TY - THES A1 - Schwärzel, Martin T1 - Localizing engrams of olfactory memories in Drosophila T1 - Lokalisation von Duftgedächtnissen in Drosophila N2 - Zars and co-workers were able to localize an engram of aversive olfactory memory to the mushroom bodies of Drosophila (Zars et al., 2000). In this thesis, I followed up on this finding in two ways. Inspired by Zars et al. (2000), I first focused on the whether it would also be possible to localize memory extinction.While memory extinction is well established behaviorally, little is known about the underlying circuitry and molecular mechanisms. In extension to the findings by Zars et al (2000), I show that aversive olfactory memories remain localized to a subset of mushroom body Kenyon cells for up to 3 hours. Extinction localizes to the same set of Kenyon cells. This common localization suggests a model in which unreinforced presentations of a previously learned odorant intracellularly antagonizes the signaling cascades underlying memory formation. The second part also targets memory localization, but addresses appetitive memory. I show that memories for the same olfactory cue can be established through either sugar or electric shock reinforcement. Importantly, these memories localize to the same set of neurons within the mushroom body. Thus, the question becomes apparent how the same signal can be associated with different events. It is shown that two different monoamines are specificaly necessary for formation of either of these memories, dopamine in case of electric shock and octopamine in case of sugar memory, respectively. Taking the representation of the olfactory cue within the mushroom bodies into account, the data suggest that the two memory traces are located in the same Kenyon cells, but in separate subcellular domains, one modulated by dopamine, the other by octopamine. Taken together, this study takes two further steps in the search for the engram. (1) The result that in Drosophila olfactory learning several memories are organized within the same set of Kenyon cells is in contrast to the pessimism expressed by Lashley that is might not be possible to localize an engram. (2) Beyond localization, a possibible mechanism how several engrams about the same stimulus can be localized within the same neurons might be suggested by the models of subcellular organisation, as postulated in case of appetitive and aversive memory on the one hand and acquisition and extinction of aversive memory on the other hand. N2 - Troy Zars und seine Mitarbeiter konnten für das olfaktorische Elektoschockgedächtnis von Drosophila zum ersten mal die Spur eines Duftgedächtnisses in den Pilzkörpern (PK) lokalisieren. Darauf aufbauend stelle ich nun in dieser Arbeit zwei Fragen: 1. Wäre es möglich auch den Prozess der Auslöschung dieses Gedächtnissen zu lokalisieren? Obwohl die Verhaltensphysiologie der Gedächtnisauslöschung sehr gut charakterisiert sind weiss man sehr wenig über die daran beteiligten molekularen Signalmechanismen und Strukturen. In Anlehnung an die Arbeit von Zars et al. (2000) kann ich zeigen, dass sowohl die Speicherung wie auch die Auslöschung dieses Gedächt-nisses in den gleichen Kenyonzellen der PK geschieht. Diese gemeinsame zelluläre Lokalisierung legt ein Model nahe, in dem die wiederholte Präsentation des mit Elektro-schock assoziierten Duftes während der Auslöschung, intrazellulär auf die gleichen Signalwege wirkt die auch für die Bildung des Duftgedächtnisses notwendig sind. 2. Wäre es möglich auch die Spur eines attraktive Duftgedächtnisses zu lokalisieren? Ich kann zeigen, dass Gedächtnisse über den gleichen Duft sowohl attraktiv als auch repulsiv sein können, je nachdem ob Zucker oder Elektroshock während der pavlovschen Konditionierung benutzt wird. Beide Gedächtnisse sind im gleichen Satz von Kenyonzellen lokalisiert. Dies wirft die Frage auf, wie das gleiche Duftsignal mit zwei verschiedenen Ereignissen (Zucker und Elektroschock) assoziiert werden kann. Es zeigt sich, dass zwei unterschiedliche Monoamine jeweils spezifisch für das Anlegen eines der beiden Gedächtnisse verantwortlich sind; Dopamin für das Electroschockgedächtnis und Octopamin für das Zuckergedächtnis. Berücksichtigt man wie Duftreize in den PK kodiert sind, ergibt sich ein Model bei dem zwar beide Spuren in einer Zelle lokalisiert sind, diese jedoch durch die Nutzung unterschiedlicher subzellulärer Bereiche voneinander getrennt werden. Jeweils einer dieser Bereiche wäre durch Dopamin moduliert, der andere durch Octopamin. Das Fazit dieser Studie ist, dass zwei wichtige Punkte bei der Lokalisierung von Gedächtnis-spuren aufgezeigt wurden. (1) Die Tatsache, dass beim Duftlernen von Drosophila mehrere Spuren verschiedener Duftgedächtnisse lokalisiert worden sind widerlegt die von Lashley aufgestellte Behauptung, dass Gedächtnisse nicht lokalisierbar sind. (2) Verschiedene Spuren können für den gleichen Duft in den gleichen Zellen angelegt werden, sofern man eine subzelluläre Organisation annimmt, wie sie sowohl für Zucker- und Elektroschockgedächtnis, als auch Gedächtnisbildung und Auslöschen vorgeschlagen werden KW - Taufliege KW - Gedächtnis KW - Lernen KW - Signaltransduktion KW - Gedächtnis KW - Verhalten KW - Catecholamine KW - Signaltransduktion KW - Lernen KW - Memory KW - Behaviour KW - catecholamines KW - signaltransduction KW - learning Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5065 ER - TY - THES A1 - Pick, Simon T1 - Kinematik und visuelle Steuerung des Kletterverhaltens und der Beinplatzierung der Fliege Drosophila melanogaster und Übertragung auf die Robotik T1 - Kinematics and visual control of climbing behaviour and leg placement in the fly Drosophila melanogaster and applications to robotics N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden visuelle Einflüsse auf die Beinplatzierung beim Laufen und auf das Kletterverhalten der Fliege Drosophila melanogaster analysiert. Während sich die Beinplatzierung als vorwiegend taktil gesteuert herausstellte, ist das Klettern sowohl bezüglich der Entscheidung zur Durchführung (Motivationssteuerung) als auch bezüglich der Ausführung selbst unter präziser visueller Kontrolle. Für die Untersuchungen wurde ein Lücken-Überwindungsparadigma entwickelt und die Kinematik des Kletterns über verschieden breite Lücken mit einer eigens entwickelten 3D-Hochgeschwindigkeits-Videoanlage erstmals quantitativ beschrieben. Drei wesentliche Verhaltensanpassungen sorgen dafür, dass die Fliegen die maximal mögliche Spannbreite ihrer Beine voll ausnützen und Lücken von bis zu 170% der eigenen Körperlänge überqueren können. Das Kletterverhalten wird abhängig von der Lückenbreite initiiert und sinnlose Versuche an unüberwindbar breiten Lücken vermieden. Die visuelle Lückenbreitenmessung wurde analysiert; sie beruht auf der Auswertung von Bewegungsparallaxe beim Anlauf. Einige Erkenntnisse aus der Laufforschung an Fliegen wurden auf einem im Rahmen dieser Arbeit modifizierten hexapoden Laufroboter umgesetzt und die Verbesserungen quantifiziert. N2 - This work started out to analyze visual influences on leg placement and on the climbing behavior of the fly Drosophila melanogaster. Whereas leg placement turned out to be predominantly under tactile control, climbing is indeed under tight visual control both with regard to the decision to initiate the behavior (motivational control) as well as with regard to the execution of climbing. A gap-crossing paradigm has been developed to facilitate a detailed study and the kinematics of climbing over gaps of various widths has been quantified using a 3D high-speed video analysis system developed for this purpose. Three major behavioral adaptations help the fly to exploit fully the limits of its leg span in order to overcome gaps of up to 170% of its own body length. Climbing is initiated dependent on gap width. Vain attempts to overcome insurmountably broad gaps are avoided. Analysis showed that the fly uses parallax motion generated during the approach to estimate the width of a gap. Some of the results of the research on the fly’s walking behavior have been implemented in a modified hexapod walking robot, and the improvements have been quantified. KW - Taufliege KW - Kinematik KW - Klettern KW - Verhaltensanpassung KW - Drosophila KW - Verhalten KW - Klettern KW - Laufen KW - Robotik KW - Drosophila KW - behaviour KW - climbing KW - walking KW - robotics Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12737 ER - TY - THES A1 - Schleyer, Michael T1 - Integrating past, present and future: mechanisms of a simple decision in larval Drosophila T1 - Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft: Mechanismen einer einfachen Entscheidung von Drosophila-Larven N2 - Is behaviour response or action? In this Thesis I study this question regarding a rather simple organism, the larva of the fruit fly Drosophila melanogaster. Despite its numerically simple brain and limited behavioural repertoire, it is nevertheless capable to accomplish surprisingly complex tasks. After association of an odour and a rewarding or punishing reinforcement signal, the learnt odour is able to retrieve the formed memory trace. However, the activated memory trace is not automatically turned into learned behaviour: Appetitive memory traces are behaviourally expressed only in absence of the rewarding tastant whereas aversive memory traces are behaviourally expressed in the presence of the punishing tastant. The ‘decision’ whether to behaviourally express a memory trace or not relies on a quantitive comparison between memory trace and current situation: only if the memory trace (after odour-sugar training) predicts a stronger sugar reward than currently present, animals show appetitive conditioned behaviour. Learned appetitive behaviour is best seen as active search for food – being pointless in the presence of (enough) food. Learned aversive behaviour, in turn, can be seen as escape from a punishment – being pointless in absence of punishment. Importantly, appetitive and aversive memory traces can be formed and retrieved independent from each other but also can, under appriate circumstances, summate to jointly organise conditioned behaviour. In contrast to learned behaviour, innate olfactory behaviour is not influenced by gustatory processing and vice versa. Thus, innate olfactory and gustatory behaviour is rather rigid and reflexive in nature, being executed almost regardless of other environmental cues. I suggest a behavioural circuit-model of chemosensory behaviour and the ‘decision’ process whether to behaviourally express a memory trace or not. This model reflects known components of the larval chemobehavioural circuit and provides clear hypotheses about the kinds of architecture to look for in the currently unknown parts of this circuit. The second chapter deals with gustatory perception and processing (especially of bitter substances). Quinine, the bitter tastant in tonic water and bitter lemon, is aversive for larvae, suppresses feeding behaviour and can act as aversive reinforcer in learning experiments. However, all three examined behaviours differ in their dose-effect dynamics, suggesting different molecular and cellular processing streams at some level. Innate choice behaviour, thought to be relatively reflexive and hard-wired, nevertheless can be influenced by the gustatory context. That is, attraction toward sweet tastants is decreased in presence of bitter tastants. The extent of this inhibitory effect depends on the concentration of both sweet and bitter tastant. Importantly, sweet tastants differ in their sensitivity to bitter interference, indicating a stimulus-specific mechanism. The molecular and cellular processes underlying the inhibitory effect of bitter tastants are unknown, but the behavioural results presented here provide a framework to further investigate interactions of gustatory processing streams. N2 - Ist Verhalten Aktion oder Reaktion? In dieser Arbeit widme ich mich dieser Frage anhand eines recht einfachen Organismus, der Larve der Taufliege Drosophila melanogaster. Trotz ihres nur aus wenigen Tausend Nervenzellen bestehenden Gehirns und begrenzten Verhaltensrepertoires ist sie dennoch zu überraschend komplexem Verhalten fähig. Nach der Assoziation eines Duftes mit einem belohnenden oder bestrafenden Geschmacksstoff ist der gelernte Duft in der Lage, die gebildete Gedächtnisspur abzurufen. Diese aktivierte Gedächtnisspur wird jedoch nicht automatisch in Verhalten übersetzt: Appetitive Gedächtnisspuren führen nur in Abwesenheit des belohnenden Geschmacks zu erlerntem Verhalten, während aversive Gedächtnisspuren nur in Anwesenheit des bestrafenden Geschmacks in erlerntem Verhalten münden. Die „Entscheidung“, eine Gedächtnisspur in Verhalten zu übersetzen oder nicht, beruht auf einem quantitativen Vergleich zwischen der Gedächtnisspur und der aktuellen Situation: Nur wenn die Gedächtnisspur (nach einem Duft-Zucker-Training) eine größere Zuckerbelohnung vorhersagt als gegewärtig vorhanden, zeigen die Tiere appetitives erlerntes Verhalten. Solches Verhalten kann man am besten als aktive Suche nach Nahrung interpretieren, die in Gegenwart von (ausreichend) Nahrung sinnlos ist. Aversives erlerntes Verhalten andererseits kann als Flucht vor einer Bestrafung verstanden werden – und in Abwesenheit einer Bestrafung gibt es nichts, wovor man fliehen könnte. Appetitive und aversive Gedächtnisspuren können unabhängig voneinander gebildet und abgerufen werden, können unter den richtigen Umständen aber auch gemeinsam erlerntes Verhalten organisieren. Im Gegensatz zu erlerntem Verhalten wird angeborenes olfaktorisches Verhalten nicht durch das Geschmackssystem beinflusst – und umgekehrt. Angeborenes Verhalten erscheint also relativ starr und reflexhaft und läuft größtenteils unbeeinflusst von anderen Umwelteinflüssen ab. Schließlich entwerfe ich ein auf Verhalten basierendes Schaltkreismodell des chemosensorischen Systems der Larve und der „Entscheidung“, eine Gedächtnisspur in Verhalten umzusetzen oder nicht. Dieses Modell stellt bekannte Komponenten des Systems dar und macht klare Vorhersagen über die Architektur, die bisher noch unbekannte Komponenten haben sollten. Das zweite Kapitel der Arbeit behandelt die Wahrnehmung und Verarbeitung von (hauptsächlich bitteren) Geschmacksstoffen. Chinin, der bittere Geschmack in Getränken wie Bitter Lemon, wirkt abstoßend auf Larven, unterdrückt ihr Fressverhalten und kann in Lernexperimenten als Bestrafung wirken. Allerdings unterscheiden sich alle drei untersuchten Verhalten in der Dynamik ihrer Dosis-Wirkungskurven, was unterschiedliche molekulare und zelluläre Wirkungsweisen nahe legt. Angeborenes Wahlverhalten, das als reflexhaft und starr gilt, kann dennoch durch den gustatorischen Kontext beeinflusst werden. Das bedeutet, die Anwesenheit eines Bitterstoffes ist in der Lage, die angeborene Präferenz von Larven für süße Geschmackstoffen zu unterdrücken. Dieser inhibitorische Effekt hängt sowohl von der Konzentration der süßen als auch der bitteren Substanz ab. Was noch wichtiger ist: Die verschiedenen Zucker sind unterschiedlich anfällig für die Störung durch Bitterstoffe, was auf einen Stimulus-spezifischen Mechanismus hindeutet. Die genauen molekularen und zellulären Prozesse, die diesem inhibitorischen Effekt von Bitterstofen zugrunde liegen, sind noch nicht bekannt, die hier präsentierten Ergebnisse bieten aber einen geeigneten Rahmen für weitergehende Untersuchungen der Interaktionen zwischen verschiedenen Teilen des Geschmacksapparates. KW - Lernen KW - Taufliege KW - Geschmackssinn KW - Geruchssinn KW - Sinnesphysiologie KW - Learning KW - Memory KW - Drosophila KW - Decision-making KW - Olfactory KW - Entscheidung KW - Synapse KW - Gedächtnis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78923 ER - TY - THES A1 - Kapustjansky, Alexander T1 - In vivo imaging and optogenetic approach to study the formation of olfactory memory and locomotor behaviour in Drosophila melanogaster T1 - In vivo Imaging und der optogenetische Ansatz zu Untersuchung der Gedächtnissbildung und lokomotorischem Verhalten bei Drosophila melanogaster N2 - Understanding of complex interactions and events in a nervous system, leading from the molecular level up to certain behavioural patterns calls for interdisciplinary interactions of various research areas. The goal of the presented work is to achieve such an interdisciplinary approach to study and manipulate animal behaviour and its underlying mechanisms. Optical in vivo imaging is a new constantly evolving method, allowing one to study not only the local but also wide reaching activity in the nervous system. Due to ease of its genetic accessibility Drosophila melanogaster represents an extraordinary experimental organism to utilize not only imaging but also various optogenetic techniques to study the neuronal underpinnings of behaviour. In this study four genetically encoded sensors were used to investigate the temporal dynamics of cAMP concentration changes in the horizontal lobes of the mushroom body, a brain area important for learning and memory, in response to various physiological and pharmacological stimuli. Several transgenic lines with various genomic insertion sites for the sensor constructs Epac1, Epac2, Epac2K390E and HCN2 were screened for the best signal quality, one line was selected for further experiments. The in vivo functionality of the sensor was assessed via pharmacological application of 8-bromo-cAMP as well as Forskolin, a substance stimulating cAMP producing adenylyl cyclases. This was followed by recording of the cAMP dynamics in response to the application of dopamine and octopamine, as well as to the presentation of electric shock, odorants or a simulated olfactory signal, induced by acetylcholine application to the observed brain area. In addition the interaction between the shock and the simulated olfactory signal by simultaneous presentation of both stimuli was studied. Preliminary results are supporting a coincidence detection mechanism at the level of the adenylyl cyclase as postulated by the present model for classical olfactory conditioning. In a second series of experiments an effort was made to selecticvely activate a subset of neurons via the optogenetic tool Channelrhodopsin (ChR2). This was achieved by recording the behaviour of the fly in a walking ball paradigm. A new method was developed to analyse the walking behaviour of the animal whose brain was made optically accessible via a dissection technique, as used for imaging, thus allowing one to target selected brain areas. Using the Gal4-UAS system the protocerebral bridge, a substructure of the central complex, was highlighted by expressing the ChR2 tagged by fluorescent protein EYFP. First behavioural recordings of such specially prepared animals were made. Lastly a new experimental paradigm for single animal conditioning was developed (Shock Box). Its design is based on the established Heat Box paradigm, however in addition to spatial and operant conditioning available in the Heat Box, the design of the new paradigm allows one to set up experiments to study classical and semioperant olfactory conditioning, as well as semioperant place learning and operant no idleness experiments. First experiments involving place learning were successfully performed in the new apparatus. N2 - Das Verständniss für die komplexen Interaktionen und Zusammenhänge, die von der molekularen Ebene bis zum Auftreten von bestimmten Verhaltensmustern führen, erfordert die interdisziplinäre Zusammenarbeit unterschiedlicher Forschungsrichtungen. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war es einen solchen interdisziplinären Ansatz für die Erforschung und die Manipulation von Verhalten und ihm zu Grunde liegenden Mechanismen zu verwirklichen. Optisches in vivo Imaging ist eine neue, sich ständig weiterentwickelnde Methode, welche es ermöglicht, nicht nur lokale sondern auch weitläufige Aktivitäten innerhalb des Nervensystem zu untersuchen. Drosophila melanogaster stellt aufgrund der leichten genetischen Zugänglichkeit einen herausragenden experimentellen Organismus dar, bei welchem neben optischem Imaging eine ganze Reihe optogenetischer Methoden angewandt werden kann, um die neuronalen Grundlagen des Verhaltens zu erforschen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe von vier genetisch kodierten Sensoren in vivo die Dynamik der cAMP Konzentration in den horizontalen Loben des Pilzkörpers, bei Applikation unterschiedlicher physiologischer und pharmazeutischer Stimuli untersucht. Dabei wurden mehrere transgene Fliegenlinien mit Sensorkonstrukten Epac1, Epac2, Epac2K390E und HCN2 an unterschiedlichen genomischen Insertionsorten, hinsichtlich ihrer Signalqualität untersucht, eine der Linien wurde für weitere Experimente ausgewählt. Zunächst wurde an dieser die in vivo Tauglichkeit des Sensors gezeigt, indem die Konzentration von cAMP durch pharmakologische Applikationen von 8-Bromo-cAMP und Forskolin, einer Substanz welche die Aktivität von cAMP produzierenden Adenylatcyclasen stimuliert, appliziert wurden. Anschließend wurde eine Untersuchung der cAMP Dynamik als Antwort auf einen elektrischen Schock, unterschiedliche Düfte, sowie einen durch Applikation von Acetylcholin simulierten Duftstimulus durchgeführt. Vorläufige Ergebnisse bestärken das aktuelle Modell der klassischen olfaktorischen Konditionierung durch die Koinzidenzdetektion auf der Ebene der Adenylatcyclase. In einem weiteren Experiment wurde der Versuch einer optogenetischen neuronalen Aktivierung unternommen, dabei wurde basierend auf einem Laufball Paradigma eine Methode entwickelt, das Laufverhalten der Fliegen zu analysieren während ihr Gehirn durch eine Imaging-Präparation freigelegt wurde, um gezielt bestimmte durch fluoreszierende Proteine markierte Gehirnbereiche anzuregen. Erste Aufzeichnungen des Laufverhaltens bei Aktivierung der protocerebrallen Brücke, einer Substruktur des Zentralkomplexes, wurden durchgeführt. Schließlich wurde eine neue Apparatur (Shock Box) für die Konditionierung von Einzeltieren entwickelt und gebaut, das Design beruht auf dem der sogenannten Heat Box, ermöglicht jedoch klassische und semioperante olfaktorische Konditionierung zusätzlich zu der in der Heat Box möglichen räumlichen und operanten Konditionierung. Die ersten Versuche für räumliches Lernen wurden in der Apparatur durchgeführt. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Cyclo-AMP KW - Gedächtnis KW - In vivo KW - Imaging KW - Drosophila KW - Memory KW - In vivo KW - Imaging KW - Drosophila KW - Memory Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69535 ER - TY - THES A1 - Schubert, Alice T1 - Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D mit Identifizierung von Interaktionspartnern in Drosophila melanogaster T1 - Immunohistochemical and functional characterisation of the serine/arginine protein kinase SRPK79D with identification of interaction partners in Drosophila melanogaster N2 - Auf der Suche nach Mutanten mit einer vom Wildtyp abweichenden Verteilung des Aktive Zone-Proteins Bruchpilot wurde die Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D identifiziert. Hier zeigte sich, dass die Mutation im Srpk79D-Gen zu einer Agglomeration von Bruchpilot in den larvalen segmentalen und intersegmentalen Nerven führt. In der vorliegenden Arbeit sollte die SRPK79D genauer charakterisiert werden. Nach Präadsorptionen und Affinitätsreinigungen von in einer früheren Arbeit erzeugten Antiseren, gelang es die Lokalisation der überexprimierten SRPK79D-GFP-Isoformen zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass keines der Antiseren die endogene Kinase im Western Blot oder immunhistocheimisch detektieren konnte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Expression der SRPK79D in einer geringen Konzentration erfolgt. Es war jedoch möglich die endogene SRPK79D-PC-Isoform mittels einer Immunpräzipitation soweit anzureichern, dass sie im Western Blot nachweisbar war. Für die SRPK79D-PB-Isoform gelang dies allerdings nicht. Anhand von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten konnte gezeigt werden, dass die panneural überexprimierte SRPK79D-PC-GFP-Isoform an die Aktiven Zone transportiert wird und dort mit Bruchpilot, sowie den Interaktionspartnern von Bruchpilot Liprin-α und Rab3 kolokalisiert. Außerdem liegt sie diffus im Zytoplasma von neuronalen Zellkörpern vor. In adulten Gehirnen lokalisiert die transgen überexprimierte SRPK79D-PC-GFP im Fanshaped body, Ringkomplex und in neuronalen Zellkörpern. Die panneural überexprimierte SRPK79D-PB-GFP-Isoform liegt im larvalen und adulten Gehirn lokal im Zytoplasma der Perikaryen akkumuliert vor und wird nicht an die Aktive Zone transportiert. Das PB-Antiserum erkennt im adulten Gehirn neuronale Zellkörper und das Neuropil in der Calyxregion der Pilzkörper. Immunhistochemische Färbungen von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten mit verschiedenen Antikörpern gegen neuronale Proteine belegen, dass die Agglomerate in der Srpk79D-Mutante für Bruchpilot spezifisch sind. Es konnten bisher keine weiteren Komponenten der Agglomerate detektiert werden. Auch ein genereller axonaler Defekt konnte durch Färbungen gegen CSP, Synaptotagmin und Experimenten mit dem Mitochondrienfarbstoff MitoTracker® FM Green ausgeschlossen werden. Die quantitative Auswertung der Präparate zeigte, dass die Morphologie der synaptischen Boutons und die Zahl der Aktiven Zonen durch die Mutation im Srpk79D-Gen nicht beeinflusst werden. Um gesicherte Kenntnis darüber zu erlangen, ob die Mutation im Srpk79D-Gen die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsexperimente durchgeführt. Es konnte sowohl für das hypomorphe Srpk79DP1-Allel, als auch für die Nullmutante Srpk79DVN eine nahezu vollständige Rettung des Agglomerat-Phänotyps mit der panneural exprimierten SRPK79D-PF- oder der SRPK79D-PB-Isoform erreicht werden. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass beide Isoformen der SRPK79D in der Lage sind den Bruchpilot-Agglomerat-Phänotyp zu retten, die Rettung der Verhaltensdefizite jedoch alle Isoformgruppen benötigen. Um zu untersuchen, ob der Agglomerations-Phänotyp der Srpk79D-Mutanten auf einer Überexpression des Bruchpilotgens oder auf Fehlspleißen seiner prä-mRNA beruht, wurden Immunpräzipitationen, semiquantitative RT-PCRs und Real Time-PCRs durchgeführt. Ausgehend von den Ergebnissen kann eine mögliche Überexpression bzw. Spleißdefekte von Bruchpilot weitgehend ausgeschlossen werden. Die simultane Überexpression von SRPK79D und Bruchpilot konnte den Phänotyp der Bruchpilot-Überexpression nicht retten. Anhand der stimulated emission depletion-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die gebildeten Agglomerate das charakteristische Donut-förmige Muster der T-bars zeigen und wahrscheinlich als fusionierte Ketten von T-bars in den larvalen Nerven vorliegen. Beim in vivo Imaging Versuch konnte demonstriert werden, dass das verkürzte Bruchpilot-D3-Strawberry in die Bruchpilot-Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante eingebaut wird und dass größere Agglomerate unbewegt im Nerv verharren. Der anterograde und retrograde Transport kleinerer Agglomerate konnte verzeichnet werden. Bei CytoTrap-Yeast-two-hybrid-Experimenten konnten für die SRPK79D-PB Isoform vier potentielle Interaktionspartner identifiziert werden: das Hitzeschockprotein Hsp70Bbb, die mitochondriale NADH-Dehydrogenase mt:ND5, das large ribosomal RNA Gen in Mitochondrien und das am Spleißen beteiligte Protein 1.3CC/Caper. Die Sequenzierung zeigte, dass nur das letzte Exon von Caper im pMyr-Vektor vorliegt. Der für die PC-Isoform durchgeführte CytoTrap-Versuch ergab nur Temperatur-Revertanten. SR-Proteinkinasen phosphorylieren die RS-Domäne von SR-Proteinen und sind dadurch an der Regulation des konstitutiven und alternativen Spleißens beteiligt. Somit stellen die acht identifizierten SR-Proteine in Drosophila potentielle Interaktionspartner der SRPK79D dar. Die durch RNAi-vermittelte Reduktion von sieben SR-Proteinen führte zu keiner Agglomeration von Bruchpilot. Jedoch führte die RNAi-vermittelte Reduktion des SR-Proteins Spleißfaktor 2 (SF2) zu kleineren Bruchpilot-Agglomeraten in den axonalen Nerven. SF2 ist selbst kein Bestandteil der Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante. Die Überexpression von SF2 führt wahrscheinlich zu einem axonalen Transportdefekt, wie die Färbung gegen das Cysteine string protein zeigte. Weiterhin führt die Überexpression zu einer Akkumulation von SF2 in larvalen Axonen und im adulten Gehirn der Fliegen. SF2 ist nicht nur in Zellkernen sämtlicher Zellen nachweisbar, sondern es konnte auch ein spezifisches Signal im subsynaptischen Retikulum der Postsynapse detektiert werden, wie die Färbungen gegen Disc large bestätigten. N2 - In a Screen for mutations which affect the distribution of the active zone protein Bruchpilot, the serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) was identified. A mutation in the Srpk79D gene leads to conspicuous agglomeration of Bruchpilot in the larval segmental and intersegmental nerves. The aim of this thesis was to characterize the function of SRPK79D and to identify its interaction partners. The isoform specific antisera which were generated in an earlier PhD thesis recognized only the pan-neuraly overexpressed GFP-tagged SRPK79D isoforms in Western blots and immunhistochemical stainings. After preabsorption and affinity purification the antisera could uncover the localization of the overexpressed SRPK79D-GFP. Without enrichment of the endogenous SRPK79D concentration seems to be too low to be detected with the antisera. However, the endogenous SRPK79D-PC isoform could be detected in a Western blot after immunoprecipitation, but not the SRPK79D-PB isoform. The panneural overexpressed SRPK79D-PC-GFP isoform co-localizes with Bruchpilot as well as with the Bruchpilot interaction partners Liprin-α and Rab3 at active zones and showed a diffuse pattern in the cytoplasm of neuronal cell bodies. In adult brains the panneural overexpressed SRPK79D-PC isoform is detectable in the fanshaped body, ring complex and neuronal cell bodies. The panneural overexpressed SRPK79D-PB isoform is not present at the active zone but is detectable in larval and adult CNS accumulating in discrete spots in the cytoplasm of neuronal cells. The panneural overexpressed SRPK79D-PB isoform is also present in the neuronal cell bodies and calyces of the mushroom body. Larval dissections followed by stainings with different antibodies against synaptic proteins showed that the agglomerates in the Srpk79D mutants are quite specific for Bruchpilot. No other components of the agglomerates could be revealed until now. General impairments of axonal transport could be excluded by stainings against cysteine string protein (CSP), Synaptotagmin, and experiments with the dye MitoTracker® Green FM. These synaptic proteins are uniformly distributed along the larval nerves. The quantification of boutons revealed that the basic synaptic structure is not altered in Srpk79D-mutants. Stainings on frozen head sections of null mutant Srpk79D revealed a spot like Bruchpilot accumulation in the antennal nerves. The mutation of Srpk79D causes behavioral deficits in adult flies as well as a shortened life span. In order to test if expression of either isoform (SRPK79D-PC/PF or –PB) is able to rescue the obtained phenotypes, rescue experiments were performed. A nearly complete rescue of the agglomerate phenotype was achieved with both SRPK79D isoforms. Rescue experiments for the observed behavioral phenotype in the null mutant background did not significant by improve the defect, neither when using the pannreural driver lines elav-GAL4 nor the newly generated nSyb-GAL4. Alkaline Phosphatase treatment followed by 1D- or 2D-gelelecrophoresis could not detect a possible phosphorylation of SRPK79D. Also the vesicle-associated protein Synapsin showed a normal isoform pattern which indicates that Synapsin is not a substrate for SRPK79D. In experiments to detect overexpression or splicing defects of the active zone protein Bruchpilot as possible cause for the agglomeration phenotype in mutant Srpk79D animals, immunoprecipitations, semiquantitative RT-PCRs and Real Time-PCRs were performed. The results showed that overexpression or splicing deficits could be largely excluded. In stainings with the new Bruchpilot antisera N-Term and D2 the staining pattern did not differ from the nc82 staining showing that the PF isoform of Bruchpilot is not forming separate agglomerates in Srpk79DVN mutants. The overexpression of D2-4 and D1-3, truncated Bruchpilot proteins without either the N- or C-terminus, respectively, showed an agglomeration of the corresponding proteins in larval and adult CNS. However the overexpression of D1-3 is not affecting the endogenous Bruchpilot distribution. The simultaneous overexpression of SRPK79D and Bruchpilot could not rescue the phenotype caused by Bruchpilot overexpression. With the stimulated emission depletion microscope the pattern of the Bruchpilot agglomerates in the Srpk79DVN mutant revealed electron-dense donut-shaped structures in larval nerves, presumably fused T-bars. With in vivo imaging experiments anterograde as well as retrograde movement of D3-labeled agglomerates in the Srpk79DVN mutant was observed whereas large agglomerates are immobile. To identify substrates or interaction partners of SRPK79D the Yeast-two-hybrid screen CytoTrap was performed. The CytoTrap screen for the SRPK79D-PB isoform identified four interaction partners: the heat shock protein Hsp70Bbb, the mitochondrial NADH-Dehydrogenase mt:ND5, the large ribosomal RNA gene in mitochondria and 1.3CC/Caper. Caper is involved in splicing via the spliceosome. Sequencing revealed that the pMyr vector includes only the last exon of Caper. The performed CytoTrap for the RC-Isoform detected only temperature revertants. The RNAi mediated knock down of each of the eight known SR proteins in Drosophila showed that seven of them do not produce a phenotype whereas the reduction of SF2 leads to Bruchpilot agglomerates in larval nerves. The SR-Protein SF2 is not included in the agglomerates of the Srpk79D mutant but showed expression in nuclei of all cell types. The overexpression of SF2 leads to an agglomeration of SF2 in the larval nerves probably due to an impairment of general axonal transport. SF2 is not only a nuclear protein; it is also associated with post synaptic structures. KW - Taufliege KW - Serin KW - Arginin KW - Proteinkinasen KW - RNS-Spleißen KW - Genmutation KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK79D KW - Serin-Arginin Proteinkinase KW - Spleißen KW - Bruchpilot KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK79D KW - serine-arginine protein kinase KW - splicing KW - Bruchpilot Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53841 ER - TY - THES A1 - Dusik, Verena T1 - Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38 in der inneren Uhr von Drosophila melanogaster T1 - Immunhistochemical and functional characterisation of the mitogen-activated protein kinase p38 in the endogenous clock of Drosophila melanogaster N2 - Circadianes und Stress-System sind zwei physiologische Systeme, die dem Organismus helfen sich an Veränderungen ihrer Umwelt anzupassen. Während letzteres spontane und schnelle Antworten auf akute, unvorhersehbare Umweltreize liefert, sagt das circadiane System täglich wiederkehrende Ereignisse vorher and bereitet den Organismus so vorzeitig auf diese nahende Umweltveränderung vor. Dennoch, trotz dieser unterschiedlichen Reaktionsmechanismen agieren beide Systeme nicht komplett autonom. Studien der vergangen Jahre belegen vielmehr eine Interaktion beider Systeme. So postulieren sie zum einem Unterschiede in der Stressantwort in Abhängigkeit von der Tageszeit zu der der Reiz auftritt und weisen zugleich auf eine Zunahme von gestörten biologischen Tagesrhythmen, wie zum Beispiel Schlafstörungen, in Folge von unkontrollierten oder exzessiven Stress hin. Ebenso liefern kürzlich durchgeführte Studien an Vertebraten und Pilzen Hinweise, dass mit p38, eine Stress-aktivierte Kinase, an der Signalweiterleitung zur inneren Uhr beteiligt ist (Hayashi et al., 2003), sogar durch dieses endogene Zeitmesssystem reguliert wird (Vitalini et al., 2007; Lamb et al., 2011) und deuten damit erstmals eine mögliche Verbindung zwischen Stress-induzierten und regulären rhythmischen Anpassungen des Organismus an Umweltveränderungen an. Molekulare und zelluläre Mechanismen dieser Verknüpfung sind bisher noch nicht bekannt. Während die Rolle von p38 MAPK bei der Stress- und Immunantwort in Drosophila melanogaster gut charakterisiert ist, wurden Expression und Funktion von p38 in der inneren Uhr hingegen bislang nicht untersucht. Die hier vorliegende Arbeit hatte daher zum Ziel mittels immunhistochemischer, verhaltensphysiologischer und molekularer Methoden eine mögliche Rolle der Stress-aktivierten Kinase im circadianen System der Fliege aufzudecken. Antikörperfärbungen sowie Studien mit Reporterlinien zeigen deutliche Färbesignale in den s-LNv, l-LNv und DN1a und erbringen erstmals einen Nachweis für p38 Expression in den Uhrneuronen der Fliege. Ebenso scheint die Aktivität von p38 MAPK in den DN1a uhrgesteuert zu sein. So liegt p38 vermehrt in seiner aktiven Form in der Dunkelphase vor und zeigt, neben seiner circadian regulierten Aktivierung, zusätzlich auch eine Inaktivierung durch Licht. 15-Minuten-Lichtpulse in der subjektiven Nacht führen zu einer signifikanten Reduktion von aktivierter, phosphorylierter p38 MAPK in den DN1a von Canton S Wildtypfliegen im Vergleich zu Fliegen ohne Lichtpuls-Behandlung. Aufzeichnungen der Lokomotoraktivität offenbaren zusätzlich die Notwendigkeit von p38 MAPK für wildtypisches Timing der Abendaktivität sowie zum Erhalt von 24-Stunden-Verhaltensrhythmen unter konstanten Dauerdunkel-Bedindungen. So zeigen Fliegen mit reduzierten p38 Level in Uhrneuronen einen verzögerten Beginn der Abendaktivität und stark verlängerte Freilaufperioden. In Übereinstimmung mit Effekten auf das Laufverhalten scheint darüber hinaus die Expression einer dominant-negativen Form von p38b in Drosophila’s wichtigsten Uhrneuronen eine verspätete nukleäre Translokation von Period zur Folge zu haben. Westernblots legen zusätzlich einen Einfluss von p38 auf den Phosphorylierungsgrad von Period nahe und liefern damit einen mögliche Erklärung für den verspäteten Kerneintritt des Uhrproteins. Abschließende Stützung der Westernblotergebnisse bringen in vitro Kinasenassays und deuten auf p38 als eine potentielle „Uhrkinase“ hin, welche auch in vivo Period an Serin 661 sowie weiteren potentiellen Phosphorylierungsstellen phosphorylieren könnte. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit eindeutig auf eine bedeutende Rolle von p38, neben dessen Funkion im Stress-System, auch im circadianen System der Fliege hin und offenbaren damit die Möglichkeit, dass p38 als Schnittstelle zwischen beider Systeme fungiert. N2 - The circadian and the stress system are two distinct physiological systems that help the organism to adapt to environmental challenges. While the latter elicits reactive responses to acute environmental changes, the circadian system predicts daily occurring alterations and prepares the organism in advance. However, despite of these differences both responses are not mutually exclusive. Studies in the last years obviously prove a strong interaction between both systems showing a strong time-related stress response depending on the time of day of stressor presentation on the one hand and increased disturbances of daily rhythms, like sleep disorders, in consequence of uncontrolled or excessive stress on the other. In line with this fact, recent studies in vertebrates and fungi indicate that p38, a stress-activated Kinase, is involved in signaling to the circadian clock (Hayashi et al., 2003) and in turn is additionally regulated by this timekeeping system (Vitalini et al., 2007; Lamb et al., 2011) providing an interesting link between stress-induced and regularly rhythmic adaptations of the organism to environmental changes. However, little is known about molecular and cellular mechanisms of this interconnection. In Drosophila melanogaster the role of p38 MAPK is well characterized in terms of immune and stress response, p38 expression and function in the circadian clock has not been reported so far. Therefore, the present thesis aimed to elucidate a putative role of the stress-activated Kinase in the fly’s circadian system using an immunohistochemical, behavioral as well as molecular approach. Surprisingly, for the first time antibody as well as reporterline studies cleary prove p38 expression in Drosophila clock neurons showing visible staining in s-LNvs, l-LNvs and DN1as. Moreover p38 MAPK in DN1as seems to be activated in a clock-dependent manner. p38 is most active under darkness and, besides its circadian activation, additionally gets inactivated by light. 15 minutes light pulse applied during the dark phase lead to a significant reduction in phosphorylated and activated p38 MAPK in Canton S wildtype flies compared to flies without light pulse treatment. In addition, locomotor activity recordings reveal that p38 is essential for a wild-type timing of evening activity and for maintaining ~24h behavioral rhythms under constant darkness. Flies with reduced p38 activity in clock neurons show delayed evening activity onsets and drastically lengthened the period of their free-running rhythms. In line with these effects on locomotor behavior, the nuclear translocation of the clock protein Period is significantly delayed on the expression of a dominant-negative form of p38b in Drosophila’s most important clock neurons. Western Blots reveal that p38 affects the phosphorylation degree of Period, what is likely the reason for its effects on nuclear entry of Period. In vitro kinase assays additionally confirm the Western Blot results and point to p38 as a potential “clock kinase” phosphorylating Period at Serin 661 and putative phosphorylation sites. Taken together, the results of the present thesis clearly indicate a prominent role of p38 in the circadian system of the fly besides its function in stress-input pathways und open up the possibility of p38 MAPK being a nodal point of both physiological systems. KW - Taufliege KW - Biologische Uhr KW - MAP-Kinase KW - Innere Uhr KW - MAPK KW - p38 KW - Phosphorylierung KW - Mitogen-aktivierte Proteinkinase KW - Drosophila melanogaster KW - Circadiane Rhythmen KW - Drosophila Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124636 ER - TY - THES A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - synaptic proteins KW - monoclonal antibodies Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 N1 - korrigierte Ausgabe der Arbeit aus dem Jahr 2022 unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27020 ER - TY - BOOK A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave 99 promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS- 15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und 101 da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - synaptic proteins KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - monoclonal antibodies Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270205 N1 - ursprüngliche Originalausgabe der Dissertation erschienen am 19.01.2012 unter: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 ER - TY - THES A1 - Amini, Emad T1 - How central and peripheral clocks and the neuroendocrine system interact to time eclosion behavior in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Wie zentrale und periphere Uhren und das neuroendokrine System zusammenwirken, um das Schlupfverhalten von \(Drosophila\) \(melanogaster\) zeitlich festzulegen N2 - To grow larger, insects must shed their old rigid exoskeleton and replace it with a new one. This process is called molting and the motor behavior that sheds the old cuticle is called ecdysis. Holometabolic insects have pupal stages in between their larval and adult forms, during which they perform metamorphosis. The pupal stage ends with eclosion, i.e., the emergence of the adult from the pupal shell. Insects typically eclose at a specific time during the day, likely when abiotic conditions are at their optimum. A newly eclosed insect is fragile and needs time to harden its exoskeleton. Hence, eclosion is regulated by sophisticated developmental and circadian timing mechanisms. In Drosophila melanogaster, eclosion is limited to a daily time window in the morning, regarded as the “eclosion gate”. In a population of laboratory flies entrained by light/dark cycles, most of the flies eclose around lights on. This rhythmic eclosion pattern is controlled by the circadian clock and persists even under constant conditions. Developmental timing is under the control of complex hormonal signaling, including the steroid ecdysone, insulin-like peptides, and prothoracicotropic hormone (PTTH). The interactions of the central circadian clock in the brain and a peripheral clock in the prothoracic gland (PG) that produces ecdysone are important for the circadian timing of eclosion. These two clocks are connected by a bilateral pair of peptidergic PTTH neurons (PTTHn) that project to the PG. Before each molt, the ecdysone level rises and then falls shortly before ecdysis. The falling ecdysone level must fall below a certain threshold value for the eclosion gate to open. The activity of PTTHn is inhibited by short neuropeptide F (sNPF) from the small ventrolateral neurons (sLNvs) and inhibition is thought to lead to a decrease in ecdysone production. The general aim of this thesis is to further the understanding of how the circadian clock and neuroendocrinal pathways are coordinated to drive eclosion rhythmicity and to identify when these endocrinal signaling pathways are active. In Chapter I, a series of conditional PTTHn silencing-based behavioral assays, combined with neuronal activity imaging techniques such as non-invasive ARG-Luc show that PTTH signaling is active and required shortly before eclosion and may serve to phase-adjust the activity of the PG at the end of pupal development. Trans-synaptic anatomical stainings identified the sLNvs, dorsal neurons 1 (DN1), dorsal neurons 2 (DN2), and lateral posterior neurons (LPNs) clock neurons as directly upstream of the PTTHn. Eclosion motor behavior is initiated by Ecdysis triggering hormone (ETH) which activates a pair of ventromedial (Vm) neurons to release eclosion hormone (EH) which positively feeds back to the source of ETH, the endocrine Inka cells. In Chapter II trans-synaptic tracing showed that most clock neurons provide input to the Vm and non-canonical EH neurons. Hence, clock can potentially influence the ETH/EH feedback loop. The activity profile of the Inka cells and Vm neurons before eclosion is described. Vm and Inka cells are active around seven hours before eclosion. Interestingly, all EH neurons appear to be exclusively peptidergic. In Chapter III, using chemoconnectomics, PTTHns were found to express receptors for sNPF, allatostatin A (AstA), allatostatin C (AstC), and myosuppressin (Ms), while EH neurons expressed only Ms and AstA receptors. Eclosion assays of flies with impaired AstA, AstC, or Ms signaling do not show arrhythmicity under constant conditions. However, optogenetic activation of the AstA neurons strongly suppresses eclosion. Chapter IV focuses on peripheral ventral’ Tracheal dendrite (v’Td) and class IV dendritic arborization (C4da) neurons. The C4da neurons mediate larval light avoidance through endocrine PTTH signaling. The v’Td neurons mainly receive O2/CO2 input from the trachea and are upstream of Vm neurons but are not required for eclosion rhythmicity. Conditional ablation of the C4da neurons or torso (receptor of PTTH) knock-out in the C4da neurons impaired eclosion rhythmicity. Six to seven hours before eclosion, PTTHn, C4da, and Vm neurons are active based on ARG-Luc imaging. Thus, C4da neurons may indirectly connect the PTTHn to the Vm neurons. In summary, this thesis advances our knowledge of the temporal activity and role of PTTH signaling during pupal development and rhythmic eclosion. It further provides a comprehensive characterization of the synaptic and peptidergic inputs from clock neurons to PTTHn and EH neurons. AstA, AstC, and Ms are identified as potential modulators of eclosion circuits and suggest an indirect effect of PTTH signaling on EH signaling via the peripheral sensory C4da neurons. N2 - Um zu wachsen, müssen Insekten ihr altes, starres Exoskelett abwerfen und durch ein neues ersetzen. Dieser Vorgang wird als Häutung bezeichnet, und das motorische Verhalten, bei dem die alte Kutikula abgestoßen wird, heißt Ekdysis. Holometabole Insekten haben zwischen ihrer Larven- und Erwachsenenform ein Puppenstadium, in welchem sie eine Metamorphose durchlaufen. Das Puppenstadium endet mit dem Schlüpfen des erwachsenen Tieres aus der Puppenhülle. Die Insekten schlüpfen in der Regel zu einem bestimmten Zeitpunkt am Tag, wenn die abiotischen Bedingungen optimal sind, da das frisch geschlüpfte Insekt zerbrechlich ist und Zeit braucht, um sein Exoskelett auszuhärten. Daher wird der Schlupf durch ausgeklügelte Mechanismen der Entwicklung und der inneren Uhr gesteuert. Bei Drosophila melanogaster ist der Sclupf auf ein tägliches Zeitfenster am Morgen beschränkt, das als "Schlupffenster" bezeichnet wird. In einer Population von Laborfliegen, die durch Licht/Dunkel-Zyklen gesteuert wird, schlüpfen die meisten Fliegen in etwa um das Einschalten der Beleuchtung. Dieses rhythmische Schlupfmuster wird von der inneren Uhr gesteuert und bleibt auch unter konstanten Bedingungen bestehen. Das Timing der Entwicklung wird von komplexen hormonellen Signalen gesteuert, darunter das Steroid Ecdyson, insulinähnliche Peptide und das prothorakotrope Hormon (PTTH). Die Wechselwirkungen zwischen der zentralen zirkadianen Uhr im Gehirn und einer peripheren Uhr in der Prothorakaldrüse (PG), die Ecdyson produziert, sind wichtig für die zirkadiane Zeitsteuerung des Schlupfs. Diese beiden Uhren sind durch ein bilaterales Paar peptiderger PTTH-Neuronen (PTTHn) verbunden, die in die PG projizieren. Vor jeder Häutung steigt der Ecdysonspiegel an und fällt dann kurz vor danach wieder ab. Der fallende Ecdysonspiegel muss einen bestimmten Schwellenwert unterschreiten, damit sich das Schlupffenster öffnen kann. Die Aktivität der PTTHn wird durch das kurze Neuropeptid F (sNPF) aus den kleinen ventrolateralen Neuronen (sLNvs) gehemmt, und es wird angenommen, dass die Hemmung zu einer Abnahme der Ecdysonproduktion führt. Das allgemeine Ziel dieser Thesis besteht darin, die Koordination zwischen der zirkadianen Uhr und den neuroendokrinen Signalwegen zur Steuerung der Eklosionsrhythmik weiter zu charakterisieren und zu ermitteln, wann diese endokrinen Signalwege aktiv sind. In Kapitel I zeigen eine Reihe von Verhaltenstests, die auf der konditionalen Ausschaltung von PTTHn basieren, in Kombination mit Techniken zur Darstellung neuronaler Aktivität, wie z. B. nicht-invasives ARG-Luc imaging, dass PTTH-Signale kurz vor dem Schlupf aktiv und erforderlich sind und zur Phasenanpassung der Aktivität der PG am Ende der Puppenentwicklung dienen könnten. Trans-synaptische anatomische Färbungen identifizierten die sLNvs, die dorsalen Neuronen 1 (DN1), die dorsalen Neuronen 2 (DN2) und die lateralen posterioren Neuronen (LPNs) als Uhrneuronen, die dem PTTHn direkt vorgeschaltet sind. Das motorische Schlupfverhalten wird durch das Ecdysis-auslösende Hormon (ETH) ausgelöst, das ein Paar ventromedialer (Vm) Neuronen zur Freisetzung des Eklosionshormons (EH) anregt, welches positiv an die Quelle des ETH, die endokrinen Inka-Zellen, zurückkoppelt. In Kapitel II zeigte die trans-synaptische Nachverfolgung, dass die meisten Uhrneuronen Input für die Vm- und nicht-kanonischen EH-Neuronen liefern, sodass die Uhr möglicherweise die ETH/EH-Rückkopplungsschleife beeinflussen kann. Das Aktivitätsprofil der Inka-Zellen und Vm-Neuronen vor dem Schlupf wird beschrieben. Vm- und Inka-Zellen sind etwa sieben Stunden vor dem Schlupf aktiv. Interessanterweise scheinen alle EH-Neuronen ausschließlich peptiderg zu sein. In Kapitel III wurde mit Hilfe von Chemoconnectomics festgestellt, dass PTTH-Neuronen Rezeptoren für sNPF, Allatostatin A (AstA), Allatostatin C (AstC) und Myosuppressin (Ms) exprimieren, während EH nur Ms- und AstA-Rezeptoren exprimieren. Eklosionsversuche mit Fliegen, deren AstA-, AstC- oder Ms-Signalübertragung beeinträchtigt ist, zeigen unter konstanten Bedingungen keine Arrhythmie. Eine optogenetische Aktivierung der AstA-Neuronen führt jedoch zu einer starken Unterdrückung des Schlupfs. Kapitel IV konzentriert sich auf die peripheren ventralen Trachealdendritischen Neurone (v'Td) und dendritische Verzweigungsneurone der Klasse IV (C4da). Die C4da-Neuronen vermitteln die Lichtvermeidung der Larven durch endokrine PTTH-Signale. Die v'Td-Neuronen erhalten hauptsächlich O2/CO2-Input aus den Tracheen und sind den Vm-Neuronen vorgeschaltet, werden aber für die Schlupfrhythmik nicht benötigt. Die bedingte Ablation der C4da-Neuronen und das Knock-out von torso (Rezeptor für PTTH) in den C4da-Neuronen beeinträchtigten die Schlupfrhythmik. Sechs bis sieben Stunden vor dem Schlupf sind die PTTHn-, C4da- und Vm-Neuronen aktiv. Somit könnten C4da-Neuronen indirekt die PTTHn mit den Vm-Neuronen verbinden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit unser Wissen über das zeitliche Aktivitätsmuster und der Rolle des PTTH signalling während der Puppenentwicklung und dem rhythmisches Schlupf erweitert. Sie liefert auch eine umfassende Charakterisierung der synaptischen und peptidergen Eingänge von Uhrneuronen zu PTTHn- und EH-Neuronen. AstA, AstC und Ms wurden als potenzielle Modulatoren der neuronalen Schlupfschaltkreise identifiziert und deuten auf einen indirekten Effekt der PTTH-Signalgebung auf das EH signalling über die peripheren sensorischen C4da-Neuronen hin. KW - Prothoracicotropic hormone KW - Prothoracic gland KW - Eclosion KW - Eclosion hormone KW - C4da KW - v’Td KW - Neuropeptide KW - Neuroendokrines System KW - Taufliege Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-361309 ER - TY - THES A1 - Ljaschenko, Dmitrij T1 - Hebbian plasticity at neuromuscular synapses of Drosophila T1 - Hebbsche Plastizität an den neuromuskulären Synapsen in Drosophila melanogaster N2 - Synaptic plasticity determines the development of functional neural circuits. It is widely accepted as the mechanism behind learning and memory. Among different forms of synaptic plasticity, Hebbian plasticity describes an activity-induced change in synaptic strength, caused by correlated pre- and postsynaptic activity. Additionally, Hebbian plasticity is characterised by input specificity, which means it takes place only at synapses, which participate in activity. Because of its correlative nature, Hebbian plasticity suggests itself as a mechanism behind associative learning. Although it is commonly assumed that synaptic plasticity is closely linked to synaptic activity during development, the mechanistic understanding of this coupling is far from complete. In the present study channelrhodopsin-2 was used to evoke activity in vivo, at the glutamatergic Drosophila neuromuscular junction. Remarkably, correlated pre- and postsynaptic stimulation led to increased incorporation of GluR-IIA-type glutamate receptors into postsynaptic receptor fields, thus boosting postsynaptic sensitivity. This phenomenon is input-specific. Conversely, GluR-IIA was rapidly removed from synapses at which neurotransmitter release failed to evoke substantial postsynaptic depolarisation. This mechanism might be responsible to tame uncontrolled receptor field growth. Combining these results with developmental GluR-IIA dynamics leads to a comprehensive physiological concept, where Hebbian plasticity guides growth of postsynaptic receptor fields and sparse transmitter release stabilises receptor fields by preventing overgrowth. Additionally, a novel mechanism of retrograde signaling was discovered, where direct postsynaptic channelrhodopsin-2 based stimulation, without involvement of presynaptic neurotransmitter release, leads to presynaptic depression. This phenomenon is reminiscent of a known retrograde homeostatic mechanism, of inverted polarity, where neurotransmitter release is upregulated, upon reduction of postsynaptic sensitivity. N2 - Das Phänomen der synaptischen Plastizität bestimmt die Entwicklung funktionaler neuronaler Schaltkreise. Die meisten Neurowissenschaftler betrachten synaptische Plastizität als die neuronal Grundlage von Lernen und Gedächtnis. Es gibt viele Ausprägungsarten synaptischer Plastizität, eine davon ist die sogenannte Hebb’sche Plastizität. Diese ist definiert durch eine aktivitätsinduzierte, langanhaltende Veränderung der Stärke einer synaptischen Verbindung, verursacht durch korrelative Aktivierung der Prä- und der Postsynapse. Zusätzlich ist die Ausbreitung der Hebb’sche Plastizität synapsenspezifisch, d.h. nur die Synapsen, die an der korrelativen Aktivierung teilnehmen, erfahren auch die Veränderung. Das Wachstumssignal breitet sich also nicht auf benachbarte Synapsen aus. Der korrelative Wesenszug der Hebb’schen Plastizität macht sie zu einem naheliegenden zellulären Mechanismus assoziativen Lernens. Es wird angenommen, dass synaptische Aktivität und synaptische Plastizität während der Entwicklung neuronaler Schaltkreise eng gekoppelt sind. Das mechanistische Verständnis dieser Kopplung ist jedoch weitgehend unverstanden. In der vorliegenden Arbeit wurde das lichtaktivierbare Kanalrhodopsin-2 verwendet, um Aktivität an der glutamatergen neuromuskulären Synapse in der lebenden, sich frei bewegenden, Drosophila melanogaster Larve auszulösen. Wenn die Prä- und die Postsynapse korrelativ aktiviert wurden, führte dies zur verstärkten Integration von Glutamatrezeptoren des GluR-IIA Typs in die postsynaptischen Rezeptorfelder, was in einer Erhöhung der postsynaptischer Empfindlichkeit mündete. Dieses Platizitätsphänomen wurde als synapsenspezifisch identifiziert und damit als Hebb’sch. Im Gegenzug, wurde der gleiche Rezeptortyp entfernt, wenn Neurotransmitterfreisetzung nicht zu einer erheblichen Depolarisation der Postsynapse führte. Dieser Mechanismus könnte für die Kontrolle des Rezeptorfeldwachstums verantwortlich sein. Es wurde ein physiologisches Modell erarbeitet, bei dem Hebb’sche Plastizität das Wachstum postsynaptischer Rezeptorfelder während der Entwicklung leitet und sporadische, nicht synchronisierte Neurotransmitterfreisetzung die Rezeptorfeldgröße stabilisiert, indem sie das Wachstum Dieser begrenzt. Zusätzlich wurde eine neue Modalität der synaptischen Plastizität an der neuromuskulären Synapse entdeckt: Ein retrograder Signalweg wird aktiviert wenn die postsynaptische Seite, unter Umgehung der Präsynapse, direkt, lichtinduziert aktiviert wird. Dieser Signalweg führt zur präsynaptischen Depression. Das Phänomen erinnert stark an einen bereits bekannten retrograden homöostatischen Mechanismus, reziproker Polarität, bei dem Neurotransmitter Freisetzung hochreguliert wird, wenn die Empfindlichkeit der Postsynapse verringert wird. KW - Synapse KW - Hebbian plasticity KW - synapse KW - Drosophila KW - Plastizität KW - Hebbsche Lernregel KW - Taufliege Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90465 ER - TY - THES A1 - Keller, Andreas T1 - Genetic Intervention in Sensory Systems of a Fly T1 - Genetische Intervention in sensorischen Systemen einer Fliege N2 - Die vorliegende Arbeit vergleicht Transgene, die in Drosophila Neuronen exprimiert wurden, um diese abzutöten oder zu blockieren. Tetanus Neurotoxin erwies sich als sehr effizient, um chemische Synapsen zu blockieren. Synapsen, die aus einer chemischen und einer elektrischen Komponente bestehen, ließen sich dagegen mit einem ektopisch exprimierten humanen Kalium-Kanal zuverlässiger ausschalten. Es wurden drei Möglichkeiten verglichen, eine zeitliche Kontrolle über die Funktion von Neuronen zu erlangen. Keines der getesteten Systeme erwies sich als universell anwendbar, aber die durch Rekombination induzierte Tetanus Neurotoxin Expression ist ein vielversprechender Ansatz. Die aus dieser vergleichenden methodischen Studie gewonnenen Ergebnisse wurden angewendet, um die Rolle von Neuronen in sensorischen Systemen bei der Verarbeitung verschiedener sensorischer Informationen zu untersuchen. Chemische und mechanische Rezeptorneuronen konnten den olfaktorisch gesteuerten Verhaltensweisen beziehungsweise den lokomotorischen Leistungen, denen sie zu Grunde liegen, zugeordnet werden. Hauptthema der Arbeit ist die Suche nach Neuronen, die an der Bewegungsdetektion im visuellen System beteiligt sind. Dabei zeigte sich, daß weder L2 noch L4 Neuronen im ersten visuellen Neuropil essentiell für die Detektion von Bewegung sind. Vielmehr deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Bewegungsdetektion über das Netzwerk der amacrinen Zellen (a) erfolgt. Die für vertikale Bewegung sensitiven VS Zellen in der Lobula Platte erwiesen sich als nicht notwendig für die Verhaltensreaktionen auf vertikale Bewegungsreize. Daraus folgt auch, daß in der Strukturmutante optomotor blind das Fehlen der VS Zellen nicht ursächlich für die stark eingeschränkten Reaktionen auf vertikale Bewegung ist. Ein anderer Defekt in optomotor blind muß dafür verantwortlich sein. Die Arbeit zeigt das große Potential der beschriebenen Methoden zur Untersuchung der Informationsverarbeitung im Nervensystem von Drosophila. Einzelne Neuronengruppen konnten komplexen Verhaltensweisen zugeordnet werden und Theorien über die Informationsverarbeitung konnten in Verhaltensexperimenten mit transgenen Fliegen getestet werden. Eine weitere Verfeinerung der Methodik zur genetischen Intervention wird das Drosophila Gehirn zu einem noch besseren Modell für die Informationsverarbeitung in Nervensystemen machen. N2 - Different transgenes that can be expressed in neurons to kill or block them were compared. Tetanus neurotoxin blocked chemical synapses very efficiently. Synapses consisting of a chemical and an electrical component were blocked more reliably by expressing a human inwardly rectifying potassium channel. To gain temporal control over neuronal function, three genetic tools have been investigated. None of the systems is without drawbacks, however, the recombination induced tetanus neurotoxin expression is a promising approach. The knowledge gained from the comparative methodological study was used to investigate the role of neurons in sensory systems in processing different sensory informations. Receptor neurons sensitive for chemical or mechanical stimuli were correlated to specific olfactory behaviors or locomotor tasks. The main topic of this thesis is the much discussed question of which neurons are involved in motion processing in the visual system of flies. Neither L2 nor L4 neurons in the first visual neuropil are essential for motion-detection. The results indicate that maybe motion is detected by the network of amacrine cells (a). The vertical motion-sensitive VS cells in the lobula plate are not necessary for behavioral responses to vertical motion. This finding implies that the lack of VS cells in the structural mutant optomotor blind is not causally related to the altered responses to motion stimuli. Other abnormalities in optomotor blind are responsible for this behavioral phenotype. This work shows the potential of the described methods in studying information processing in the Drosophila brain. Groups of neurons were correlated to complex behavioral responses and theories about information processing were tested by behavioral experiments with transgenic flies. The refinement of the genetic tools to interfere with neuronal function will make the Drosophila brain an even better model to study information processing in nervous systems. KW - Taufliege KW - Bewegungssehen KW - Neurophysiologie KW - Nervengift KW - Drosophila KW - Tetanus Neurotoxin KW - Bewegungsdetektion KW - Visuelles System KW - Lamina KW - Lobula Platte KW - Drosophila KW - Tetanus Neurotoxin KW - Motion detection KW - visual system KW - lamina KW - lobula plate Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-680 ER - TY - THES A1 - Rister, Jens T1 - Genetic dissection of peripheral pathways in the visual system of Drosophila T1 - Genetische Zerlegung peripherer Pfade im visuellen System von Drosophila N2 - Die visuellen Systeme von Vertebraten und Invertebraten weisen Ähnlichkeiten in den ersten Schritten visueller Informationsverarbeitung auf. Im menschlichen Gehirn werden zum Beispiel die Modalitäten Farbe, Form und Bewegung separat in parallelen neuronalen Pfaden verarbeitet. Dieses grundlegende Merkmal findet sich auch bei der Fliege Drosophila melanogaster, welche eine ähnliche Trennung in farbsensitive und (farbenblinde) bewegungssensitive Pfade aufweist, die durch zwei verschiedene Gruppen von Photorezeptoren (dem R1-6 und dem R7/8 System) determiniert werden. Fliegen haben ein hoch organisiertes visuelles System, welches durch die repetitive, retinotope Organisation von vier Neuropilen charakterisiert ist: Dies sind die Lamina, die Medulla, die Lobula und die Lobulaplatte. Jedes einzelne besteht aus Kolumnen, die denselben Satz von Nervenzellen enthalten. In der Lamina formen Axonbündel von sechs Photorezeptoren R1-6, die auf denselben Bildpunkt blicken, Säulen, die als Cartridges bezeichnet werden. Diese sind die funktionellen visuellen „sampling units“ und sind mit vier Typen von Interneuronen erster Ordnung assoziiert, die von R1-6 den gleichen Input erhalten: L1, L2, L3 und die Amakrinzellen (amc, mit ihrem postsynaptischen Partner T1). Diese stellen parallele Pfade dar, die auf anatomischer Ebene im Detail untersucht wurden; jedoch ist wenig über ihre funktionelle Rolle bei der Verarbeitung für das Verhalten relevanter Information bekannt, z.B. hinsichtlich der Blickstabilisierung, der visuellen Kurskontrolle oder der Fixation von Objekten. Die Verfügbarkeit einer Vielfalt von neurogenetischen Werkzeugen für die Struktur-Funktionsanalyse bei Drosophila ermöglicht es, erste Schritte in Richtung einer genetischen Zerlegung des visuellen Netzwerks zu unternehmen, das Bewegungs- und Positionssehen vermittelt. In diesem Zusammenhang erwies sich die Wahl des Effektors als entscheidend. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass das clostridiale Tetanus-Neurotoxin die Photorezeptorsynapsen adulter Drosophila Fliegen nicht blockiert, hingegen irreversible Schäden bei Expression während deren Entwicklung verursacht. Aus diesem Grund wurde das dominant-negative shibire Allel shits1, welches sich als geeigneter erwies, zur Blockierung der Lamina Interneurone verwendet, um die Notwendigkeit der jeweiligen Pfade zu analysieren. Um festzustellen, ob letztere auch hinreichend für das gleiche Verhalten waren, wurde für die umgekehrte Strategie die Tatsache ausgenutzt, daß die Lamina Interneurone Histaminrezeptoren exprimieren, die vom ort Gen kodiert werden. Die spezifische Rettung der ort Funktion in definierten Pfaden im mutanten Hintergrund ermöglichte festzustellen, ob sie für eine bestimmte Funktion hinreichend waren. Diese neurogenetischen Methoden wurden mit der optomotorischen Reaktion und dem objektinduzierten Orientierungsverhalten als Verhaltensmaß kombiniert, um folgende Fragen innerhalb dieser Doktorarbeit zu beantworten: (a) Welche Pfade stellen einen Eingang in elementare Bewegungsdetektoren dar und sind notwendig und/oder hinreichend für die Detektion gerichteter Bewegung? (b) Gibt es Pfade, die spezifisch Reaktionen auf unidirektionale Bewegung vermitteln? (c) Welche Pfade sind notwendig und/oder hinreichend für das objektinduzierte Orientierungsverhalten? Einige grundlegende Eigenschaften des visuellen Netzwerks konnten dabei aufgedeckt werden: Die zwei zentralen Cartridge Pfade, die von den großen Monopolarzellen L1 und L2 repräsentiert werden, haben eine Schlüsselfunktion bei der Bewegungsdetektion. Über ein breites Spektrum von Reizbedingungen hinweg sind die beiden Subsysteme redundant und können Bewegung unabhängig voneinander verarbeiten. Um eine Beeinträchtigung des Systems festzustellen, wenn nur einer der beiden Pfade intakt ist, muß dieses an die Grenzen seiner Leistungsfähigkeit gebracht werden. Bei niedrigem Signal/Rauschverhältnis, d.h. bei geringem Musterkontrast oder geringer Hintergrundbeleuchtung, hat der L2 Pfad eine höhere Sensitivität. Bei mittlerem Musterkontrast sind beide Pfade auf die Verarbeitung unidirektionaler Bewegung in entgegengesetzten Reizrichtungen spezialisiert. Im Gegensatz dazu sind weder der L3, noch der amc/T1 Pfad notwendig oder hinreichend für die Detektion von Bewegungen. Während der erstere Positionsinformation für Orientierungsverhalten zu verarbeiten scheint, nimmt der letztere eine modulatorische Rolle bei mittlerem Kontrast ein. Es stellte sich heraus, daß das Orientierungsverhalten noch robuster als das Bewegungssehen ist und möglicherweise auf einem weniger komplizierten Mechanismus beruht, da dieser keinen nichtlinearen Vergleich der Signale benachbarter visueller „sampling units“ benötigt. Die Fixation von Objekten setzt nicht grundsätzlich das Bewegungssehen voraus, allerdings verbessert die Detektion von Bewegung die Fixation von Landmarken, im besonderen, wenn diese schmal sind oder einen geringen Kontrast aufweisen. N2 - Vertebrate and invertebrate visual systems exhibit similarities in early stages of visual processing. For instance, in the human brain, the modalities of color, form and motion are separately processed in parallel neuronal pathways. This basic property is also found in the fly Drosophila melanogaster which has a similar division in color- sensitive and (color blind) motion-sensitive pathways that are determined by two distinct subsets of photoreceptors (the R1-6 and the R7/8 system, respectively). Flies have a highly organized visual system that is characterized by its repetitive, retinotopic organization of four neuropils: the lamina, the medulla, the lobula and the lobula plate. Each of these consists of columns which contain the same set of neurons. In the lamina, axon bundles of six photoreceptors R1-6 that are directed towards the same point in space form columnar structures called cartridges. These are the visual sampling units and are associated with four types of first-order interneuron that receive common input from R1-6: L1, L2, L3 and the amacrine cells (amc, together with their postsynaptic partner T1). They constitute parallel pathways that have been studied in detail at the anatomical level. Little is known, however, about their functional role in processing behaviorally relevant information, e.g. for gaze stabilization, visual course control or the fixation of objects. The availability of a variety of neurogenetic tools for structure-function analysis in Drosophila allowed first steps into the genetic dissection of the neuronal circuitry mediating motion and position detection. In this respect, the choice of the effector turned out to be crucial. Surprisingly, it was found that the clostridial tetanus neurotoxin failed to block mature Drosophila photoreceptor synapses, but caused irreversible damage when expressed during their development. Therefore, the dominant-negative shibire allele shits1 which turned out to be better suited was used for blocking lamina interneurons and thereby analyzing the necessity of the respective pathways. To determine whether the latter were also sufficient for the same behavioral task, the inverse strategy was developed, based on the fact that lamina interneurons express histamine receptors encoded by the ort gene. The specific rescue of ort function in defined channels in an otherwise mutant background allowed studying their sufficiency in a given task. Combining these neurogenetic methods with the optomotor response and object induced orientation behavior as behavioral measures, the aim of the present thesis was to answer the following questions: (a) Which pathways feed into elementary motion detectors and which ones are necessary and/or sufficient for the detection of directional motion? (b) Do pathways exist which specifically mediate responses to unidirectional motion? (c) Which pathways are necessary and/or sufficient for object induced orientation behavior? Some basic properties of the visual circuitry were revealed: The two central cartridge pathways, represented by the large monopolar cells L1 and L2, are key players in motion detection. Under a broad range of stimulatory conditions, the two subsystems are redundant and are able to process motion independently of each other. To detect an impairment when only one of the pathways is intact, one has to drive the system to its operational limits. At low signal to noise ratios, i.e. at low pattern contrast or low background illumination, the L2 pathway has a higher sensitivity. At intermediate pattern contrast, both pathways are specialized in mediating responses to unidirectional motion of opposite stimulus direction. In contrast, neither the L3, nor the amc/T1 pathway is necessary or sufficient for motion detection. While the former may provide position information for orientation, the latter has a modulatory role at intermediate pattern contrast. Orientation behavior turned out to be even more robust than motion vision and may utilize a less sophisticated mechanism, as it does not require a nonlinear comparison of signals from neighboring visual sampling units. The position of objects is processed in several redundant pathways, involving both receptor subsystems. The fixation of objects does not generally require motion vision. However, motion detection improves the fixation of landmarks, especially when these are narrow or have a reduced contrast. KW - Genetik KW - Neurogenetik KW - Visuelles System KW - Bewegungssehen KW - Taufliege KW - Lamina KW - visual system KW - peripheral pathways KW - motion vision KW - elementary motion detector KW - optomotor response Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25980 ER - TY - THES A1 - Fischer, Robin T1 - Generating useful tools for future studies in the center of the circadian clock – defined knockout mutants for PERIOD and TIMELESS T1 - Generierung nützlicher Instrumente für zukünftige Studien im Zentrum der Inneren Uhr - definierte knockout Mutanten für PERIOD und TIMELESS N2 - To unravel the role of single genes underlying certain biological processes, scientists often use amorphic or hypomorphic alleles. In the past, such mutants were often created by chance. Enormous approaches with many animals and massive screening effort for striking phenotypes were necessary to find a needle in the haystack. Therefore at the beginning chemical mutagens or radiation were used to induce mutations in the genome. Later P-element insertions and inaccurate jump-outs enabled the advantage of potential larger deletions or inversions. The mutations were characterized and subsequently kept in smaller populations in the laboratories. Thus additional mutations with unknown background effects could accumulate. The precision of the knockout through homologous recombination and the additional advantage of being able to generate many useful rescue constructs that can be easily reintegrated into the target locus made us trying an ends-out targeting procedure of the two core clock genes period and timeless in Drosophila melanogaster. Instead of the endogenous region, a small fragment of approximately 100 base pairs remains including an attP-site that can be used as integration site for in vitro created rescue constructs. After a successful ends-out targeting procedure, the locus will be restored with e.g. flies expressing the endogenous gene under the native promoter at the original locus coupled to a fluorescence tag or expressing luciferase. We also linked this project to other research interests of our work group, like the epigenetic related ADAR-editing project of the Timeless protein, a promising newly discovered feature of time point specific timeless mRNA modification after transcription with yet unexplored consequences. The editing position within the Timeless protein is likewise interesting and not only noticed for the first time. This will render new insights into the otherwise not-satisfying investigation and quest for functional important sequences of the Timeless protein, which anyway shows less homology to other yet characterized proteins. Last but not least, we bothered with the question of the role of Shaggy on the circadian clock. The impact of an overexpression or downregulation of Shaggy on the pace of the clock is obvious and often described. The influence of Shaggy on Period and Timeless was also shown, but for the latter it is still controversially discussed. Some are talking of a Cryptochrome stabilization effect and rhythmic animals in constant light due to Shaggy overexpression, others show a decrease of Cryptochrome levels under these conditions. Also the constant light rhythmicity of the flies, as it was published, could not be repeated so far. We were able to expose the conditions behind the Cryptochrome stabilization and discuss possibilities for the phenomenon of rhythmicity under constant light due to Shaggy overexpression. N2 - Um die Rolle einzelner Gene hinter biologischen Prozessen zu entschlüsseln, bedienen sich Wissenschaftler häufig amorpher oder hypomorpher Allele. Diese wurden in der Vergangenheit oft auf Zufall basierend generiert. Gewaltige Ansätze mit zahllosen Tieren unter enormem Selektionsaufwand bei der Suche nach markanten Phänotypen waren notwendig um sprichwörtlich die Nadel im Heuhaufen zu finden. Zunächst wurden chemische Mutagene oder Strahlung verwendet um Mutationen im Genom zu induzieren. Später kamen P-element Insertionen und induziertes unpräzises Herausspringen der Transposons dazu. Das hatte den Vorteil, dass so unter Umstände größere Deletionen oder Inversionen entstanden. Die Mutationen wurden charakterisiert und die Tiere anschließend in kleinen Populationen gehalten. Dadurch konnten sich zusätzliche Mutationen mit möglichen Hintergrundeffekten unbemerkt ansammeln. Ebenso blieben weitere durchaus mögliche Mutationen aufgrund der Mutagene und dem deutlicheren Phänotyp der primären Mutation oftmals unbemerkt. Die Präzision eines Knockouts durch homologe Rekombination und der Vorteil, zusätzlich im Stande zu sein, jedes entworfene Rettungskonstrukt auf einfache Weise wieder einsetzen zu können, überzeugte uns, eine Ends-out Targeting Prozedur mit den zwei Uhr Basisgenen period und timeless in Drosophila melanogaster durchzuführen. Dabei soll ein geplanter Knockout zu einer kompletten Deletion des gesamten Bereichs durch homologe Rekombination führen. Anstelle der endogenen Region verbleibt lediglich ein kleines Fragment von ungefähr 100 Basenpaaren inklusive einer attP-Stelle, die als Insertionsstelle für in vitro hergestellte Konstrukte genutzt werden kann. Angestrebte Ziele sind beispielsweise Fliegen, die das endogene Gen unter der Kontrolle des ursprünglichen Promoters am originalen Lokus gebunden an einen Fluoreszenzmarker oder aber gekoppelt an Luziferase exprimieren. Wir koppelten dieses Projekt zusätzlich mit anderen Forschungsinteressen unserer Arbeitsgruppe, wie zum Beispiel dem epigenetischen ADAR-Editierungsprojekt des Timeless Proteins, einer vielversprechenden Neuentdeckung zeitpunktspezifischer und posttranskriptionaler Modifizierung der timeless mRNA, mit bisher noch unbekannten Folgen. Die Position der Editierung innerhalb des Timeless Proteins ist ebenfalls sehr interessant und nicht zum ersten Mal im Fokus von Wissenschaftlern. Dies wird neue Einblicke in die sonst bislang nicht zufriedenstellende Suche nach funktionell wichtigen Strukturen von Timeless bringen, welche aufgrund der geringen Homologie zu anderen bisher charakterisierten Proteinen bislang nur unzureichend bestimmt werden konnten. Zuletzt beschäftigten wir uns mit der Frage nach der Rolle von Shaggy bezüglich der inneren Uhr. Der Einfluss einer Überexpression oder Herabregulierung von Shaggy auf die Taktung der Uhr ist eindeutig und wurde schon oft beschrieben. Der Einfluss von Shaggy auf Period und Timeless wurde ebenfalls bereits gezeigt, wird jedoch im Falle des letzteren Proteins noch sehr kontrovers diskutiert. Während einige von einem Cryptochrom stabilisierenden Effekt und rhythmischen Tieren in konstanter Beleuchtung aufgrund von Shaggy Überexpression sprechen, zeigen andere einen Abfall des Cryptochromlevels unter eben genau diesen Umständen. Es war uns möglich die Umstände hinter der Cryptochromstabilisierung aufzudecken. Darüber hinaus zeigen wir mögliche Gründe für das Phänomen des Rhythmus im Dauerlicht von Shaggy Überexpressionstieren auf. KW - Biologische Uhr KW - Circadian clock KW - Period KW - Timeless KW - Genetic engineering KW - Shaggy KW - Taufliege KW - Knockout Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119141 ER - TY - THES A1 - Bausenwein, Burkhard T1 - Funktionelle Charakterisierung von Daughter of Sevenless T1 - Functional characterisation of Daughter of Sevenless N2 - Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse. N2 - One mechanism used by receptor tyrosine kinases to relay a signal to different downstream effector molecules is to use adaptor proteins that provide docking sites for a variety of proteins. The daughter of sevenless (dos) gene was isolated in a genetic screen for components acting downstream of the Sevenless (Sev) receptor tyrosine kinase. Dos contains a N-terminally located PH domain and several tyrosine residues within consensus binding sites for a number of SH2 domain containing proteins. The structural features of Dos and experiments demonstrating tyrosine phosphorylation of Dos upon Sev activation suggested that Dos belongs to the family of multisite adaptor proteins that include the Insulin Receptor Substrate (IRS) proteins, Gab1, and Gab2. In this work, a monoclonal mouse anti-Dos antibody was generated. The epitope of this antibody lies within the C-terminal 416 amino acids of the Dos Protein. Western Blot analyses of the Dos protein revealed a molecular mass of 115 kD. The staining of eye imaginal discs from wildtype third instar larvae with the monoclonal antibody showed that the Dos protein is expressed in cells in and posterior to the morphogenetic furrow. In this cells Dos localizes to the apical region. For the molecular characterisation of the homozygous lethal dosR31 allele, genomic sequence analysis were performed and the sequences compared to the dos cDNA sequence. The established amino acid sequence of the DosR31 protein showed six amino acid substitutions that potentially influence the tertiary structure of the protein. In addition, a stop codon in position 463 of the amino acid sequence was found. These results confirm that dosR31 is a loss-of-function allele which does not provide normal Dos function. To study the functional requirements of the potential SH2 domain binding sites for the Dos function in receptor tyrosine kinase mediated signaling processes, mutated dos transgenes were expressed in flies. The putative binding sites for the SH2 domains of the SH2/SH3 adaptor protein Shc, PhospholipaseC-g (PLCg), the regulatory subunit of Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3kinase) and the Corkscrew (Csw) tyrosine phosphatase were mutated by changing the invariant tyrosine within the consensus sites into phenylalanine. Ectopic expression of the mutated constructs lacking the binding sites for the Shc, PLCg, and PI3kinase SH2 domains can substitute the loss of endogenous Dos function during development. In contrast, tyrosine 801, corresponding to a Corkscrew (Csw) SH2 domain binding site, is essential for Dos function. Ectopic expression of transgenes upon heat shock induction may lead to phenotypic effects not caused by the transgene. To circumvent this problem, the endogenous dos enhancer/promotor element was cloned to study the function of the mutated transgenes expressed in a wildtype pattern. The cloned genE-dos minigene was able to fully substitute the loss of endogenous Dos function in dosR31 and dosP115 animals and shows wildtype like expression in eye imaginal discs. To study the role of the mutated SH2 domain binding sites for Dos function in eye development, a new in vivo test system based on the Flp/FRT flipase recombinase system was established. This clonal assay system allows the expression of the mutated transgenes under the control of the dos enhancer/promotor in clones of cells lacking endogenous Dos function. Expression of mutated transgenes in clones of cells lacking endogenous Dos function provided evidence that tyrosine residue Y801 that has been shown to bind a Csw SH2 domain is critical for Dos function. The tyrosine residues within the potential SH2 domain binding sites for Shc, PLCg and PI3kinase do not play an essential role for the Dos function during eye development. The established clonal test system is of general use for assaying the in vivo function of putative protein-protein interaction regions within the Dos protein for eye development irrespective of their requirement in other developmental processes. KW - Taufliege KW - Auge KW - Ontogenie KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Daughter of Sevenless KW - Multi-Adaptor-Protein KW - PH-Domäne KW - SH2-Domänen Bindungsstelle KW - Rezeptor-Tyrosin-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Daughter of Sevenless KW - multi-adaptor-protein KW - PH-domain KW - SH2-domain binding site KW - receptor tyrosin kinase KW - signal transduction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-814 ER - TY - THES A1 - Hampel, Stefanie T1 - Funktionelle Analyse des Einflusses von putativen T-Beta-H-positiven Neuronen auf das ethanolinduzierte Verhalten von Drosophila melanogaster T1 - Functional analysis of putative TbH neurons involved in ethanol induced behavior of Drosophila melanogaster N2 - Es sollten neuronale Netzwerke in Drosophila melanogaster identifiziert werden, die in die Entwicklung von ethanolinduziertem Verhalten involviert sind. Mittels der Tyramin-beta-Hydroxylase (TbH) wird der letzte Schritt der Biosynthese von Oktopamin aus Tyramin gewährleistet. TbHM18 Mutanten entwickeln eine reduzierte Ethanoltoleranz und haben keine nachweisbaren Oktopamin Konzentrationen (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). Die molekulargenetische Ursache dieser Mutante wurde näher untersucht. Wahrscheinlich ist die Deletion von einem Teil des Intron 1, des Exon 2 und einem Teil des Intron 2 des TbH-Gens verantwortlich für den Verlust der Tyramin-beta-Hydroxylase. Die Deletion der kodierenden Sequenz führt jedoch nicht zu einem Leserasterschub in der Aminosäuresequenz. Demzufolge könnte ein verkürztes Protein hergestellt werden. Ferner gibt es zwei Transkripte des TbH-Gens, woraus eventuell zwei Proteine exprimiert werden könnten. Ein Protein wäre die Tyramin-beta-Hydroxylase und das andere könnte eine Dopamin-beta-Hydroxylase sein. Um möglicherweise spezifische putative Subsets von TH-positiven Neuronen zu markieren, wurden verschiedene GAL4-Treiberlinien mit Hilfe unterschiedlicher Fragmente der Promoterregion des TbH-Gens hergestellt. Mittels des GAL4/UAS Systems konnte die Neurotransmitterausschüttung in putativen TbH-positiven Neuronen der TbH-GAL4-Linien inhibiert werden. Auf diese Weise sollte die Funktion der putativen TbH-positiven Neurone während der Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz untersucht werden. Das Transgen Tetanustoxin wurde mit der 1.3TbH-GAL4 Treiberlinie in einem bestimmten Set von Neuronen exprimiert. Die Inhibition der Synaptobrevin-abhängigen Neurotransmission in den 1.3TH-GAL4-positiven Neuronen beeinflusst nicht das ethanolinduzierte Verhalten. Hingegen das Ausschalten der Erregbarkeit der Zellen mit Hilfe eines UAS-Kir2.1 Transgens resultiert in erhöhter Resistenz gegenüber Ethanol. Das heißt, dass Synaptobrevin-unabhängige zelluläre Mechanismen der Zellen notwendig sind, um ethanolinduziertes Verhalten zu regulieren. Die 1.3TbH-GAL4-Linie exprimiert in einem sehr spezifischen Subset von Neuronen GAL4, bzw. Effektoren. Insgesamt werden ≈ 10 Zellen detektiert. Davon liegen die Somata zweier Neurone caudal und projizieren in die Region der ersten und vierten Bande des Fächerförmigen Körpers. Weitere kleine Ansammlungen von acht Zellen können um den Ösophagus und im Bereich des Subösophagialganglion verzeichnet werden. Die mit GFP markierten Neurone exprimieren wahrscheinlich kein Oktopamin. Ferner resultierte die Inhibition der synaptischen Transmission von 6.2TbH-GAL4-positiven Neuronen, mit Hilfe von Tetanustoxin, in einer erhöhten Ethanolsensitivität. Ebenfalls zu einer ethanolinduzierten Verhaltensänderung führt die Inaktivierung der 6.2TbH-GAL4 Zellen mittels eines UAS-Kir2.1 Transgens. Dabei entwickeln die Fliegen eine erhöhte Ethanolresistenz. Somit wäre möglich, dass die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Resistenz über verschiedene zelluläre Mechanismen reguliert werden. Die 6.2TbH-GAL4-Linie ermöglicht die Transgen-Expression in 65-70 Neuronen. Diese innerverieren u.a. das Subösophagialganglion, den Ösophagus, den Ellipsoid Körper, das laterale und das dorso-laterale Protocerebrum. Fünf der Neurone, die sich durch die 6.2TbH-GAL4 Treiberlinie markieren lassen, exprimieren Oktopamin. Dazu gehört ein VUM-Neuron und vier große caudale Zellen. Eine weitere putativ oktopaminerge GAL4-Linie Tdc2-GAL4 wurde mit der UAS-Kir2.1 Effektorlinie gekreuzt und die Nachkommen im Inebriometer gemessen. Bei Inaktivierung der Erregbarkeit der Tdc2-positiven Neurone resultiert dies in einer erhöhten Ethanolsensitivität, hingegen in keiner Veränderung der Toleranz. Die reduzierten Levels an Oktopamin spielen dabei wahrscheinlich eine Rolle. Hingegen regulieren eventuelle neurosekretorische Zellen über andere Mechanismen die Ethanolresistenz, wie die 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 Fliegen zeigen. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Neuronencluster für verschiedene ethanolinduzierte Verhaltensantworten verantwortlich sind. Da wahrscheinlich neurosekretorische Zellen des PI die Ethanolresistenz beeinflussen (RODAN et al. 2002), hingegen den Zentralkomplex-innervierende Zellen eher für die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz notwendig sind (URIZAR et al. 2007). N2 - We wanted to identify neuronal networks in Drosophila melanogaster that are involved in the development of ethanol sensitivity and/or tolerance. The tyramine-beta-hydroxylase (TbH) catalyzes the last step in the biosynthesis of tyramine into octopamine. The TbHM18 mutant develdops a reduced ethanol tolerance, because they have no concentrations of octopamine in their bodies (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). We investigated the molecular reason of the mutant. Probably the deletion of a part of intron 1, exon 2 and a part of intron 2 of the TbH gene is responsible for the loss of the tyramine-beta-hydroxylase. The deletion of the coding sequence does not result in a frame shift of the aminoacid sequence and because of this a truncated protein could be expressed. Further there are two transcripts of the TbH gene, from that two proteins could be expressed. One protein could be the tyramine-beta-hydroxylase and the other, a dopamine-beta-hydroxylase. For possibly marking specific putative subsets of TbH-positive neurons, different GAL4 driver lines were generated with different promoter fragments out of the TbH gene. Via the GAL4/UAS system the neurotransmitter release could be inhibited in putative TbH-positive neurons. In this manner the function of the putative TbH-positive neurons should be analyzed during the development of ethanol sensitivity and tolerance. The transgene tetanustoxin was expressed in a specific subset of 1.3TbH-GAL4 positive neurons. The ethanol induced behaviour is not influenced by inhibition of synaptobrevin-dependent neurotransmission in 1.3TbH-GAL4 positive neurons. Blocking the excitability of cells by using a UAS-Kir2.1 transgene results in increased ethanol resistence. That means that synaptobrevin-independent cellular mechanisms of cells are necessary for regulating ethanol induced behaviour. The 1.3TbH-GAL4 line expresses GAL4 in a very specific subset of neurons as well as effectors. All in all about 10 cells can be detected. Two somata of these cells are located caudal which project to the first and fourth layer of the fanshaped body. Eight more cells are localized frontal around the esophagus and in the subesophagial region. Probably the GFP-marked neurons do not express octopamine. Furthermore the inhibition of synaptic transmission with tetanustoxin of 6.2TbH-GAL4 positive neurons results in an increased ethanol sensitivity. Also the inactivation of 6.2TbH-GAL4 cells with an UAS-Kir2.1 transgene leads to an ethanol-induced change of behaviour and there the flies develop an increased ethanol resistence. It could be possible that the development of ethanol sensitivity and tolerance is regulated by different cellular mechanisms. The 6.2TbH-GAL4 line enables transgene expression in 65-70 neurons. These are innervating for example the SOG, esophagus, ellipsoid body, lateral and the dorsolateral protocerebrum. Five of these 6.2TbH-GAL4 driven neurons express octopamine, which include four big caudal cells and probably one VUM-neuron. An additional putative octopaminergic GAL4-line, the Tdc2-GAL4 line was crossed to the UAS-Kir2.1 effector line and the offspring measured for ethanol sensitivity and tolerance in the inebriometer. Inactivation of the excitability of the Tdc2-positive neurons results in an increased ethanol sensitivity, but on the other hand to no change of ethanol tolerance. The reduced octopamine levels do probably play a role in this. However the potential neurosecretory cells regulate the ethanol resistence by different mechanisms, like 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 flies show. The inhibition of neurotransmission with three other TbH-GAL4 lines (600TbH-GAL4, 4.6TbH-GAL4, 6.6TbH-GAL4) show no divergence of ethanol-induced behaviour compared to wildtype flies. There, the specific expression pattern of 600TbH-GAL4 line includes five cells in the pars intercerebralis and a brain surrounding glia layer. Further the 6.6TbH-GAL4 line enables expression of effector genes in eight cells and in a surrounding layer of the brain as well. The expression of 600TbH-GAL4 line and 6.6TbH-GAL4 line do not overlap with the octopaminergic expression pattern of our colocalization studies. The expression of UAS- effector genes driven by 4.6TbH-GAL4 line can be provided in approxymatly 67 neurons of the adult brain. With this GAL4-line the structures of the ellipsoid body, antennal lobes, pars intercerebralis and a big commissur are innervated. Seven cells can be detected caudal, but the region that they are projecting to is unknown. It could be shown that different clusters of neurons are responsible for several ethanol-induced behavioural responses. Because neurosecretory cells of the pars intercerebralis seem to influence the ethanol resistance (RODAN et al. 2002), but central complex- innervating cells are necessary rather for the development of ethanol sensitivity and tolerance (URIZAR et al. 2007). KW - Taufliege KW - TbH KW - Drosophila melanogaster KW - Ethanol KW - TbH KW - Drosophila melanogaster KW - Ethanol Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25600 ER - TY - THES A1 - Chen, Jiangtian T1 - Functions of allatostatin A (AstA) and myoinhibitory peptides (MIPs) in the regulation of food intake and sleep in Drosophila T1 - Funktion der Allatostatin A (AstA) und myoinhibitorische Peptide (MIP) in Bezug zu Nahrungsaufnahme und Schlaf bei Drosophila N2 - Neuropeptides and peptide hormones carrying neural or physiological information are intercellular signalling substances. They control most if not all biological processes in vertebrates and invertebrates by acting on specific receptors on the target cell. In mammals, many different neuropeptides and peptide hormones are involved in the regulation of feeding and sleep. In \textit{Drosophila}, allatostatin A (AstA) and myoinhibitory peptides (MIPs) are brain-gut peptides. The AstA receptors are homologues of the mammalian galanin receptors and the amino acid sequences of MIPs are similar to a part of galanin, which has an orexigenic effect and is implicated in the control of sleep behaviour in mammals. I am interested in dissecting pleiotropic functions of AstA and MIPs in the regulation of food intake and sleep in \textit{Drosophila}. \par In the first part of the dissertation the roles of brain-gut peptide allatostatin A are analysed. Due to the genetic and molecular tools available, the fruit fly \textit{Drosophila melanogaster} is chosen to investigate functions of AstA. The aims in this part are to identify pleiotropic functions of AstA and assign specific effects to the activity of certain subsets of AstA expressing cells in \textit{Drosophila} adults. A new and restricted \textit{AstA\textsuperscript{34}-Gal4} line was generated. The confocal imaging result showed that AstA neurons are located in the posterior lateral protocerebrum (PLP), the gnathal ganglia (GNG), the medullae, and thoracic-abdominal ganglion (TAG). AstA producing DLAa neurons in the TAG innervate hindgut and the poterior part of midgut. In addition, AstA are detected in the enteroendocrine cells (EECs).\par Thermogenetic activation and neurogenetic silencing tools with the aid of the \textit{UAS/Gal4} system were employed to manipulate the activity of all or individual subsets of AstA cells and investigate the effects on food intake, locomotor activity and sleep. Our experimental results showed that thermogenetic activation of two pairs of PLP neurons and/or AstA expressing EECs reduced food intake, which can be traced to AstA signalling by using \textit{AstA} mutants. In the locomotor activity, thermogenetic activation of two pairs of PLP neurons and/or AstA expressing EECs resulted in strongly inhibited locomotor activity and promoted sleep without sexual difference, which was most apparent during the morning and evening activity peaks. The experimental and control flies were not impaired in climbing ability. In contrast, conditional silencing of the PLP neurons and/or AstA expressing EECs reduced sleep specifically in the siesta. The arousal experiment was employed to test for the sleep intensity. Thermogenetically activated flies walked significantly slower and a shorter distance than controls for all arousal stimulus intensities. Furthermore, PDF receptor was detected in the PLP neurons and the PLP neurons reacted with an intracellular increase of cAMP upon PDF, only when PDF receptor was present. Constitutive activation of AstA cells by tethered PDF increased sleep and thermogenetic activation of the PDF producing sLNvs promoted sleep specifically in the morning and evening. \par The study shows that the PLP neurons and/or EECs vis AstA signalling subserve an anorexigenic and sleep-regulating function in \textit{Drosophila}. The PLP neurons arborise in the posterior superior protocerebrum, where the sleep relevant dopaminergic neurons are located, and EECs extend themselves to reach the gut lumen. Thus, the PLP neurons are well positioned to regulate sleep and EECs potentially modulate feeding and possibly locomotor activity and sleep during sending the nutritional information from the gut to the brain. The results of imaging, activation of the PDF signalling pathway by tethered PDF and thermoactivation of PDF expressing sLNvs suggest that the PLP neurons are modulated by PDF from sLNv clock neurons and AstA in PLP neurons is the downstream target of the central clock to modulate locomotor activity and sleep. AstA receptors are homologues of galanin receptors and both of them are involved in the regulation of feeding and sleep, which appears to be conserved in evolutionary aspect.\par In the second part of the dissertation, I analysed the role of myoinhibitory peptides. MIPs are brain-gut peptides in insects and polychaeta. Also in \textit{Drosophila}, MIPs are expressed in the CNS and EECs in the gut. Previous studies have demonstrated the functions of MIPs in the regulation of food intake, gut motility and ecdysis in moths and crickets. Yet, the functions of MIPs in the fruit fly are little known. To dissect effects of MIPs regarding feeding, locomotor activity and sleep in \textit{Drosophila melanogater}, I manipulated the activity of MIP\textsuperscript{WÜ} cells by using newly generated \textit{Mip\textsuperscript{WÜ}-Gal4} lines. Thermogenetical activation or genetical silencing of MIP\textsuperscript{WÜ} celles did not affect feeding behaviour and resulted in changes in the sleep status. \par My results are in contradiction to a recent research of Min Soohong and colleagues who demonstrated a role of MIPs in the regulation of food intake and body weight in \textit{Drosophila}. They showed that constitutive silencing of MIP\textsuperscript{KR} cells increased food intake and body weight, whereas thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells decreased food intake and body weight by using \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4} driver. Then I repeated the experiments with the \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4} driver, but could not reproduce the results. Interestingly, I just observed the opposite phenotype. When MIP\textsuperscript{KR} cells were silenced by expressing UAS-tetanus toxin (\textit{UAS-TNT}), the \textit{Mip\textsuperscript{KR}$>$TNT} flies showed reduced food intake. The thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells did not affect food intake. Furthermore, I observed that the thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells strongly reduced the sleep duration.\par In the third part of the dissertation, I adapted and improved a method for metabolic labelling for \textit{Drosophila} peptides to quantify the relative amount of peptides and the released peptides by mass spectrometry under different physiological and behavioural conditions. qRT-PCR is a practical technique to measure the transcription and the corresponding mRNA level of a given peptide. However, this is not the only way to measure the translation and production of peptides. Although the amount of peptides can be quantified by mass spectrometry, it is not possible to distinguish between peptides stored in vesicles and released peptides in CNS extracts. I construct an approach to assess the released peptides, which can be calculated by comparing the relative amount of peptides between two timepoints in combination with the mRNA levels which can be used as semiquantitative proxy reflecting the production of peptides during this period. \par After optimizing the protocol for metabolic labelling, I carried out a quantitative analysis of peptides before and after eclosion as a test. I was able to show that the EH- and SIFa-related peptides were strongly reduced after eclosion. This is in line with the known function and release of EH during eclosion. Since this test was positive, I next used the metabolic labelling in \textit{Drosophila} adult, which were either fed \textit{ad libitum} or starved for 24 hrs, and analysed the effects on the amount of AstA and MIPs. In the mRNA level, my results showed that in the brain \textit{AstA} mRNA level in the 24 hrs starved flies was increased compared to in the \textit{ad libitum} fed flies, whereas in the gut the \textit{AstA} mRNA level was decreased. Starvation induced the reduction of \textit{Mip} mRNA level in the brain and gut. Unfortunately, due to technical problems I was unable to analyse the metabolic labelled peptides during the course of this thesis.\par N2 - Neuropeptide und Peptidhormone sind interzelluläre Botenstoffe, die neuronale und physiologische Informationen tragen. Sie kontrollieren die meisten - wenn nicht alle - biologische Prozesse in Wirbeltieren und Wirbellosen durch ihre Wirkung auf spezifische Rezeptoren an den Zielzellen. So sind bei Säugetieren z.B. viele unterschiedliche Neuropeptide an der Regulierung des Freßverhaltens und des Schlafs beteiligt. In \textit{Drosophila} sind Allatostatin A (AstA) und myoinhibitorische Peptide (MIP) typische Gehirn-Darm- Peptide. Die AstA-Rezeptoren sind Homologe des Galanin-Rezeptors der Wirbeltiere, und die Aminosäurensequenz von MIP sind ähnlich zu einer Teilsequenz von Galanin, welches einen orexigenischen Effekt hat und mit der Kontrolle des Schlafverhaltens in Säugetieren verbunden ist. Ich bin interessiert an der Identifierung möglicher pleiotroper Funktionen von AstA und MIP in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Schlaf in \textit{Drosophila}. \par Im ersten Teil der Dissertation wird die Rolle der Hirn-Darm- Peptide der AstA-Familie analysiert. Aufgrund der verfügbaren genetischen und molekularen Werkzeuge wurde die Taufliege \textit{Drosophila melanogaster} als Modell ausgewählt, um die Funktionen von AstA zu erforschen. Der Fokus lag dabei darauf, die pleiotropen Funktionen von AstA zu identifizieren, und herauszufinden, ob den verschiedenen AstA-exprimierenden Zelltypen jeweils unterschiedliche Funktionen zukommen. Eine neue, eingeschränkte AstA-Gal4-Linie wurde generiert. AstA-exprimierende Neuronen lassen sich im posterio-lateralen Protocerebrum (PLP), dem Gnathalganglion (GNG), der Medulla und dem thorakal-abdominalen Ganglion(TAG) finden. DLAa-Neuronen im TAG innervieren den Enddarm und den vorderen Teil des Mitteldarms. Ausserdem wird AstA auch in enteroendokrinen Zellen (EEC) im Mitteldarm exprimiert.\par Thermogenetische Aktivierung und neurogenetische Stillegung wurden zusammen mithilfe des UAS/Gal4-Systems eingesetzt, um die Aktivität vieler oder einzelner Untergruppen von AstA-Zellen zu manipulieren und die Effekte auf Nahrungsaufnahme, Laufaktivität und Schlaf zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die thermogenetische Aktivierung der zwei Paare von PLP-Neuronen und/oder AstA-exprimierenden EEC Schlaf und Nahrungsaufnahme reduziert, was auf die signalisierende Funktion von AstA zurückzuführen ist. In der Laufaktivität führte die thermogenetische Aktivierung der zwei Paare von PLP-Neuronen und/oder AstA-exprimierende EEC zu starker Hemmung, und förderte Schlaf ohne geschlechtsspezifischen Unterschied, was während der Aktivitätsgipfel am Morgen und Abend am besten zu beobachten war. Die Experimental- sowie die Kontrollfliegen waren im generellen Klettervermögen nicht beeinträchtigt. In Kontrast dazu reduzierte eine konditionale Stillegung von PLP-Neuronen und allen \textit{AstA-Gal4} exprimierenden Neuronen besonders den Siesta-Schlaf. Fliegen mit thermogenetisch aktivierten AstA-Zellen liefen wesentlich langsamer und weniger als die Kontrollgruppe bei allen Erregungsintensitäten. Außerdem wurde der PDF-Rezeptor in den PLP-Neuronen ermittelt. Die PLP-Neuronen reagierten auf PDF-Gabe mit einem intrazellulären Anstieg von cAMP nur dann, wenn der PDF-Rezeptor anwesend war. Konstitutive Aktivierung von AstA-Zellen durch "tethered" PDF steigerte den Schlaf, und thermogenetische Aktivierung von PDF-produzierenden sLNvs förderte Schlaf besonders am Morgen und Abend.\par Die Studie zeigt, dass die PLP-Neuronen und/oder EECs via AstA eine anorexigenische und schlafregulierende Funktion in \text{Drosophila} ausübt. PLP-Neuronen verzweigen im posterio-superioren Protocerebrum, wo die für Schlaf relevanten dopaminergen Neurone lokalisiert sind. Die EECs erstrecken sich bis zum Darmlumen. Daher sind die PLP-Neuronen gut positioniert, um Schlaf zu regulieren, und EECs modulieren potenziell die Verdauung und möglicherweise auch Laufaktivität und Schlaf durch Vermittlung der Nahrungsinformationen vom Darm zum Gehirn. Die Ergebnisse von Imaging, Aktivierung des PDF-wegs durch "tethered" PDF und Thermoaktivierung von PDF-exprimierenden s-LNvs weisen darauf hin, dass die PLP-Neuronen durch PDF aus sLNv-Uhr-Neuronen moduliert werden. AstA in den PLP-Neuronen scheint ein indirektes Ausgangssignal der inneren Uhr das die Laufaktivität und Schlaf modelliert. Die AstA-Rezeptoren sind Homologe der Galanin-Rezeptoren; beide sind an der Regulierung von Ernährung und Schlaf beteiligt, was auf eine evolutionär bewahrte Funktion hindeutet. \par Im zweiten Teil der Dissertation habe ich die Rolle der MIP analysiert. MIP sind Hirn-Darm- Peptide der Insekten und Polychaeta. Auch in \textit{Drosophila} wird MIP durch Neurone im ZNS und durch EEC im Darm exprimiert. Bisherige Studien haben Funktionen von MIP bei der Nahrungsaufnahme, Regulation der Darmbewegung und Häutung in Motten und Grillen demonstriert. Für \textit{Drosophila} waren Funktionen von MIP nicht bekannt. Um mögliche Effekte von MIP bezüglich des Freßverhaltens, Laufaktivität und und Schlaf in \textit{Drosophila melanogaster} zu finden, habe ich die Aktivität von MIP\textsuperscript{WÜ}-Zellen mit Hilfe der neu in unserem Labor hergestellten \textit{Mip\textsuperscript{WÜ} -Gal4}-Linien manipuliert. Dabei konnte ich keinen Effekt auf das Freßverhalten finden, nachdem ich die MIP\textsuperscript{WÜ}–Zellen thermogenetisch aktiviert oder genetisch stillgelegt habe. Allerdings führte dies zu Änderungen des Schlafstatuses. \par Meine Ergebnisse stehen im Widerspruch zu einer neueren Veröffentlichung von Min Soohong und Kollegen, die eine Rolle der MIP in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht von \textit{Drosophila} nachweisen konnten. Sie zeigten dass konstitutive Stillegung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen Nahrungsaufnahme und Körpergewicht steigerte, während thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen Nahrungsaufnahme und Körpergewicht durch \textit{MIP\textsuperscript{KR}-Gal4}-Treiber verringerte. Ich habe daraufhin die Versuche mit der von Soohong eingesetzen \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4}-Treiber wiederholt, konnte aber damit die Ergebnisse nicht bestätigen. Interessanterweise habe ich genau das Gegenteil beobachtet. Wenn ich MIP\textsuperscript{KR}-Zellen durch Expresseion von UAS-Tetanustoxin (UAS-TNT) ausgeschaltet habe, zeigten die \textit{Mip\textsuperscript{KR}$>$TNT}-Fliegen eine reduzierte Nahrungsaufnahme. Eine thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen hat die Nahrungsaufnahme nicht beeinflusst. Weiterhin habe ich beobachtet, dass die thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen die Schlafdauer stark reduziert.\par Im dritten Teil der Dissertation haben ich eine Methode zur metabolischen Markierung für \textit{Drosophila}-Peptide adaptiert und verbessert, um die relative Menge von Peptiden und die Peptidausschüttung mittels Massenspektrometrie unter verschiedenen physiologischen Bedingungen und Verhaltenskontexten zu quantifizieren. qRT-PCR ist eine praktische Technik um die Transkription und die entsprechende mRNA-Menge für ein gegebenes Peptid zu messen. Dies ist allerdings kein zwingendes Maß für die Translation und Menge eines Peptids. Massenspektrometisch kann die Peptidmenge zwar quantifiziert werden, es kann aber nicht zwischen in Vesikel gespeicherten Peptiden und ausgeschütteten Peptiden in ZNS-Extrakten unterschieden werden. Ich habe nach einem Zugang zu den ausgeschütteten Peptiden gesucht, die durch Vergleich der relativen Menge der Peptide zwischen zwei Zeitpunkten kalkuliert werden können, wenn die mRNA-Menge, welche ein semiquantitatives Proxy der Produktion der Peptide in dieser Periode darstellt, bekannt ist. \par Nachdem ich das Protokoll für die metabolische Markierung optimiert hatte, habe ich als Test eine quantitative Peptidomanalyse vor und nach dem Adultschlupf durchgeführt. Dabei konnte ich zeigen, dass die EH- und SIFa-relatierte Peptide nach dem Schlupf stark reduziert sind. Dies passt gut überein mit der bekannten Funktion und Freisetzung von EH während des Schlupfs. Da dieser Test positiv war, habe ich dann als nächsten Schritt die metabolische Markierung in adulten \textit{Drosophila} eingesetzt, die für 24h entweder \textit{ad libitum} gefüttert oder gehungert wurden, und geschaut, wie sich dies auf die Menge der AstA und MIP auswirkt. Meine Ergebnisse zeigten, dass das \textit{AstA} mRNA-Niveau im Gehirn der Fliegen, die 24 Stunden gehungert haben im Vergleich zu \textit{ad libitum} gefütterten Fliegen steigt, während das \textit{AstA} mRNA-Niveau im Darm sank. Hunger führte zur Reduzierung des \textit{Mip} mRNA-Spiegels in Gehirn und Darm. Wegen technischer Probleme konnte ich die metabolisch markierten Peptide während meiner Forschungsphase leider nicht mehr analysieren. \par KW - AstA KW - MIPs KW - Nahrungsaufnahme KW - Schlaf KW - Taufliege KW - Peptide KW - Drosophila Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156838 ER - TY - THES A1 - Roth, Martin T1 - Functional and developmental characterisation of matrix binding sites in decapentaplegic T1 - Funktionelle und entwicklungsspezifische Charakterisierung von Matrix-Bindungsstellen von decapentaplegic N2 - In the last years it became evident that many cytokines do not only bind to their specific cell surface receptors but also interact with components of the extracellular matrix. Mainly in Drosophila, several enzymes were identified, that are involved in glycosaminoglycan synthesis. Mutations in these enzymes mostly result in disturbances of several signaling pathways like hedgehog, wingless, FGF or dpp. In most cases it was, due to these pleiotropic effects, not possible to examine the relevance of matrix interactions for single pathways. The aim of this work was to examine the relevance of matrix interactions for the TGF-ß superfamily member DPP. Based on the fact that DPP is highly homologous to human BMP-2, the basic N-terminus of mature DPP was mutated, which has been shown to contain a heparin-binding site in BMP-2. Thus, a wildtype variant (D-MYC), a deletion variant (D-DEL), which lacked the whole basic part of the N-terminus and a duplication variant (D-DUP), which contained a second copy of the basic core moitiv, were generated. In order to characterise the variants biochemically, they were expressed in E.coli and refolded in a bioactive form. In chicken limbbud assay, the deletion variant was much more active than the wildtype variant, comparable to data of BMP-2. By means of biacore mesurements with the immobilised ectodomain of the high affinity type I receptor thick veins, it could be demonstrated, that the variants differ only in matrix binding and not in their receptor affinity. Different matrix binding was shown by Heparin FPLC. The biological relevance of the matrix interaction of DPP was examined in transgenic flies. To allow expression of the different variants under the control of various Gal4 driver lines, they were cloned behind an UAS-promoter site. In early tracheal development, a strong dependence of DPP signaling on matrix binding was observed. While ectopic expression of the deletion variant caused only minor defects, the branching pattern was strongly disturbed by overexpression of wildtype and duplication variant. Ubiquitous expression of the variants in the wing imaginal disc caused overproliferation of the disc and expansion of the omb target gene expression. The extent of phenotypes correlated with the matrix binding ability of the variants. Corresponding disturbances of the wing vein pattern was observed in adult flies. By the crossing of different dpp allels, transheterozygous animals were created, that lack dpp only in imaginal discs. Expression of the variants under the control of a suitable dpp-Gal4 driver line revealed insights into the biological relevance of matrix binding on DPP gradient formation and specific target gene activation in wing imaginal discs. It was shown, that all variants were able to generate a functional DPP gradient with correct expression of the target genes omb and spalt. Again a correlation between extent of target gene domains and matrix binding ability of the corresponding variants was found. Thus by mutating the N-terminus of DPP, it could be shown that this is responsible for DPP`s matrix interaction. Also the relevance of matrix binding of DPP in different tissues was examined. It turned out, that the reorganisation of tracheal branching by DPP strongly depends on matrix interactions wheras the establishing of a gradient in wing imaginal discs depends only gradually on matrix interactions. Based on these data a model for the action of DPP/TGFßs as morphogens was established. While a deletion of matrix binding leads to a decrease in specific bioactivity of the cytokine, the latter is increased by additional matrix binding sites. N2 - In den letzten Jahren wurde deutlich, daß viele Zytokine nicht nur mit ihren spezifischen Zelloberflächen-Rezeptoren interagieren, sondern auch Affinität zu Komponenten der Extrazellulären Matrix zeigen. Vor allem in Drosophila konnten viele Enzyme zur Synthese von Glukosaminoglykanen identifiziert werden. Mutationen in diesen Enzymen führen in der Regel zu Störungen verschiedener Signalwege, wie z.B. hedgehog, wingless, FGF oder dpp. Aufgrund dieser pleiotropen Effekte, war es meist nicht möglich, die Bedeutung der Matrix-Interaktionen für bestimmte Zytokine zu untersuchen. In dieser Arbeit sollte die Bedeutung der Matrix-Interaktion für das TGF-ß-Superfamilienmitglied DPP unter-sucht werden. Ausgehend von der hohen Homologie zwischen humanem BMP-2 und DPP wurde der basische N-Terminus von DPP, der im BMP-2 für die Heparininteraktion verantwortlich ist, verändert. Es wurde neben einer Wildtypvariante (D-MYC) eine Deletionsvariante (D-DEL) generiert, die keine basischen Aminosäuren im N-Terminus aufweist, sowie eine Duplikationsvariante (D-DUP), die eine zweite Kopie des basischen Hauptmotivs im N-Terminus enthält. Zur biochemischen Charakterisierung wurden die Varianten sowie wildtypisches DPP in E.coli exprimiert und in eine bioaktive Form zurückgefaltet. Im Limbbud-Test zeigte sich vergleichbar zum BMP-2 eine stark erhöhte Aktivität der Deletionsvariante gegenüber Wildtyp-DPP. Durch Biacore-Messungen an der immobilisierten Ektodomäne des hochaffinen DPP TypI-Rezeptors Thick veins konnte gezeigt werden, daß alle Varianten gleiche Rezeptoraffinität haben und sich nur in der Matrixbindung unterscheiden. Letzteres wurde durch eine analytische FPLC mit Heparin als Matrix gezeigt. Die biologische Relevanz der Matrixbindung wurde in transgenen Fliegen untersucht. Hierbei wurden die DPP-Varianten hinter einen UAS-Promoter kloniert, um jene unter der Kontrolle verschiedener Gal4-Treiberlinien exprimieren zu können. In der frühen Tracheenentwicklung zeigte sich eine sehr starke Matrix-Abhängigkeit der DPP-Wirkung. Während ektopische Expression der Deletionsvariante fast keine Störung der Zellmigration verursachte, war das Muster der Tracheenäste bei ektopischer Expression von D-MYC als auch D-DUP massiv gestört. Ubiquitäre Expression der Varianten in der Flügelimaginalscheibe verursachte Überproliferation und eine Ausdehnung der Expressionsdomäne des omb-Genes. Die Stärke der Phänotypen korrelierte dabei mit der Matrixbindung der Varianten. Entsprechende Störungen des Venenmusters konnten in Flügeln adulter Tiere festgestellt werden. Durch Kreuzung zweier dpp-Allele konnten transheterozygote Fliegen gewonnen werden, die keine dpp-Expression in den Imaginalscheiben zeigen. Die Expression der Varianten unter Kontrolle eines geeigneten dpp-Gal4-Treibers in diesen Fliegen gab Aufschluß über die tatsächliche Relevanz der DPP-Matrix-Interaktion für die Ausbildung eines DPP-Gradienten und spezifische Aktivierung verschiedener Targetgene in der Flügelscheibe. Es wurde gezeigt, daß alle Varianten dazu in der Lage sind, einen DPP-Gradienten mit entsprechender Expression der Targetgene omb und spalt zu erzeugen. Wieder wurde eine Korrelation zwischen Ausdehnung der Targetgen-Domänen und der Matrixbindung der Varianten beobachtet. Somit konnte durch Mutation des N-Terminus des DPP-Proteins gezeigt werden, daß dieser für die Matrixinteraktion von DPP verantwortlich ist. Auch wurde Aufschluß über die Bedeutung der Matrixinteraktion an verschiedenen DPP-Wirkungsorten gewonnen. Die Abhängigkeit des DPP-Signalpotentials von der Matrixbindung differiert zwischen verschiedenen Gewebetypen. Während die Wirkung von DPP in der Restrukturierung der trachealen Migration sehr stark von einer Matrixbindung abhängt, sieht man in bei der Proliferation und Musterbildung in der Imaginalscheibe nur graduelle Effekte. Diese Daten führten zur Etablierung eines Models für den Wirkungsmechanismus von DPP/TGFß Molekülen als morphogene Faktoren. Während eine Deletion von Matrixbindung zu einem Verlust der spezifischen biologischen Aktivität führt, wird durch zusätzliche Matrixbindung eine erhöhte Aktivität erreicht. KW - Taufliege KW - Transforming Growth Factor beta KW - Extrazellulärraum KW - extrazelluläre Matrix KW - decapentaplegic KW - Drosophila KW - Glucosaminoglykane KW - extracellular matrix KW - decapentaplegic KW - Drosophila KW - glucosaminoglycans Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7542 ER - TY - THES A1 - Hartlieb, Heiko T1 - Functional analysis of Mushroom body miniature’s RGG-box and its role in neuroblast proliferation in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse der RGG-Box von Mushroom body miniature und deren Rolle in der Neuroblastenproliferation in Drosophila melanogaster N2 - Development of the central nervous system in Drosophila melanogaster relies on neural stem cells called neuroblasts. Neuroblasts divide asymmetrically to give rise to a new neuroblast as well as a small daughter cell which eventually generates neurons or glia cells. Between each division, neuroblasts have to re-grow to be able to divide again. In previous studies, it was shown that neuroblast proliferation, cell size and the number of progeny cells is negatively affected in larvae carrying a P-element induced disruption of the gene mushroom body miniature (mbm). This mbm null mutation called mbmSH1819 is homozygously lethal during pupation. It was furthermore shown that the nucleolar protein Mbm plays a role in the processing of ribosomal RNA (rRNA) as well as the translocation of ribosomal protein S6 (RpS6) in neuroblasts and that it is a transcriptional target of Myc. Therefore, it was suggested that Mbm might regulate neuroblast proliferation through a role in ribosome biogenesis. In the present study, it was attempted to further elucidate these proposed roles of Mbm and to identify the protein domains that are important for those functions. Mbm contains an arginine/glycine rich region in which a di-RG as well as a di-RGG motif could be found. Together, these two motifs were defined as Mbm’s RGG-box. RGG-boxes can be found in many proteins of different families and they can either promote or inhibit protein-RNA as well as protein-protein interactions. Therefore, Mbm’s RGG-box is a likely candidate for a domain involved in rRNA binding and RpS6 translocation. It could be shown by deletion of the RGG-box, that MbmdRGG is unable to fully rescue survivability and neuroblast cell size defects of the null mutation mbmSH1819. Furthermore, Mbm does indeed rely on its RGG-box for the binding of rRNA in vitro and in mbmdRGG as well as mbmSH1819 mutants RpS6 is partially delocalized. Mbm itself also seems to depend on the RGG-box for correct localization since MbmdRGG is partially delocalized to the nucleus. Interestingly, protein synthesis rates are increased in mbmdRGG mutants, possibly induced by an increase in TOR expression. Therefore, Mbm might possess a promoting function in TOR signaling in certain conditions, which is regulated by its RGG-box. Moreover, RGG-boxes often rely on methylation by protein arginine methyltransferases (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) to fulfill their functions. Mbm might be symmetrically dimethylated within its RGG-box, but the results are very equivocal. In any case, Dart1 and Dart5 do not seem to be capable of Mbm methylation. Additionally, Mbm contains two C2HC type zinc-finger motifs, which could be involved in rRNA binding. In an earlier study, it was shown that the mutation of the zinc-fingers, mbmZnF, does not lead to changes in neuroblast cell size, but that MbmZnF is delocalized to the cytoplasm. In the present study, mbmZnF mutants were included in most experiments. The results, however, are puzzling since mbmZnF mutant larvae exhibit an even lower viability than the mbm null mutants and MbmZnF shows stronger binding to rRNA than wild-type Mbm. This suggests an unspecific interaction of MbmZnF with either another protein, DNA or RNA, possibly leading to a dominant negative effect by disturbing other interaction partners. Therefore, it is difficult to draw conclusions about the zinc-fingers’ functions. In summary, this study provides further evidence that Mbm is involved in neuroblast proliferation as well as the regulation of ribosome biogenesis and that Mbm relies on its RGG-box to fulfill its functions. N2 - Die Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster beruht auf neuronalen Stammzellen genannt Neuroblasten. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und bringen dabei sowohl einen neuen Neuroblasten als auch eine kleinere Tochterzelle hervor, die wiederum letztlich Neuronen oder Gliazellen generiert. Zwischen jeder Zellteilung müssen die Neuroblasten wieder auf ihre ursprüngliche Größe wachsen, sodass sie zur erneuten Teilung in der Lage sind. In vorhergehenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl die Proliferation der Neuroblasten, deren Zellgröße als auch die Anzahl ihrer Tocherzellen reduziert ist in Larven, die eine P-Element-induzierte Unterbrechung des Gens mushroom body miniature (mbm) tragen. Diese mbm-Nullmutation, genannt mbmSH1819, ist homozygot letal während des Puppenstadiums. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das nucleoläre Protein Mbm eine Rolle in der Prozessierung ribosomaler RNA (rRNA), sowie der Translokation des ribosomalen Proteins S6 (RpS6) in Neuroblasten erfüllt und dass seine Transkription durch Myc reguliert wird. Daher wurde geschlussfolgert, dass Mbm die Proliferation von Neuroblasten durch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese regulieren könnte. In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, weitere Hinweise auf diese möglichen Funktionen von Mbm zu finden und die Proteindomänen zu identifizieren, die dafür benötigt werden. Mbm beinhaltet einen Arginin/Glycin-reichen Abschnitt, der ein di-RG sowie ein di-RGG Motiv enthält. Diese beiden Motive wurden zusammen zu Mbms RGG-Box definiert. RGG-Boxen finden sich in vielen Proteinen verschiedener Familien und sie können sich sowohl verstärkend als auch inhibierend auf Protein-RNA- sowie Protein-Protein-Interaktionen auswirken. Somit stellt Mbms RGG-Box einen vielversprechenden Kandidaten dar für eine Proteindomäne, die in die rRNA-Bindung sowie die Translokation von RpS6 involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mbm mit deletierter RGG-Box (MbmdRGG) nicht in der Lage ist, die Überlebensfähigkeit und die Neuroblastengröße der Nullmutation mbmSH1819 vollständig zu retten. Des Weiteren benötigt Mbm die RGG-Box, um rRNA in vitro zu binden und in mbmdRGG sowie mbmSH1819 Mutanten konnte eine partielle Delokalisation von RpS6 beobachtet werden. Die korrekte Lokalisation von Mbm selbst scheint auch von der RGG-Box abzuhängen, da MbmdRGG teilweise in den Nukleus delokalisiert ist. Interessanterweise ist außerdem die Proteinsyntheserate in mbmdRGG Mutanten erhöht, was möglicherweise in einer Erhöhung der TOR-Expression begründet ist. Somit könnte Mbm unter bestimmten Bedingungen eine verstärkende Funktion im TOR-Signalweg erfüllen, die durch seine eigene RGG-Box reguliert wird. Des Weiteren sind RGG-Boxen hinsichtlich ihrer Funktion häufig von der Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) abhängig. Mbm könnte innerhalb seiner RGG-Box symmetrisch dimethyliert sein, allerdings sind die Ergebnisse in dieser Hinsicht sehr zweifelhaft. Jedenfalls scheinen Dart1 und Dart5 nicht imstande zu sein, Mbm zu methylieren. Außerdem beinhaltet Mbm zwei Zink-Finger-Motive des C2HC-Typs, die in die Bindung von rRNA involviert sein könnten. Eine vorhergehende Studie konnte zeigen, dass die Mutation der Zink-Finger, mbmZnF, zwar nicht zu einer Veränderung der Neuroblastengröße führt, allerdings, dass MbmZnF ins Zytoplasma delokalisiert vorliegt. In der vorliegenden Studie wurden die mbmZnF Mutanten in die meisten Experimente mit einbezogen. Allerdings sind die Ergebnisse rätselhaft, da mbmZnF-mutierte Larven sogar eine geringere Überlebensrate zeigen als die mbm Nullmutanten und da MbmZnF eine stärkere Bindungsaffinität zu rRNA zeigt als wildtypisches Mbm. Dies weist auf eine unspezifische Interaktion zwischen MbmZnF und einem anderen Protein, RNA oder DNA hin, was einen dominant-negativen Effekt auslösen könnte, indem andere Interaktionspartner gestört werden. Somit gestaltet es sich schwierig, Schlussfolgerungen zur Funktion der Zink-Finger zu ziehen. Zusammengefasst liefert die vorliegende Studie weitere Anhaltspunkte, dass Mbm in der Neuroblastenproliferation sowie der Regulation der Ribosomenbiogenese involviert ist und dass Mbm seine RGG-Box benötigt, um seine Funktionen zu erfüllen. KW - Taufliege KW - Neuroblast KW - Gehirn KW - Entwicklung KW - Drosophila melanogaster KW - brain development KW - neuroblast proliferation KW - mushroom body miniature KW - Gehirnentwicklung KW - Neuroblastenproliferation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199674 ER - TY - THES A1 - Hovhanyan, Anna T1 - Functional analyses of Mushroom body miniature (Mbm) in growth and proliferation of neural progenitor cells in the central brain of Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse des Mushroom body minature (Mbm) in das Wachstum und die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen im zentralen Gehirn von Drosophila melanogaster N2 - Zellwachstum und Zellteilung stellen zwei miteinander verknüpfte Prozesse dar, die dennoch grundsätzlich voneinander zu unterscheiden sind. Die Wiederaufnahme der Proliferation von neuralen Vorläuferzellen (Neuroblasten) im Zentralhirn von Drosophila nach der spät-embryonalen Ruhephase erfordert zunächst Zellwachstum. Der Erhalt der regulären Zellgröße ist eine wichtige Voraussetzung für die kontinuierliche Proliferation der Neuroblasten über die gesamte larvale Entwicklungsphase. Neben extrinsischen Ernährungssignalen ist für das Zellwachstum eine kontinuierliche Versorgung mit funktionellen Ribosomen notwendig, damit die Proteinsynthese aufrechterhalten werden kann. Mutationen im mushroom body miniature (mbm) Gen wurden über einen genetischen Screen nach strukturellen Gehirnmutanten identifiziert. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der funktionellen Charakterisierung des Mbm Proteins als neues nukleoläres Protein und damit seiner möglichen Beteiligung in der Ribosomenbiogenese. Der Vergleich der relativen Expressionslevel von Mbm und anderen nuklearen Proteinen in verschiedenen Zelltypen zeigte eine verstärkte Expression von Mbm in der fibrillären Komponente des Nukleolus von Neuroblasten. Diese Beobachtung legte die Vermutung nahe, dass in Neuroblasten neben generell benötigten Faktoren der Ribosomenbiogenese auch Zelltyp-spezifische Faktoren existieren. Mutationen in mbm verursachen Proliferationsdefekte von Neuroblasten, wirken sich jedoch nicht auf deren Zellpolarität, die Orientierung der mitotischen Spindel oder die Asymmetrie der Zellteilung aus. Stattdessen wurde eine Reduktion der Zellgröße beobachtet, was im Einklang mit einer Beeinträchtigung der Ribosomenbiogenese steht. Insbesondere führt der Verlust der Mbm Funktion zu einer Retention der kleinen ribosomalen Untereinheit im Nukleolus, was eine verminderte Proteinsynthese zur Folge hat. Interessanterweise wurden Störungen der Ribosomenbiogenese nur in den Neuroblasten beobachtet. Zudem ist Mbm offensichtlich nicht erforderlich, um Wachstum oder die Proliferation von Zellen der Flügelimginalscheibe und S2-Zellen zu steuern, was wiederum dafür spricht, dass Mbm eine Neuroblasten-spezifische Funktion erfüllt. Darüber hinaus wurden die transkriptionelle Regulation des mbm-Gens und die funktionelle Bedeutung von posttranslationalen Modifikationen analysiert. Mbm Transkription wird von dMyc reguliert. Ein gemeinsames Merkmal von dMyc Zielgenen ist das Vorhandensein einer konservierten „E-Box“-Sequenz in deren Promotorregionen. In der Umgebung der mbm-Transkriptionsstartstelle befinden sich zwei „E-Box“-Motive. Mit Hilfe von Genreporteranalysen konnte nachgewiesen werden, dass nur eine von ihnen die dMyc-abhängige Transkription vermittelt. Die dMyc-abhängige Expression von Mbm konnte auch in Neuroblasten verifiziert werden. Auf posttranslationaler Ebene wird Mbm durch die Proteinkinase CK2 phosphoryliert. In der C-terminalen Hälfte des Mbm Proteins wurden in zwei Clustern mit einer Abfolge von sauren Aminosäuren sechs Serin- und Threoninreste als CK2- Phosphorylierungsstellen identifiziert. Eine Mutationsanalyse dieser Stellen bestätigte deren Bedeutung für die Mbm Funktion in vivo. Weiterhin ergaben sich Evidenzen, dass die Mbm-Lokalisierung durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung gesteuert wird. Obwohl die genaue molekulare Funktion von Mbm in der Ribosomenbiogenese noch im Unklaren ist, unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die besondere Rolle von Mbm in der Ribosomenbiogenese von Neuroblasten um Zellwachstum und Proliferation zu regulieren. N2 - Cell growth and cell division are two interconnected yet distinct processes. Initiation of proliferation of central brain progenitor cells (neuroblasts) after the late embryonic quiescence stage requires cell growth, and maintenance of proper cell size is an important prerequisite for continuous larval neuroblast proliferation. Beside extrinsic nutrition signals, cell growth requires constant supply with functional ribosomes to maintain protein synthesis. Mutations in the mushroom body miniature (mbm) gene were previously identified in a screen for structural brain mutants. This study focused on the function of the Mbm protein as a new nucleolar protein, which is the site of ribosome biogenesis. The comparison of the relative expression levels of Mbm and other nucleolar proteins in different cell types showed a pronounced expression of Mbm in neuroblasts, particularly in the fibrillar component of the nucleolus, suggesting that in addition to nucleolar components generally required for ribosome biogenesis, more neuroblast specific nucleolar factors exist. Mutations in mbm cause neuroblast proliferation defects but do not interfere with cell polarity, spindle orientation or asymmetry of cell division of neuroblasts. Instead a reduction in cell size was observed, which correlates with an impairment of ribosome biogenesis. In particular, loss of Mbm leads to the retention of the small ribosomal subunit in the nucleolus resulting in decreased protein synthesis. Interestingly, the defect in ribosome biogenesis was only observed in neuroblasts. Moreover, Mbm is apparently not required for cell size and proliferation control in wing imaginal disc and S2 cells supporting the idea of a neuroblast-specific function of Mbm. Furthermore, the transcriptional regulation of the mbm gene and the functional relevance of posttranslational modifications were analyzed. Mbm is a transcriptional target of dMyc. A common feature of dMyc target genes is the presence of a conserved E-box sequence in their promoter regions. Two E-box motifs are found in the vicinity of the transcriptional start site of mbm. Gene reporter assays verified that only one of them mediates dMyc-dependent transcription. Complementary studies in flies showed that removal of dMyc function in neuroblasts resulted in reduced Mbm expression levels. At the posttranslational level, Mbm becomes phosphorylated by protein kinase CK2. Six serine and threonine residues located in two acidic amino acid rich clusters in the C-terminal half of the Mbm protein were identified as CK2 phosphorylation sites. Mutational analysis of these sites verified their importance for Mbm function in vivo and indicated that Mbm localization is controlled by CK2-mediated phosphorylation. Although the molecular function of Mbm in ribosome biogenesis remains to be determined, the results of this study emphasize the specific role of Mbm in neuroblast ribosome biogenesis to control cell growth and proliferation. KW - Taufliege KW - Mbm KW - Neuroblast KW - cell growth KW - proliferation KW - ribosome biogenesis KW - CK2 KW - Myc KW - Vorläuferzellen KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91303 ER - TY - THES A1 - Chen, Yi-chun T1 - Experimental access to the content of an olfactory memory trace in larval Drosophila T1 - Eine experimentelle Strategie zur Beschreibung des Inhaltesdes Duftgedächtnisses von Larven der Drosophila N2 - Animals need to evaluate their experiences in order to cope with new situations they encounter. This requires the ability of learning and memory. Drosophila melanogaster lends itself as an animal model for such research because elaborate genetic techniques are available. Drosphila larva even saves cellular redundancy in parts of its nervous system. My Thesis has two parts dealing with associative olfactory learning in larval Drosophila. Firstly, I tackle the question of odour processing in respect to odour quality and intensity. Secondly, by focusing on the evolutionarily conserved presynaptic protein Synapsin, olfactory learning on the cellular and molecular level is investigated. Part I.1. provides a behaviour-based estimate of odour similarity in larval Drosophila by using four recognition-type experiments to result in a combined, task-independent estimate of perceived difference between odour-pairs. A further comparison of these combined perceived differences to published calculations of physico-chemical difference reveals a weak correlation between perceptual and physico-chemical similarity. Part I.2. focuses on how odour intensity is interpreted in the process of olfactory learning in larval Drosophila. First, the dose-effect curves of learnability across odour intensities are described in order to choose odour intensities such that larvae are trained at intermediate odour intensity, but tested for retention either with that trained intermediate odour intensity, or with respectively HIGHer or LOWer intensities. A specificity of retention for the trained intensity is observed for all the odours used. Such intensity specificity of learning adds to appreciate the richness in 'content' of olfactory memory traces, and to define the demands on computational models of associative olfactory memory trace formation. In part II.1. of the thesis, the cellular site and molecular mode of Synapsin function is investigated- an evolutionarily conserved, presynaptic vesicular phosphoprotein. On the cellular level, the study shows a Synapsin-dependent memory trace in the mushroom bodies, a third-order “cortical” brain region of the insects; on the molecular level, Synapsin engages as a downstream element of the AC-cAMP-PKA signalling cascade. N2 - Tiere müssen ihre eigenen Erfahrungen heranziehen, damit sie neue Situationen meistern können. Dies setzt die Fähigkeit zum Lernen und ein Gedächtnis voraus. Drosophila melanogaster eignet sich dank der Vielzahl verfügbarer genetischer Methoden als ein Modellorganismus für solche Forschung. Die Drosophila Larve kommt zudem in Teilen ihres Nervensystems ohne zelluläre Redundanz aus. Meine Doktorarbeit gliedert sich in zwei Teile, die das assoziative olfaktorische Lernen der Drosophila Larven zum zentralen Gegenstand haben. Erstens bearbeite ich den Prozess der Geruchswahrnehmung hinsichtlich der Duftqualität und Duftintensität. Im zweiten Teil meiner Arbeit erforschen wir das olfaktorische Lernen auf zellulärer und molekularer Ebene und konzentrieren uns dabei auf das hochkonservierte präsynaptische Protein Synapsin. Teil I.1. handelt von der Ähnlichkeit zwischen Duftpaaren in der Wahrnehmung von Drosophila Larven anhand vier verschiedener Typen von Lernexperiment. Mit diesen Experimenten ließ sich eine Abschätzung der vom Tier wahrgenommenen Ähnlichkeiten zwischen Paaren von Duftstoffen erreichen. Ein Vergleich dieser wahrgenommenen Ähnlichkeiten mit veröffentlichten physikalisch-chemischen Ähnlichkeiten ergibt eine schwache Korrelation. Teil I.2. befasst sich damit, wie die Intensität eines Duftes in die olfaktorische Wahrnehmung und das Gedächtnis der Drosophila Larven integriert sein könnte. Zunächst wird die Lernbarkeit verschiedener Duftstoffe abhängig von ihren Intensitäten beschrieben; anhand dieser Dosis-Wirkungskurven werden dann Duftintensitäten so ausgewählt, dass die Larven mit der mittleren Duftintensität trainiert werden, aber mit einer höheren, oder mit einer niedrigeren Duftintensität getestet werden. Es zeigt sich eine Spezifität des Gedächtnisabrufs für die trainierte Intensität, und zwar für alle verwendeten Duftstoffe. Eine solche Spezifität für Intensität bereichert das Bild des ‚Inhalts’ von olfaktorischen Gedächtnisspuren und damit die Anforderungen an Computermodelle über Riechen und Geruchslernen. Im Teil II.1. habe ich in Zusammenarbeit mit Birgit Michels auf zelluläre Ebene die Funktion von Synapsin beim assoziativen Lernen von Drosophila Larven untersucht- ein evolutionär konserviertes, präsynaptisches, vesikel-assoziiertes Phosphoprotein. Auf zellulärer Ebene zeigt die Studie eine Synapsin-abhängige Gedächtnisspur im Pilzkörper, einer dem olfaktorischen Cortex der Vertebraten womöglich homologen Struktur. Auf molekularer Ebene wurde nachgewiesen, dass Synapsin als ein Zielprotein in der AC-cAMP-PKA Kaskade am Lernvorgang beteiligt ist. KW - Taufliege KW - Geruchssinn KW - Lernen KW - Sinnesphysiologie KW - Ähnlichkeit KW - Wahrnehmung KW - Geschmack KW - Duftintensität KW - Drosophila KW - Olfaction KW - Learning KW - Sensory KW - Physiology KW - Similarity KW - Perception KW - Taste KW - Odour Intensity KW - Drosophila KW - Geruchssinn KW - Lernen KW - Sinnesphysiologie Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83705 ER -