways. Since most of the knowledge of WISP3 was gained in epithelial cells, cancer cells or chondrocyte cell lines, we investigated the roll of WISP3 in primary human mesenchymal stem cells (hMSCs) as well as primary chondrocytes. WISP3 knock down was efficiently established with three short hairpin RNAs in both cell types, displaying a change of morphology followed by a reduction in cell number. Simultaneous treatment with recombinant WISP3 was not enough to rescue the observed phenotype nor increase the endogenous expression of WISP3. We concluded that WISP3 acts as an essential survival factor, where the loss resulted in the passing of cell cycle control points followed by apoptosis. Nevertheless, Annexin V-Cy3 staining and detection of active caspases by Western blot and immunofluorescence staining detected no clear evidence for apoptosis. Furthermore, the gene expression of the death receptors TRAILR1 and TRAILR2,important for the extrinsic activation of apoptosis, remained unchanged during WISP3 mRNA reduction. Autophagy as cause of cell death was also excluded, given that the autophagy marker LC3 A/B demonstrated to be uncleaved in WISP3-deficient hMSCs. To reveal correlated signalling pathways to WISP3 a whole genome expression analyses of WISP3-deficient hMSCs compared to a control (scramble) was performed. Microarray analyses exhibited differentially regulated genes involved in cell cycle control, adhesion, cytoskeleton and cell death. Cell death observed by WISP3 knock down in hMSCs and chondrocytes might be explained by the induction of necroptosis through the BMP/TAK1/RIPK1 signalling axis. Loss of WISP3 allows BMP to bind its receptor activating the Smad 2/3/4 complex which in turn can activate TAK1 as previously demonstrated in epithelial cells. TAK1 is able to block caspase-dependent apoptosis thereby triggering the assembly of the necrosome resulting in cell death by necroptosis. Together with its role in cell cycle control and extracellular matrix adhesion, as demonstrated in human mammary epithelial cells, the data supports the role of WISP3 as tumor suppressor and survival factor in cells of the musculoskeletal system as well as epithelial cells. N2 - WISP3 ist ein Mitglied der CCN-Familie, die aus sechs Familienmitgliedern besteht und in den 1990er Jahren endeckt wurde: Cysteine-rich, angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) und den Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6). Die CCN-Proteine sind durch ihre Interaktion mit verschiede- nen Integrinen und Heparansulfaten involviert in die Regulation der Adhäsion, der Migration, der Mi- togenese, der Chemotaxis, der Proliferation, des Zellüberlebens, der Angiogenese, der Tumorgenese und der Wundheilung. WISP3 ist momentan das einzige Mitglied, das direkt mit einer muskuloskelettalen Erkrankung, der Progressiven Pseudorheumatoiden Dysplasie (PPD), assoziiert wird. PPD ist charakter- isiert durch eine normale embryonale Entwicklung mit fortschreitender Knorpeldegeneration beginnend im Alter von drei bis acht Jahren. Tierversuche mit knock out oder Überexpression von WISP3 in Mäusen waren nicht in der Lage die Symptome der Erkrankung nachzustellen, da keine Unterschiede im Vergleich zu den Wurfgeschwistern beobachtbar waren. In vitro und in vivo Studien offenbarten eine antagonisierende Rolle für WISP3 im BMP, IGF und Wnt Signalweg. Da die meisten Informationen über WISP3 jedoch in Epithel- und Krebszellen sowie immortalisierten Chondrozytenzelllinien generiert wurden, untersuchten wir die Rolle von WISP3 in primären humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSZs) und primären Chondrozyten. Der WISP3 knock down wurde mit drei short hairpin RNAs in beiden Zelltypen etabliert und wies eine veränderte Zellmorphologie sowie eine reduzierte Zellzahl auf. Knock down mit gleichzeitiger rekombi- nanter WISP3-Behandlung konnte den beobachteten Phänotyp sowie den Zellverlust nicht retten und auch eine Änderung der endogenen Genexpression von WISP3 war nicht zu detektieren. Schlussfolgernd muss WISP3 ein wichtiger Überlebensfaktor sein, dessen Verlust zur Überschreitung von Zellzyklus- Kontrollpunkten führt, was in Apoptose mündet. Apoptosenachweise wie Annexin V-Cy3 Färbung, Immunfluoreszenzfärbung und Western blot für aktive Caspasen lieferten keine positiven Beweise für diese Form des Zelltodes. Auch die Genexpression der Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2, wichtig für die extrinsische Aktivierung der Apoptose, zeigte kein verändertes Expressionsmuster in WISP3-defizienten hMSZs. Autophagie als Zelltod wurde ebenfalls ausgeschlossen, nachdem im West- ern Blot kein gespaltene Form des Autophagiemarkers LC3 A/B zu detektieren war. Um die Rolle von WISP3 beim Zelltod weiter zu entschlüsseln, wurden Genom-Expressionsanalysen von WISP3-defizienten hMSZs im Vergleich zu Kontroll-hMSZs angefertigt. Die Analysen ergaben unterschiedlich regulierte Gene vor allem in den Bereichen Zellzyklus-Regulation, Adhäsion, Zytoskelett und Zelltod. Der durch WISP3-Verlust ausgelöste Zelltod kann möglicherweise durch die Aktivierung der Nektroptose über den BMP/TAK1/RIPK1 Signalweg erklärt werden. Es ist bekannt, dass WISP3 BMP4 bindet und so dessen Bindung an den Rezeptor verhindert. Bei WISP3 Verlust bindet BMP4 an seinen Rezeptor und aktiviert den Smad 2/3/4 Komplex der wiederum TAK1 phosphoryliert, wie zuvor in Epithelzellen demonstriert. TAK1 ist in der Lage die Caspase-induzierte Apoptose zu blockieren und auf diese Weise die Bildung des Nekrosomes auszulösen, welches zum Zelluntergang durch Nekroptose führt. Zusammen mit seiner Rolle in der Zellzyklus-Kontrolle und der extrazellulären Matrixadhäsion, die in humanen Brustepithelialzellen nachgewiesen wurden, unterstützen diese Daten eine Rolle für WISP3 als Tumorsuppressor und Überlebensfaktor in Zellen des Epithel und des muskuloskelettalen Systems. KW - Knorpelzelle KW - PPD KW - mesenchymal stem cells KW - cell death KW - chondrocytes KW - Mesenchymzelle KW - Dysplasie KW - Genexpression KW - Werk Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109641 ER - TY - THES A1 - Herrmann, Alexander Michael T1 - CD8+ Lymphozyten mediierter Angriff auf Neuronen des ZNS: Relevanz von Granzym B und Perforin für akute elektrophysiologische Veränderungen T1 - CD8+ lymphocyte-mediated attack on neurons of the CNS: Relevance on granzyme B and perforin for acute electrophysiological alterations N2 - Zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten spielen in vielen inflammatorischen, aber auch primär neurodegenerativen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Daher besitzt die Fragestellung inwiefern CD8+ ZTL Neurone direkt schädigen und ggf. welche mechanistischen Aspekte dieser Schädigung zugrunde liegen, eine hohe Relevanz. Um diese Fragestellung eingehender zu beleuchten, wurde mit dem OT-I-System gearbeitet. Dieses gut vorcharakterisierte CD8+ T-Zell-Modell besitzt den Vorteil, dass diese transgenen Zellen nur eine Peptidsequenz des Ovalbumin (OVA) Protein als spezifisches Antigen erkennen. Zunächst wurden in der vorliegenden Arbeit Co-Kultivierungs-Experimente durchgeführt. Hierzu wurden akut isolierte murine Hippokampus-Neurone unter verschiedenen Bedingungen mit OT-I Lymphozyten co-kultiviert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass unter Antigenpräsentation der Neurone signifikant mehr Neurone in die Apoptose/Nekrose geführt werden, als unter Kontroll-Bedingungen, in denen entweder kein Antigen oder ein Antigen, das nicht von OT-I Lymphozyten erkannt wird, präsentiert wird. Nachdem die Antigen-abhängigen zytotoxischen Effekte auf Neurone gezeigt werden konnten, wurde mithilfe elektrophysiologischer Techniken die mechanistischen und funktionellen Konsequenzen des direkten neuronalen/OT-I-vermittelten Zellkontakts untersucht. Bei diesem experimentellen Ansatz wurde durch elektrisches Auslenken eines Neurons nach Kontakt mit einem OT-I Lymphozyt die passiven elektrischen Parameter der Neuronenmembran gemessen. In diesen Messungen konnte gezeigt werden, dass nach unmittelbarem Kontakt eines Neurons mit einem OT-I Lymphozyt der neuronale Membranwiderstand reduziert wird bzw. die Leitfähigkeit der Zellmembran erhöht wird. Diese Änderung der neuronalen Membran-Leitfähigkeit findet in einem Zeitraum von 10 min nach dem Zell-Zell-Kontakt statt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass dieser Einfluss von OT-I Lymphozyten auf Neurone strikt Antigen-abhängig ist. Zur Untersuchung des Mechanismus der OT-I T-Lymphozyten auf Neurone wurde das Augenmerk auf verschiedene T-Zell-induzierte Apoptosewegegelegt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Blockieren der Fas/FasL-Interaktion mittels eines Antikörpers kein Unterschied, weder in der neuronalen Apoptoserate nach Co-Kultivierung, noch eine Änderung der passiven neuronalen Membran-Leitfähigkeit auftritt. Weiterhin wurde die Rolle der von T-Zellen sezernierten Granula Perforin und Granzym B untersucht. Um den Einfluss dieser Granula aufzuklären, wurden OT-I Lymphozyten verwendet, die entweder defizient für Perforin oder Granzym B waren. In diesem experimentellen Ansatz wurde gezeigt, dass ausschließlich Perforin für die Erniedrigung des passiven neuronalen Membran-Widerstandes verantwortlich ist. Diese Erhöhung der neuronalen Membranleitfähigkeit führte aber nicht direkt zum neuronalen Zelltod. Vielmehr wurde durch die einhergehende Depolarisation des Neurons die elektrische Aktivität der Zelle vermindert, sodass es zu einem sogenannten „electrical silencing“ kommt. Dieser Umstand konnte auch in der Betrachtung der spontanen Netzwerkaktivität von Neuronenkulturen gezeigt werden. Hierfür wurden hoch dichte Neuronenkulturen auf MEA-Chips kultiviert. Mit Hilfe dieser MEA konnten die Summenfeldpotentiale der Neuronenkulturen detektiert werden. Hierbei wurde beobachtet, dass nach Beladung der Neuronen mit dem spezifischen OT-I-Antigen und OT-I Zellen eine Verringerung der spontanen Netzwerkaktivität einhergeht. Auch in diesem Effekt konnte eine Antigen-Spezifität nachgewiesen werden. Da der Prozess der zellulären Apoptose mit einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration einhergeht, und Perforin als Ca2+-durchlässiger unselektiver Porenbildner fungiert, wurden zur Überprüfung der Hypothese calcium imaging-Experimente durchgeführt. Analog zu den elektrophysiologischen Messungen wurde gezeigt, dass nach direktem Zell-Zell-Kontakt zwischen Neuron und OT-I Lymphozyt eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration zu messen ist. Dass diese Änderung des neuronalen Ca2+-Einstroms durch Perforin-abhängige Membranporen hervorgerufen wird, konnte durch die Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten bewiesen werden. Unter Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten wurde keine Änderung der neuronalen Ca2+-Konzentration ermittelt. Weiterhin wurde in diesem experimentellen Ansatz gezeigt, dass auch der OT-I-vermittelte neuronale Ca2+-Anstieg strikt Antigen-abhängig ist.Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass MHC-I/Antigen-vermittelte CD8+ Lymphozyten-Interaktion mit einem Neuron zu „electrical silencing“ des Neurons führt. Dieser Prozess ist klar Perforin-abhängig, führt jedoch nicht zum unmittelbaren Zelltod des Neurons. N2 - Cytotoxic CD8+ T cells are considered as important effector cells contributing to neuronal damage in inflammatory and primary degenerative disorders in the CNS. Hence, it is highly relevant to know to what extent CD8+ T-lymphocytes can contribute to neuronal damage in these disorders. To challenge this question, we used the murine OT-I system. The advantage of this well-characterized transgenic model is that OT-I CD8+ T-lymphocytes are restricted to one single antigen – one peptide sequence of Ovalbumin (Ova). In a first set of experiments, OT-I lymphocytes were co-cultured with neurons that presented Ova in a MHC-I specific context on their surface. As control, neurons without any antigen or neurons that presented a scrambled peptide form (SIY) were used. These co-culture experiments indicates that neuronal killing by OT-I lymphocytes is a MHC-I and antigen-dependent mechanism. To clarify the underlying mechanism and the functionally consequences in this OT-I/neuron interaction, we performed electrophysiological patch-clamp analysis to measure the influence from one single OT-I T-cell on a single neuron. For this purpose, we established a special protocol to stimulate the neuronal membrane to measure the passive electrical parameters after a direct OT-I contact. These measurements revealed a significant antigen restricted reduction in neuronal membrane resistance. This effect could be detected within 10 min after the direct cell-cell contact. To challenge the underlying cellular mechanisms we analyzed several known apoptosis pathways. In a first set of experiments, we investigated the Fas/FasL interaction. To answer this question, we used a blocking FasL antibody, to interrupt this pathway. These experiments showed no changes in neuronal apoptosis, neither in co-cultivation experiments nor in the electrophysiological situation. As next step we investigate the role of CD8+ lymphocyte derived granula perforin and granzyme B. Therefore we used OT-I T-cells that are either deficient for perforin or granzyme B. Using these experimental conditions, we could show that only perforin is responsible for changing passive electrical parameters. However, these reductions in neuronal membrane resistance did not lead immediately in neuronal cell death, but rather led to a depolarization and therefore to an electrical silencing of the neuron. This electrical silencing was also shown to occur in the spontaneous network activity in a neuronal network. The network activity was measured on a high density neuron network cultivated on a MEA. These MEA measurements revealed a decrease in the total spike activity after loading of OT-I lymphocytes on an antigen presenting neuronal network. Due to the increase of the intracellular Ca2+ level in the process of cell death and the Ca2+ selectivity of perforin membrane pores, we hypothesized that neuronal silencing and neuronal cell death elicited by perforin pores might lead to an intracellular Ca2+ increase. To proof this hypothesis we established a calcium imaging experiment in an OT-I/neuron contact situation. These measurements were done in the same manner as the electrophysiological measurements. Ca2+ imaging indicated increasing Ca2+ levels in neurons after application of perforin releasing OT-I lymphocytes. Furthermore, these experiments revealed a strictly antigen dependence for Ca2+ increase in target cells. In conclusion, we could show that MHC-I/antigen-mediated CD8+ lymphocyte interactions with neurons led to their electrical silencing. This process was perforin dependent. However this process was not causally linked to neuronal cell death. KW - Antigen CD8 KW - T-Lymphozyt KW - Lymphozyten mediierter Angriff auf Neurone KW - Nervendegeneration KW - Lymphozyten KW - neurone Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109124 ER -