TY  - THES
A1  - Proft, Florian Lukas Patrick
T1  - Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch
T1  - Molecular mechanisms of effectivness of the antidepressant venlafaxine - genetic investigations in mice and men
N2  - Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt.
Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz.
Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird.

Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen.
Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern.


Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war.

Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. 
Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen.
Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet.
Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren.


In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert.
Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. 
Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben.
Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren.
N2  - Depressive disorders not only lead to the suffering of the affected individuals but also to economic losses by incapacitating them to fulfill social demands and by utilization of health care systems. Therapeutic intervention via pharmacotherapy is successful in variabel degrees.
Etiological research revealed a diversity of somatic factors to be associated with the illness. Primary pharmacological treatment is using substances that inhibit the reuptake of monoaminergic neurotransmitters (serotonin, norepinephrine, in part also dopamine) into the presynaptic terminals. Continued application, sometimes for weeks, leads to a reduction of depressive symptoms (lag of onset). On the other hand for a number of patients various pharmacotherapeutic drugs do not result in symptomatic relief or remission. A reason for these discrepancies to date has not been determined but it is to assume, that pharmacokinetic and pharmacodynamic variations between patients bear the responsibility.
In the thesis at hand venlafaxine, an inhibitor of serotonin- respectively serotonin- and norepinephrine-reuptake, was used. Venlafaxine's pharmacodynamic activity is dependent on its concentration in the target compartment as the affinity for the serotonin-transporter is 30 times that for the norepinephrine-transporter.

Two goals were targeted here. Comparative gene expression analysis was performed to identify potential effectors of antidepressive effectiveness. On this basis a more specific pharmacological intervention than increasing monoaminergic transmission might be facilitated.
The second part of the thesis was dedicated to pharmacogenetic research. In it the predictiveness of the expression activity of the genes coding for venlafaxine's primary targets (SLC6A2, norepinephrine-transporter; SLC6A4, serotonin-transporter) in combination with serum concentrations of active moiety (venlafaxine and its equally active metabolite o desmethylvenlafaxine) towards the therapeutic effect was investigated. Knowledge on such an association might improve efficacy of future pharmacological intervention with venlafaxine, as serum concentrations necessary for patients' desired improvement in the light of a respective genotype could be individually targeted.

For gene expression analysis, first, mice (DBA/2 strain) were given venlafaxine in different dosages via the oral route for one month and their hippocampi were analyzed by hypothesis-free genome wide microarray analysis for genes differentially expressed between treatment groups. For candidate genes identified that way, differential expression was validated via qRT-PCR. In the second step validated genes were investigated via qRT-PCR for differential expression in leucocytes of patients who had received antidepressive venlafaxine treatment for one month. Expression was compared between leucocytes after one week and during the fifth week of treatment, that is, before and after potential onset of antidepressive effect. Post mortem comparison between human central and peripheral tissue had to a certain degree shown congruence of expression patterns and thus leucocyte analysis can give hints towards events in the central nervous system.

Candidate genes identified in the animal study code for transcription factors respectively proteins mediating in second messenger cascades. In human leucocytes statistical significance was reached for the reduced mRNA abundance of Fos after one month of treatment. Fos is a transcription factor subunit that after heterodimerization with Jun influences expression of effector genes.
Association of Fos with depressive disorder and its role in an antidepressive effect had been shown in animal studies. Hippocampal knock-out (ko) of Fos in mice had been associated with reduced fear behaviour and higher excitability of the neurons in this region. Also an association with synaptic plasticity and thus with learning behaviour had been shown. On the other hand, in rats depression-like behaviour had been associated with low hippocampal Fos expression and following successful pharmacological "therapy" expression had been found to be induced. Thus already between non-human species pronounced differences in the role of Fos respectively Fos can be seen.

Regarding the different species and tissues investigated as well as the heterogeneous reports on the role of Fos, it can thus only be concluded that the gene respectively its protein product is part of the development and the venlafaxine-induced relief of depressive symptoms.
New antidepressant drugs based on an interaction with Fos, e.g. by decreasing its abundance, might in theory be considered. However, due to its far-reaching activity in a number of various processes throughout the organism and especially its role as a proto-oncogene, systemic inhibition of Fos does not seem a proper basis for innovative therapeutic intervention.
Future studies should therefore focus on other differentially expressed genes found in the microarray analysis.

For evaluating the predictive power of the expression activity of the genes SLC6A2 respectively SLC6A4 which code for venlafaxine's primary targets (serotonin- respectively norepinephrine-transporter) and the serum concentration of active moiety with regard to the achieved antidepressive effect in a naturalistic clinical design patients from the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy (University Hospital of Würzburg) were analyzed. SLC6A2 was genotyped for rs28386840 and SLC6A4 for 5-HTTLPR. To investigate phenotypical conditions, patients were dichotomized into carriers of "low-expressing" and "high-expressing" genotypes. Results of the pharmacological intervention were evaluated using the CGI-I-scale and symptom changes after one month of venlafaxine application were dichotomized into "good response" and "bad response".
rs28386840 was found not to be associated with therapeutic outcome. The high-expressing genotype of SLC6A4 was found to be significantly associated with insufficient response. After stratifying the collective for serum concentrations this especially held true in the subcollective with high concentration (200 - 400 ng / ml). Below and above this range 5-HTTLPR was not significantly associated with the response.
It can be concluded that genotyping rs28386840 will not be useful for instruction of therapeutic intervention with venlafaxine. However, information on patients' 5-HTTLPR might instruct psychiatrists, if venlafaxine is considered for treatment, to use serum concentrations which exceed the range recommended by the AGNP (> 400 ng / ml) in patients with the high-expressing genotype of SLC6A4.
The study at hand analyzed only 56 patients and inclusion of a variety of cofactors as well as regression analysis incorporating both polymorphisms to evaluate their potential and probable synergistic effect was not possible. Thus, before application of the present findings into clinical practice, validation and confirmation of the potentially causal relationship in larger samples using a prospective controlled design is necessary.
KW  - Wirkmechanismus
KW  - Venlafaxin
KW  - Pharmakogenetik
KW  - Genexpression
KW  - Maus
KW  - Mensch
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201
ER  - 
TY  - THES
A1  - Simann, Meike
T1  - Aufklärung der Effekte von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 und 2 auf die Adipogenese und Osteogenese von primären humanen Knochenmark-Stroma-Zellen
T1  - Elucidation of fibroblast growth factor 1 and 2 effects on the adipogenesis and osteogenesis of primary human bone marrow stromal cells
N2  - Regulating and reverting the adipo-osteogenic lineage decision of trabecular human bone marrow stromal cells (hBMSCs) represents a promising approach for osteoporosis therapy and prevention. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its subfamily member FGF2 were scored as lead candidates to exercise control over lineage switching processes (conversion) in favor of osteogenesis previously. However, their impact on differentiation events is controversially discussed in literature. Hence, the present study aimed to investigate the effects of these FGFs on the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion of primary hBMSCs. Moreover, involved downstream signaling mechanisms should be elucidated and, finally, the results should be evaluated with regard to the possible therapeutic approach.

This study clearly revealed that culture in the presence of FGF1 strongly prevented the adipogenic differentiation of hBMSCs as well as the adipogenic conversion of pre-differentiated osteoblastic cells. Lipid droplet formation was completely inhibited by a concentration of 25 ng/µL. Meanwhile, the expression of genetic markers for adipogenic initiation, peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARg2) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa), as well as subsequent adipocyte maturation, fatty acid binding protein 4 (FABP4) and lipoprotein lipase (LPL), were significantly downregulated. Yet, the genetic markers of osteogenic commitment and differentiation were not upregulated during adipogenic differentiation and conversion under FGF supplementation, not supporting an event of osteogenic lineage switching. 

Moreover, when examining the effects on the osteogenic differentiation of hBMSCs and the osteogenic conversion of pre-differentiated adipocytic cells, culture in the presence of FGF1 markedly decreased extracellular matrix (ECM) mineralization. Additionally, the gene expression of the osteogenic marker alkaline phosphatase (ALP) was significantly reduced and ALP enzyme activity was decreased. Furthermore, genetic markers of osteogenic commitment, like the master regulator runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), as well as markers of osteogenic differentiation and ECM formation, like collagen 1 A1 (COL1A1) and integrin-binding sialoprotein (IBSP), were downregulated. In contrast, genes known to inhibit ECM mineralization, like ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator (ANKH) and osteopontin (OPN), were upregulated. ANKH inhibition revealed that its transcriptional elevation was not crucial for the reduced matrix mineralization, perhaps due to decreased expression of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) that likely annulled ANKH upregulation. Like FGF1, also the culture in the presence of FGF2 displayed a marked anti-adipogenic and anti-osteogenic effect.

The FGF receptor 1 (FGFR1) was found to be crucial for mediating the described FGF effects in adipogenic and osteogenic differentiation and conversion. Yet, adipogenic conversion displayed a lower involvement of the FGFR1. For adipogenic differentiation and osteogenic differentiation/conversion, downstream signal transduction involved the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ERK kinases 1 and 2 (MEK1/2), probably via the phosphorylation of FGFR docking protein FGFR substrate 2a (FRS2a) and its effector Ras/MAPK. The c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38-MAPK, and protein kinase C (PKC) were not crucial for the signal transduction, yet were in part responsible for the rate of adipogenic and/or osteogenic differentiation itself, in line with current literature.

Taken together, to the best of our knowledge, our study was the first to describe the strong impact of FGF1 and FGF2 on both the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion processes of primary hBMSCs in parallel. It clearly revealed that although both FGFs were not able to promote the differentiation and lineage switching towards the osteogenic fate, they strongly prevented adipogenic differentiation and lineage switching, which seem to be elevated during osteoporosis. Our findings indicate that FGF1 and FGF2 entrapped hBMSCs in a pre-committed state. In conclusion, these agents could be applied to potently prevent unwanted adipogenesis in vitro. Moreover, our results might aid in unraveling a pharmacological control point to eliminate the increased adipogenic differentiation and conversion as potential cause of adipose tissue accumulation and decreased osteoblastogenesis in bone marrow during aging and especially in osteoporosis.
N2  - Die Regulation und Umkehr des adipogenen und osteogenen Commitments von trabekulären humanen Knochenmarks-Stroma Zellen (hBMSCs) stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prävention und Therapie der Knochenerkrankung Osteoporose dar. Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) und sein Proteinfamilien-Mitglied FGF2 wurden in einer vorhergehenden Studie als Hauptkandidaten bezüglich der Kontrolle einer Konversion (Schicksalsänderung) von hBMSCs in die osteogene Richtung bewertet. Der Effekt von FGF1 und FGF2 auf die Differenzierung von hBMSCs wird jedoch in der Literatur kontrovers diskutiert. Folglich zielte die aktuelle Studie darauf ab, die Effekte dieser Faktoren auf die adipogene und osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs zu untersuchen. Außerdem sollten die nachgeschalteten Signalmechanismen aufgeklärt und die Ergebnisse abschließend bezüglich des angestrebten Therapieansatzes bewertet werden.
Die vorliegende Studie zeigte eindeutig, dass die adipogene Differenzierung von hBMSCs sowie die adipogene Konversion von vordifferenzierten osteoblastischen Zellen durch die Kultur in Gegenwart von FGF1 stark inhibiert wurden. Die typische Bildung von intrazellulären Fetttropfen war bei einer Konzentration von 25 ng/µL vollständig inhibiert, während die Genexpression von frühen und späten adipogenen Markern signifikant herunterreguliert war. Die osteogenen Marker waren jedoch während der adipogenen Differenzierung und Konversion unter FGF-Zugabe nicht hochreguliert, was eine etwaige Schicksalsänderung zugunsten der osteogenen Richtung nicht unterstützte.
Bei der Untersuchung der osteogenen Differenzierung von hBMSCs und der osteogenen Konversion von vordifferenzierten adipozytischen Zellen bewirkte die Zugabe von FGF1 zum Differenzierungsmedium eine deutliche Verminderung der Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM). Darüber hinaus war die Genexpression der alkalischen Phosphatase (ALP) signifikant reduziert; außerdem wurde die ALP Enzymaktivität erniedrigt. Sowohl Marker des osteogenen Commitments einschließlich des osteogenen Master-Transkriptionsfaktors RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), als auch Marker der weiterführenden osteogenen Differenzierung waren herunterreguliert. Im Kontrast dazu waren Inhibitoren der ECM-Mineralisierung hochreguliert. Die Hochregulation von ANKH (ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator) schien hierbei jedoch keine direkte Auswirkung auf die Reduzierung der Mineralisierung zu haben; seine Wirkung wurde wahrscheinlich durch die Herunterregulation von ENPP1 (Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1) aufgehoben. Wie FGF1 zeigte auch FGF2 eine anti-adipogene und anti-osteogene Wirkung.
Der FGF Rezeptor 1 (FGFR1) war für die Weiterleitung der beschriebenen FGF-Effekte entscheidend, wobei die adipogene Konversion eine erniedrigte Beteiligung dieses Rezeptors zeigte. Bei der adipogenen Differenzierung und der osteogenen Differenzierung und Konversion waren die nachgeschalteten Signalwege ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) bzw. MEK1/2 (Mitogenactivated protein kinase (MAPK)/ ERK kinases 1 and 2) involviert, vermutlich über eine Phosphorylierung des FGFR Substrats FRS2a (FGFR substrate 2a) und der Ras/MAP Kinase. Im Gegensatz dazu waren die c-Jun N-terminale Kinase (JNK), die p38-MAP Kinase und die Proteinkinase C (PKC) nicht an der Weiterleitung des FGF-Signals beteiligt. Sie zeigten sich jedoch, in Übereinstimmung mit der aktuellen Literatur, verantwortlich für das Ausmaß der adipogenen bzw. osteogenen Differenzierung selbst.
Zusammenfassend war die vorliegende Studie nach unserem besten Wissen die erste, die den starken Einfluss von FGF1 und FGF2 parallel sowohl auf die adipogene als auch die osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs untersucht hat. Sie zeigte deutlich, dass, obwohl beide FGFs nicht die Differenzierung und Konversion zum osteogenen Zellschicksal hin unterstützen konnten, sie dennoch wirkungsvoll die adipogene Differenzierung und Konversion verhinderten, die während der Osteoporose erhöht zu sein scheinen. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass hBMSCs durch FGF1 und FGF2 in einem Stadium vor dem Schicksals-Commitment festgehalten werden. Folglich könnten diese Proteine verwendet werden, um eine ungewollte Adipogenese in vitro zu verhindern. Außerdem könnten unsere Ergebnisse helfen, einen pharmakologischen Kontrollpunkt zur Eliminierung der gesteigerten adipogenen Differenzierung und Konversion aufzudecken, welche potentielle Gründe für die Fettakkumulation und die reduzierte Osteoblastogenese im Knochenmark während des Alterns und besonders in der Osteoporose sind.
KW  - Mesenchymzelle
KW  - Genexpression
KW  - Fibroblastenwachstumsfaktor
KW  - Osteoporose
KW  - Fettzelle
KW  - Bone marrow stromal cell (BMSC)
KW  - Osteogenesis
KW  - Adipogenesis
KW  - Differentiation
KW  - adipocytes
KW  - Mesenchymale Stammzelle
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119322
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zimmermann, Henriette
T1  - Antigenic variation and stumpy development in \(Trypanosoma\)  \(brucei\)
T1  - Antigene Variation und Stumpy Entwicklung in \(Trypanosoma\)  \(brucei\)
N2  - The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to persist within its mammalian host. Trypanosomes evade the hosts' immune system by antigenic variation of their surface coat, consisting of variant surface glycoproteins (VSGs). Out of a repertoire of thousands of VSG genes, only one is expressed at any given time from one of the 15 telomeric expression sites (ES). The VSG is stochastically exchanged either by a transcriptional switch of the active ES (in situ switch) or by a recombinational exchange of the VSG within the active ES. However, for infections to persist, the parasite burden has to be limited. The slender (sl) bloodstream form secretes the stumpy induction factor (SIF), which accumulates with rising parasitemia. SIF induces the irreversible developmental transition from the proliferative sl to the cell cycle-arrested but fly-infective stumpy (st) stage once a concentration threshold is reached. Thus, antigenic variation and st development ensure persistent infections and transmissibility. A previous study in monomorphic cells indicated that the attenuation of the active ES could be relevant for the development of trypanosomes. The present thesis investigated this hypothesis using the inducible overexpression of an ectopic VSG in pleomorphic trypanosomes, which possess full developmental competence. These studies revealed a surprising phenotypic plasticity: while the endogenous VSG was always down-regulated upon induction, the ESactivity determined whether the VSG overexpressors arrested in growth or kept proliferating. Full ES-attenuation induced the differentiation of bona fide st parasites independent of the cell density and thus represents the sole natural SIF-independent differentiation trigger to date. A milder decrease of the ES-activity did not induce phenotypic changes, but appeared to prime the parasites for SIF-induced differentiation. These results demonstrate that antigenic variation and development are linked and indicated that the ES and the VSG are independently regulated. Therefore, I investigated in the second part of my thesis how ES-attenuation and VSG-silencing can be mediated. Integration of reporters with a functional or defective VSG 3'UTR into different genomic loci showed that the maintenance of the active state of the ES depends on a conserved motif within the VSG 3'UTR. In situ switching was only triggered when the telomere-proximal motif was partially deleted, suggesting that it serves as a DNA-binding motif for a telomere-associated protein. The VSG levels seem to be additionally regulated in trans based on the VSG 3'UTR independent of the genomic context, which was reinforced by the regulation of a constitutively expressed reporter with VSG 3' UTR upon ectopic VSG overexpression.
N2  - Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt, um in seinem Säugetierwirt zu überleben. Die Grundlage der Immunevasion ist die antigene Variation des Oberflächenmantels, der aus dem variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) besteht. Von mehreren tausend VSG-Genen wird zu jedem Zeitpunkt nur ein einziges aus einer der 15 telomerischen Expressionsstellen (ES) exprimiert. Das VSG kann entweder durch einen transkriptionellen Wechsel der aktiven ES (in situ Wechsel) oder durch einen rekombinatorischen Wechsel des VSG-Gens innerhalb der aktiven ES stochastisch ausgetauscht werden. Damit jedoch eine langanhaltende Infektion des Wirts möglich wird, muss gleichzeitig der Parasitenbefall begrenzt werden. Mit ansteigender Parasitämie akkumuliert der 'stumpy induction factor' (SIF), welcher von der 'slender' (sl) Blutstromform sekretiert wird. Sobald ein Schwellenwert in der SIF-Konzentration erreicht ist, wird die irreversible Differenzierung der proliferativen sl in die zellzyklusarretierte 'stumpy'(st) Form eingeleitet, welche infektiös für den Fliegenvektor ist. Somit stellen antigene Variation und st- Differenzierung das Persistieren der Infektion und die Übertragung des Parasiten sicher. Eine frühere Arbeit mit monomorphen Zellen deutete darauf hin, dass die Attenuierung der aktiven ES eine Rolle für die Differenzierung der Trypanosomen spielen könnte. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Dissertation untersucht, indem in pleomorphen Zellen mit vollständiger Entwicklungskompetenz ein ektopisches VSG induzierbar überexprimiert wurde. Diese Studien offenbarten eine erstaunliche phänotypische Plastizität: während das endogene VSG nach Induktion runter reguliert wurde, arretierten die VSG-Überexpressoren in Abhängigkeit von der ES-Aktivität entweder im Wachstum oder teilten sich weiter. Die vollständige ES-Attenuierung löste die Differenzierung zu echten st Zellen unabhängig von der Zelldichte aus und ist somit der bisher einzige natürliche SIF-unabhängige Differenzierungsauslöser. Eine mildere Abnahme der ES-Aktivität verursachte keinen Phänotyp, scheint aber die Zellen auf die SIF-induzierte Differenzierung vorzubereiten. Diese Ergebnisse zeigen, dass antigene Variation und Differenzierung verbunden sind und deuteten an, dass die ES und das VSG unabhängig voneinander reguliert werden. Daher habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation untersucht, wie ES-Attenuierung und VSG-Stilllegung vermittelt werden können. Die Integration eines Reporters mit funktioneller oder defekter VSG 3'UTR an verschiedenen Orten im Genom zeigte, dass die Aufrechterhaltung der ES-Aktivität von einem konservierten Motiv in der VSG 3'UTR abhängig ist. Ein in situ Wechsel wurde nur ausgelöst, wenn Teile des Telomer-proximalen Motiv deletiert wurden, was nahelegt, dass das Motiv auf DNA-Ebene von einem Telomerbindeprotein erkannt wird. Die VSG-Level scheinen unabhängig vom genomischen Kontext zusätzlich in trans basierend auf der VSG 3'UTR reguliert zu werden, was durch die Regulation eines konstitutiv exprimierten Reporters mit VSG 3'UTR nach VSG-Überexpression bekräftigt wurde.
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Genexpression
KW  - Entwicklung
KW  - Parasit
KW  - VSG
KW  - antigenic variation
KW  - monoallelic expression
KW  - stumpy development
KW  - differentiation
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146902
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jessen, Christina
T1  - NRF2 links antioxidant and immune-relevant features in melanoma
T1  - NRF2 verknüpft antioxidative und immunrelevante Eigenschaften im Melanom
N2  - The transcription factor NRF2 is considered as the master regulator of cytoprotective and ROS-detoxifying gene expression. Due to their vulnerability to accumulating reactive oxygen species, melanomas are dependent on an efficient oxidative stress response, but to what extent melanomas rely on NRF2 is only scarcely investigated so far. In tumor entities harboring activating mutations of NRF2, such as lung adenocarcinoma, NRF2 activation is closely connected to therapy resistance. In melanoma, activating mutations are rare and triggers and effectors of NRF2 are less well characterized.
This work revealed that NRF2 is activated by oncogenic signaling, cytokines and pro-oxidant triggers, released cell-autonomously or by the tumor microenvironment. Moreover, silencing of NRF2 significantly reduced melanoma cell proliferation and repressed well-known NRF2 target genes, indicating basal transcriptional activity of NRF2 in melanoma. Transcriptomic analysis showed a large set of deregulated gene sets, besides the well-known antioxidant effectors. NRF2 suppressed the activity of MITF, a marker for the melanocyte lineage, and induced expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), thereby stabilizing the dedifferentiated melanoma phenotype and limiting pigmentation markers and melanoma-associated antigens. In general, the dedifferentiated melanoma phenotype is associated with a reduced tumor immunogenicity. Furthermore, stress-inducible cyclooxygenase 2 (COX2) expression, a crucial immune-modulating gene, was regulated by NRF2 in an ATF4-dependent manner. Only in presence of both transcription factors was COX2 robustly induced by H2O2 or TNFα. COX2 catalyzes the first step of the prostaglandin E2 (PGE2) synthesis, which was described to be associated with tumor immune evasion and reduction of the innate immune response.
In accordance with these potentially immune-suppressive features, immunocompetent mice injected with NRF2 knockout melanoma cells had a strikingly longer tumor-free survival compared to NRF2-proficient cells. In line with the in vitro data, NRF2-deficient tumors showed suppression of COX2 and induction of MITF. Furthermore, transcriptomic analyses of available tumors revealed a strong induction of genes belonging to the innate immune response, such as RSAD2 and IFIH1. The expression of these genes strongly correlated with immune evasion parameters in human melanoma datasets and NRF2 activation or PGE2 supplementation limited the innate immune response in vitro.
In summary, the stress dependent NRF2 activation stabilizes the dedifferentiated melanoma phenotype and facilitates the synthesis of PGE2. As a result, NRF2 reduces gene expression of the innate immune response and promotes the generation of an immune-cold tumor microenvironment. Therefore, NRF2 not only elevated the ROS resilience, but also strongly contributed to tumor growth, maintenance, and immune control in cutaneous melanoma.
N2  - Der Transkriptionsfaktor NRF2 gilt als Masterregulator der antioxidativen Zellantwort. Im Melanom ist die Rolle von NRF2 bisher nur wenig untersucht worden, obwohl das Melanom anfällig für oxidativen Stress ist und somit eine besondere Abhängigkeit von antioxidativen Prozessen besteht. In Tumorentitäten mit NRF2 aktivierende Mutationen, wie z.B. dem Lungenadenokarzinom, ist die NRF2 Aktivierung mit einer Therapieresistenz verbunden. Allerdings sind diese aktivierenden Mutationen im Melanom selten und Mechanismen, die zu einer NRF2 Aktivierung führen, sind kaum bekannt.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NRF2 hier vor allem durch onkogene Signalwege, Zytokine und pro-oxidative Trigger aktiviert wird. Zudem verringerte die NRF2 Inhibierung die Zellproliferation und reduzierte die Expression von bekannten NRF2 Zielgenen. Dies weist darauf hin, dass die basale Transkriptionsaktivität von NRF2 im Melanom wichtig ist. Neben den bekannten Zielgenen waren außerdem eine Vielzahl von ROS-unabhängigen Gen-Sets dereguliert. Zum einen reduzierte NRF2 die Aktivität von MITF, dem melanozytären Lineage Marker und induzierte die Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors, EGFR. Dadurch stabilisiert NRF2 den undifferenzierten Melanom-Phänotyp, welcher allgemein mit einer verminderten Expression von Pigmentierungsmarkern und Melanom-assoziierten Antigenen verbunden ist. Zum anderen regulierte NRF2 die Expression von Cyclooxygenase 2 (COX2), in Abhängigkeit von dem Transkriptionsfaktor ATF4. COX2 wurde basal und nach H2O2 oder TNFα Stimulation nur in Anwesenheit beider Transkriptionsfaktoren exprimiert. COX2 katalysiert die Prostaglandin E2 (PGE2) Synthese und es wurde beschrieben, dass hohe Konzentrationen an PGE2, sowohl die Immunevasion von Tumoren erleichtert als auch die angeborenen Immunantwort reduziert.
In Übereinstimmung mit diesen potenziell immun-evasiven Eigenschaften zeigten immunkompetente Mäuse, denen NRF2-knockout Melanomzellen injiziert wurden, im Vergleich zu Kontrollzellen, ein deutlich längeres tumorfreies Überleben. Die NRF2-abhängige COX2 Erhöhung und MITF Hemmung, wurde zudem in den Maustumoren bestätigt. Darüber hinaus zeigten die NRF2-defizienten Tumore eine starke Induktion von Genen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. RSAD2 und IFIH1. Die Expression dieser Gene korrelierte mit Immunevasionsparametern in Datensätzen des humanen Melanoms und eine NRF2 Aktivierung oder PGE2 Zugabe unterdrückte die Genexpression der angeborene Immunantwort bereits in vitro.
Somit stabilisiert stress-induziertes NRF2 den undifferenzierten Melanom-Phänotyp und fördert die immunmodulierende PGE2 Produktion. Infolgedessen reduziert NRF2 die angeborene Immunantwort und unterstützt die Entstehung einer immun-suppressiven Tumormikroumgebung, welche das Tumorwachstum erleichtert. Die endogene NRF2 Aktivierung im Melanom fördert somit nicht nur die ROS-Resilienz, sondern auch die Tumoraufrechterhaltung und das Tumorwachstum im immunkompetenten Organismus.
KW  - Melanom
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Genexpression
KW  - Krebsforschung
KW  - NRF2
KW  - Antioxidantien
KW  - melanoma dedifferentiation
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233495
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fetiva Mora, Maria Camila
T1  - Changes in chromatin accessibility by oncogenic YAP and its relevance for regulation of cell cycle gene expression and cell migration
T1  - Änderungen der Chromatinzugänglichkeit durch onkogene YAP und seine Relevanz für die Genexpression während des Zellzyklus und für die Zellmigration
N2  - Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes. 

The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration.

Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration.
N2  - Ein Kennzeichen vieler Tumoren ist die fehlerhafte Aktivierung von zellzyklusregulierenden Signalwegen. Ein für das Tumorwachstum wichtiger Signalwege ist der Hippo-Signalweg und das durch ihn regulierte Onkogen YAP, ein transkriptioneller Koaktivator. Durch die Regulierung von Zellzyklusgenen ist YAP verantwortlich für onkogene Prozesse wie Zellproliferation und Metastasierung. Der MMB-Multiproteinkomplex wiederum – er entsteht, wenn B-MYB an das MuvB-Kernmodul bindet – ist ein wichtiger Regulator der mitotischen Genexpression, welche ebenso mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wurde. Unser Labor hat zuvor einen neuen Mechanismus der Regulation mitotischer Gene durch den MMB-Komplex und YAP identifiziert: Durch die Bindung an Enhancer der MMB-Zielgene und die Förderung der B-MYB-Bindung an Promotoren reguliert YAP eine Reihe von mitotischen und zytokinetischen Zielgenen, welche die Zellproliferation fördern. Diese Doktorarbeit befasst sich mit den Mechanismen der YAP- und MMB-vermittelten Transkription und charakterisiert die Rolle der YAP regulierten Enhancer während der Transkription von Zellzyklusgenen.

Die in dieser Dissertation dargelegten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von konstitutiv aktivem, onkogenem YAP5SA zu weitreichenden Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit nicht-transformierter humaner MCF10A Zellen führt. ATAC-seq zeigte, dass ein grosse Anzahl YAP-gebundene Enhancer zugänglich und aktiviert werden. Gleichzeitig konnte festgestellt werden, dass die MMB-gebundenen Promotoren bereits vor der Expression von YAP zugänglich sind und während der YAP-Induktion offen bleiben. Mittels CRISP-Interferenz (CRISPRi) und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) konnten wir zeigen, dass YAP-gebundene Enhancer die Rekrutierung von CDK7 an MMB-regulierten Promotoren sowie die Initiation und Elongation der Transkription von G2/M Genen fördert. Durch die experimentelle Blockade der YAP-B-MYB Proteininteraktion konnten wir darüber hinaus belegen, dass auch die Bindung von YAP an B-MYB für die Initiation der Transkription an MMB-regulierten Genen entscheidend ist. Unerwarteterweise führte die Überexpression von YAP5SA auch dazu, dass bestimmte Regionen im Genom weniger zugänglich werden. Motivanalysen ergaben, dass diese neu geschlossenen Regionen Bindungsmotive für die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren enthalten. Die Chromatinschließung durch YAP ist an eine reduzierte Expression und an den Verlust der Chromatinbindung des p53-Familienmitglieds Np63 gekoppelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von Np63 durch YAP ein wichtiger Schritt in der YAP-abhängigen Förderung der Zellmigration ist.

Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Dissertation Einblicke in die Rolle von YAP bei Chromatinveränderungen welche zu den onkogenen Aktivitäten von YAP beitragen. Die Überexpression von YAP führt dabei einerseits zur Öffnung des Chromatins an YAP-gebundenen Enhancern, die zusammen mit dem MMB-Komplex die Expression von G2/M Genen stimulieren. Andererseits fördert YAP auch das Schließen von Chromatin an Np63-gebundenen Regionen, was wiederum Zellmigration nach sich zieht.
KW  - YAP
KW  - B-MYB
KW  - MMB
KW  - enhancers
KW  - transcription
KW  - chromatin accessibility
KW  - opening of chromatin
KW  - closing of chromatin
KW  - cell migration
KW  - G2/M genes
KW  - Chromatin
KW  - Genexpression
KW  - Zellzyklus
KW  - Zellmigration
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302910
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bakari Soale, Majeed
T1  - Regulation of the Variant Surface Glycoprotein (VSG) Expression and Characterisation of the Nucleolar DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
T1  - Regulation der Expression des variable Oberflächen- Glykoprotein (VSG) und Charakterisierung des nukleolären DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
N2  - The variant surface glycoprotein (VSG) of African trypanosomes plays an essential role in protecting the parasites from host immune factors. These trypanosomes undergo antigenic variation resulting in the expression of a single VSG isoform out of a repertoire of around 2000 genes. The molecular mechanism central to the expression and regulation of the VSG is however not fully understood. 
Gene expression in trypanosomes is unusual due to the absence of typical RNA polymerase II promoters and the polycistronic transcription of genes. The regulation of gene expression is therefore mainly post-transcriptional. Regulatory sequences, mostly present in the 3´ UTRs, often serve as key elements in the modulation of the levels of individual mRNAs. In T. brucei VSG genes, a 100 % conserved 16mer motif within the 3´ UTR has been shown to modulate the stability of VSG transcripts and hence their expression. As a stability-associated sequence element, the absence of nucleotide substitutions in the motif is however unusual. It was therefore hypothesised that the motif is involved in other essential roles/processes besides stability of the VSG transcripts.
In this study, it was demonstrated that the 100 % conservation of the 16mer motif is not essential for cell viability or for the maintenance of functional VSG protein levels. It was further shown that the intact motif in the active VSG 3´ UTR is neither required to promote VSG silencing during switching nor is it needed during differentiation from bloodstream forms to procyclic forms. Crosstalk between the VSG and procyclin genes during differentiation to the insect vector stage is also unaffected in cells with a mutated 16mer motif. Ectopic overexpression of a second VSG however requires the intact motif to trigger silencing and exchange of the active VSG, suggesting a role for the motif in transcriptional VSG switching. The 16mer motif therefore plays a dual role in VSG in situ switching and stability of VSG transcripts. The additional role of the 16mer in the essential process of antigenic variation appears to be the driving force for the 100 % conservation of this RNA motif. 
A screen aimed at identifying candidate RNA-binding proteins interacting with the 16mer motif, led to the identification of a DExD/H box protein, Hel66. Although the protein did not appear to have a direct link to the 16mer regulation of VSG expression, the DExD/H family of proteins are important players in the process of ribosome biogenesis. This process is relatively understudied in trypanosomes and so this candidate was singled out for detailed characterisation, given that the 16mer story had reached a natural end point. Ribosome biogenesis is a major cellular process in eukaryotes involving ribosomal RNA, ribosomal proteins and several non-ribosomal trans-acting protein factors. The DExD/H box proteins are the most important trans-acting protein factors involved in the biosynthesis of ribosomes. Several DExD/H box proteins have been directly implicated in this process in yeast. In trypanosomes, very few of this family of proteins have been characterised and therefore little is known about the specific roles they play in RNA metabolism. Here, it was shown that Hel66 is involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. Hel66 localises to the nucleolus and depleting the protein led to a severe growth defect. Loss of the protein also resulted in a reduced rate of global translation and accumulation of rRNA processing intermediates of both the small and large ribosomal subunits. Hel66 is therefore an essential nucleolar DExD/H protein involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. As very few protein factors involved in the processing of rRNAs have been described in trypanosomes, this finding represents an important platform for future investigation of this topic.
N2  - Das variable Oberflächen-Glykoprotein (“varaint surface glycoprotein“, VSG) der Afrikanischen Trypanosomen schützt den Parasiten vor Immunfaktoren des Wirtes. Trypanosomen beherrschen die antigene Variation und expremieren nur eine einzige VSG Isoform aus einem Repertoire von ungefähr 2000 Genen. Der molekulare Mechanismus der die Expression dieser VSG Gene reguliert ist nicht komplett bekannt.
Die Genexpression ist in Trypanosomen sehr ungewöhnlich. Es gibt keine typischen Promotoren für RNA Polymerase II und Gene werden polycistronisch transkribiert. Daher ist die Regulation der Genexpression hauptsächlich posttranskriptional. Die Expression individueller mRNAs wird durch regulatorische Sequenzen reguliert, die sich häufig in den 3´ UTRs befinden. In den VSG Genen von T. brucei moduliert ein zu 100% konserviertes 16mer Motiv in der 3´ UTR die Stabilität der VSG Transkripte und damit deren Expression. Für eine Sequenz, die die Stabilität der mRNA reguliert, ist das Fehlen von Nukleotid Substitutionen sehr ungewöhnlich. Es wurde deshalb spekuliert, dass das 16mer Motiv neben der Stabilisierung des VSG Transkriptes noch an anderen essentiellen Prozessen beteiligt ist.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die 100%ige Konservierung des 16mer Motives weder für das Überleben der Zellen, noch für den Erhalt der Expression des VSG Protein in funktioneller Menge notwendig ist. Außerdem wurde gezeigt dass das intakte Motiv in der 3´UTR des aktiven VSGs weder für das „VSG silencing“ während des VSG Austausches („switching“) noch für die Differenzierung von Blutbahnformen zu prozyklischen Formen benötigt wird. Auch die Interaktionen („crosstalk“), die während der Differenzierung zum Insekten Stadium zwischen den VSG und Prozyklin Genen stattfinden, sind in Zellen mit mutiertem 16mer Motiv noch funktionell. Die ektopische Überexpression eines zweiten VSGs benötigt allerdings das intakte Motiv, um das aktive VSG zu inaktivieren und auszutauschen: dies suggeriert eine Rolle des Motivs im transkriptionalen „VSG switching“. Das 16mer Motif spielt daher eine Doppelrolle bei der Regulation der Stabilität der VSG Transkripte und im VSG in situ
„switching“. Letzteres, die Rolle im essentiellen Prozess der antigenen Variation, ist dabei offensichtlich die treibende Kraft hinter der 100%igen Konservierung des RNA Motives.
Eine Suche nach möglichen RNA bindenden Proteinen, die mit dem 16mer interagieren, führte zur Identifikation des DExD/H box Proteins Hel66. Obwohl das Protein wohl nicht direkt an der Regulation der VSG Expression über das 16mer beteiligt ist, spielen Mitglieder der DexD/H Proteinfamilie eine wichtige Rolle in der Biogenese von Ribosomen. Dieser Prozess ist in Trypanosomen noch nicht komplett verstanden und daher wurde das Protein für eine nähere
 
Analyse ausgewählt, auch weil die 16mer Story ohne weitere Kandidaten zu einem Ende gekommen war. Die Biogenese von Ribosomen ist ein wichtiger zellulärer Prozess in Eukaryoten und benötigt ribosomale RNA, ribosomale Proteine sowie einige nicht-ribosomale, trans-agierende Protein Faktoren. Proteine der DExD/H box Familie sind die wichtigsten trans- agierenden Proteinfaktoren, die an der Biogenese der Ribosomen beteiligt sind. In der Hefe sind mehrere DExD/H box Proteine bekannt, die eine direkte Rolle in diesem Prozess spielen. In Trypanosomen sind erst sehr wenige Proteine aus dieser Familie untersucht worden und es ist daher kaum bekannt, welche spezifische Rollen sie im RNA Metabolismus spielen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Hel66 an der rRNA Prozessierung während der Biogenese der Ribosomen beteiligt ist. Hel66 ist im Nukleolus lokalisiert und die Reduktion des Proteins durch RNAi führte zu einem schweren Wachstumsphänotyp. Reduktion von Hel66 führte auch zu einer globalen Reduktion der Translation sowie zur Akkumulation von Synthese- Zwischenstadien der rRNAs sowohl der kleinen und als auch der großen ribosomalen Untereinheit. Hel66 ist daher ein essentielles nukleoläres DExD/H Protein dass an der Prozessierung der rRNA während der Biogenese der Ribosomen beteiligt ist. Da bisher erst wenige Proteine bekannt sind, die in Trypanosomen an diesem Prozess beteiligt sind, sind diese Ergebnisse ein sehr wichtiger Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen in der Zukunft.
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Genexpression
KW  - Variant Surface Glycoprotein
KW  - VSG
KW  - DExD/H box protein
KW  - Ribosome biogenesis
KW  - rRNA processing
KW  - Ribosome
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-258090
ER  -