TY - THES A1 - Riedl, Sabine T1 - Untersuchungen zur Induktion und zum Transfer der Vancomycin-Resistenz vom VanA-Typ sowie zur Flavophospholipol-Resistenz in Enterococcus faecium T1 - Investigations concerning the induction and the transfer of VanA-type glycopeptide resistance in Enterococcus faecium N2 - Enterokokken gelten primär als opportunistische Erreger mit geringer Pathopotenz. Sie zeichnen sich allerdings durch ausgeprägte natürliche und erworbene Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika aus. Besorgniserregend ist hierbei insbesondere das Auftreten von Vancomycin-resistenten Enterokokken. Glycopeptidantibiotika, wie Vancomycin und Teicoplanin, werden als Reserveantibiotika gegen multiresistente gram-positive Erreger, wie zum Beispiel Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Stämme (MRSA) eingesetzt. Der VanA-Typ der Glycopeptidresistenz, welcher zuerst in Enterococcus faecium beschrieben wurde, ist die in Zentraleuropa vorherrschende Variante der Glycopeptidresistenz. Das Transposon Tn1546, das die vanA-Resistenzdeterminante kodiert, liegt häufig auf großen konjugativen Plasmiden vor und kann zwischen Enterokokken-Stämmen transferiert werden. In dieser Arbeit wurde der direkte Einfluss von Vancomycin und eines weiteren Antibiotikums, Flavophospholipol (FPL), auf die Rate des konjugativen Transfers des vanA-Operons in E. faecium untersucht. Das Phosphoglycolipidantibiotikum FPL wird derzeit als Leistungsförderer in der Tiermast eingesetzt. Beide Antibiotika induzieren die Expression der Glycopeptidresistenz vom VanA-Typ. Es konnte gezeigt werden, dass Flavophospholipol in unterschiedlichen Konzentrationen die Häufigkeit des Transfers von konjugativen VanA-Plasmiden sowohl in klinischen E. faecium-Isolaten, als auch in E. faecium-Stämmen aus Tierfaeces signifikant hemmte. Vancomycin zeigte keinen signifikanten Effekt auf die Transferrate der VanA-Plasmide. Somit konnte nachgewiesen werden, dass in E. faecium kein funktionaler Zusammenhang zwischen der Induktion des vanA-Operons durch Vancomycin und FPL und der Transferfrequenz der konjugativen VanA-Plasmide unter dem Einfluss der beiden Antibiotika besteht. Weiterhin wurde die Induktion des vanA-Operons unter dem Einfluss verschiedener Antibiotika in einem E. faecium-Isolat näher untersucht. Hierbei wurde die Expression des 39 kDa VanA-Ligase Proteins direkt durch das Western Blot-Verfahren dargestellt. Eine Induktion der Expression des VanA-Ligase Proteins erfolgte durch Inhibitoren der späten Phase der Zellwandsynthese, wie Vancomycin, Flavophospholipol, Bacitracin und Tunicamycin. Außerdem konnte eine leichte Induktion des VanA-Ligase Proteins durch Fosfomycin, Cefalexin und Cefuroxim, Meropenem und Clindamycin nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass Cefuroxim und Clindamycin zwei Antibiotika, die in klinischen Studien eine Besiedelung mit VRE begünstigen, auch eine geringe Zunahme der VanA-Ligase Expression bewirken. Zudem wurde deutlich, dass durch den Einfluss von Hitzestress und osmotischem Stress keine Induktion der 39 kDa VanA-Ligase Bande erfolgt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung einer putativen Resistenz-determinante gegen Flavophospholipol. Die Eigenschaft der FPL-Resistenz konnte nicht durch in vitro-Filterkonjugation von FPL-resistenten auf FPL-sensitive E. faecium-Stämme übertragen werden. Zur molekularen Untersuchung der Resistenz gegen Flavophospholipol wurde ein resistenter E. faecium-Stamm durch das konjugative Transposon Tn916 mutagenisiert. In allen identifizierten FPL-sensitiven Mutanten war die Insertionstelle des Transposons und dessen Orientierung im Chromosom identisch und es deletierte ein 1,5 kb großer genomischer Bereich „downstream“ der Transposon-Insertionsstelle. Dieser Bereich umfasste das 3´-Endes des Gens für eine putative Threonyl-tRNA Synthetase und den Genlocus für einen putativen Transkriptionsregulator. Die Sequenzen in allen Mutanten begannen ca. 200 bp vor dem Startcodon eines Gens für ein putatives Penicillin-Bindeprotein (PBP). In Northern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Transkription des putativen PBP in der Mutante 64/3-1 schwächer war als im Wildtyp 64/3. Außerdem wurden durch 3H Penicillin-Markierung von PBP-Extrakten Unterschiede im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine im Wildtyp und in der Mutante deutlich. Während im Wildtyp fünf Penicillin-Bindeproteine zu erkennen waren, fehlten PBP2 und PBP3 in der Mutante 64/3-1. Die Größe von PBP3 entsprach hierbei der geschätzten Größe des putativen PBP von 79 kDa. In der Mutante 64/3-1 fand wahrscheinlich durch den Verlust eines putativen Regulators oder wichtiger regulatorischer Bereiche eine Veränderung im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine statt, welche zum FPL-sensitiven Phänotyp führte. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass Flavophospholipol in E. faecium an PBP2 und PBP3 bindet und es sich hierbei um bifunktionale „high molecular weight“ Penicillin-Bindeproteine mit Transglycosylase- und Transpeptidase-Untereinheit handeln muss. N2 - Enterococci are primary opportunistic pathogens. Species of this genus are inherently resistant to many antimicrobial agents and readily acquire additional resistances, which is likely the reason why enterococci have become prominent nosocomial pathogens. Glycopeptides, such as vancomycin and teicoplanin are the antibiotics of last resort for the treatment of methicillin-resistant staphylococci (MRSA). In Central Europe, the VanA-type is the most frequent genotype of acquired glycopeptide resistance. The vanA gene cluster is located on transposons of the Tn1546 type, which are integrated into conjugative plasmids, and can therefore be transferred among enterococcal strains. In this study, the influence of vancomycin and flavophospholipol (FPL) on the conjugative transfer of vanA plasmids was determined in several Enterococcus faecium strains. FPL is a phosphoglycolipid antibiotic used as a growth promoter in animal husbandry. Both antibiotics have an inducing effect on the vanA operon. We showed that subinibitory concentrations of FPL inhibit the tranfer of vanA plasmids. This inhibitory effect is dose-dependend and was observed both in clinical and animal isolates of E. faecium. Vancomycin had no significant effect on the transfer rate of vanA plasmids. These results suggest that there is no functional link between the induction of vancomycin resistance of VanA-type and the frequency of transfer of conjugative vanA plasmids in E. faecium. Furthermore, the influence of some antibiotics on the VanA ligase protein expression was examined by Western-blotting analysis. Induction of the 39 kDa protein could be detected after addition of some cell-wall active agents such as vancomycin, flavophospholipol, bacitracin and tunicamycin. Fosfomycin, cefalexine and cefuroxime as well as meropenem and clindamycin had a weaker inducing effect on the VanA ligase protein expression. Heat- and osmotic stress had no effect on the expression of the VanA ligase. A further objective of this study was the identification of a putative Flavophospholipol resistance determinant. Transfer of the FPL resistance between E. faecium strains could not be detected in filter mating experiments. For the molecular analysis of the Flavophospholipol resistance an insertional mutagenesis was carried out in a FPLr E. faecium strain using the conjugative transposon Tn916. The chromosomal insertion sites of the transposon were identical in all identified mutants with a 1.5 kb sequence deletion downstream of Tn916. Sequence analysis of the deleted area revealed homolgy to the 3´-end of a putative threonyl-tRNA synthetase gene and the gene of a putative regulator. The sequences in all mutants began about 200 bp upstream of the startcodon of a putative penicillin-binding protein (PBP) gene. The transcription of this penicillin-binding protein was weaker in the transposonmutant 64/3-1 than in the wildtype 64/3 as could be shown by Northern hybridisation. Further, binding-studies using 3H penicillin showed differences in the expression pattern of the penicillin-binding proteins between wildtype and mutant 64/3-1. The wildtype contained five PBP, while PBP2 and PBP3 where not marked in mutant 64/3-1. The size of PBP3 corresponds with an estimated size of the putative penicillin-binding protein of 79 kDa. This results suggest that the change in the penicillin-binding protein expression pattern of FPLs mutant 64/3-1 may be caused by the loss of a putative regulator or an important regulatory sequence. The PBP studies also show that FPL binds to PBP2 and PBP3 in E. faecium and these are likely bifunctional high molecular weight penicillin-binding proteins with transglycosylase- and transpeptidase-modules. KW - Streptococcus faecium KW - Vancomycin KW - Flavomycin KW - Arzneimittelresistenz KW - Genregulation KW - Enterococcus faecium KW - VanA KW - Flavophospholipol KW - Regulation KW - Resistenz KW - Enterococcus faecium KW - VanA KW - flavophospholipol KW - regulation KW - resistance Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5633 ER - TY - THES A1 - Maibaum, Maria T1 - Molekulargenetische Untersuchungen zur Persistenz und Genomvariabilität von Escherichia-coli-Isolaten von Patientinnen mit chronisch rezidivierenden Harnwegsinfektionen T1 - Molecular genetic investigations of persistence and gene variability of Escherichia coli isolates from patients with chronic recurrent urinary tract infections N2 - Harnwegsinfektionen gehören zu den häufigsten Infektionskrankheiten des Menschen und werden überwiegend durch uropathogene Escherichia coli (UPEC) ausgelöst. Die genaue Erforschung der Krankheitserreger durch molekularbiologische Verfahren könnte zur Entwicklung neuer diagnostischer Methoden sowie zu besseren Präventions- und Therapiestrategien führen. In der vorliegenden Studie wurden 166 Stuhl- und 86 Urinisolate, die von Patientinnen mit chronisch rezidivierenden Harnwegsinfektionen gewonnen wurden, auf das Vorhandensein der Virulenzfaktoren alpha-Hämolysin, P-, S- und Typ-1-Fimbrien sowie den zytotoxisch-nekrotisierenden Faktor 1 sowohl geno- als auch phänotypisch untersucht. Weiterhin wurde mit Hilfe der Rep-PCR und der Pulsfeldgelelektrophorese ein Identitäts-Screening durchgeführt, so daß sämtliche E. coli-Isolate zu 46 Stuhl- und 16 Urinklonen zusammengefaßt werden konnten. Alle untersuchten Gene fanden sich bei den Urinklonen häufiger als bei den Stuhlklonen, dabei war das Typ-1-Fimbrien-Gencluster jeweils am häufigsten vorhanden. Im Gegensatz zu den Stuhlstämmen exprimierten alle hly positiven Urinstämme dieses Toxin auch, die Fimbrienproduktion überwog dagegen bei den Stuhlisolaten. Bezüglich der Klinik korrelierte die Pathogenität der Urinklone mit der Aktivitätsstufe, bei den Stuhlklonen konnte dieser Zusammenhang nicht nachgewiesen werden. Bedingt durch den chronischen Krankheitsverlauf der Patientinnen wiesen die E. coli-Isolate dieser Studie ein geringeres pathogenes Potential auf als vergleichbare Isolate akuter Infektionsereignisse. Es konnten keine Deletionen von Pathogenitätsinseln beobachtet werden. Auffallend war, daß unter der Langzeitmetaphylaxe mit AcimethinR sämtliche untersuchten Pathogenitätsfaktoren seltener auftraten. Bei der Beobachtung der einzelnen Patientinnen über einen längeren Zeitraum hinweg (Januar bis Oktober 1998) konnten mehrfach Persistenzen verschiedener Klone von bis zu 9 Monaten nachgewiesen werden. N2 - Urinary tract infections belong to the most common human infectious diseases and are mostly caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC). In the following study 166 stool- and 86 urine strains were isolated from 11 patients suffering from chronic urinary tract infections and as well genetically as phenotypically tested on the possession of hemolysin, P-, S- and type-1-fimbriae and cytotoxic necrotizing factor type 1. Besides they were analyzed by so called Rep-polymerase chain reaction and pulse field gene electrophoresis. With this identity-screening all strains could be divided into 46 stool- and 16 urine clones. All investigated gene clusters existed more often on the urine as on the stool clones. The type-1-fimbriae gene cluster was always the most frequent virulence factor. More toxic UPEC isolates correlated with clinical gravity of disease, whereas virulence of stool clones had no connection with disease activity. Due to chronic progress of disease these E. coli strains possessed less virulence factors than comparable isolates from acute infection phases. There was no proof of deletions of pathogenicity islands. All clones isolated under prophylaxis with AcimethinR carried less pathogen factors than strains without therapy. Persistence of several clones could be observed up to 9 months. KW - Harnwegsinfektion KW - Escherichia coli KW - Genomvaribilität KW - urinary tract infection KW - Escherichia coli KW - gene variability Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4581 ER - TY - THES A1 - Staib, Peter T1 - Analyse der Expression einer Virulenzgenfamilie von Candida albicans während der Infektion T1 - Analysis of the expression of a Candida albicans virulence gene family during infection N2 - Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können. N2 - The opportunistic human pathogenic yeast Candida albicans is a member of the microflora on mucosal surfaces of many healthy people but can cause superficial infections as well as life-threatening deep organ mycoses in immunocompromised patients. Although the ability of C. albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, it is generally assumed that a number of virulence factors also contribute to the pathogenicity of C. albicans, thereby supporting colonization, distribution and multiplication of the fungal cells and allowing an adaption to various host niches. The production of secreted aspartic proteases (SAPs), encoded by a large family of homologous genes, plays an important role in C. albicans pathogenicity. It is likely that the individual proteases fullfill various functions during infection or are optimally adapted to different host niches. However, the contribution of single SAP genes to pathogenicity is not well understood. Because the host-induced activation of these virulence genes at a certain infection stage might give clues to their specific role in pathogenicity, an in vivo-expression technology (IVET) was developed in this work that allows the detection of gene activation in C. albicans during infection. The method is based on genetic recombination as a reporter of gene expression, resulting in the specific excision of a mycophenolic acid resistance marker from the genome by a site-specific recombinase after induction of the target gene. Because deletion of the marker represents an irreversible event that is inherited by the progeny of the corresponding cell, even a transient gene expression at a certain infection stage or in specific organs can be detected in single cells recovered from infected tissue by plating on appropriate indicator medium. The suitability of the reporter system for detecting a biologically meaningful gene activation in C. albicans was confirmed by analyzing expression of the SAP2 gene, which is induced in vitro during growth in a medium containing bovine serum albumin as the sole nitrogen source, but repressed in other commonly used laboratory media. IVET was then used to analyze the in vivo expression of six different SAP genes of C. albicans, SAP1-SAP6, in various animal models. It could be demonstrated that the individual protease genes are indeed differentially regulated, depending on the type of the infection, i.e. locally restricted mucosal infection or systemic infection, and the stage of an infection. Even the highly homologous SAP4-SAP6 genes, which from the results of in vitro experiments had been supposed to be hyphae-specific genes, were differentially regulated in vivo. SAP5 and SAP6, but not the other SAP genes, were significantly activated in a mouse model of oesophageal candidiasis when C. albicans hyphae invaded into the epithelium. A stage-specific expression of SAP genes was observed in a mouse model of Candida peritonitis. Soon after inoculation of C. albicans yeasts into the peritoneal cavity, before hyphae formation was observed, SAP5 but not SAP6 or any of the other SAP genes analyzed was activated in a significant part of the infecting cell population. Therefore, SAP5 seems to be important for tissue invasion during mucosal infection and also during the initial steps of a disseminated infection. By intravenous inoculation of C. albicans into mice, thereby bypassing the early infection stages, it was demonstrated that expression of SAP5 and SAP6, but also SAP4, continued into the later stages of a disseminated infection. In contrast, an induction of the SAP2 gene was observed predominantly in the late stages of a systemic infection, when the fungal cells had spread to deep organs. Hence, SAP2 presumably supports the multiplication of the fungal cells within the infected organs, perhaps by providing nutrient supply, rather than the invasion into host tissues. The in vivo regulation of SAP2 was shown to be influenced by certain repeat structures in the promotor region of this gene. In the C. albicans model strain CAI4 that was used in this study even the two SAP2 alleles, which differed in this repeat region, were differentially regulated during the course of a systemic infection, the SAP2-2 allele being induced at an earlier infection stage than the SAP2-1 allele. In contrast to the other SAP genes, expression of SAP1 and SAP3 could be detected in only few infecting cells, and a role in pathogenicity could not be attributed to these genes in the infection models used in this work. During the course of an infection C. albicans presumably employs many different virulence factors at the same time in order to achieve the best possible adaptation to the corresponding host niche. Yet, a question that has hardly been addressed but may enhance our understanding of the host-microbe interactions is whether different properties of the fungal cell are regulated in a coordinated fashion by specific host signals. At least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators CPH1 and EFG1, respectively, control hyphae formation in C. albicans. As dimorphic growth is important for infection and because expression of the genes SAP4-SAP6 is linked to the hyphal growth form in vitro, a possible dependence of hyphae-associated SAP gene expression on these regulators was analyzed by studying SAP5 expression in corresponding signal transduction mutants. SAP5 activation in vivo was reduced in cph1 as well as in efg1 single mutants. Therefore, both CPH1 and EFG1 contribute to SAP5 activation during infection. Since the cph1 mutant formed hyphae in infected tissue as efficiently as the wild-type strain, hyphae formation alone evidently was not sufficient for full SAP5 induction in vivo. On the other hand, induction of SAP5 in vivo did not depend on the hyphal growth form, because a reduced but still significant SAP5 expression was also detected in the efg1 mutant that grew only in the yeast form in the infected animals. In cells defective in both of the regulators an induction of SAP5 was hardly detectable. Therefore, these signalling pathways are important for the control of various cellular programs during infection and coordinate the expression of different virulence genes in C. albicans. The in vivo analysis of virulence gene expression of C. albicans provided insights into regulatory adaptation mechanisms of the pathogen in various host niches. The individual members of a virulence gene family of this fungus are differentially and stage-specifically regulated during infection and thus presumably contribute very specifically to pathogenesis. Moreover, various virulence traits can be regulated in a coordinated fashion during infection and in this way together support the adaptability of C. albicans to the host. Overall, these findings enhance our understanding of the pathogenicity of this important opportunistic fungal pathogen. KW - Candida albicans KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Pilzinfektionen KW - Virulenzmechanismen KW - Genregulation KW - Reportergene KW - In Vivo Expressionstechnologie KW - Proteasen KW - Candida albicans KW - fungal infections KW - virulence mechanisms KW - gene regulation KW - reporter genes KW - in vivo expression technology KW - Candida albicans Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179875 ER - TY - THES A1 - Piechaczek, Katharine T1 - Untersuchungen zum Einfluß der Pathogenitätsinseln I536 und II536 auf die Genexpression des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 T1 - Studies on the influence of the pathogenicity islands I536 and II536 on the gene expression of the gene expression of the uropathogenic Escherichia coli strain 536 N2 - Escherichia coli wird als der häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit auslösen zu können, benötigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen Stämmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-Hämolysin, die Adhäsine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Ausprägung der Virulenz hängt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenitätsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 führt zum Verlust der Virulenz und zur Zerstörung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilität und die Enterobaktin- und a-Hämolysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenitätsinseln I536 und II536 für die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zunächst eine Proteomanalyse durchgeführt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von präparativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kulturüberstandsfraktionen der untersuchten Stämme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen Stämme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgeführt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten Stämmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abhängiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in ähnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenität wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren überprüft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgeführt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden. N2 - Escherichia coli is one of the common causes of urinary tract infections. Pathogenic E. coli differ from non-pathogenic E. coli variants by the presence of certain virulence factors which contribute to their ability to cause disease. The uropathogenic E. coli strain 536 (O6:K15:H31) is able to produce different virulence factors such as a-hemolysin, fimbrial adhesins (P-, type 1 and S-fimbriae) and specific capsules. Furthermore the bacteria produce iron uptake systems like enterobactin and yersiniabactin and have the capacity to survive in human serum. The development of pathogenicity is connected to pathogenicity islands (PAI I536-V536). All four PAIs are associated with tRNA genes. The deletion of PAI I536 and PAI II536 results in the truncation of the associated tRNA gene and loss of virulence. The deletion of PAI II536 results in the truncation of the leuX gene. PAI II536 as well as leuX deletion mutants show a reduced production of type 1 fimbriae, flagellae and of the iron uptake system enterobactin. Furthermore, they show delayed hemolysin production and a reduced serum resistance. Additionally, the leuX-encoded tRNA5Leu may also regulate the expression of various other genes. The aim of this work was the further characterization and analysis of the role of PAI I536/II536 and of the tRNA5Leu for protein expression as well as for the regulation and expression of two site-specific recombinases, FimB and FimE, of the E. coli strain 536. Firstly, the protein expression patterns of E. coli 536 and different derivatives were studied. Differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536, its mutants 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) and strain 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. With the help of preparative 2 D-gel electrophoresis 39 differentially expressed intracellular proteins could be identified. The identities of 37 proteins have been determined by MALDI-TOF mass spectrometry in Halle. Two of these proteins show no matches in sequence databases. The preparations of the culture supernatants resulted in 2 D proteinpatterns from which three protein spots whose expression is markedly altered in the different strains are identified. The influence of the tRNA5Leu on the expression of outer membrane proteins was also studied. Differences in the protein expression patterns of the wild-type strain 536 and the mutants were analyzed by one- and two-dimensional gel electrophoresis. The analysis of 2 D protein patterns of outer membrane preparation resulted in the detection of some proteinspots whose expression was altered in the different strain backgrounds. It was identified during the proteom analysis that tha expression of the YgaG protein was shown to be reduced in a leuX-negative background. This protein shows a strong homology to the LuxS protein of Vibrio harveyi. The LuxS protein is a component of the quorum sensing system. It has been shown that many bacteria express proteins similar to LuxS of V. harveyi and that quorum sensing may play a role in pathogenicity. To investigate whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli strain 536, a ygaG deletion mutant was made. In addition, differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536 and the ygaG mutant were analyzed by 2 D gel electrophoresis. Whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli Strain 536 has not be investigated. In order to get a deeper insight into the role of the tRNA5Leu as a potential regulator of the expression of the typ 1-fimbriae, a transcriptional fusion between the promotor area of fimB and fimE and the lacZ gene lacking its own promotor was constructed. However the transcription of fimB and fimE did not show any significant differences between the wild-type strain 536 and the leuX-mutant 536D102. KW - Escherichia coli KW - Harnwegskrankheit KW - Virulenzfaktor KW - Proteom KW - Proteom KW - Pathogenitätsinseln KW - leuX-tRNA KW - uropathogener E. coli Stamm 536 KW - Proteomics KW - Pathogenicity islands KW - leuX-tRNA KW - uropathogenic E. coli strain 536 Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1862 ER - TY - THES A1 - Cho, Seung-Hak T1 - Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus T1 - Epidemiological and molecular investigations of the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus N2 - Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehören zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig darüber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die Fähigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hängt von der genetischen Ausstattung der Stämme mit dem für die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon häufiger in klinischen als in kommensalen Stämmen vorkommt. Der überwiegende Teil dieser ica-positiven Stämme bildete phänotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stämme, unabhängig von ihrer Herkunft, das vollständige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stämme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stämme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stämmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant häufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stämmen nachweisbar, während es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytären Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stämme wiesen überdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phänotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante führte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollständige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollständig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen überein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo während einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phänotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stämmen zu größeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilität unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausübt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veränderten SigB-Expression in Zusammenhang steht. N2 - Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis belong to the most frequent causes of nosocomial infections in immunocompromised patients. These bacteria form an essential part of the healthy skin flora of human beings. Little is known, whether there are differences in the genetic equipment between clinical and commensal isolates and which factors contribute to the setup of staphylococci in the hospital environment. The results of the presented work show that the ability to form biofilms is an essential feature of pathogenic staphylococci. The expression of this virulence factor is highly variable and depends on the presence of the ica operon which is responsible for biofilm formation, specific environmental factors and the influence of insertion sequences. In an epidemiological investigation, it was shown that the ica operon in S. epidermidis is more often present in clinical strains than in commensal ones. The predominant part of these ica-positive strains formed phenotypically a biofilm. In contrast, all examined S. aureus contained, independent of their origin, the complete ica gene clusters, while, however, none of these strains formed a biofilm under laboratory conditions. Biofilm formation could be induced by subinhibitory concentrations of specific antibiotics or osmotic stress in 30 percent of the S. aureus strains. Also, biofilm formation could be stimulated in ica-positive S. epidermidis strains through these environmental factors. The study also revealed that there is an association between biofilm formation, antibiotic resistance and the occurrence of the insertion sequence IS256. Thus, IS256 was significantly more often detected in clinical S. epidermidis and S. aureus strains, while there was no difference in the occurrence of IS257 between clinical and saprophytic isolates. Most of the IS256-positive S. epidermidis strains carried the ica operon and were simultaneously resistant against at least two antibiotics. Furthermore, it was shown that IS256 is involved in phase variation of biofilm formation in vivo. In case of a clinical S. epidermidis strain that was isolated from a patient with a catheter-associated urinary tract infection, the insertion of the element in the icaC gene was detected resulting in a biofilm-negative phenotype. Subcultivation of the insertion mutant resulted in biofilm-forming variants after a few passages. Nucleotide sequencing indicated the complete excision of IS256 from the icaC gene including the duplicated target site sequence of seven base pairs. These data are in agreement with the results received in a recent in vitro study and show that IS256 has an influence on the ica-expression during an infection. In this study, phase variation of biofilm formation was also shown in S. aureus. After serial passages, several biofilm producers were derived from formerly biofilm-negative single colonies which could also revert to the biofilm-negative phenotype again. DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis showed that in the variants large DNA-rearrangements took place. In addition to the variable biofilm production, differences in the expression of the alternative transcription factor SigmaB were observed in the variants. Nucleotide sequencing of the sigB system indicated several point mutations in the SigB regulatory genes rsbU and rsbW of the variants. This implies that the SigB gene locus is subject to a strong genetic variability that results, in turn, in pleiotropic effects on gene expression in S. aureus. However, Northern blot analysis revealed that the biofilm formation in the S. aureus variants are not associated with the varying SigB expression. KW - Staphylococcus aureus KW - Staphylococcus epidermis KW - Biofilm KW - Molekulargenetik KW - Staphylokokken KW - nosokomiale Infektionen KW - Biofilmbildung KW - ica-Operon KW - Insertionssequenzen KW - Phasenvariation KW - Regulatorgene KW - staphylococci KW - nosocomial infections KW - biofilm formation KW - ica Operon KW - insertion sequences KW - phase variation KW - regulator genes Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181296 ER - TY - THES A1 - Kalk, Andreas T1 - Die Dezentralisierung im Gesundheitswesen Kolumbiens und Brasiliens und ihre Auswirkungen auf die Leprakontrolle T1 - The decentralization of the health system in Colombia and Brazil and its impact on leprosy control N2 - Pläne zur Dezentralsierung sind ein integrierter Bestandteil der Gesundheitssektorreform in einer zunehmenden Anzahl von Ländern. Die Fähigkeit derartiger Reformen, die Qualität und Effizienz des Gesundheitssystem zu verbessern, ist nur durch begrenzte wissenschaftliche Evidenz untermauert. Diese Studie beabsichtigt die Auswirkungen der Dezentralisierung auf ein spezielles Feld der Seuchenkontrolle, die Leprakontrolle, in Kolumbien und Brasilien zu untersuchen. Sie analysiert die zuzuordnende Gesetzgebung, epidemiologische Indikatoren und lokale Publikationen. Zudem wurden 39 semi-strukturierte Interviews mit Schlüsselinformanten durchgeführt. In beiden Ländern stellte die Devolution der technischen Verantwortlichkeit und der finanziellen Ressourcen die implementierte Form der Dezentralisierung dar. Der Zugang zu präventiven und kurativen Diensten wie auch die Einbindung der Bevölkerung in Entscheidungsprozesse verbesserten sich nur in Brasilien eindeutig. Die Dezentralisierung zu privaten Gesundheitsdiensten in Kolumbien hatte zweifelhafte Auswirkungen auf die Qualität der Leistungen und mehr noch auf die öffentliche Gesundheitsvorsorge (Public Health). Der Finanzfluss (einschließlich der Finanzadquisition durch staatliche Steuern statt durch Versicherungsgesellschaften) schien in Brasilien besser kontrolliert zu sein. Leprakontrolle in Brasilien profitierte von der Dezentralisierung, in Kolumbien nahm sie massiven Schaden. N2 - Decentralization policies are an integrated component of health sector reform in an increasing number of countries. The ability of such policies to improve the health system’s quality and efficiency is backed up by limited scientific evidence. This study intends to evaluate the impact of decentralization on a specialized field of disease control (leprosy control) in Colombia and Brazil. It analyzes the respective juridical base, epidemiological indicators and local publications. Furthermore, 39 semi-structured interviews with key informants were conducted. In both countries, the devolution of technical responsibility and financial resources to the municipalities was the implemented form of decentralization. Access to preventive and curative health care and the community participation in decision-making improved clearly only in Brazil. The decentralization to private providers in Colombia had dubious effects on service quality in general and still more on Public Health. The flow of finances (including finance collection through state-owned taxes instead of insurance companies) seemed to be better controlled in Brazil. Leprosy control in Brazil took advantage of the decentralization process; in Colombia, it came close to a collapse. KW - Dezentralisierung KW - Lepra KW - Gesundheitssektorreform KW - Privatisierung KW - Seuchenkontrolle KW - decentralization KW - leprosy KW - health sector reform KW - privatization KW - disease control Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-828 ER - TY - THES A1 - Maldeghem, Jeannette ¬von¬ T1 - Charakterisierung und Antibiotika-Resistenzprofil von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli Isolaten von Patienten und Ausscheidern T1 - Antimicrobial Resistance of Shiga Toxin-producing Escherichia coli O157 and non-O157 Strains isolated from Patients and Healthy Subjects N2 - Einhundertvierundvierzig STEC-Stämme von Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom (68 Stämme), von Durchfallpatienten (42 Stämme) und von asymptomatischen Ausscheidern (44 Stämme) wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Antibiotika-empfindlichkeit hin untersucht. Zu den insgesamt 13 getesteten Antibiotika zählten die ß-Laktam Antibiotika Ampicillin, Piperacillin, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefotiam und Imipenem, die Aminoglykoside Gentamicin und Streptomycin, die Gyrasehemmer Ofloxacin und Ciprofloxacin sowie Tetracyclin, Chlorampenicol und die Sulfamethoxazol/Trimethoprim-Kombination Cotrimoxazol. Alle E. coli O157 Stämme, die von Patienten mit HUS isoliert wurden, waren sensibel gegen die getesteten Antibiotika. Lediglich ein E. coli O157 Stamm, der von einem Durchfall-Patienten isoliert wurde, zeigte eine Resistenz gegen Tetracyclin. Allgemein häufiger wurden Antibiotikaresistenzen bei non-O157 Stämmen gefunden. Fünf von 22 non-O157 Stämmen, die von HUS-Patienten isolierten wurden, zeigten mindestens eine Resistenz gegen die getesteten Antibiotika. Vierzehn von fünfunddreißig non-O157 E. coli Stämmen, die sowohl von Durchfall-Patienten als auch von asymptomatischen Ausscheidern stammten, konnten sowohl Einfachresistenzen als auch Multiresistenzen aufweisen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) zeigte, daß alle resistente Stämme einen extrem hohen Resistenzstatus besitzen. Sowohl ß-Laktam als auch Tetracyclin Resistenzen konnten mittels Konjugation auf einen E. coli-Laborstamm übertragen werden. Dies läßt die Anwesenheit von R-Plasmiden vermuten. Die Tatsache, daß über 12 Prozent Shigatoxin produzierender E. coli Stämme aus humanen Stuhlproben Antibiotikaresistenzen aufweisen, hat klinische und epidemiologische Bedeutung. Resistente STEC-Stämme hätten einen selektiven Vorteil gegenüber anderen koliformen Bakterien in Mastbetrieben, die Antibiotika dem Futtermittel beimengen. Hieraus wiederum steigt die Gefahr einer potentiellen Übertragung resistenter Pathogene auf den Menschen. Auf der anderen Seite könnte die ansteigende Anzahl Antibiotika-resistenter Stämme zu einer rasch durchführbaren epidemiologischen Nachweismethode führen. N2 - The resistance to antibiotics of 144 Shiga Toxin-producing E. coli (STEC) strains isolated from patients with haemolytic-uremic syndrome (HUS) (68 strains), diarrhoea (42 strains) and from healthy subjects (44 strains) was examined using ampicillin, piperacillin, cefotaxime, ceftazidime, gentamicin, tetracycline, trimethoprimsulfamethoxazole, ofloxacin, ciprofloxacin, chloramphenicol, imipenem and streptomycin and resistant strains were characterised. All E. coli O157 isolates from patients with HUS were sensitive to the antibiotics tested. Only one E. coli O157 strain, obtained from patient with diarrhoea, was resistant against tetracycline. However, resistance in non-O157 strans occurred more frequently. 5 of 22 non-O157 strains from HUS-patients were resistant to between one and six of the antibiotics tested. Fourteen of 35 non-O157 strains from patients with diarrhoea and healthy individuals were also resistant against at least one of the antibiotics tested. Determination of minimal inhibitory concentrations (MIC) revealed that all strains expressed highly resistance phenotypes. ß-Lactam and tetracycline resistance phenotypes could be transferred by conjugation to E. coli laboratory strains, suggesting the presence of R-plasmids in STEC. The observation that > 12 per cent of STEC strains in human stool samples are resistant to antibiotics has clinical and epidemiological implications. KW - STEC KW - Antibiotika KW - Resistenzen KW - STEC KW - Antibiotics KW - Resistance Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181990 ER - TY - THES A1 - Kemmer, Gabriele T1 - Charakterisierung der initialen Aufnahme des Kofaktors V (NAD) bei Haemophilus influenzae T1 - Characterization of the initial uptake of the cofactor V (NAD) in Haemophilus influenzae N2 - H. influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium und wird in die Familie der Pasteurellacaea eingeordnet. Das Bakterium zeigt Auxotrophien für Hämin unter aeroben Bedingungen und für Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bei aeroben wie anaeroben Wachstum. Es können zwei Unterarten unterschieden werden: die bekapselten Stämme, die systemische Erkrankungen hervorrufen und die unbekapselten bzw. nicht-typisierbaren Stämme, die für Oberflächeninfektionen verantwortlich sind. Da bei H. influenzae bisher nur wenig über die NAD-Aufnahme bekannt war, sollten in dieser Arbeit Proteine identifiziert und charakterisiert werden, die an der NAD-Aufnahme beteiligt sind. Das Außenmembranprotein e(P4), kodiert von dem hel-Gen, wurde als eine Komponente des Häminaufnahmesystems beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine hel-Deletionsmutante hergestellt, anhand der nachgewiesen wurde, daß e(P4) als saure Phosphatase nicht an der Hämin-, sondern an der NAD-Aufnahme beteiligt ist. Mit Hilfe von verschiedenen Phosphatase-Assays und dem Malat-Enzym-Assay konnten NADP und Nikotinamid-Mononukleotid (NMN) als physiologisch relevante Substrate identifiziert werden. Die biologische Relevanz von e(P4) für die NAD-Aufnahme wurde durch Mutantenanalyse in Wachstumstests und Transport-Assays nachgewiesen. Es wurde gezeigt, daß die hel-Deletionsmutante mit NAD und NMN ein signifikantes Wachstumsdefizit hatte und nicht fähig war, beide Nikotinamid-Nukleotid-Quellen aufzunehmen, während die Nutzung von Nikotinamid-Ribosyl (NR) keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies. Um die Frage zu klären, ob die Lokalisation von e(P4) als Lipoprotein an der Außenmembran wichtig für die NMN-Spaltung ist, wurden zwei Mutanten hergestellt, bei denen im hel-Gen der Lipidanker Cystein durch ein Glycin ausgetauscht wurde, um das Protein im Periplasma zu exprimieren. Die Periplasma-Extrakte dieser Cystein-Mutanten zeigten in Phosphatase-Assays keine Aktivität. Um zu untersuchen, ob die Phosphatase-Aktivität die einzige für die NAD-Aufnahme relevante Funktion von e(P4) ist, wurden Phosphatase-Mutanten hergestellt und charakterisiert. Sie exprimierten ein mutiertes e(P4)-Protein, das durch einen Aminosäureaustausch die Phosphatase-Aktivität verloren hatte. Es zeigte sich, daß die Phänotypen der Phosphatase-Mutanten in Bezug auf die Fähigkeit NMN zu spalten, NAD und NMN aufzunehmen und als Faktor V-Quelle zum Wachstum zu nutzen, exakt mit den Phänotypen der Deletionsmutante korrelierten. Es konnten daher keine weiteren Funktionen von e(P4) festgestellt werden. Das periplasmatische Protein NadN wurde als Pyrophosphatase beschrieben, die fähig ist, NAD zu NMN zu hydrolysieren. Weiter wurde eine 5´-Nukleotidase-Aktivität nachgewiesen, mit der NadN NMN zu NR dephosphorylieren kann. Die Relevanz von NadN für die NAD-Aufnahme wurde anhand einer nadN-Knockout-Mutante untersucht. In Wachstumskurven und Transport-Assays zeigte sich, daß die nadN-Mutante nicht fähig war, NAD aufzunehmen und zum Wachstum zu verwenden. Auch die Nutzung von NMN war bei der Mutante eingeschränkt, während mit NR als Faktor V-Substrat kein Unterschied zum Stamm Rd erkennbar war. Durch die Charakterisierung einer hel nadN-Doppelmutante konnte nachgewiesen werden, daß keine weiteren Enzyme außer e(P4) und NadN an der Prozessierung von NAD zu NR beteiligt sind. Es zeigte sich auch, daß nur NR über einen putativen Transporter ins Zytoplasma aufgenommen wird. Das Protein OmpP2 stellt ein Hauptporin der äußeren Membran dar. Durch eine ompP2-Deletionsmutante konnte mit Hilfe von Wachstumskurven und Transport-Assays nachgewiesen werden, daß NAD, NMN und NR durch diese Pore ins Periplasma diffundieren. N2 - H. influenzae is a facultativ anaerobic, Gram-negative bacterium and belongs to the familiy of Pasteurellaceae. This bacterium shows auxotrophies for hemin under aerobic conditions and for nicotinamid adenine dinucleotide (NAD) at aerobic and anaerobic growth. Two subspecies are distinguishable: the encapsulated strains, the causative agents for systemic and invasive diseases and the unencapsulated or nontypeable strains, responsible for inflammation of the respiratory tract. In H. influenzae little is known about the utilization of NAD, therefore this work was aimed to identify and characterize gene products which are involved in the uptake of NAD. The outer membrane protein e(P4), encoded by the gene hel, was described as a component of the hemin uptake system. In this work a hel deletion mutant was constructed to proof that the acid phosphatase e(P4) is not involved in the uptake of hemin but in the uptake of NAD. With the aid of different phosphatase assays and the maleic enzyme assay NADP and NMN could be identified as the physiological relevant substrates. The biological relevance of e(P4) was proofed by mutant analysis in growth tests and transport assays. It was shown that the hel deletion mutant had a significant growth deficiency with NAD and NMN and was not able to take up both nicotinamide nucleotide sources, whereas the utilization of nicotinamide ribosyl (NR) showed no difference compared to the wildtype. To address the question, wether the localization of the lipoprotein e(P4) at the outer membrane is important for the hydrolysis of NMN, two mutants were constructed which had a Cystein-Glycin replacement in the lipid anchor of the hel gene to express the protein in the periplasm. The periplasm extracts of these Cystein mutants showed no activity in phosphatase assays. To investigate wether the phosphatase acitivty of e(P4) is the only relevant function for the uptake of NAD, phosphatase mutants were constructed and characterized. They expressed a mutated e(P4) protein which had lost the phosphatase activity by an amino acid replacement. The phenotypes of the phosphatase mutants correlated exactly with the phenotype of the deletion mutant concerning the ability to cleave NMN, to take up NAD and NMN and to use them as factor V sources. The periplasmic protein NadN was described as a pyrophosphatase which is able to hydrolase NAD to NMN. Further a 5´-nucleotidase function was identified enabling NadN to dephosphorylate NMN to NR. The relevance of NadN for the utilization of NAD was investigated with a nadN knockout mutant. Growth curves and transport assays revealed that the nadN mutant was not able to take up NAD and to use it for growth. The utilization of NMN was reduced, whereas the utilization of NR showed no difference compared to the wildtype. By characterizing a hel nadN double mutant it was shown that no further enzymes than e(P4) and NadN are involved in the processing of NAD to NR and that only NR is taken up into the cytoplasm through a putativ transporter. The protein OmpP2 is the major porin of the outer membrane. Growth curves and transport assays with an ompP2 deletion mutant revealed that NAD, NMN and NR diffuse through this porin into the periplasm. KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Pyrophosphatase KW - 5`-Nukleotidase KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - pyrophosphatase KW - 5`-nucleotidase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1548 ER - TY - THES A1 - Fuchs, Sibylle Maria T1 - Untersuchungen zur Regulation von Shiga-Toxin 2 und zur Attenuierung von enterohämorrhagischen Escherichia coli T1 - Investigation of Shiga toxin 2 regulation and attenuation of enterohaemorrhagic Escherichia coli N2 - Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) gehören zu den wichtigsten der sich in jüngster Zeit verbreitenden Pathogene und verursachen die verschiedensten Durchfallerkrankungen von unblutiger Diarrhö bis zu hämorrhagischer Kolitis, oftmals unter Ausprägung von lebensbedrohlichen extraintestinalen Symptomen wie dem hämolytisch-urämischen Syndrom. Die wichtigsten Virulenzfaktoren dieser Pathogene sind Shiga-Toxine (Stx) und Faktoren, die an der Ausprägung der sog. "attaching and effacing"-Läsionen auf Darmepithelzellen beteiligt sind. Vor allem Kinder und ältere Menschen sind von den Infektionen, die häufig in Form von Ausbrüchen auftreten, betroffen. Die Übertragung erfolgt meist über fäkal kontaminierte Nahrungsmittel. Da die Behandlung von EHEC-Infektionen mit manchen Antibiotika die Entwicklung der extraintestinalen Symptome noch verstärken kann, wäre die Impfung gefährdeter Personen der beste Weg für die Bekämpfung dieser Erreger. Eine weitere Möglichkeit der Prävention wäre die Eradikation dieser Organismen in ihren asymptomatischen Wirten, über die EHEC in die menschliche Nahrungskette gelangen können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war unter anderem die Etablierung der Grundlagen für einen Lebendvakzinstamm zur Prävention von EHEC-Infektionen. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Strategien mit dem Ziel verfolgt, einen Stx2-produzierenden EHEC-Stamm zu attenuieren. Eine Attenuierungsstrategie für EHEC ist die direkte Ausschaltung von Virulenzfaktor-Strukturgenen wie den Toxingenen. Zu diesem Zweck wurde eine stx2-negative Mutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 durch eine Deletion im Zentrum des stx2-Genclusters konstruiert, was zur Fusion der 154 N-terminalen Aminosäuren von StxA2 mit den 62 C-terminalen Aminosäuren von StxB2 führte. Die Charakterisierung der Mutante zeigte, daß der Toxin-konvertierende Bakteriophage noch intakt war. Das Fusionsprotein hatte seine zytotoxische Aktivität zwar vollständig verloren, konnte jedoch durch Stx2-spezifisches Schweineantiserum detektiert werden. Daraus wurde geschlossen, daß das mutierte Protein einen Teil seiner antigenen Strukturen behalten hatte und daß es potentiell für die Impfung gegen Stx2-spezifische Schädigungen verwendet werden könnte. Eine weitere Strategie mit dem Ziel der Attenuierung von EHEC-Stämmen war die Deletion von Genen, die in die Regulation von Virulenzfaktoren involviert sind. Auf diese Weise sollte die Expression von Pathogenitätsfaktoren verhindert werden. Als erstes wurde versucht, einen postulierten bakteriophagenkodierten toxinspezifischen Regulator zu identifizieren und zu charaktierisieren, der die Fähigkeit besaß, die Expression eines stx2-spezifischen Reportergens nach der Induktion des Phagen zu steigern. Eine Transposonmutagenese des Stx2-konvertierenden Phagen 933W ergab verschiedene Phagenmutanten mit veränderter Expression des Reportergens nach Induktion des Phagen. Die Expressionsveränderung korrelierte nur bedingt mit der Veränderung der Produktion von Toxin oder Phagenpartikeln. Das Transposon der am stärksten in ihrer Reportergenexpression reduzierten Mutante war im ORF L0065 inseriert, der unmittelbar "upstream" von den Phagengenen int/xis lokalisiert ist. Der klonierte wildtypische ORF war nicht in der Lage, die Transposonmutante in trans zu komplementieren. Daraus wurde geschlossen, daß der Phänotyp der Mutante durch einen polaren Effekt des Transposons auf int/xis bedingt sein könnte, da eine reduzierte Phagengenomexcision eine Verminderung der Phageninduktion verursachen würde, was sich entsprechend auf die Reportergenexpression auswirken könnte. Neely et al. (1998) identifizierten den Phagen-Antiterminator Q als einen möglichen Kandidaten für den postulierten phagenkodierten stx2-Regulator. Eine Deletion dieses zentralen Phagenregulators könnte durch die Störung der regulären Phagenfunktionen zur Attenuierung von EHEC beitragen. Als zweites wurde in einem Projekt von Dr. I. Mühldorfer anhand von recA-negativen Mutanten der EHEC-Stämme O157:H7 86-24 und EDL933 in verschiedenen Mäusemodellen demonstriert, daß die Deletion von recA einen massiven Virulenzverlust und damit eine Attenuierung der Stämme zur Folge hatte. Die dadurch bedingte drastische Reduktion der Toxinproduktion konnte indirekt auf das Fehlen von recA zurückgeführt werden. Im Gegensatz dazu veränderte die Deletion von recA im UPEC-Stamm O6:K15:H31 536 die Virulenz dieses Stammes nicht. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Auswertung der Ergebnisse der Virulenztests. Die Deletion von recA ist außerdem eine wichtige Sicherheitsmaßnahme für eine Prävention der Integration von Fremd-DNA in Lebendvakzine und damit für die Verhinderung der Reversion dieser Stämme zur Pathogenität. Als drittes wurden die Auswirkungen der Deletion des Gens leuX, das für die seltenere Leucin-spezifische tRNA5Leu kodiert, auf die Expression von EHEC-Virulenzfaktoren anhand einer leuX-Deletionsmutante des EHEC-Stammes O157:H7 86-24 untersucht. Die Deletion dieser tRNA im UPEC-Stamm 536 führt wegen der dadurch reduzierten Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu einer Attenuierung des Stammes. Es wurde gezeigt, daß wie in UPEC auch in EHEC die Produktion von Flagellen und Enterobaktin beeinträchtigt war. Zusätzlich war die Häminverwertung reduziert. Außerdem verminderte die Deletion von leuX die Expression nicht-identifizierter Proteine der äußeren und inneren Membran sowie eines mit Typ 1-Fimbrien-spezifischem Serum kreuzreaktiven Antigens. Im Gegensatz dazu wurden die Stx2-Produktion sowie die in vivo-Virulenz des Stammes in Mäusen nicht beeinflußt. Die Enterohämolyse sowie die Expression von Intimin waren verstärkt. Die Expression der typischen EHEC-Virulenzfaktoren war demnach in der leuX-Mutante nicht reduziert. Der Einfluß von leuX auf die Expression dieser Faktoren war offensichtlich nicht auf eine Translationsreduktion durch die fehlende Bereitstellung der tRNA beschränkt, sondern scheint weitere Mechanismen zu involvieren. Eine wirkliche Attenuierung von EHEC kann durch die Deletion von leuX wahrscheinlich nicht erzielt werden. N2 - Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are important emerging pathogens responsible for the development of diarrheal diseases, ranging from unbloody diarrhea to hemorrhagic colitis, and of life-threatening extraintestinal complications like the hemolytic-uremic syndrome. The most important virulence factors of this pathogen are the mostly phage-encoded Shiga toxins (Stx) and the factors involved in the development of so-called "attaching and effacing lesions" on gut epithelial cells. Children and the elderly are mainly affected by these infections, which often occur as outbreaks. The infections are predominantly transmitted by fecally contaminated food. The treatment of EHEC infections with some antibiotics may promote the development of extraintestinal complications. Therefore, the best way to combat this infectious agent would be the vaccination of the endangered people. Another way would be the eradication of the organism in its asymptomatic carrier animals involved in the transmission of EHEC into the human food chain. The objective of this thesis was to lay the basis for the development of a life vaccine strain for people or cattle against EHEC infections. Therefore, different strategies aiming at the attenuation of a Stx2-producing EHEC wildtype strain were followed. One strategy for the attenuation of EHEC is the direct knockout of virulence factor structural genes, like the toxin genes. Therefore, a stx2-negative mutant of the EHEC strain O157:H7 86-24 was constructed by deleting the central part of the stx2 gene cluster, leading to the fusion of the 154 N-terminal aminoacids of StxA2 with the 62 C-terminal aminoacids of StxB2. The characterisation of the mutant revealed that the toxin-converting bacteriophage was still intact, but that the fusion protein had completely lost its cytotoxic activity and that it could be detected using Stx2-specific pig antiserum. It has been concluded that the respective mutant protein had kept part of its antigenic structure and that it could potentially be used for vaccination against Stx2-specific damage. Another strategy aiming at the attenuation of EHEC-strains was the deletion of genes involved in the regulation of virulence factors in order to prevent the expression of the respective factors. Firstly, the identification and characterisation of a formerly postulated bacteriophage-encoded toxin-specific regulator which had the capability to induce the expression of a stx2-specific reporter gene after induction of the phage was attempted. A transposon-mutagenesis of the Stx2-converting phage 933W yielded a variety of phage mutants with altered expression of the reporter gene upon phage induction. Toxin production as well as the capability to produce phage particles did not correlate well with the reporter gene phenotypes. The transposon of the mutant with the lowest induction of the reporter gene was inserted into ORF L0065 located immediately upstream of the phage's int/xis genes. The cloned wildtype ORF was not able to trans-complement the transposon mutant. It was concluded that the mutant's phenotype was due to a reduced excision of the phage genome caused by a polar effect of the transposon on int/xis and therefore reduced phage induction leading to reduced reporter gene induction. Neely et al. (1998) identified the phage antiterminator Q as a possible candidate for the postulated phage-encoded stx2 regulator. The specific deletion of this general phage regulator might help to attenuate EHEC by disturbing regular phage functions. Secondly, recA-negative mutants of the EHEC-strains O157:H7 86-24 and EDL933 were examined in different mouse models as part of a project of Dr. I. Muehldorfer. It was demonstrated that the deletion of recA brought about a massive virulence loss due to a drastic reduction of toxin production, which was indirectly caused by the lack of recA. Thus, the deletion of recA attenuates pathogenic EHEC strains in the mouse model. In contrast, the deletion of recA in UPEC strain O6:K15:H31 536 did not alter the virulence of this strain. The analysis of the revealed virulence data was performed as part of this thesis. In addition, the deletion of recA is an important safety measurement for preventing the integration of foreign DNA into attenuated strains and thus, it helps preventing reversion of the vaccine to pathogenicity. Thirdly, the consequences of a deletion of the gene leuX coding for the minor Leucin specific tRNA5Leu on the expression of virulence factors in EHEC were examined by the construction and characterisation of an EHEC O157:H7 86-24 leuX-deletion mutant. In UPEC strain 536, the deletion of this tRNA lead to an attenuation of this strain due to reduced expression of diverse virulence factors. It was demonstrated that in EHEC, like in UPEC, the production of flagella and enterobactin was reduced. In addition, Hemin utilisation was impaired. The deletion of leuX also diminished the expression of various proteins of the outer and inner membrane as well as of an antigen cross-reacting with serum specific for type 1-fimbriae. In contrast, it did not influence the production of Stx2 as well as the in vivo pathogenicity of the strain in mice. Enterohaemolysis and the expression of Intimin were enhanced. Thus, it was demonstrated that the typical EHEC virulence factors were not reduced in the leuX mutant. In addition, it became obvious that the impact of leuX on the expression of the respective genes is not only based on a translational reduction due to a lack of tRNA availability but seems to involve further mechanisms. We concluded that apparently, an attenuation of EHEC is not possible by the deletion of leuX. KW - EHEC KW - STEC KW - Attenuierung KW - Virulenzfaktor KW - Genexpression KW - Enterhämorrhagische Escherichia coli KW - EHEC KW - STEC KW - Shiga-Toxin 2 KW - Stx2 KW - Stx2-Mutante KW - Regulation KW - Phage KW - lysogen KW - Phageninduktion KW - Enterohaemorrhagic Escherichia coli KW - EHEC KW - STEC KW - shiga toxin 2 KW - Stx2 KW - Stx2-mutant KW - regulation KW - phage KW - lysogen KW - phage induction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1303 ER - TY - THES A1 - Goebel, Stefan T1 - Mechanismen der Toxoplasma-gondii-vermittelten Inhibierung der Apoptose in humanen Wirtszelllinien T1 - Mechanisms of Toxoplasma gondii-mediated inhibition of apoptosis in human-derived host cell lines N2 - Als obligat intrazellulärer Parasit und Erreger von lebenslang persistierenden Infektionen in Mensch und Tier dürfte Toxoplasma gondii von der Integrität seiner Wirtszelle in besonderem Maße abhängig sein. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss des Parasiten auf die Wirtszellapoptose zu untersuchen. T. gondii inhibiert die in vitro induzierte Apoptose in humanen HL-60- und U937-Zellen. Dabei muss der Parasit aktiv in die Zelle eindringen, jedoch nicht in dieser replizieren können. Er interferiert dabei mit mindestens zwei Komponenten der Apoptose-Signalkaskade: Erstens vermindert T. gondii die Herunterregulation der Mcl-1-Expression nach Apoptoseinduktion. Das führt dazu, dass trotz Apoptoseinduktion die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma inhibiert wird und daraufhin die Caspasen 9 und 3 sowie deren Substrate weniger stark aktiviert werden. Zweitens wird die Expression der Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) durch T. gondii inhibiert. Beide Mechanismen könnten an der Inhibierung der Wirtszellapoptose durch T. gondii beteiligt sein und dem Parasiten damit sein intrazelluläres Überleben sichern. N2 - As an obligate intracellular parasite that causes persistent infections in humans and animals Toxoplasma gondii may rely on the integrity of its host cells. We investigated the effect of the parasite on host cell apoptosis. T. gondii inhibits the in vitro induced apoptosis in human-derived HL-60 and U937 cells. For this effect it is necessary that the parasite is able to invade its host cell actively but not to replicate. T. gondii interferes with at least two different components of the apoptosis-inducing signaling cascade: Firstly, it partially abrogates the down-regulation of Mcl-1 expression after induction of apoptosis. As a result, the translocation of cytochrome c from the mitochondria into the cytoplasm is inhibited and the activiation of caspases 9 and 3 and their substrates is diminished. Secondly, the expression of poly (ADP-ribose)polymerase (PARP) is down-regulated by the parasite. Both mechanisms may contribute to the inhibition of host cell apoptosis by T. gondii and may facilitate intracellular survival of the parasite. KW - Toxoplasmase gondii KW - Apoptosis KW - Molekularbiologie KW - Toxoplasma gondii KW - Apoptose KW - Poly-(ADP-Ribose)Polymerase KW - Mcl-1 KW - Parasit KW - Signaltransduktion KW - Caspasen KW - Toxoplasma gondii KW - apoptosis KW - poly-(ADP-ribose)polymerase KW - Mcl-1 KW - parasite KW - signal transduction KW - caspases Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1325 ER - TY - THES A1 - Grimm, Dorothee T1 - Entwicklung von neuen Nachweismethoden für Legionellen und Amöben und ihre Anwendung in ökologischen Studien T1 - Development and evaluation of novel detection systems specific for legionellae and amoebae and their application in ecological studies N2 - Legionella pneumophila wurde 1976 als Erreger der Legionellose, einer schweren Form von Lungenentzündung, identifiziert. Die inzwischen 42 Arten umfassende Gattung ist weltweit in aquatischen Biotopen verbreitet. Die Bakterien leben vergesellschaftet mit anderen Mikroorganismen in Biofilmen oder intrazellulär in Protozoen. Sie haben ein duales Wirtssystem, das heißt, sie sind in der Lage, sich sowohl in Einzellern als auch in humanen Phagozyten zu vermehren. Für die Erweiterung ihrer Habitate spielen verschiedene Umweltfaktoren eine Rolle. Eine exakte und schnelle Detektion und Identifikation der humanpathogenen Keime ist sowohl für die Lokalisierung der Infektionsquelle als auch für eine rechtzeitige Therapie der Patienten von großer Bedeutung. Die Technik der fluoreszierenden in situ Hybridisierung (FISH) basiert auf der Bindung einer spezifischen, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Oligonukleotidsonde an eine komplementäre Zielsequenz der ribosomalen RNA. In der vorliegenden Arbeit wurde für die in situ Hybridisierung eine neue 16S rRNA-gerichtete Sonde LEGPNE1 entwickelt, die spezifisch ist für L. pneumophila. In Versuchsreihen mit verschiedenen Bakterienkulturen wurden die Spezifität und Sensitivität der Gensonde ermittelt. LEGPNE1 erwies sich als artspezifisch und erkannte alle getesteten L. pneumophila-Stämme, ungeachtet ihrer Serogruppe. Nicht-pneumophila-Referenzstämme hybridisierten nicht mit der Sonde, ein einziger Basenaus-tausch in der Sequenz war für diese Unterscheidung ausreichend. Die Anwendung der Sonde wurde auch in Amöben-Infektionsassays und Umweltproben erfolgreich durchgeführt. Unterschiedliche, intrazellulär vorliegende Bakterien wurden von der Sonde spezifisch erkannt. Eine in situ Dokumentation der Infektions- und Vermehrungsrate war damit möglich. Durch die meist fakultativ intrazelluläre Lebensweise der Legionellen ist es wichtig, auch die Wirtszellen der Keime qualitativ zu detektieren und zu identifizieren. Die Entwicklung neuer Gensonden wurde daher auf die beiden bekannten Wirtsamöben Hartmannella und Naegleria ausgedehnt. Basierend auf Sequenzvergleichen wurden die gattungsspezifischen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konstruiert und in Versuchsreihen mit Referenzstämmen bei steigender Stringenz etabliert. Mit ihrer Hilfe konnten die Ergebnisse der zeit- und arbeitsaufwendigen Determination unbekannter Amöben anhand morphologischer Merkmale bestätigt werden. In situ Hybridisierungen mit einer Kombination von 16S und 18S rRNA-gerichteten Sonden wurden in Amöben-Infektionsassays mit Hartmannella vermiformis und L. pneumophila erfolgreich durchgeführt. Eine Interferenz der Sonden fand nicht statt. Die in situ Untersuchung der Struktur und Funktion komplexer mikrobieller Lebensgemeinschaften erfordert eine kultivierungsunabhängige und hochauflösende Methode, wie sie die fluoreszierende in situ Hybridisierung darstellt. Mit dem Ziel, mögliche Präferenzen der Legionellen für bestimmte Parameter, wie pH, Temperatur, elektrische Leitfähigkeit, Strömungsverhältnisse, zu erkennen und zu definieren, wurden mit Hilfe der neu entwickelten 16S rRNA-gerichteten Sonde 21 verschiedene Kaltwasserhabitate auf die Verbreitung von Legionella untersucht. Die Bakterien zeigten jedoch ein breites Toleranzspektrum gegenüber den gemessenen Parametern. Sie waren in nahezu allen beprobten Gewässern zu finden und ließen sich unabhängig von der Jahreszeit nachweisen. Die neue Sonde LEGPNE1 zeigte sich in in situ Hybridisierungen der Umweltproben als hochspezifisch. Mit ihr konnten auch nicht kultivierbare Legionellen detektiert werden. In drei Legionella-positiven Gewässern wurde außerdem das Vorkommen von Amöben untersucht. Es konnten insgesamt acht Amöbengattungen isoliert, kultiviert und bestimmt werden. Dominierend waren Stämme des nicht humanpathogenen Naegleria gruberi-Komplexes, Echinamoeba spp. und Echinamoeba-like Amöben. In einzelnen Proben wurden Acanthamoeba spp. Gruppe II, Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata und Vexillifera spp. gefunden. Durch in situ Hybridisierung mit den neuen 18S rRNA-gerichteten Sonden HART498 und NAEG1088 konnten die Ergebnisse der morphologischen Bestimmung der Amöben bestätigt werden. Auch die Amöben zeigten keine Präferenzen bezüglich der in den Standorten gemessenen Wasserparameter. Die in situ Hybridisierung mit rRNA-gerichteten Gensonden erlaubt eine Analyse der Struktur und Dynamik von Biozönosen, ermöglicht aber keine Aussage über die speziellen Aktivitäten der nachgewiesenen Bakterien. Eine Lösung hierfür könnte der spezifische in situ Nachweis von mRNA-Molekülen darstellen. Ein Problem hierbei stellt ihre, im Vergleich zu anderen Molekülen wie rRNA, sehr kurze Halbwertszeit und das Vorhandensein von nur wenigen Kopien pro Zelle dar. Daher ist im Anschluss an die in situ Hybridisierung in den meisten Fällen eine Signalamplifikation nötig, um ein detektierbares Signal zu erhalten. In dieser Arbeit sollte die für das iap-Gen in Listeria monocytogenes entwickelte Methode zum Nachweis der mip-mRNA in L. pneumophila etabliert werden. Erste Anwendungen in Dot blot- und in situ Hybridisierungen mit mehrfach DIG-markierten Polyribonukleotidsonden bzw. mit simultan eingesetzten, einfach DIG-markierten Oligonukleotiden zeigten noch nicht die gewünschte Spezifität. Diese Ergebnisse stellen jedoch eine wichtige Grundlage für zukünftige Experimente dar. N2 - Legionella pneumophila was identified in 1976 as the causative agent of a life-threatening atypical pneumonia. Today the genus comprises about 42 species which are spread worldwide in aquatic biotopes. The bacteria live in association with other microorganisms in biofilms as well as intracellularly in protozoa. They have a dual host system which means that they are able to replicate both in protozoans and in human phagocytes. Several environmental factors are known to play a role in their distribution. The ability to quickly detect and to exactly identify these potential human pathogens is important in order to recognize reservoirs for disease as well as to treat patients in due time. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique based on the reaction of a specific oligonucleotide, labeled with a fluorescence marker, with the complementary rRNA target region. In this work a new 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe LEGPNE1 for in situ hybridization was developed, which is specific for L. pneumophila. The specificity and the sensitivity of the probe were evaluated in experiments with different bacterial cultures. LEGPNE1 was demonstrated to be highly species-specific recognizing all tested strains of L. pneumophila independently of the serogroup. Non-pneumophila reference strains did not hybridize with the probe. Only one mismatch in the sequence was shown to be sufficient for the oligonucleotide to distinguish between complementary and nearly complementary sequences. The probe was also applied successfully to infected amoebal cells and environmental samples. Different bacteria located intracellularly were recognized specifically by the probe. This allows the in situ monitoring of bacterial infection and multiplication rates in amoebae. As legionellae presumably live most of the time as intracellular parasites, it is also important to be able to detect their hosts. Therefore, the design of new probes was extended to cover two known host amoebal genera, Hartmannella and Naegleria. Based on comparative sequence analysis the genus-specific 18S rRNA-targeted probes HART498 and NAEG1088 were constructed. Subsequently they were tested in hybridization series with different reference strains and gradually increasing stringency. Amoebal strains which had been identified previously based on their morphological features could be reconfirmed using in situ hybridization with these new oligonucleotides. In situ hybridization experiments of infection assays with Hartmannella vermiformis and Legionella pneumophila using a combination of 16S and 18S rRNA-targeted probes were done successfully. Interference of the probes with the results of the tests was not observed. For the analysis of the composition of complex microbial communities a culture-independent and highly specific method is required. This can be achieved by the fluorescence in situ hybridization. In order to determine potential preferences of legionellae for water parameters such as pH, temperature, conductivity, or water current, twenty-one different cold water habitats were examined for the presence of Legionella using the newly designed 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe. The bacteria were shown to be able to tolerate a broad range of the measured parameters. They could be found in nearly all of the habitats investigated independent of the season. The new probe LEGPNE1 was proved to detect L. pneumophila in environmental samples highly specifically, even if the cells were in a nonculturable state. Three Legionella-positive sampling sites were examined for the presence of amoebae. Using traditional culture methods followed by morphological determination, eight amoebal genera could be isolated and identified. Most abundant were strains of the apathogenic Naegleria gruberi-complex, Echinamoeba spp. and Echinamoeba-like amoebae. Other species including Acanthamoeba spp. (sequence type II), Hartmannella spp., Platyamoeba placida, Saccamoeba spp., Thecamoeba quadrilineata and Vexillifera spp. were found sporadically. In situ hybridization experiments using the new 18S rRNA-targeted oligonucleotide probes HART498 and NAEG1088 confirmed the determinations done by morphological criteria. Concomitant analysis of selected water parameters revealed no preference of the protozoa for certain environmental conditions. In situ hybridization with rRNA-targeted oligonucleotide probes is a powerful tool to analyze structure and dynamics in biocenosis. However, this technique does not provide much information about the in situ function of the detected bacteria. The specific in situ detection of mRNA molecules allows to narrow this gap. One problem in the application of this method is the instability and low copy number of mRNA in each cell compared to other molecules like rRNA. Therefore, a signal amplification posterior to the in situ hybridization is required in most cases in order to generate a detectable signal. In this work the detection of the mRNA of mip in L. pneumophila was to be established using a protocol developed for the detection of iap in Listeria monocytogenes. However, first applications of dot blot and in situ hybridizations using DIG-conjugated polyribonucleotide probes and several DIG-labeled oligonucleotides applied simultaneously did not show the neccessary specificity. This technical approach will be essential for further experiments in this field of research. KW - Legionella pneumophila KW - Freilebende Amöben KW - Nachweis KW - Ökosystem KW - Legionella pneumophila KW - freilebende Süßwasseramöben KW - Nachweis KW - Bestimmung KW - 16S rRNA KW - 18SrRNA KW - fluoreszierende in situ Hybridisierung KW - Legionella pneumophila KW - free-living freshwater amoebae KW - detection KW - identification KW - 16S rRNA KW - 18SrRNA KW - fluorescence in situ hybridization Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1351 ER - TY - THES A1 - Nesper, Jutta M. T1 - Charakterisierung von spontan phagenresistenten Vibrio cholerae O1 El Tor Mutanten T1 - Charakterization of spontaneous phageresistant Vibrio cholerae O1 El Tor mutants N2 - Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberflächenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zusätzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Moleküle synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unverändertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgewählte spontan phagenresistente Stämme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen Stämme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit verändertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das für die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich für die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber verändertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeinträchtigt waren. Zusätzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zusätzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Phänotyp an abiotischen Oberflächen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose für die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen Mäusen ergaben, daß O-Antigen negative Stämme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im Dünndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte für den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zusätzlich wurde die Überlebensfähigkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen Dünndarm vorkommen, unter „in vitro“ Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegenüber schwachen organischen Säuren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallensäuren. O-Antigen negative Stämme waren dagegen weiterhin resistent gegenüber Gallensäuren und schwachen organischen Säuren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde für keine der LPS-Mutanten eine größere Beeinträchtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilität, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der äußeren Membran war offensichtlich nicht beeinträchtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verstärktem Maße periplasmatische Proteine in den Überstand diffundieren können. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur für eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund dafür ist höchstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen äußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des Dünndarms ermöglicht. N2 - Vibrio cholerae is a Gram-negative, facultative pathogen and is the causative agent of cholera. In this study the adsorption site of the temperate phage K139 on the bacterial cell surface was determined. Phage-binding studies with purified lipopolysaccharide (LPS) showed that the O-antigen of the serogroup O1 serves as the phage receptor. In addition, phage resistant mutants of the O1 El Tor Inaba strain P27459 were screened by using a virulent isolate of phage K139. Analysis of the LPS by PAGE migration patterns revealed that most of the spontaneous mutants synthesize incomplete LPS molecules, either composed of defective O-antigen or core oligosaccharide. Phage resistent isolates with apparently normal LPS form either translucent or opaque colonies. The genetic nature of spontaneous phage resistant strains was investigated. O-antigen negative strains were investigated by Southern hybridization with probes specific for the well known O1-antigen biosynthesis cluster (rfb). Two of the investigated O-antigen negative mutants revealed insertions of element IS1004 into the rfb-gene cluster. Spontaneous phage resistant R-LPS mutants were found to synthesize an altered core without attached O-antigen. This type of mutants are most likely affected in the core oligosaccharide biosynthesis gene cluster (waa), which was identified by searching the V. cholerae genomic database. waaF, encoding heptosyl-II-transferase, was inactivated and the LPS was found to have the same migration behaviour in PAA gels than two spontaneous mutants. However, in contrast to the constructed waaF mutant complementation with waaF in trans restored only the core oligosaccharide but not the O-antigen synthesis in the spontaneous mutants. Further analysis revealed that one mutant had a deletion of 546 bp affecting waaF and waaL, the latter is thought to encode the putative O-antigen-ligase. Spontaneous mutants with intact O-antigen but altered core oligosaccharide were identified as galU mutants, which were also affected in the galactose catabolism. Other gal genes, galE and galK, were inactivated and these mutants were also found to be defective in the catabolism of exogenous galactose but synthesized an apparently normal LPS. Additionally, galU and galE mutants were found to lyse in the presence of high galactose concentrations. Furthermore the role of galU and galE in biofilm formation was investigated. In contrast to the spontaneous phage resistant opaque colony variant the translucent wt-strain was unable to form a biofilm, therefore the galE and galU mutations were also introduced into the opaque colony variant. galU and galE mutants of the opaque strain were translucent and unable to form a biofilm on abiotic surfaces, suggesting that the synthesis of UDP-galactose, via UDP-glucose, is essential for the biosynthesis of the exopolysaccharide. Virulence studies in infant mice indicated that O-antigen negative mutants, galU and R-LPS mutants but not galE and galEK mutants were defective in colonization of the mouse small intestine, excluding any toxic galactose effects in the gut. By investigating the sensitivity to several substances known to be present in the intestine „in vitro“, it was shown that galU and R-LPS mutants were more sensitive to weak organic acids, cationic antimicrobial peptides, the complement system and bile salts. O-antigen negative strains were found to be sensitive against gut-associated bacteriocidal substances, but they displayed significant resistance to bile salts and organic acids. No gross change in other virulence determinants such as motility, synthesis of pili TCP, choleratoxin production or outer-membrane proteins has yet been found for any of the LPS mutants. However, some periplasmic leakage for galU and significant leakage for R-LPS mutants was observed. These results suggest that not only the O-antigen, as already known, but also a specific core oligosaccharide architecture seems to be required for V. cholerae colonization, most probably in providing resistance against bacteriocidal substances. KW - Vibrio cholerae KW - Resistenz KW - Bakteriophagen KW - Vibrio cholerae KW - LPS KW - Virulenz KW - Biofilmbildung KW - Vibrio cholerae KW - LPS KW - virulence KW - biofilmformation Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1747 ER - TY - THES A1 - Köhler, Rolf T1 - Entwicklung eines GFP-Reportersystems in Legionella und molekularbiologische Funktionsanalyse des Legionella Mip-Proteins T1 - Development of a GFP-Reportersystems in Legionella and molecular analysis of the Legionella Mip-protein N2 - Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist. N2 - The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila was first identified in 1977 as the etiologic agent of legionellosis, a severe and atypical pneumonia. It possesses a dual host system which allows the bacteria to replicate in protozoa in aquatic habitats as well as a pathogen in human phagocytic cells. In order to analyze the complex interaction of the bacterial pathogen and its host cells, in this thesis a new GFP reporter system was established and sussessfully evaluated. It is now possible to monitor a Legionella infection in vivo and to quantify bacterial invasion influenced by different factors in a more convenient way. To analyze GFP expression in Legionella a transcriptional fusion of the gfpmut2 gene with the Legionella-specific mip (macrophage infectivity potentiator) promoter was constructed. In addition, a vector habouring the sod (super oxid dimutase) promoter derived from Listeria monocytogenes was used. Following transformation into Legionella strains strong GFP-mediated fluorescence was detected confirming the functionality of GFP in Legionella for the first time. Using fluorescence microscopy, spectrofluorimetry and flow cytometry (FACS-analysis) the strains were examined regarding differences in virulence and intracellular replication. Re-confirming results from earlier studies obtained by using enumeration of CFU values showed the validity of the method. Quantification of the mip promoter activity revealed a constitutively expression, this indicates that differences in Legionella virulene are not due to variations in mip promoter activity. Moreover, the influence of different phagocytosis inhibitors on Legionella uptake into the protozoan hosts Acanthamoeba castellanii and Hartmannella vermiformis using the GFP reporter system was examined. Application of cytochalasin D had no influence on bacterial uptake in A. castellanii and H. vermiformis suggesting in microfilament-independent mechanism. Phagocytosis in H. vermiformis is mainly accomplished using receptor-mediated phagocytosis as it was evident from inhibition studies with cycloheximide and methylamine. In contrast, phagocytosis in A. castellanii is mediated by other receptors or additional mechanisms are available. This results confirm the proposed heterogeneity of uptake mechanisms by different protozoan hosts. After L. pneumophila is phagocytosed the endosomal pathway of phagosome maturation is blocked, by means of secreted but as yet unidentified effector molecules. To study a putative protein translocation C-terminal Mip::GFP fusion proteins were constructed. The stability of the proteins was rather weak which is likely due to the dimeric conformational state of the Mip protein. In addition, transport over the cytoplasmic membran was not accomplished. Therefore the fusion proteins proved not to be useful for examine translocational events. Because of the unknown in vivo function of bacterial PPIases the focus in the the second part of this work was to identify a putative interaction partner of the Mip protein and to elucidate the influence of dimerization and PPIase activity on Legionella's virulence. Using cross linking experiments a putative interaction partner could be detected. N-terminal sequencing revealed no homology to already known Legionella or other proteins. N-terminal blockade of the putative partner molecule may be the cause that hampered sequence identification. It has been shown that the isomerase activity of the Legionella Mip protein is not necessary for invasion and intracellular survival in protozoan, monocytes and U937 macrophages. Additional features of the protein are its homodimeric conformational state and the assoziation with the outer membrane. In cooperation with the group of Prof. Dr. G. Fischer in Halle a N-terminal truncated (aa 4-79) dimerization-deficient Mip protein (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) was constructed and biochemically characterized. Using site specific mutagenesis participation of the N-terminal located amino acids (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) in the dimerization of the Mip protein was confirmed. To analyze the influence on pathogenicity of the dimeric state of the Mip protein a mip negative strain was complemented by providing the gene encoding the monomeric Mip (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) in cis. The proper integration and protein expression was confirmed. The results demonstrate that the isomerase activity is dispensable for intracellular growth in protozoan hosts. Moreover, the results clearly demonstrated that dimerization and not the isomearse activity are essential for virulence of Legionella in a monocellular system. In contrast, it could be shown that the isomerase activity is necessary for full virulence in the animal model (guinea pigs). The loss of the isomerase avtivity have a more dramatic impact on the intracellular survival of Legionella compared to the monocellular system (A. castellanii). Moreover, Legionella strains replicated intracellulary dependent on their remaining in vitro isomerase activity. Using the monomeric Mip expressing strain L.p.JR32-2.4 it could be demonstrated that dimerization also plays a role in the animal model. This work provides evidence for a different role of the isomerase activity of the Mip protein in monocellular systems and during the infection of higher organisms. KW - Legionella pneumophila KW - Bakterielle Infektion KW - Grün fluoreszierendes Protein KW - In vivo KW - Legionella pneumophila KW - GFP-Reportergen KW - in vivo Monitoring KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - FACS-Analyse KW - MIP KW - PPIasen KW - Dimerisierung KW - Legionella pneumophila KW - GFP-reportersystem KW - in vivo monitoring KW - fluorescence microscopy KW - FACS-analysis KW - Mip KW - PPIases KW - dimerization Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1594 ER - TY - THES A1 - Dietrich, Claudia T1 - Molekularbiologische Studien zur Bedeutung der Flagelle für die Virulenz von Legionella pneumophila T1 - Molecular studies of flagellar function in Legionella pneumophila virulence N2 - Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein fakultativ intrazelluläres, ubiquitär vorkommendes Umweltbakterium. Die Rolle, die Flagelle und Motilität der Legionellen bei der Infektion von Protozoen oder humanen Zellen spielen können, ist bisher noch nicht geklärt. Um etwas über noch unbekannte Flagellengene und deren Organisation in Legionella zu erfahren, wurde mit Hilfe einer Cosmid-Genbank des Stammes L. pneumophila Philadelphia I die flaA-Region näher charakterisiert. Im 5´-Bereich von flaA konnten auf dem Gegenstrang zwei Stoffwechselgene (accD und folC) identifiziert werden, im 3´-Bereich schliessen sich die Flagellengene flaG, fliD und fliS, sowie zwei offene Leseraster mit Homologien zu den erst kürzlich bei Legionella beschriebenen Genen enhA und milA an. Zur Untersuchung des Einflusses der Flagelle auf den Infektionsverlauf wurde die flaA-negative Mutante KH3, bei der das flaA-Gen durch Insertion einer Kanamycin-Kassette unterbrochen worden war, wieder komplementiert. Dies gelang durch Reintegration des intakten flaA-Gens mit Hilfe des „Suicide“-Vektors pMSS704 in das Chromosom von KH3, wodurch Stamm CD10 entstand. Durch Westernblot-Analyse konnte gezeigt werden, dass der Stamm wieder in der Lage war, Flagellin zu exprimieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigten außerdem das Vorhandensein intakter Flagellen. Das Verhalten von flagellierten und nicht flagellierten Legionellen bei der Infektion von Wirtszellen wurde hinsichtlich Auffinden, Adhärenz, Invasion, intrazellulärer Vermehrung und Lyse der Zellen untersucht. Als Wirtszellen wurden sowohl Protozoen (Acanthamoeba castellanii), als auch humane Zellen (HL-60 Zellen und frisch isolierte Blutmonozyten) verwendet. Dabei wurde deutlich, dass die Flagelle für das Erreichen der Wirtszellen eine wichtige Funktion hat. Wurde der Motilitätsdefekt der flaA-Mutanten durch Zentrifugation auf die Zielzellen aufgehoben, so konnten mit den gewählten Versuchsbedingungen bezüglich des Adhärenzvermögens der Stämme keine Unterschiede detektiert werden. Es wurde jedoch eine signifikante Reduktion der Invasionseffizienz für die nicht flagellierten Legionellen beobachtet. Diese war bei den humanen Zellen besonders ausgeprägt. Hinsichtlich der intrazellulären Vermehrung konnte keine Attenuierung der Mutante festgestellt werden. Allerdings führte vermutlich die Reduktion der Invasivität zu einer geringeren Ausbreitungsgeschwindigkeit im HL-60 Modell, die bei niedriger Infektionsdosis mit einer verlangsamten Wachstumsrate der Bakterien einherging. Durch Sequenzierung des Genbank-Cosmids 12/44, auf welchem die Gene fliA und motA lokalisiert waren, konnten im „upstream“-Bereich von fliA zwei putative Flagellenregulatorgene identifiziert werden (motR und flhF). Im 3´-Bereich von motA schließt sich, um 26 bp überlappend, das Gen motB an, welches für den Motor der Flagelle eine Rolle spielt, gefolgt von einem Leseraster unbekannter Funktion und einem ORF mit Homologien zu prfB. Durch Insertion einer Kanamycin-Kassette in das motA-Gen von L. pneumophila Corby konnte in dieser Arbeit eine motA-negative Mutante hergestellt werden. Westernblot-Analyse und elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass es weiterhin zur Expression und zur Polymerisation des Flagellins kommt. Lichtmikroskopisch war jedoch zu beobachten, dass die hergestellte Mutante im Gegensatz zum Wildtyp durch den fehlerhaften Flagellenmotor nicht mehr in der Lage ist, gerichtete Strecken zu schwimmen. Untersuchungen mit den Wirtszellen A. castellanii und humanen HL-60 Zellen belegten, wie schon bei der flaA-Mutante, eine Beteiligung der Motilität an Vorgängen wie Auffinden der Zielzelle und deren Invasion, wohingegen die Adhärenz und die intrazelluläre Vermehrung nicht beeinträchtigt waren. Eine Southernblot-Analyse des erst kürzlich beschriebenen Transkriptionsregulators FlaR ergab, dass es sich hierbei vermutlich um einen L. pneumophila-spezifischen Regulationsfaktor handelt, welcher in Kombination mit dem „upstream“ auf dem Gegenstrang liegenden ORF234 vorkommt. Fusionen der Promotorbereiche mit dem Reportergen gfp zeigten, dass beide Gene auch in Legionella aktiv sind und temperaturabhängig reguliert werden. N2 - Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires´ disease, lives as a facultative intracellular bacterium in the environment and has the capability to survive and replicate both in protozoa and human phagocytic and non-phagocytic cells. The role of flagella and motility in the infection of host cells still has to be determined. To better characterize the flaA-region of Legionella and to learn about the organisation of flagellar genes, two clones of a cosmid library harbouring this region from the genome of L. pneumophila Philadelphia I have been sequenced. Upstream of flaA, leading in the opposite direction, the metabolic genes accD and folC could be identified. Downstream of flaA the flagellar genes flaG, fliD, coding for the flagella-capping-protein, and fliS are located. Further downstream, two ORFs with homologies to the recently described Legionella genes enhA and milA have been identified. To investigate the influence of the flagella on the infection process, the flaA negative mutant strain KH3, where the flaA gene was inactivated by insertion of a kanamycin cassette, was complemented. This could be achieved, using the suicide vector pMSS704, by integration of the intact flaA gene back into the chromosome, leading to the complemented strain CD10. It could be shown by Western blotting that strain CD10 regained the ability to express the flagellin protein. Electronmicrographs also confirmed the presence of intact assembled flagella. Using the three strains, L. pneumophila Corby wild-type, the flaA mutant KH3, and the complemented flaA mutant CD10, the behaviour of the flagellated and non flagellated strains was investigated concerning encountering, adherence, invasion, intracellular multiplication and lysis of host cells. Both protozoa (A. castellanii) and human phagocytes (HL-60 cells and freshly isolated blood monocytes) have been utilized as potential host cells. It could be shown that flagellation enables the bacteria to reach the cells. In contrast, when the motility defect was artificially overcome by centrifugation, no difference in attachment of the three strains could be detected in our experiments. However, there was a significant reduction in the invasion efficiency for the flaA negative strain which was extremely relevant to the invasion of human phagocytes. Concerning the intracellular replication rate no difference could be observed, although most likely the defect in infectivity of the flaA mutant leads to a slower growth curve in the HL-60 model when using low MOIs. For the flaA mutant strain KH1, an unexpected decrease in cytotoxicity could also be observed. However, as the flaA mutant KH3 showed wildtype behaviour in this respect, the defect is most probably independent of flagellation. The sequencing of the cosmid library clone 12/44, harbouring the genes fliA and motA, showed the clustering of further flagellar genes of Legionella. Upstream of fliA two genes could be identified, showing high similarities to the putative flagellar regulator genes motR and flhF, respectively. Downstream of motA, overlapping by 26 bp, motB is located. It also plays a major role in the function of the flagellar motor and is followed by an ORF of unknown function. Still further downstream an ORF with homologies to prfB of E. coli could be sequenced. Southern blot analysis of different Legionella-strains with a motA specific probe gave positive signals for all L. pneumophila strains, as well as for some non-pneumophila strains (e. g. L. gormanii, L. jordanis, and L. bozemanii). By insertion of a kanamycin cassette into the motA gene of L. pneumophila Corby, a motA negative mutant could also be constructed. Western blot analysis and electronmicrographs confirmed that flagellin was still expressed and assembled into flagella, while light microscopy demonstrated the inability of the mutant to swim due to the impaired flagellar motor. Experiments with A. castellanii and HL-60 cells revealed the importance of motility for the finding and the invasion of host cells as already demonstrated for the flaA mutant, while intracellular replication was not affected. Recently, a gene (flaR) has been described for L. pneumophila Corby, belonging to the LysR-familiy of transcriptional regulators. It could be shown that this regulator is able to bind both to its own promotor as well as to a lower extent to the flaA promotor. Southern hybridization of different Legionella species with a flaR specific probe revealed that FlaR must be a L. pneumophila specific factor, only being present in L. pneumophila strains, together with an upstream gene (ORF234), which is leading in the opposite direction. Fusions of the promotor regions of the two genes with the reporter gene gfp (green fluorescent protein gene) demonstrated that both promotors are actually functional in Legionella, being more active at 37°C than at 30°C. Furthermore, their activity during intracellular replication in amoebae could be demonstrated. In conclusion, the flagellum and the motility, both subject to strict regulation, are of great importance to Legionella´s ability to reach and infect potential host cells KW - Legionella pneumophila KW - Virulenz KW - Geißel KW - Molekularbiologie KW - Legionellen KW - Flagelle KW - Virulenz KW - Invasion KW - intrazelluläre Vermehrung KW - Legionella KW - flagella KW - virulence KW - invasion KW - intracellular multiplication Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1081 ER - TY - THES A1 - Flügel, Manfred T1 - Molekularbiologische Studien zur Pathogenität und Ökologie von Legionella pneumophila T1 - Molecularbiological studies on the pathogenicity and ecology of Legionella pneumophila N2 - Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit, ist ein Umweltkeim mit Verbreitung in aquatischen Habitaten. Die Keime sind in der Lage, sich intrazellulär in eukaryontischen Zellen, wie Makrophagen, Monozyten und Protozoen zu vermehren. Die erfolgreiche Besiedlung ökologischer Nischen, aber auch das Virulenzpotential des Keimes können dabei von Umweltfaktoren abhängen. Die Erforschung ökologischer Zusammenhänge kann daher für das Verständnis der bakteriellen Virulenz von großer Bedeutung sein. Ausgangspunkt dieser Arbeit ist die in der späten stationären Phase des Bakterienwachstums von L. pneumophila zu beobachtende intensive Pigmentierung des Kulturmediums. Für diesen Phänotyp ist das Legiolysin (Lly) verantwortlich. Es ist eines der wenigen bekannten Genprodukte von L. pneumophila, die einen Einfluß auf das Überleben des Keimes in der Umwelt haben. Legiolysin kann daher als Fitnessfaktor bezeichnet werden. Um die ökologischen Zusammenhänge der Pigmentgenerierung näher zu untersuchen, wurde das lly-positive Plasmid pEWL 1 subkloniert und sequenziert. Neben lly konnten in diesem Genabschnitt durch Sequenzvergleiche der abgeleiteten Aminosäuresequenzen sechs weitere Leseraster detektiert werden. Die drei unmittelbar benachbarten Gene von lly kodieren dabei für Proteine mit Funktionalität in Bezug zur lly-Determinante, während die drei upstream von lly liegenden Leseraster Homologien zu Proteinen aufweisen, die an Transportprozessen beteiligt sind. Die Länge des RNA-Transkripts von lly konnte im Northern-Blot mit ungefähr 1,8 kb bestimmt werden und läßt damit auf die gemeinsame Transkription des lly-Gens mit dem unmittelbar upstream liegenden Leseraster schließen. Durch Sequenzanalysen konnte aufgezeigt werden, daß das für diesen Phänotyp verantwortliche Legiolysin-Gen für eine p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) kodiert. Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von p-Hydroxyphenylpyruvat zu Homogentisat (HGA). In Zusammenarbeit mit Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, Würzburg) konnte im Vergleich zu lly-negativen L. pneumophila- und rekombinanten E. coli-Stämmen in den Kulturüberständen von lly-positiven Stämmen auf Basis einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) HGA nachgewiesen werden. Es konnte somit gezeigt werden, daß das Legiolysin-Gen für ein Protein mit HPPD- Aktivität kodiert, und in die Degradation der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin involviert ist. Des weiteren wurden chromosomale Integrationsmutationen der aus L. pneumophila stammenden Gene lly und mip ("macrophage infectivity potentiator") in E. coli K-12 Stämmen erstellt. Diese wurden nachfolgend in ökologisch ausgerichteten Langzeitstudien eingesetzt. Die chromosomale Integration von lly erfolgte als ortsspezifische Rekombination in die l att - site von E. coli WM 2269. Die Integration von mip erfolgte in die fim-Region des E. coli K-12-Stammes AAEC 160. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befaßt sich mit ökologischen Studien zur Persistenz von L. pneumophila in der Umwelt. Durch die Bestrahlung mit Licht über einen Verlauf von sieben Tagen konnte gezeigt werden, daß die Exprimierung von lly zu einer Persistenz unter Lichtstreß führt. Dieser Lichtschutz könnte in der Umwelt, aber auch bei der Sanierung von Wasserleitungssystemen mittels UV-Licht Relevanz aufweisen. Die Assoziation von L. pneumophila JR32 und JR32-1 (lly-negativ) mit dem Cyanobakterium Fischerella wurde in Mikrokosmen über einen Verlauf von sieben Tagen beobachtet. Dabei konnte gezeigt werden, daß Legionella in Assoziation mit Fischerella bzw. in dessen Überstand zu persistieren vermag, während dies den Bakterien in frischem Fischerella-Medium nicht möglich war. Wie die Coinkubation der Fischerellen mit L. pneumophila JR32-1 zeigte, spielt die Expression von lly dabei keine Rolle. Ein Wachstum der Bakterienkulturen konnte weder im Fischerella-Überstand, noch in Fischerella-Medium beobachtet werden. Durch Rasterelektronenmikroskopie konnte der adhäsive Charakter der Assoziation von L. pneumophila zu Fischerella dokumentiert werden. Durch Persistenzstudien von L. pneumophila und E. coli in Boden wurde die Überlebensfähigkeit der Mikroorganismen in suboptimaler Umgebung getestet. Für Legionella ist eine rapide Abnahme der Zellzahl schon nach kurzer Zeit zu detektieren. Nach sechs Tagen konnten keine Zellen mehr kultiviert werden. Die Defizienz der Pathogenitäts- und Umweltfaktoren Mip, Fla (Flagellin) und Lly hatte dabei keinen Einfluß auf die Persistenz der Bakterien im Boden. Zudem sind die zuvor generierten rekombinanten E. coli-Klone AAEC 160-1 und WM 2269-1 mit genomischer mip- bzw. lly-Integration eingesetzt worden. Innerhalb von vier Wochen konnte für diese Stämme eine kontinuierliche Reduktion der Zellzahlen beobachtet werden. Somit erwies sich keiner der Organismen als erfolgreicher Besiedler der Bodenprobe. Die Studien zum Verlust der Kultivierbarkeit von L. pneumophila und E. coli erfolgten in autoklaviertem Leitungswasser bzw. PBS und zwei unterschiedlich behandelten Varianten von Mainwasser. Neben sterilfiltriertem Mainwasser fand die Inokulierung der Organismen auch in einem Ansatz mit autoklaviertem Mainwasser statt. Es konnte gezeigt werden, daß L. pneumophila in Leitungswasser und Mainwasser außerordentlich gut zu persistieren vermochte. Zudem konnte dokumentiert werden, daß auch E. coli DH5a in ein lebensfähiges, aber nicht mehr kultivierbares Ruhestadium (viable but nonculturable, VBNC) eintreten kann. Parallel zur Ermittlung der CFU-Werte wurden während des Verlaufs der Experimente die Lebendzellzahlen durch Fluoreszenzfärbungen bestimmt. Der Übergang von L. pneumophila in das VBNC-Ruhestadium wurde zudem durch in situ - Hybridisierungen mit fluoreszenzmarkierten 16 S rRNA-Oligonukleotidsonden dokumentiert. Im Naturhaushalt spielt dieser Übergang zu VBNC-Stadien bei Umweltbakterien zur Überwindung ungünstiger Phasen eine große Rolle. Schließlich erfolgten Experimente zur Reaktivierung der VBNC-Ruhestadien. Diese Reaktivierung ist abhängig von speziesspezifischen Triggern und kann bei L. pneumophila durch Coinkubation mit Acanthamoeba castellanii erfolgen. N2 - Legionella pneumophila, the causative agent of the Legionnaires' disease, is an environmental strain with a widespread distribution in aquatic habitats. Legionella are able to replicate intracellularly in eucaryotic cells, such as macrophages, monocytes and protozoa. The sucsessful colonization of ecological niches, but also the virulence potential of Legionella depends on environmental factors. Therefore the investigation of ecological context is expected to provide an understanding of bacterial virulence. The starting-point of this dissertation is the intensive pigmentation of the culture medium of L. pneumophila, witch could be observed in the late stationary phase of bacterial growth. The Legiolysin proteine (Lly) is responsible for this phenotype. This gene product of L. pneumophila is known to show an influence on the survival in the environment, which is why Legiolysin has been termed a fitness factor. In order to investigate the ecological connections of the pigmentation, the lly-positive plasmid pEWL 1 was subcloned and sequenced. In this genetic section six further open reading frames (ORF) could be detected besides lly by sequence comparison of the derived amino acid sequences. The three directly neighbouring genes of lly code for proteins which have functionality with regard to the lly-determinant. The three reading frames upstream of lly show homologies to proteins, which are involved in transport processes. The RNA transcript of lly could be determined by Northern blot with a lenght of about 1,8 kb. Therefore transcription of the lly gene together with the upstream ORF is suggested. It could be shown by sequence analysis, that the Legiolysine gene responsible for this phenotype, is coding for a p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD). This enzyme catalyzes the reaction of p-hydroxyphenylpyruvate to homogentisate (HGA). In collaboration with Prof. P. Proksch (Pharmazeutische Biologie, Würzburg) the existence of HGA was demonstrated in culture supernatants of lly-positive strains on the basis of high performance liquid chromatography (HPLC). It could be shown, that the legiolysin gene is coding for a protein with a HPPD activity, and, therefore, is involved in the degradation of the aromatic amino acids Phenylalanine and Tyrosine. Additionally chromosomal integration mutants of the L. pneumophila genes lly and mip ("macrophage infectivity potentiator") were created in E. coli K-12 strains. These mutants were subsequently used in ecological long-time studies. The chromosomal integration of lly took place as a locus-specific recombination in the l att - site of E. coli WM 2269. The integration of mip happened in the fim-region of the E. coli strain AAEC 160. The second part of the present dissertation is concerned with ecological studies to the persistence of L. pneumophila in the environment. Accordingly, it could be shown, that the expression of lly leds to persistence to light-stress. This light protection could be relevant in the environment, but also during the sanitation of water pipes by UV-light. The association of L. pneumophila JR32 and JR32-1 (lly-negative) with the cyanobacterium Fischerella was observed in microcosms during a course of seven days. Legionella are able to persist in association with Fischerella, and in the Fischerella culture supernatant, respectively. Survival of the bacteria was not possible in fresh Fischerella medium. However, the expression of lly shows no difference, as could be shown by the coincubation of L. pneumophila with Fischerella. The growth of bacterial cultures cold neither be detected in supernatants of Fischerella, nor in fresh Fischerella medium. The adhesive character of the association of L. pneumophila with Fischerella could be documented by SEM (scanning electron microscopy). The survival of Legionella in suboptimal environment was tested by studying the persistence of L. pneumophila and E. coli in soil. A rapid decline of CFU (colony forming unit) for Legionella could be detected within a short time, as cells could not be cultivated any more after six days. The deficiency of the pathogenetic and enviromental factors Mip, Fla (Flagellin) and Lly had no influence on the persistence of the bacteria in the soil. Additionally the recombinant E. coli clones AAEC 160-1 and WM 2269-1 with the genomic mip and lly integrations, were used in this exreriments. During a course of four weeks, a continuous reduction of CFU could be observed for these strains. Therefore none of these organisms proved successful in colonization of soil samples. The studies regarding the loss of culturability of L. pneumophila and E. coli were made in autoclaved potable water and PBS (phosphate buffered saline), respectively, and in two variants of Main river water, one of which was autoclavedwhile the other one was sterilized by filtration. It could be shown, that L. pneumophila are able to persist well in potable water and in the river water. Additionally, not only L. pneumophila, but also E. coli DH5a entered a viable but nonculturable state (VBNC). During the course of these experiments, the numbers of live cells were determined by fluorescence dyes Moreover, the transition of L. pneumophila into the VBNC state was documented by in situ hybridization technique with fluorescence marked 16 S rRNA oligonucleotide probes (FISH). This transition into the VBNC state plays an important role to overcome unfavourable phases in natural environments. Finally experiments were made to reactivate the VBNC states. This resuscitation is dependent on species specific triggers and could be achieved by coincubation of L. pneumophila with the amoeba Acanthamoeba castellanii. KW - Legionella pneumophila KW - Pathogenität KW - Ökologie KW - Molekularbiologie KW - Legionella pneumophila KW - Legiolysin KW - p-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase KW - Pigmentierung KW - Lichtschutz KW - Fischerella sp. KW - Legionella pneumophila KW - Legiolysin KW - p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase KW - pigmentation KW - light protection KW - Fischerella sp. Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1178 ER - TY - JOUR A1 - Frischholz., S. A1 - Röllinghoff, M. A1 - Moll, Heidrun T1 - Cutaneous leishmaniasis: Co-ordinate expression of granzyme A and lymphokines by CD4\(^+\) T cells from susceptible mice. JF - Immunology N2 - We have recently demonstrated that the frequency ofT cells expressing granzyme A is significantly higher in skin lesions and spleens of susceptible BALB/c mice compared with resistant C57BL/6 mice infected with Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. In the present study, we have performed in vitro studies to characterize the subpopulation, the antigen responsiveness and the lymphokine production pattern of granzyme A-expressing T cells in L. major-infected mice. Using a limiting dilution system for functional analysis of selected T cells at the clonallevel, we could show that granzyme A activity in infected BALB/c mice can be assigned to L. major-reactive CD4\(^+\) T cells secreting interleukin-2 (IL-2) and IL-4. Granzyme A production was most pronounced in the early phase of infection. On the other hand, granzyme A expression could not be detected in C57BL/6-derived T cells responding to L. major. The da ta support the suggestion that granzyme A is produced by L. major-responsive CD4\(^+\) T cells facilitating lesion formation and the dissemination of infection. Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30954 VL - 82 SP - 255 EP - 260 ER - TY - JOUR A1 - Moll, Heidrun A1 - Fuchs, Harald A1 - Blank, Christine A1 - Röllinghoff, Martin T1 - Langerhans cells transport Leishmania major from the infected skin to the draining lymph node for presentation to antigen-specific T cells N2 - No abstract available KW - Immunologie KW - Langerhans cell KW - Leishmania major KW - T-cell Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46023 ER - TY - JOUR A1 - Gillitzer, Reinhard A1 - Moll, Heidrun T1 - Simultaneous demonstration of two antigens with immunogold-silver staining and immunoenzymatic labeling N2 - A novel technique for independent and simultaneous labeling of two antigens expressed on individual cells (referred to as mixed labeling) is presented. The staining procedure combined three-step (streptavidin-biotin) immunogold-silver staining with three-step immunoenzymatic labeling. To ensure both high specificity and high sensitivity, particular emphasis was placed on designing a protocol that avoids immunological crossreactivity between the antibody reagents and overlapping of the final color products. Two examples for usage of this mixed labeling technique are described: lymphocyte subpopulations were identified in inflammatory lesions of human skin and infected host cells were characterized in the skin of mice infected with the obligatory intracellular parasite Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33019 ER - TY - JOUR A1 - Blank, Christine A1 - Fuchs, Harald A1 - Rappersberger, Klemens A1 - Röllinghoff, Martin A1 - Moll, Heidrun T1 - Parasitism of epidermal Langerhans cells in experimental cutaneous leishmaniasis with Leishmania major N2 - Murine epidermal Langerhans cells (LC) have been demonstrated to stimulate a vigorous T cell response to Leishmania major, a cause of human cutaneous leishmaniasis. It was therefore of interest to analyze whether LC can take up viable parasites. Epidermal cells were obtained from mouse ear skin for incubation with L. major and subsequent detection of intracellular parasites by cytochemistry. Freshly isolated LC, but not cultured LC, phagocytosed L. major and the uptake was inhibited by antibodies to the complement receptor type 3. Electron microscopic studies revealed the presence of viable amastigotes within Le. Moreover, with double-Iabeling techniques, L. major-containing LC could also be detected in infected skin. The results demonstrate that LC can internalize L. major. Since the number of organisms per infected LC remained consistently low, the prime task of LC may not be the promotion of parasite spreading but the presentation of L. major antigen to T cells and, thus, the regulation of the cellular immunity during cutaneous leishmaniasis. Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45850 ER - TY - JOUR A1 - Moll, Heidrun T1 - Epidermal Langerhans cells are critical for immunoregulation of cutaneous leishmaniasis N2 - In leishmaniasis, macrophages are known to play a central role as modulators of the specific immune activity. In this article, Heidrun Moll presents evidence for the critical involvement of another component of the skin immune system, the epidermal Langerhans cell. She proposes that Langerhans cells take up parasites in the skin and transport them to the draining lymph node for presentation to T cells and initiation of the specific immune response. KW - Biologie KW - Immunologie Y1 - 1993 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-61323 ER -