TY - THES A1 - Fischer, Robin T1 - Generating useful tools for future studies in the center of the circadian clock – defined knockout mutants for PERIOD and TIMELESS T1 - Generierung nützlicher Instrumente für zukünftige Studien im Zentrum der Inneren Uhr - definierte knockout Mutanten für PERIOD und TIMELESS N2 - To unravel the role of single genes underlying certain biological processes, scientists often use amorphic or hypomorphic alleles. In the past, such mutants were often created by chance. Enormous approaches with many animals and massive screening effort for striking phenotypes were necessary to find a needle in the haystack. Therefore at the beginning chemical mutagens or radiation were used to induce mutations in the genome. Later P-element insertions and inaccurate jump-outs enabled the advantage of potential larger deletions or inversions. The mutations were characterized and subsequently kept in smaller populations in the laboratories. Thus additional mutations with unknown background effects could accumulate. The precision of the knockout through homologous recombination and the additional advantage of being able to generate many useful rescue constructs that can be easily reintegrated into the target locus made us trying an ends-out targeting procedure of the two core clock genes period and timeless in Drosophila melanogaster. Instead of the endogenous region, a small fragment of approximately 100 base pairs remains including an attP-site that can be used as integration site for in vitro created rescue constructs. After a successful ends-out targeting procedure, the locus will be restored with e.g. flies expressing the endogenous gene under the native promoter at the original locus coupled to a fluorescence tag or expressing luciferase. We also linked this project to other research interests of our work group, like the epigenetic related ADAR-editing project of the Timeless protein, a promising newly discovered feature of time point specific timeless mRNA modification after transcription with yet unexplored consequences. The editing position within the Timeless protein is likewise interesting and not only noticed for the first time. This will render new insights into the otherwise not-satisfying investigation and quest for functional important sequences of the Timeless protein, which anyway shows less homology to other yet characterized proteins. Last but not least, we bothered with the question of the role of Shaggy on the circadian clock. The impact of an overexpression or downregulation of Shaggy on the pace of the clock is obvious and often described. The influence of Shaggy on Period and Timeless was also shown, but for the latter it is still controversially discussed. Some are talking of a Cryptochrome stabilization effect and rhythmic animals in constant light due to Shaggy overexpression, others show a decrease of Cryptochrome levels under these conditions. Also the constant light rhythmicity of the flies, as it was published, could not be repeated so far. We were able to expose the conditions behind the Cryptochrome stabilization and discuss possibilities for the phenomenon of rhythmicity under constant light due to Shaggy overexpression. N2 - Um die Rolle einzelner Gene hinter biologischen Prozessen zu entschlüsseln, bedienen sich Wissenschaftler häufig amorpher oder hypomorpher Allele. Diese wurden in der Vergangenheit oft auf Zufall basierend generiert. Gewaltige Ansätze mit zahllosen Tieren unter enormem Selektionsaufwand bei der Suche nach markanten Phänotypen waren notwendig um sprichwörtlich die Nadel im Heuhaufen zu finden. Zunächst wurden chemische Mutagene oder Strahlung verwendet um Mutationen im Genom zu induzieren. Später kamen P-element Insertionen und induziertes unpräzises Herausspringen der Transposons dazu. Das hatte den Vorteil, dass so unter Umstände größere Deletionen oder Inversionen entstanden. Die Mutationen wurden charakterisiert und die Tiere anschließend in kleinen Populationen gehalten. Dadurch konnten sich zusätzliche Mutationen mit möglichen Hintergrundeffekten unbemerkt ansammeln. Ebenso blieben weitere durchaus mögliche Mutationen aufgrund der Mutagene und dem deutlicheren Phänotyp der primären Mutation oftmals unbemerkt. Die Präzision eines Knockouts durch homologe Rekombination und der Vorteil, zusätzlich im Stande zu sein, jedes entworfene Rettungskonstrukt auf einfache Weise wieder einsetzen zu können, überzeugte uns, eine Ends-out Targeting Prozedur mit den zwei Uhr Basisgenen period und timeless in Drosophila melanogaster durchzuführen. Dabei soll ein geplanter Knockout zu einer kompletten Deletion des gesamten Bereichs durch homologe Rekombination führen. Anstelle der endogenen Region verbleibt lediglich ein kleines Fragment von ungefähr 100 Basenpaaren inklusive einer attP-Stelle, die als Insertionsstelle für in vitro hergestellte Konstrukte genutzt werden kann. Angestrebte Ziele sind beispielsweise Fliegen, die das endogene Gen unter der Kontrolle des ursprünglichen Promoters am originalen Lokus gebunden an einen Fluoreszenzmarker oder aber gekoppelt an Luziferase exprimieren. Wir koppelten dieses Projekt zusätzlich mit anderen Forschungsinteressen unserer Arbeitsgruppe, wie zum Beispiel dem epigenetischen ADAR-Editierungsprojekt des Timeless Proteins, einer vielversprechenden Neuentdeckung zeitpunktspezifischer und posttranskriptionaler Modifizierung der timeless mRNA, mit bisher noch unbekannten Folgen. Die Position der Editierung innerhalb des Timeless Proteins ist ebenfalls sehr interessant und nicht zum ersten Mal im Fokus von Wissenschaftlern. Dies wird neue Einblicke in die sonst bislang nicht zufriedenstellende Suche nach funktionell wichtigen Strukturen von Timeless bringen, welche aufgrund der geringen Homologie zu anderen bisher charakterisierten Proteinen bislang nur unzureichend bestimmt werden konnten. Zuletzt beschäftigten wir uns mit der Frage nach der Rolle von Shaggy bezüglich der inneren Uhr. Der Einfluss einer Überexpression oder Herabregulierung von Shaggy auf die Taktung der Uhr ist eindeutig und wurde schon oft beschrieben. Der Einfluss von Shaggy auf Period und Timeless wurde ebenfalls bereits gezeigt, wird jedoch im Falle des letzteren Proteins noch sehr kontrovers diskutiert. Während einige von einem Cryptochrom stabilisierenden Effekt und rhythmischen Tieren in konstanter Beleuchtung aufgrund von Shaggy Überexpression sprechen, zeigen andere einen Abfall des Cryptochromlevels unter eben genau diesen Umständen. Es war uns möglich die Umstände hinter der Cryptochromstabilisierung aufzudecken. Darüber hinaus zeigen wir mögliche Gründe für das Phänomen des Rhythmus im Dauerlicht von Shaggy Überexpressionstieren auf. KW - Biologische Uhr KW - Circadian clock KW - Period KW - Timeless KW - Genetic engineering KW - Shaggy KW - Taufliege KW - Knockout Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119141 ER - TY - THES A1 - Ramos Tirado, Mario T1 - Stammzellbasierte Behandlungsstrategien zur Stimmlippenaugmentation und laryngealen Defektrekonstruktion T1 - Stem cell-based treatment strategies for laryngoplasty and reconstruction of laryngeal defects N2 - Der Kehlkopf ist ein stimmerzeugendes knorpelhaltiges Organ und spielt eine wichtige Rolle in der Atemfunktion und beim aspirationsfreien Schluckakt. Funktionsstörungen des Kehlkopfs wie Stimmbandlähmungen werden durch Schädigungen des Kehlkopfnervs nach operativen Eingriffen und Halsverletzungen hervorgerufen. Des Weiteren führen durch Traumen, Teil- und komplette Resektionen verursachte Substanzdefekte des Kehlkopfs zu Funktionsverlusten. Die hierfür notwendigen und komplexen Rekonstruktionen werden durch das schlechte Regenerationspotential von Knorpelgewebe eingeschränkt und können nur bedingt durch synthetische Ersatzmaterialen oder körpereigenes Ersatzgewebe bewerkstelligt werden. Ist es möglich, mit Hilfe des Tissue Engineerings aus körpereigenen Stammzellen und biokompatiblen Trägermaterialien implantierbares Knorpelersatzgewebe herzustellen, welches zur dauerhaften Wiederherstellung der Kehlkopffunktionen eingesetzt werden kann? Die zusätzliche Markierung von Stammzellen mit superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikeln (VSOP) als Zellmarker bietet die Möglichkeit der Detektion und der Verfolgung der Zellen mittels nicht-invasiver Nachweismethoden nach deren Implantation. Ist die Verwendung dieser Nanopartikel ohne negative Folgen für die Stammzellen möglich und sind diese für den Einsatz in der Laryngologie geeignet? Fettgewebsstammzellen (ASC) wurden aus humanem Liposuktionsmaterial und Kaninchen-Nackenfett isoliert und expandiert. Die Zellen wurden in Hydrogelkombinationen aus Kollagen Typ-I, Agarose, Fibrin und Hyaluronsäure eingebettet und mit den chondrogenen Wachstumsfaktoren TGF-β3, BMP-6 und IGF-I über 14 Tage differenziert. Anschließend wurden diese Zell-Hydrogelkonstrukte bezüglich Morphologie, extrazellulärer Matrixanreicherung und knorpelspezifischer Genexpression histologisch, immunhistochemisch und molekularbiologisch analysiert. In einem weiteren Schritt wurden die Integration der Zell-Hydrogelkonstrukte in natives Knorpelgewebe sowie die Defektdeckung in einem in vitro- und einem in vivo-Knorpeldefektmodell mit vor- und nicht-vordifferenzierten Zell-Hydrogelkonstrukten untersucht. Die Analyse möglicher zyto- und genotoxischer Effekte von VSOP sowie des Einflusses der Markierung von ASC mit VSOP auf die Proliferation, Migration und das Multidifferenzierungspotential erfolgte nach der Markierung der Zellen mit unterschiedlichen VSOP-Konzentrationen. Außerdem wurden VSOP-markierte ASC in Kaninchenstimmlippen injiziert und die Nachweisbarkeit dieser Zellen im Injektionsareal histologisch und mittels Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht. Nach 14-tägiger chondrogener Differenzierung wurde in den Zell-Hydrogelkonstrukten eine knorpelähnliche Morphologie, die Anreicherung knorpelspezifischer Matrixproteine und die Expression chondrogener Markergene nachgewiesen. Die Kombination der chondrogenen Wachstumsfaktoren zeigte keinen verstärkenden Einfluss auf die Chondrogenese von ASC. Hydrogele aus Kollagen Typ I und Hyaluronsäure wiesen die stärkste extrazelluläre Matrixanreicherung auf. Bei den agarosefreien Hydrogelen war eine ausgeprägte Gelschrumpfung auffällig. In den beiden Knorpeldefektmodellen konnte weder eine Integration der Zell-Hydrogelkonstrukte in den Nativknorpel noch eine vollständige Defektdeckung nachgewiesen werden. Nach der Markierung von ASC mit VSOP zeigte sich bei der höchsten Konzentration von 1,5 mM eine genotoxische Wirkung. Zytotoxische Effekte sowie Einflüsse der Markierung auf die Proliferation, Migration und das Multidifferenzierungspotential von ASC waren nicht nachweisbar. VSOP-markierte ASC konnten nach deren Injektion in Kaninchenstimmlippen im Injektionsareal nur vereinzelt mittels MRT und histologisch nachgewiesen werden. Es ist möglich, mit Hilfe des Tissue Engineerings aus körpereigenen Stammzellen und biokompatiblen Trägermaterialien implantierbares knorpelähnliches Gewebe herzustellen. Dabei begünstigen agarosefreie Trägermaterialien die chondrogene Differenzierung von ASC. Diese könnte durch die jeweilige Erhöhung der Zelldichte und Wachstumsfaktorkonzentrationen sowie die Verlängerung der Induktionszeit verstärkt werden. Eine mögliche klinische Anwendung dieser knorpelähnlichen Gewebe in der Laryngologie ist jedoch durch deren Schrumpfung wie auch mangelnde Integration und Defektdeckung noch weit entfernt. Aufgrund ihrer genotoxischen Wirkung kann eine Verwendung von VSOP als Zellmarker auch unterhalb von 1,5 mM ohne negative Folgen für den Organismus nicht sicher ausgeschlossen werden. Der inhomogene Gewebekontrast im Kehlkopf, die schlechte Auflösung im MRT und die geringe Größe von VSOP erschweren die Nachweisbarkeit und Verfolgung markierter Zellen mittels MRT. Daher sind andere nicht-invasive Nachweismethoden für die Verwendung von VSOP im Kehlkopf zu evaluieren. Der möglichen Anwendung dieser knorpelähnlichen Gewebe und VSOP in der rekonstruktiven Laryngologie muss eine erfolgreiche Optimierung und ausführliche positive Validierung in klinischen Tests vorausgehen. N2 - The larynx is a voice-producing and cartilage-containing organ that plays an important role in the respiratory function and aspiration-free swallowing. Dysfunctions of the larynx, such as vocal cord paralysis, are caused by damage to the laryngeal nerve after surgery and neck injuries. Furthermore, tissue defects caused by trauma and partial or complete resection of the larynx lead to loss of functions. The required and complex reconstructions are limited by the poor regeneration potential of cartilage, and can only be partially accomplished by synthetic graft materials or autologous replacement tissue. Is it possible to generate implantable cartilage replacement tissues that can be used for permanent restoration of laryngeal functions out of autologous stem cells and biocompatible scaffolds by the means of tissue engineering? The supplementary labeling of stem cells with very small superparamagnetic iron oxide nanoparticles (VSOP) as cell markers offers the possibility to identify and trace the cells after their implantation using non-invasive detection methods. Can VSOP be used without negative consequences for the stem cells, and are these nanoparticles suitable for application in laryngology? Adipose tissue-derived stem cells (ASC) were isolated from human liposuction material and rabbit nuchal fat. After expansion, the cells were embedded in hydrogel combinations of collagen type I, agarose, fibrin and hyaluronic acid and then differentiated with the chondrogenic growth factors TGF-β3, BMP-6, and IGF-I for 14 days. Subsequently, these cell-seeded hydrogel constructs were analyzed histologically, immunohistochemically and molecular biologically regarding morphology, extracellular matrix accumulation and cartilage-specific gene expression. In a further step, the integration of pre- and non predifferentiated cell-seeded hydrogel constructs into native cartilage tissue and defect coverage were examined in cartilage defect models in vitro and in vivo. The analysis of potential cytotoxic and genotoxic effects of VSOP, as well as the influence of the nanoparticles on proliferation, migration, and multilineage potential of ASC, was performed after labeling the cells with different VSOP concentrations. In addition, VSOP-labeled ASC were injected into rabbit vocal folds and the detectability of these cells in the injection area was examined histologically and by magnetic resonance imaging (MRI). A cartilage-like morphology, the accumulation of cartilage-specific matrix proteins and the expression of chondrogenic marker genes, was observed in the cell-seeded hydrogel constructs after 14 days of chondrogenic differentiation. The combination of the chondrogenic growth factors had no reinforcing effect on the chondrogenesis of ASC. Hydrogels of collagen type I and hyaluronic acid showed the strongest extracellular matrix accumulation. A pronounced shrinkage was observed with agarose-free hydrogels. In the cartilage defect models neither an integration of the cell-seeded hydrogel constructs into the native cartilage nor a complete defect coverage were detected. The labeling of ASC with the highest VSOP concentration of 1.5 mM induced genotoxic effects. Cytotoxic effects and influences of labeling with VSOP on proliferation, migration and multilineage potential of ASC could not be observed. After their injection into rabbit vocal folds VSOP-labeled ASC were only sporadically detected histologically and by MRI in the injection area. It is possible to generate implantable cartilage-like tissues out of autologous stem cells and biocompatible scaffolds by the means of tissue engineering. Here, agarose-free scaffolds promote the chondrogenic differentiation of ASC. This may be enhanced by increasing the cell density and growth factor concentrations as well as extending the induction time. Because of their shrinkage and the lack of integration and defect coverage, a possible clinical application of these cartilage-like tissues in laryngology is still far away. Due to the genotoxic effects of 1.5 mM VSOP, the use of these nanoparticles as cell markers without negative consequences for the organism cannot be ruled out with certainty at lower concentrations. The inhomogeneous tissue contrast in the larynx, a poor resolution in MRI and the small size of VSOP make labeled cells difficult to detect and trace in the larynx by MRI. Therefore, other non-invasive detection methods for the use of VSOP in the larynx have to be evaluated. The potential application of these cartilage-like tissues and VSOP in reconstructive laryngology must be preceded by successful optimization and extensive positive validation in clinical trials. KW - Tissue Engineering KW - Hydrogele KW - Hydrogel KW - Fettgewebsstammzellen KW - Eisenoxidnanopartikel KW - Stammzelle KW - Kehlkopf Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117528 ER - TY - THES A1 - Graver, Shannon T1 - Molecular and cellular cross talk between angiogenic, immune and DNA mismatch repair pathways T1 - Molekulare und zellulare Interaktion zwischen Angiogenese, DNA Fehlerreparatur (Mismatch Repair) und Immunologischen Signalwegen N2 - VEGF is a main driver of tumor angiogenesis, playing an important role not only in the formation of new blood vessels, but also acts as a factor for cell migration, proliferation, survival and apoptosis. Angiogenesis is a universal function shared by most solid tumors and its inhibition was thought to have the potential to work across a broad patient population. Clinical evidence has shown that inhibiting pathological angiogenesis only works in a subset of patients and the identification of those patients is an important step towards personalized cancer care. The first approved antiangiogenic therapy was bevacizumab (Avastin®), a monoclonal antibody targeting VEGF in solid tumors including CRC, BC, NSCLC, RCC and others. In addition to endothelial cells, VEGF receptors are present on a number of different cell types including tumor cells, monocytes and macrophages. The work presented in this thesis looked at the in vitro cellular changes in tumor cells and leukocytes in response to the inhibition of VEGF signaling with the use of bevacizumab. In the initial experiments, VEGF was induced by hypoxia in tumor cells to evaluate changes in survival, proliferation, migration and changes in gene or protein expression. There was a minimal direct response of VEGF inhibition in tumor cells that could be attributed to bevacizumab treatment, with minor variations in some of the cell lines screened but no uniform or specific response noted. MMR deficiency often results in microsatellite instability (MSI) in tumors, as opposed to microsatellite stable (MSS) tumors, and accounts for up to 15% of colorectal carcinomas (CRCs). It has been suggested in clinical data that MMR deficient tumors responded better to bevacizumab regimens, therefore further research used isogenic paired CRC tumor cell lines (MMR deficient and proficient). Furthermore, a DNA damaging agent was added to the treatment regimen, the topoisomerase inhibitor SN-38 (the active metabolite of irinotecan). Inhibiting VEGF using bevacizumab significantly inhibited the ability of MMR deficient tumor cells to form anchor dependent colonies, however conversely, bevacizumab treatment before damaging cells with SN-38, showed a significant increase in colony numbers. Moreover, VEGF inhibition by bevacizumab pretreatment also significantly increased the mutation fraction in MMR deficient cells as measured by transiently transfecting a dinucleotide repeat construct, suggesting VEGF signaling may have an intrinsic role in MMR deficient cells. A number of pathways were analyzed in addition to changes in gene expression profiles resulting in the identification of JNK as a possible VEGF targeted pathway. JUN expression was also reduced in these conditions reinforcing this hypothesis, however the intricate molecular mechanisms remain to be elucidated. In order to remain focused on the clinical application of the findings, it was noted that some cytokines were differentially regulated by bevacizumab between MMR proficient and deficient cells. Treatment regimens employed in vitro attempted to mimic the clinical setting by inducing DNA damage, then allowing cells to recover with or without VEGF using bevacizumab treatment. Inflammatory cytokines, CCL7 and CCL8, were found to have higher expression in the MMR deficient cell line with bevacizumab after DNA damage, therefore the cross talk via tumor derived factors to myeloid cells was analyzed. Gene expression changes in monocytes induced by tumor conditioned media showed CCL18 to be a bevacizumab regulated gene by MMR deficient cells and less so in MMR proficient cells. CCL18 has been described as a prognostic marker in gastric, colorectal and ovarian cancers, however the significance is dependent on tumor type. CCL18 primarily exerts its function on the adaptive immune system to trigger a TH2 response in T cells, but is also described to increase non-specific phagocytosis. The results of this study did show an increase in the phagocytic activity of macrophages in the presence of bevacizumab that was significantly more apparent in MMR deficient cells. Furthermore, after DNA damage MMR deficient cells treated with bevacizumab released a cytokine mix that induced monocyte migration in a bevacizumab dependent manner, showing a functional response with the combination of MMR deficiency and bevacizumab. In summary, the work in this thesis has shown evidence of immune cell modulation that is specific to MMR deficient tumor cells that may translate into a marker for the administration of bevacizumab in a clinical setting. VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte. N2 - VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte. KW - Angiogenesis KW - Immune KW - DNA Mismatch repair KW - Vascular endothelial Growth Factor KW - Inhibition KW - Angiogenese KW - Mismatch KW - DNS-Reparatur KW - Phagozytose Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108302 ER - TY - THES A1 - Zhu, Ana Cheng T1 - Metagenomic analysis of genetic variation in human gut microbial species T1 - Metagenomische Analysen der genetischen Variationen in menschlichen Darmbakterien N2 - Microbial species (bacteria and archaea) in the gut are important for human health in various ways. Not only does the species composition vary considerably within the human population, but each individual also appears to have its own strains of a given species. While it is known from studies of bacterial pan-genomes, that genetic variation between strains can differ considerably, such as in Escherichia coli, the extent of genetic variation of strains for abundant gut species has not been surveyed in a natural habitat. This is mainly due to the fact that most of these species cannot be cultured in the laboratory. Genetic variation can range from microscale genomic rearrangements such as small nucleotide polymorphism (SNP) to macroscale large genomic rearrangements like structural variations. Metagenomics offers an alternative solution to study genetic variation in prokaryotes, as it involves DNA sequencing of the whole community directly from the environment. However, most metagenomic studies to date only focus on variation in gene abundance and hence are not able to characterize genetic variation (in terms of presence or absence of SNPs and genes) of gut microbial strains of individuals. The aim of my doctorate studies was therefore to study the extent of genetic variation in the genomic sequence of gut prokaryotic species and its phenotypic effects based on: (1) the impact of SNP variation in gut bacterial species, by focusing on genes under selective pressure and (2) the gene content variation (as a proxy for structural variation) and their effect on microbial species and the phenotypic traits of their human host. In the first part of my doctorate studies, I was involved in a project in which we created a catalogue of 10.3 million SNPs in gut prokaryotic species, based on metagenomes. I used this to perform the first SNP-based comparative study of prokaryotic species evolution in a natural habitat. Here, I found that strains of gut microbial species in different individuals evolve at more similar rates than the strains within an individual. In addition, I found that gene evolution can be uncoupled from the evolution of its originating species, and that this could be related to selective pressure such as diet, exemplified by galactokinase gene (galK). Despite the individuality (i.e. uniqueness of each individual within the studied metagenomic dataset) in the SNP profile of the gut microbiota that we found, for most cases it is not possible to link SNPs with phenotypic differences. For this reason I also used gene content as a proxy to study structural variation in metagenomes. In the second part of my doctorate studies, I developed a methodology to characterize the variability of gene content in gut bacterial species, using metagenomes. My approach is based on gene deletions, and was applied to abundant species (demonstrated using a set of 11 species). The method is sufficiently robust as it captures a similar range of gene content variability as has been detected in completely sequenced genomes. Using this procedure I found individuals differ by an average of 13% in their gene content of gut bacterial strains within the same species. Interestingly no two individuals shared the same gene content across bacterial species. However, this variation corresponds to a lower limit, as it is only accounts for gene deletion and not insertions. This large variation in the gene content of gut strain was found to affect important functions, such as polysaccharide utilization loci (PULs) and capsular polysaccharide synthesis (CPS), which are related with digestion of dietary fibers. In summary, I have shown that metagenomics based approaches can be robust in characterizing genetic variation in gut bacterial species. I also illustrated, using examples both for SNPs and gene content (galK, PULs and CPS), that this genetic variation can be used to predict the phenotypic characteristics of the microbial species, as well as predicting the phenotype of their human host (for example, their capacity to digest different food components). Overall, the results of my thesis highlight the importance of characterizing the strains in the gut microbiome analogous to the emerging variability and importance of human genomics. N2 - Mikrobielle Arten (Bakterien und Archaeen) im menschlichen Darm sind wichtige Begleiter für unsere Gesundheit. Jedoch gibt es nicht nur starke Unterschiede zwischen individuellen Wirten in der Artenzusammensetzung des Darmmikrobioms, sondern es scheint sogar Individuen-spezifische Bakterienstämme zu geben. Analysen von Bakterien wie z.B. Escherichia coli haben schon früh gezeigt, dass die Genome von Bakterienstämmen derselben Art große Unterschiede aufzeigen können; jedoch wurden diese Unterschiede bisher noch nicht in einer natürlichen Umgebung gezeigt. Genetische Variation kann viele Ausprägungen haben und reicht von kleinen Veränderungen wie „small nucleotide polymorphism“ (SNP) zu makroskopischen Veränderung, wie z.B. chromosomalen Restrukturierungen. All diese genetischen Variationen wurden bis jetzt nicht in der natürlichen Umgebung der Bakterien studiert, vorallem bedingt durch fehlende Methoden um die meisten dieser Bakterien um Labor zu kultivieren. Metagenomische Studien können hier helfen, da sie unabhängig von Kultivierungen jegliche DNS aus einer natürlichen Bakteriengemeinschaft untersuchen. Jedoch wurde dies in den meisten bisher veröffentlichten metagenomischen Studien nicht ausgenutzt da diese hauptsächlich auf die Anzahl der gefunden Gene ausgerichtet waren. Das Ziel meiner Doktorarbeit war es, die genetische Variation in Darmbakterien zu beschreiben und phenotypische Veränderungen zu untersuchen. Dies habe ich umgesetzt durch die Erforschung (1) der SNP-Varianz in Darmbakterien, mit besonderem Augenmerk auf Gene, die unter einem selektivem Druck stehen und (2) der Variationen in der Genzusammensetzung eines Genomes (als eine Annäherung an strukturelle Variationen) und welchen Effekt dies auf Mikrobenarten und Wirtsphenotypen hat. Im ersten Kapitel meiner Doktorarbeit beschreibe ich meine Arbeit in einem Projekt unserer Gruppe, in dem wir basierend auf metagenomischen Daten 10 Millionen SNPs in menschlichen Darmbakterien beschrieben haben. Diesen Datensatz habe ich verwendet um die erste SNP-basierte, vergleichende Studie der Bakterienevolution in einem natürlichen Habitat zu realisieren. Ich entdeckte, dass Bakterienstämme unabhängig vom Wirt ähnliche evolutionäre Raten haben. Genauer gesagt, die evolutionäre Rate für eine Art ist stabiler zwischen Wirten, als die von verschiedenen Spezies innerhalb eines Wirtes. Ausserdem fand ich heraus, dass die Evolution von einzelnen Genen unabhängig vom restlichen Genom einer Spezies ist. Dies könnte durch einen Selektionsdruck wie z.B. die Ernährung des Wirtes ausgelöst werden, was ich am Beispiel des Galactokinasegenes (galK) gezeigt habe. Obwohl wir zeigen konnten, dass das SNP-Profil der Darmbakterien spezifisch für den jeweiligen Wirt ist, konnten wir keine Assoziation zwischen SNPs und Wirtsphänotypen finden. Auch aus diesem Grund habe ich mich in meiner weiteren Arbeit verstärkt auf makroskopische Genomvariationen konzentriert. Im zweiten Teil meiner Doktoarbeit entwickelte ich eine neue Methode, um Variationen in der genomische Zusammensetzung von einzelnen Bakterienarten zu beschreiben, wieder basierend auf metagenomischen Daten. Hierbei fokussiere ich mich insbesondere auf Gene, die in unseren metagenomischen Daten im Verglich zum Referengenom fehlen und wende dies auf die 11 dominantesten Bakterienspezies an. Diese neue Methode ist robust, da die gefundene Genomvarianz in unseren metagenomischen Daten übereinstimmt mit Daten aus komplett sequenzierten Genomen. So konnte ich herausfinden, dass im Durchschnitt 13% der Gene einer Bakterienart zwischen einzelen Wirten varieren. Besonders interessant ist hier, dass wir keine zwei Wirte gefunden haben, die für eine Bakterienart genau diesselben Gene haben. Jedoch ist die erwarte Varianz aller Wahrscheinlichkeit nach noch größer, da ich mit dieser Methode nur fehlende Gene beschreiben kann, aber nicht neu hinzugekommende. Diese Varianz kann auch wichtige bakterielle Funktionen betreffen, z.B. Gene für „polysaccharide utilization loci“ (PULs) und „capsular polysaccharide synthesis“ (CPS), welche wichtig sind um Ballaststoffe in der Nahrung zu verwerten. Zusammenfassend konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass metagenomische Methoden robust genug sind um die genetische Varianz von Darmbakterien zu beschreiben. Ausserdem konnte ich zeigen, dass die beschriebene Varianz benutzt werden kann, um phenotypische Veränderungen von Bakterien vorherzusagen (demonstriert für die galK, PULs and CPS-Gene). Dies wiederrum könnte benutzt werden um Vorhersagen für den Wirt über z.B. seine Ernährung zu machen. Meine Doktorarbeit zeigt wie wichtig es ist, einzelne Bakterienstämme zu charakterisieren, ganz analog zu der Bedeutsamkeit der genetischen Varianz des menschlichen Genomes. KW - metagenomic KW - Darmflora KW - Metagenom Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113890 ER - TY - THES A1 - Münz, Thomas Sebastian T1 - Aspects of neuronal plasticity in the mushroom body calyx during adult maturation in the honeybee Apis mellifera T1 - Aspekte neuronaler Plastizität im Pilzkörper kalyx während der Adultreifung der Honigbiene Apis mellifera N2 - Division of labor represents a major advantage of social insect communities that accounts for their enormous ecological success. In colonies of the honeybee, Apis mellifera, division of labor comprises different tasks of fertile queens and drones (males) and, in general, sterile female workers. Division of labor also occurs among workers in form of an age-related polyethism. This helps them to deal with the great variety of tasks within the colony. After adult eclosion, workers spend around three weeks with various duties inside the hive such as tending the brood or cleaning and building cells. After this period workers switch to outdoor tasks and become foragers collecting nectar, pollen and water. With this behavioral transition, workers face tremendous changes in their sensory environment. In particular, visual sensory stimuli become important, but also the olfactory world changes. Foragers have to perform a completely new behavioral repertoire ranging from long distance navigation based on landmark orientation and polarized-skylight information to learning and memory tasks associated with finding profitable food sources. However, behavioral maturation is not a purely age-related internal program associated with a change, for example, in juvenile hormone titers. External factors such as primer pheromones like the brood pheromone or queen mandibular pheromone can modulate the timing of this transition. In this way colonies are able to flexibly adjust their work force distribution between indoor and outdoor tasks depending on the actual needs of the colony. Besides certain physiological changes, mainly affecting glandular tissue, the transition from indoor to outdoor tasks requires significant adaptations in sensory and higher-order integration centers of the brain. The mushroom bodies integrate olfactory, visual, gustatory and mechanosensory information. Furthermore, they play important roles in learning and memory processes. It is therefore not surprising that the mushroom bodies, in particular their main input region, the calyx, undergo volumetric neuronal plasticity. Similar to behavioral maturation, plastic changes of the mushroom bodies are associated with age, but are also to be affected by modulating factors such as task and experience. In my thesis, I analyzed in detail the neuronal processes underlying volumetric plasticity in the mushroom body. Immunohistochemical labeling of synaptic proteins combined with quantitative 3D confocal imaging revealed that the volume increase of the mushroom body calyx is largely caused by the growth of the Kenyon cell dendritic network. This outgrowth is accompanied by changes in the synaptic architecture of the mushroom body calyx, which is organized in a distinct pattern of synaptic complexes, so called microglomeruli. During the first week of natural adult maturation microglomeruli remain constant in total number. With subsequent behavioral transition from indoor duties to foraging, microglomeruli are pruned while the Kenyon cell dendritic network is still growing. As a result of these processes, the mushroom body calyx neuropil volume enlarges while the total number of microgloumeruli becomes reduced in foragers compared to indoor workers. In the visual subcompartments (calyx collar) this process is induced by visual sensory stimuli as the beginning of pruning correlates with the time window when workers start their first orientation flights. The high level of analysis of cellular and subcellular process underlying structural plasticity of the mushroom body calyx during natural maturation will serve as a framework for future investigations of behavioral plasticity in the honeybee. The transition to foraging is not purely age-dependent, but gets modulated, for example, by the presence of foragers. Ethyl oleate, a primer pheromone that is present only in foragers, was shown to delay the onset of foraging in nurse bees. Using artificial application of additional ethyl oleate in triple cohort colonies, I tested whether it directly affects adult neuronal plasticity in the visual input region of the mushroom body calyx. As the pheromonal treatment failed to induce a clear behavioral phenotype (delayed onset of foraging) it was not possible to show a direct link between the exposure to additional ethyl oleate and neuronal plasticity in mushroom body calyx. However, the general results on synaptic maturation confirmed my data of natural maturation processes in the mushroom body calyx. Given the result that dendritic plasticity is a major contributor to neuronal plasticity in the mushroom body calyx associated with division of labor, the question arose which proteins could be involved in mediating these effects. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) especially in mammals, but also in insects (Drosophila, Cockroach), was shown to be involved in facilitating learning and memory processes like long-term synaptic potentiation. In addition to presynaptic effects, the protein was also revealed to directly interact with cytoskeleton elements in the postsynapse. It therefore is a likely candidate to mediate structural synaptic plasticity. As part of my thesis, the presence and distribution of CaMKII was analyzed, and the results showed that the protein is highly concentrated in a distinct subpopulation of the mushroom body intrinsic neurons, the noncompact Kenyon cells. The dendritic network of this population arborizes in two calyx subregions: one receiving mainly olfactory input – the lip – and the collar receiving visual input. This distribution pattern did not change with age or task. The high concentration of CaMKII in dendritic spines and its overlap with f-actin indicates that CaMKII could be a key player inducing structural neuronal plasticity associated with learning and memory formation and/or behavioral transitions related to division of labor. Interestingly CaMKII immunoreactivity was absent in the basal ring, another subregion of the mushroom body calyx formed almost exclusively by the inner compact Kenyon cells and known to receive combined visual and olfactory input. This indicates differences of this mushroom body subregion regarding the molecular mechanisms controlling plastic changes in corresponding Kenyon cells. How is timing of behavioral and neuronal plasticity regulated? The primer pheromone ethyl oleate was found in high concentrations on foragers and was shown to influence behavioral maturation by delaying the onset of foraging when artificially applied in elevated concentrations. But how is ethyl oleate transferred and how does it shift the work force distribution between indoor and outdoor tasks? Previous work showed that ethyl oleate concentrations are highest in the honeycrop of foragers and suggested that it is transferred and communicated inside the colony via trophallaxis. The results of this thesis however clearly show, that ethyl oleate was not present inside the honey crop or the regurgitate, but rather in the surrounding tissue of the honey crop. As additionally the second highest concentration of ethyl oleate was measured on the surface of the cuticle of forgers, trophallaxis was ruled out as a mode of transmission. Neurophysiological measurements at the level of the antennae (electroantennogram recordings) and the first olfactory neuropil (calcium imaging of activity in the antennal lobe) revealed that the primer pheromone ethyl oleate is received and processed as an olfactory stimulus. Appetitive olfactory conditioning using the proboscis extension response as a behavioral paradigm showed that ethyl oleate can be associated with a sugar reward. This indicates that workers are able to perceive, learn and memorize the presence of this pheromone. As ethyl oleate had to be presented by a heated stimulation device at close range, it can be concluded that this primer pheromone acts via close range/contact chemoreception through the olfactory system. This is also supported by previous behavioral observations. Taken together, the findings presented in this thesis revealed structural changes in the synaptic architecture of the mushroom body calyx associated with division of labor. For the primer pheromone ethyl oleate, which modulates the transition from nursing to foraging, the results clearly showed that it is received via the olfactory system and presumably acts via this pathway. However, manipulation experiments did not indicate a direct effect of ethyl oleate on synaptic plasticity. At the molecular level, CaMKII is a prime candidate to mediate structural synaptic plasticity in the mushroom body calyx. Future combined structural and functional experiments are needed to finally link the activity of primer pheromones like ethyl oleate to the molecular pathways mediating behavioral and synaptic plasticity associated with division of labor in Apis mellifera. The here identified underlying processes will serve as excellent models for a general understanding of fundamental mechanisms promoting behavioral plasticity. N2 - Arbeitsteilung stellt einen der wesentlichen Faktoren dar, der für den ökologischen Erfolg von sozialen Insektengemeinschaften verantwortlich ist. In Staaten der Honigbiene, Apis mellifera, umfasst die Arbeitsteilung verschiedene Aufgaben für die fertilen Königinnen und Drohnen (Männchen) beziehungsweise die gewöhnlicherweise sterilen Arbeiterinnen. Arbeitsteilung findet aber auch in Form eines altersabhängigen Polyethismus zwischen den Arbeiterinnen selber statt. Dies hilft ihnen die Vielzahl verschiedener Aufgaben im Stock zu bewältigen. Nach dem Schlupf verbringen die Arbeiterinnen etwa drei Wochen mit verschiedenen Aufgaben im Stock, wie beispielsweise Brutpflege oder Reinigen und Bauen neuer Wabenzellen. Nach dieser Zeit wechseln die Arbeiterinnen zu Aufgaben außerhalb des Stocks und werden Nektar-, Pollen- oder Wassersammlerinnen. Durch diesen Verhaltensübergang sind die Arbeiterinnen mit einem massiven Wandel ihrer sensorischen Umwelt konfrontiert. Im speziellen werden nun visuelle Reize wichtig, aber auch die olfaktorische Welt der Arbeiterinnen ändert sich. Sammlerinnen zeigen ein komplett neues Verhaltensrepertoire das von Langstreckennavigation, basierend Landmarken und dem Polarisationsmuster des Himmels, bishin zu Lern- und Gedächtnisaufgaben im Zusammenhang mit dem Auffinden profitabler Futterquellen reicht. Allerdings ist Verhaltensreifung kein rein altersbedingtes internes Programm beispielsweise basierend auf einer Veränderung des Juvenilhormon-Titers. Externe Faktoren wie beispielsweise die Primer Pheromone Brutpheromone oder Königinnenpheromon können den Zeitpunkt des Übergangs modulieren. Hierdurch sind Staaten in der Lage ihre Arbeiterkräfte flexibel zwischen Innen- und Außendienst Aufgaben zu verschieben. Neben bestimmten physiologischen Veränderungen, die vor allem Drüsengewebe betreffen, benötigt der Übergang vom Innendienst zum Außendienst deutliche Anpassungen sensorischer und höherer Integrationszentren im Gehirn. Die Pilzkörper integrieren olfaktorische, visuelle und mechanosensorische Informationen. Sie spielen weiterhin eine wichtige Rolle für Lern- und Gedächtnisvorgänge. Es ist daher nicht überraschend, dass die Pilzkörper, im Speziellen deren Haupteingangsregion, der Kalyx, eine neuronale Volumensplastizität durchlaufen. Ähnlich wie die Verhaltensreifung, sind plastische Veränderungen im Pilzkörper mit dem Alter verbunden, werden aber auch durch modulierende Faktoren wie Aufgabe und Erfahrungen beeinflusst. In meiner Dissertation habe ich detailliert die neuronalen Prozesse analysiert, die der Volumensplastizität des Pilzkörpers zugrunde liegen. Immunhistologische Färbungen synaptischer Proteine kombiniert mit quantitativer 3D Konfokalmikroskopie zeigten, dass die Volumenszunahme des Pilzkörpers hauptsächlich durch dendritisches Wachstum des Kenyon-Zellen-Netzwerks bedingt ist. Dieses Auswachsen wurde begleitet durch Veränderungen der synaptischen Architektur des Kalyx des Pilzkörpers, welcher in Form synaptischer Komplexe, sogenannter Mikroglomeruli organisiert ist. Während der ersten Woche der Adultreifung blieb die Gesamtzahl der Mikroglomeruli konstant. Im folgenden Verhaltensübergang von Innendienstaufgaben zum Sammeln, wurden die Mikroglomeruli zurückgetrimmt, während das dendritische Kenyon-Zell-Netzwerk weiterhin wuchs. Als Ergebnis dieser Prozesse vergrößerte sich das Volumen des Kalyx des Pilzkörpers während die Gesamtzahl der Mikroglomeruli bei Sammlerinnen im Vergleich zu Inndienst Arbeiterinnen reduziert war. In der visuellen Unterregion (Kragen des Kalyx) wurde dieser Prozess induziert durch sensorische Stimuli, da der Beginn des Zurücktrimmens mit dem Zeitfenster zusammenfiel, in dem die Arbeiterinnen ihre ersten Orientierungsflüge starteten. Der hohe Analysegrad der zellulären und subzellulären Prozesse, die der strukturellen Plastizität des Kalyx des Pilzkörpers während der natürlichen Reifung zugrunde liegen, wird zukünftigen Untersuchungen der Verhaltensplastizität bei Honigbienen als Referenz dienen. Der Übergang zur Sammlerin ist nicht rein altersabhängig, sondern wird beispielsweise durch die Gegenwart von anderen Sammlerinnen moduliert. Ethyloleat, ein Primer Pheromone das nur auf Sammlerinnen auftritt, verzögert das Einsetzen des Sammelns von Ammenbienen. Durch das Einbringen zusätzlichen Ethyloleats in Dreifach Kohorten, testete ich, ob es einen direkten Einfluss auf die neuronale Plastizität der visuellen Eingangsregion des Pilzkörper Kalyx hat. Da durch die Pheromon Behandlung kein eindeutiger Verhaltensphänotyp (verzögerter Sammelbeginn) induziert werden konnte, war es nicht möglich einen direkten Zusammenhang zwischen der verstärkten Ethyloleat-Exposition und der neuronalen Plastizität des Kalyx des Pilzkörpers herzustellen. Dennoch bestätigten die Beobachtungen der synaptischen Reifung meine generellen Daten zu den natürlichen Reifungsprozessen im Kalyx des Pilzkörper. Basierend auf dem Ergebnis, dass dendritische Plastizität einen wesentlichen Anteil an der arbeitsteilungsbezogenen neuronalen Plastizität des Kalyx des Pilzkörper hat, stellte sich die Frage, welche Proteine daran beteiligt sein könnten diese Effekte zu vermitteln. Von der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II (CaMKII) ist bekannt, dass sie speziell bei Säugetieren - aber bei Insekten (Drosophila, Schabe) - daran beteiligt ist, Lern- und Gedächtnisvorgänge, wie die Langzeitpotenzierung, zu ermöglichen. Neben präsynaptischen Effekten, wurde gezeigt, dass dieses Protein direkt mit Elementen des postsynaptischen Cytoskeletts interagieren kann. Als Teil meiner Dissertation habe ich das Vorkommen und die Verteilung der CaMKII analysiert. Ich konnte es hochkonzentriert in einer definierten Subpopulation der intrinsischen Pilzkörper-Neurone, den „nicht kompakten“ Kenyon Zellen, nachweisen. Das dendritische Netzwerk dieser Population verzweigt sich in zwei Kalyx Subregionen: eine olfaktorisch innervierte – die Lippe – und den Kragen, welcher optischen Eingang erfährt. Dieses Verteilungsmuster ändert sich nicht mit dem Alter oder der Aufgabe der Biene. Die hohe Konzentration von CaMKII in den dendritsichen Dornenfortsätzen und die gleichzeitige räumliche Überlappung mit f-Aktin, weisen darauf hin, dass CaMKII eine Schüsselrolle bei der Induzierung struktureller neuronaler Plastizität im Zusammenhang mit Lernen und Gedächtnisbildung und/oder Arbeitsteilung bezogener Verhaltensübergänge, zukommen könnte. Interessanterweise wies der Basalring, eine weitere Subregion des Kalyx des Pilzkörpers die dafür bekannt ist kombinierten visuellen und olfaktorischen Eingang zu erhalten und fast ausschließlich durch die „inneren kompakten“ Kenyon Zellen gebildet wird, keine Immunreaktivität auf. Dies deutet auf Unterschiede in den molekularen Mechanismen die plastische Veränderungen in den entsprechenden Kenyon zellen kontrollieren. Wie wird die zeitliche Abstimmung der Verhaltensplastizität und neuronalen Plastizität reguliert? Für das in hohen Konzentration auf Sammlerinnen vorkommende Primer Pheromon Ethyloelat konnte durch dessen Anwendung in erhöhten Konzentrationen gezeigt werden, dass es die Verhaltensreifung durch Verzögerung des Sammelbeginns beeinflussen kann. Wie aber wird Ethyloleat transferiert und wie verschiebt es die Arbeitskräfteverteilung zwischen Innen- und Außendienst Aufgaben? Frühere Arbeiten zeigten die höchste Konzentration von Ethyloleat im Sozialmagen der Sammlerinnen und schlugen vor, dass es innerhalb der Kolonie über Trophollaxis transferiert und kommuniziert wird. Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigten aber eindeutig, dass Ethyloleat nicht im Inhalt des Sozialmagen und auch nicht im Regurgitat, sondern nur im Gewebe des Sozialmagens vorhanden ist. Da zusätzlich die zweithöchste Konzentration von Ethyloleat auf der Oberfläche der Kutikula von Sammlerinnen gemessen wurde, wurde Trophollaxis als Übertragungsmodus ausgeschlossen. Neurophysiologische Messungen an der Antenne (Elektroantennografie), dem ersten olfaktorischen Neuropil (Calcium Imaging der Aktivität des Antennallobus), zeigten, dass Ethyloleat als olfaktorischer Reiz wahrgenommen und prozessiert wird. Appetitive olfaktorische Konditionierung mit Hilfe des Rüsselstreckreflexes wurde als Verhaltensparadigma verwendet um zu zeigen, dass Ethyloleat mit einer Zuckerbelohnung assoziiert werden kann. Dies deutet darauf hin, dass Arbeiterinnen in der Lage sind, die Anwesenheit dieses Pheromons zu perzipieren, zu erlernen und sich auch daran zu erinnern. Da Ethyloleat nur durch Erwärmung als Stimulus präsentiert werden konnte, lässt sich schlussfolgern, dass es über Nahbereichs/Kontakt-Chemorezeption durch das olfaktorische System wahrgenommen wird. Dies wird auch durch frühere Verhaltensbeobachtungen unterstützt. Zusammengenommen, zeigen die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse strukturelle Veränderungen in der synaptischen Architektur des Kalyx des Pilzkörpers in Zusammenhang mit Arbeitsteilung. Für das Primer Pheromone Ethyloleat, welches den Übergang von Ammendiensten zum Sammeln moduliert, zeigten die Ergebnisse eindeutig, dass es über das olfaktorische System wahrgenommen wird und vermutlich auch über diesen Weg seine Wirkung vermittelt. Dennoch konnten Manipulationsexperimente keine direkte Verbindung zwischen Ethyloleat und der synaptischen Reifung herstellen. Auf molekularer Ebene stellt CaMKII einen Topkandidaten dar, der strukturelle synaptische Plastizität im Kalyx des Pilzkörpers vermitteln kann. Eine Kombination struktureller und funktioneller Experimente ist der nächste logische Schritt um schlussendlich die Verbindung zwischen der Aktivität von Primer Pheromonen (wie Ethyloleat) und molekularen Signalwegen, die Verhaltensplastizität und synaptische Plastizität im Zusammenhang mit der Arbeitsteilung von Apis mellifera vermitteln, herzustellen. Die hierbei identifizierten zugrundeliegenden Prozesse werden als exzellente Modelle für ein generelles Verständnis der fundamentalen Mechanismen welche Verhaltensplastizität vermitteln, dienen. KW - Biene KW - Neuronale Plastizität KW - Pheromon KW - Neuronal plasticity KW - Honeybee KW - Pheromon communication KW - CaMKII KW - Division of labor KW - Neuronale Plastizität KW - Honigbiene KW - Pheromon Kommunikation KW - Arbeitsteilung Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111611 ER - TY - THES A1 - Stoll, Georg T1 - Identification of the mRNA-associated TOP3β- TDRD3-FMRP (TTF) -complex and its implication for neurological disorders T1 - Identifikation des mRNA-assoziierten TOP3β-TDRD3-FMRP (TTF) -Komplex und seine Bedeutung für neurologische Störungen N2 - The propagation of the genetic information into proteins is mediated by messenger- RNA (mRNA) intermediates. In eukaryotes mRNAs are synthesized by RNA- Polymerase II and subjected to translation after various processing steps. Earlier it was suspected that the regulation of gene expression occurs primarily on the level of transcription. In the meantime it became evident that the contribution of post- transcriptional events is at least equally important. Apart from non-coding RNAs and metabolites, this process is in particular controlled by RNA-binding proteins, which assemble on mRNAs in various combinations to establish the so-called “mRNP- code”. In this thesis a so far unknown component of the mRNP-code was identified and characterized. It constitutes a hetero-trimeric complex composed of the Tudor domain-containing protein 3 (TDRD3), the fragile X mental retardation protein (FMRP) and the Topoisomerase III beta (TOP3β) and was termed TTF (TOP3β-TDRD3-FMRP) -complex according to its composition. The presented results also demonstrate that all components of the TTF-complex shuttle between the nucleus and the cytoplasm, but are predominantly located in the latter compartment under steady state conditions. Apart from that, an association of the TTF-complex with fully processed mRNAs, not yet engaged in productive translation, was detected. Hence, the TTF-complex is a component of „early“ mRNPs. The defined recruitment of the TTF-complex to these mRNPs is not based on binding to distinct mRNA sequence-elements in cis, but rather on an interaction with the so-called exon junction complex (EJC), which is loaded onto the mRNA during the process of pre-mRNA splicing. In this context TDRD3 functions as an adapter, linking EJC, FMRP and TOP3β on the mRNP. Moreover, preliminary results suggest that epigenetic marks within gene promoter regions predetermine the transfer of the TTF-complex onto its target mRNAs. Besides, the observation that TOP3β is able to catalytically convert RNA-substrates disclosed potential activities of the TTF-complex in mRNA metabolism. In combination with the already known functions of FMRP, this finding primarily suggests that the TTF-complex controls the translation of bound mRNAs. In addition to its role in mRNA metabolism, the TTF-complex is interesting from a human genetics perspective as well. It was demonstrated in collaboration with researchers from Finland and the US that apart from FMRP, which was previously linked to neurocognitive diseases, also TOP3β is associated with neurodevelopmental disorders. Understanding the function of the TTF-complex in mRNA metabolism might hence provide important insight into the etiology of these diseases. N2 - Die Umwandlung der genetischen Information in Proteine erfolgt über Boten-RNA (mRNA) -Intermediate. Diese werden in Eukaryonten durch die RNA-Polymerase II gebildet und nach diversen Prozessierungs-Schritten der Translationsmaschinerie zugänglich gemacht. Während man früher davon ausging, dass die Genexpression primär auf der Ebene der Transkription reguliert wird, ist heute klar, dass post- transkriptionelle Prozesse einen ebenso wichtigen Beitrag hierzu leisten. Neben nicht-kodierenden RNAs und Metaboliten tragen insbesondere RNA- Bindungsproteine zur Kontrolle dieses Vorgangs bei. Diese finden sich in unterschiedlichen Kombinationen auf den mRNAs zusammen und bilden dadurch den sog. „mRNP-Code“ aus. Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine bislang unbekannte Komponente des mRNP-Codes identifiziert und charakterisiert. Es handelt es sich dabei um einen hetero-trimeren Komplex, welcher aus dem Tudor Domänen Protein 3 (TDRD3) dem Fragilen X Mentalen Retardations-Protein (FMRP) sowie der Topoisomerase III beta (TOP3β) besteht. Aufgrund seiner Zusammensetzung wurde dieser TTF (TOP3β-TDRD3-FMRP) -Komplex genannt. In der vorliegenden Arbeit konnte der Nachweis geführt werden, dass sämtliche Komponenten des TTF-Komplexes zwischen Zellkern und Cytoplasma pendeln, unter Normalbedingungen jedoch vornehmlich im Cytoplasma lokalisiert sind. Des Weiteren ließ sich eine Assoziation des TTF-Komplexes mit mRNAs nachweisen, die zwar vollständig prozessiert, jedoch noch nicht Teil der produktiven Phase der Translation sind. Der TTF-Komplex ist somit eine Komponente „früher“ mRNPs. Die Rekrutierung des TTF-Komplexes an definierte mRNPs wird nicht durch Bindung an spezifische mRNA-Sequenzelemente bedingt, sondern basiert auf einer Interaktion mit dem sog. Exon Junction Complex (EJC), welcher im Kontext des pre-mRNA Spleißens auf die mRNA geladen wird. Hierbei spielt TDRD3 als Adapter zwischen dem EJC, FMRP und TOP3β die entscheidende Rolle. Präliminäre Experimente legen darüber hinaus den Schluss nahe, dass epigenetische Markierungen im Promotor-Bereich distinkter Gene von entscheidender Bedeutung für den Transfer des TTF-Komplexes auf dessen Ziel-mRNAs sind. Einen wichtigen ersten Hinweis auf die potentielle Funktion des TTF-Komplexes im Kontext des mRNA Metabolismus erbrachte die Beobachtung, dass TOP3β in der Lage ist RNA katalytisch umzusetzen. Dieser Befund lässt in Verbindung mit den bereits beschriebenen Aktivitäten von FMRP vermuten, dass der TTF-Komplex die Translation gebundener mRNAs kontrolliert. Zusätzlich zu seiner Rolle im mRNA Metabolismus ist der TTF-Komplex auch aus humangenetischer Sicht hoch interessant. So konnte in Zusammenarbeit mit finnischen und US-amerikanischen Forschern gezeigt werden, dass neben FMRP, einem bekannten Krankheitsfaktor neurokognitiver Syndrome, auch TOP3β mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert ist. Das Verständnis der Funktion des TTF-Komplexes im mRNA Metabolismus könnte daher wichtige Einblicke in die Etiologie dieser Krankheiten liefern. KW - Messenger-RNS KW - Messenger-RNP KW - RNA binding proteins KW - mRNA metabolism KW - eukaryotic gene expression Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111440 ER - TY - THES A1 - Kuhtz, Juliane T1 - Epimutationen humaner Keimzellen und Infertilität T1 - Epimutations of human germ cells and infertility N2 - Infertilität stellt in unserer heutigen Gesellschaft ein zunehmendes Problem dar. Bei der Suche nach den der Infertilität zugrunde liegenden Ursachen gerät immer mehr die Epigenetik in den Fokus. Epigenetische Prozesse sind nicht nur in die Embryo-nalentwicklung und Wachstumsprozesse des Kindes involviert, sondern auch in korrekte Funktionsweisen von Gameten. Störungen können die Fertilität beeinträch-tigen. Eine besondere Rolle spielen geprägte Gene, die auf einem ihrer Allele, je nach parentaler Herkunft, ein Imprint in Form von DNA-Methylierung tragen. Fehl-regulationen solcher geprägter Gene können zu Imprinting-Erkrankungen führen. Seit Einführung der In-vitro-Fertilisation (IVF) wurden verschiedene assistierte Re-produktionstechniken (ART) entwickelt, um infertilen Paaren zu helfen. Die Sicher-heit dieser Techniken ist nicht abschließend geklärt. Immer wieder wird von nach ART-Behandlung gehäuft auftretenden Imprinting-Erkrankungen berichtet. Diese Erkrankungen stehen jedoch eher in Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Infertilität, als mit ART selbst. Dennoch ist es notwendig zu untersuchen inwieweit sich ART eventuell auf den Gesundheitszustand dieser Kinder auswirken könnte. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Zusammenhang von Epigenetik, Infertilität und ART von verschiedenen Standpunkten aus beleuchtet. In humanen Spermien wurde die DNA-Methylierung verschiedener geprägter Gene hinsichtlich Epimutationen untersucht. ICSI (intracytoplasmatic sperm injection) und IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) sind verschiedene Techniken zur Selektion von Spermien für eine ART-Behandlung. Hier wurde un-tersucht, ob IMSI epigenetisch bessere Spermien selektiert als die konventionelle ICSI-Methode. Außerdem ist bekannt, dass in Spermienköpfen fertiler und infertiler Männer Vakuolen vorkommen können, deren epigenetische Bedeutung jedoch un-bekannt ist. Ob diese Vakuolen in Zusammenhang mit Epimutationen stehen könn-ten, wurde ebenfalls überprüft. Dazu wurde bisulfitkonvertierte DNA weniger Sper-mien (11 je Probe) mithilfe der Limiting Dilution (LD)–Technik und Pyrosequenzie-rung analysiert. Insgesamt standen 880 Spermien für diese Untersuchung zur Ver-fügung. Es konnte kein Unterschied zwischen IMSI- und ICSI-selektierten Spermien gefunden werden. Vorhandene Vakuolen im Spermienkopf beeinträchtigten nicht die DNA-Methylierung der Gene hGTL2, hLIT1 und hPEG3. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Frage, inwieweit die Technik der In-vitro-Maturation (IVM) DNA-Methylierung in humanen Oocyten beeinflussen könnte. Bisulfitkonvertierte DNA einzelner humaner Oocyten wurde mit LD und Pyrose-quenzierung analysiert. Verglichen wurden IVM und in vivo gereifte Oocyten. Hier-für standen 139 Oocyten zur Verfügung, wovon 90 mittels IVM und 49 in vivo gereift waren. Untersucht wurden vier geprägte Gene (hGTL2, hLIT1, hPEG3 und hSNRPN) und drei nicht geprägte Gene (hDNMT3Lo, hNANOG und hOCT4). Es konnten keine IVM-bedingten Epimutationen gefunden werden. Im dritten Projekt wurde untersucht, ob sich die DNA-Methylierung normaler Sper-mien von Spermien aus Oligozoospermie-Asthenozoospermie-Teratozoospermie (OAT)–Syndrom-Patienten unterscheidet. Eine weitere Frage war, ob Epimutationen einen Einfluss auf den ART-Ausgang haben. Untersucht wurden 54 Spermienpro-ben von Paaren in ART-Behandlung. Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster der geprägten Gene hGTL2 und hPEG3 sowie der beiden nicht geprägten Pluripotenzgene hNANOG und hOCT4 wurde die Methode Deep Bisulfite Sequencing (DBS) verwendet. Dies ist eine Next Generation Sequencing (NGS)–Technik, angewandt an bisulfitkonvertierter DNA. Diese Technik ermöglicht es mehrere Proben sowie Gene gleichzeitig zu analysieren. Es zeigte sich, dass OAT-Spermien, die zu einer Lebendgeburt geführt hatten, sich epigenetisch nicht von normalen Spermien unterschieden. Besonders viele Epimutationen konnten hingegen in OAT-Spermien gefunden werden, die zu keiner Schwangerschaft ge-führt hatten. Zwischen Spermien die zu einer Lebendgeburt oder keiner Schwan-gerschaft geführt hatten, zeigten sich Unterschiede in der Häufigkeit von hGTL2-Epimutationen. Über die Häufigkeit von Epimutationen konnte eine prädiktive Aus-sage zum ART-Ausgang getroffen werden. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass sich eine Häu-fung von Epimutationen darauf auswirkt, ob eine Schwangerschaft erreicht werden kann oder nicht. Diese Epimutationen liegen bereits im parentalen Genom vor. Sie werden nicht durch ART verursacht. Allerdings muss man Techniken finden, mit denen man Gameten mit möglichst wenig Epimutationen selektiert, um eine Über-tragung solcher auf das Kind zu verhindern. N2 - Infertility is an increasing problem in today’s society. The search for the underlying causes of infertility reveals more and more the role of epigenetics. Epigenetic pro-cesses are involved in embryo development and growth, but also in the proper func-tion of gametes. Disturbances have been shown to impair fertility. Imprinted genes play an important role. They carry a parental-specific DNA methylation imprint on one of their alleles. Deregulation of these genes leads to imprinting diseases. Since the introduction of in vitro fertilisation (IVF), different assisted reproductive technologies (ART) have been developed to treat infertile couples. The safety of these techniques is not finally solved. Increased rates of imprinting diseases in ART offspring have been reported, but seem more likely to be linked to the underlying parental infertility problems than to ART itself. Nevertheless it is of importance to in-vestigate how ART could affect the health of those children. In the work presented here the relations between epigenetics, infertility and ART have been investigated from different points of view. Firstly, the DNA methylation pattern of different imprinted genes has been investi-gated in human sperm with regard to the frequency of epimutations. ICSI (intracyto-plasmatic sperm injection) and IMSI (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection) are different techniques to select sperm for ART treatment. It was analysed whether IMSI selects epigenetically superior sperm than the conventional ICSI method. Furthermore it is known that sperm from fertile and infertile men can carry vacuoles in their sperm heads. Their epigenetic relevance is unknown. Whether these vacuoles are linked to epimutations has also been investigated here. Bisulfite converted DNA of a few sperm (11 per sample) was analysed using the Limiting Dilution (LD) technique followed by pyrosequencing. In total 880 sperm were available for analysis. No difference between IMSI and ICSI selected sperm was found. Further, no influence of sperm head vacuoles on the DNA methylation patterns of the genes hGTL2, hLIT1 and hPEG3 could be observed. Secondly, it was of interest whether the in vitro maturation (IVM) technique has an influence on DNA methylation in human oocytes. Bisulfite converted DNA of single human oocytes was analysed with LD and pyrosequencing. IVM oocytes were com-pared to in vivo grown oocytes. A total of 139 oocytes were available, of which 90 oocytes were IVM treated while 49 oocytes were grown in vivo. Four imprinted genes (hGTL2, hLIT1, hPEG3 and hSNRPN) and three non-imprinted genes (hDNMT3Lo, hNANOG and hOCT4) were analysed. No IVM-induced epimutations were detected. Finally, it was investigated whether DNA methylation patterns of normal sperm would differ from sperm of oligozoospermia-asthenozoospermia-teratozoospermia (OAT) syndrome patients. Furthermore it was of interest whether epimutations would influence the ART outcome. A total of 54 sperm samples from couples undergoing ART treatment were investigated. To analyse DNA methylation of the imprinted genes hGTL2 and hPEG3 as well as the non-imprinted pluripotency genes hNANOG and hOCT4, Deep Bisulfite Sequencing (DBS) was applied. This is a Next Generation Sequencing (NGS) technique applied on bisulfite converted DNA, al-lowing the analysis of several samples and genes at once. The obtained results showed that OAT samples, which had led to a live-birth, did not differ epigenetically from normal sperm. Much more epimutations were found in OAT sperm which had failed to achieve a pregnancy. Sperm not being able to achieve a pregnancy differed from sperm that had led to a live-birth with regard to hGTL2 epimutation frequency. In addition, ART outcome can be predicted using the frequency of epimutations. Taken together this work shows that the amount of epimutations influences whether a pregnancy can be achieved or not. Epimutations already exist within the parental genome. They are not caused by ART. Nevertheless, one needs to find techniques with which gametes with as few as possible epimutations are being selected to pre-vent the transmission of these onto the offspring. KW - Epigenetik KW - Sterilität KW - Epimutationen KW - geprägte Gene KW - humane Keimzellen KW - Infertilität Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108248 ER -