TY  - THES
A1  - Ott, Christine Kornelia
T1  - Diverse Aspects of the Sorting and Assembly Machinery in Human Mitochondria
T1  - Diverse Aspekte der Sortierungs- und Assemblierungsmaschinerie in humanen Mitochondrien
N2  - Mitochondria are organelles of endosymbiotic origin, which play many important roles in eukaryotic cells. Mitochondria are surrounded by two membranes and, considering that most of the mitochondrial proteins are produced in the cytosol, possess import machineries, which transport mitochondria-targeted proteins to their designated location. A special class of outer mitochondrial membrane (OMM) proteins, the β-barrel proteins, require the sorting and assembly machinery (SAM) for their OMM integration. Both mitochondrial β-barrel proteins and the central component of the SAM complex, Sam50, have homologs in gram-negative bacteria. In yeast mitochondria, bacterial β-barrel proteins can be imported and assembled into the OMM. Our group demonstrated that this, however, is not the case for human mitochondria, which import only neisserial β barrel proteins, but not those of Escherichia coli and Salmonella enterica. As a part of this study, I could demonstrate that β-barrel proteins such as Omp85 and PorB of different Neisseria species are targeted to human mitochondria. Interestingly, only proteins belonging to the neisserial Omp85 family were integrated into the OMM, whereas PorB was imported into mitochondria but not assembled. By exchanging parts of homologous neisserial Omp85 and E. coli BamA and, similarly, of neisserial PorB and E. coli OmpC, it could be demonstrated in this work that the mitochondrial import signal of bacterial β barrel proteins cannot be limited to one short linear sequence, but rather secondary structure and protein charge seem to play an important role, as well as specific residues in the last β-strand of Omp85. Omp85 possesses five conserved POTRA domains in its amino-terminal part. This work additionally demonstrated that in human mitochondria, at least two POTRA domains of Omp85 are necessary for membrane integration and functionality of Omp85. In the second part of this work, the influence of Sam50 on the mitochondrial cristae structure was investigated. This work contributed to a study performed by our group in which it was confirmed that Sam50 is present in a high molecular weight complex together with mitofilin, CHCHD3, CHCHD6, DnaJC11, metaxin 1 and metaxin 2. This connection between the inner and outer mitochondrial membrane was shown to be crucial for the maintenance of the mitochondrial cristae structure. In addition, a role of Sam50 in respiratory complex assembly, suggested by a SILAC experiment conducted in our group, could be confirmed by in vitro import studies. An influence of Sam50 not only on respiratory complexes but also on the recently described respiratory complex assembly factor TTC19 was demonstrated. It was shown that TTC19 not only plays a role in complex III assembly as published, but also influences the assembly of respiratory complex IV. Thus, in this part of the work a connection between the OMM protein Sam50 and maintenance of cristae structure, respiratory complex assembly and an assembly factor could be established.
N2  - Mitochondrien sind Zellorganellen endosymbiotischen Ursprungs, die viele wichtige Funktionen in eukaryotischen Zellen haben. Mitochondrien sind von zwei Membranen umgeben, und da die meisten Mitochondrienproteine im Cytosol hergestellt werden, besitzen sie Importmaschinerien, die die für die Mitochondrien bestimmten Proteine zu ihrem jeweiligen Zielort transportieren. Eine besondere Klasse von Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran (ÄMM), die β-Fassproteine, benötigen die Sortierungs- und Assemblierungsmaschinerie (SAM) für ihre Integration in die ÄMM. Sowohl mitochondriale β-Fassproteine als auch die zentrale Komponente des SAM-Komplexes, Sam50, haben Homologe in gramnegativen Bakterien. In Hefemitochondrien können bakterielle β Fassproteine importiert und in der ÄMM assembliert werden. Unsere Gruppe hat gezeigt, dass dies jedoch nicht auf humane Mitochondrien zutrifft, die nur neisserielle β-Fassproteine importieren, nicht aber diejenigen von Escherichia coli und Salmonella enterica. Im Rahmen dieser Studie konnte ich zeigen, dass β Fassproteine verschiedener Neisserienarten, wie Omp85 und PorB, in humane Mitochondrien aufgenommen werden. Interessanterweise wurden nur Proteine der neisseriellen Omp85-Familie in die ÄMM eingebaut, während PorB zwar importiert, jedoch nicht assembliert wurde. Durch das Austauschen von Teilen von homologem neisseriellen Omp85 und E.coli BamA und ebenso von neisseriellem PorB und E. coli OmpC konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das mitochondriale Importsignal bakterieller β-Fassproteine nicht auf eine kurze lineare Sequenz eingegrenzt werden kann, sondern dass die Sekundärstruktur und die Ladung des Proteins eine wichtige Rolle zu spielen scheinen, sowie im Fall von Omp85 einige bestimmte Aminosäurereste des letzten β-Stranges. Omp85 besitzt fünf konservierte POTRA-Domänen in seiner aminoterminalen Hälfte. In dieser Arbeit wurde zudem demonstriert, dass in humanen Mitochondrien mindestens zwei POTRA-Domänen von Omp85 für die Membranintegration und Funktionalität von Omp85 vorhanden sein müssen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von Sam50 auf die mitochondriale Cristaestruktur untersucht. Diese Arbeit hat zu einer von unserer Gruppe durchgeführten Studie beigetragen, in der bestätigt werden konnte, dass Sam50 in einem hochmolekularen Komplex mit Mitofilin, CHCHD3, CHCHD6, DnaJC11, Metaxin 1 und Metaxin 2 vorliegt. Es wurde gezeigt, dass diese Verbindung zwischen der inneren und äußeren Mitochondrienmembran unverzichtbar für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Cristaestruktur ist. Zudem konnte eine Rolle von Sam50 bei der Assemblierung von Atmungskettenkomplexen, die durch ein in unserem Labor durchgeführtes SILAC-Experiment nahegelegt worden war, durch in-vitro-Importstudien bestätigt werden. Weiterhin wurde ein Einfluss von Sam50 nicht nur auf Atmungskettenkomplexe, sondern auch auf einen vor kurzem beschriebenen Assemblierungsfaktor der Atmungskette, TTC19, demonstriert. Es wurde gezeigt, dass TTC19 nicht nur, wie veröffentlicht, eine Rolle bei der Assemblierung des Atmungskettenkomplexes III spielt, sondern auch die Assemblierung des Atmungskettenkomplexes IV beeinflusst. In diesem Teil der Arbeit konnte folglich eine Verbindung zwischen dem ÄMM-Protein Sam50 und der Organisation der Cristaestruktur, der Atmungskettenassemblierung und einem Assemblierungsfaktor nachgewiesen werden.
KW  - Mitochondrien
KW  - Mensch
KW  - Molekularbiologie
KW  - mitochondria
KW  - Import
KW  - Omp85
KW  - beta-barrel-proteins
KW  - cristae
KW  - beta-Fassproteine
KW  - Cristaestruktur
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85462
ER  - 
TY  - THES
A1  - Melzer, Juliane
T1  - Die Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in Neuroblasten während der Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster
T1  - The function of the p21-activated kinase Mbt in neuroblasts during the development of the central nervous system of Drosophila melanogaster
N2  - p21-aktivierte Kinasen regulieren zahlreiche zelluläre Prozesse, die während der Entwicklung, aber auch beispielsweise bei der Krebsentstehung, von zentraler Bedeutung sind. Mbt, das einzige Typ II PAK-Protein von Drosophila melanogaster, spielt eine Rolle bei der Gehirnentwicklung. Eine Nullmutation von mbt, mbtP1, bildet kleinere Gehirne mit stark verkleinerten Pilzkörpern aus. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Mbt in Neuroblasten untersucht. Mbt wurde als Teil des apikalen Proteinkomplexes in Neuroblasten des Zentralhirns nachgewiesen. Die apikale Lokalisation von Mbt ist Zellzyklus-abhängig und wird über Bindung an Cdc42 reguliert. Sie ist essentiell für die Funktion von Mbt in Neuroblasten. Trotz apikaler Mbt-Lokalisation in Neuroblasten zeigte die mbt Nullmutante keine Defekte des basalen Mechanismus der asymmetrischen Zellteilung. Mud zeigte geringfügige Lokalisationsveränderungen, die auf einen möglichen Einfluss von Mbt hinweisen. Obwohl PAKs zentrale Regulatoren des Zytoskeletts sind, zeigte die mbtP1 Mutante keine offensichtlichen Veränderungen des Aktin- und Tubulin-Zytoskeletts. Armadillo, ein Aktin-assoziiertes Mbt-Substrat, zeigte ebenfalls keine Lokalisationsveränderung in Neuroblasten. Mbt steuert jedoch die apikale Anreicherung von Cno, einem weiteren Aktin-assoziierten Protein, in Neuroblasten. Darüber hinaus beeinflusst Mbt die Zellgröße von Neuroblasten, sowie deren Proliferationspotenzial und Überleben. mbtP1 Neuroblasten sind kleiner als wildtypische Neuroblasten, haben ein geringeres Proliferationsvermögen und eine geringere Überlebenswahrscheinlichkeit. Der Zelltod von Neuroblasten ist jedoch ein sekundärer Effekt. Daher kann eine Blockierung von Apoptose den adulten Pilzkörperphänotyp nicht retten. Signalwege, die Zellgröße und Proliferation regulieren, wurden auf eine Beteiligung von Mbt hin analysiert. mbtP1 induzierte leichte Effekte im Insulin-Signalweg und die Delokalisation eines nukleolären Proteins. Eine genetische Interaktion von mbtP1 mit Mutationen in Genen des klassischen MAPK-Signalweges identifzierte mbt als Positivregulator dieses Signalweges im Auge. Ein ähnlicher, schwächerer Effekt wurde auch bzgl. der Proliferation und Größe von Neuroblasten beobachtet. Eine 2D-Gelanalyse von Larvengehirnen identifizierte Bic und Hsp83 als mögliche von Mbt regulierte Proteine. Diese Arbeit charakterisiert eine bisher unbekannte Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in neuronalen Stammzellen und liefert damit Ansatzpunkte für eine detaillierte Aufklärung der Funktionsmechanismen von Typ II PAKs bei der Regulation von Zellproliferation und Überleben
N2  - p21-activated kinases regulate numerous cellular processes central not only during development, but also for example for cancer pathogenesis. Mbt, the only type II PAK in Drosophila, regulates brain development. The mbt null mutant mbtP1 exhibits reduced brain size, with the mushroom bodies showing the most pronounced reduction. In this work, the function of Mbt in neuroblasts was investigated. Mbt was identified as a component of the apical protein complex in central brain neuroblasts. The apical localization of Mbt was cell cycle dependent and regulated by binding to Cdc42, which is essential for Mbt function in neuroblasts. Despite apical localization of Mbt, the mbtP1 null allel showed no defects in the basic mechanism of asymmetric cell division in larval neuroblasts. However, Mud showed minor localization changes indicating a possible influence of Mbt. Even though PAKs are well-known regulators of the cytoskeleton, no obvious changes in the actin and tubulin cytoskeleton were observed in mbtP1 neuroblasts. The localization of Armadillo, an actin-associated Mbt substrate, was also undisturbed throughout the cell cycle. Mbt controls the apical enrichment of Cno, another actin-associated protein. Moreover, Mbt influences neuroblast cell size, proliferation potential and survival. mbtP1 neuroblasts were smaller than wildtype neuroblasts and showed reduced proliferation activity and survival. However, the apoptotic loss of mbtP1 neuroblasts is a secondary effect. Thus, the adult mushroom body phenotype cannot be rescued by blocking apoptosis. Signalling pathways known to regulate growth and proliferation were analyzed with respect to a possible participation of Mbt. mbtP1 induced slight effects in the insulin pathway and strongly influenced the localization of an unknown nucleolar protein. Genetic interactions of mbtP1 with mutations in genes involved in the classical MAPK pathway identified mbt as a positive regulator of the MAPK pathway. A similar effect was also observed with respect to neuroblast proliferation and size. A 2D gel analysis of larval brains identified Bic and Hsp83 as candidate proteins, that might be regulated by Mbt. This work characterizes a novel function of the p21-activated kinase Mbt in neural stem cells. It provides starting points for a detailed analysis of the mechanisms of type II PAK functions in the control of cell growth, proliferation and survival.
KW  - Taufliege
KW  - Auge
KW  - Ontogenie
KW  - Pilzkörper
KW  - Molekularbiologie
KW  - p21-aktivierten Kinase
KW  - PAK
KW  - Neuroblast
KW  - Pilzkörper
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - p21 activated kinase
KW  - PAK
KW  - neuroblast
KW  - mushroombody
KW  - Drosophila melanogaster
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85619
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TY  - THES
A1  - Schramm, Sabine
T1  - SYCE3, ein neues Synaptonemalkomplexprotein: Expression, funktionelle Analyse und Bindungspartner
T1  - SYCE3, a novel synaptonemal complex protein:Expression, functional analysis and binding partners
N2  - Der Synaptonemalkomplex ist eine evolutionär hoch konservierte Struktur. Er wird spezifisch während der Prophase I der Meiose ausgebildet und ist essentiell für die Segregation der homologen Chromosomen während der Meiose und auch für die Entstehung genetischer Vielfalt. Der Synaptonemalkomplex ist eine proteinöse Struktur, deren Aufbau dem einer Leiter ähnelt. Dabei werden die Leiterholme als Lateralelemente bezeichnet. Sie bestehen unter anderem aus den Proteinen SYCP2 und SYCP3 und assoziieren mit dem Chromatin der homologen Chromosomen. Die Stufen der Leiter bestehen hingegen aus Transversalfilamenten, deren Hauptkomponente parallele Homodimere des meiosespezifische Proteins SYCP1 sind. Dabei wird ein SYCP1 Dimer mit seinem C-Terminus in den Lateralelementen verankert und kann über seine N-terminale Domäne eine schwache Interaktion mit der N-terminalen Domäne eines gegenüberliegenden SYCP1 Dimers eingehen. Um diese Bindung zu stabilisieren werden Proteine des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes benötigt: Während SYCE1 durch seine Interaktion mit SYCP1 die N-terminale Assoziation zweier gegenüberliegender SYCP1 Dimere stabilisiert, verknüpfen die zwei anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE2 und Tex12 lateral benachbarte SYCP1 Filamente und breiten so das SYCP1 Netzwerk entlang der chromosomalen Achsen aus. Dieser Prozess wird als Synapse bezeichnet und stellt eines der Schlüsselereignisse der Meiose dar. Fehler während dieses Prozesses führen meist zu Aneuploidie der entstehenden Gameten oder zum Abbruch der Meiose und somit zu Infertilität des betroffenen Organismus. In dieser Arbeit wurde mit SYCE3 ein neues Protein des murinen Synaptonemalkomplexes charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass SYCE3 meiosespezifisch in Männchen und Weibchen exprimiert wird und Bestandteil des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ist. Hierbei zeigt es dasselbe Verteilungsmuster wie SYCP1 und SYCE1 und kann mit beiden Proteinen interagieren. Eine zusätzliche Interaktion konnte zwischen SYCE3 und SYCE2 nachgewiesen werden. Durch Untersuchungen an entsprechenden Knockout Mausmodellen konnte in dieser Arbeit außerdem gezeigt werden, dass SYCE3 in Abwesenheit von SYCP1 nicht an die chromosomalen Achsen rekrutiert werden kann. Die Ausbildung der Lateralelemente und auch die Anwesenheit der anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE1 und SYCE2 sind hingegen für die Anlagerung von SYCE3 an die chromosomalen Achsen nicht essentiell. Somit steht SYCE3 hinsichtlich seiner Bedeutung für die Paarung und die Synapse der homologen Chromosomen hierarchisch offenbar über den bisher beschriebenen Zentralelementproteinen SYCE1, SYCE2 und Tex12. Die funktionelle Bedeutung von SYCE3 für die Synapse der homologen Chromosomen und für den korrekten Ablauf der homologen Rekombination wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Herstellung und die Charakterisierung einer Syce3-/- Maus detailliert untersucht: Dabei führte der Knockout von SYCE3 zur Infertilität in beiden Geschlechtern, die gleichzeitig mit einer signifikanten Reduktion der Größe der entsprechenden Hoden und Ovarien im Vergleich zum Wildtyp einherging. Weitere Untersuchungen ergaben zudem, dass es in Syce3 defizienten Tieren zu einem Abbruch der Meiose kommt. Dabei hatte das Fehlen von SYCE3 keinen Einfluss auf die Ausbildung der Axialelemente. Die Initiation der Synapse hingegen war sowohl in Oocyten als auch in Spermatocyten in Abwesenheit von SYCE3 stark gestört. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass das Fehlen von SYCE3 Einfluss auf die homologe Rekombination nimmt: Zwar können sich frühe (DNA Doppelstrangbrüche) und intermediäre (Transitionsknoten) Rekombinationsereignisse in der Abwesenheit von SYCE3 ausbilden, die Prozessierung zu späten Rekombinationsstrukturen (Rekombinationsknoten) und die damit einhergehende Ausbildung von Crossing-over Strukturen fand jedoch nicht statt. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das neue Synaptonemalkomplexprotein SYCE3 essentiell für die Fertilität von Mäusen ist. Durch den Knockout von Syce3 kann die Synapse zwischen den Homoligen nicht initiiert werden und es findet kein Crossing-over statt. Im Assembly Prozess des Synaptonemalkomplexes agiert SYCE3 oberhalb der anderen zentralelementspezifischen Proteine und unterhalb von SYCP1.
N2  - The synaptonemal complex is an evolutionary highly conserved structure. It assembles specifically during prophase I of meiosis and is essential for the segregation of homologous chromosomes and thus represents a major determinant of the genetic diversity of sexually reproducing organisms. The synaptonemal complex is a proteinacious, ladder-like structure. The ladder beams are termed lateral elements and are composed of the meiosis-specific proteins SYCP2 and SYCP3 which are associated with the chromatin of the homologs. The rungs are made up of transverse filaments mainly consisting of the meiosis-specific protein SYCP1. SYCP1 forms parallel homodimers that are anchored via their C-termini to the lateral elements and interact in a head-to-head fashion with an opposing SYCP1 homodimer. For stabilizing this interaction additional proteins are essential. These are components of the so-called central element of the synaptonemal complex: while SYCE1 stabilizes the N-terminal association of opposing SYCP1 homodimers, the two other central element specific proteins SYCE2 and Tex12 connect adjoined SYCP1 filaments and thus elongate the SYCP1 network along the homologs. This process is termed synapsis and is a key feature of meiosis. Errors occurring during this process frequently lead to aneuploidy of the resulting gametes or cause meiotic arrest and infertility. Within the scope of this study a novel protein of the murine synaptonemal complex, we named SYCE3, was characterized. SYCE3 is exclusively expressed during male and female meiosis and is a component of the central element. Its expression pattern resembles that of SYCP1 and SYCE1 and it is able to interact with both of these proteins. Additionally, an interaction between SYCE3 and SYCE2 could be verified. In the context of this dissertation it was found that loading of SYCE3 to the chromosomal axis requires SYCP1. In contrast, chromosome loading of SYCE3 was independent of lateral element assembly and of the presence of the other central element specific proteins, SYCE1, SYCE2 and Tex12. The second thematic complex addressed in this thesis was the relevance of SYCE3 for synapsis and homologous recombination. To this end a Syce3-/- mouse was generated. Syce3-/- mice are infertile and both testes and ovaries are characterized by a significant reduction in size compared to wild-type littermates. Furthermore, depletion of SYCE3 had no influence on the assembly of axial elements and in males alignment of homologs was not affected. However, Syce3-/- oocytes and spermatocytes were unable to initiate synapsis between homologous chromosomes. In addition, homologous recombination was analyzed in the scope of this study and the obtained data strongly points to a central role of SYCE3 during this process: while early (DNA double-strand breaks) and intermediate (transition nodules) recombination events could take place in the absence of SYCE3, structures indicating late recombination events (recombination nodules) and sites of homologous recombination (crossovers) failed to develop. Taken together, this thesis clearly demonstrates that the novel synaptonemal complex protein SYCE3 is essential for fertility in mice. Deletion of Syce3 blocks initiation of synapsis and formation of crossovers. During synaptonemal complex assembly, SYCE3 acts downstream of SYCP1, but upstream of other central element proteins (SYCE1, SYCE2 and Tex12).
KW  - Meiose
KW  - Molekularbiologie
KW  - Fertilität
KW  - Synaptonemalkomplex
KW  - Meiosis
KW  - Synaptonemal complex
KW  - fertility
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70903
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TY  - THES
A1  - Nuwal, Tulip
T1  - Characterization of Synapsin, Tubulin-Binding Chaperone E-like, And Their Putative Interactions With Synapse Associated Protein Of 47 kDa In Drosophila melanogaster
N2  - In this thesis we have used Drosophila melanogaster as a model organism to investigate proteins and their putative interacting partners that are directly or indirectly involved in the release of neurotransmitters at the synapse. We have used molecular techniques to investigate conserved synaptic proteins, synapsin and synapse associated protein of 47 kD (SAP47), and a putative interaction partner of SAP47, tubulin binding chaperone E-like (TBCEL). SAP47 and synapsins are highly conserved synaptic vesicle associated proteins in Drosophila melanogaster. To further investigate the role and function of Sap47 and Syn genes, we had earlier generated the null mutants by P-element mutagenesis (Funk et al., 2004; Godenschwege et al., 2004). Western blots and ELISA of brain homogenates from Sap47156 null mutants showed the presence of up-regulated phospho-synapsin in comparison to wild-type (CS) and the presence of up-regulated phospho-synapsin was partially abolished when a pan-neuronal rescue of SAP47 was performed by the Gal4- UAS technique. Thus, the results suggest a qualitative and quantitative modulation of synapsin by SAP47. At the transcript level, we did not observe any difference in content of Syn transcript in Sap47156 and wild-type CS flies. The question of a direct molecular interaction between SAP47 and synapsin was investigated by co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments and we did not find any stable interactions under the several IP conditions we tested. The possibility of Sap47 as a modifier of Syn at the genetic level was investigated by generating and testing homozygous double null mutants of Sap47 and Syn. The Syn97, Sap47156 double mutants are viable but have a reduced life span and decreased locomotion when compared to CS. In 2D-PAGE analysis of synapsins we identified trains of spots corresponding to synapsins, suggesting that synapsin has several isoforms and each one of them is posttranslationally modified. In an analysis by Blue native-SDS-PAGE (BN-SDS-2D- PAGE) and Western blot we observed synapsin and SAP47 signals to be present at 700-900 kDa and 200-250 kDa, respectively, suggesting that they are part of large but different complexes. We also report the possibility of Drosophila synapsin forming homo- and heteromultimers, which has also been reported for synapsins of vertebrates. In parallel to the above experiments, phosphorylation of synapsins in Drosophila was studied by IP techniques followed by 1D-SDS gel electrophoresis and mass spectrometry (in collaboration with S. Heo and G. Lubec). We identified and verified 5 unique phosphorylation sites in Drosophila synapsin from our MS analysis. Apart from phosphorylation modifications we identified several other PTMs which have not been verified. The significance of these phosphorylations and other identified PTMs needs to be investigated further and their implications for synapsin function and Drosophila behavior has to be elucidated by further experiments. In a collaborative project with S. Kneitz and N. Nuwal, we investigated the effects of Sap156 and Syn97 mutations by performing a whole Drosophila transcriptome microarray analysis of the individual null mutants and the double mutants (V2 and V3). We obtained several candidates which were significantly altered in the mutants. These genes need to be investigated further to elucidate their interactions with Sap47 and Syn. In another project, we investigated the role and function of Drosophila tubulin- binding chaperone E-like (Tbcel, CG12214). The TBCEL protein has high homology to vertebrate TBCE-like (or E-like) which has high sequence similarity to tubulin-binding chaperone E (TBCE) (hence the name TBCE-Like). We generated an anti-TBCEL polyclonal antiserum (in collaboration with G. Krohne). According to flybase, the Tbcel gene has only one exon and codes for two different transcripts by alternative transcription start sites. The longer transcript RB is present only in males whereas the shorter transcript RA is present only in females. In order to study the gene function we performed P- element jump-out mutagenesis to generate deletion mutants. We used the NP4786 (NP) stock which has a P(GawB) insertion in the 5’ UTR of the Tbcel gene. NP4786 flies are homozygous lethal due to a second-site lethality as the flies are viable over a deficiency (Df) chromosome (a deletion of genomic region spanning the Tbcel gene and other upstream and downstream genes). We performed the P-element mutagenesis twice. In the first trial we obtained only revertants and the second experiment is still in progress. In the second attempt, jump-out was performed over the deficiency chromosome to prevent homologous chromosome mediated double stranded DNA repair. During the second mutagenesis an insertion stock G18151 became available. These flies had a P-element insertion in the open reading frame (ORF) of the Tbcel gene but was homozygous viable. Western blots of fresh tissue homogenates of NP/Df and G18151 flies probed with anti-TBCEL antiserum showed no TBCEL signal, suggesting that these flies are Tbcel null mutants. We used these flies for further immunohistochemical analyses and found that TBCEL is specifically expressed in the cytoplasm of cyst cells of the testes and is associated with the tubulin of spermatid tails in wild-type CS, whereas in NP/Df and G18151 flies the TBCEL staining in the cyst cells was absent and there was a disruption of actin investment cones. We also found enrichment of TBCEL staining around the actin investment cone. These results are also supported by the observation that the enhancer trap expression of the NP4786 line is localised to the cyst cells, similar to TBCEL expression. Also, male fertility of NP/Df and G18151 flies was tested and they were found to be sterile with few escapers. Thus, these results suggest that TBCEL is involved in Drosophila spermatogenesis with a possible role in the spermatid elongation and individualisation process.
N2  - In dieser Arbeit benutzte ich Drosophila melanogaster als Modellorganismus für die Untersuchung von Proteinen und ihren möglichen Interaktionspartnern, die direkt oder indirekt an der Freisetzung von Neurotransmittern an der Synapse beteiligt sind. Für die Untersuchung der konservierten synaptischen Proteine Synapsin (SYN) und Synapsen-assoziertes Protein von 47 kDa (SAP47), sowie ihrer möglichen Interaktionspartner, bediente ich mich molekularer Methoden. SAP47 und SYN sind hoch konservierte Proteine von Drosophila melanogaster, die mit synaptischen Vesikeln assoziert sind. Um die Rolle und Funktion der Sap47- und Syn-Gene näher zu beleuchten, wurden bereits früher mit Hilfe von P-Element Mutagenesen Null Mutanten generiert (Funk et al., 2004; Godenschwege et al., 2004). Western Blots und ELISA der Gehirnhomogenate der Sap47156 Nullmutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp (CS) das Vorhandensein von hochreguliertem phospho-Synapsin. Dieser Effekt ließ sich durch ein panneuronales Rescue wieder partiell rückgängig machen. Diese Ergebnisse lassen eine qualitative sowie quantitative Modulation von SYN druch SAP47 vermuten. Auf der Transkriptebene konnte ich keinen Unterschied im Gehalt von Syn Transkript zwischen den Sap47156 und wildtypischen CS Fliegen feststellen. Das Vorhandensein einer direkten molekularen Interaktion zwischen SAP47 und SYN wurde in Co-Immunopräzipitations-Experimenten (CO-IP) untersucht. Ich konnte unter diversen getesteten IP Bedingungen keine stabilen Interaktionen finden. Die Möglichkeit, dass Sap47 auf der molekularen Ebene modifizierend auf das Syn-Gen wirkt, wurde durch das Erzeugen und Testen homozygoter doppelter Nullmutanten für Sap47 und Syn untersucht. Syn97, Sap47156 Doppelmutanten sind lebensfähig, zeigen jedoch eine im Vergleich zu CS reduzierte Lebensspanne und Lokomotion. In einer 2D-SDS-PAGE Analyse der Synapsine identifizierte ich Reihen von Synapsin-Signalen, die darauf schließen ließen, dass Synapsin über mehrere Isoformen verfügt, von denen jede mehrfach posttranslational modifiziert ist. In einer Blue native-SDS-PAGE (BN-SDS-2D-PAGE) mit anschließendem Western Blot konnte ich Synapsin und SAP47 Signale bei 700-900 kDa beziehungsweise 200-250 kDa feststellen, was darauf schließen ließ, dass sie als Komponenten von unterschiedlichen größeren Komplexen fungieren. Ich zeigte außerdem die Möglichkeit auf, dass Drosophila Synapsin Homo- und Heteromultimere bilden kann, was bereits für Synapsine von Wirbeltieren gezeigt wurde. Gleichzeitig mit den obigen Experimenten untersuchte ich durch IP Methoden, gefolgt von 1D SDS Gelelektrophorese und Massenspektroskopie (in Zusammenarbeit mit S. Heo und G. Lubec), die Phosphorylierung der Synapsine in Drosophila. In der MS Analyse konnte ich 5 distinkte Phosphorylierungs-Stellen des Drosophila Synapsins identifizieren und verifizieren. Zusätzlich zu den Modifikationen durch Phosphorylierung konnte ich einige andere posttranslationale Modifikationen zeigen, die jedoch nicht verifiziert wurden. Die Bedeutung dieser Phosphorylierung, sowie anderer identifizierter Modifikationen, sollte durch weitere Experimente beleuchtet werden. In einem Kollaborationsprojekt mit S. Kneitz und N. Nuwal untersuchte ich die Auswirkungen der Sap47156 und Syn97 Mutationen mithilfe einer Microarray Analyse des gesamten Drosophila Transkriptoms der individuellen Nullmutanten sowie Doppelmutanten (V2 und V3). Es wurden einige Kandidaten gefunden, die in den Mutanten signifikante Änderungen aufweisen. Diese Gene sollten weiterhin auf ihre Interaktionen mit Sap47 und Syn untersucht werden. In einem weiteren Projekt untersuchte ich die Rolle und Funktion des Drosophila tubulin binding chaperon E-like-Gens(Tbcel, CG12214). Das TBCEL Protein weist eine hohe Homologie zum Vertebraten TBCE-like (oder E-like) auf, welches über eine namensgebende hohe Sequenzähnlichkeit zum Tubulin bindenden Chaperon E (TBCE) verfügt. Ich erzeugte ein polyklonales anti-TBCEL Antiserum (in Kollaboration mit G. Krohne). Laut Flybase besitzt das Tbcel-Gen nur ein Exon und kodiert für zwei unterschiedliche Transkripte durch alternative Orte des Transkriptionsstarts. Das längere Traskript RB ist nur in Männchen vorhanden, während das kürzere Transkript RA sich nur in Weibchen finden lässt. Um eine Untersuchung der Genfunktion zu ermöglichen, führte ich eine P-Element jump-out-Mutagenese durch, mit der Deletions-Mutanten generiert werden sollten. Ich benutzte dazu den Stamm NP4786 (NP), welches eine P(GawB) Insertion in der 5´ UTR des Tbcel-Gens aufweist. NP4786 Fliegen sind aufgrund einer second-site Lethalität homozygot letal, da sie über einer chromosomalen Defizienz (Df) (einer Deletion der genomischen Region, die das Tbcel-Gen sowie benachbarte Gene umfasst) lebensfähig sind. Die P-Element jump-out-Mutagenese wurde von mir zweimal durchgeführt, wobei ich beim ersten Mal nur Revertanten erhielt, während der zweite Durchgang sich momentan noch in Arbeit befindet. Beim zweiten Versuch wurde der jump-out über dem Defizienz-Chromosom durchgeführt, um eine doppelsträngige DNA Reparatur durch das homologe Chromosom zu verhindern. Während der zweiten Mutagenese wurde ein Stamm G18151 verfügbar, bei welchem die P-Element Insertion im offenen Leseraster (Open reading frame: ORF) des Tbcel-Gens erfolgt war. Western Blots von frischem Gewebehomogenat der NP/Df und G18151 Fliegen zeigten nach dem Testen mit anti-TBCEL Antiserum kein Signal, was darauf schließen lässt, dass diese Fliegen Tbcel Nullmutanten sind. Ich verwendete diese Fliegen für weitere immunhistochemische Analysen und fand heraus, dass TBCEL im Wildtyp spezifisch im Zytoplasma der Cysten-Zellen der Hoden exprimiert wird, sowie mit dem Tubulin der Spermatidenschwänze assoziert ist, während es in den NP/Df und G18151 Fliegen keine TBCEL-Färbung der Cysten-Zellen gab. Des weiteren konnte eine Störung der Actin Kegel und eine Anreicherung von TBCEL um diese herum gezeigt werden. Diese Ergebnisse werden zusätzlich durch die Beobachtung unterstützt, dass die Enhancer-trap Expression der NP4786 Linie analog zu dem TBCEL in den Cysten-Zellen lokalisiert ist. Zusätzlich wurde die Fertilität der NP/Df und G18151 Männchen getestet und gezeigt, dass diese Tiere nahezu vollständig steril sind. Die Ergebnisse lassen daher vermuten, dass TBCEL an der Spermatogenese bei Drosophila beteiligt ist, sowie eine mögliche Rolle bei der Elongation und Individualisierung der Spermatiden spielt.
KW  - Taufliege
KW  - Synapsine
KW  - Molekularbiologie
KW  - synaptisch protein
KW  - synapsin
KW  - tubulin binding chaperone E-like
KW  - SAP47
KW  - Massenspektrometrie
KW  - synaptic proteins
KW  - synapsin
KW  - tubulin binding chaperone E-like
KW  - SAP47
KW  - mass spectrometry
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51683
ER  - 
TY  - THES
A1  - Knapek, Stephan
T1  - Synapsin and Bruchpilot, two synaptic proteins underlying specific phases of olfactory aversive memory in Drosophila melanogaster
T1  - Synapsin und Bruchpilot, zwei synaptische Proteine für spezifische Komponenten von aversivem olfaktorischem Gedächtnis bei Drosophila melanogaster
N2  - Memory is dynamic: shortly after acquisition it is susceptible to amnesic treatments, gets gradually consolidated, and becomes resistant to retrograde amnesia (McGaugh, 2000). Associative olfactory memory of the fruit fly Drosophila melanogaster also shows these features. After a single associative training where an odor is paired with electric shock (Quinn et al., 1974; Tully and Quinn, 1985), flies form an aversive odor memory that lasts for several hours, consisting of qualitatively different components. These components can be dissociated by mutations, their underlying neuronal circuitry and susceptibility to amnesic treatments (Dubnau and Tully, 1998; Isabel et al., 2004; Keene and Waddell, 2007; Masek and Heisenberg, 2008; Xia and Tully, 2007). A component that is susceptible to an amnesic treatment, i.e. anesthesia-sensitive memory (ASM), dominates early memory, but decays rapidly (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). A consolidated anesthesia-resistant memory component (ARM) is built gradually within the following hours and lasts significantly longer (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). I showed here that the establishment of ARM requires less intensity of shock reinforcement than ASM. ARM and ASM rely on different molecular and/or neuronal processes: ARM is selectively impaired in the radish mutant, whereas for example the amnesiac and rutabaga genes are specifically required for ASM (Dudai et al., 1988; Folkers et al., 1993; Isabel et al., 2004; Quinn and Dudai, 1976; Schwaerzel et al., 2007; Tully et al., 1994). The latter comprise the cAMP signaling pathway in the fly, with the PKA being its supposed major target (Levin et al., 1992). Here I showed that a synapsin null-mutant encoding the evolutionary conserved phosphoprotein Synapsin is selectively impaired in the labile ASM. Further experiments suggested Synapsin as a potential downstream effector of the cAMP/PKA cascade. Similar to my results, Synapsin plays a role for different learning tasks in vertebrates (Gitler et al., 2004; Silva et al., 1996). Also in Aplysia, PKA-dependent phosphorylation of Synapsin has been proposed to be involved in regulation of neurotransmitter release and short-term plasticity (Angers et al., 2002; Fiumara et al., 2004). Synapsin is associated with a reserve pool of vesicles at the presynapse and is required to maintain vesicle release specifically under sustained high frequency nerve stimulation (Akbergenova and Bykhovskaia, 2007; Li et al., 1995; Pieribone et al., 1995; Sun et al., 2006). In contrast, the requirement of Bruchpilot, which is homologous to the mammalian active zone proteins ELKS/CAST (Wagh et al., 2006), is most pronounced in immediate vesicle release (Kittel et al., 2006). Under repeated stimulation of a bruchpilot mutant motor neuron, immediate vesicle release is severely impaired whereas the following steady-state release is still possible (Kittel et al., 2006). In line with that, knockdown of the Bruchpilot protein causes impairment in clustering of Ca2+ channels to the active zones and a lack of electron-dense projections at presynaptic terminals (T-bars). Thus, less synaptic vesicles of the readily-releasable pool are accumulated to the release sites and their release probability is severely impaired (Kittel et al., 2006; Wagh et al., 2006). First, I showed that Bruchpilot is required for aversive olfactory memory and localized the requirement of Bruchpilot to the Kenyon cells of the mushroom body, the second-order olfactory interneurons in Drosophila. Furthermore, I demonstrated that Bruchpilot selectively functions for the consolidated anesthesia-resistant memory. Since Synapsin is specifically required for the labile anesthesia sensitive memory, different synaptic proteins can dissociate consolidated and labile components of olfactory memory and two different modes of neurotransmission (high- vs. low frequency dependent) might differentiate ASM and ARM.
N2  - Gedächtnis ist ein dynamischer Prozess. In der Zeit kurz nach seiner Bildung ist es instabil und anfällig gegen amnestische Störungen, dann wird es schrittweise konsolidiert und schließlich resistent gegenüber retrogradem Gedächtnisverlust (McGaugh, 2000). Auch das assoziative olfaktorische Gedächtnis der Fruchtfliege Drosophila melanogaster zeigt diese Merkmale. Nach einem einzelnen assoziativen Training, in welchem ein Duft mit elektrischen Stromstößen gepaart wird, bilden die Fliegen ein aversives Duftgedächtnis, welches über mehrere Stunden anhält und aus qualitativ unterschiedlichen Komponenten besteht (Quinn et al., 1974; Tully and Quinn, 1985). Diese Komponenten können zum Beispiel durch Mutationen, die zugrunde liegenden neuronalen Verknüpfungen oder durch ihre Anfälligkeit für amnestische Behandlungen unterschieden werden (Dubnau and Tully, 1998; Isabel et al., 2004; Keene and Waddell, 2007; Masek and Heisenberg, 2008; Xia and Tully, 2007). Eine gegen amnestische Behandlungen, wie beispielsweise Kälte-induzierte Betäubung, anfällige Komponente beherrscht das frühe Gedächtnis, zerfällt jedoch schnell (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). Diese wird deshalb Anästhesie-sensitives Gedächtnis genannt (anesthesia-sensitive memory [ASM]). Im Gegensatz dazu baut sich eine konsolidierte Komponente erst langsam in den folgenden Stunden nach dem Training auf, hält stattdessen jedoch länger an (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). Diese Komponente ist resistent gegenüber Kälte-induzierter Anästhesie und wird deshalb als ARM (anesthesia-resistant memory) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass das konsolidierte ARM bereits mit deutlich weniger starken Elektroschocks im Training gebildet wird als das instabile ASM. ARM und ASM unterliegen unterschiedliche molekulare und/oder neuronale Prozesse. Während in einer Mutante für das radish Gen selektiv ARM beeinträchtigt ist, werden andere Gene wie zum Beispiel amnesiac oder rutabaga ausschließlich für ASM benötigt (Dudai et al., 1988; Folkers et al., 1993; Isabel et al., 2004; Quinn and Dudai, 1976; Schwaerzel et al., 2007; Tully et al., 1994). Die beiden letzteren sind Teil des cAMP Signalweges, welcher vermutlich hauptsächlich die cAMP abhängige Protein-Kinase A (PKA) aktiviert (Levin et al., 1992). Hier zeige ich, dass eine Null-Mutante für das evolutionär konservierte Phosphoprotein Synapsin einen selektiven Defekt in ASM hat. Weitere Experimente lassen vermuten, dass Synapsin als Effektor stromabwärts der cAMP/PKA Kaskade wirkt. Ähnlich wie bei Drosophila spielt Synaspin auch in Vertebraten eine Rolle in unterschiedlichen Lernparadigmen (Gitler et al., 2004; Silva et al., 1996). Auch in der Meeresschnecke Aplysia wurde eine PKA abhängige Phosphorylierung von Synapsin als Mechanismus für die Regulierung von Neurotransmitterausschüttung und Kurzzeitplastizität vorgeschlagen (Angers et al., 2002; Fiumara et al., 2004). Synapsin wird für die Bildung eines Reserve-Pools von Vesikeln an der Präsynapse und für die Aufrechterhaltung der Vesikelausschüttung speziell bei anhaltender, hochfrequenter Stimulation von Nervenzellen benötigt (Akbergenova and Bykhovskaia, 2007; Li et al., 1995; Pieribone et al., 1995; Sun et al., 2006). Im Gegensatz dazu wird Bruchpilot, ein Protein der aktiven Zone und homolog zu den ELKS/CAST Proteinen bei Säugern (Wagh et al., 2006), haupsächlich für sofortige Vesikelausschüttung gebraucht (Kittel et al., 2006). Bei wiederholter Stimulation an Motorneuronen einer bruchpilot Mutante ist die akute Vesikelausschüttung stark vermindert, während die darauf folgende andauernde Ausschüttung noch immer möglich ist (Kittel et al., 2006). Dazu passend beeinträchtigt eine künstliche Verminderung des Bruchpilot-Proteins die Ansammlung von Ca2+ Kanälen an den aktiven Zonen, sowie die Bildung von elektronendichten Strukturen (T-bars) an den präsynaptischen Endigungen. Deshalb akkumulieren weniger Vesikel des “readily-releasable” Pools an den Ausschüttungsstellen und die Ausschüttungswahrscheinlichkeit ist stark vermindert (Kittel et al., 2006; Wagh et al., 2006). In dieser Arbeit zeige ich zum ersten Mal, dass Bruchpilot für aversives olfaktorisches Gedächtnis benötigt wird. Der Ort an dem Bruchpilot hierfür gebraucht wird sind die Kenyon-Zellen des Pilzkörpers, die olfaktorischen Interneuronen zweiter Ordnung in Drosophila. Desweiteren zeige ich, dass die Funktion von Bruchpilot selektiv für das konsolidierte ARM ist. Da Synapsin spezifisch für das labile ASM benötigt wird, können diese beiden olfaktorischen Gedächtniskomponenten durch verschiedene synaptische Proteine getrennt werden, und zwei unterschiedliche Arten der Neurotransmitterausschüttung (abhängig von hoch- oder niedrig-frequenter Stimulation) könnten ASM und ARM auseinander halten.
KW  - Taufliege
KW  - Assoziatives Gedächtnis
KW  - Geruchswahrnehmung
KW  - Molekularbiologie
KW  - Synapsin
KW  - Bruchpilot
KW  - Präsynapse
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - olfaktorisches Gedächtnis
KW  - Synapsin
KW  - Bruchpilot
KW  - presynapse
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - olfactory memory
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49726
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heinecke, Kai
T1  - Die Dynamik der primären Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren
T1  - Dynamics of the primary recognition steps of BMP receptors
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor β (TGF-β) die Transforming Growth Factor β-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im nächsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und fünf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuität in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen lässt. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ ähnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellulären Domäne, einer Transmembrandomäne sowie einer intrazellulären Kinasedomäne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellulären Domänen führt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene auslösen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilität der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass für die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden nötig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalität der verschiedenen Rezeptordomänen in der Signalübermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedomäne abhängig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abhängig ist.
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), together with Activins, Growth and Differentiation Factors (GDFs) and Transforming Growth Factor β (TGFβ), are secreted signalling proteins that belong to the Transforming Growth Factor β superfamily. They play an important role in regulating the development, maintenance and regeneration of tissues and organs. Signalling of TGFβ superfamily members occurs by binding to two types of serine-/threonine kinase receptors termed type I and type II. First, the high affinity receptor (in case of BMP2 the type I receptor) is bound, and then the low affinity receptor is recruited into the signalling complex. The fact that there are only seven type-I and five type-II receptors are known implies a limited promiscuity in ligand-receptor interaction. The architecture of both receptor subtypes is quite similar, with a small extracellular ligand-binding domain, a single transmembrane domain and an intracellular kinase domain. Subsequent transphosphorylation of the intracellular receptor domains leads to phosphorylation of SMAD proteins, which then act as downstream mediators and activate gene transcription. The main part of this work was to analyze the initial steps in receptor complex formation and the mobility of TGFβ-superfamily receptors with fluorescence microscopy techniques. It could be shown that complex formation requires a certain ligand threshold concentration and shows an all-or-nothing switch-like behaviour. Furthermore, differences between different ligands using the same receptors could be visualized. The other parts of this work deal with the functionality of the different receptor domains in signal transduction, the analysis of high- and low-affinity binding sites on whole cells and the influence of the SMAD- and MAPK-pathways on alkaline phosphatase induction. It could be shown that the type of SMAD phosphorylation ist solely dependent on the type of the kinase domain, that there exist different receptor populations on a cell that are addressed by different ligand concentrations and that alkaline phosphatase induction is highly dependent on the time course of SMAD- and MAPK-pathway activation.
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
KW  - Signaltransduktion
KW  - Signalkomplex
KW  - Rezeptormobilität
KW  - Rezeptor-Liganden-Interaktion
KW  - Physiologische Chemie
KW  - Molekulare Biophysik
KW  - Molekularbiologie
KW  - Signaling complex
KW  - receptor mobility
KW  - receptor-ligand-interaction
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257
ER  - 
TY  - THES
A1  - Link, Stefanie
T1  - Molekulare Charakterisierung des Filamentösen Hämagglutinins von Bordetella holmesii
T1  - Molecular characterization of the filamentous hemagglutinin of Bordetella holmesii
N2  - Zur Gattung Bordetella zählen derzeit neun verschiedene Arten Gram-negativer Bakterien. Der strikt humanpathogene Keim B. pertussis ist der Erreger des Keuchhustens und stellt das wohl wichtigste Mitglied der Gattung dar. B. holmesii gehört zu den sogenannten neuen Bordetella-Arten und wurde 1995 erstmals von Weyant et al. beschrieben. In den letzten Jahren gewann B. holmesii als humanpathogener Keim, der Keuchhusten-ähnliche Erkrankungen verursacht, zunehmend an Bedeutung. Mit Ausnahme des BvgAS-Systems (Gerlach et al., 2004) konnten in B. holmesii bislang keine für die „klassischen“ Bordetella-Arten bekannten Virulenzfakoren nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein zum Filamentösen Hämagglutinin homologer Faktor in B. holmesii identifiziert. Der fhaB-Locus aus B. holmesii unterscheidet sich deutlich von dem der anderen Bordetella-Arten, da die fhaB-Sequenz in B. holmesii (fhaBBH) stromaufwärts von einem putativen Membranprotein und stromabwärts von einem IS1001-ähnlichen IS-Element flankiert wird. Sowohl auf DNA- als auch auf Proteinebene weist das fhaBBH-Gen die größte Ähnlichkeit zu dem fhaB-Homolog aus B. avium auf, was die Vermutung bestärkt, dass B. holmesii phylogenetisch im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Durch in silico-Analysen der FhaBBH-Aminosäuresequenz konnte eine N-terminale Signalpeptiddomäne sowie eine TPS-Domäne identifiziert werden. Dies lässt vermuten, dass FHABH an die bakterielle Oberfläche transportiert und möglicherweise sekretiert wird. Anhand von in silico-Analysen wurde zudem ein KGD-Motiv, nicht jedoch eine Heparinsulfat- und eine Kohlenhydratbindedomäne im FhaBBH identifiziert. Das KGD-Motiv könnte das RGD-Motiv im FHA der „klassischen“ Bordetella-Arten bei der Erkennung von Rezeptoren ersetzen. In Zellkultur-Experimenten konnte die Adäsionsfähigkeit von B. holmesii G7702 an A549-Zellen nachgewiesen werden. Eine fhaB-Deletionsmutante des entsprechenden Stammes zeigte dagegen eine signifikant niedrigere Adhäsionsrate an die menschlichen Lungenepithelzellen. Somit konnte gezeigt werden, dass FHA in B. holmesii eine Rolle als Adhäsionsfaktor spielt. Die im Vergleich zum Wildtyp stark verringerte Adhäsionsrate der bvgA-Mutante von B. holmesii G7702 lässt zudem auf die Beteiligung weiterer Adhäsionsfaktoren an der Wirtszelladhäsion in B. holmesii und deren Regulation durch das BvgAS-Systems schließen. Die Regulationsstudien haben gezeigt, dass die fhaB-Transkription in B. holmesii über zwei konstitutiv aktive Promotoren und einen bvg-abhängigen Promotor erfolgt. In vitro ist phosphoryliertes BvgABH in der Lage, spezifisch an die fhaB-upstream-Region aus B. holmesii zu binden. Innerhalb der fhaBBH-upstream-Region wurden drei putative BvgA-Bindestellen BS2-4 identifiziert, die Ähnlichkeiten zu inverted repeat-Anordnungen der BvgA-Konsensussequenz 5’- T/A T T C C/T T A -3’ aufweisen. Basierend auf den Ergebnissen der in vitro-Binde- und in vivo-Expressionsstudien zur Charakterisierung der einzelnen putativen BvgABH-Bindestellen wird ein Modell für die BvgABH-Bindung innerhalb des fhaB-Promotors in B. holmesii vorgeschlagen. Demnach wird zunächst die primäre BvgABH-Bindestelle BS2 mit der höchsten Affinität von BvgABH-P gebunden, wobei für BvgABH-P eine Dimerisierung angenommen wird. Anschließend bindet ein zweites BvgABH-P-Dimer an die als sekundäre Bindestelle bezeichnete BS3-Region, die sich stromabwärts von BS2 befindet. Eine möglicherweise darauf folgende unspezifische Anlagerung von zwei weiteren BvgABH-P-Dimeren an den 37 bp großen DNA-Abschnitt zwischen BS2 und BS3 ist, ebenso wie die Besetzung der niedrigaffinen Bindestelle BS4 durch ein weiteres BvgABH-P-Dimer, hauptsächlich auf kooperative Protein-Protein-Wechselwirkungen zurückzuführen. Das an BS4 gebundene BvgABH-P-Dimer befindet sich am weitesten stromabwärts und könnte zusammen mit der RNA-Polymerase die Initiation der Transkription gewährleisten. Ergebnisse aus den in vitro-Bindestudien sowie die unterschiedliche Zusammensetzung und Anordnung der putativen BvgA-Bindestellen der fhaB-Promotoren aus B. holmesii und B. pertussis deuten auf eine unterschiedliche Regulation dieser beiden Promotoren hin. So scheint der fhaB-Promotor aus B. holmesii, im Vergleich zum fhaB-Promotor aus B. pertussis, erst bei höheren Konzentrationen an phosphoryliertem BvgA gebunden und somit aktiviert zu werden. In B. holmesii wird vermutlich die konstitutive FHA-Synthese nach BvgAS-Stimulation durch die bvg-abhängige fhaBBH-Expression unterstützt, um eine erfolgreiche Infektion des Wirtes zu gewährleisten.
N2  - The Bordetella genus which are Gram-negative bacteria include nine species. The most important member of this genus is Bordetella pertussis, a strictly human pathogen and the agent of whooping cough. B. holmesii belongs to the so-called new Bordetella species and has been described for the first time in 1995 by Weyant et al.. Over time it has emerged as an important pathogen, which can cause pertussis-like disease in humans. Except for the bvgAS locus no “classical” virulence factors have been detected in B. holmesii so far. Here it was possible to identify a fhaB-homologous gene in B. holmesii G7702 (fhaBBH). The fhaBBH upstream region was found to contain an open reading frame, orfMP, encoding an putative membrane protein, which is also present in B. bronchiseptica and B. parapertussis. An IS1001-like IS element is located downstream of fhaB in B. holmesii (Karin Schmitt, personal communication). Thus the fhaB locus of B. holmesii exhibits significant differences compared to that of the B. bronchiseptica cluster and the other “new” Bordetella species. Sequence alignments indicated, that fhaB of B. holmesii is most similar to the homologue of B. avium on DNA as well as on protein level. This suggests a phylogenetic position of B. holmesii near B. avium. FhaBBH contains an N-terminal signal peptide domain, which in general is necessary for the sec-depending transport of proteins through the cytoplasmic membrane. Furthermore, a so-called TPS domain could be identified inside the FhaB of B. holmesii, suggesting the transport of FHABH to the bacterial surface and possibly secretion. Sequence analysis of FhaBBH also revealed a KGD motif, but no heparin binding and no carbohydrate binding site could be identified. Possibly the KGD motif could replace the RGD motif of “classical” FHA in receptor recognition. Cell culture experiments demonstrated that B. holmesii G7702 is able to adhere to A549 cells and that filamentous haemagglutinin plays a role as adhesion factor in B. holmesii. Thus the strain B. holmesii G7702 fhaB-, in which fhaBBH is deleted, exhibited a significantly lower adhesion rate compared to the wildtype strain. Furthermore, for the strain B. holmesii G7702 bvgA::kan, which cannot produce BvgA, a significant lower adhesion rate compared to B. holmesii G7702 and B. holmesii G7702 fhaB- could be observed. This leads to the assumption that fhaB expression in B. holmesii depends on BvgASBH. The adhesion behaviour of B. holmesii G7702 bvgA::kan also shows that in addition to FHA other adhesion factors, which are presumably regulated by the BvgASBH system, seem to be involved in host cell adhesion of B. holmesii. The regulation studies indicated, that fhaB transcription in B. holmesii can occur from three different promotors, two of which are constitutive (P1 and P2) and one which is under the control of the BvgASBH system (P3). In vitro, the phosphorylated form of BvgABH is able to bind to the fhaB upstream region of B. holmesii specifically. Inside the fhaB upstream region of B. holmesii, three putative BvgABH binding sites could be identified. These regions, named BS2-4, exhibit similarities to “inverted repeat” structures of the BvgA consensus sequence 5’- T/A T T C C/T T A -3’. Based on the in vitro and in vivo results concerning the characterization of the putative BvgABH binding sites, a model for BvgABH binding inside the fhaBBH upstream region was developed. According to that, BvgABH-P binds as a dimer first to the primary binding site BS2 with a high affinity. After that a second BvgABH-P dimer binds to BS3 inside the secondary binding region, which is located downstream of BS2. A possibly subsequent unspecific binding of two additional BvgABH-P dimers to the region between BS2 and BS3 and the occupation of BS4 results exclusively from cooperative protein-protein interactions. The BvgABH-P dimer, which binds to BS4, is located downstream and presumably interacts with the RNA polymerase in order to initiate fhaBBH transcription. Results from in vitro binding studies as well as the divergent structure and localisation of BvgA binding sites inside the fhaB promotors of B. holmesii and B. pertussis suggest a differential regulation of these two promotors. For activation of fhaB promotor of B. holmesii, higher concentrations of phosphorylated response regulator seem to be necessary compared to that for fhaB promotor activation in B. pertussis. Presumably in B. holmesii the constitutive fhaBBH expression is supported by the bvg-dependent fhaBBH expression as a result of a BvgASBH stimulating signal in order to guarantee successful infection of the host.
KW  - Bordetella
KW  - Adhäsine
KW  - Molekularbiologie
KW  - Bordetella holmesii
KW  - Filamentöses Hämagglutinin
KW  - BvgAS-System
KW  - Bordetella holmesii
KW  - filamentous hemagglutinin
KW  - bvgAS system
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23049
ER  - 
TY  - THES
A1  - Milenkovic, Vladimir M.
T1  - Structural and functional analysis of bestrophin
N2  - Morbus Best (OMIM 153700), auch als vitelliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) bezeichnet, ist eine autosomal dominant vererbte Makuladystrophie mit juvenilem Beginn. Die Erkrankung geht einher mit einer Ansammlung von Lipofuscin-ähnlichem Material im sowie unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE). Das bei Morbus Best mutierte VMD2- Gen kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein, genannt Bestrophin, und wird vorwiegend im RPE exprimiert. Das Protein hat eine komplexe Membrantopologie mit 4-6 putativen Transmembrandomänen (TMD) und ist vermutlich in den Ca2+-abhängigen Transport von Chloridionen durch die Plasmamembran involviert. Die überwiegende Mehrheit der krankheitsassoziierten Veränderungen bei M. Best Patienten sind Missense-Mutationen, die innerhalb der hochkonservierten N-terminalen Hälfte des Proteins nahe der mutmaßlichen Transmembrandomänen akkumulieren. Der Zusammenhang zwischen Pathologie und identifizierter Mutationen bzw. der Chloridkanal- Funktion von Bestrophin-1 ist noch unklar. Um die biologische Funktion von Bestrohin-1 weiter aufzuklären und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der BMD besser zu verstehen, wurde mit Hilfe des GAL4-basierenden Hefe-Zwei-Hybridsystems (Y2H) nach interagierenden Partnern von Bestrophin-1 gesucht. Ein Screen in einer bovinen RPE cDNABank mit verschiedenen verkürzten Fragmenten von Bestrophin-1 ergab 53 mögliche interagierende Partner. Allerdings schlossen anschließende Verifikationsexperimente die Kandidatengene aus. Somit deuten die Resultate dieser umfangreichen YH2-Studie daraufhin, dass Bestrophin für das herkömmliche Zwei-Hybrid-System nicht geeignet ist. Zum einen könnte dies daran liegen, dass das Protein ein integraler Bestandteil der Membran ist und zum anderen, dass möglicherweise der Transport der gewählten Bestrophin-Fragmente zum Nukleus nicht stattfindet. Dies gilt jedoch als Grundvoraussetzung für eine Proteininteraktion im Hefe-2-Hybridsystem. Bestrophin gehört zu einer großen Familie von integralen Membranproteinen, von der bis heute bereits über 100 Mitglieder bei verschiedenen Organismengruppen wie denSäugern, Insekten und Würmern identifiziert werden konnten. Als auffälligste Besonderheit in der Familie der Bestrophine zeigt sich neben einer nicht-variablen RFP-Domäne (Arginin- Phenylalanin-Prolin) eine evolutionär hochkonservierte N-terminale Region. Um die phylogenetische Beziehung der Bestrophine zu untersuchen sowie den Aufbau und die Funktion von konservierten Motiven innerhalb der Familienmitglieder zu identifizieren, wurde diese konservierte N-terminale Region sowohl bioinformatisch wie auch Chapter Two: Zusammenfassung 4 phylogenetisch weiter untersucht. Die phylogenetische Analyse der Bestrophin Homologen brachte vier evolutionär konservierte Familienmitglieder in Säugern hervor, die jeweils eine starke Homologie zu den Proteinen VMD2, VMD2-L1 bis VMD2-L3 des Menschen zeigen. Die signifikante Ähnlichkeit der Proteinsequenz innerhalb der vier Familienmitglieder lässt die Schlussfolgerungen zu, dass zum einen jedes einzelne Familienmitglied ihre eigene evolutionär konservierte Funktion hat und zum anderen dass die Divergenz des Bestrophins in verschiedene Familienmitglieder zeitlich vor der Divergenz der verschiedenen Säugerspezien erfolgt sein muss.
N2  - Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.
KW  - Makuladegeneration
KW  - Membranproteine
KW  - Molekularbiologie
KW  - VMD2
KW  - bestrophin
KW  - VMD2
KW  - bestrophin
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19372
ER  - 
TY  - THES
A1  - Berkane, Emir
T1  - Etude de l'interaction entre GpJ, une protéine du bactériophage Lambda, et LamB, une protéine de la membrane externe des bactéries gram-négatives
T1  - Interaktion zwischen dem Protein GPJ des Bakteriophagen Lambda und LamB, einem Protein aus der externen Membran von gram-negativen Bakterien
N2  - La fixation du bactériophage Lambda sur son récepteur cellulaire, LamB, est dûe à une protéine de sa queue appelée GpJ. Le but des travaux est d’étudier l’intéraction entre le bactériophage Lambda et LamB à travers l’étude du complexe entre LamB et GpJ exprimée en protéine de fusion. Pour ce faire, deux protéines de fusion sont utilisées : MBP-gpJ et HisgpJ. MBP-gpJ est une protéine de fusion entre la Maltose Binding Protéine et l’extrêmité Cterminale de la protéine GpJ (résidu 684 à 1132), grâcieusement fournie par le Pr. Charbit (Paris, France). Grâce à la Technique du Film Noir (BLM), il a été permis d’observer que MBP-gpJ, après expression dans E.coli et purification, intéragit grâce au fragment de GpJ avec l’extrêmité extracellulaire de LamB. Cette intéraction se traduit par un blocage complet et réversible des canaux de LamB sauvage, mais également de mutants: LamB de Shigella sonnei, LamB Y118G et LamB D4+D6+D9v. Afin d’obtenir des informations sur la liaison de LamB avec uniquement le fragment de GpJ sans la partie MBP, une autre protéine de fusion a été réalisée: His-GpJ. His-gpJ représente l’extrêmité C-terminale de GpJ (684-1132) en fusion avec un 6×Histidine-tag. Cette protéine est exprimée sous forme de corps d’inclusion dans E.coli. Après purification et renaturation, une protéine de nouveau soluble peut être obtenue. Lors d’expériences de Film Noir, His-gpJ intéragit certes avec LamB, mais n’induit pas le blocage des canaux comme précedemment observé après ajout de MBP-gpJ. En parallèle, la formation d’un complexe entre His-gpJ et LamB sauvage, ainsi que de mutants a pu être confirmée au travers de travaux de SDS-PAGE et d’immunodétection par la présence de bandes de masse moléculaire élevée. L’utilisation de mutants de LamB a par ailleurs permis d’essayer d’identifier la partie de LamB impliquée dans l’interaction avec le fragment C-terminal de GpJ, qui se révèle être différente de celle de GpJ dans la queue du bactériophage Lambda. Mots clés: bactériophage Lambda, gpJ, LamB, technique du film noir (BLM), immunodétection.
N2  - The bacteriophage Lambda is a virus which infects bacteria carrying LamB protein in their outer membrane. GpJ, a protein of the tail of the phage, is involved in the binding to LamB. The study of the interaction between GpJ expressed as fusion protein and LamB was performed in order to investigate the interaction between the bacteriophage Lambda and LamB. The fusion proteins are called MBP-gpJ and His-gpJ. MBP-gpJ is a chimeric protein representing Maltose Binding Protein connected to the Cterminal part of the GpJ protein (residue 684 until 1132), graciously given by Pr. Charbit (Paris, France). MBP-gpJ, expressed in E.coli and purified, bound to the exoplasmic side of LamB and LamB variants in planar lipid bilayer experiments and allowed a complete and reversible blockage of LamB channels. In order to obtain data about the binding of the GpJ fragment alone to LamB, an other fusion protein without MBP was created, called His-gpJ. His-gpJ is the C-terminal part of GpJ (684-1132) in fusion with a 6×Histidine-tag, produced as insoluble form in E.coli. After renaturation, a soluble protein can be obtained. Without MBP, the GpJ fragment still bound to LamB in planar lipid bilayer experiments, but did not block significantly its channels, as previously observed after addition of MBP-gpJ. The interaction between His-gpJ and LamB or LamB mutants was also demonstrated on SDSPAGE and immunodetection by the presence of high molecular mass bands. Furthermore, the use of variants of lamB allowed to demonstrate that the C-terminal fragment of GpJ does not bind to the same area on the surface of LamB than GpJ involved in the tail of the Lambda phage.
KW  - Bakteriophage Lambda
KW  - Molekularbiologie
KW  - GPJ
KW  - Phage Lamda
KW  - LampB
KW  - gram-negative Bakterien
KW  - GPJ
KW  - Phage Lamda
KW  - LamB
KW  - gram-negative Bacteria
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12889
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lalic-Mülthaler, Mio
T1  - Molekularbiologischer Nachweis und Immunologie des P60-Proteins, sowie In-vitro-Transkription PrfA-abhängiger bzw. -unabhängiger Gene von Listeria monocytogenes
T1  - Molecular biologycal detection and immunology of the P60-protein and in vitro-transcription of PrfA-dependent and -independent genes of Listeria monocytogenes
N2  - Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).
N2  - Listeria monocytogenes, a Gram positive, optionally intracellular bacterium is capable of causing heavy infections of the central nervous system in immunocompromised humans. Due to its ubiquitous occurrence, as well as its high resistance to preservation methods there is a great interest in its rapid identification and differentiation towards the apathogenen species of Listeria. Due to the preserved and variable domains P60 as an essential housekeeping gene represents a promising target in order to establish ge-nus- and species-specific detection systems. An immunogenic map of the P60 of L. innocua and L. monocytogenes was generated by EPITOP-SPOT-mapping. Furthermore CD4-T-cells specific for P60 were hereby characterized and for one of them the epitope was exactly determined. Transfer experiments with these T-cells and booster infections with L. monocytogenes and/or L. innocua showed that L. innocua alone is not capable of establishing an immune protection against L. monocytogenes, while in vitro and in vivo it was sufficient to maintain an existing immunity through stimulating memory T-cells by cross-reactive epitopes. In vitro-transcription from Phly, PplcA and PactA occurs strictly PrfA-dependent while that of Piap, PprfA1/2 and, unexpectedly, also from Pmpl is PrfA-independent. It requires – except with PprfA - high concentrations of ATP but not GTP. In order to ensure an efficient tran-scription, the first three initiating nucleotides have to be available in higher concentration. RNAP separated over a heparin column after preparation from L. monocytogenes either exposed to heat shock treatment at 48°C (RNAP48), shifted to MEM (RNAPMEM), or cultured directly in BHI (RNAPBHI) showed different activity profiles with the promoters mentioned above. Therefore actA and hly may require an alternative sigma factor (not Sigma-43) for their optimal transcription.
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Immunreaktion
KW  - Molekularbiologie
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - innocua
KW  - P60
KW  - PrfA
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - innocua
KW  - P60
KW  - PrfA
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8760
ER  -