TY - THES A1 - Mambretti, Egle Maria T1 - Opioid receptors as therapeutic targets for nociceptor specific regional analgesia T1 - Opioidrezeptoren als therapeutisches Target einer nozizeptionsspezifischen Regionalanalgesie N2 - Opioids have been, since centuries, the gold standard for pain treatment and relief. They exert their effects after binding to opioid receptors (OP) that are expressed and functional in the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS). As their systemic application has many side effects, including sedation and respiratory depression, a peripheral application of opioids and selective targeting of µ-OP (MOP) in nociceptive axons would be extremely beneficial. MOP presence and function has been conclusively demonstrated at nerve terminals; however it is still controversial whether functional MOPs are available on the membrane of peripheral nociceptive axons to mediate opioid-induced antinociception. While under pathologic conditions (i.e. nerve injury) exogenous as well as endogenous MOP agonists applied at the damaged nerve can elicit potent antinociception or anti-allodynia, under physiological conditions no antinociception was seen in rats. This could be caused by either a lack of functional opioid receptors in the axonal membranes or by the inability of injected opioids to cross the intact perineurial barrier and to reach nociceptors. Previous behavioral test results showed an antinociceptive effect (up to 5h) following perisciatic application of the hydrophilic DAMGO (MOP agonist) if coinjected with hypertonic saline solution (HTS; 10% NaCl), a treatment suited to open the perineural barrier. The effect was inhibited by naloxone, a MOP antagonist, documenting its specific action via MOP. Fentanyl, a lipophilic opioid, elicited an effect, which was enhanced by HTS treatment, indicating that HTS may act not only on the barrier but also directly on axonal MOP presence and/or functionality. To provide a basis for testing this hypothesis, the present work was designed to study the axonal localization of MOP in experimental animals under different conditions using molecular and morphological methods. Initially four different commercial antibodies were tested for MOP detection. Immunoreactions with these antibodies specifically detected MOP in the hippocampus and in amygdala, while in the peripheral nervous system the reactions showed varying labeling patterns pointing towards less specificity with low signal-to-noise ratio. Double labelling with calcitonin gene related peptide (CGRP), a neuropeptide expressed in sensory fibers, with the non-compacted myelin marker S100 or with the neuronal marker PGP9.5 documented significant immunoreaction signals outside sensory nerve fibers. Therefore, none of these antibodies appeared suitable. Taking advantage of a new commercial monoclonal rabbit antibody (RabMAb) and of genetically modified mice in which the fluorescent protein mcherry was inserted in the C-tail of MOP (MOP-mcherry knock-in mice), MOP fusion protein expression in rat and mouse CGRP+ sciatic nerve fibers and fiber bundles was confirmed by immunofluorescence labeling. Immunoelectron microscopic analysis indicated MOP/MOP-mcherry-localization in the cytoplasm and the membranes of unmyelinated axons organized in Remak bundles. Both antibodies detected bands of appropriate size in Western Blot in the CNS and additional larger bands in the PNS. Quantitative analyses 60 min after HTS-treatment revealed no change in MOP mRNA in the sciatic nerve and DRG as well as no change in MOP immunoreactivity in the sciatic nerve. Thus, the opioid-induced long lasting antinociception enhanced by perisciatic injection of HTS were not due to a sustained increased MOP expression or content in sensory, putative nociceptive axons. In summary, the current study succeeded to unequivocally document the presence of MOP protein in intact sensory axons of rat and mouse sciatic nerve. Thus, axonal MOPs may indeed mediate antinociceptive opioid effects observed in behavioral studies in naive animals possibly via activation of potassium or calcium channels. As HTS treatment does not lead to a sustained increase in axonal MOP protein or MOP mRNA expression, other mechanisms might enhance MOP function, including inhibition of MOP recycling or changes in functional coupling. Future studies should further explore the axonal mechanisms of antinociception by opioids and enhancing treatments. N2 - Opioide sind seit Jahrhunderten der Goldstandard für die Schmerzbehandlung. Sie entfalten ihre Wirkung nach der Bindung mit Opioidrezeptoren (OP), die im zentralen (ZNS) und peripheren (PNS) Nervensystem exprimiert und funktionell sind. Da die systemische Anwendung viele Nebenwirkungen hat, wie die Beruhigung und Atemdepression, wäre eine Anwendung von Opioiden und die gezielte Targeting von µ-OP (MOP) in nozizeptiven Axone in Rahmen einer Regionalanalgesie besser. Die Anwesenheit und die Funktionalität der MOP wurden zwar schon in Nervenendungen gezeigt, aber es ist noch strittig, ob funktionelle MOP in der Membran von peripheren nozizeptiven Axonen sind, um opioid-induzierte Antinozizeption zu vermitteln. Während bei Erkrankungen der Nerven (z.B. traumatische Nervenbeschädigung) exogene und endogene MOP-Agonisten Antinozizeption und Antiallodynie bewirken, konnte in gesunden Ratten kein Effekt bei perineuraler Injektion am Nerven beobachtet werden. Dies könnte entweder durch einen Mangel an funktionellen OP in axonalen Membranen verursacht sein. Alternativ könnte die mangelde Penetration der injizierten Opioide durch die Barriere des Perineuriums verantwortlich sein, die es verhindert, dass die Opioide die Nozizeptoren erreichen. Vorherige Ergebnisse aus Schmerzverhaltenstests zeigten eine Anhebung von mechanischen nozizeptiven Schwellen (bis 5 h) nach perineuraler Anwendung des hydrophilen MOP-Agonisten DAMGO, wenn dieser mit einer hypertonen Lösung (HTS; 10% NaCl) ko-injiziert war. Denn dies ist eine geeignete Behandlung, die die Barriere des Perineuriums öffnet. Der Effekt wurde von Naloxon, einem MOP-Antagonist, gehemmt, was eine spezifische Wirkung via MOP unterstützt. Die Wirkung von Fentanyl, einem lipophilen Opioid, wurde ebenfalls durch die HTS-Behandlung verbessert. Das führt zu unserer Hypothese, dass HTS nicht nur die Schranke öffnet, sondern auch direkt Expression und/oder Funktionalität von axonalen MOP verbessert. Um eine Grundlage für die Untersuchung dieser Hypothese zu schaffen, war das Ziel dieser Arbeit, die axonale MOP bei Versuchstieren unter verschiedenen Bedingungen mit molekularen und morphologischen Methoden zu charaktiersieren. Am Anfang wurden vier verschiedene kommerzielle Antikörper für die Erkennung der MOP getestet. Immunreaktionen mit diesen Antikörpern wiesen spezifisch MOP in dem Hippocampus und in der Amygdala nach, während im peripheren Nervensystem die Immunreaktion veränderliche Markierungsmuster und weniger Spezifität mit einem ungünstigeren Signal-zu-Hintergund Verhältnis zeigte. Die Doppelmarkierung mit calcitonin gene-related peptide (CGRP), einem Neuropeptid, das in sensorischen Fasern exprimiert ist, mit dem Marker für non-compacted Myelin S100 oder mit dem neuronalen Marker PGP9.5, bestätigte ein reproduzierbares Färbemuster außerhalb sensorischer Nervenfasern. Deshalb war keiner dieser Antikörper geeignet. Mit der Anwendung eines neuen kommerziell erhältlichen monoklonalen Kaninchen Antikörpers (RabMAb) gegen MOP sowie gentechnisch veränderten Mäusen, bei denen das fluoreszierende Protein mCherry in das C-terminale Ende von MOP eingefügt wurde (MOP-mcherry knock-in Mäusen), wurden MOP und das MOP-Fusionprotein im CGRP+ im Ischiasnerv und Fasernbündeln durch Immunfluoreszenzmarkierung von Ratten und Mäuse bestätigt. Die immunelectron-mikroscopische Analyse zeigte MOP/MOP-mcherry im Zytoplasma und der Membran unmyelinizierter Axone, die in Remak Bündlen organisiert sind. Beide Antikörper erkannten Banden in richtige Größe in Western Blot in ZNS und mehrere größere Banden in PNS. Quantitative Analysen 60 min nach HTS-Behandlung zeigten keine Veränderung in MOP mRNA in dem Ischiasnerv und Hinterwurzelganglion sowie keine Veränderung in der MOP-Immunreaktivität in dem Ischiasnerv. Daher müssen noch weitere Ursachen für die verbesserte Wirkung von Opioiden am Nerven nach HTS in Betracht gezogen werden. Zusammenfassend konnte diese Studie die MOP-Proteins in intakten sensorischen Axonen des N. ischiadicus der Ratte und Maus eindeutig nachweisen. Axonale MOPs könnten über Kaliumkanäle oder Calciumkanäle in den Verhaltenstests bei naiven Tiere antinozizeptiv wirken. Da die HTS Behandlung zu keiner deutlichen Steigerung von axonalem MOP-Protein führen kann, sollten anderen Mechanismen wie MOP-Recycling oder Veränderung der intrazellulären Singaltransduktion untersucht werden, die die Funktionalität von MOP erhöhen. Zukünftige Studien ferner den genauen Mechanismus klären, wie axonal Opioide antinozizeptiv wirken, um so die Behandlung von Schmerzen mit Regionalanalgesie weiter zu verbessert. KW - opioid receptors KW - nociceptors KW - regional analgesia KW - Opioide KW - Rezeptor KW - Nozizeptor KW - Lokalanästhesie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128866 ER - TY - THES A1 - Schneider, Johannes T1 - Functional diversification of membrane microdomains in Bacillus subtilis T1 - Funktionale Diversifizierung von Membran-Mikrodomänen in Bacillus subtilis N2 - Eukaryotic cells are considered as evolutionary complex organisms because they possess organelles that enable them to regulate the spatio-temporal organization of cellular processes. Spatio-temporal organization of signal transduction cascades occurs in eukaryotic cells via organization of membrane-associated microdomains or lipid rafts. Lipid rafts are nanoscale-sized domains in the plasma membrane that are constituted by a specific set of lipids and proteins and harbor a number of proteins related to signal transduction and trafficking. The integrity of lipid rafts is important for the assembly and functional coordination of a plethora of signaling networks and associated processes. This integrity is partially mediated by a chaperone protein called flotillin. Disruption of lipid raft integrity, for example via depletion or overproduction of flotillin, alters raft-associated signal transduction cascades and causes severe diseases like Alzheimer’s, Parkinson’s disease or cardiovascular disease. It was traditionally assumed that a sophisticated compartmentalization of cellular processes like the one exhibited in lipid rafts was exclusive to eukaryotic cells and therefore, lipid rafts have been considered as a hallmark in the evolution of cellular complexity, suggesting that prokaryotic cells were too simple organisms to organize such sophisticated membrane platforms. However, it was recently discovered that bacteria are also able to organize Functional Membrane Microdomains (FMMs) in their cellular membrane that are able to organize and catalyze the functionality of many diverse cellular processes. These FMMs of bacterial membranes contain flotillin-like proteins which play important roles in the organization of FMM-associated cellular processes. In this dissertation I describe the structural and biological significance of the existence of two distinct flotillin proteins, FloA and FloT, in the FMMs of the bacterial model Bacillus subtilis. Localization studies, proteomic data and transcriptomic analyses show that FloA and FloT are individual scaffold proteins that activate different regulatory programs during bacterial growth. Using the tractable bacterial model system, I show that the functionality of important regulatory proteins, like the protease FtsH or the signaling kinases KinC, PhoR and ResE, is linked to the activity of FMMs and that this is a direct consequence of the scaffold activity of the bacterial flotillins. FloA and FloT distribute heterogeneously along the FMMs of B. subtilis thereby generating a heterogeneous population of FMMs that compartmentalize different signal transduction cascades. Interestingly, diversification of FMMs does not occur randomly, but rather in a controlled spatio-temporal program to ensure the activation of given signaling networks at the right place and time during cell growth. N2 - Eukaryotische Zellen werden als evolutionär komplexe Organismen betrachtet, weil sie Organellen besitzen, mit denen sie die raum-zeitliche Organisation von zellulären Prozessen steuern können. Die räumliche und zeitliche Organisation von Signalwegen in eukaryotischen Zellen erfolgt durch die Abgrenzung von membran-assoziierten Mikrodomänen oder Lipid Rafts. Lipid Rafts sind wenige Nanometer große Felder in der Plasmamembran, die aus einem spezifischen Set von Lipiden und Proteinen zusammengesetzt sind und eine Reihe von für die Signaltransduktion und den Proteintransfer erforderlichen Proteine enthalten. Die Integrität der Lipid Rafts ist wichtig um zahlreiche Signalwege und damit assoziierte Prozesse zu verbinden und funktional zu koordinieren. Diese Integrität wird zum Teil von einem Chaperon-Protein namens Flotillin vermittelt. Eine Beeinträchtigung der Integrität der Lipid Rafts, z.B. aufgrund eines Mangels an Flotillin oder einer Überproduktion von Flotillin, verändert Raft-assoziierte Signalwege und verursacht schwere Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson oder kardiovaskuläre Erkrankungen. Bislang wurde angenommen, dass eine so anspruchsvolle Kompartimentierung zellulärer Prozesse wie im Falle der Lipid Rafts ausschließlich in eukaryotischen Zellen vorkommt. Lipid Rafts galten daher als Meilenstein in der Evolution der zellulären Komplexität und prokaryotische Zellen als zu einfache Organismen, um solch komplexe Plattformen in der Membran einzurichten. Vor kurzem wurde jedoch herausgefunden, dass Bakterien ebenfalls in der Lage sind, Funktionale Mikrodomänen in der Membran (FMMs) zu formen, die viele verschiedene zelluläre Prozesse organisieren und katalysieren können. Diese FMMs in bakteriellen Membranen enthalten Flotillin-ähnliche Proteine, die wichtige Aufgaben bei der Organisation von FMM-assoziierten Prozessen übernehmen. In dieser Dissertation beschreibe ich die strukturelle und biologische Signifikanz des Vorkommens der beiden verschiedenen Flotillin-Proteine FloA und FloT in den FMMs des bakteriellen Modellorganismus Bacillus subtilis. Lokalisationsstudien, proteomische Daten und transkriptomische Analysen demonstrieren, dass FloA und FloT individuelle Gerüstproteine sind, die während des Bakterienwachstums verschiedene regulatorische Programme aktivieren. Mit Hilfe des zugänglichen bakteriellen Modellorganismus zeige ich, dass die Funktionsweise von wichtigen regulatorischen Proteinen, wie z.B. der Protease FtsH oder der Signalwegskinasen KinC, PhoR und ResE, an die Aktivität der FMMs gebunden ist, und dass dies eine direkte Folge der stützenden Tätigkeit der bakteriellen Flotilline ist. FloA und FloT sind unterschiedlich in den FMMs von B. subtilis verteilt, wodurch sie eine heterogene Population von FMMs erzeugen, die verschiedene Signalwege abgrenzen kann. Interessanterweise erfolgt die Diversifizierung der FMMs nicht zufällig, sondern durch ein räumlich und zeitlich kontrolliertes Programm, um die Aktivierung von bestimmten Signalwegen am richtigen Ort und zur richtigen Zeit während des Zellwachstums sicherzustellen. KW - Heubacillus KW - Plasmamembran KW - Diversifikation KW - FMMs KW - Bacillus subtilis KW - Flotillin KW - Lipid Rafts Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127569 ER - TY - THES A1 - Bruttel, Valentin Stefan T1 - Soluble HLA-G binds to dendritic cells which likely suppresses anti-tumour immune responses in regional lymph nodes in ovarian carcinoma T1 - Lösliches HLA-G wird von dendritischen Zellen gebunden, was beim Ovarialkarzinom zur Hemmung von Immunraktionen in regionalen Lymphknoten führen kann N2 - Zusammenfassung Einleitung HLA-G, ein nicht-klassisches HLA bzw. MHC Klasse Ib Molekül, kann sowohl als membrangebundenes als auch als lösliches Molekül verschiedenste Immunzellpopulationen effektiv inhibieren. Unter physiologischen Bedingungen wird HLA-G vor allem in der Plazenta exprimiert, wo es dazu beiträgt den semiallogenen Embryo vor einer Abstoßung durch das mütterliche Immunsystem zu beschützen. Außerdem wird HLA-G in einer Vielzahl von Tumoren wie zum Beispiel in Ovarialkarzinomen überexprimiert. Ziel dieser Arbeit war es besonders die Rolle von löslichem HLA-G im Ovarialkarzinom und die Expression von HLA-G in verschiedenen Subtypen des Ovarialkarzinoms genauer zu untersuchen. Ergebnisse Anhand eines Tissue Microarrays wurde bestätigt dass HLA-G unter physiologischen Bedingungen nur in sehr wenigen Geweben wie Plazenta oder Testes exprimiert wird. Außerdem wurden erstmals auch im Nebennierenmark hohe Expressionslevel detektiert. Im Gegensatz zur physiologischen Expression wurde HLA-G in serösen, muzinösen, endometrioiden und Klarzellkarzinomen und somit in Tumoren aller untersuchten Subtypen des Ovarialkarzinoms detektiert. Am häufigsten war HLA-G in hochgradigen serösen Karzinomen überexprimiert. Hier konnte gezeigt werden dass auf Genexpressionslevel in Ovarialkarzinomen die Expression des immunsuppressiven HLA-G mit der Expression von klassischen MHC Molekülen wie HLA-A, -B oder -C hochsignifikant korreliert. Außerdem konnte in Aszitesproben von Patientinnen mit Ovarialkarzinomen hohe Konzentrationen von löslichem HLA-G nachgewiesen werden. Auch auf metastasierten Tumorzellen in regionalen Lymphknoten war HLA-G nachweisbar. Überraschenderweise wurde aber besonders viel HLA-G auf Dendritischen Zellen in Lymphknoten detektiert. Da in Monozyten und Dendritischen Zellen von gesunden Spendern durch IL-4 oder IL-10 im Gegensatz zu Literatur keine Expression von HLA-G induzierbar war, untersuchten wir ob Dendritische Zellen lösliches HLA-G binden. Es konnte gezeigt werden, dass besonders Dendritische Zellen die in Gegenwart von IL-4, IL-10 und GM-CSF aus Monozyten generiert wurden (DC-10) effektiv lösliches HLA-G über ILT Rezeptoren binden. In Abhängigkeit von ihrer Beladung mit HLA-G hemmen auch fixierte DC-10 Zellen noch die Proliferation von zytotoxischen CD8+ T Zellen. Zudem wurden regulatorische T Zellen induziert. Schlussfolgerungen Besonders in den am häufigsten diagnostizierten hochgradigen serösen Ovarialkarzinomen ist HLA-G in den meisten Fällen überexprimiert. Durch die Expression immunsuppressiver MHC Klasse Ib Moleküle wie HLA-G können wahrscheinlich auch Tumore wachsen, die noch klassische MHC Moleküle exprimieren und aufgrund ihrer Mutationslast eigentlich vom Immunsystem erkannt und eliminiert werden müssten. Lösliches HLA-G könnte zudem lokal Immunantworten gegen Tumorantigene unterdrücken indem es an Dendritische Zellen in regionalen Lymphknoten bindet. Diese Zellen präsentieren nomalerweise zytotoxischen T Zellen Tumorantigene und spielen daher eine entscheidende Rolle in der Entstehung von protektiven Immunantworten. Mit löslichem HLA-G beladene Dendritische Zellen hemmen jedoch die Proliferation von CD8+ T Zellen und induzieren regulatorische T Zellen. Dadurch könnten Ovarialkarzinome “aus der Ferne” auch in metastasenfreien Lymphknoten die Entstehung von gegen den Tumor gerichteten Immunantworten unterdrücken. Dieser erstmals beschriebene Mechanismus könnte auch in anderen malignen Erkrankungen eine Rolle spielen, da lösliches HLA-G in einer Vielzahl von Tumorindikationen nachgewiesen wurde. N2 - Abstract Background HLA-G is a non-classical MHC class I molecule which exerts strong immunosuppressive effects on various immune cells. Several membrane-bound and soluble isoforms are known. Physiologically, HLA-G is predominantly expressed in the placenta, where it contributes to protecting the semi-allogeneic embryo from rejection by the maternal immune system. However, HLA-G is also often upregulated during tumourigenesis, such as in ovarian cancer. The aim of this thesis is to investigate how soluble HLA-G may contribute to local immunosuppression in ovarian carcinomas, and to characterize HLA-G expression in different ovarian carcinoma subtypes and metastases. Results As reported by others, physiological HLA-G expression is restricted to few tissues, such as placenta and testes. Here, HLA-G was also detected in the medulla of the adrenal gland. In contrast, HLA-G expression was frequently detected in tumours of all assessed subtypes of ovarian carcinomas (serous, mucinous, endometrioid and clear cell). Highest expression levels were detected in high-grade serous carcinomas. In primary tumours, expression of HLA-G correlated with expression of classical MHC class I molecules HLA-A, -B and -C. Surprisingly, high levels of HLA-G were also detected on dendritic cells in local lymph nodes. As no expression of HLA-G was inducible in monocytes or dendritic cells from healthy donors in response to IL-10 or IL-4, we speculated that tumour-derived soluble HLA-G might be transferred to dendritic cells via the lymphatic system. Accordingly, high levels of tumour-derived soluble HLA-G were detected in ovarian cancer ascites samples. In vitro, dendritic cells expanded in the presence of IL-4, IL-10 and GM-CSF (DC-10) were particularly prone to binding high amounts of soluble HLA-G via ILT receptors. Furthermore, HLA-G loaded DC-10 cells inhibited the proliferation of CD8 effector cells and induced regulatory T cells, even when the DC-10 cells had been fixed with paraformaldehyde. Conclusion The immunosuppressive molecule HLA-G is overexpressed in high-grade serous ovarian carcinomas, which account for the majority of ovarian cancers. In particular tumours with a high mutational burden and intact expression of classical, immunogenic MHC class Ia molecules may use HLA-G to escape from immunosurveillance. Additionally, tumour-derived soluble HLA-G may inhibit adaptive immune responses by binding to dendritic cells in local lymph nodes. Dendritic cells usually play a decisive role in the initiation of adaptive anti-tumour immune responses by presenting tumour antigens to cytotoxic T cells. In contrast, dendritic cells loaded with soluble HLA-G inhibit the proliferation of effector T cells and promote the induction of regulatory T cells. Thus, soluble HLA-G that is transferred to dendritic cells via lymphatic vessels may enable ovarian carcinomas to remotely suppress anti-tumour immune responses in local lymph nodes. This novel immune-escape mechanism may also exist in other solid tumours that express HLA-G. KW - HLA-G KW - HLA-G KW - Dendritische Zelle KW - Eierstocktumor KW - ovarian cancer KW - ovarian carcinoma KW - transfer KW - dendritic cells KW - immune escape Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127252 ER - TY - THES A1 - Schulze, Markus T1 - Role of Chronophin for glioma cell migration and invasion T1 - Die Rolle von Chronophin für die Migration und Invasion von Gliomzellen N2 - Abstract Glioblastomas, primary brain tumors, represent a tumor entity with a dismal prognosis and a median survival of only about one year. Invasion into the healthy brain parenchyma contributes substantially to the malignancy of this type of brain tumor. Therefore, a better understanding of the mechanisms promoting the invasive behavior of these brain tumors is needed to identify new therapeutic targets. Cofilin, an actin regulatory protein, has been shown to be an important regulator of the invasive behavior of tumor cells in other types of cancer and the actin cytoskeleton is involved in the formation of a variety of cellular structures important for cell migration and invasion. Cofilin is regulated by phosphorylation on a single residue, serine 3. The aim of this thesis was to examine the role of the cofilin regulatory phosphatase chronophin for glioma cell migration and invasion. First, it was established that chronophin depletion in the cell line GBM6840 leads to an increase in the ratio of phosphorylated cofilin to total cofilin. Higher chronophin levels were correlated with a decrease in F-actin in the cell lines GBM6840 and U87 as measured in an actin spin down assay and in a flow cytometry based assay. Furthermore, it was shown that knockdown of chronophin in two different cell lines, GBM6840 and DBTRG-05-MG, strongly increased their invasiveness in vitro. Expression of human chronophin in the cell line U87 decreased its invasiveness substantially. There was no difference in cell proliferation between GBM6840 and DBTRG-05-MG cells expressing a chronophin targeting shRNA or a control shRNA and U87 cells transfected with an empty vector or a human chronophin encoding plasmid. The increase in invasiveness after chronophin depletion could be correlated with an increase in directionality in cell migration under 2D culture conditions in the cell lines U87 and GBM6840. Moreover, treatment with the ROCK inhibitor Y-27632 decreased directionality in GBM6840 cells under 2D culture conditions and reduced the invasiveness of GBM6840 chronophin shRNA cells back to control levels. Expression of a non-phosphorylatable cofilin mutant, the S3A mutant, was able to reduce invasiveness and to reduce directionality under 2D culture conditions back to control levels in GBM6840 chronophin shRNA cells. This provides important evidence for the involvement of cofilin phosphoregulation in the phenotypes described above. In vivo, when injected into NOD-SCID mice, chronophin depleted cells showed a dramatic growth reduction as compared to control and rescue cells. Transciptomic characterization of GBM6840 cells by microarray analysis and subsequent comparison of the data with microarray profiles of normal brain tissues and different glioma entities identified two specifically chronophin regulated transcripts potentially involved in tumor progression and invasion, MXI1 and EDIL3. Moreover, c-myc was identified as a significantly altered transcription factor after chronophin deregulation based on the number of c-myc target molecules in the microarray dataset. MXI1 is a potential negative regulator of c-myc dependent transcription, and was strongly downregulated after chronophin knockdown in GBM6840. In line with this, the activity of a c-myc reporter plasmid was increased after chronophin depletion in GBM6840 and reduced after chronophin expression in U87 cells. However, the protein level of the c-myc protein was reduced after chronophin depletion in GBM6840. Finally, anaylsis of the expression of proteases known to be important for glioblastoma pathogenesis revealed no major changes in protease expression between chronophin depleted and control cells. Therefore, a comprehensive analysis of chronophin in the context of glioma pathogenesis has been performed in this thesis. It has been shown that chronophin depletion strongly enhanced invasiveness of glioma cells and that it induced transcriptomic changes potentially involved in tumor progression. The proteins regulating cofilin phosphorylation are therefore valuable therapeutic targets for anti-invasive therapy in glioblastomas. Inhibitors for kinases upstream of cofilin, e.g. LIMKs and ROCKs, are available, and might be promising agents for anti-invasive therapy. N2 - Zusammenfassung Glioblastome sind primäre Gehirntumore, die eine besonders schlechte Prognose besitzen und bei denen die mediane Überlebenszeit nur ca. ein Jahr beträgt. Zur Malignität dieses Tumortyps trägt entscheidend das Eindringen der Tumorzellen in das gesunde Hirnparenchym bei. Daher ist es notwendig die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesem Phänomen zu Grunde liegen, um neue therapeutische Zielmoleküle zu identifizieren. Cofilin, ein Protein das das Aktinzytoskellet reguliert, ist in anderen Krebsarten als wichtiger Regulator des invasiven Verhaltens von Zellen bekannt und das Aktinzytoskellet ist an der Bildung einer Vielzahl von zellulären Strukturen beteiligt, die wichtig für die Zellmigration und –invasion sind. Cofilin wird über die Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure, des Serin 3, reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Cofilin regulatorischen Phosphatase Chronophin für Zellmigration und -invasion zu untersuchen. Zuerst konnte gezeigt werden, dass eine Chronophin Depletion in der Zelllinie GBM6840 zu einer Zunahme des Anteils von P-Cofilin am Gesamtcofilin führt. Ebenso war ein hohes Chronophin Level in den Zelllinien GBM6840 und U87 mit einer Abnahme des F-Actin Levels korreliert, was in einem Aktin spin down Assay als auch mittels Durchflusszytrometrie gemessen werden konnte. Es konnte weiter gezeigt werden, dass eine shRNA vermittelte Depletion des Chronphin zu einer starken Zunahme der Invasivität in den Zelllinien GBM6840 und DBTRG-05-MG in vitro führt. Chronophin Expression in der Zelllinie U87 führte zu einer starken Abnahme der Invasivität. Es gab hingegen keinen Chronophin abhängigen Unterschied in der Proliferation von GBM6840 und DBTRG-05-MG Zellen, die entweder eine Kontroll- oder eine Chronophin gerichtete shRNA exprimierten, sowie keinen zwischen U87 Zellen, die mit einem Leervektor oder einem Chronophin codierenden Konstrukt transfiziert worden waren. Die Zunahme der Invasion nach Chronophin Depletion konnte mit einer Zunahme der Direktionalität der Zellen bei der Migration in einer 2D Umgebung korreliert werden. Desweiteren konnte durch Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 in GBM6840 Zellen eine Erniedrigung der Direktionalität bei der Migration in 2D Kultur ebenso erreicht werden, wie eine Reduktion der Invasivität von Chronophin shRNA exprimierenden GBM6840 Zellen auf Kontrollniveau. Die Expression einer nicht-phosphorylierbaren Cofilin Mutante, der S3A Mutante, erniedrigte sowohl die Direktionalität in der 2D Migration als auch die Invasivität von GBM6840 Chronophin shRNA exprimierenden Zellen zurück auf Kontrollniveau. Diese Experimente lieferten wichtige Hinweise darauf, dass die Phosphoregulation von Cofilin ursächlich an der Entstehung der Phänotypen beteiligt war, die nach Chronophin Knockdown beobachtet wurden. In vivo konnte nach Injektion in NOD-SCID Mäuse eine dramatische Wachstumsreduktion der Chronophin depletierten Zellen gemessen werden. Durch Charakterisierung des Transkriptoms der Zelllinie GBM6840 mittels Microarrays und nachfolgender Vergleich der Ergebnisse mit Microarray-Profilen von Normalhirngewebe und verschiedenen Gliomentitäten konnten zwei spezifisch Chronophin abhängig regulierte Transkripte identifiziert werden, MXI1 und EDIL3, die potentiell mit der Progression und Invasivität von Gliomen verknüpft sind. MXI1, ein potentieller negativer Regulator der c-myc abhängigen Transkription, war nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 stark herunterreguliert. In Übereinstimmung mit diesem Befund war die Aktiviät eines c-myc Reporterplasmids nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 erhöht, nach Chronophin Expression in U87 jedoch erniedrigt. Das c-myc Protein selbst wies eine deutliche Reduktion nach Chronophin Depletion in GBM6840 auf. Abschließend wurde die Expression von Proteasen untersucht, für die eine Rolle in der Gliominvasion bekannt ist. Hier wurden jedoch keine größeren Chronophin abhängigen Expressionsunterschiede gefunden. Zusammenfassend gesagt konnte eine umfassende Charakterisierung der Rolle des Chronophin in der Gliompathogenese erreicht werden. Zum einen konnte gezeigt werden, dass Chronophin ein äußerst wichtiger Regulator der Invasion ist, zum anderen dass es zu Chronophin abhängigen transkriptomischen Veränderungen kommt, die potentiell zur Malignisierung des Tumors beitragen. Daher sind die Proteine die die Cofilinphosphorylierung regulieren potentielle therapeutische Zielmoleküle für eine anti-invasive Therapie im Glioblastom. Inhibitoren für die Kinasen, die Regulatoren des Cofilin sind, die ROCK- und LIM-Kinasen, sind verfügbar und stellen möglicherweise vielversprechende Substanzen für die anti-invasive Therapie dar. KW - Zellmigration KW - Chronophin KW - Invasion KW - Glioblastom KW - Gliom KW - PDXP KW - Glioma KW - Glioblastoma KW - Invasion KW - Migration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109292 ER - TY - THES A1 - Stumpf, Anette D. T1 - Development of fluorescent FRET receptor sensors for investigation of conformational changes in adenosine A1 and A2A receptors T1 - Entwicklung fluoreszenter FRET Rezeptor-Sensoren zur Untersuchung von Konformationsänderungen in Adenosin A1 und A2A Rezeptoren N2 - Adenosine receptors that belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) are involved in a lot of regulatory processes and are widely distributed throughout the body which makes them an attractive target for drugs. However, pharmacological knowledge of these receptors is still limited. A big advance regarding the structural knowledge of adenosine receptors was the development of the first crystal structure of the adenosine A2A receptor in 2008. The crystal structure revealed the amino acids that form the ligand binding pocket of the receptor and depicted the endpoint of receptor movement in the ligand binding process. Within the scope of this work two members of the adenosine receptor family were investigated, namely the adenosine A1 and the A2A receptor (A1R, A2AR). A1R was generated on base of the previously developed A2AR. Receptors were tagged with fluorophores, with the cyan fluorescent protein (CFP) at the C-terminal end of receptor and the Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH) binding sequence within the third intracellular loop of receptors. Resulting fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were investigated with help of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements within living cells. FRET experiments enable the examination of alteration in the distance of two fluorophores and thus the observation of receptor dynamical movements. For comparison of A1R and A2AR regarding receptor dynamical movement upon ligand binding, fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were superfused with various ligands and the outcomes of FRET experiments were compared regarding signal height of FRET ratio evoked by the distinct ligand that is correlated to the conformational change of receptor upon ligand binding. Beside the different direction of FRET ratio upon ligand binding at A1R and A2AR sensor, there were differences observable when signal height and association and dissociation kinetics of the various ligands investigated were compared to each other. Differences between the adenosine receptor subtypes were especially remarkable for the A1R subtype selective agonist CPA and the A2AR subtype selective agonist CGS 21680. Another part of the project was to investigate the influence of single amino acids in the ligand binding process within the fluorescent A1R sensor. Amino acid positions were derived from the crystal structure of the A2AR forming the ligand binding pocket and these amino acids were mutated in the A1R structure. Investigation of the A1R sensor and its mutants regarding confocal analysis showed involvement of some amino acids in receptor localization. When these amino acids were mutated receptors were not expressed in the plasma membrane of cells. Some amino acids investigated were found to be involved in the ligand binding process in general whereas other amino acids were found to have an influence on the binding of distinct structural groups of the ligands investigated. In a further step, A1R and A2AR were N-terminally tagged with SNAP or CLIP which allowed to label receptor sensors with multiple fluorophores. With this technique receptor distribution in cells could be investigated with help of confocal analysis. Furthermore, ligand binding with fluorescent adenosine receptor ligands and their competition with help of a non-fluorescent antagonist was examined at the SNAP tagged A1R and A2AR. Finally the previously developed receptor sensors were combined to the triple labeled receptor sensors SNAP A1 Fl3 CFP and SNAP A2A Fl3 CFP which were functional regarding FRET experiments and plasma membrane expression was confirmed via confocal analysis. In the future, with the help of this technique, interaction between fluorescent ligand and SNAP tagged receptor can be monitored simultaneously with the receptor movement that is indicated by the distance alteration between FlAsH and CFP. This can lead to a better understanding of receptor function and its dynamical movement upon ligand binding which may contribute to the development of new and more specific drugs for the A1R and A2AR in the future. N2 - Adenosin Rezeptoren, die zur Gruppe der Rhodopsin-ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, sind in eine Vielzahl regulatorischer Prozesse eingebunden und weit im Körper verbreitet. Das macht sie zu einer interessanten Zielstruktur für Arzneistoffe. Das Wissen über die Struktur der Adenosin Rezeptoren ist jedoch noch begrenzt. Ein großer Fortschritt zu mehr strukturellem Wissen war die Entwicklung der ersten Kristallstruktur des Adenosin A2A Rezeptors im Jahr 2008. Mit der Kristallstruktur wurden die Aminosäuren bekannt, die die Ligandenbindetasche dieses Rezeptors formen. Zudem gab die Kristallstruktur Einblick in den Endpunkt der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei Mitglieder der Adenosin Rezeptor Familie, der Adenosin A1 Rezeptor und der Adenosin A2A Rezeptor (A1R, A2AR), genauer untersucht. Der A1R wurde auf Basis des vor kurzem veröffentlichten A2AR entwickelt. Die Rezeptoren wurden mit Fluorophoren versehen, zum einen mit dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) am C-Terminus des Rezeptors und zum anderen mit der Bindesequenz des kleinen Fluorophors "Fluorescein Arsenical Hairpin binder" (FlAsH) in der dritten intrazellulären Schleife des Rezeptors. Die daraus resultierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP wurden mit Hilfe des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET) in lebenden Zellen erforscht. FRET Messungen ermöglichen es, eine Änderung der Distanz zwischen den beiden Fluorophoren und damit Rezeptorbewegungen zu untersuchen. Um A1R und A2AR bezüglich dynamischer Rezeptorbewegungen nach Ligandenbindung vergleichen zu können, wurden die fluoreszierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP mit verschiedenen Liganden umspült. Die Ergebnisse der FRET Messungen bezüglich ihrer Höhe des FRET Ratio wurden verglichen, welche mit der Konformationsänderung des Rezeptors nach Ligandenbindung zusammenhängt. Neben der unterschiedlichen Richtung des FRET Ratio nach Ligandenbindung am A1R und A2AR Sensor waren Unterschiede bezüglich der Signalhöhe und der Bindungs- und Dissoziationskinetiken feststellbar, wenn die verschiedenen Liganden miteinander verglichen wurden. Unterschiede zwischen den Adenosin Rezeptor Subtypen waren speziell für den A1R subtypselektiven Agonist CPA und für den A2AR subtypselektiven Agonist CGS 21680 feststellbar. Einen weiteren Punkt in diesem Projekt stellte die Erforschung des Einflusses, den einzelne Aminosäuren im fluoreszierenden A1R Sensor auf den Prozess der Ligandenbindung haben, dar. Die Position der Aminosäuren wurde der Kristallstruktur des A2AR entnommen und entsprechende Aminosäuren im A1R mutiert. Die konfokalmikroskopische Analyse des A1R Sensors und seiner Mutanten ergab, dass einige Aminosäuren direkt an der zellulären Expression des Rezeptors beteiligt waren. Wurden diese Aminosäuren mutiert, wurde der Rezeptor nicht in der Plasmamembran der Zellen exprimiert. Einige Aminosäuren die untersucht wurden,hatten einen generellen Einfluss auf die Bindung der Liganden, andere Aminosäuren hatten mehr Einfluss auf die Bindung bestimmter struktureller Gruppen der untersuchten Liganden. In einem weiteren Schritt wurden A1R und A2AR am N-terminalen Rezeptorende mit SNAP oder CLIP versehen, was eine Markierung der Rezeptoren mit einer Vielzahl an Fluorophoren erlaubt. Mit Hilfe dieser Technik konnte die Verteilung der Rezeptoren in der Zelle mit konfokaler Mikroskopie untersucht werden. Des Weiteren wurde die Bindung von fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Liganden und deren Verdrängung mit einem nicht-fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Antagonist erforscht. Am Ende des Projekts wurden die zuvor beschriebenen fluoreszierenden Rezeptorsensoren zu dreifach fluorophormarkierten Rezeptorsensoren kombiniert, was zu den Sensoren SNAP A1 Fl3 CFP und SNAP A2A Fl3 CFP führte. Beide Rezeptorsensoren waren funktionell bezüglich FRET Experimenten und der Expression in der Plasmamembran der Zellen. In Zukunft können mit dieser Methode gleichzeitig die Bindung von fluoreszierenden Liganden am SNAP-markierten Rezeptor, so wie die Rezeptorbewegung beobachtet werden, die durch eine Distanzänderung zwischen CFP und FlAsH angezeigt wird. Das kann zu einem besseren Verständnis der Rezeptorfunktion und der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung führen, die in Zukunft zur Entwicklung spezifischerer Wirkstoffe am A1R und A2AR beitragen könnte. KW - Adenosinrezeptor KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Adenosine receptors Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125469 ER - TY - THES A1 - Wegner, Julia T1 - Restoring tissue-like functionality in circulating CD8 T-cells: mechanistic studies and application in immunomonitoring of cancer patients T1 - Wiederherstellen einer gewebeartigen Funktionalität in humanen CD8 T-Zellen des Blutes: mechanistische Studien und Anwendung beim Immunomonitoring von Krebspatienten N2 - Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are the only source of human lymphoid cells routinely available for immunologic research and for immunomonitoring of T-cell responses to microbial and tumor-associated antigens. However the large majority of human T-cells resides in tissues, especially in lymphatic organs, while only 1 % of the body’s T-cells circulate in the blood stream. Previous work in mice and humans had indicated that CD4 T-cells transiently lose antigen sensitivity when cellular contacts are lost, e.g. by leaving lymphoid organs such as lymph nodes (LNs) and entering the circulation. In this study, these findings were extended to CD8 T-cells. Thus, CD8 T-cell responses of the human tonsil show a significant drop in sensitivity to viral antigens if tissue-exit was simulated by keeping cells in dispersed culture at body temperature for two hours. Conversely, tissue-like functionality in blood-derived CD8 T-cells was restored by applying the simple and robust RESTORE protocol. Indeed, application of the RESTORE protocol, i.e. pre-culturing PBMCs for two days at a high cell density before initiation of antigenic stimulation, demonstrated that CD8 T-cell responses to a broad range of viral and to tumor-associated antigens are greatly underestimated, and sometimes even remain undetected if conventional, unprocessed PBMC cultures are used. The latter finding is particularly striking with regard to the appearance of Wilms tumor 1 (WT1)-specific CD8 T-cell responses in leukemia patients after allogeneic bone marrow transplantation. My studies on the mechanism of the RESTORE protocol show that HD preculture of PBMCs does not involve antigen-or cytokine-driven clonal expansion of T-cells. Moreover, the gain in antigen sensitivity cannot be explained by a decreased activity of regulatory T-cells during the preculture step. The increased antigen sensitivity of CD8 T-cells from HD precultures of PBMCs is associated with tonic T-cell receptor signaling as indicated by enhanced tyrosine phosphorylation of the CD3 ζ chains and the tyrosine kinase Lck, thereby preparing T-cells for full responses. The upregulation of genes involved in aerobic glycolysis in “restored” CD8 memory T-cells relative to fresh cells might be an essential requirement for increased T-cell functionality including the regulation of IFN-γ production. Taken together, the RESTORE protocol, which was initially described for the CD4 T-cell response to the antibody TGN1412 permits a more meaningful monitoring of CD8 T-cell responses to viral infections and tumors. Furthermore, when generating T-cell lines for adoptive T-cell therapy, the RESTORE protocol allows the generation of CD8 T-cell lines with an improved representation of clones responding to low antigen concentrations. N2 - Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs: peripheral blood mononuclear cells) stellen die einzige routinemäßig zugängliche Quelle für humane Lymphozyten dar, welche für die immunologische Forschung und das „Immunomonitoring“ von T-Zellantworten gegen mikrobielle und Tumor-assoziierte Antigene verwendet werden. Jedoch befindet sich der Großteil der T-Zellen des Menschen in Geweben, insbesondere den lymphatischen Organen, wohingegen sich nur 1 % der T-Zellen im Blut aufhalten. Frühere Studien, die sowohl mit murinen als auch mit humanen Zellen durchgeführt wurden, zeigten, dass CD4 T-Zellen ihre Sensitivität gegenüber Antigenen zeitweise verlieren sobald zelluläre Kontakte unterbrochen werden. Dies erfolgt beispielsweise beim Verlassen der T-Zellen von Geweben und dem Eintreten in die Blutzirkulation. In dieser Arbeit wurden diese Beobachtungen auf CD8 T-Zellen ausgeweitet. So weisen humane tonsilläre CD8 T-Zellen eine signifikant niedrigere Sensitivität gegenüber viralen Antigenen auf, wenn diese in Dispersion bei Körpertemperatur für zwei Stunden gehalten werden, um das Verlassen von Geweben und somit den Verlust von zellulären Kontakten zu simulieren. Im Gegenzug konnte eine gewebeähnliche T-Zellfunktionalität bei Blutzellen durch Anwendung des RESTORE Protokolls wiederhergestellt werden. In der Tat zeigte die Anwendung des RESTORE Protokolls, welches eine Vorkultur von PBMCs für zwei Tage bei hoher Zelldichte vor antigenspezifischer T-Zellstimulation einschließt, dass CD8 T-Zellantworten gegen eine Vielzahl viraler und Tumor-assoziierter Antigene deutlich unterschätzt werden, wenn herkömmliche Stimulationsansätze verwendet werden. Teilweise können diese so gemessenen T-Zellantworten bei Verwendung herkömmliche Stimulationsansätze auch gar nicht nachgewiesen werden. Dieser Effekt war bei der Detektion von Wilms Tumor 1 (WT1)-spezifischen CD8 T-Zellantworten bei Leukämiepatienten nach allogener Stammzelltransplantation besonders deutlich zu beobachten. Meine mechanistischen Studien zeigten, dass die Vorkultur von PBMCs bei hoher Zelldichte selbst nicht zu einer Antigen- oder Zytokin-getriebenen T-Zell Expansion führt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der RESTORE Effekt durch den Zugewinn an CD8 T-Zellsensitivität erklärt werden kann und nicht auf eine verringerte CD8 T-Zellsuppression durch regulatorische T-Zellen während der Vorkultur zurückzuführen ist. Die erhöhte Antigensensitivität von vorkultivierten CD8 T-Zellen steht im Zusammenhang mit tonischer T-Zell Signalweiterleitung, welche anhand von erhöhter Tyrosin Phosphorylierung der CD3 ζ Ketten des T-Zell-Rezeptors und der Tyrosinkinase Lck nachgewiesen werden kann. Diese tonischen T-Zellsignale bereiten CD8 T-Zellen darauf vor, bereits auf kleine Mengen Antigen effektiv zu reagieren. Auch die Hochregulierung von Genen, welche der aeroben Glykolyse zuzuordnen sind in vorkultivierten CD8 Gedächtniszellen im Vergleich zu CD8 Gedächtniszellen, welche direkt aus dem Blut isoliert wurden, trägt zu einer erhöhten T-Zellfunktionalität bei, welche die Regulation der IFN-γ Produktion einschließt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Anwendung des RESTORE Protokolls, welches ursprünglich zum Nachweis von CD4 T-Zellantworten gegen den Antikörper TGN1412 entwickelt wurde, eine verlässliche Methode zum Nachweis von CD8 T-Zellantworten gegen virale Infektionen und Tumore darstellt. Des Weiteren kann das RESTORE Protokoll zur Generierung von T-Zelllinien in der adoptive T-Zelltherapie eingesetzt werden. Die Anwendung des Protokolls erlaubt das Generieren von Zelllinien, welche auch T-Zellklone beinhalten, die durch Immunantworten auf geringe Antigenkonzentrationen entstanden sind. KW - Antigen CD8 KW - CD8 T cell KW - antigen KW - CD8 T-Zelle KW - RESTORE protocol KW - sensitivity KW - T-Lymphozyt KW - Gewebe Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124177 ER - TY - THES A1 - Tran-Gia, Johannes T1 - Model-Based Reconstruction Methods for MR Relaxometry T1 - Modellbasierte Rekonstruktionsmethoden für die MR-Relaxometrie N2 - In this work, a model-based acceleration of parameter mapping (MAP) for the determination of the tissue parameter T1 using magnetic resonance imaging (MRI) is introduced. The iterative reconstruction uses prior knowledge about the relaxation behavior of the longitudinal magnetization after a suitable magnetization preparation to generate a series of fully sampled k-spaces from a strongly undersampled acquisition. A Fourier transform results in a spatially resolved time course of the longitudinal relaxation process, or equivalently, a spatially resolved map of the longitudinal relaxation time T1. In its fastest implementation, the MAP algorithm enables the reconstruction of a T1 map from a radial gradient echo dataset acquired within only a few seconds after magnetization preparation, while the acquisition time of conventional T1 mapping techniques typically lies in the range of a few minutes. After validation of the MAP algorithm for two different types of magnetization preparation (saturation recovery & inversion recovery), the developed algorithm was applied in different areas of preclinical and clinical MRI and possible advantages and disadvantages were evaluated. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein modellbasiertes Verfahren namens MAP (engl. Model-based Acceleration of Parameter mapping) für die Bestimmung des T1-Gewebeparameters mittels Magnetresonanztomographie (MRT) entwickelt. Dieser iterative Algorithmus verwendet das Vorwissen über den nach einer Magnetisierungspräparation zu erwartenden Signalverlauf, um aus einer im Anschluss an eine initiale Präparation aufgenommene zeitliche Serie stark unterabgetasteter k-Räume eine Serie voll abgetasteter k-Räume zu generieren.Eine Fourier-Transformation dieser Serie in den Bildraum zeigt den örtlich aufgelösten zeitlichen Verlauf der longitudinalen Relaxation, was eine Kartierung des Gewebeparameters T1 ermöglicht. In seiner schnellsten Form ermöglicht dieses Verfahren die Rekonstruktion einer T1-Karte aus einem innerhalb weniger Sekunden nach einer passenden Magnetisierungspräparation aufgenommenen radialen Gradienten-Echo-Datensatz, während die Messdauer herkömmlich verwendeter T1-Bestimmungstechniken üblicherweise im Bereich von einigen Minuten liegt. Nach der Validierung des MAP-Algorithmus für zwei unterschiedliche Arten der Magnetisierungspräparation (Sättigungspräparation, Inversion) wurde die entwickelte Technik im Rahmen dieser Arbeit in verschiedenen Bereichen der präklinischen und klinischen MRT angewendet und mögliche Vor- und Nachteile untersucht. KW - Kernspintomographie KW - Radiologische Diagnostik KW - Bildgebendes Verfahren KW - Magnetic Resonance Relaxometry KW - Magnetresonanz-Relaxometrie KW - Model Based Reconstruction Algorithms in Magnetic Resonance Imaging KW - Modellbasierte-Rekonstruktionsalgorithmen in der Magnetresonanztomografie KW - Relaxation Parameter Mapping in Magnetic Resonance Imaging KW - Bestimmung des Relaxations-Parameters in der Magnetresonanztomografie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109774 ER - TY - THES A1 - Jänicke, Laura Annika T1 - Regulation of MYC Activity by the Ubiquitin-Proteasome System T1 - Regulation der MYC Aktivität durch das Ubiquitin-Proteasom-System N2 - The oncogenic MYC protein is a transcriptional regulator of multiple cellular processes and is aberrantly activated in a wide range of human cancers. MYC is an unstable protein rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. Ubiquitination can both positively and negatively affect MYC function, but its direct contribution to MYC-mediated transactivation remained unresolved. To investigate how ubiquitination regulates MYC activity, a non-ubiquitinatable MYC mutant was characterized, in which all lysines are replaced by arginines (K-less MYC). The absence of ubiquitin-acceptor sites in K-less MYC resulted in a more stable protein, but did not affect cellular localization, chromatin-association or the ability to interact with known MYC interaction partners. Unlike the wild type protein, K-less MYC was unable to promote proliferation in immortalized mammary epithelial cells. RNA- and ChIP-Sequencing analyses revealed that, although K-less MYC was present at MYC-regulated promoters, it was a weaker transcriptional regulator. The use of K-less MYC, a proteasomal inhibitor and reconstitution of individual lysine residues showed that proteasomal turnover of MYC is required for MYC target gene induction. ChIP-Sequencing of RNA polymerase II (RNAPII) revealed that MYC ubiquitination is dispensable for RNAPII recruitment and transcriptional initiation but is specifically required to promote transcriptional elongation. Turnover of MYC is required to stimulate histone acetylation at MYC-regulated promoters, which depends on a highly conserved region in MYC (MYC box II), thereby enabling the recruitment of BRD4 and P-TEFb and the release of elongating RNAPII from target promoters. Inhibition of MYC turnover enabled the identification of an intermediate in MYC-mediated transactivation, the association of MYC with the PAF complex, a positive elongation factor, suggesting that MYC acts as an assembly factor transferring elongation factors onto RNAPII. The interaction between MYC and the PAF complex occurs via a second highly conserved region in MYC’s amino terminus, MYC box I. Collectively, the data of this work show that turnover of MYC coordinates histone acetylation with recruitment and transfer of elongation factors on RNAPII involving the cooperation of MYC box I and MYC box II. N2 - Der Transkriptionsfaktor MYC ist an der Regulation einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt ist und spielt bei der Tumorentstehung und des Tumorwachstum eine entscheidende Rolle. MYC ist ein kurzlebiges Protein, das durch das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut wird. Die Ubiquitinierung von MYC hat auch einen stimulierenden Einfluss auf dessen transkriptionelle Aktivität. Dabei blieb jedoch der Mechanismus, der dieser Beobachtung zugrunde liegt, bislang ungeklärt. Um den direkten Einfluss von Ubiquitinierung auf die Aktivität von MYC zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine MYC Mutante analysiert, in der alle Lysine zu Argininen mutiert wurden (K-less MYC). Die Mutation der Ubiquitin-Verknüpfungsstellen resultierte in einem stabileren Protein, hatte jedoch keinen Einfluss auf die zelluläre Lokalisation oder Assoziation mit bekannten Interaktionspartnern. Im Vergleich zu Wildtyp (WT) MYC war K-less MYC jedoch in der Vermittlung MYC-induzierter biologischer Phänotypen stark beeinträchtigt. Mittels RNA- und ChIP-Sequenzierungen konnte gezeigt werden, dass K-less MYC zwar an MYC-regulierte Promotoren bindet, in der transkriptionellen Aktivität aber stark beeinträchtigt ist und diese Zielgene nicht aktivieren kann. Dabei war K-less MYC noch in der Lage, RNA Polymerase II (RNAPII) zu den Zielpromotoren zu rekrutieren und die Transkription dort zu initiieren, jedoch war der Übergang zur Elongation blockiert. Die Verwendung eines Proteasom-Inhibitors sowie die Rekonstitution einzelner Lysine in K-less MYC zeigten, dass der proteasomale Abbau von MYC für die Aktivierung von Zielgenen benötigt wird. Der proteasomale Abbau ist für die Histon-Acetylierung von Bedeutung, die von einer hoch konservieren Region in MYC, der MYC Box II, abhängt. Durch die WT MYC-vermittelte Induktion der Histon-Acetylierung können folglich die Proteine BRD4 und P-TEFb an die Promotoren rekrutiert werden. Diese Proteine spielen bei dem Übergang der initiierenden RNAPII zur elongierenden RNAPII eine essentielle Rolle. Darüber hinaus ermöglichte die Inhibition des MYC Abbaus die Identifizierung eines Zwischenschritts der MYC-abhängigen Transaktivierung: die Assoziation von MYC mit dem positiven Elongationskomplex, dem PAF-Komplex. Dieser wird über eine zweite hochkonservierte Region in MYC, der MYC Box I, rekrutiert. Somit kann angenommen werden, dass MYC als eine Verbindungsstelle fungiert, die positive Elongationsfaktoren auf die RNAPII transferiert. Zusammenfassend resultieren die Daten dieser Arbeit in einem Model, nach dem der proteasomale Abbau von MYC die Histon-Acetylierung mit der Rekrutierung und dem Transfer von Elongationsfaktoren auf die RNAPII koordiniert, was der Kooperation von MYC Box I und MYC Box II bedarf. KW - Myc KW - Ubiquitinierung KW - Transkription KW - RNS-Polymerase II KW - Elongation (Transkription) KW - Proteasomaler Abbau Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123339 ER - TY - THES A1 - Post, Antonia T1 - Snap25 heterozygous knockout mice as a potential model for attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD) T1 - Heterozygote Snap25 Knockout-Mäuse als Modell für Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) N2 - SNAP25 (Synaptosomal-Associated Protein of 25 kDa; part of the SNARE complex) is involved in the docking and fusion of synaptic vesicles in presynaptic neurons necessary for the regulation of neurotransmitter release, as well as in axonal growth and synaptic plasticity. In humans, different single nucleotide polymorphisms of SNAP25 have repeatedly been associated with attention deficit/hyperactivity disorder (ADHD). Thus, in this study heterozygous Snap25 knockout mice were investigated as a model of ADHD. Heterozygous (+/-) Snap25 knockout mice as well as their wild-type (+/+) littermates were reared under control conditions or underwent a Maternal Separation (MS) procedure. Starting at the age of 2 months, mice were tested for locomotor activity in a repeated long-term Open Field (OF) task, for attention deficits and impulsive behavior in the 5 Choice Serial Reaction Time Task (5CSRTT), for anxiety-like behavior in the Light-Dark Box (LDB) and for depression-like behavior in the Porsolt Forced Swim Test (FST). The brains of these mice were subsequently tested for the expression of several ADHD related genes in a quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) study. Another group of female mice (+/+; +/-) underwent a one hour OF test after oral administration of 45 mg/kg Methylphenidate (MPH) or placebo. To find an optimized dosage for this MPH challenge, a pilot study was performed. Wild-type C57BL/6 mice were tested in a long-term OF with several dosages of MPH both intraperitoneally (i.p.) and orally. The brains of these animals were afterwards investigated for neurotransmitter concentrations. In this pilot study the dosages of MPH that were similarly behaviorally effective without causing symptoms of overdosing were 7.5-15 mg/kg intraperitoneally and 30-60 mg/kg orally. However, even though it was possible to find intraperitoneal and oral doses that correlate behaviorally, the neurochemistry was mostly different. In the study on Snap25-deficient mice, unstressed controls showed a hyperactive phenotype in the second of two long-term OF sessions (60 min) spaced three weeks apart. Considering all groups, there was a significant interaction of stress and genotype in the second session, with animals subjected to MS being overall hyperactive with no genotype differences. In the training phase of the 5CSRTT only effects of stress were found, with MS animals finding and consuming fewer rewards. In the single test trial, several genotype effects became apparent, with tendencies for the number of correct nose pokes and the number of rewards eaten, and a significant effect for the number of rewards eaten directly after the correct response. In all of these variables +/- mice performed worse than their wild-type littermates. In the LDB +/- mice entered the lit compartment of the arena earlier than the controls, thus showing attenuated anxiety-like behavior. Regarding depressive-like behavior in the FST, male +/- mice spent significantly less time struggling than male +/+ mice. In the gene expression study, +/- mice had lower expression levels of Maoa and Comt, and higher expression levels of Nos1 than wild-types. Finally, the locomotor activity response to MPH was exaggerated in +/- mice as compared to controls. Heterozygous Snap25 knockout mice show some of the behavioral characteristics of ADHD, as for example a mild hyperactivity in a familiar environment, difficulties in the correct execution of a given task and even some behavior that can be interpreted as delay aversion. Additionally, expression levels of three ADHD related genes were changed in these animals. Although the exaggerated locomotor activity response to MPH is not to be expected of an ADHD model, the difference in the response between +/+ and +/- mice nonetheless implicates a potential dysfunction of the brain dopaminergic system. N2 - SNAP25 (Synaptosomal assoziiertes Protein, 25 kDa; Teil des SNARE Komplexes) ist an der Fusion von synaptischen Vesikeln mit der präsynaptischen Zellmembran beteiligt, und somit notwendig für die Regulation der Neurotransmitter-Ausschüttung. Außerdem wird eine wichtige Funktion bei dem Wachstum von Axonen und synaptischer Plastizität diskutiert. In Humanstudien wurden wiederholt verschiedene Einzelnukleotid-polymorphismen von SNAP25 mit Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) assoziiert. In der vorliegenden Studie wurden heterozygote Snap25 knockout Mäuse als Modell für ADHS untersucht. Heterozygote (+/-) Snap25 knockout Mäuse und ihre wildtypischen Wurfgeschwister wurden unter Kontrollbedingungen großgezogen oder einer maternalen Separation (MS) unterzogen. Beginnend im Alter von etwa 2 Monaten wurden diese Mäuse verschiedenen Verhaltenstests unterzogen: in einem wiederholten Langzeit-Open-Field (OF) Test wurde Aktivität untersucht, Aufmerksamkeitsdefizite und Impulsivität mit dem 5 Choice Serial Reaction Time Task (5CSRTT), angst-ähnliches Verhalten in der Light-Dark Box (LDB) und depressions-ähnliches Verhalten im Porsolt Forced Swim Test (FST). Die Gehirne dieser Mäuse wurden anschließend auf die Expression verschiedener ADHS bezogener Gene in einer quantitativen Real-Time-PCR (qRT-PCR) untersucht. Eine zusätzliche Gruppe weiblicher Mäuse (+/+; +/-) durchlief einen einstündigen OF Test nach oraler Gabe von 45 mg/kg Methylphenidat (MPH) oder Placebo. Um eine optimale Dosierung für MPH in diesem Experiment zu finden, wurde eine Pilotstudie durchgeführt. Hierbei wurden wildtypische C57/BL6 Mäuse in einem Langzeit OF Test mit Gabe unterschiedlicher Dosierungen von MPH, sowohl oral als auch intraperitoneal (i.p.), untersucht. Im Anschluss wurden die Gehirne dieser Tiere auf Neurotransmitter-konzentration geprüft. Diese Pilotstudie ergab als optimale Dosierungen von MPH auf Verhaltensebene 7.5-15 mg/kg i.p. und 30-60 mg/kg oral. Allerdings waren die neurochemischen Effekte der beiden unterschiedlichen Applikationsarten größtenteils verschieden. In der Snap25 Studie zeigten ungestresste Kontroll-Tiere einen leicht hyperaktiven Phänotyp in dem zweiten von zwei Langzeit-Open-Field Tests (60 min) im Abstand von 3 Wochen. Bei Betrachtung aller Gruppen ergab sich auch eine signifikante Interaktion von Stress und Genotyp in der zweiten Testung, und zwar dahingehend, dass MS Tiere grundsätzlich aktiveres Verhalten zeigten, ohne Genotypen-Unterschiede. In der Anfangsphase des 5CSRTT lagen nur signifikante Haupteffekte für Stress vor, gestresste Tiere hatten größere Probleme im Meistern der Aufgabe als Wildtypen. Erst im sogenannten Test-Trial am Ende der Versuchsreihe ergaben sich signifikante Haupteffekte für den Genotyp. Heterozygote Snap25 knockout Mäuse zeigten beispielsweise weniger korrekte Reaktionen und konsumierten auch weniger Belohnungspellets direkt im Anschluss an eine korrekte Reaktion als Wildtypen. In der LDB brauchten +/- Mäuse wiederum weniger Zeit als Wildtypen, um den erleuchteten Teil der Arena zu betreten, und zeigten dadurch ein reduziertes Angst-ähnliches Verhalten. Im Gegensatz dazu ergab sich ein erhöht Depressions-ähnliches Verhalten für männliche heterozygote Snap25 knockout Mäuse im FST. Auf der Genexpressions-Ebene hatten +/- Mäuse niedrigere Expressionslevels von Maoa und Comt und höhere Expressionslevels von Nos1 als Wildtypen. Abschließend zeigte sich eine erhöhte Reaktion auf MPH bei heterozygoten Mäusen. Zusammenfassend zeigen heterozygote Snap25 knockout Mäuse einige Charakteristika von ADHS auf Verhaltensebene, wie zum Beispiel eine leichte Hyperaktivität in bekannter Umgebung, Schwierigkeiten im Erlernen einer gestellten Aufgabe und sogar Verhaltensweisen, die auf eine Abneigung gegenüber Verzögerungen hindeuten. Zusätzlich kommt es aufgrund des Knockouts zu veränderten Expressionslevels verschiedener ADHS assoziierter Gene. Auch wenn die erhöhte Verhaltensreaktion von +/- Mäusen auf MPH nicht die erwartete Reaktion eines ADHS Modells darstellt, deutet sie dennoch auf ein Ungleichgewicht des dopaminergen Systems im Gehirn hin, das bei ADHS eine wichtige Rolle spielt. KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - SNAP-Rezeptor KW - Tiermodell KW - Verhalten KW - Genexpression KW - Animal model KW - Snap25 KW - Attention deficit / hyperactivity disorder Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122899 ER - TY - THES A1 - Murti, Krisna T1 - The Role of NFATc1 in Burkitt Lymphoma and in Eµ-Myc induced B cell Lymphoma T1 - Die Role des NAFTc1 Transkriptionsfaktors im Burkitt Lymphom und im Eµ-Myc-induzierten B-Zell Lymphom N2 - Burkitt lymphoma (BL) is a highly aggressive B cell malignancy. Rituximab, a humanized antibody against CD20, in a combination with chemotherapy is a current treatment of choice for B-cell lymphomas including BL. However, certain group of BL patients are resistant to Rituximab therapy. Therefore, alternative treatments targeting survival pathways of BL are needed. In BL deregulation of MYC expression, together with additional mutations, inhibits differentiation of germinal centre (GC) B cells and drives proliferation of tumor cells. Pro-apoptotic properties of MYC are counteracted through the B-cell receptor (BCR) and phosphoinositide-3-kinase (PI3K) pathway to ensure survival of BL cells. In normal B-cells BCR triggering activates both NF-κB and NFAT-dependent survival signals. Since BL cells do not exhibit constitutive NF-κB activity, we hypothesized that anti-apoptotic NFATc1A isoform might provide a major survival signal for BL cells. We show that NFATc1 is constitutively expressed in nuclei of BL, in BL cell lines and in Eµ-Myc–induced B cell lymphoma (BCL) cells. Nuclear residence of NFATc1 in these entities depends on intracellular Ca2+ levels but is largely insensitive to cyclosporine A (CsA) treatment and therefore independent from calcineurine (CN) activity. The protein/protein interaction between the regulatory domain of NFATc1 and DNA binding domain of BCL6 likely contributes to sustained nuclear residence of NFATc1 and to the regulation of proposed NFATc1-MYC-BCL6-PRDM1 network in B-cell lymphomas. Our data revealed lack of strict correlation between the expression of six NFATc1 isoforms in different BL-related entities suggesting that both NFATc1/alphaA and -betaA isoforms provide survival functions and that NFATc1alpha/betaB and -alpha/betaC isoforms either do not possess pro-apoptotic properties in BL cells or these properties are counterbalanced. In addition, we show that in BL entities expression of NFATc1 protein is largely regulated at post-transcriptional level, including MYC dependent increase of protein stability. Functionally we show that conditional inactivation of Nfatc1 gene in Eµ-Myc mice prevents development of BCL tumors with mature B cell immunophenotype (IgD+). Loss of NFATc1 expression in BCL cells ex vivo results in apoptosis of tumor cells. Together our results identify NFATc1 as an important survival factor in BL cells and, hence, as a promising target for alternative therapeutic strategies for BL. N2 - Das Burkitt Lymphom (BL) ist eine hoch aggressive B-Zellentartung. Rituximab, ein humanisierter Antikörper gegen CD20, in Kombination mit Chemotherapie ist die augenblickliche Behandlung der Wahl für B-Zelllymphome inklusive dem BL. Allerdings sind bestimmte Gruppen der BL-Patienten resistent gegenüber einer Rituximabtherapie. Deshalb werden alternative Behandlungsmöglichkeiten, die das Überleben der BL gezielt beeinflussen, gesucht. Die Deregulation der MYC-Expression, zusammen mit weiteren Mutationen, inhibiert die Differenzierung der Keimzentrums- (GC-) B-Zellen im BL und treibt die Proliferation der Tumorzellen. Die pro-apoptotischen Eigenschaften von MYC sind durch den B-Zellrezeptor (BCR) und Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Signalwege gegenreguliert, was zum Überleben der BL-Zellen führt. Da BL-Zellen keine konstitutive NF-κB-Aktivität aufweisen, stellten wir die Hypothese auf, dass die anti-apoptotischen Isoformen von NFATc1A ein Hauptüberlebenssignal für BL-Zellen bereitstellen könnten. Wir zeigen, dass NFATc1 konstitutiv in den Kernen primärer BL-Zellen, der BL-Zelllinien und in den Zellen eines Eµ-MYC-induzierten B-Zelllymphoms (BCL) vorliegt. Nukleäre NFATc1-Präsenz in diesen Entitäten hängt von intrazellulären Ca2+-Mengen ab, ist aber weitestgehend unempfindlich gegenüber Cyclosporine A (CsA)-Behandlung und unabhängig von Calcineurin (CN)-Aktivität. Stattdessen trägt wahrscheinlich die Protein/Proteininteraktion zwischen der regulatorischen Domäne von NFATc1 und der DNA-Bindungsdomäne von BCL6 zur anhaltenden nukleären Präsenz von NFATc1 und dem vorgeschlagenen NFATc1-MYC-BCL6-PRDM1-Netzwerk in B-Zelllymphomen bei. Unsere Daten ergaben keine strenge Korrelation zwischen der Expression der sechs NFATc1-Isoformen in verschiedenen BL-verwandten Entitäten. Dies suggeriert, dass sowohl NFATc1/αA wie –βA Überlebenssignale vermitteln und dass NFATc1α/βB und –α/βC-Isoformen in BL-Zellen keine pro-apoptotischen Eigenschaften besitzen oder diese Funktionen gegenreguliert werden. Des Weiteren zeigen wir, dass in BL-Entitäten die Expression der NFATc1-Proteine auf post-transkriptioneller Ebene reguliert werden. Dies schließt einen MYC-abhängigen Anstieg der Proteinstabilität ein. In Bezug auf die Funktion von NFATc1 zeigen wir, dass seine konditionelle Inaktivierung in Eµ-MYC-Mäusen die Entwicklung von BCL-Tumoren mit reifem T-Zellimmunphänotyp (IgD+) verhindert. Dementsprechend resultiert der Verlust der NFATc1-Expression in BCL-Zellen ex vivo in einer Apoptose der Tumorzellen. Zusammengefasst brandmarken unsere Resultate NFATc1 als einen entscheidenden Überlebensfaktor in BL-Zellen bzw. identifizieren es als vielversprechendes Ziel alternativer therapeutischer Strategien in BL. KW - Transkriptionsfaktor KW - Burkitt Lymphom KW - B-Zell-Lymphom KW - NFATc1 KW - Burkitt Lymphoma Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106448 ER - TY - THES A1 - Glotzbach-Schoon, Evelyn T1 - Contextual fear conditioning in humans: The return of contextual anxiety and the influence of genetic polymorphisms T1 - Kontextuelle Furchtkonditionierung beim Menschen: die Wiederkehr von Kontextangst und der Einfluss von genetischen Polymorphismen N2 - Als Angst bezeichnet man einen nicht auf spezifische Objekte gerichteten länger anhaltenden zukunfts-orientierten Zustand der Besorgnis. Diese ist kennzeichnend für Angststörungen wie Panikstörung, generalisierte Angststörung und Posttraumatische Belastungsstörung (PTBS). Experimentell kann Angst durch kontextuelle Furchtkonditionierung ausgelöst werden. Bei dieser Art der Konditionierung werden aversive Ereignisse als unvorhersehbar erlebt, wodurch der gesamte Kontext mit der Gefahr assoziiert wird. Diese Arbeit hat zum Ziel, Mechanismen der Entstehung und Aufrechterhaltung von Kontextangst zu untersuchen. Dies sind zum einem erleichterte Akquisition von Kontextkonditionierungen und deren fehlerhafte Extinktion. Hier ist vor allem die Fragestellung relevant, wie dies durch genetische Varianten moduliert wird (Studie 1). Zum anderen soll die Wiederkehr der Angst nach der Extinktion mit einem neuen Reinstatement-Paradigma untersucht werden (Studie 2). Zur Untersuchung dieser Forschungsfragen wurden zwei kontextuelle Furchtkonditionierungsstudien in virtueller Realität (VR) durchgeführt. Während der Akquisition wurden leicht schmerzhafte elektrische Reize (unkonditionierter Stimulus, US) unvorhersehbar präsentiert, während die Probanden in einem virtuellen Büroraum waren. Dadurch wurde dieser Raum zum Angstkontext (CXT+). Ein zweiter Büroraum wurde nie mit dem US gepaart, deshalb wurde dieser Raum zum Sicherheitskontext (CXT-). Die Extinktion, in der die Kontexte ohne US präsentiert wurden, fand 24 h später statt, und ein Test zum Abruf der Extinktion bzw. zur Wiederkehr der Angst nochmals 24 h später. In beiden Studien wurde die Angst auf drei verschiedenen Ebenen gemessen: Verhalten (angstpotenzierter Schreckreflex), Physiologie (tonische Hautleitfähigkeit), und verbale Ebene (explizite Ratings). Die Probanden für Studie 1 wurden anhand der 5-HTTLPR (S+ Risikoallel vs. LL nicht-Risikoallel) und NPSR1 rs324981 (T+ Risikoallel vs. AA nicht-Risikoallel) Polymorphismen stratifiziert, sodass vier kombinierte Genotyp Gruppen (S+/T+, S+/LL, LL/T+ und LL/AA) mit je 20 Probanden vorlagen. Es zeigte sich, dass der angstpotenzierte Schreckreflex durch die Interaktion zwischen beiden genetischen Polymorphismen moduliert wurde. Nur Träger beider Risikoallele (S+ Träger des 5-HTTLPR und T+ Träger des NPSR1 Polymorphismus) zeigten einen höheren Schreckreflex im CXT+ als im CXT- während der Akquisition. Der Abruf der Extinktion an Tag 3, gemessen anhand des Schreckreflexes, wurde allerdings nicht durch die Genotypen moduliert. Interessanterweise zeigte sich auf dem expliziten Angstlevel (Valenz- und Angstratings) nur ein Einfluss des NPSR1 Polymorphismus, und zwar bewerteten die nicht-Risikoallel Träger (AA) den CXT+ mit negativerer Valenz und höherer Angst im Vergleich zum CXT-; die Risikoallel Träger (T+) taten dies nicht. In der zweiten Studie wurde fast das gleiche Paradigma benutzt wie in der ersten Studie mit der Ausnahme, dass eine Versuchsgruppe (Reinstatementgruppe) den US noch einmal am Anfang des dritten Untersuchungstages vor der Präsentation von CXT+ und CXT- appliziert bekam. Die zweite Versuchsgruppe (Kontrollgruppe) erhielt keinen US, sondern wurde direkt durch CXT+ und CXT- geführt. Es zeigte sich, dass nur in der Reinstatementgruppe die Angst auf impliziter und expliziter Ebene wiederkehrte, d.h. die Probanden zeigten einen höheren Schreckreflex und höhere Angstratings auf den CXT+ im Vergleich zum CXT-. Wichtig war vor allem, dass die Wiederkehr der Angst in der Reinstatementgruppe mit der Veränderung der Zustandsangst und der Stimmung (von der Extinktion zum Test) korrelierte. D.h. je größer die Angst und je negativer die Stimmung wurden, desto höher war die Wiederkehr der Angst. Zusammengefasst belegt Studie 1, dass erleichterte kontextuelle Furchtkonditionierung auf impliziter Ebene (Schreckreflex) ein Endophänotyp für Angststörungen sein könnte, was zu unserem Verständnis der Ätiologie von Angststörungen beitragen könnte. Die Ergebnisse der zweiten Studie legen nahe, dass eine ängstliche und negative Stimmung nach der Extinktion die Rückkehr von Angst begünstigen könnte. Darüber hinaus scheint das VR-basierte kontextuelle Furchtkonditionierungsparadigma ein geeignetes Mittel zu sein, um Mechanismen der Angstentstehung und Angstwiederkehr experimentell zu erforschen. Weiterführende Studien könnten nun auch Angstpatienten untersuchen und das Paradigma auf evolutionär-relevante Kontexte (z.B. Höhe, Dunkelheit, weite Plätze) ausweiten. N2 - Sustained anxiety is considered as a chronic and future-oriented state of apprehension that does not belong to a specific object. It is discussed as an important characteristic of anxiety disorders including panic disorder, generalized anxiety disorder (GAD) and posttraumatic stress disorder (PTSD). Experimentally, sustained anxiety can be induced by contextual fear conditioning in which aversive events are unpredictably presented and therefore the whole context becomes associated with the threat. This thesis aimed at investigating important mechanisms in the development and maintenance of sustained anxiety: (1) facilitated acquisition and resistant extinction of contextual anxiety due to genetic risk factors (Study 1), and (2) the return of contextual anxiety after successful extinction using a new reinstatement paradigm (Study 2). To this end, two contextual fear conditioning studies were conducted in virtual reality (VR). During acquisition one virtual office was paired with unpredictable mildly painful electric stimuli (unconditioned stimulus, US), thus becoming the anxiety context (CXT+). Another virtual office was never paired with any US, thus becoming the safety context (CXT-). Extinction was conducted 24 h later, i.e. no US was presented, and extinction recall was tested another 24 h later on Day 3. In both studies context-evoked anxiety was measured on three different response levels: behavioral (anxiety-potentiated startle reflex), physiological (skin conductance level), and verbal (explicit ratings). In Study 1, participants were stratified for 5-HTTLPR (S+ risk allele vs. LL no risk allele) and NPSR1 rs324981 (T+ risk allele vs. AA no risk allele) polymorphisms, resulting in four combined genotype groups with 20 participants each: S+/T+, S+/LL, LL/T+, and LL/AA. Results showed that acquisition of anxiety-potentiated startle was influenced by a gene × gene interaction: only carriers of both risk alleles (S+ carriers of the 5-HTTLPR and T+ carriers of the NPSR1 polymorphism) exhibited significantly higher startle magnitudes in CXT+ compared to CXT-. However, extinction recall as measured with anxiety-potentiated startle was not affected by any genotype. Interestingly, the explicit anxiety level, i.e. valence and anxiety ratings, was only influenced by the NPSR1 genotype, in a way that no risk allele carriers (AA) reported higher anxiety and more negative valence in response to CXT+ compared to CXT-, whereas risk allele carriers (T+) did not. Study 2 adopted nearly the same paradigm with the modification that one group (reinstatement group) received one unsignaled US at the beginning of the experimental session on Day 3 before seeing CXT+ and CXT-. The second group served as a control group and received no US, but was immediately exposed to CXT+ and CXT-. Results showed a return of anxiety on the implicit and explicit level (higher startle responses and anxiety ratings in response to CXT+ compared to CXT-) in the reinstatement group only. Most important, the return of contextual anxiety in the reinstatement group was associated with a change of state anxiety and mood from extinction to test, that is the more anxiety and negative mood participants experienced before the reinstatement procedure, the higher their return of anxiety was. In sum, results of Study 1 showed that facilitated contextual fear conditioning on an implicit behavioral level (startle response) could be regarded as an endophenotype for anxiety disorders, which can contribute to our understanding of the etiology of anxiety disorders. Results of Study 2 imply that anxiety and negative mood after extinction could be an important facilitator for the return of anxiety. Furthermore, the present VR-based contextual fear conditioning paradigm seems to be an ideal tool to experimentally study mechanisms underlying the acquisition and the return of anxiety. Future studies could investigate clinical samples and extend the VR paradigm to evolutionary-relevant contexts (e.g., heights, darkness, open spaces). KW - Angst KW - Genetik KW - Kontextkonditionierung KW - context conditioning KW - anxiety KW - genetics KW - virtual reality KW - Virtuelle Realität Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87955 ER - TY - THES A1 - Hirschbeck, Maria Wenefriede T1 - Structure-based drug design on the enoyl-ACP reductases of Yersinia pestis and Burkholderia pseudomallei T1 - Struktur-basiertes Wirkstoffdesign an Enoyl-ACP Reductase von Yersinia pestis und Burkholderia pseudomallei N2 - Spreading drug resistances among Gram-negative pathogens and the paucity of new agents on the antibacterial drug market against these tenacious bacteria create a pressing need for the development of new antibiotics. The bacterial fatty acid biosynthesis pathway FAS-II, especially the enoyl-ACP reductase catalyzing the last step of the elongation cycle, is an established drug target against tuberculosis but has not been extensively exploited for drug design against other bacterial pathogens. In this thesis the enoyl-ACP reductases of the Gram-negative biothreat organisms Burkholderia pseudomallei and Yersinia pestis were targeted in a structure-based drug design approach. The structure of the most recently identified enoyl-ACP isoenzyme FabV was characterized by X-ray crystallography and could be determined in three different states. FabV from B. pseudomallei was obtained in the apo-form of the enzyme, whereas FabV from Y. pestis was characterized in a binary complex with the cofactor NADH as well as in a ternary complex with NADH and the triclosan-based 2-pyridone inhibitors PT172 and PT173. Analysis of the FabV structure revealed the typical fold of the short chain dehydrogenase/reductase superfamily with the NADH-binding Rossmann fold and a substrate-binding pocket with a conserved active site geometry compared to the related isoenzyme FabI. Additional structural elements of FabV are located around the active site. The monomeric form of the enzyme is thereby stabilized and the substrate-binding loop is kept in a closed, helical conformation. The ternary complexes of FabV exhibited a similar inhibitor-binding mode as observed for triclosan inhibition in FabI and point to a potential substrate-binding mechanism. B. pseudomallei possesses FabI as an additional enoyl-ACP reductase isoenzyme, which was structurally characterized in the apo form and in ternary complexes with NAD+ and the diphenyl ether inhibitors triclosan, PT02, PT12 or PT404 as well as the 4-pyridone inhibitor PT155. The structural data of the ternary enoyl-ACP reductases complexes of B. pseudomallei and Y. pestis hold the promise for the possibility to develop antibacterials targeting FabV or even both isoenzymes, FabI and FabV, based on the triclosan scaffold. N2 - Die Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen in Gram-negativen Pathogenen sowie der Mangel neuer Medikamente auf dem Arzneimittelmarkt gegen diese hartnäckigen Bakterien weist einen dringenden Bedarf an neuen Antibiotika auf. Die bakterielle Fettsäurebiosynthese (FAS-II), speziell die Enoyl-ACP-Reduktase, welche den finalen Schritt des Elongationszyklus katalysiert, ist ein etablierter Angriffspunkt in der Tuberkulosetherapie. Sie wurde jedoch bisher noch nicht für die gezielte Wirkstoffentwicklung gegen andere bakterielle Krankheitserreger genutzt. In dieser Dissertation waren die Enoyl-ACP Reduktasen aus Burkholderia pseudomallei und Yersinia pestis Gegenstand des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Struktur des zuletzt gefundenen Isoenzyms der Enoyl-ACP-Reduktase, FabV, wurde röntgenstrukturanalytisch charakterisiert und konnte in drei verschiedenen Zuständen bestimmt werden. Die Struktur des FabV Proteins aus B. pseudomallei wurde in der Apo-Form gelöst, während FabV aus Y. pestis in binären und ternären Komplexen mit NADH bzw. NADH und einem Triclosan-basierten 2-Pyridon-Inhibitor, PT172 bzw. PT173 charakterisiert wurde. FabV weist die typische Struktur eines Mitglieds der Short-Chain-Dehydrogenase/Reduktase Superfamilie mit einer NADH-bindenden Rossmann-Faltung und einer Substratbindetasche auf mit einer, im Vergleich zu dem verwandten Isoenzym FabI, konservierte Geometrie des aktiven Zentrums. Zusätzliche strukturelle Elemente sind um das aktive Zentrum gefaltet und stabilisieren damit das Enzym in seiner monomeren Form. Darüber hinaus halten sie den Substratbindeloop in einer geschlossenen helikalen Gestalt. Die ternären FabV Komplexe zeigen Übereinstimmungen mit dem bekannten Bindungsmechanismus des Inhibitors Triclosan in FabI und deuten auf einen möglichen Substratbindungsmechanismus hin. B. pseudomallei besitzt FabI als zusätzliches Isoenzym der Enoyl-ACP-Reduktasen. Dieses Isoenzym wurde in der Apo-Form und in ternären Komplexen mit NAD+ und den Diphenylether-Inhibitoren Triclosan, PT02, PT12 und PT404 sowie dem 4-Pyridon-Inhibitor PT155 strukturell charakterisiert. Die strukturellen Daten der ternären Enoyl-ACP-Reduktase Komplexe von B. pseudomallei und Y. pestis stellen die Möglichkeit in Aussicht Antibiotika zu entwickeln, welche FabV oder auch beide Isoenzyme, FabI und FabV, inhibieren. KW - Yersinia KW - Burkholderia KW - Arzneimitteldesign KW - Fettsäurestoffwechsel KW - Struktur-basiertes Wirkstoff Design KW - Fettsäurebiosynthese KW - Triclosan KW - FabI KW - FabV KW - Yersinia pestis KW - Burkholderia pseudomallei KW - FAS-II Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70869 ER - TY - THES A1 - Koziol, Uriel T1 - Molecular and developmental characterization of the Echinococcus multilocularis stem cell system T1 - Molekulare und entwicklungsbiologische Charakterisierung des Echinococcus multilocularis Stammzellsystems N2 - The metacestode larva of Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), one of the most dangerous zoonotic diseases in the Northern Hemisphere. Unlike “typical” metacestode larvae from other tapeworms, it grows as a mass of interconnected vesicles which infiltrates the liver of the intermediate host, continuously forming new vesicles in the periphery. From these vesicles, protoscoleces (the infective form for the definitive host) are generated by asexual budding. It is thought that in E. multilocularis, as in other flatworms, undifferentiated stem cells (so-called germinative cells in cestodes and neoblasts in free-living flatworms) are the sole source of new cells for growth and development. Therefore, this cell population should be of central importance for the progression of AE. In this work, I characterized the germinative cells of E. multilocularis, and demonstrate that they are indeed the only proliferating cells in metacestode vesicles. The germinative cells are a population of undifferentiated cells with similar morphology, and express high levels of transcripts of a novel non-autonomous retrotransposon family (ta-TRIMs). Experiments of recovery after hydroxyurea treatment suggest that individual germinative cells have extensive self-renewal capabilities. However, germinative cells also display heterogeneity at the molecular level, since only some of them express conserved homologs of fgfr, nanos and argonaute genes, suggesting the existence of several distinct sub-populations. Unlike free-living flatworms, cestode germinative cells lack chromatoid bodies. Furthermore, piwi and vasa orthologs are absent from the genomes of cestodes, and there is widespread expression of some conserved neoblast markers in E. multilocularis metacestode vesicles. All of these results suggest important differences between the stem cell systems of free-living flatworms and cestodes. Furthermore, I describe molecular markers for differentiated cell types, including the nervous system, which allow for the tracing of germinative cell differentiation. Using these molecular markers, a previously undescribed nerve net was discovered in metacestode vesicles. Because the metacestode vesicles are non-motile, and the nerve net of the vesicle is independent of the nervous system of the protoscolex, we propose that it could serve as a neuroendocrine system. By means of bioinformatic analyses, 22 neuropeptide genes were discovered in the E. multilocularis genome. Many of these genes are expressed in metacestode vesicles, as well as in primary cell preparations undergoing complete metacestode regeneration. This suggests a possible role for these genes in metacestode development. In line with this hypothesis, one putative neuropeptide (RGFI-amide) was able to stimulate the proliferation of primary cells at a concentration of 10-7 M, and the corresponding gene was upregulated during metacestode regeneration. N2 - Das Metazestoden Larvenstadium von Echinococcus multilocularis ist die Ursache für die alveoläre Echinokokkose (AE), eine der gefährlichsten Zoonosen in der nördlichen Hemisphäre. Im Gegensatz zu Metazestoden anderer Bandwürmer wächst es zu einem Labyrinth verknüpfter Vesikel, die in der Peripherie permanent neu gebildet werden und dabei die Leber des Wirts infilitrieren. In diesen Vesikeln werden die Protoskolizes (das infizierende Stadium für den Endwirt) durch asexuelle Knospung aus der Vesikelwand heraus gebildet. Man geht davon aus dass in E. multilocularis, wie in anderen Plattwürmen, undifferenzierte Stammzellen (so gennante „Germinative cells” in Bandwürmern und Neoblasten in Turbellarien) der einzige Ursprung neuer Zellen für Wachstum und Entwicklung sind. Deshalb sollte diese Zellpopulation eine zentrale Rolle im Fortschritt der AE spielen. In dieser Arbeit habe ich die Germinative cells von E. multilocularis charakterisiert und zeige, dass sie tatsächlich die einzigen sich vermehrenden Zellen in Metazestodenvesikeln sind. Die Germinative cells sind eine Population von undifferenzierten Zellen mit ähnlicher Morphologie, die eine hohe Zahl an Transkripten einer neuen Retrotransposonfamilie (ta-TRIMs) exprimieren. Experimente nach Behandlung mit Hydroxyurea deuten darauf hin, dass einzelne Germinative cells die Fähigkeit haben sich selbst zu erneuern. Allerdings, zeigen die Germinative cells auch Heterogenität auf molekurarer Ebene, da nur manche von Ihnen konservierte Homologe von fgfr, nanos und argonaute Genen exprimieren, was auf die Existenz eindeutiger Subpopulationen hinweist. Im Gegensatz zu Turbellarien fehlen den Germinative cells von Zestoden “Chromatoid bodies”, weiterhin fehlen dem Genom der Zestoden Orthologe von piwi und vasa und es werden einige Neoblastenmarker in den Metazestodenvesikeln von E. multilocularis umfassend exprimiert. All diese Ergebnisse zeigen deutliche Unterschiede zwischen den Stammzellsystemen von Turbellarien und Zestoden auf. Ich beschreibe ausserdem molekulare Marker für differenzierte Zelltypen, inklusive solche des Nervensystems. Mit diesen Markern wurde ein Nervennetz in Metazestodenvesikeln endeckt, das bis dato unbeschrieben war. Da die Vesikel unbeweglich sind und ihr Nervennetz unabhängig vom Nervensystem des Protoscolex ist wird angenommen dass es als Neuroendokrinsystem dient. Mit Hilfe von Genomanalysen wurden 22 Neuropeptidgene im Genom von E. multilocularis entdeckt. Viele von ihnen werden sowohl in Metazestodenvesiklen exprimiert als auch in Primärzellpräparationen, die zu kompletten Vesikeln regenerieren. Das weist auf eine mögliche Rolle dieser Gene in der Metazestodenentwicklung hin. Einhergehend mit dieser Hypothese war ein putatives Neuropeptid (RGFIamide) in der Lage die Vermehrung von Primärzellen bei einer Konzentration von 10-7 M zu stimulieren, dabei war das korrespondierende Gen während der Metazestodenregeneration hochreguliert. KW - Fuchsbandwurm KW - Echinococcus multilocularis KW - Stammzelle KW - Larve Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105040 ER - TY - THES A1 - Busch, Martin T1 - Aortic Dendritic Cell Subsets in Healthy and Atherosclerotic Mice and The Role of the miR-17~92 Cluster in Dendritic Cells T1 - Subsets dendritischer Zellen in der Aorta gesunder und atherosklerotischerMäuse und die Rolle des miR-17~92 Clusters in dendritischen Zellen N2 - Atherosclerosis is accepted to be a chronic inflammatory disease of the arterial vessel wall. Several cellular subsets of the immune system are involved in its initiation and progression, such as monocytes, macrophages, T and B cells. Recent research has demonstrated that dendritic cells (DCs) contribute to atherosclerosis, too. DCs are defined by their ability to sense and phagocyte antigens, to migrate and to prime other immune cells, such as T cells. Although all DCs share these functional characteristics, they are heterogeneous with respect to phenotype and origin. Several markers have been used to describe DCs in different lymphoid and non-lymphoid organs; however, none of them has proven to be unambiguous. The expression of surface molecules is highly variable depending on the state of activation and the surrounding tissue. Furthermore, DCs in the aorta or the atherosclerotic plaque can be derived from designated precursor cells or from monocytes. In addition, DCs share both their marker expression and their functional characteristics with other myeloid cells like monocytes and macrophages. The repertoire of aortic DCs in healthy and atherosclerotic mice has just recently started to be explored, but yet there is no systemic study available, which describes the aortic DC compartment. Because it is conceivable that distinct aortic DC subsets exert dedicated functions, a detailed description of vascular DCs is required. The first part of this thesis characterizes DC subsets in healthy and atherosclerotic mice. It describes a previously unrecognized DC subset and also sheds light on the origin of vascular DCs. In recent years, microRNAs (miRNAs) have been demonstrated to regulate several cellular functions, such as apoptosis, differentiation, development or proliferation. Although several cell types have been characterized extensively with regard to the miRNAs involved in their regulation, only few studies are available that focus on the role of miRNAs in DCs. Because an improved understanding of the regulation of DC functions would allow for new therapeutic options, research on miRNAs in DCs is required. The second part of this thesis focuses on the role of the miRNA cluster miR- 17~92 in DCs by exploring its functions in healthy and atherosclerotic mice. This thesis clearly demonstrates for the first time an anti-inflammatory and atheroprotective role for the miR17-92 cluster. A model for its mechanism is suggested. N2 - Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der arteriellen Gefäßwand und zahlreiche Zellen des Immunsystems, wie zum Beispiel Monozyten, Makrophagen, T und B Zellen sind an der Entstehung und Entwicklung beteiligt. Aktuelle Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass auch dendritische Zellen (DCs) zur Atherosklerose beitragen. DCs sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, Antigene zu erkennen, aufzunehmen, zu migrieren und andere Immunzellen, wie zum Beispiel T Zellen, zu aktivieren. Auch wenn alle DCs diese funktionellen Merkmale teilen, so sind sie in Bezug auf ihren Phänotyp oder Ursprung eine eher heterogene Gruppe. Zahlreiche Oberflächenmoleküle wurden in der Vergangenheit genutzt, um DCs in lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben zu beschreiben. Allerdings hat sich keines dieser Moleküle als spezifisch und unverwechselbar erwiesen. Die Expression von Oberflächenmolekülen ist sehr variabel und hängt nicht nur vom Aktivierungszustand der DCs, sondern auch vom umliegenden Gewebe ab. Dazu kommt, dass DCs in der Aorta, beziehungsweise im atherosklerotischen Plaque, von designierten Vorläuferzellen, aber auch von Monozyten abstammen können und DCs das Profil ihrer Oberflächenmoleküle, sowie ihre funktionellen Eigenschaften, mit anderen myeloiden Zellen wie Monozyten und Makrophagen teilen. Neuere Arbeiten haben damit begonnen das Repertoire an DCs in der Aorta von gesunden und atherosklerotischen Mäusen zu untersuchen. Da es naheliegt, dass verschiedene DC Untergruppen ganz bestimmte Funktionen ausüben, wird eine detaillierte Beschreibung vaskulärer DCs in der Forschung benötigt. Weil es hierzu allerdings bislang kaum Studien gibt, untersucht der erste Teil dieser Arbeit zum ersten Mal systematisch die in gesunden und atherosklerotischen Mäusen vorkommenden Gruppen an DCs. Sie beschreibt außerdem eine zuvor nicht beachtete DC-Untergruppe und gibt Aufschluss über den Ursprung vaskulärer DCs. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass microRNAs (mirRNAs) zahlreiche zelluläre Vorgänge wie Apoptose, Differenzierung, Entwicklung und Proliferation regulieren. Obwohl viele Zelltypen in Bezug auf die in ihrer Regulation eingebundenen mirRNAs charakterisiert wurden, gibt es nur wenige Studien, die sich mit der Rolle von mirRNAs in DCs beschäftigen. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Rolle der miRNA Gruppe miR-17~92 in DCs und untersucht deren Rolle in gesunden und atherosklerotischen Mäusen. Diese Arbeit zeigt erstmals eine deutliche anti-inflammatorische und protektive Rolle dieser miRNA und schlägt ein Modell für die entdeckten Mechanismen vor. KW - Aorta KW - Maus KW - Zelle KW - Cluster KW - miRNS KW - Dendritische Zelle KW - Arteriosklerose KW - miR-17~92 KW - dendritic cells KW - atherosclerosis KW - mice KW - murine Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71683 ER - TY - THES A1 - Chen, Wenchun T1 - Studies on the role of calcium channels and the kinase domain of transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) in platelet function T1 - Studien über die Rolle von Calcium Kanälen und der Kinase Dömane von transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) für die Thrombozytenfunktion N2 - Platelet activation and aggregation are essential processes for the sealing of injured vessel walls and preventing blood loss. Under pathological conditions, however, platelet aggregation can lead to uncontrolled thrombus formation, resulting in irreversible vessel occlusion. Therefore, precise regulation of platelet activation is required to ensure efficient platelet plug formation and wound sealing but also to prevent uncontrolled thrombus formation. Rapid elevations in the intracellular levels of cations are a core signaling event during platelet activation. In this thesis, the roles of Ca2+ and Mg2+ channels in the regulation of platelet function were investigated. Orai1, the major store-operated calcium (SOC) channel in platelets, is not only vital for diverse signaling pathways, but may also regulate receptor-operated calcium entry (ROCE). The coupling between the Orai1 signalosome and canonical transient receptor potential channel (TRPC) isoforms has been suggested as an essential step in the activation of store-operated calcium entry (SOCE) and ROCE in human platelets. However, the functional significance of the biochemical interaction between Orai and TRPC isoforms still remains to be answered. In the first part of this thesis, the functional crosstalk between Orai1 and TRPC6 was addressed. Orai1-mediated SOCE was found to enhance the activity of phospholipases (PL) C and D, to increase diacylglycerol (DAG) production and finally to regulate TRPC6-mediated ROCE via DAG, indicating that the regulation of TRPC6 channel activity seems to be independent of the physical interaction with Orai1. Furthermore, Orai1 and TRPC6 double deficiency led to a reduced Ca2+ store content and basal cytoplasmic Ca2+ concentrations, but surprisingly also enhanced ATP secretion, which may enhance Ca2+ influx via P2X1 and compensate for the severe Ca2+ deficits seen in double mutant platelets. In addition, Orai1 and TRPC6 were not essential for G protein-coupled receptor (GPCR)-mediated platelet activation, aggregation and thrombus formation. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) contains a cytosolic serine/threonine protein kinase. To date, a few in vitro substrates of the TRPM7 kinase have been identified, however, the physiological role of the kinase remains unknown. In the second part of this thesis, mice with a point mutation which blocks the catalytic activity of the TRPM7 kinase (Trpm7KI) were used to study the role of the TRPM7 kinase in platelet function. In Trpm7KI platelets phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) metabolism and Ca2+ mobilization were severely impaired upon glycoprotein (GP) VI activation, indicating that the TRPM7 kinase regulates PLC function. This signaling defect in Trpm7KI platelets resulted in impaired aggregate formation under flow and protected animals from arterial thrombosis and ischemic brain infarction. Altogether, these results highlight the kinase domain of TRPM7 as a pivotal signaling moiety implicated in the pathogenesis of thrombosis and cerebrovascular events. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sind zwei elementare Prozesse für das Abdichten verletzter Gefäßwände und damit zur Verhinderung von exzessivem Blutverlust. Unter pathologischen Bedingungen kann die Thrombozytenaggregation jedoch zur unkontrollierten Thrombusbildung und folglich zum irreversiblen Gefäßverschluss führen. Daher ist eine präzise Regulation der Thrombozytenaktivierung wichtig, um effizient Gefäßverletzungen zu schließen aber gleichzeitig eine unkontrollierte Thrombusbildung zu verhindern. Schnelle Veränderungen der zytoplasmatischen Konztentration von Kationen stellen ein Kernelement der Signaltransduktion während der Plättchenaktivierung dar. In dieser Arbeit wurden die Rolle von Ca2+ und Mg2+ Kanälen in der Regulation der Thrombozytenfunktion untersucht. Orai1, der bedeutendste store-operated calcium (SOC) Kanal in Thrombozyten, ist nicht nur entscheidend für verschiedene Signalwege, sondern reguliert möglicherweise auch receptor-operated calcium entry (ROCE). Die Kopplung zwischen dem Orai1-Signalkomplex und canonical transient receptor potential channel (TRPC) Isoformen wurde als entscheidender Schritt in der Aktivierung in der Aktivierung von store-operated calcium entry (SOCE) und ROCE in humanen Thrombozyten vermutet. Die Frage nach der funktionellen Relevanz der Interaktion zwischen Orai und TRPC Isoformen blieb jedoch unbeantwortet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der funktionelle Crosstalk zwischen Orai1 und TRPC6 adressiert. Hierbei zeigte sich, das Orai1-vermittelter SOCE die Aktivität der Phosholipasen (PL) C und D steigert, die Diacylglycerol (DAG) Produktion verstärkt und schließlich TRPC6-vermittelten ROCE via DAG reguliert, was darauf hindeutet, dass die Regulation der TRPC6 Kanalaktivität unabhängig von einer direkten Interaktion mit Orai1 zu sein scheint. Darüber hinaus führte die Doppeldefizienz von Orai1 und TRPC6 zu verringerten Ca2+ Konzentrationen in intrazellulären Ca2+-Speichern und im Zytoplasma der Thrombozyten. Überraschenderweise war auch die ATP-Sekretion erhöht, was eventuell den Ca2+-Einstrom durch P2X1 verstärkt und möglicherweise das starke Ca2+-Defizit in den doppeldefizienten Thrombozyten kompensiert. Außerdem wurde gezeigt, dass Orai1 und TRPC6 nicht für die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten sowie für die Thrombusbildung mittlels G protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) benötigt werden. Transient receptor potential melastatin-like 7 (TRPM7) enthält eine zytosolische Serin/Threonin-Kinase Domain. Bislang wurden zwar wenige in vitro Substrate der TRPM7 Kinase identifiziert, jedoch ist die physiologische Rolle dieser Kinase immer noch unbekannt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer Punktmutation, welche die katalytische Aktivität der TRPM7 Kinase blockiert (Trpm7KI) eingesetzt um die Rolle der TRPM7 Kinase für die Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In Trpm7KI Thrombozyten war der Metabolismus von phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) und die Ca2+-Mobilisierung nach Aktivierung des Rezeptors Glykoprotein (GP) VI schwer beeinträchtigt, was darauf hindeutet, dass die Aktivität der TRPM7 Kinase die Funktion der PLC reguliert. Aus diesem Signaltransduktionsdefekt in Trpm7KI Thrombozyten resultierte eine verringerte Aggregatbildung unter Flussbedingungen und ein Schutz der Tiere vor arteriellen Thrombosen und ischämischem Schlaganfall. Zusammenfassend heben diese Ergebnisse die Kinasedomäne von TRPM7 als einen ausschlaggebenden Bestandteil in Signalkaskaden hervor und implizieren eine Rolle dieser Domäne in der Pathogenese von ischämischen Kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. KW - Thrombozyt KW - Calciumkanal KW - Protein TRPC6 KW - Platelet KW - Orai1 KW - Crosstalk KW - TRPM7 kinase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103719 ER - TY - THES A1 - Wu, Lingdan T1 - Emotion Regulation in Addicted Smokers T1 - Emotionsregulation bei abhängigen Rauchern N2 - Background: Nicotine addiction is the most prevalent type of drug addiction that has been described as a cycle of spiraling dysregulation of the brain reward systems. Imaging studies have shown that nicotine addiction is associated with abnormal function in prefrontal brain regions that are important for cognitive emotion regulation. It was assumed that addicts may perform less well than healthy nonsmokers in cognitive emotion regulation tasks. The primary aims of this thesis were to investigate emotional responses to natural rewards among smokers and nonsmokers and to determine whether smokers differ from nonsmokers in cognitive regulation of positive and negative emotions. To address these aims, two forms of appraisal paradigms (i.e., appraisal frame and reappraisal) were applied to compare changes in emotional responses of smokers with that of nonsmokers as a function of appraisal strategies. Experiment 1: The aim of the first experiment was to evaluate whether and how appraisal frames preceding positive and negative picture stimuli affect emotional experience and facial expression of individuals. Twenty participants were exposed to 125 pairs of auditory appraisal frames (either neutral or emotional) followed by picture stimuli reflecting five conditions: unpleasant-negative, unpleasant-neutral, pleasant-positive, pleasant-neutral and neutral-neutral. Ratings of valence and arousal as well as facial EMG activity over the corrugator supercilii and the zygomaticus major were measured simultaneously. The results indicated that appraisal frames could alter both subjective emotional experience and facial expressions, irrespective of the valence of the pictorial stimuli. These results suggest and support that appraisal frame is an efficient paradigm in regulation of multi-level emotional responses. 8 Experiment 2: The second experiment applied the appraisal frame paradigm to investigate how smokers differ from nonsmokers on cognitive emotion regulation. Sixty participants (22 nonsmokers, 19 nondeprived smokers and 19 12-h deprived smokers) completed emotion regulation tasks as described in Experiment 1 while emotional responses were concurrently recorded as reflected by self-ratings and psychophysiological measures (i.e., facial EMG and EEG). The results indicated that there was no group difference on emotional responses to natural rewards. Moreover, nondeprived smokers and deprived smokers performed as well as nonsmokers on the emotion regulation task. The lack of group differences in multiple emotional responses (i.e., self-reports, facial EMG activity and brain EEG activity) suggests that nicotine addicts have no deficit in cognitive emotion regulation of natural rewards via appraisal frames. Experiment 3: The third experiment aimed to further evaluate smokers’ emotion regulation ability by comparing performances of smokers and nonsmokers in a more challenging cognitive task (i.e., reappraisal task). Sixty-five participants (23 nonsmokers, 22 nondeprived smokers and 20 12-h deprived smokers) were instructed to regulate emotions by imagining that the depicted negative or positive scenario would become less negative or less positive over time, respectively. The results showed that nondeprived smokers and deprived smokers responded similarly to emotional pictures and performed as well as nonsmokers in down-regulating positive and negative emotions via the reappraisal strategy. These results indicated that nicotine addicts do not have deficit in emotion regulation using cognitive appraisal strategies. In sum, the three studies consistently revealed that addicted smokers were capable to regulate emotions via appraisal strategies. This thesis establishes the groundwork for therapeutic use of appraisal instructions to cope with potential self-regulation failures in nicotine addicts. N2 - Hintergrund: Nikotinsucht ist die am weitesten verbreitete Form von Drogenabhängigkeit und wird beschrieben als eine immer stärker werdende Dysregulation des Belohnungssystems im Gehirn. Bildgebende Studien zeigten, dass Nikotinabhängige eine abnormale Funktion der präfrontalen Gehirnregionen aufweisen, die für die kognitive Emotionsregulation von entscheidender Bedeutung sind. Es wurde angenommen, dass Süchtige bei kognitiven Aufgaben zur Emotionsregulation schlechter abschneiden als gesunde Nichtraucher. Vorrangige Ziele dieser Thesis waren die Untersuchung emotionaler Reaktionen auf natürliche, Raucher-irrelevante Stimuli bei Rauchern und Nichtrauchern. Außerdem sollte herausgefunden werden, ob sich Raucher von Nichtrauchern bezüglich ihrer kognitiven Regulation von positiven und negativen Emotionen unterscheiden. Um diese Veränderungen in der emotionalen Reaktion in Abhängigkeit der Interpretationsstrategie vergleichen zu können, wurden zwei Paradigmen zur Einschätzung emotionaler Stimuli eingesetzt: Eine prospektive Interpretationsstrategie des kommenden Stimulus (appraisal frame) und eine retrospektive Interpretationsstrategie nach der Stimuluspräsentation (reappraisal). Experiment 1: Ziel des ersten Experiments war die Evaluierung ob und wie Interpretationen vor positiven oder negativen Stimulusbildern die emotionale Erfahrung und den Gesichtsausdruck von Personen beeinflussen. 20 Versuchspersonen wurden 125 Paare auditiver Beschreibungen (entweder neutral oder emotional) präsentiert, gefolgt von Stimulusbildern, die zusammen fünf Stimulus-Kategorien bildeten: unangenehm – negativ, unangenehm – neutral, angenehm – positiv, angenehm – neutral und neutral – neutral. Valenz- und Arousal-Ratings wurden abgefragt und die EMG-Aktivität der Gesichtsmuskeln corrugator supercilii und zygomaticus 10 major wurden zeitgleich aufgenommen. Die Ergebnisse zeigten, dass appraisal frames sowohl emotionale Reaktionen einschließlich subjektiver emotionaler Erfahrungen beeinflussen als auch den Gesichtsausdruck verändern können, unabhängig von der Valenz des Bildstimulus. Dies zeigt und beweist die Effizienz des appraisal frame Paradigmas bei der Regulation von emotionalen Reaktionen auf mehreren Verarbeitungsebenen. Experiment 2: Das zweite Experiment bezog sich auf das appraisal frame Paradigma und sollte untersuchen wie sich Raucher von Nichtrauchern in ihrer kognitiven Emotionsregulation unterscheiden. 60 Probanden (22 Nichtraucher, 19 Raucher ohne Entzug und 19 Raucher mit 12 Stunden Zigarettenentzug) führten Emotionsregulationsaufgaben wie in Experiment 1 beschrieben aus, während ihre emotionalen Reaktionen ständig über Selbsteinschätzungen und psychophysiologische Messungen aufgenommen wurden (faziales EMG und EEG). Die Ergebnisse zeigten keine Gruppenunterschieden bei den emotionalen Reaktionen auf natürliche Stimuli, ohne Bezug zum Rauchen; Außerdem schnitten Raucher mit und ohne Zigarettenentzug in der Emotionsregulationsaufgabe genauso gut ab wie Nichtraucher. Die gleichen Ergebnisse in allen Gruppen hinsichtlich emotionaler Reaktionen (Selbsteinschätzung, faziale EMG Aktivität und EEG Aktivität) machten deutlich, dass Nikotinabhängige keine Einschränkungen in der kognitiven Emotionsregulation auf natürliche Stimuli mittels Vorbeurteilungen haben. Experiment 3: Der dritte Versuch wurde durchgeführt, um die Fähigkeiten von Rauchern bei der Emotionsregulation zu untersuchen, indem die Erfolge von Rauchern und Nichtrauchern in einer schwierigeren kognitiven Aufgabe (reappraisal task) verglichen wurden. 65 Versuchspersonen (23 Nichtraucher, 22 Raucher ohne Entzug und 20 Raucher mit 12 Stunden Zigarettenentzug) wurden instruiert ihre Emotionen zu regulieren, indem sie emotionale Bilder 11 mit neutralem Gefühl interpretieren. Die Probanden sollten sich vorstellen, dass die negativen oder positiven Syenarios immer weniger negativ oder weniger positiv werden. Die Ergebnisse stellen heraus, dass Raucher mit und ohne Zigarettenentzug ähnlich auf emotionale Bilder reagierten und ihre positiven und negativen Emotionen mit der reappraisal Strategie genauso gut herunterregulierten wie Nichtraucher. Zusammenfassend machen die drei Studien deutlich, dass Nikotinabhängige mittels Interpretationsstrategien ihre Emotionen regulieren können. Diese Thesis bilden das Fundament für den therapeutischen Nutzen von Interpretationsstrategien, damit Nikotinabhängige mit potenziellen Selbstregulationsstörungen umgehen können. KW - Gefühl KW - Regulation KW - Rauch KW - Elektroencephalogramm KW - Elektromyographie KW - Emotion KW - Regulation KW - Smoke KW - Electroencephalography KW - Electromyography Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85471 ER - TY - THES A1 - Sun, Ping T1 - Alzheimer`s disease and brain insulin resistance: The diabetes inducing drug streptozotocin diminishes adult neurogenesis in the rat hippocampus – an in vivo and in vitro study T1 - Alzheimer-Krankheit und Insulinresistenz im Gehirn: Streptozotocin, das Änderungen im Insulinstoffwechsel hervorruft, reduziert die Neubildung von Neuronen im Hippocampus von adulten Ratten - In vivo- und In vitro-Untersuchungen N2 - Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disease of the brain, which is characterized by a progressive loss of memory and spatial orientation. Only less than 5-10% of AD sufferers are familial cases due to genetic mutations in the amyloid precursor protein (APP) gene or presenilin (PS) 1 and 2 genes. The cause of sporadic AD (sAD) which covers > 95% of AD patients is still unknown. Current research found interactions between aging, diabetes and cognitive decline including dementia in general and in AD in particular. Disturbances of brain glucose uptake, glucose tolerance and utilization and impairment of the insulin/insulin receptor (IR) signaling cascade are thought to be key targets for the development of sAD. In the brain of AD patients, neural plasticity is impaired indicated by synaptic and neuronal loss. Adult neurogenesis (AN), the generation of functional neurons in the adult brain, may be able to restore neurological function deficits through the integration of newborn neurons into existing neural networks. The dentate gyrus of the hippocampus is one out of few brain regions where life-long AN exists. However, there is a big controversy in literature regarding the involvement of AN in AD pathology. Most animal studies used transgenic mice based on the Amyloid ß (Aß) hypothesis which primarily act as models for the familial form of AD. Findings from human post mortem AN studies were also inconstistent. In this thesis, we focused on the possible involvement of AN in the pathogenesis of the sporadic form of AD. Streptozotocin intracerebroventricularily (STZ icv) treated rats, which develop an insulin-resistant brain state and learning and memory deficits preceding Aß pathology act as an appropriate animal model for sAD. We used STZ treatment for both parts of my work, for the in vivo and in vitro study. In the first part of my thesis, my coworkers and I investigated STZ icv treatment effects on different stages of AN in an in vivo approach. Even if STZ icv treatment does not seem to considerably influence stem cell proliferation over a short-term (1 month after STZ icv treatment) as well as in a long-term (3 months after STZ icv treatment) period, it results in significantly less immature and newborn mature neurons 3 months after STZ icv treatment. This reduction detected after 3 months was specific for the septal hippocampus, discussed to be important for spatial learning. Subsequently we performed co-localization studies with antibodies detecting BrdU (applied appr. 27 days before sacrifice) and cell-type specific markers such as NeuN, and GFAP, we found that STZ treatment does not affect the differentiation fate of newly generated cells. Phenotype analysis of BrdU-positive cells in the hilus and molecular layer revealed that some of the BrdU-positive cells are newborn oligodendrocytes but not newborn microglia. In the second part of my thesis I worked with cultured neural stem cells (NSCs) isolated from the adult rat hippocampus to reveal STZ effects on the proliferation of of NSCs, and on the survival and differentiation of their progeny. Furthermore, this in vitro approach enabled me to study cellular mechanisms underlying the observed impaired neurogenesis in the hippocampus of STZ-treated rats. In contrast to our findings of the STZ icv in vivo study we revealed that STZ supplied with the cell culture medium inhibits the proliferation of NSCs in a dose-dependent and time-dependent manner. Moreover, performing immunofluorescence studies with antibodies detecting cell-type specific markers after triggering NSCs to differentiate, we could show that STZ treatment affects the number of newly generated neurons but not of astrocytes. Analyzing newborn cells starting to differentiate and migrate I was able to demonstrate that STZ has no effect on the migration of newborn cells. Trying to reveal cellular mechanisms underlying the negative influence of STZ on hippocampal AN, we performed qRT-PCR and immunofluorescence staining and thus could show that in NSCs the expression of glucose transporter (GLUT)3 mRNA as well as IR and GLUT3 protein levels are reduced after STZ treatment. Therefore, the inhibition of the proliferation of NSCs may be (at least partially) caused by these two molecules. Interestingly, the effect of STZ on differentiating cells was shown to be different, as IR protein expression was not significantly changed but GLUT3 protein levels were decreased in consequence of STZ treatment. In summary, this project delivered further insights into the interrelation between AN the sporadic form of sAD and thus provides a basis of new therapeutic approaches in sAD treatment through intervening AN. Discrepancies between the results of the two parts of my thesis, the in vivo and in vitro part, were certainly caused to a certain extent by the missing microenvironment in the in vitro approach with cultured NSCs. Future studies e.g. using co-culture systems could at least minimize the effect of a missing natural microenvironment of cultured NSCs, so that the use of an in vitro approach for the investigation of STZ treatment underlying cellular mechanisms can be improved. N2 - Die Alzheimer-Krankheit (AK) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit. Nur etwa 5 bis 10% der Betroffenen leiden an der familiären Form, die auf bestimmten Mutationen in einzelnen Genen, wie z.B. dem Amyloid precursor protein (APP)-Gen, zurückzuführen ist. Die Ursache der sporadischen Form der AK (sAK), die mehr als 95% der Betroffenen ausmacht, ist hingegen noch weitgehend unbekannt. Jüngste Erkenntnisse weisen auf eine Wechselwirkung von hohem Alter, Stoffwechselkrankheiten wie z.B. Diabetes, und kognitiven Defiziten, welche eine Demenz im Allgemeinen und die Alzheimer-Krankheit im Besonderen kennzeichnen, hin. Deshalb werden Störungen in der Glukoseaufnahme, in der Glukosetoleranz, und in der Funktion des Insulin/Insulinrezeptorsignalweges als Schlüsselelemente für die Entstehung einer sAK angesehen. Die neuronale Plastizität der Gehirne von AK-Patienten ist stark eingeschränkt, was sich vor allem durch den Verlust von Synapsen als auch durch den Verlust ganzer Nervenzellen zeigt. Die adulte Neurogenese (AN), die Neubildung von Neuronen im Gehirn von erwachsenen Individuen, könnte durch den Einbau neu gebildeter Neurone in existierende neuronale Netzwerke eine wichtige Rolle bei der Regenerierung neurologischer Defizite spielen. Der Gyrus dentatus im Hippocampus ist eine der wenigen Gehirnregionen, in welcher lebenslang AN stattfindet. Jedoch ist noch unklar, ob eine veränderte AN an der Pathogenese der AK beteiligt ist. Es wurden bereits viele Untersuchungen zur AN in Tiermodellen durchgeführt, wobei die überwiegende Anzahl von bisher verwendeten Tiermodellen auf der Amyloid ß-(Aß) Hypothese basieren, und somit primär Modelle für die familiäre AK darstellen. Studien mit humanem post mortem-Gewebe gaben bisher jedoch auch noch keine klaren Hinweise auf die mögliche Bedeutung einer veränderten AN für die AK. In dieser Thesis sollte die Rolle der AN für die Pathogenese der sAD untersucht werden. Dafür wurden Ratten mit Streptozotocin intracerebroventrikulär (STZ icv) behandelt. Diese so behandelten Ratten gelten als Tiermodell für die sAK, da sie bereits kurze Zeit nach ihrer STZ icv-Behandlung kognitive Defizite zeigen, ihr Gehirn eine Insulin-Resistenz entwickelt, und etwas später dann auch erste Anzeichen einer Aß-Pathologie nachweisbar sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde in einem in vivo-Ansatz der mögliche Einfluss einer STZ icv-Behandlung auf die verschiedenen Stadien der AN untersucht. Wir konnten zeigen, dass 1 Monat nach STZ icv-Behandlung weder die Proliferation neuraler Stammzellen (neural stem cells, NSCs) noch die Bildung junger Neurone verändert war, dass aber nach 3 Monaten signifikant weniger junge unreife und auch reife Neurone entstanden sind. Diese reduzierte Anzahl neu gebildeter Neurone konnte nur im septalen Teil des Hippocampus, dem eine bedeutende Rolle beim räumlichen Lernen zugesprochen wird, nachgewiesen werden. Durch eine quantitativ ausgewertete Ko-Lokalisationsstudie mit Antikörpern gegen Bromodesoxyuridin (BrdU) (mehrmalige i.p.-Gabe 27 Tage vor Gewebeentnahme) und zelltyp-spezifischen Markern wie dem Neuronenmarker NeuN und dem Marker für Astrozypen GFAP konnten wir zeigen, dass die STZ icv-Gabe nur die Anzahl der neu gebildeten Neuronen, aber nicht die Differenzierungsrichtung der neu gebildeten Zellen verändert. Eine qualitative Phänotypanalyse BrdU-positiver Zellen ergab außerdem, dass im Hilus und in der Molekularschicht des Gyrus dentatus lokalisierte BrdU-positive Zellen neu gebildeten Oligodendrozyten, aber nicht neu gebildeten Mikrogliazellen, zugeordnet werden konnten. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich NSCs aus dem adulten Hippocampus isoliert und kultiviert, um auch auf diese Art und Weise mögliche Effekte von STZ auf die Proliferation von NSCs als auch auf das Überleben und die Differenzierung von neu geborenen Zellen zu untersuchen. Ziel dieser in vitro-Studie war eine genauere Analyse der durch STZ-Gabe ausgelösten grundlegenden zellulären Mechanismen. Im Widerspruch zu den Ergebnissen der in vivo-Studie konnte ich einen Dosis- und Zeit-abhängigen negativen Effekt von STZ auf die Proliferation der NSCs zeigen. Darüber hinaus führte die Zugabe von STZ zum Medium letztendlich zu einer verringerten Bildung von Neuronen, die Neubildung von Astrozyten zeigte sich jedoch unverändert. In einem Test zur Untersuchung der Migration neu gebildeter Zellen konnte ich keinen Einfluss von STZ auf die Migration nachweisen. Weitere Analysen ergaben, dass die verringerte Proliferation der NSCs im Zusammenhang mit einer reduzierten mRNA- als auch Protein-Expression des Glukosetransporters(GLUT)3 und mit reduzierten Insulinrezeptorkonzentrationen stehen könnte. In sich differenzierenden Zellen jedoch wurde neben einer ebenfalls reduzierten GLUT3- Proteinexpression keine veränderte Insulinrezeptorenausstattung detektiert. Zusammenfassend gibt die vorliegende Arbeit mithilfe des in vivo- als auch in vitro-Ansatzes Hinweise auf eine Bedeutung der hippocampalen AN für die Entstehung der sAK und bietet dadurch Ansatzpunkte für neue therapeutische Ansätze. Die im in vivo- und in vitro-Ansatz erzielten unterschiedlichen Resultate, die sicherlich zum Teil durch die fehlende Mikroumgebung der NSCs und sich differenzierenden Zellen im in vitro-Ansatz verursacht wurden, können in Zukunft z.B. durch Ko-Kulturen zumindest verringert werden, so dass mithilfe von in vitro-Ansätzen grundlegende zelluläre Mechanismen einer STZ-Effekts in Zukunft besser untersucht werden können. KW - Alzheimerkrankheit KW - Insulinresistenz KW - adult neurogenesis KW - streptozotocin KW - Alzheimer`s disease KW - insulin resistance Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119252 ER - TY - THES A1 - Ehmann, Nadine T1 - Linking the active zone ultrastructure to function in Drosophila T1 - Struktur-Funktions-Beziehungen an der aktiven Zone in Drosophila N2 - Accurate information transfer between neurons governs proper brain function. At chemical synapses, communication is mediated via neurotransmitter release from specialized presynaptic intercellular contact sites, so called active zones. Their molecular composition constitutes a precisely arranged framework that sets the stage for synaptic communication. Active zones contain a variety of proteins that deliver the speed, accuracy and plasticity inherent to neurotransmission. Though, how the molecular arrangement of these proteins influences active zone output is still ambiguous. Elucidating the nanoscopic organization of AZs has been hindered by the diffraction-limited resolution of conventional light microscopy, which is insufficient to resolve the active zone architecture on the nanometer scale. Recently, super-resolution techniques entered the field of neuroscience, which yield the capacity to bridge the gap in resolution between light and electron microscopy without losing molecular specificity. Here, localization microscopy methods are of special interest, as they can potentially deliver quantitative information about molecular distributions, even giving absolute numbers of proteins present within cellular nanodomains. This thesis puts forward an approach based on conventional immunohistochemistry to quantify endogenous protein organizations in situ by employing direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). Focussing on Bruchpilot (Brp) as a major component of Drosophila active zones, the results show that the cytomatrix at the active zone is composed of units, which comprise on average ~137 Brp molecules, most of which are arranged in approximately 15 heptameric clusters. To test for a quantitative relationship between active zone ultrastructure and synaptic output, Drosophila mutants and electrophysiology were employed. The findings indicate that the precise spatial arrangement of Brp reflects properties of short-term plasticity and distinguishes distinct mechanistic causes of synaptic depression. Moreover, functional diversification could be connected to a heretofore unrecognized ultrastructural gradient along a Drosophila motor neuron. N2 - Kommunikation zwischen Nervenzellen ist von grundlegender Bedeutung für die Hirnfunktion. An chemischen Synapsen findet diese an hoch spezialisierten interzellulären Kontaktstellen statt, den aktiven Zonen, welche die Voraussetzung für präzise Neurotransmission schaffen und somit die synaptische Kommunikation gewährleisten. In aktiven Zonen befindet sich eine Vielzahl von Proteinen dicht gepackt, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Plastizität der Signaltransduktion vermitteln. Bisher ist es jedoch unklar, in welcher Weise die molekularen Organisationsprinzipien dieser Proteine die Funktion der aktiven Zone beeinflussen. Teilweise ist dies dem Auflösungsvermögen konventioneller Lichtmikroskopie geschuldet, das nicht ausreicht um die Architektur der aktiven Zone im Nanometer Bereich aufzuklären. Unlängst jedoch haben neue Methoden der hochaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie ihren Weg in die Neurowissenschaften gefunden. Diese sind in der Lage die Lücke zwischen optischer Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu schließen, ohne die Identität der Proteinspezies aus den Augen zu verlieren. Besonderes Interesse kommt hierbei sogenannten Lokalisationsmikroskopie Techniken zu. Diese können neben der Darstellung molekularer Organisationen im Idealfall sogar quantitative Informationen über die absolute Anzahl bestimmter Moleküle in subzellulären Bereichen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die auf klassischer Immunohistochemie beruht und dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) nutzt, um die endogene Proteinorganisation in situ zu quantifizieren. Fokussierend auf Brp (Bruchpilot), einem Protein an der aktiven Zone von Drosophila melanogaster, zeigen die Ergebnisse, dass die Zytomatrix an der aktiven Zone modular aufgebaut ist, wobei jedes Modul ~137 Brp Moleküle umfasst. Diese sind zum Großteil in etwa 15 Gruppen mit je 7 Untereinheiten angeordnet. Um auf einen quantitativen Zusammenhang zwischen der Ultrastruktur der aktiven Zone und ihrer Funktion zu schließen, wurden Drosophila Mutanten eingesetzt und mittels Elektrophysiologie funktionell untersucht. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass sich spezifische Eigenschaften von Kurzzeitplastizität in der präzisen Anordnung von Brp widerspiegeln, was Rückschlüsse auf verschiedene Ursprünge synaptischer Depression zulässt. Darüber hinaus beschrieben dSTORM Experimente erstmals, dass ein funktioneller Gradient entlang des Motoneurons mit der graduellen Veränderung der Anzahl von Bruchpilotmolekülen pro aktive Zone korreliert. KW - Taufliege KW - Elektrophysiologie KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Synapse KW - Drosophila KW - active zone KW - structure-function relationships KW - super-resolution microscopy KW - electrophysiology KW - Synapses KW - Microscopy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118186 ER - TY - THES A1 - Brede, Christian T1 - Peripheral alloantigen expression directs the organ specific T cell infiltration after hematopoietic cell transplantation T1 - Die Expression von Alloantigenen im peripheren Gewebe beeinflusst die selektive Organinfiltration durch T Zellen nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation N2 - In acute graft-versus-host disease (GVHD) alloreactive donor T cells selectively damage skin, liver, and the gastrointestinal tract while other organs are rarely affected. The mechanism of this selective target tissue infiltration is not well understood. We investigated the importance of alloantigen expression for the selective organ manifestation by examining spatiotemporal changes of cellular and molecular events after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). To accomplish this we established a novel multicolor light sheet fluorescence microscopy (LSFM) approach for deciphering immune processes in large tissue specimens on a single-cell level in 3 dimensions. We combined and optimized protocols for antibody penetration, tissue clearing, and triple-color illumination to create a method for analyzing intact mouse and human tissues. This approach allowed us to successfully quantify changes in expression patterns of mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) and T cell responses in Peyer’s patches following allo-HCT. In addition, we proofed that LSFM is suitable to map individual T cell subsets after HCT and detected rare cellular events. We employed this versatile technique to study the role of alloantigen expression for the selective organ manifestation after allo-HCT. Therefore, we used a T cell receptor (TCR) transgenic mouse model of GVHD that targets a single peptide antigen and thereby mimics a major histocompatibility complex (MHC)-matched single antigen mismatched (miHAg-mismatched) HCT. We transplanted TCR transgenic (OT-I) T cells into myeloablatively conditioned hosts that either express the peptide antigen ovalbumin ubiquitously (βa-Ova) or selectively in the pancreas (RIP-mOva), an organ that is normally not affected by acute GVHD. Of note, at day+6 after HCT we observed that OT-I T cell infiltration occurred in an alloantigen dependent manner. In βa-Ova recipients, where antigen was ubiquitously expressed, OT-I T cells infiltrated all organs and were not restricted to gastrointestinal tract, liver, and skin. In RIP-mOva recipients, where cognate antigen was only expressed in the pancreas, OT-I T cells selectively infiltrated this organ that is usually spared in acute GVHD. In conditioned RIP-mOva the transfer of 100 OT-I T cells sufficed to effectively infiltrate and destroy pancreatic islets resulting in 100% mortality. By employing intact tissue LSFM in RIP-mOva recipients, we identified very low numbers of initial islet infiltrating T cells on day+4 after HCT followed by a massive T cell migration to the pancreas within the following 24 hours. This suggested an effective mechanism of effector T cell recruitment to the tissue of alloantigen expression after initial antigen specific T cell encounter. In chimeras that either expressed the model antigen ovalbumin selectively in hematopoietic or in parenchymal cells only, transplanted OT-I T cells infiltrated target tissues irrespective of which compartment expressed the alloantigen. As IFN-γ could be detected in the serum of transplanted ovalbumin expressing recipients (βa-Ova, βa-Ova-chimeras and RIP-mOva) at day+6 after HCT, we hypothesized that this cytokine may be functionally involved in antigen specific OT-I T cell mediated pathology. In vitro activated OT-I T cells responded with the production of IFN-γ upon antigen re-encounter suggesting that IFN-γ might be relevant in the alloantigen dependent organ infiltration of antigen specific CD8+ T cell infiltration after HCT. Based on these data we propose that alloantigen expression plays an important role in organ specific T cell infiltration during acute GVHD and that initial alloreactive T cells recognizing the cognate antigen propagate a vicious cycle of enhanced T cell recruitment that subsequently culminates in the exacerbation of tissue restricted GVHD. N2 - In der akuten Graft-Versus-Host Disease (GVHD) infiltrieren allogene Spender T Zellen Haut, Leber und den Magen-Darm-Trakt des Empfängers und attackieren das Gewebe. Andere Organe sind dagegen interessanterweise nur selten betroffen. Die Mechanismen dieser selektiven Organinfliltration sind bisher weitestgehend unbekannt. In meiner Dissertationsarbeit untersuchte ich den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation während der GVHD. Um komplexe Immunprozesse die nach allogener Stammzelltransplantation auftreten, besser zu verstehen, entwickelten wir eine Lichtblattmikroskopietechnik (LSFM) die zelluläre und molekulare Veränderungen im intakten Gewebe detektieren kann. Wir etablierten eine neuartigen mehrfarben LSFM-Methodik, die es ermöglicht, Immunprozesse in großen Gewebsstücken von Maus und Mensch in Einzelzellauflösung dreidimensional darzustellen. Dazu kombinierten und optimierten wir Protokolle, um eine Penetration von Antikörpern tief in das Gewebe sowie die Aufklärung und die dreifache Beleuchtung des Gewebes zu ermöglichen. Diese Methode erlaubte uns die erfolgreiche Quantifizierung der Proteinexpression des Adressins mucosal vascular addressin cell adhesion molecule–1 (MAdCAM-1) als auch die Quantifizierung der T Zell Antwort im intakten Peyer’s Plaque nach allogener hämatopoetischer Transplantation (HCT). Weiterhin konnten wir die Methode zur Untersuchung der Migration unterschiedlicher T Zell-Subpopulationen nach HCT erfolgreich einsetzen und konnten einzelne, organinfiltrierende Zellen detektierten und quantifizieren. Wir benutzten die LSFM Methode um den Einfluss der Alloantigenexpression auf die selektive Organmanifestation zu studieren. Dazu verwendeten wir ein Transplantationsmodell, in dem der Haupthistokompatibilitätskomplex übereinstimmt (MHC-matched) und eine Diskrepanz nur in einem einzelnen Peptid Antigen (miHAG-mismatch) zwischen Spender und Empfänger bestand. Wir transplantierten T Zell Rezeptor (TCR) transgene (OT-I) T Zellen in myeloablativ bestrahlte Empfänger, die das Peptidantigen Ovalbumin entweder in allen Geweben (βa-Ova) oder selektiv in der Bauchspeicheldrüse (RIP-mOva) exprimieren. Die Bauchspeicheldrüse ist ein Organ, das normalerweise nicht von der akuten GVHD betroffen ist. An Tag 6 nach allogener HCT waren alle Organe die das Alloantigen exprimieren auch von Spender T Zellen infiltriert. In myeloablativ bestrahlten RIP-mOva Empfängern reichten bereits 100 transferierte OT-I T Zellen aus, um Alloantigen-exprimierende pankreatische Inselzellen zu zerstören. Dies führte zu einer Mortalität von 100% der Empfänger und spricht für eine sehr effiziente Alloantigendetektion und Gewebsinfiltration durch die Spender T Zellen. Um die Kinetik der Organinfiltration der Spender T Zellen detailliert zu untersuchen, verwendeten wir die neue Lichtblattmikroskopietechnik, welche die Analyse intakter Organe ermöglicht. In RIP-mOva Empfängern identifizierten wir erste wenige Spender T Zellen im Pankreas an Tag 4 nach Transplantation, gefolgt von einer massiven Pankreasinfiltration durch Spender T Zellen innerhalb von 24 Stunden. Dies deutet auf eine gezielte Rekrutierung der Spender T Zellen nach erstem Antigenkontakt in das Gewebe mit Alloantigenexpression. Um zu untersuchen, ob die Alloantigenexpression vom parenchymalen Gewebe oder aber durch hämatopoetische Zellen zur spezifischen Organinfiltration führt, transplantierten wir OT-I T Zellen in chimäre Empfänger, in denen das Alloantigen entweder nur im Gewebsparenchym oder ausschließlich von hämatopoetischen Zellen exprimiert wird. An Tag 6 nach der allogenen HCT fanden wir Spender T Zellen in allen Geweben, unabhängig davon welches Empfängerzellkompartment das Alloantigen präsentierte. Wir detektierten hohe IFN-γ-Werte im Serum von Ovalbumin exprimierenden Empfänger (βa-Ova, βa- Ova-Chimären und RIP-mOva). Weiterhin fanden wir, dass nach erneutem Kontakt mit dem spezifischen Alloantigen, OT-I T Zellen die in vitro aktiviert wurden, IFN-γ produzierten. Wir schließen aus diesen Beobachtungen, dass für die antigenabhängige Gewebeinfiltration IFN-γ wichtig ist. Zusammenfassend postulieren wir, dass die Alloantigenexpression im Gewebe eine wichtige Rolle in der organspezifischen Infiltration durch Spender T Zellen spielt, und dass T Zellen die Alloantigen spezifisch erkennen, dafür verantwortlich sind, dass weitere Effektor-T Zellen in das Gewebe rekrutiert werden. KW - Alloantigen KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Genexpression KW - Blutstammzelle KW - Graft versus Host Disease KW - Hematopoietic Cell Transplantation KW - Alloantigen Expression KW - Light Sheet Fluorescence Microscopy KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Hämatopoetische Stammzelltransplantation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85365 ER - TY - THES A1 - Weber, David T1 - Hey target gene regulation in embryonic stem cells and cardiomyocytes T1 - Regulation von Hey Zielgenen in embryonalen Stammzellen und Kardiomyozyten N2 - The Notch signaling pathway is crucial for mammalian heart development. It controls cell-fate decisions, coordinates patterning processes and regulates proliferation and differentiation. Critical Notch effectors are Hey bHLH transcription factors (TF) that are expressed in atrial (Hey1) and ventricular (Hey2) cardiomyocytes (CM) and in the developing endocardium (Hey1/2/L). The importance of Hey proteins for cardiac development is demonstrated by knockout (KO) mice, which suffer from lethal cardiac defects, such as ventricular septum defects (VSD), valve defects and cardiomyopathy. Despite this clear functional relevance, little is known about Hey downstream targets in the heart and the molecular mechanism by which they are regulated. Here, I use a cell culture system with inducible Hey1, Hey2 or HeyL expression to study Hey target gene regulation in HEK293 cells, in murine embryonic stem cells (ESC) and in ESC derived CM. In HEK293 cells, I could show that genome wide binding sites largely overlap between all three Hey proteins, but HeyL has many additional binding sites that are not bound by Hey1 or Hey2. Shared binding sites are located close to transcription start sites (TSS) where Hey proteins preferentially bind to canonical E boxes, although more loosely defined modes of binding exist. Additional sites only bound by HeyL are more scattered across the genome. The ability of HeyL to bind these sites depends on the C-terminal part of the protein. Although there are genes which are differently regulated by HeyL, it is unclear whether this regulation results from binding of additional sites by HeyL. Additionally, Hey target gene regulation was studied in ESC and differentiated CM, which are more relevant for the observed cardiac phenotypes. ESC derived CM contract in culture and are positive for typical cardiac markers by qRT PCR and staining. According to these markers differentiation is unaffected by prolonged Hey1 or Hey2 overexpression. Regulated genes are largely redundant between Hey1 and Hey2. These are mainly other TF involved in e.g. developmental processes, apoptosis, cell migration and cell cycle. Many target genes are cell type specifically regulated causing a shift in Hey repression of genes involved in cell migration in ESC to repression of genes involved in cell cycle in CM. The number of Hey binding sites is reduced in CM and HEK293 cells compared to ESC, most likely due to more regions of dense chromatin in differentiated cells. Binding sites are enriched at the proximal promoters of down-regulated genes, compared to up-or non-regulated genes. This indicates that up-regulation primarily results from indirect effects, while down-regulation is the direct results of Hey binding to target promoters. The extent of repression generally correlates with the amount of Hey binding and subsequent recruitment of histone deacetylases (Hdac) to target promoters resulting in histone H3 deacetylation. However, in CM the repressive effect of Hey binding on a subset of genes can be annulled, likely due to binding of cardiac specific activators like Srf, Nkx2-5 and Gata4. These factors seem not to interfere with Hey binding in CM, but they recruit histone acetylases such as p300 that may counteract Hey mediated histone H3 deacetylation. Such a scenario explains differential regulation of Hey target genes between ESC and CM resulting in gene and cell-type specific regulation. N2 - Der Notch Signalweg ist essenziell für die Herzentwicklung in Säugetieren. Er kontrolliert Zell-differenzierung, koordiniert Musterbildungsprozesse und reguliert Proliferation und Differenzierung. Kritische Notch Effektoren sind Hey bHLH Transkriptionsfaktoren, welche im Herzen in atrialen (Hey1) und ventrikulären (Hey2) Kardiomyozyten und dem sich entwickelnden Endokardium (Hey1/2/L) exprimiert werden. Die Bedeutung von Hey Proteinen während der Herzentwicklung wird an Hand von verschiedenen KO Mäusen ersichtlich, welche letale Herzdefekte, wie ventrikuläre Septumdefekte, Herzklappendefekte und Kardiomyopathien, entwickeln. Trotz dieser klaren funktionalen Relevanz ist wenig über Hey Zielgene im Herzen und den molekularen Mechanismus bekannt, über den diese reguliert werden. Hier wurde ein Zellkultursystem mit induzierbarer Expression von Hey1, Hey2 oder HeyL verwendet, um Hey Zielgene in HEK293, murinen embryonalen Stammzellen und in differenzierten Kardiomyozyten zu studieren. In HEK293 Zellen konnte ich zeigen, dass die Bindestellen im Genom weitestgehend zwischen allen drei Hey Proteinen überlappen, HeyL jedoch viele zusätzliche Bindestellen aufweist, welche weder von Hey1 noch Hey2 gebunden werden. Gemeinsame Bindestellen befinden sich nahe Transkriptionsstartstellen, präferentiell an kanonische E boxen. Die nur von HeyL gebunden Bindestellen sind mehr über das Genom verteilt. Dabei ist die Fähigkeit von HeyL diese Stellen zu binden vom C-terminalen Teil abhängig. Obwohl es Gene gibt, die unterschiedlich von HeyL reguliert werden, ist es auf Grund der sehr viel größeren Anzahl an HeyL Bindestellen unklar, ob diese Regulation das Resultat von zusätzlicher HeyL Bindung ist. Zusätzlich wurde die Regulation von Hey Zielgenen in embryonalen Stammzellen und differenzierten Kardiomyozyten untersucht, da diese Zellen für die beobachteten kardialen Phänotypen relevanter sind. Differenzierte Kardiomyozyten kontrahieren in Kultur und sind positiv für typische kardiale Marker an Hand von qRT-PCR und Färbungen. Nach diesen Markern ist die Differenzierung durch kontinuierliche Überexpression von Hey1 oder Hey2 unverändert. Die Hey1 und Hey2 regulierten Gene sind weitestgehend redundant. Viele Zielgene sind andere Transkriptionsfaktoren, die zum Beispiel an Entwicklungsprozessen, Apoptose, Zellmigration und dem Zellzyklus beteiligt sind. Diese werden oft Zelltyp spezifisch reguliert, was zur Folge hat, dass in embryonalen Stammzellen auch an der Zellmigration beteiligte Gene reprimiert werden, während es in Kardiomyozyten vor allem Gene sind, die den Zellzyklus betreffen. Die Zahl der Hey Bindestellen ist in Kardiomyozyten und HEK293 Zellen verglichen mit embryonalen Stammzellen reduziert, höchstwahrscheinlich da differenzierte Zellen weniger offenes Chromatin besitzen. Die Bindestellen sind in reprimierten Genen verglichen mit induzierten oder nicht regulierten Genen angereichert. Dies deutet an, dass eine Induktion meist durch indirekte Effekte zu Stande kommt, während eine Repression das direkte Ergebnis der Hey Bindung an Zielpromotoren ist. Die Stärke der Repression korreliert dabei generell mit der Menge an Promoter gebundenem Hey Protein, welches Histon-Deacetylasen rekrutiert und zu einer Reduktion der Histon H3 Acetylierung führt. In Kardiomoyzyten wird der repressive Effekt von Hey für bestimmte Gene unterbunden, wahrscheinlich durch Bindung herzspezifischer Aktivatoren, wie Srf, Nkx2 5 und Gata4. Diese Faktoren scheinen nicht die Bindung von Hey zu beeinflussen, aber sie rekrutieren Acetylasen wie p300, welche Hey vermittelter Histon H3 Deacetylierung entgegenwirken. Dieses Model erklärt die unterschiedliche Regulation von Hey Zielgenen zwischen embryonalen Stammzellen und Kardiomyozyten. KW - Transkriptionsfaktor KW - Gen notch KW - Gene regulation KW - Notch signalling KW - Hey proteins KW - Genregulation KW - Notch Signalweg KW - Hey Proteine Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101663 ER - TY - THES A1 - Anjana Vaman, Vamadevan Sujatha T1 - LASP1, a newly identified melanocytic protein with a possible role in melanin release, but not in melanoma progression T1 - LASP1, ein neu identifiziertes melanozytischen Protein mit einer möglichen Rolle bei der Freisetzung von Melanin, jedoch nicht in Melanomprogression N2 - LIM and SH3 protein 1 (LASP1) is a nucleocytoplasmic scaffolding protein. LASP1 interacts with various cytoskeletal proteins via its domain structure and is known to participate in physiological processes of cells. In the present study, a detailed investigation of the expression pattern of LASP1 protein in normal skin, melanocytic nevi and melanoma was carried out and the melanocyte–specific function of LASP1 was analyzed. LASP1 protein was identified in stratum basale of skin epidermis and a very high level was detected in nevi, the benign tumor of melanocyte. In the highly proliferative basal cells, an additional distinct nuclear localization of the protein was noted. In different tumor entities, an elevated LASP1 expression and nuclear localization, correlated positively with malignancy and tumor grade. However, LASP1 level was determined to be very low in melanoma and even reduced in metastases. Melanoma is distinguished as the first tumor tested to date – that displayed an absence of elevated LASP1 expression. In addition no significant relation was observed between LASP1 protein expression and clinicopathological parameters in melanoma. The epidermal melanin unit of skin comprises of melanocytes and keratinocytes. Melanocytes are specialized cells that synthesize the photo protective coloring pigment, melanin inside unique organelles called melanosomes. The presence of LASP1 in melanocytes is reported for the first time through this study and the existence was confirmed by immunoblotting analysis in cultured normal human epidermal melanocyte (NHEM) and in melanoma cell lines, along with the immunohistostaining imaging in normal skin and in melanocytic nevi. LASP1 depletion in MaMel2 cells revealed a moderate increase in the intracellular melanin level independently of de novo melanogenesis, pointing to a partial hindrance in melanin release. Immunofluorescence images of NHEM and MaMel2 cells visualized co-localization of LASP1 with dynamin and tyrosinase concomitant with melanosomes at the dendrite tips of the cells. Melanosome isolation experiments by sucrose density gradient centrifugation clearly demonstrated the presence of LASP1 and the melanosome specific markers tyrosinase and TRP1 in late stage melanosomes. The study identified LASP1 and dynamin as novel binding partners in melanocytes and provides first evidence for the existence of LASP1 and dynamin (a protein well–known for its involvement in vesicle formation and budding) in melanosomes. Co-localization of LASP1 and dynamin along the dendrites and at the tips of the melanocytes indicates a potential participation of the two proteins in the membrane vesicle fission at the plasma membrane. In summary, a possible involvement of LASP1 in the actin–dynamin mediated membrane fission and exocytosis of melanin laden melanosome vesicles into the extracellular matrix is suggested. N2 - LIM und SH3 protein 1 (LASP1) ist ein nukleozytoplasmatischen Gerüstprotein. LASP1 interagiert über seine Domänenstruktur mit verschiedenen Zytoskelettproteinen und ist an physiologischen Prozessen wie Migration und Zellproliferation beteiligt. In der vorliegenden Studie wurde eine detaillierte Untersuchung des Expressionsmusters von LASP1 in normale Haut, Nävi und Melanom durchgeführt und die Melanozyten-spezifische Funktion des Proteins analysiert. LASP1 konnte durch immunhistologische Färbungen im Stratum basale der Epidermis und in hoher Konzentration in Nävi (gutartige Tumore der Melanozyten) nachgewiesen werden, während die Expression in Melanom und Metastasen sehr gering ist. Auch wurde kein signifikanter Zusammenhang zwischen der LASP1 Proteinexpression in Melanomen und den klinisch-pathologischen Parametern bei 58 Patienten festgestellt. Dies steht im Gegensatz zu allen bisher getesteten Tumoren (u.a. Brust, HCC und Medulloblastom), bei der eine erhöhte LASP1 Expression in den Tumoren beobachtet wurde, die mit dem Tumorgrad korrelierte. Die hochproliferativen Basalzellen der Epidermis bestehen aus Keratinozyten und Melanozyten und weisen, im Gegensatz zu Nävi und Melanomzellen, eine deutliche Kernlokalisation des LASP1 Proteins auf. Melanozyten sind spezialisierte Zellen, die das UV-Schutzfarbpigment Melanin in einzigartigen Organellen, genannt Melanosomen, synthetisieren. Die Expression von LASP1 in diesen Melanozyten konnte zum ersten Mal in dieser Studie nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzaufnahmen und Western Blots mit kultivierten normalen menschlichen epidermalen Melanozyten (NHEM) und Melanom-Zelllinien bestätigen die LASP1 Expression. Funktionelle Experimente mit LASP1 depletierten Zellen zeigen eine erhöhte Melaninkonzentration, die unabhängig von der de novo Melanogenese ist. Immunfluoreszenaufnahmen visualisieren eine Ko-Lokalisation von LASP1 mit Tyrosinase an den Melanosomen in den Zellausläufern von pigmentierten MaMel2 Zellen. Eine Auftrennung der einzelnen Melanosomenstadien durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation erlauben die Detektion von LASP1 mit Dynamin, TRP1 und Tyrosinase in späten Stadium IV Melanosomen. Die vorliegende Studie liefert den ersten Beweis für die Existenz von Dynamin (einem für die Vesikelbildung essentiellem Protein) in Melanosomen und identifiziert Dynamin als neuartigen Bindungspartner von LASP1 in Melanozyten. Die Ko-Lokalisierung LASP1 und Dynamin entlang der Dendriten und in den Spitzen der Melanozyten weist auf eine mögliche Beteiligung beider Proteine an der Melanosomen-Vesikel-Abspaltung an der Plasmamembran hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass LASP1 an der Actin-Dynamin vermittelten Exocytose von Melanin-beladenen Melanosomvesikeln in die Extrazellulärmatrix beteiligt ist. KW - Melanom KW - Melanin KW - LASP1 KW - melanocytic nevi KW - melanoma cancer KW - Molekularbiologie KW - Melanin release Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116316 ER - TY - THES A1 - Ye, Yuxiang T1 - Molecular and Cellular Magnetic Resonance Imaging of Myocardial Infarct Healing T1 - Molekulare und zelluläre Magnetresonanztomographie der Wundheilung nach Myokardinfarkt N2 - Myokardinfarkte (MI) sind eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Eine rechtzeitige Wiederherstellung des koronaren Blutflusses im ischämischen Myokard reduziert signifikant die Sterblichkeitsrate akuter Infarkte und vermindert das ventrikuläre Remodeling. Überlebende MI-Patienten entwickeln jedoch häufig eine Herzinsuffizienz, die mit einer reduzierten Lebensqualität, hohen Sterblichkeitsrate (10% jährlich), sowie hohen Kosten für das Gesundheitssystem einhergeht. Die Entwicklung der Herzinsuffizienz nach einem MI ist auf den hohen Verlust kontraktiler Kardiomyozyten, während der Ischämie-Reperfusion zurückzuführen. Anschließende komplexe strukturelle und funktionelle Veränderungen resultieren aus Modifikationen des infarzierten und nicht infarzierten Myokards auf molekularer und zellulärer Ebene. Die verbesserte Überlebensrate von Patienten mit akutem MI und das Fehlen effizienter Therapien, die die Entwicklung und das Fortschreiten des ventrikulären Remodelings verhindern, führen zu einer hohen Prävalenz der Herzinsuffizienz. Die kardiale Magnetresonanztomographie (MRT) ist eine wichtige Methode zur Diagnose und Beurteilung des Myokardinfarktes. Mit dem technologischen Fortschritt wurden die Grenzen der MRT erweitert, so dass es heute möglich ist, auch molekulare und zelluläre Ereignisse in vivo und nicht-invasiv zu untersuchen. In Kombination mit kardialer Morphologie und Funktion könnte die Visualisierung essentieller molekularer und zellulärer Marker in vivo weitreichende Einblicke in den Heilungsprozess infarzierter Herzen liefern, was zu neuen Erkenntnissen für ein besseres Verständnis und bessere Therapien des akuten MI führen könnte. In dieser Arbeit wurden Methoden für die molekulare und zelluläre kardiale MRT-Bildgebung der Inflammation und des Kalziumstroms im Heilungsprozess des akuten Myokardinfarktes in vivo in einem Rattenmodel mit klinischer Relevanz etabliert. N2 - Myocardial infarction (MI) is a leading cause of death worldwide. Timely restoration of coronary blood flow to ischemic myocardium significantly reduces acute infarct mortality and attenuates ventricular remodeling. However, surviving MI patients frequently develop heart failure, which is associated with reduced quality of life, high mortality rate (10% annually), as well as high healthcare expenditures. The main processes involved in the evolution of heart failure post-MI are the great loss of contractile cardiomyocytes during ischemia-reperfusion and the subsequent complex structural and functional alterations, which are rooted in modifications at molecular and cellular levels in both the infarcted and non-infarcted myocardium. However, we still lack efficient treatments to prevent the development and progression of left ventricular remodeling. The improved survival rate of acute MI patients combined with the lack of effective therapy for post-MI remodeling contributes to the high prevalence of heart failure. Cardiac Magnetic Resonance Imaging (MRI) is an important tool for diagnosis and assessment of MI. With the advancement of this technology, the frontier of MRI has been extended to probing molecular and cellular events in vivo and non-invasively. In combination with assessment of morphology and function, the visualization of essential molecular and cellular markers in vivo could provide comprehensive, multifaceted views of the healing process in infarcted hearts, which might give new insight for the treatment of acute MI. In this thesis, molecular and cellular cardiac MRI methods were established to visualize and investigate inflammation and calcium flux in the healing process of acute MI in vivo, in a clinically relevant rat model. KW - Kernspintomografie KW - Herzinfarkt KW - magnetic resonance imaging KW - myocardial infarction KW - Wundheilung KW - NMR-Tomographie Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72514 ER - TY - THES A1 - Jordan Garrote, Ana-Laura T1 - The role of host dendritic cells during the effector phase of intestinal graft-versus-host disease T1 - Die Rolle der dendritischen Zellen in der akuten intestinalen Graft-versus-Host Reaktion N2 - Monocytes can be functionally divided in two subsets, both capable to differentiate into dendritic cells (DCs): CX3CR1loCCR2+ classical monocytes, actively recruited to the sites of inflammation and direct precursors of inflammatory DCs; and CX3CR1hiCCR2− non-classical monocytes, characterized by CX3CR1-dependent recruitment to non-inflamed tissues. Yet, the function of non-classical monocyte-derived DCs (nc-mo-DCs), and the factors, which trigger their recruitment and DC differentiation, have not been clearly defined to date. Here we show that in situ differentiated nc-moDCs mediate immunosuppression in the context of intestinal graft-versus-host disease (GVHD). Employing multi-color confocal microscopy we observed a dramatic loss of steady state host-type CD103+ DC subset immediately after transplantation, followed by an enrichment of immune-regulatory CD11b+ nc-moDCs. Parabiosis experiments revealed that tissue-resident non-classical CX3CR1+ monocytes differentiated in situ into intestinal CD11b+ nc-moDCs after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). Differentiation of this intestinal DC subset depended on CSF-1 but not on Flt3L, thus defining the precursors as monocytes and not pre-DCs. Importantly, CX3CR1 but not CCR2 was required for this DC subset differentiation, hence defining the precursors as non-classical monocytes. In addition, we identify PD-L1 expression by CX3CR1+ nc-moDCs as the major mechanism they employ to suppress alloreactive T cells during acute intestinal GVHD. All together, we demonstrate that host nc-moDCs surprisingly mediate immunosuppression in the context of murine intestinal GVHD – as opposed to classical “inflammatory” monocyte-derived dendritic cells (mo-DCs) – via coinhibitory signaling. This thorough study unravels for the first time a biological function of a - so far only in vitro and phenotypically described - DC subset. Our identification of this beneficial immunoregulatory DC subset points towards alternate future strategies in underpinning molecular pathways to foster their function. We describe an unexpected mechanism of nc-moDCs in allo-HCT and intestinal GVHD, which might also be important for autoimmune disorders or infections of the gastrointestinal tract. N2 - Monozyten (MO) lassen sich funktionell in zwei Subpopulationen unterteilen, die sich in dendritische Zellen (DC) differenzieren können: 1) Klassische Monozyten (CX3CR1loCCR2+), die direkte Vorläuferzellen von inflammatorischen DCs (mo-DCs) sind und aktiv an die Stelle der Entzündung rekrutiert werden und 2) nicht-klassische Monozyten (CX3CR1hiCCR2−). Bisher ist weder die Funktion der, aus nicht-klassischen Monozyten abstammenden, DC-Subpopulation (nc-mo-DCs) bekannt, noch ist geklärt, welche Faktoren die Ausdifferenzierung und die Rekrutierung der nc-mo-DCs in periphere Gewebe ermöglichen. In dieser Dissertationsarbeit zeige ich, dass nc-mo-DCs in situ differenzieren und in der akuten intestinalen Graft-versus-Host Erkrankung (GVHD) immunsuppressiv wirken. Konfokale Mikroskopie verdeutlichte den Rückgang der, im gesunden Gleichgewicht im intestinalen Gewebe dominierenden, CD103+ DCs direkt nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation (HCT) zugunsten immunregulatorischer CD11b+ nc-moDCs. Weiterhin zeigten Parabiose Experimente, dass nicht-klassische CX3CR1+ Monozyten im intestinalen Gewebe ansässig sind und sich nach allogener HCT in situ zu CD11b+ nc-moDCs ausdifferenzieren. Die Differenzierung findet in Abhängigkeit von CSF-1 und unabhängig von Flt3L statt, ein Beweis dafür, dass dieser Zelltyp aus Monozyten und nicht aus DC-Vorläuferzellen gebildet wird. Die Differenzierung dieser intestinalen DC Subpopulation hängt von CX3CR1, nicht jedoch von CCR2 ab, ein Beweis dafür, dass dieser Zelltyp aus nicht-klassischen Monozyten gebildet wird. Mechanistisch zeigen wir, dass nc-moDCs alloreaktive T-Zellen durch die Expression von PD-L1 supprimieren. Zusammenfassend beschreiben wir erstmalig nc-moDCs als neue DC Subpopluation, die im Mausmodell die intestinale GVHD unterdrückt und sich damit wesentlich von den bisher beschriebenen, klassischen proinflammatorischen mo-DCs unterscheidet. Die von den nc-moDCs vermittelte immunregulatorische Wirkung könnte weiterhin eine wichtige Rolle bei Autoimmunerkrankungen und Infektionen im Magen-Darm-Trakt spielen und sollte daher in zukünftigen Therapieansätzen berücksichtigt werden. KW - Knochenmarktransplantation KW - bone marrow transplantation KW - Immunologie KW - Dendritische Zellen KW - imunology KW - dendritic cells KW - Immunologie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102130 ER - TY - THES A1 - Karabeg, née Lee, Margherita Maria T1 - Differences and Similarities in the Impact of Different Types of Stress on Hippocampal Neuroplasticity in Serotonin Transporter Deficient Mice T1 - Unterschiede und Gemeinsamkeiten in den Auswirkungen verschiedener Arten von Stress auf die Neuroplastizität im Hippocampus von Mäusen mit fehlendem Serotonin Transporter N2 - Stress has been shown to influence neuroplasticity and is suspected to increase the risk for psychiatric disorders such as major depression and anxiety disorders. Additionally, the short variant of the human serotonin transporter (5-HTT) length polymorphism (5-HTTLPR) is suggested to increase the risk for the development of such disorders. While stress as well as serotonergic signaling are not only discussed to be involved in the development of psychiatric disorders, they are also known to influence hippocampal adult neurogenesis (aN). Therefore, it has long been suspected that aN is involved in the etiology of these illnesses. The exact role of aN in this context however, still remains to be clarified. In the present doctoral thesis, I am introducing two different studies, which had been carried out to assess possible changes in neuroplasticity and behavior as a result of 5-HTT genotype by stress interactions. In both studies, animals of the 5-HTT knock-out (5-HTT-/-) mouse line were used, which have been found to exhibit increased anxiety- and depression-related behavior, an altered stress response and decreased aggressive behavior. The aim of the first study, the so-called Spatial Learning study, had been to evaluate whether mice with altered levels of brain 5-HT as a consequence of lifelong 5-HTT deficiency perform differently in two spatial memory tests, the Morris Water Maze (WM) and the Barnes Maze (BM) test prospectively differing in aversiveness. Mice of the Spatial Learning study were of male sex and six months of age, and where subjected to a total of 10 (BM) or 15 (WM) trials. My particular interest was to elucidate if there are genotype by treatment interactions regarding blood plasma corticosterone levels and, if neurobiological equivalents in the brain to the found behavioral differences exist. For this purpose I carried out a quantitative immunohistochemistry study, investigating stem cell proliferation (via the marker Ki67) and aN (via the immature neuron marker NeuroD), as well as expression of the two immediate early genes (IEGs) Arc and cFos as a markers for neuronal activity in the hippocampus. The aim of the second study, the chronic mild stress (CMS) study had been to evaluate whether the innate divergent depression-like and anxiety-like behavior of mice with altered levels of brain 5-HT as a consequence of 5-HTT-deficiency is altered any further after being subjected to a CMS paradigm. Two cohorts of one-year-old female mice had been subjected to a variety of unpredictable stressors. In order to exclude possible interfering influences of behavioral testing on corticosterone levels and the outcome of the quantitative immunohistochemistry study the first cohort had been behaviorally tested after CMS while the second one had remained behaviorally untested. The objective of my part of the study was to find out about possible genotype by treatment interactions regarding blood plasma corticosterone as well as regarding aN in the hippocampus of the mice that had been subjected to CMS. For this purpose I performed a quantitative immunohistochemistry study in order to investigate the phenomenon of adult neurogenesis (via Ki67, NeuroD and the immature neuron marker DCX). Both studies led to interesting results. In the CMS study, we could not replicate the increased innate anxiety- and depression-like behavior in 5-HTT-/- mice known from the literature. However, with regard to the also well documented reduced locomotor activity, as well as the increased body weight of 5-HTT-/- mice compared to their 5-HTT+/- and 5-HTT+/+ littermates, we could demonstrate that CMS leads to increased explorative behavior in the Open Field Test and the Light/Dark Box primarily in 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ mice. The Spatial learning study revealed that increased stress sensitivity of 5-HTT-/- mice leads to a poorer performance in the WM test in relation to their 5-HTT+/+ and 5-HTT+/- littermates. As the performance of 5-HTT-/- mice in the less aversive BM was undistinguishable from both other genotypes, we concluded that the spatial learning ability of 5-HTT-/- mice is comparable to that of both other genotypes. As far as stress reactivity is concerned, the experience of a single trial of either the WM or the BM resulted in increased plasma corticosterone levels, irrespective of the 5-HTT genotype. After several trials 5-HTT-/- mice exhibited higher corticosterone concentrations compared with both other genotypes in both tests. Blood plasma corticosterone levels were highest in 5-HTT-/- mice tested in the WM indicating greater aversiveness of the WM and a greater stress sensitivity of 5-HTT deficient mice. In the CMS study, the corticosterone assessment of mice of cohort 1, which had undergone behavioral testing before sacrifice, resulted in significantly elevated corticosterone levels in 5-HTT-/- mice in relation to their 5-HTT+/+ controls. Contrary, corticosterone levels in mice of cohort 1, which had remained behaviorally untested, were shown to be elevated / increased after CMS experience regardless of the 5-HTT genotype. Regarding neuroplasticity, the Spatial Learning study revealed higher baseline levels of cFos- and Arc-ir cells as well as more proliferation (Ki67-ir cells) and higher numbers of neuronal progenitor cells (NeuroD-ir cells) in 5-HTT-/- compared to 5-HTT+/+ mice. Moreover, in 5-HTT-/- mice we could demonstrate that learning performance in the WM correlates with the extent of aN. The CMS study, in which aN (DCX-ir cells), has also been found to be increased in 5-HTT-/- mice compared to their 5-HTT+/+ littermates, yet only in control animals, did show hampered proliferation (Ki67-ir cells) in the hippocampus of all 5-HTT genotypes following CMS experience. Interestingly, the number of immature neurons (DCX-ir cells) was diminished exclusively in 5-HTT-/- mice in response to CMS. From the Spatial Learning study we concluded, that increased IEG expression and aN levels observed in the hippocampus of 5-HTT deficient mice can be the neurobiological correlate of emotion circuit dysfunction and heightened anxiety of these mice and that 5-HTT-/- animals per se display a “stressed” phenotype as a consequence of long-life 5-HTT deficiency. Due to the different age and sex of the mice in the two studies, they cannot be compared easily. However, although the results of the CMS study seem to contradict the results of the Spatial Learning study at the first glance, they do support the conclusion of the Spatial Learning study by demonstrating that although CMS does have an impact on 5-HTT-/- mice on the neurobiological level (e.g. manifesting in a decrease of DXC-ir cells following CMS) CMS experience cannot add onto their heightened inborn stress-level and is almost ineffective regarding further changes of the behavior of 5-HTT-deficient mice. I thus propose, that 5-HTT-/- mice as a result of lifelong altered 5-HT signaling display a stressed phenotype which resembles a state of lethargy and is paralleled by baseline heightened IEG expression and aN. It cannot be altered or increased by CMS, but it becomes most visible in stressful situations such as repeated spatial learning tests like the WM in which locomotor activity is required. N2 - Es ist bekannt, dass Stress die Neuroplastizität beeinflusst und es wird vermutet, dass dieser das Risiko erhöht eine psychische Erkrankung wie Depressionen oder Angststörungen zu entwickeln. Daneben wurde auch die kurze Variante des menschlichen Serotonintransporter (5-HTT)-Gens mit einem erhöhten Risiko für psychische Erkrankungen assoziiert. Stress und 5-HT werden jedoch nicht nur mit psychischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, sondern sie sind auch bekannt dafür, dass sie die hippocampale adulte Neurogenese (aN) beeinflussen. Nicht zuletzt deswegen wird seit langem vermutet, dass die aN an der Ätiologie dieser Erkrankungen beteiligt ist. Dabei ist jedoch noch unklar, welche Rolle die aN hierbei spielt. In der vorliegenden Doktorarbeit stelle ich zwei verschiedene Studien vor, die durchgeführt wurden um mögliche Veränderungen in der Neuroplastizität und dem Verhalten aufgrund von Interaktionen zwischen dem 5-HTT Genotyp und Stress zu erforschen. In beiden Studien wurden Tiere der 5-HTT knock-out (5-HTT-/-) Mauslinie verwendet, die bekannt dafür sind, erhöhtes depressions- und angstähnliches Verhalten, sowie eine veränderte Stressantwort und verringertes aggressives Verhalten zu zeigen. Das Ziel der ersten Studie, der sogenannten Spatial Learning-Studie, war es herauszufinden ob Mäuse, die aufgrund des lebenslangen Fehlens des 5-HTT einen veränderten 5-HT-Spiegel besitzen, im Morris Water Maze (WM) und dem Barnes Maze (BM), zwei Verhaltenstests, die das räumliche Gedächtnis überprüfen und sich potenziell in ihrer Aversivität unterscheiden, ein verändertes Verhalten zeigen. Die Mäuse der Spatial Learing-Studie waren männlich, sechs Monate alt und waren im Ganzen zehnmal dem BM und fünfzehnmal dem WM unterzogen worden. Mein spezielles Interesse galt der Untersuchung ob es Interaktionen zwischen Genotyp und Testbedingung gibt, die sich auf den Kortikosteron-Spiegel sowie auf neurobiologischer Ebene auswirken. Zu diesem Zweck führte ich eine quantitative immunhistologische Studie durch. In dieser untersuchte ich die hippocampale aN auf Ebene der Stammzellproliferation (über den Marker Ki67) und auf Ebene von jungen unreifen Neuronen (über neuronalen Vorläuferzell-Marker NeuroD) sowie die Expression der beiden Immediate Early Genes (IEGs) Arc und cFos, als Marker für neuronale Aktivität im Hippocampus. Das Ziel der zweiten Studie, in der Mäuse unterschiedlichen 5-HTT-Genotyps chronisch mildem Stress (chronic mild stress, CMS) ausgesetzt wurden, war es herauszufinden, ob das angeborene, verstärkte depressions- und angstähnliche Verhalten von 5-HTT-defizienten Mäusen noch weiter durch den CMS moduliert wird. Hierfür wurden zwei Kohorten von einjährigen weiblichen Mäusen unterschiedlichen 5-HTT-Genotyps einer Auswahl an unvorhersehbaren Stressoren ausgesetzt. Die Mäuse der ersten Kohorte wurden nach dem CMS noch verschiedenen Verhaltenstests unterzogen, während die Mäuse der zweiten Kohorte nicht auf ihr Verhalten hin getestet wurden. Meine Aufgabe in dieser Studie zielte darauf, mögliche Interaktionseffekte zwischen dem 5-HTT-Genotyp und der Behandlung mit CMS in Bezug auf den Kortikosteron-Spiegel im Blutplasma sowie auf die aN im Hippocampus zu finden. Die aN wurde mithilfe der quantitativen Immunhistochemie und verschiedenen Markern einzelner aN-Stadien wie z.B. Ki67, NeuroD sowie DCX untersucht. Beide Studien führten zu interessanten Ergebnissen. Das aus der Literatur bekannte verstärkte depressions- und angstähnliche Verhalten der 5-HTT-/- Mäuse konnte im Rahmen unserer CMS-Studie nicht repliziert werden. Jedoch gelang uns bezüglich der bereits von mehreren Studien ebenfalls dokumentierten reduzierten lokomotiorischen Aktivität, als auch dem erhöhten Gewicht der 5-HTT-/-- im Vergleich zu den 5-HTT+/+-Mäusen der Nachweis, dass CMS vor allem in 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen zu vermehrtem explorativem Verhalten im Open Field Test und in der Light/Dark Box führt. Die Spatial Learning-Studie zeigte, dass 5-HTT-/- Mäuse im Vergleich zu 5-HTT+/+ Mäusen im der WM-Tests, aber nicht der BM-Tests, eine schlechter Leistung an den Tag legten, dass aber alle Mäuse unabhängig vom 5-HTT-Gentoyps gut räumlich lernen konnten. Im Hinblick auf die Stressantwort konnte gezeigt werden, dass ein einzelner Durchgang im WM oder BM zu einem vom 5-HTT-Genotyp unabhängigen Kortikosteronanstieg im Blutplasma führte. Mehrere Durchgänge resultierten jedoch in beiden Tests in Genotyp-abhängigen Unterschieden der Kortikosteronskonzentrationen. Diese waren 5-HTT-/- Mäusen im Vergleich zu 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen erhöht. Hierbei zeigten 5-HTT-/- Mäuse nach mehrfacher WM-Erfahrung, noch tendenziell höhere Kortikosteronkonzentrationen im Blutplasma als die Mäuse nach mehrfacher BM-Erfahrung, was auf eine höhere Aversivität des WM sowie eine höhere Stresssensitivität der 5-HTT-/- Mäuse hindeutet. In der CMS-Studie resultierte die Untersuchung von Mäusen der Kohorte 1, die vor ihrem Tod noch Verhaltenstests unterzogen worden waren, unabhängig von ihrer CMS-Erfahrung in signifikant erhöhten Kortikosteronkonzentrationen in 5-HTT-/- im Vergleich zu 5-HTT+/- und 5-HTT+/+ Mäusen. Im Gegensatz dazu waren die Kortikosteron-Werte der Kohorte 2, unabhängig vom Genotyp, in den CMS-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen siginikant erhöht. Die Untersuchung neuroplastischer Phänomene ergab im Rahmen der Spatial Learning-Studie in 5-HTT-/-, verglichen mit 5-HTT+/+-Mäusen, eine erhöhte Anzahl cFos- und Arc-immunreaktiven (ir) Zellen, eine erhöhte Anzahl neuronaler Vorläuferzellen (NeuroD-ir Zellen) sowie mehr proliferierende Zellen (Ki67-ir Zellen). Darüberhinaus konnte in 5-HTT-/- Mäusen gezeigt werden, dass die Leistung im WM-Test mit der Anzahl neu gebildeter junger Neurone korreliert, was für die funktionelle Relevanz der aN spricht. Auch in der CMS Studie, war die aN (DCX-ir Zellen) in 5-HTT-/- gegenüber 5-HTT+/+ Mäusen erhöht, wenn auch nur in Kontrolltieren. Außerdem konnte mit der CMS Studie gezeigt werden dass Stress, sowohl unabhängig vom Genotyp als auch in Interaktion mit dem 5-HTT-/- Genotyp, die Proliferation, sowie die Anzahl unreifer Neurone verringert. Aus den Ergebnissen der Spatial Learning-Studie folgerten wir, dass die Expression von IEGs und das Ausmaß der aN im Hippocampus von 5-HTT-defizienten Mäusen das neurobiologische Korrelat von erhöhter Ängstlichkeit sein könnte, da 5-HTT-/- Mäuse aufgrund des ihnen lebenslang fehlenden 5-HTT von sich aus einen gestressten Phänotyp mitbringen. Aufgrund des unterschiedlichen Alters und Geschlechts der Mäuse dieser beiden Studien ist es nicht leicht die Ergebnisse dieser beiden Studien zu vergleichen. Dennoch unterstützen sie die Schlussfolgerung der Spatial Learning-Studie, selbst wenn die Ergebnisse der CMS Studie denen der Spatial Learning-Studie auf den ersten Blick zu widersprechen scheinen. Und zwar zeigen die Ergebnisse, dass CMS, obwohl er sich neurobiologisch, in Form einer Verringerung von DCX-ir Zellen, auf 5-HTT-/- Mäuse auswirkt, nichts in punkto des angeborenen erhöhten Stress-Levels ausrichten kann und beinahe wirkungslos ist im Hinblick auf das Verhalten der 5-HTT-/- Mäuse. Aus alledem folgere ich, dass 5-HTT-defiziente Mäuse aufgrund ihrer lebenslang veränderten 5-HT-Homöostase einen gestressten Phänotyp aufweisen, welcher sich u.a. durch eine verstärkte Lethargie bemerkbar macht, parallel dazu zeichnen sich die 5-HTT-defizienten Mäuse durch eine verstärkte Expression von IEGs sowie durch erhöhte aN aus. Die genannte verstärkte Lethargie kann durch CMS nicht verändert oder verstärkt werden sondern wird in Situationen mit erhöhtem Stress, z. B. in Verhaltenstests wie dem WM, welche körperliche Aktivität voraussetzen, besonders leicht erkennbar. KW - Serotonin KW - Neuronale Plastizität KW - Maus KW - Stress KW - Serotonin Transporter KW - Chronic Mild Stres KW - Morris Water Maze KW - Neuroplasticity KW - Learning Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115831 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Sebastian T1 - Studies on the function and regulation of CD84, GPVI and Orai2 in genetically modified mice T1 - Untersuchungen zur Funktion und Regulation von CD84, GPVI und Orai2 in genetisch veränderten Mäusen N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury are essential processes to limit blood loss but they also contribute to arterial thrombosis, which can lead to myocardial infarction and stroke. Stable thrombus formation requires a series of events involving platelet receptors which contribute to adhesion, activation and aggregation of platelets. Regulation of receptor expression by (metallo-)proteinases has been described for several platelet receptors, but the molecular mechanisms are ill-defined. The signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) family member CD84 is expressed in immune cells and platelets, however its role in platelet physiology was unclear. In this thesis, CD84 deficient mice were generated and analyzed. In well established in vitro and in vivo assays testing platelet function and thrombus formation, CD84 deficient mice displayed phenotypes indistinguishable from wild-type controls. It was concluded that CD84 in platelets does not function as modulator of thrombus formation, but rather has other functions. In line with this, in the second part of this thesis, a novel regulation mechanism for platelet CD84 was discovered and elucidated. Upon platelet activation, the N-terminus of CD84 was found to be cleaved exclusively by the a disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10), whereas the intracellular part was cleaved by calpain. In addition, regulation of the platelet activating collagen receptor glycoprotein VI (GPVI) was studied and it was shown that GPVI is in contrast to CD84 differentially regulated by ADAM10 and ADAM17. A novel role of CD84 under pathophysiological conditions was revealed as CD84 deficient mice were protected from ischemic stroke in the model of transient middle cerebral artery occlusion and this protection was based on the lack of CD84 in T cells. Ca2+ is an essential second messenger that facilitates activation of platelets and diverse functions in different eukaryotic cell types. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) represents the major mechanism leading to rise in intracellular Ca2+ concentration in non-excitable cells. The Ca2+ sensor STIM1 (stromal interaction molecule 1) and the SOC channel subunit protein Orai1 are established mediators of SOCE in platelets. STIM2 is the major STIM isoform in neurons, but the role of the SOC channel subunit protein Orai2 in platelets and neurons has remained elusive. In the third part of this thesis, Orai2 deficient mice were generated and analyzed. Orai2 was dispensable for platelet function, however, Orai2 deficient mice were protected from ischemic neurodegeneration and this phenotype was attributed to defective SOCE in neurons. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Blutplättchen sind wichtige Prozesse um Blutverlust nach Gefäßverletzungen zu vermeiden. Diese Prozesse spielen aber auch eine Rolle in der arteriellen Thrombose, die zu Herzinfarkt und Schlaganfall führen kann. Die Bildung stabiler Thromben setzt eine Reihe von Vorgängen voraus, an denen Blutplättchenrezeptoren beteiligt sind, welche zur Adhäsion, Aktivierung und Aggregation der Blutplättchen beitragen. Für einige Blutplättchenrezeptoren wurde eine Regulation der Expression durch (Metallo )Proteinasen beschrieben, jedoch sind die molekularen Mechanismen weitgehend unbekannt. CD84, ein Protein das zur signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) Familie gehört, wird sowohl in Immunzellen als auch in Blutplättchen exprimiert. Jedoch war die Rolle von CD84 in der Physiologie der Blutplättchen unklar. In der vorliegenden Arbeit wurden CD84 defiziente Mäuse generiert und analysiert. In etablierten in vitro und in vivo Test, welche die Blutplättchenfunktion und Thrombusbildung untersuchen, war der Phänotyp von CD84 defizienten Mäusen unverändert gegenüber Wildtyp-Kontrollen. Es wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass CD84 in Blutplättchen nicht als Modulator der Thrombusbildung fungiert, sondern eher andere Funktionen hat. Im Einklang damit wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ein neuer Regulationsmechanismus entdeckt und aufgeklärt. Infolge von Blutplättchenaktivierung wurde der N-terminale Teil von CD84 ausschließlich von a disintegrin and metalloproteinase 10 (ADAM10) geschnitten, während der intrazelluläre Anteil durch Calpain prozessiert wurde. Weiterhin wurde die Regulation des Blutplättchen-aktivierenden Kollagenrezeptors Glykoprotein VI (GPVI) untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass GPVI, im Gegensatz zu CD84, einer differenziellen Regulation durch ADAM10 und ADAM17 unterliegt. Unter pathophysiologischen Bedingungen wurde eine neue Rolle von CD84 aufgedeckt, da CD84 defiziente Mäuse vor ischämischem Schlaganfall im transient middle cerebral artery occlusion Modell geschützt waren. Dieser Schutz beruhte auf dem Fehlen von CD84 auf T Zellen. Ca2+ ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff, der die Aktivierung von Blutplättchen ermöglicht sowie diverse Funktionen in verschiedenen eukaryotischen Zellen erfüllt. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) stellt den Hauptmechanismus dar, der zum Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration in nicht-erregbaren Zellen führt. Der Ca2+ Sensor STIM1 (stromal interaction molecule 1) und das SOC-Kanal Protein Orai1 sind als Vermittler des SOCE in Blutplättchen bekannt. STIM2 stellt die Hauptisoform der STIM Moleküle in Neuronen dar, jedoch war die Rolle des SOC-Kanal Proteins Orai2 in Blutplättchen und Neuronen weitgehend unbekannt. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Orai2 defiziente Mäuse generiert und analysiert. Orai2 war nicht essentiell für die Funktion von Blutplättchen, jedoch waren Orai2 defiziente Mäuse vor ischämischer Neurodegeneration geschützt. Dieser Phänotyp wurde auf einen defekten SOCE in Neuronen zurückgeführt. KW - Thrombozyt KW - Maus KW - Genexpression KW - Metalloproteinasen KW - platelets KW - CD84 KW - Metalloproteinase KW - GPVI Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87949 ER - TY - THES A1 - Patil, Sandeep S. T1 - Oncolytic virotherapy and modulation of tumor microenvironment with vaccinia virus strains T1 - Onkolytische Virotherapie und Modulation des Tumormilieus mittels verschiedener Vaccinia Virus Typen N2 - Oncolytic viral therapies have shown great promise pre-clinically and in human clinical trials for the treatment of various cancers. Oncolytic viruses selectively infect and replicate in cancer cells, destroying tumor tissue via cell lysis, while leaving noncancerous tissues unharmed. Vaccinia virus (VACV) is arguably one of the safest viruses, which has been intensively studied in molecular biology and pathogenesis as a vaccine for the eradication of smallpox in more than 200 million people. It has fast and efficient replication, and cytoplasmic replication of the virus lessens the chance of recombination or integration of viral DNA into the genome of host cells. Anti-tumor therapeutic efficacy of VACV has been demonstrated for human cancers in xenograft models with a variety of tumor types. In addition recombinant oncolytic VACVs carrying imaging genes represent an advance in treatment strategy that combines tumor-specific therapeutics as well as diagnostics. As for other targeted therapies, a number of challenges remain for the clinical translation of oncolytic virotherapy. These challenges include the potential safety risk of replication of oncolytic virus in non-tumor tissue, the relatively poor virus spread throughout solid tumor tissue and the disadvantageous ratio between anti-viral and anti-tumoral immunity. However, manipulation of components of the tumor microenvironment may help oncolytic virus infection in killing the tumor tissue and thereby increasing the anti-tumor efficacy. Furthermore, dogs with natural cancer are considered as one of the best animal models to develop new drugs for cancer therapy. Traditionally, rodent cancer models have been used for development of cancer therapeutics. However, they do not adequately represent several features that define cancer in humans, including biology of initiation of tumor, the complexity of cancer recurrence and metastasis and outcomes to novel therapies. However, the tumor microenvironment, histopathology, molecular and genomics data from dog tumors has significant similarities with corresponding human tumors. These advantages of pet dog cancers provide a unique opportunity to integrate canine cancer patients in the studies designed for the development of new cancer drugs targeted against both human and canine cancers. This dissertation centers on the use of VACV strains in canine cancer xenografts with the aim of understanding the effects of modulation of tumor microenvironment on VACV-mediated tumor therapy. In the first studies, wild-type VACV strain LIVP6.1.1 was tested for its oncolytic efficiency in canine soft tissue sarcoma (STSA-1) and canine prostate carcinoma (DT08/40) cells in culture and xenografts models. LIVP6.1.1 infected, replicated within, and killed both STSA-1 and DT08/40 cells in cell culture. The replication of virus was more efficient in STSA-1 cells compared to DT08/40 cells. In xenograft mouse models, LIVP6.1.1 was safe and effective in regressing both STSA-1 and DT08/40 xenografts. However, tumor regression was faster in STSA-1 xenografts compared to DT08/40 xenografts presumably due to more efficient replication of virus in STSA-1 cells. Biodistribution profiles revealed persistence of virus in tumors 5 and 7 weeks post virus injection in STSA-1 and DT08/40 xenografts, respectively, with the virus mainly cleared from all other major organs. Immunofluorescence staining detected successful colonization of VACV in the tumor. Consequently, LIVP6.1.1 colonization in the tumor showed infiltration of innate immune cells mainly granulocytes and macrophages in STSA-1 tumor xenografts. These findings suggest that virotherapy-mediated anti-tumor mechanism in xenografts could be a combination of direct viral oncolysis of tumor cells and virus-dependent infiltration of tumor-associated host immune cells. In further studies, the effects of modulation of tumor angiogenesis of VACV therapy were analyzed in canine cancer xenografts. GLV-1h109 VACV strain (derived from prototype virus GLV-1h68) encoding the anti-VEGF single chain antibody GLAF-1 was characterized for its oncolytic efficacy in STSA-1 and DT08/40 cancer cells in culture and tumor xenografts. Concomitantly, the effects of locally expressed GLAF- 1 in tumors on virus replication, host immune infiltration, tumor vascularization and tumor growth were also evaluated. GLV-1h109 was shown to be similar to the parental virus GLV-1h68 in expression of the two marker genes that both virus strains have in common (Ruc-GFP and gusA) in cell cultures. Additionally, the anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 was expressed by GLV-1h109 in both cell cultures and tumor xenografts. The insertion of GLAF-1 did not significantly affect the replication and cytotoxicity of GLV-1h109 in the STSA-1 and DT08/40 cell lines, although at early time points (24-48 hpi), the replication of GLV-1h109 was higher in STSA-1 cells compared to DT08/40 cells. In addition, STSA-1 cells were more susceptible to lysis with GLV-1h109 than DT08/40 cells. GLV-1h109 achieved a significant inhibition of tumor growth in both STSA-1 and DT08/40 canine xenografts models. Consequently, the significant regression of tumor growth was initiated earlier in STSA-1 tumor xenografts compared to regression in DT08/40 xenografts. The reason for the higher efficacy of GLV-1h109 in STSA-1 xenografts than DT08/40 xenografts was attributed to more efficient replication of virus in STSA-1 cells. In addition, tumor-specific virus infection led to a continued presence of GLAF-1 in peripheral blood, which could be useful as a pharmacokinetic marker to monitor virus colonization and persistence in GLV-1h109- injected xenograft mice. GLAF-1 is a single-chain antibody targeting human and murine VEGF. It was demonstrated that GLAF-1 was functional and recognized both canine and human VEGF with equal efficiency. Histological analysis of tumor sections 7 days after GLV-1h109 injection confirmed that colonization of VACV and intratumoral expression of GLAF-1 translated into a significant decrease in blood vessel number compared to GLV-1h68 or PBS-treated control tumors. Subsequently, reduction in blood vessel density significantly improved the spread and replication of VACV as observed by FACS analysis and standard plaque assay, respectively. Inhibition of tumor angiogenesis and increased replication of virus further improved the infiltration of innate immune cells mainly granulocytes and macrophages in STSA-1 tumor xenografts. Both the results, i.e. improved virus spread and increased infiltration of innate immune cells in tumor, were explained by a phenomenon called “vascular normalization”, where anti-VEGF therapy normalizes the heterogeneous tumor vasculature thereby improving delivery and spread of VACV. In summary, the effects of inhibition of tumor angiogenesis on virus spread and replication were demonstrated using a vaccinia virus caring an anti- angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF) in canine cancer xenografts. In the final studies, the effects of VACV therapy on modulation of the immune system were analyzed in canine cancer patients enrolled in a phase I clinical trial. V-VET1 (clinical grade LIVP6.1.1 VACV) injection significantly increased the percentages of CD3+CD8+ T lymphocytes at 21 days after initiation of treatment. CD3+CD8+ T lymphocytes are mainly cytotoxic T lymphocytes that have potential to lyse cancer cells. Subsequently, the frequency of immune suppressor cells, mainly MDSCs and Treg was also analyzed in peripheral blood of canine cancer patients. Increase in the MDSC population and decreased CD8/Treg ratio is known to have inhibitory effects on the functions of cytotoxic T cells. We demonstrated that injection of V-VET1 in canine cancer patients significantly reduced the percentages of MDSCs at 21 days post initiation of treatment. Additionally, CD8/Treg ratio was increased 21 days after initiation of V-VET1 treatment. We also showed that changes in the frequency of immune cells neither depends on dose of virus nor depends on tumor type according to the data observed from this clinical trial with eleven analyzed patients. This preclinical and clinical data have important clinical implications of how VACV therapy can be used for the treatment of canine cancers. Moreover, dogs with natural cancers can be used as an ideal animal model to improve the oncolytic virotherapy for human cancers. Furthermore, modulation of tumor microenvironment mainly tumor angiogenesis and tumor immunity has significant impact on the success of oncolytic virotherapy. N2 - Therapien für verschiedenste Krebsarten mittels onkolytischer Viren zeigten sowohl in präklinischen- als auch in humanen klinischen Studien ein erfolgversprechendes Potenzial. Onkolytische Viren infizieren selektiv Krebszellen und replizieren ausschließlich in diesen. In der Folge zerstören sie Tumorgewebe durch Zelllyse, während gesundes Gewebe unbeeinträchtigt bleibt. Das Vaccinia-Virus besitzt ein äußerst geringes Risikopotential, und wurde intensiv auf molekularbiologischer Ebene und in Bezug auf seine Pathogenese untersucht. All das qualifizierte es als Vakzin zur Ausrottung der Pocken und seit Markteinführung mehr als 200 Millionen Menschen injiziert. Das Vaccinia-Virus zeigt eine schnelle und effiziente Replikation, welche im Zytoplasma der Zelle stattfindet. Dies verringert die Möglichkeit der Rekombination oder Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom. Die therapeutische Wirksamkeit onkolytischer Vaccinia-Viren (VACVs) wurde in humanen Xenograft-Mausmodellen mit unterschiedlichen Tumorarten gezeigt. Rekombinante onkolytische VACVs, welche mit fluoreszierenden Genen ausgestattet sind, kombinieren die Vorteile tumorspezifischer Therapeutika und dienen gleichzeitig als Diagnostika. Wie auch andere spezifische Therapien, steht auch die onkolytische Virustherapie vor einer Reihe von Herausforderungen. Dazu gehören die Replikation onkolytischer Viren in nicht-kanzerogenem Gewebe, relativ schlechte Virusverbreitung durch solides Tumorgewebe und ein unvorteilhaftes Verhältnis zwischen antiviraler und antitumoraler Immunität. Die gezielte Manipulation einzelner Komponenten des Tumormikromilieus kann jedoch zu einer verbesserten Virusinfektion und Lyse des Tumorgewebes führen und somit die Effizienz der antitumoralen Therapie verstärken. ... KW - Onkolyse KW - Vaccinia-Virus KW - Tumor microenvironment KW - Oncolytic Virotherapy Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99514 ER - TY - THES A1 - Kern, Selina Melanie T1 - Functional characterization of splicing-associated kinases in the blood stages of the malaria parasite Plasmodium falciparum T1 - Funktionelle Charakterisierung von Splicing-assoziierten Kinasen in den Blutstadien des Malariaerregers Plasmodium falciparum N2 - Besides HIV and tuberculosis, malaria still is one of the most devastating infectious diseases especially in developing countries, with Plasmodium falciparum being responsible for the frequently lethal form of malaria tropica. It is a major cause of mortality as well as morbidity, whereby pregnant women and children under the age of five years are most severely affected. Rapidly emerging drug resistances and the lack of an effective and safe vaccine hamper the combat against malaria by chemical and pharmacological regimens, and moreover the poor socio-economic and healthcare conditions in malaria-endemic countries are compromising the extermination of this deadly tropical disease to a large extent. Malaria research is still questing for druggable targets in the parasitic protozoan which pledge to be refractory against evolving resistance-mediating mutations and yet constitute affordable and compliant antimalarial chemotherapeutics. The parasite kinome consists of members that represent most eukaryotic protein kinase groups, but also contains several groups that can not be assigned to conservative ePK groups. Moreover, given the remarkable divergence of plasmodial kinases in respect to the human host kinome and the fact that several plasmodial kinases have been identified that are essential for the intraerythrocytic developmental cycle, these parasite enzymes represent auspicious targets for antimalarial regimens. Despite elaborate investigations on several other ePK groups, merely scant research has been conducted regarding the four identified members of the cyclin-dependent kinase-like kinase (CLK) family, PfCLK-1-4. In other eukaryotes, CLKs are involved in mRNA processing and splicing by means of phosphorylation of serine/arginine-rich (SR) proteins, which are crucial components of the splicing machinery in the alternative splicing pathway. All four PfCLKs are abundantly expressed in asexual parasites and gametocytes, and stage-specific expression profiles of PfCLK-1 and PfCLK-2 exhibited nucleus-associated localization and an association with phosphorylation activity. In the course of this study, PfCLK-3 and PfCLK-4 were functionally characterized by indirect immunofluorescence, Western blot analysis and kinase activity assays. These data confirm that the two kinases are primarily expressed in the nucleus of trophozoites and both kinases possess in vitro phosphorylation activity on physiological substrates. Likewise PfCLK-1 and PfCLK-2, reverse genetic studies exhibited the indispensability of both PfCLKs on the asexual life cycle of P. falciparum, rendering them as potential candidates for antiplasmodial strategies. Moreover, this study was conducted to identify putative SR proteins as substrates of all four PfCLKs. Previous alignments revealed a significant homology of the parasite CLKs to yeast SR protein kinase Sky1p. Kinase activity assays showed in vitro phosphorylation of the yeast Sky1p substrate and SR protein Npl3p by precipitated PfCLKs. In addition, four homologous plasmodial SR proteins were identified that are phosphorylated by PfCLKs in vitro: PfASF-1, PFSRSF12, PfSFRS4 and PfSR-1. All four parasite SR splicing factors are predominantly expressed in the nuclei of trophozoites. For PfCLK-1, a co-localization with the SR proteins was verified. Finally, a library of human and microbial CLK inhibitors and the antiseptic chlorhexidine (CHX) was screened to determine their inhibitory effect on different parasite life cycle stages and on the PfCLKs specifically. Five inhibitors out of 63 compounds from the investigated library were selected that show a moderate inhibition on asexual life cycle stages with IC50 values ranging between approximately 4 and 8 µM. Noteworthy, these inhibitors belong to the substance classes of aminopyrimidines or oxo-β-carbolines. Actually, the antibiotic compound CHX demonstrated an IC50 in the low nanomolar range. Stage-of-inhibition assays revealed that CHX severely affects the formation of schizonts. All of the selected CLKs inhibitors also affect gametocytogenesis as well as gametogenesis, as scrutinized in gametocyte toxicity assays and exflagellation assays, respectively. Kinase activity assays confirm a specific inhibition of CLK-mediated phosphorylation of all four kinases, when the CLK inhibitors are applied on immunoprecipitated PfCLKs. These findings on PfCLK-inhibiting compounds are initial attempts to determine putative antimalarial compounds targeting the PfCLKs. Moreover, these results provide an effective means to generate chemical kinase KOs in order to phenotypically study the role of the PfCLKs especially in splicing events and mRNA metabolism. This approach of functionally characterizing the CLKs in P. falciparum is of particular interest since the malarial spliceosome is still poorly understood and will gain further insight into the parasite splicing machinery. N2 - Neben HIV und Tuberkulose stellt Malaria vor allem in Entwicklungsländern immer noch eine der verheerendsten Infektionskrankheiten dar, wobei Plasmodium falciparum für die oft tödlich verlaufende Form der Malaria tropica verantwortlich ist. Sie ist eine der Hauptgründe für Mortalität und Morbitität, von der vor allem schwangere Frauen und Kinder unter fünf Jahren am schlimmsten betroffen sind. Das Fehlen eines effektiven und ungefährlichen Impfstoffes und sich schnell ausbreitende Medikamentenresistenzen erschweren die Bekämpfung von Malaria mit Arzneimitteln. Darüber hinaus beeinträchtigen die schlechten sozioökonomischen Bedingungen und der mangelhafte Zustand des Gesundheitssystems in Malaria-endemischen Ländern die Elimination dieser tödlichen Tropenkrankheit in hohem Maße. Die Malariaforschung ist immer noch auf der Suche nach vielversprechenden Angriffspunkten im Parasiten, die widerstandsfähig gegenüber sich entwickelnden resistenz-vermittelnden Mutationen sind und dennoch erschwingliche und verträgliche Chemotherapeutika gegen Malaria darstellen. Das Kinom des Parasiten besteht aus Vertretern der meisten eukaryotischen Proteinkinase-Gruppen und enthält zudem einige Gruppen, die keiner der konventionellen Gruppen zuordenbar sind. Darüber hinaus stellen Kinasen vielversprechende Angriffspunkte für Malariamedikamente dar, da das Parasitenkinom bemerkenswerte Divergenzen gegenüber dem Wirtskinom aufweist und zudem einige Parasitenkinasen identifiziert wurden, die unerlässlich für den Replikationszyklus von asexuellen Parasiten sind. Trotz umfangreicher Untersuchungen anderer Kinasegruppen des Parasiten wurden die vier identifizierten Vertreter der Zyklin-abhängige-Kinase-ähnlichen Kinasen (cyclin-dependent kinase-like kinases, CLKs) bisher kaum untersucht. In anderen Eukaryoten sind CLKs an der mRNA-Prozessierung und am Spleißen durch die Phosphorylierung von Serin/Arginin-reichen (SR-) Proteinen beteiligt, welche wiederum Komponenten der Spleißmaschinerie sind. Alle vier PfCLKs sind abundant exprimiert in asexuellen Parasiten sowie Gametozyten, und stadien-spezifische Expressionsprofile von PfCLK-1 und PfCLK-2 zeigten eine Kern-assoziierte Expression sowie Phosphorylierungsaktivität in in vitro-Aktivitätsstudien. Im Verlauf dieser Studie wurden PfCLK-3 und PfCLK-4 mittels indirekter Immunfluoreszenzstudien, Western Blot-Analysen und Kinaseaktivitätsassays funktionell charakterisiert. Die Ergebnisse bestätigen, dass beide Kinasen vorrangig im Nukleus von P. falciparum-Trophozoiten lokalisiert sind und Phosphorylierungsaktivität gegenüber physiologischen Substraten in vitro aufweisen. Ähnlich wie für PfCLK-1 und PfCLK-2 konnte in Reverse-Genetik-Studien gezeigt werden, dass sowohl PfCLK-3 als auch PfCLK-4 essentiell für den asexuellen Replikationszyklus von P. falciparum sind. Dieser Umstand macht beide Kinasen zu potenziellen Angriffspunkten für antiplasmodiale Bekämpfungsstrategien. Des Weiteren wurde diese Studie ausgeführt, um mögliche Interaktionspartner aller vier PfCLKs zu identifizieren. Vorangegangene Sequenzabgleiche brachten eine bemerkenswerte Homologie der Parasiten-CLKs zur SR-Proteinkinase Sky1p der Bäckerhefe zu Tage. Kinaseaktivitätsassays zeigten Phosphorylierung des Sky1p-Substrates und SR-Proteins Npl3p durch präzipitierte PfCLKs in vitro. Außerdem wurden vier homologe plasmodiale SR-Proteine bzw. mutmaßliche Spleißfaktoren identifiziert, die ebenso von den PfCLKs in vitro phosphoryliert werden: PfASF-1, PFSRSF12, PfSFRS4 und PfSR-1. Alle vier Parasiten-Spleißfaktoren sind vorwiegend in Kernen von Trophozoiten exprimiert. Für PfCLK-1 konnte eine Ko-Lokalisation mit den SR-Proteinen nachgewiesen werden. Abschließend wurden eine Sammlung humaner und mikrobieller CLK-Inhibitoren sowie das Antiseptikum Chlorhexidin (CHX) auf ihren hemmenden Effekt auf verschiedene Lebenszyklusstadien von P. falciparum und gezielt auf die PfCLKs überprüft. Es wurden fünf Inhibitoren aus einer Sammlung von 63 Substanzen auserwählt, die eine moderate Hemmung auf asexuelle Lebenszyklusstadien aufwiesen, mit IC50-Werten zwischen ungefähr 4 und 8 µM. Das Antibiotikum CHX zeigte sogar einen IC50-Wert im niedrigen nanomolaren Bereich. Nachfolgende Stage-of-Inhibition-Assays deckten auf, dass CHX die Entwicklung von Schizonten enorm beeinträchtigt. Wie in Gametozyten-Toxizitätsassays und Exflagellationsassays ermittelt wurde, hemmen alle ausgewählten CLK-Inhibitoren ferner sowohl die Gametozytogenese als auch die Gametogenese. Kinaseaktivitätsassays bestätigen eine spezifische Hemmung der CLK-vermittelten Phosphorylierung aller vier Kinasen, wenn die CLK-Inhibitoren auf immunopräzipitierte PfCLKs angewendet wurden. Diese Erkenntnisse über PfCLK-hemmende Substanzen sind erste Ansätze, um mögliche Wirkstoffe gegen Malaria zu finden, die die PfCLKs als Angriffspunkte haben. Zudem stellen diese Resultate ein wirksames Mittel zur Verfügung, um chemische Kinase-Knockout-Parasiten zu generieren. Diese können dann verwendet werden, um die Rolle der PfCLKs vor allen in Bezug auf Spleißvorgänge und mRNA-Metabolismus phänotypisch zu untersuchen. Der Ansatz, die CLKs des Parasiten funktionell zu charakterisieren, ist von besonderem Interesse, da das Spleißosom des Malariaparasiten immer noch nicht ausreichend erforscht ist. Dadurch können weitere Erkenntnisse über die Spleißmaschinerie des Parasiten gewonnen werden. KW - Plasmodium falciparum KW - Malaria tropica KW - Posttranskriptionelle Regulation KW - Kinasen KW - Splicing KW - SR proteins KW - Molekularbiologie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115219 ER - TY - THES A1 - Subbarayal, Prema T1 - The role of human Ephrin receptor tyrosine kinase A2 (EphA2) in Chlamydia trachomatis infection T1 - Die Rolle der humanen Rezeptor-Tyrosinkinase EphrinA2 (EphA2) in der Chlamydia trachomatis Infektion N2 - Chlamydia trachomatis (Ctr), an obligate intracellular gram negative human pathogen, causes sexually transmitted diseases and acquired blindness in developing countries. The infectious elementary bodies (EB) of Ctr involved in adherence and invasion processes are critical for chlamydial infectivity and subsequent pathogenesis which requires cooperative interaction of several host cell factors. Few receptors have been known for this early event, yet the molecular mechanism of these receptors involvement throughout Ctr infection is not known. Chlamydial inclusion membrane serves as a signaling platform that coordinates Chlamydia-host cell interaction which encouraged me to look for host cell factors that associates with the inclusion membrane, using proteome analysis. The role of these factors in chlamydial replication was analyzed by RNA interference (RNAi) (in collaboration with AG Thomas Meyer). Interestingly, EphrinA2 receptor (EphA2), a cell surface tyrosine kinase receptor, implicated in many cancers, was identified as one of the potential candidates. Due to the presence of EphA2 in the Ctr inclusion proteome data, I investigated the role of EphA2 in Ctr infection. EphA2 was identified as a direct interacting receptor for adherence and entry of C. trachomatis. Pre-incubation of Ctr-EB with recombinant human EphA2, knockdown of EphA2 by siRNA, pretreatment of cells with anti-EphA2 antibodies or the tyrosine kinase inhibitor dasatinib significantly reduced Ctr infection. This marked reduction of Ctr infection was seen with both epithelial and endothelial cells used in this study. Ctr activates EphA2 upon infection and invades the cell together with the activated EphA2 receptor that interacts and activates PI3K survival signal, promoting chlamydial replication. EphA2 upregulation during infection is associated with Ctr inclusion membrane inside the cell and are prevented being translocated to the cell surface. Ephrins are natural ligands for Ephrin receptors that repress the activation of the PI3K/Akt pathway in a process called reverse signaling. Purified Ephrin-A1, a ligand of EphA2, strongly interferes with chlamydial infection and normal development, supporting the central role of these receptors in Chlamydia infection. Overexpression of full length EphA2, but not the mutant form lacking the intracellular cytoplasmic domain, enhanced PI3K activation and Ctr infection. Ctr infection induces EphA2 upregulation and is mediated by activation of ERK signaling pathway. Interfering with EphA2 upregulation sensitizes Ctr-infected cells to apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) suggesting the importance of intracellular EphA2 signaling. Collectively, these results revealed the first Ephrin receptor “EphA2” that functions in promoting chlamydial infection. In addition, the engagement of a cell surface receptor at the inclusion membrane is a new mechanism how Chlamydia subverts the host cell and induces apoptosis resistance. By applying the natural ligand Ephrin-A1 and targeting EphA2 offers a promising new approach to interfere with Chlamydia infection. Thus, the work provides the evidence for a host cell surface tyrosine kinase receptor that is exploited for invasion as well as for receptor-mediated intracellular signaling to facilitate the chlamydial replication. N2 - Chlamydia trachomatis (Ctr) ist ein obligat intrazellulär lebendes Gram negatives Bakterium, das Geschlechtskrankheiten verursachen kann. In Entwicklungsländern führt es zudem häufig zu erworbener Blindheit. Die infektiösen Elementarkörper (EB) sind für die Anheftung an die Wirtszelle sowie die Aufnahme von Ctr in die Wirtzelle verantwortlich. Dies ist ein wichtiger Schritt, da nur so die sich anschließende Krankheitsentwicklung stattfinden kann. Diese ist auch abhängig vom engen Zusammenspiel der Ctr Proteine mit den Wirtszellfaktoren. Obgleich dieser Schritt so wichtig ist, wurden erst wenige Wirtszellrezeptoren gefunden und welche Rolle diese Rezeptoren im weiteren Verlauf der Infektion spielen, ist noch nicht richtig verstanden. Die chlamydiale Inklusionsmembran fungiert als Signalplattform, die das Zusammenspiel von Chlamydien und Wirtszelle koordiniert. In dieser Arbeit wurden die Wirtszellproteine, die an der Inklusionsmembran lokalisiert sind, mit Hilfe einer Proteomanalyse identifiziert. Anschließend wurde die Rolle dieser Proteine bei der Chlamydienvermehrung in einem RNAi screen untersucht (in Zusammenarbeit mit der AG Thomas Meyer). Hier wurde überraschenderweise der EphrinA2 Rezeptor, eine sich auf der Oberfläche der Zellen befindliche Rezeptor Tyrosin Kinase, die vor allem mit Krebs in Verbindung gebracht wird, als ein potentieller Kandidat identifiziert. Da die Proteomdaten gezeigt haben, dass EphrinA2 an der Inklusionsmembran lokalisiert ist, wurde die Rolle von EphrinA2 während der Ctr Infektion hier näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass EphrinA2 ein direkter Rezeptor für Ctr ist, der sowohl die Adhärenz als auch die Aufnahme von Ctr in die Wirtszelle bewerkstelligt. Vorinkubation von Ctr- EB mit rekombinantem menschlichen EphrinA2, das herunterregulieren von EphrinA2 mit Hilfe einer siRNA oder das Vorinkubieren der menschlichen Zelle mit Antikörpern gegen EphrinA2 oder dem Tyrosinkinase Inhibitor Dasatinib, reduzierten die Ctr Infektion signifikant. Diese drastische Reduktion der Ctr Infektion wurde sowohl in Epithelzellen als auch in Endothelzellen beobachtet. Ctr aktiviert EphrinA2 während der Infektion und invadiert die Wirtszelle zusammen mit dem aktivierten Rezeptor, dieser interagiert mit dem aktivierten PI3K Überlebenssignal, was die Replikation der Chlamydien ermöglicht. An der Inklusionsmembran akkumuliert EphrinA2, da der Transport von neuem Rezeptor zur Zellmembran unterbunden ist. Ephrine sind die natürlichen Liganden der Ephrinrezeptoren, sie unterdrücken die Aktivierung des PI3K/Akt Signalweges in einem Prozess, der reverse Signalübertragung genannt wird. Aufgereinigtes Ephrin-A1, ein Ligand des EphrinA2 Rezeptors, verhindert eine normale Chlamydieninfektion, was eine zentrale Rolle dieses Rezeptors weiterhin bestätigt. Die Überexpression von EphrinA2, erhöhte die PI3K Aktivierung und Ctr Infektion. Dies war nicht der Fall, wenn eine Mutante, der die intrazelluläre Domäne fehlt, überexprimiert wurde. Eine Ctr Infektion induziert die Hochregulierung von EphrinA2, welche durch die Aktivierung des ERK Signalwegs bewerkstelligt wird. Wenn die Hochregulierung von EphrinA2 verhindert wird, werden Ctr infizierte Zellen sensitiver für Apoptose induziert durch tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), was ein weiter Hinweis für die Bedeutung der intrazellulären EphrinA2 Signalübermittlung ist. Insgesamt haben diese Ergebnisse den ersten Ephrin Rezeptor "EphA2" offenbart, der in der Förderung chlamydialer Infektionen fungiert. Hinzu kommt, dass die Bindung eines Oberflächenrezeptors an die Inklusionsmembran ein neuer Mechanismus ist, die Wirtszelle zu verändern und eine Apoptoseresistenz in der Zelle zu induzieren. Die Zugabe des natürlichen Liganden Ephrin-A1 eröffnet eine neue vielversprechende Möglichkeit Chlamydieninfektionen zu bekämpfen. Daher liefert diese Arbeit erste Hinweise, das eine Wirtszelltyrosinkinase, die sich an der Zelloberfläche befindet, notwendig ist für die Invasion und die intrazelluläre Signalübermittlung, welche für die chlamydiale Replikation notwendig ist, essentiell ist. KW - Chlamydia trachomatis KW - ctr KW - Ephrine KW - Rezeptor KW - endocytosis KW - Ephrin ligand KW - chlamydia KW - signalling KW - PI3K KW - EphA2 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114778 ER - TY - THES A1 - Gonzalez-Leal, Iris Janet T1 - Roles of cathepsins B and L in the Th1/Th2 polarization by dendritic cells T1 - Die Rolle von Kathepsinen B und L während der Th1/Th2 Polarisierung durch Dendritische Zellen N2 - Leishmaniasis is a neglected tropical disease that can be manifested through different clinical forms, ranging from cutaneous to visceral. The host response against Leishmania spp. is greatly dependent on T cell-mediated immunity, in which T helper 1 responses are associated with macrophage activation and elimination of the parasite, while regulatory T cells and T helper 2 responses are correlated with parasite survival and persistence of infection. Leishmania uses different virulence factors as strategies for evading the immune response of the host. One of them are cathepsin-like cysteine proteases, which are currently under extensive investigation as targets for drug development. Previous studies with inhibitors of cathepsins B and L in vivo revealed an outstanding modulation of the host T helper cell response. However, the mechanisms behind these observations were not further investigated. Given the urgent need for better treatments against leishmaniasis, the aim of this study was to investigate the effects that the lack of cathepsin B and L activity have on the signals that dendritic cells use to instruct T helper cell polarization in response to infection with Leishmania major. The cathepsin inhibitors tested showed low or no cytotoxicity in bone marrow-derived dendritic cells, and dendritic cells and macrophages could be generated from cathepsin B and cathepsin L-deficient mice without apparent alterations in their phenotype in comparison to wild-type controls. Furthermore, lack of cathepsin B and L activity showed no impact in the rate of promastigote processing by dendritic cells. Cathepsin B and cathepsin L-deficient macrophages showed no differences in parasite proliferation and capacity to produce nitric oxide in comparison to wild-type macrophages. In response to the parasite, dendritic cells treated with a cathepsin B inhibitor and dendritic cells from cathepsin B-deficient mice showed higher levels of expression of major histocompatibility complex (MHC) class II molecules than dimethyl sulfoxide (DMSO) or wild-type controls, but it was not accompanied by changes in the expression of costimulatory molecules. Wild-type dendritic cells and macrophages are not able to express the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-12 in response to promastigotes. However, cells treated with a cathepsin B inhibitor or cells deficient for cathepsin B were able to express IL-12, whilethe expression of other cytokines -including IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-alpha-remained unchanged. These characteristics point towards a more “pro-Th1” profile of dendritic cells in the absence of cathepsin B. This data is the first report on IL-12 regulation depending on cathepsin B. The IL-12 up-regulation observed was already present at the transcriptional level. Furthermore, it was also present in macrophages and dendritic cells in response to LPS, and the latter had a higher capacity to induce T cell helper 1 polarization in vitro than wild-type dendritic cells. The activation of different signaling pathways was analyzed, but the up-regulation of IL-12 could not be attributed to modulation of nuclear factor-kappaB (NFkappaB), p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) and extra-cellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 pathways. Thus, the mechanism behind IL-12 regulation by cathepsin B remains to be elucidated, and the impact of these effects is yet to be confirmed in vivo. Altogether it is tempting to speculate that cathepsin B, in addition to its role in processing endocytosed material, is involved in the modulation of the pro-inflammatory cytokine IL-12. N2 - Leishmaniose ist eine hauptsächlich in den Tropen vorkommende Infektionskrankheit, die sich in verschiedenen klinischen Formen, von kutan bis viszeral, manifestieren kann. Die Reaktion des Wirtes gegen Leishmania spp. hängt stark von der T-Zell-vermittelten Immunantwort ab, wobei die Antwort der T1-Helferzellen assoziiert ist mit der Aktivierung von Makrophagen und der Beseitigung des Parasiten, während die regulatorischen T-Zellen und T2-Helferzellen mit dem Überleben der Parasiten und der Fortdauer der Infektion in Verbindung stehen. Leishmania verwendet verschiedene Virulenzfaktoren als Strategie zur Umgehung der Immunantwort des Wirtes. Darunter zählen Cathepsin-ähnliche Cysteinproteasen, die derzeit Gegenstand umfangreicher Untersuchungen sind mit dem Ziel, für die Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden zu können. Frühere Studien mit Inhibitoren von Cathepsin B und L in vivo zeigten eine hervorragende Modulation der Wirt-T-Helferzellantwort. Jedoch wurden die Mechanismen, die diesen Beobachtungen zu Grunde liegen, nicht weiter untersucht. Angesichts der dringenden Notwendigkeit einer besseren Behandlung gegen Leishmaniose war das Ziel dieser Studie die Auswirkungen zu untersuchen, die das Fehlen von Cathepsin B und L-Aktivität auf die Signale hat, welche die dendritischen Zellen verwenden, um die Reaktion der T-Helferzellen auf eine Infektion mit Leishmania major zu beeinflussen. Die getesteten Cathepsin-Inhibitoren zeigten geringe oder keine Cytotoxizität in den aus dem Knochenmark präparierten dendritischen Zellen. Dendritische Zellen und Makrophagen von Cathepsin B- und Cathepsin L-defizienten Mäusen zeigten keine offensichtlichen Veränderungen ihres Phänotyps im Vergleich zu Wildtypkontrollen. Weiterhin zeigte das Fehlen von Cathepsin B- und L-Aktivität keine Auswirkung auf die Prozessierung der Promastigoten durch dendritische Zellen. Auch zeigten Cathepsin Bund Cathepsin L-defiziente Makrophagen keine Unterschiede in der Parasitenproliferation und der Fähigkeit Stickoxid zu produzieren im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen. In Reaktion auf den Parasiten war bei mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelten dendritischen Zellen und dendritischen Zellen von Cathepsin-B-defizienten Mäusen eine höhere Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen ersichtlich im Vergleich zu DMSO oder Wildtyp-Kontrollen, aber es wurden keine Veränderungen in der Expression von costimulatorischen Molekülen festgestellt. Dendritische Zellen und Makrophagen von Wildtyp-Mäusen sind nicht in der Lage das pro-inflammatorische Zytokin IL-12 als Reaktion auf die Promastigoten zu exprimieren. Jedoch konnten dendritische Zellen, die mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelt waren oder Cathepsin-B-defiziente Zellen, IL-12 exprimieren, während die Expression von anderen Zytokinen - einschließlich IL-6 und TNF-alpha- unverändert blieb. Diese Eigenschaften weisen in die Richtung einer "pro-Th1"-Antwort der dendritischen Zellen in Abwesenheit von Cathepsin B. Diese Daten sind der erste Bericht über die IL-12-Regulierung in Abhängigkeit von Cathepsin B. Die Hochregulation von IL-12 war bereits auf der Transkriptionsebene zu beobachten. Weiterhin war sie in Makrophagen und dendritischen Zellen auch als Reaktion auf LPS vorhanden. Dendritische Zellen von Cathepsin B-defizienten Mäusen hatten eine höhere Kapazität zur Induktion einer eine T1-Helferzell-Polarisierung in vitro als dendritische Zellen von Wildtyp-Mäusen. Die Aktivierung von verschiedenen Signalwegen wurde untersucht, jedoch konnte die Hochregulierung von IL-12 nicht auf die Modulation von NF_B, p38 MAPK und ERK1/2-Signalwege zurückgeführt werden. Damit ist der für die IL-12-Regulierung durch Cathepsin B verantwortliche Mechanismus noch nicht geklärt; auch die Auswirkungen dieser Effekte in vivo müssen noch bestätigt werden. Insgesamt lässt die vorliegende Studie vermuten, dass Cathepsin B nicht nur an der Prozessierung von endozytiertem Material sondern auch an der Regulierung des pro-inflammatorischen Zytokins IL-12 beteiligt ist. KW - Leishmaniose KW - Dendritische Zelle KW - leishmaniasis KW - dendritic cells KW - th1/th2 polarization KW - T-Lymphozyt KW - Helferzelle KW - Immunologie KW - Infektionsbiologie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114397 ER - TY - THES A1 - Stieb, Sara Mae T1 - Synaptic plasticity in visual and olfactory brain centers of the desert ant Cataglyphis T1 - Synaptische Plastizität visueller und olfaktorischer Gehirnzentren der Wüstenameise Cataglyphis N2 - Wüstenameisen der Gattung Cataglyphis wurden zu Modellsystemen bei der Erforschung der Navigationsmechanismen der Insekten. Ein altersabhängiger Polyethismus trennt deren Kolonien in Innendienst-Arbeiterinnen und kurzlebige lichtausgesetzte Fourageure. Nachdem die Ameisen in strukturlosem oder strukturiertem Gelände bis zu mehrere hundert Meter weite Distanzen zurückgelegt haben, können sie präzise zu ihrer oft unauffälligen Nestöffnung zurückzukehren. Um diese enorme Navigationsleistung zu vollbringen, bedienen sich die Ameisen der sogenannten Pfadintegration, welche die Informationen aus einem Polarisationskompass und einem Entfernungsmesser verrechnet; des Weiteren orientieren sie sich an Landmarken und nutzen olfaktorische Signale. Im Fokus dieser Arbeit steht C. fortis, welche in Salzpfannen des westlichen Nordafrikas endemisch ist - einem Gebiet, welches vollständig von anderen Cataglyphis Arten gemieden wird. Die Tatsache, dass Cataglyphis eine hohe Verhaltensflexibilität aufweist, welche mit sich drastisch ändernden sensorischen Anforderungen verbunden ist, macht diese Ameisen zu besonders interessanten Studienobjekten bei der Erforschung synaptischer Plastizität visueller und olfaktorischer Gehirnzentren. Diese Arbeit fokussiert auf plastische Änderungen in den Pilzkörpern (PK) - sensorischen Integrationszentren, die mutmaßlich an Lern- und Erinnerungsprozessen, und auch vermutlich am Prozess des Landmarkenlernens beteiligt sind - und auf plastische Änderungen in den synaptischen Komplexen des Lateralen Akzessorischen Lobus (LAL) – einer bekannten Relaisstation in der Polarisations-Leitungsbahn. Um die strukturelle synaptische Plastizität der PK in C. fortis zu quantifizieren, wurden mithilfe immunozytochemischer Färbungen die prä- und postsynaptischen Profile klar ausgeprägter synaptischer Komplexe (Mikroglomeruli, MG) der visuellen Region (Kragen) und der olfaktorischen Region (Lippe) der PK-Kelche visualisiert. Die Ergebnisse legen dar, dass eine Volumenzunahme der PK-Kelche während des Übergangs von Innendiensttieren zu Fourageuren von einer Abnahme der MG-Anzahl im Kragen und, mit einem geringeren Anteil, in der Lippe - dieser Effekt wird als Pruning bezeichnet - und einem gleichzeitigen Auswachsen an Dendriten PK-intrinsischer Kenyonzellen begleitet wird. Im Dunkeln gehaltene Tiere unterschiedlichen Alters zeigen nach Lichtaussetzung den gleichen Effekt und im Dunkel gehaltene, den Fourageuren altersmäßig angepasste Tiere weisen eine vergleichbare MG-Anzahl im Kragen auf wie Innendiensttiere. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die immense strukturelle synaptische Plastizität in der Kragenregion der PK-Kelche hauptsächlich durch visuelle Erfahrungen ausgelöst wird und nicht ausschließlich mit Hilfe eines internen Programms abgespielt wird. Ameisen, welche unter Laborbedingungen bis zu einem Jahr alt wurden, zeigen eine vergleichbare Plastizität. Dies deutet darauf hin, dass das System über die ganze Lebensspanne eines Individuums flexibel bleibt. Erfahrene Fourageure wurden in Dunkelheit zurückgeführt, um zu untersuchen, ob die lichtausgelöste synaptische Umstrukturierung reversibel ist, doch ihre PK zeigen nur einige die Zurückführung widerspiegelnde Plastizitätsausprägungen, besonders eine Änderung der präsynaptischen Synapsinexprimierung. Mithilfe immunozytochemischer Färbungen, konfokaler Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionen wurden die prä- und postsynaptischen Strukturen synaptischer Komplexe des LAL in C. fortis analysiert und potentielle strukturelle Änderungen bei Innendiensttieren und Fourageuren quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Komplexe aus postsynaptischen, in einer zentralen Region angeordneten Fortsätzen bestehen, welche umringt sind von einem präsynaptischen kelchartigen Profil. Eingehende und ausgehende Trakte wurden durch Farbstoffinjektionen identifiziert: Projektionsneurone des Anterioren Optischen Tuberkels kontaktieren Neurone, welche in den Zentralkomplex ziehen. Der Verhaltensübergang wird von einer Zunahme an synaptischen Komplexen um ~13% begleitet. Dieser Zuwachs suggeriert eine Art Kalibrierungsprozess in diesen potentiell kräftigen synaptischen Kontakten, welche vermutlich eine schnelle und belastbare Signalübertragung in der Polarisationsbahn liefern. Die Analyse von im Freiland aufgenommener Verhaltenweisen von C. fortis enthüllen, dass die Ameisen, bevor sie mit ihrer Fouragiertätigkeit anfangen, bis zu zwei Tage lang in unmittelbarer Nähe des Nestes Entdeckungsläufe unternehmen, welche Pirouetten ähnliche Drehungen beinhalten. Während dieser Entdeckungsläufe sammeln die Ameisen Lichterfahrung und assoziieren möglicherweise den Nesteingang mit spezifischen Landmarken oder werden anderen visuellen Informationen, wie denen des Polarisationsmusters, ausgesetzt und adaptieren begleitend ihre neuronalen Netzwerke an die bevorstehende Herausforderung. Darüber hinaus könnten die Pirouetten einer Stimulation der an der Polarisationsbahn beteiligten neuronalen Netzwerke dienen. Videoanalysen legen dar, dass Lichtaussetzung nach drei Tagen die Bewegungsaktivität der Ameisen heraufsetzt. Die Tatsache, dass die neuronale Umstrukturierung in visuellen Zentren wie auch die Veränderungen im Verhalten im selben Zeitrahmen ablaufen, deutet darauf hin, dass ein Zusammenhang zwischen struktureller synaptischer Plastizität und dem Verhaltensübergang von der Innendienst- zur Fouragierphase bestehen könnte. Cataglyphis besitzen hervorragende visuelle Navigationsfähigkeiten, doch sie nutzen zudem olfaktorische Signale, um das Nest oder die Futterquelle aufzuspüren. Mithilfe konfokaler Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionen wurden potentielle Anpassungen der primären olfaktorischen Gehirnzentren untersucht, indem die Anzahl, Größe und räumliche Anordnung olfaktorischer Glomeruli im Antennallobus von C. fortis, C. albicans, C. bicolor, C. rubra, und C. noda verglichen wurde. Arbeiterinnen aller Cataglyphis-Arten haben eine geringere Glomeruli-Anzahl im Vergleich zu denen der mehr olfaktorisch-orientierten Formica Arten - einer Gattung nah verwandt mit Cataglyphis - und denen schon bekannter olfaktorisch-orientierter Ameisenarten. C. fortis hat die geringste Anzahl an Glomeruli im Vergleich zu allen anderen Cataglyphis-Arten und besitzt einen vergrößerten Glomerulus, der nahe dem Eingang des Antennennerves lokalisiert ist. C. fortis Männchen besitzen eine signifikant geringere Glomeruli-Anzahl im Vergleich zu Arbeiterinnen und Königinnen und haben einen hervorstechenden Männchen-spezifischen Makroglomerulus, welcher wahrscheinlich an der Pheromon-Kommunikation beteiligt ist. Die Verhaltensrelevanz des vergrößerten Glomerulus der Arbeiterinnen bleibt schwer fassbar. Die Tatsache, dass C. fortis Mikrohabitate bewohnt, welche von allen anderen Cataglyphis Arten gemieden werden, legt nahe, dass extreme ökologische Bedingungen nicht nur zu Anpassungen der visuellen Fähigkeiten, sondern auch des olfaktorischen Systems geführt haben. Die vorliegende Arbeit veranschaulicht, dass Cataglyphis ein exzellenter Kandidat ist bei der Erforschung neuronaler Mechanismen, welche Navigationsfunktionalitäten zugrundeliegen, und bei der Erforschung neuronaler Plastizität, welche verknüpft ist mit der lebenslangen Flexibilität eines individuellen Verhaltensrepertoires. N2 - Desert ants of the genus Cataglyphis have become model systems for the study of insect navigation. An age-related polyethism subdivides their colonies into interior workers and short-lived light-exposed foragers. While foraging in featureless and cluttered terrain over distances up to several hundred meters, the ants are able to precisely return back to their often inconspicuous nest entrance. They accomplish this enormous navigational performance by using a path integration system - including a polarization compass and an odometer - as their main navigational means in addition to landmark-dependent orientation and olfactory cues. C. fortis, being the focus of the present thesis, is endemic to the salt flats of western North Africa, which are completely avoided by other Cataglyphis species. The fact that Cataglyphis ants undergo a behavioral transition associated with drastically changing sensory demands makes these ants particularly interesting for studying synaptic plasticity in visual and olfactory brain centers. This thesis focuses on plastic changes in the mushroom bodies (MBs) - sensory integration centers supposed to be involved in learning and memory presumably including landmark learning - and in synaptic complexes belonging to the lateral accessory lobe (LAL) known to be a relay station in the polarization processing pathway. To investigate structural synaptic plasticity in the MBs of C. fortis, synaptic complexes (microglomeruli, MG) in the visual (collar) and olfactory (lip) input regions of the MB calyx were immunolabeled and their pre- and postsynaptic profiles were quantified. The results show that a volume increase of the MB calyx during behavioral transition is associated with a decrease of MG number - an effect called pruning - in the collar and, less pronounced, in the lip that goes along with dendritic expansion in MB intrinsic Kenyon cells. Light-exposure of dark-reared ants of different age classes revealed similar effects and dark-reared ants age-matched to foragers had MG numbers comparable to those of interior workers. The results indicate that the enormous structural synaptic plasticity of the MB calyx collar is primarily driven by visual experience rather than by an internal program. Ants aged artificially for up to one year expressed a similar plasticity indicating that the system remains flexible over the entire life-span. To investigate whether light-induced synaptic reorganization is reversible, experienced foragers were transferred back to darkness with the result that their MBs exhibit only some reverse-type characteristics, in particular differences in presynaptic synapsin expression. To investigate the structure of large synaptic complexes in the LAL of C. fortis and to detect potential structural changes, pre- and postsynaptic profiles in interior workers and foragers were immunolabeled and quantified by using confocal imaging and 3D-reconstruction. The results show that these complexes consist of postsynaptic processes located in a central region that is surrounded by a cup-like presynaptic profile. Tracer injections identified input and output tracts of the LAL: projection neurons from the anterior optic tubercle build connections with neurons projecting to the central complex. The behavioral transition is associated with an increase by ~13% of synaptic complexes suggesting that the polarization pathway may undergo some sort of calibration process. The structural features of these synaptic contacts indicate that they may serve a fast and reliable signal transmission in the polarization vision pathway. Behavioral analyses of C. fortis in the field revealed that the ants perform exploration runs including pirouette-like turns very close to the nest entrance for a period of up to two days, before they actually start their foraging activity. During these orientation runs the ants gather visual experience and might associate the nest entrance with specific landmarks or get entrained to other visual information like the polarization pattern, and, concomitantly adapt their neuronal circuitries to the upcoming challenges. Moreover, the pirouettes may serve to stimulate and calibrate the neuronal networks involved in the polarization compass pathway. Video recordings and analyses demonstrate that light experience enhanced the ants’ locomotor activity after three days of exposure. The fact that both the light-induced behavioral and neuronal changes in visual brain centers occur in the same time frame suggests that there may be a link between structural synaptic plasticity and the behavioral transition from interior tasks to outdoor foraging. Desert ants of the genus Cataglyphis possess remarkable visual navigation capabilities, but also employ olfactory cues for detecting nest and food sites. Using confocal imaging and 3D-reconstruction, potential adaptations in primary olfactory brain centers were analyzed by comparing the number, size and spatial arrangement of olfactory glomeruli in the antennal lobe of C. fortis, C. albicans, C. bicolor, C. rubra, and C. noda. Workers of all Cataglyphis species have smaller numbers of glomeruli compared to those of more olfactory-guided Formica species - a genus closely related to Cataglyphis - and to those previously found in other olfactory-guided ant species. C. fortis has the lowest number of glomeruli compared to all other species, but possesses a conspicuously enlarged glomerulus that is located close to the antennal nerve entrance. Males of C. fortis have a significantly smaller number of glomeruli compared to female workers and queens and a prominent male-specific macroglomerulus likely to be involved in sex pheromone communication. The behavioral significance of the enlarged glomerulus in female workers remains elusive. The fact that C. fortis inhabits microhabitats that are avoided by all other Cataglyphis species suggests that extreme ecological conditions may not only have resulted in adaptations of visual capabilities, but also in specializations of the olfactory system. The present thesis demonstrates that Cataglyphis is an excellent candidate for studying the neuronal mechanisms underlying navigational features and for studying neuronal plasticity associated with the ant’s lifelong flexibility of individual behavioral repertoires. KW - Neuroethologie KW - Plastizität KW - Cataglyphis KW - Visuelles System KW - Soziale Insekten KW - Synaptische Plastizität KW - Verhaltenplastizität KW - Pilzkörper KW - Mikroglomeruli KW - Antennallobus KW - synaptic plasticity KW - behavioral maturation KW - mushroom body KW - microglomeruli KW - antennal lobe Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85584 ER - TY - THES A1 - Schubert, Andreas T1 - Protein kinases as targets for the development of novel drugs against alveolar echinococcosis T1 - Proteinkinasen als Angriffspunkte für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika gegen die Alveoläre Echinokokkose N2 - The metacestode larval stage of the fox tapeworm Echinococcus multilocularis is the causative agent of alveolar echinococcosis (AE), one of the most lethal zoonosis of the northern hemisphere. The development of metacestode vesicles by asexual multiplication and the almost unrestricted infiltrative growth within the host organs is ensured from a population of undifferentiated, proliferative cells, so-called germinative cells. AE treatment options include surgery, if possible, as well as Benzimidazole-based chemotherapy (BZ). Given that the cellular targets of BZs, the -tubulins, are highly conserved between cestodes and humans, the chemotherapy is associated with considerable side-effects. Therefore, BZ can only be applied in parasitostatic doses and has to be given lifelong. Furthermore, the current anti-AE chemotherapy is ineffective in eliminating the germinative cell population of the parasite, which leads to remission of parasite growth as soon as therapy is discontinued. This work focuses on protein kinases involved in the proliferation and development of the parasite with the intention of developing novel anti-AE therapies. Polo-like kinases (Plks) are important regulators of the eukaryotic cell cycle and are involved in the regulation and formation of the mitotic spindles during the M-phase of the cell cycle. Plks have already been shown to be associated with deregulated cellular growth in human cancers and have been investigated as novel drug targets in the flatworm parasite Schistosoma mansoni. In the first part of this work, the characterisation of a novel and druggable parasite enzyme, EmPlk1, which is homologous to the polo-like kinase 1 (Plk1) of humans and S. mansoni (SmPlk1), is presented. Through in situ hybridisation, it could be demonstrated that emplk1 is specifically expressed in the Echinococcus germinative cells. Upon heterologous expression in the Xenopus oocyte system, EmPlk1 induced germinal vesicle breakdown, thus indicating that it is an active kinase. Furthermore, BI 2536, a compound originally designed to inhibit the human ortholog of EmPlk1, inhibited the EmPlk1 activity at a concentration of 25 nM. In vitro treatment of parasite vesicles with similar concentrations of BI 2536 led to the elimination of the germinative cells from Echinococcus larvae, thus preventing the growth and further development of the parasite. In in vitro cultivation systems for parasite primary cells, BI 2536 effectively inhibited the formation of new metacestode vesicles from germinative cells. Thus, BI 2536 has profound anti-parasitic activities in vitro at concentrations well within the range of plasma levels measured after the administration of safe dosages to patients (50 nM after 24 h). This implies that EmPlk1 is a promising new drug target for the development of novel anti-AE drugs that would specifically affect the parasite’s stem cell population, namely the only parasite cells capable of proliferation. In addition to the chemotherapeutic aspects of this work, the inhibitor BI 2536 could be further used to study the function of stem cells in this model organism, utilising a method of injection of parasite stem cells into metacestode vesicles, for instance, as has been developed in this work. In the second part of this work, a novel receptor tyrosine kinase, the Venus flytrap kinase receptor (EmVKR) of E. multilocularis has been characterised. Members of this class of single-pass transmembrane receptors have recently been discovered in the related trematode S. mansoni and are associated with the growth and differentiation of sporocyst germinal cells and ovocytes. The ortholog receptor in EmVKR is characterised by an unusual domain composition of an extracellular Venus flytrap module (VFT), which shows significant similarity to GABA receptors, such as the GABAB receptor (γ-amino butyric acid type B) and is linked through a single transmembrane domain to an intracellular tyrosine kinase domain with similarities to the kinase domains of human insulin receptors. Based upon the size (5112bp) of emvkr and nucleotide sequence specificities, efforts have been made to isolate the gene from cell culture samples to study the ligand for the activation of this receptor type in Xenopus oocytes. To date, this type of receptor has only been described in invertebrates, thus making it an attractive target for drug screening. In a first trial, the ATP competitive inhibitor AG 1024 was tested in our in vitro cell culture. In conclusion, the EmVKR represents a novel receptor tyrosine kinase in E. multilocularis. Further efforts have to be made to identify the activating ligand of the receptor and its cellular function, which might strengthen the case for EmVKR as a potential drug target. The successful depletion of stem cells in the metacestode vesicle by the Plk1 inhibitor BI 2536 gives rise to optimising the chemical component for EmPlk1 as a new potential drug target. Furthermore, this inhibitor opens a new cell culture technique with high potential to study the cellular behaviour and influencing factors of stem cells in vitro. N2 - Das Verbreitungsgebiet des kleinen Fuchsbandwurms erstreckt sich über die nördliche Hemisphäre und eine Infektion des Menschen verursacht eine meist tödliche verlaufende Parasitose, die alveolaren Echinococcose (AE). Durch infiltratives und asexuelles Wachstum des Larvenstadiums der AE im betroffenen Wirtsorgan kommt es zu einer tödlich verlaufenden Krankheit. Das Wachstum der Metacestoden wird dabei durch undifferenzierte proliferierende Stammzellen, den sog. „germinativen Zellen“ des Fuchsbandwurmes verursacht. Die derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten von AE sehen neben einem chirurgischen Eingriff, der in den meisten Fällen nicht möglich ist, nur eine Chemotherapie mit Benzimidazolen (BZ) vor. Die Chemotherapie mit BZ richtet sich dabei gegen die β-Tubuline des Parasiten und ist überwiegend mit einer lebenslangen Behandlung verbunden. Obwohl sich die Behandlungsmöglichkeiten und die Prognose für Patienten seit der Verwendung von Benzimidazolen bedeutsam verbessert haben, kommt es dennoch zu starken Nebenwirkungen und die angewendete Chemotherapie wirkt nur parasitostatisch. Der Grund dafür liegt an der hohen Homologie zwischen den β-Tubulinen des Parasiten und des Menschen, welche die Zielproteine von Benzimidazolen sind. Um die Nebenwirkungen für den Patienten gering zu halten, werden die Benzimidazole nur in Konzentrationen verabreicht, die parasitostatisch wirken, was zu keiner Abtötung des Parasitengewebes führt. Darüber hinaus sind die gegenwärtigen AE-Medikamente nicht wirksam gegen die germinativen Zellen des Parasiten, was zu einem Wiederauftreten des Wachstums von Parasitengewebe führt, sobald die Chemotherapie unterbrochen wird. Die hier vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung eines neuen chemotherapeutischen Ansatzes gegen AE und befasst sich mit Proteinkinasen, die einen wesentlichen Einfluss auf die Proliferation und die Differenzierung von Zellen des Parasiten haben. Proteinkinasen, die in direkten Zusammenhang mit den Zellzyklus stehen, sind beispielsweise die Polo-like kinasen (Plk), welche die Bildung von mitotischen Spindelfasern während der M-Phase regulieren. Wie bereits in vorhergehenden Studien gezeigt werden konnte, sind Plks auch an der Entstehung von Krebs beteiligt und daher interessante Ansatzpunkte für die Entwicklung von neuen Chemotherapeutika. Darüber hinaus zeigte sich auch, dass Sie zur Chemotherapie von parasitären Krankheiten Verwendung finden könnten, wie zur Behandlung von Schistosomiasis, welche durch Schistosoma mansoni ausgelöst wird. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung der Polo-like kinase 1 (Plk1) aus E. multilocularis, die Homologien zur humanen Plk1 und der aus S. mansoni (SmPlk1) aufweist und daher als Ansatzpunkt für eine neuartige chemotherapeutische Behandlung von AE angesehen werden kann. Es konnte gezeigt werden, dass EmPlk1 in germinativen Zellen (Stammzellen) des Parasiten stark exprimiert wird und das es möglich ist, dieses orthologe Protein mit nanomolekularer Konzentration (25 nM) des Plk1 Inhibitors BI 2536 in seiner zellulären Funktion zu hemmen. Darüber hinaus führt die Behandlung in vitro zu einem Verlust von Stammzellen im Larvenstadium von E. multilocularis, was zu einer drastischen Verminderung des Wachstums und der Entwicklung des Parasiten führt. Des Weiteren konnte sehr deutlich gezeigt werden, dass bei Verwendung des Inhibitors BI 2536 in Zellkultursystemen mit „Primärzellen“ (80% Stammzellen) des Parasiten diese nicht mit mehr in der Lage sind in Metacestoden zu regenerieren. Dabei ist entscheidend, dass die verwendeten Konzentrationen des Inhibitors BI 2536 innerhalb der gemessenen Plasmakonzentrationen von Krebspatienten liegen (50 nM nach 48 Stunden). Die Inhibierung der Plk1 wird daher als vielversprechender neuer Ansatzpunkt einer Chemotherapie zur Behandlung der AE angesehen. Die Inhibierung der EmPlk1 hat einen wesentlichen Einfluss auf die Differenzierung von Stammzellen des Parasiten, wodurch das Wachstum und die weitere Entwicklung des Parasiten gehemmt werden. Des Weiteren kann neben der chemotherapeutischen Behandlung der Inhibitor BI2536 auch für das weitere Studium von Stammzellen und deren zelluläre Funktion in E. multilocularis genutzt werden. Dafür wurden erste in vitro Experimente mittels Injektion in stammzellfreie Metacestoden Vesikel durchgeführt. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit einem neuen Transmembranrezeptor in E. multilocularis, der hier als Venus-Fliegenfallen-Rezeptor charakterisiert wird. Dieser Rezeptortyp wurde erst kürzlich in S. mansoni beschrieben und steht im Zusammenhang mit der Entwicklung und dem Wachstum von Keimzellen des Parasiten. Der Rezeptor weist eine ungewöhnliche Zusammensetzung aus einer extrazellulären Venusfliegenfallendomäne (VFT) mit starker Ähnlichkeit zu GABA Rezeptoren auf (γ-amino-Buttersäure Typ B) und ist über eine einzelne Transmembrandomäne mit einer intrazellulären Tyrosinkinasedomäne verbunden, die eine hohe Homologie zu humanen Insulinrezeptoren zeigt. Der lange Genabschnitt (5112bp) von emvkr mit sequenzspezifischen Eigenschaften war schwierig zu klonieren, um eine anschließende Expression in Xenopus Oozyten durchzuführen. Bisher wurde dieser Rezeptor nur in Invertebraten beschrieben und stellt somit einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung von neuen Chemotherapeutika dar. In einem ersten Versuch wurde die Wirkung des ATP-Kompetitive Inhibitors AG 1024 in unserer in vitro Zellkultur untersucht. Zusammenfassend wurde die Relevanz von EmVKR als neuartiger Tyrosinkinaserezeptor in E. multilocularis verdeutlicht. In anschließenden Studien sollte die Aktivierung durch Ligandenbindung an den Rezeptor, sowie seine weitere zelluläre Funktion untersucht werden. Diese Erkenntnisse könnten dann eine entscheidende Rolle für die Entwicklung von neuen Medikamenten mit EmVKR spielen. Des Weiteren wurde die erfolgreiche Entfernung von Stammzellen aus Metacestoden Vesikel mit dem Plk1 Inhibitor BI 2536 gezeigt. Dies bietet nun die Option diesen Inhibitor auf das Wirkstoffziel EmPlk1 weiter zu optimieren. Darüber hinaus hat die Verwendung dieses Inhibitors den entscheidenden Zugang für eine neue Zellkulturtechnik ermöglicht, die das Studieren von Stammzellen und deren Einflussfaktoren in vitro bietet. KW - Chemotherapie KW - Echinococcus KW - Fuchsbandwurm KW - Stammzelle KW - Polo-like kinase 1 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113694 ER - TY - THES A1 - Alrefai, Hani Gouda Alsaid T1 - Molecular Characterization of NFAT Transcription Factors in Experimental Mouse Models T1 - Molekulare Charakterisierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren in experimentellen Mausmodellen N2 - In this work we wanted to investigate the role of NFATc1 in lymphocyte physiology and in pathological conditions (eg. psoriasis). NFATc1 is part of the signal transduction pathways that regulates B cells activation and function. NFATc1 has different isoforms that are due to different promoters (P1 and P2), polyadenylation and alternative splicing. Moreover, we tried to elucidate the points of interactions between the NFAT and the NF-κB pathways in activated B-cell fate. NFAT and NF-κB factors share several properties, such as a similar mode of induction and architecture in their DNA binding domain. We used mice which over-express a constitutive active version of NFATc1/α in their B cells with -or without- an ablated IRF4. IRF4 inhibits cell cycle progression of germinal center B cell-derived Burkitt’s lymphoma cells and induces terminal differentiation toward plasma cells. Our experiments showed that a ‘double hit’ in factors affecting B cell activation (NFATc1 in this case) and late B cell Differentiation (IRF4 in this case) alter the development of the B cells, lead to increase in their numbers and increase in stimulation induced proliferation. Therefore, the overall picture indicates a link between these 2 genes and probable carcinogenic alterations that may occur in B cells. We also show that in splenic B cells, c-Rel (of the NF-κB canonical pathway) Support the induction of NFATc1/αA through BCR signals. We also found evidence that the lack of NFATc1 affects the expression of Rel-B (of the NF-κB non-canonical pathway). These data suggest a tight interplay between NFATc1 and NF-κB in B cells, influencing the competence of B cells and their functions in peripheral tissues. We also used IMQ-induced psoriasis-like inflammation on mice which either lack NFATc1 from B cell. Psoriasis is a systemic chronic immunological disease characterized primarily by abnormal accelerated proliferation of the skin keratinocytes. In psoriasis, the precipitating event leads to immune cell activation. Our experiments showed that NFATc1 is needed for the development of psoriasis. It also showed that IL-10 is the link that enables NFAT from altering the B cell compartment (eg Bregs) in order to affect inflammation. The important role of B cell in psoriasis is supported by the flared up psoriasis-like inflammation in mice that lack B cells. Bregs is a special type of B cells that regulate other B cells and T cells; tuning the immunological response through immunomodulatory cytokines. N2 - Diese Arbeit befasst sich mit der Regulation und der Funktion des Transkriptionsfaktors NFATc1 (“nuclear factor of activated T-cells c1) in B-Lymphozyten. Hierzu wurde zum einen die transkriptionelle Kontrolle des Nfatc1-Gens in aktivierten B-Lymphozyten und zum anderen die Bedeutung dieses Faktors für die Wachstumskontrolle und Autoimmunität anhand verschiedener Modellsysteme analysiert. Sechs verschiedene NFATc1-Isoformen können in B-Lymphozyten durch die Nutzung zweier verschiedener Promotoren, zweier Polyadenylierungsstellen und eines alternativen Splicings generiert werden. Wir zeigen hier, dass insbesondere die NF-kB Faktoren c-Rel und p50 eine essentielle Bedeutung für die starke Induktion des Promoters P1 und damit der Expression der kurzen Isoform NFATc1A in B-Zell-Rezeptor-stimulierten B-Zellen spielen. Interessanterweise zeigen NFATc1-defiziente B-Lymphozyten eine geschwächte Aktivierung der NF-kB-Faktoren, was auf eine enge Verknüpfung dieser zwei Signalwege hindeutet. NFATc1-defiziente B-Lymphozyten weisen eine Aktivierungs- und Wachstumsschwäche auf (Bhattacharyya S., et.al.). Hier zeigen wir, dass die Überexpression von konstitutiv aktivem NFATc1A in B-Lymphozyten, insbesondere wenn dies im Kontext einer IRF4-Defizienz geschieht, zu einer verstärkten Expansion der B-Zellpopulation, insbesondere nach deren Aktivierung, führt. Dies belegt die kritische Bedeutung, die der wohldosierten Expressions- und Aktivierungskontrolle der NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten zukommt. Dies zeigt sich auch in einem Imiquimod-induziertem Psoriasis Mausmodell. Hier wird durch Applikation von Imiquimod auf die Haut eine der Schuppenflechte ähnelnde entzündliche Reaktion ausgelöst, die insbesondere durch eine stark verstärkte Proliferation der Keratinozyten gekennzeichnet ist. Wir können zeigen, dass die NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten kritisch an dieser Reaktion beteiligt sind. Fehlt den B-Lymphozyten das NFATc1-Gen, so produziert eine Subpopulation, die sogenannten regulatorischen B-Zellen, verstärkt das immunmodulatorischen Zytokins IL-10, wodurch die entzündliche Reaktion fast komplett unterdrückt wird. Dies ähnelt vorhergehenden Beobachtungen, in denen wir zeigen konnten, dass auch in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose (EAE) die Immunreaktion durch den Verlust von NFATc1 in B-Zellen erheblich gelindert werden kann (Bhattacharyya S., et.al.). KW - Schuppenflechte KW - Maus KW - Transkriptionsfaktor KW - B-Lymphozyt KW - NFAT KW - NF-kB KW - Transgenic mice KW - Psoriasis KW - Cancer KW - B cells Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97905 ER - TY - THES A1 - Yang, Zhenghong T1 - A systematic study of learned helplessness in Drosophila melanogaster T1 - Eine systematische Untersuchung der erlernten Hilflosigkeit in Drosophila melanogaster N2 - The learned helplessness phenomenon is a specific animal behavior induced by prior exposure to uncontrollable aversive stimuli. It was first found by Seligman and Maier (1967) in dogs and then has been reported in many other species, e.g. in rats (Vollmayr and Henn, 2001), in goldfishes (Padilla, 1970), in cockroaches (Brown, 1988) and also in fruit flies (Brown, 1996; Bertolucci, 2008). However, the learned helplessness effect in fruit flies (Drosophila melanogaster) has not been studied in detail. Thus, in this doctoral study, we investigated systematically learned helplessness behavior of Drosophila for the first time. Three groups of flies were tested in heatbox. Control group was in the chambers experiencing constant, mild temperature. Second group, master flies were punished in their chambers by being heated if they stopped walking for 0.9s. The heat pulses ended as soon as they resumed walking again. A third group, the yoked fly, was in their chambers at the same time. However, their behavior didn’t affect anything: yoked flies were heated whenever master flies did, with same timing and durations. After certain amount of heating events, yoked flies associated their own behavior with the uncontrollability of the environment. They suppressed their innate responses such as reducing their walking time and walking speed; making longer escape latencies and less turning around behavior under heat pulses. Even after the conditioning phase, yoked flies showed lower activity level than master and control flies. Interestingly, we have also observed sex dimorphisms in flies. Male flies expressed learned helplessness not like female flies. Differences between master and yoked flies were smaller in male than in female flies. Another interesting finding was that prolonged or even repetition of training phases didn’t enhance learned helplessness effect in flies. Furthermore, we investigated serotonergic and dopaminergic nervous systems in learned helplessness. Using genetic and pharmacological manipulations, we altered the levels of serotonin and dopamine in flies’ central nervous system. Female flies with reduced serotonin concentration didn’t show helpless behavior, while the learned helplessness effect in male flies seems not to be affected by a reduction of serotonin. Flies with lower dopamine level do not display the learned helplessness effect in the test phase, suggesting that with low dopamine the motivational change in learned helplessness in Drosophila may decline faster than with a normal dopamine level. N2 - Das „learned helplessness“ Phänomen ist ein spezifisches Verhalten nach vorheriger Exposition von unkontrollierbaren aversiven Stimuli induziert. Es wurde zuerst von Seligman und Maier (1967) bei Hunden und dann in vielen anderen Tierarten berichtet, z.B. in Ratten (Vollmayr und Henn, 2001), in Goldfische (Padilla , 1970), in Kakerlaken (Brown, 1988) sowie in Fruchtfliegen (Brown, 1996; Bertolucci, 2008). Allerdings wurde das learned helplessness Phänomen in Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) noch nicht genau erforscht. Somit wird in dieser Doktorarbeit haben wir erlernten learned helplessness von Drosophila zum ersten Mal systematisch untersucht. Drei Gruppen von Fliegen wurden in Heatbox getestet. Die Kontrollgruppe war in den Kammern erlebter konstant milder Temperatur. Die zweite Master Gruppe wurde in ihren Kammern erhitzt, wenn sie blieb stehen für 0,9 s. Die Hitze endete, sobald sie sich wieder bewegten. Eine dritte Gruppe, die Yoked Fliegen, war in ihren Kammern gleichzeitig. Doch ihr Verhalten keine Auswirkungen auf die Hitze hatte: Yoked Fliegen wurden erhitzt, wenn Master Fliegen wurden, mit gleichen Zeitpunkt und Dauer. Nach gewissen Hitze Veranstaltungen, Yoked Fliegen assoziierten ihre eigenen Verhalten mit der Unkontrollierbarkeit der Umwelt. Sie unterdrückte ihre angeborene Reaktionen, wie die Verringerung ihrer Laufaktivität; verlängerte mehr Fluchtlatenzzeiten und weniger Umdrehen Verhalten unter Hitzen. Auch nach der Konditionierungsphase zeigte Yoked Fliegen niedrigeren Aktivität als Master und Kontrolle Fliegen. Interessanterweise haben wir auch Sex Dimorphismus in Fliegen beobachtet. Male Fliegen haben learned helplessness nicht wie weibliche Fliegen ausgedrückt. Die Unterschiede zwischen den Master und Yoked Fliegen waren bei männlichen kleiner als bei weiblichen Fliegen. Ein weiteres interessantes Ergebnis war, dass längere oder sogar wiederholte Trainingsphasen die lerned helplessness Wirkung bei Fliegen nicht verstärken könnten. Darüber hinaus haben wir serotonergen und dopaminerge Nervensysteme in learned helplessness erforscht. Mit genetischen und pharmakologischen Manipulationen, haben wir das Niveau von Serotonin und Dopamin im zentralen Nervensystem der Fliegen geändert. Weibliche Fliegen mit reduzierten Serotoninkonzentration zeigten kein hilflos Verhalten, während die learned helplessness Wirkung in männlichen Fliegen schien nicht durch eine Reduktion von Serotonin beeinflusst zu werden. Fliegen mit niedrigerer Dopamin Konzentration zeigten keine learned helplessness Wirkung in der Testphase an, was darauf hindeutet, dass mit niedrigen Dopamin die Motivationsänderung in learned helplessness in Drosophila kann schneller als mit einem normalen Dopaminspiegel sinken. KW - Taufliege KW - Gelernte Hilflosigkeit KW - Drosophila KW - learned helplessness KW - depression KW - learning and memory Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112424 ER - TY - THES A1 - Heydenreich, Nadine T1 - Studies on the contact-kinin system and macrophage activation in experimental focal cerebral ischemia T1 - Untersuchungen zum Kontakt-Kinin-System und zur Makrophagen-Aktivierung beim Experimentellen Schlaganfall N2 - Traditionally, ischemic stroke has been regarded as the mere consequence of cessation of cerebral blood flow, e.g. due to the thromboembolic occlusion of a major brain supplying vessel. However, the simple restoration of blood flow via thrombolysis and/or mechanical recanalization alone often does not guarantee a good functional outcome. It appears that secondary detrimental processes are triggered by hypoxia and reoxygenation, which are referred to as ischemia/reperfusion (I/R) injury. During recent years it became evident that, beside thrombosis inflammation and edema formation are key players in the pathophysiology of cerebral ischemia. The contact-kinin system represents an interface between thrombotic, inflammatory and edematous circuits. It connects the intrinsic coagulation pathway with the plasma kallikrein-kinin system (KKS) via coagulation factor FXII. The serine protease inhibitor C1-inhibitor (C1-INH) has a wide spectrum of inhibitory activities and counteracts activation of the contact-kinin system at multiple levels. The first part of the thesis aimed to multimodally interfere with infarct development by C1-INH and to analyze modes of actions of human plasma derived C1-INH Berinert® P in a murine model of focal cerebral ischemia. It was shown that C57BL/6 mice following early application of 15.0 units (U) C1-INH, but not 7.5 U developed reduced brain infarctions by ~60% and less neurological deficits in the model of transient occlusion of the middle cerebral artery (tMCAO). This protective effect was preserved at more advanced stages of infarction (day 7), without increasing the risk of intracerebral bleeding or affecting normal hemostasis. Less neurological deficits could also be observed with delayed C1-INH treatment, whereas no improvement was achieved in the model of permanent MCAO (pMCAO). Blood-brain-barrier (BBB) damage, inflammation and thrombosis were significantly improved following 15.0 U C1-INH application early after onset of ischemia. Based on its strong antiedematous, antiinflammatory and antithrombotic properties C1-INH constitutes a multifaceted therapeutic compound that protects from ischemic neurodegeneration in ‘clinically meaningful’ settings. The second part of the thesis addresses the still elusive functional role of macrophages in the early phase of stroke, especially the role of the macrophage-specific adhesion molecule sialoadhesin (Sn). For the first time, sialoadhesin null (Sn-/-) mice, homozygous deficient for Sn on macrophages were subjected to tMCAO to assess the clinical outcome. Neurological and motor function was significantly improved in Sn-/- mice on day 1 after ischemic stroke compared with wildtype (Sn+/+) animals. These clinical improvements were clearly detectable even on day 3 following tMCAO. Infarctions on day 1 were roughly the same size as in Sn+/+ mice and did not grow until day 3. No intracerebral bleeding could be detected at any time point of data acquisition. Twenty four hours after ischemia a strong induction of Sn was detectable in Sn+/+ mice, which was previously observed only on perivascular macrophages in the normal brain. Deletion of Sn on macrophages resulted in less disturbance of the BBB and a reduced number of CD11b+ (specific marker for macrophages/microglia) cells, which, however, was not associated with altered expression levels of inflammatory cytokines. To further analyze the function of macrophages following stroke this thesis took advantage of LysM-Cre+/-/IKK2-/- mice bearing a nuclear factor (NF)-ϰB activation defect in the myeloid lineage, including macrophages. Consequently, macrophages were not able to synthesize inflammatory cytokines under the control of NF-ϰB. Surprisingly, infarct sizes and neurological deficits upon tMCAO were roughly the same in conditional knockout mice and respective wildtype littermates. These findings provide evidence that macrophages do not contribute to tissue damage and neurological deficits, at least, not by release of inflammatory cytokines in the early phase of cerebral ischemia. In contrast, Sn which is initially expressed on perivascular macrophages and upregulated on macrophages/microglia within the parenchyma following stroke, influenced functional outcome. N2 - Der ischämische Schlaganfall wird traditionell als unmittelbare und „einfache“ Folge der Unterbrechung des Blutflusses zum Gehirn z.B. durch thromboembolische Gefäßverschlüsse gesehen. Häufig führt die alleinige Wiederherstellung des Blutflusses durch Lysetherapie bzw. mechanische Rekanalisation jedoch nicht zu einer Funktionserholung. Dies rückt sekundäre pathophysiologische Prozesse in den Fokus, die durch die Hypoxie und anschließende Wiederversorgung mit Sauerstoff angestoßen werden und zu einem sogenannten Reperfusionsschaden führen. In den letzten Jahren wurde klar, dass neben der Thrombenbildung Entzündungsprozesse und Hirnschwellung zentrale Bestandteile der Pathophysiologie von ischämischen Schlaganfällen sind, die über ein komplexes Netzwerk von Signalwegen eng miteinander verknüpft sind. An dieser Schnittstelle setzt die vorliegende Dissertation an. Das Kontakt-Kinin-System verbindet das plasmatische Kallikrein-Kinin-System (KKS), welches entzündliche und ödematöse Prozesse anstößt, über den Blutgerinnungsfaktor FXII mit dem intrinsischen Blutgerinnungsweg, der letztlich für die Thrombenbildung verantwortlich ist. Der endogene Serinprotease-Inhibitor C1-Inhibitor (C1-INH) besitzt ein breites Wirkungsspektrum und wirkt der Aktivierung des Kontakt-Kinin-Systems auf verschiedenen Ebenen entgegen. Ziel des ersten Teils der vorliegenden Dissertation war es, mittels C1-INH auf multimodale Weise ins Infarktgeschehen einzugreifen und die Wirkmechanismen des humanen C1-INH Berinert® P im Mausmodell nach fokaler zerebraler Ischämie zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die frühe Behandlung von C57BL/6 Mäusen mit 15.0 Units (U) C1-INH im Modell der transienten Okklusion der Arteria cerebri media (tMCAO) eine drastische Reduzierung der Infarktvolumina um annähernd 60%, sowie deutlich weniger neurologische und funktionelle Defizite zur Folge hatte. Diese Schutzwirkung war auch im fortgeschrittenen Stadium (Tag 7) der Schlaganfallentwicklung zu beobachten, ohne das Risiko einer intrazerebralen Blutung zu erhöhen oder die normale Hämostase zu beeinflussen. Die Applikation von 7.5 U C1-INH hatte dagegen keinen Effekt. Ein wesentlich verbessertes neurologisches Verhalten konnte auch nach verzögerter Injektion von 15.0 U C1-INH erzielt werden. Im Gegensatz dazu bewirkte die Behandlung im Modell der permanenten MCAO (pMCAO) keine Verbesserung. Mechanistisch führte die Gabe von 15.0 U C1-INH zu einer deutlichen Stabilisierung der Bluthirnschranke und weniger Ödembildung. Darüber hinaus war die lokale Entzündungsreaktion nach C1-INH-Applikation abgeschwächt und es bildeten sich weniger Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation. Basierend auf seiner vielfältigen antithrombotischen, antientzündlichen und antiödematösen Potenz stellt C1-INH einen vielversprechenden Ansatz zum Schutz vor ischämischer Neurodegeneration nach Schlaganfall unter ‚klinisch relevanten‘ Bedingungen dar. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der bislang ungeklärten funktionellen Rolle von Makrophagen in der Frühphase nach Schlaganfall, speziell der Rolle des Makrophagen-spezifischen Signalmoleküls Sialoadhesin (Sn). Hierzu wurden erstmals Sialoadhesin-defiziente (Sn-/-) Mäuse, deren Makrophagen kein Sn exprimieren, der tMCAO unterzogen und die klinischen Folgen bewertet. Sn-/- Tiere zeigten verglichen mit Wildtypen (Sn+/+) verbesserte neurologische und motorische Funktionen an Tag 1 nach Schlaganfall. Diese Verbesserung war auch an Tag 3 nach Schlaganfall eindeutig nachweisbar. Die Infarkte an Tag 1 waren größenmäßig vergleichbar mit Sn+/+ Mäusen und nahmen bis Tag 3 nicht an Größe zu. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine intrazerebrale Blutung beobachtet. 24 Stunden nach Schlaganfall kam es bei Sn+/+ Mäusen zu einer starken Induktion von Sn, welches im normalen Gehirn nur auf perivaskulären Makrophagen exprimiert wurde. Die Deletion von Sn auf Makrophagen wirkte einer Bluthirnschrankenstörung entgegen und hatte eine deutlich geringere Infiltration von CD11b+ (spezifischer Marker für Makrophagen/Mikroglia) Zellen ins ischämische Gewebe zur Folge. Dies war interessanterweise nicht mit einer Veränderung der Zytokinexpression verknüpft. Zur weiteren Untersuchung der Makrophagenrolle nach Schlaganfall wurde die Dissertation auf LysM-Cre+/-/IKK2-/- Mäuse ausgedehnt. Diese wiesen einen Makrophagen-spezifischen Defekt in der Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuklearfaktor (NF)-ϰB auf, und konnten folglich inflammatorische Zytokine unter der Transkriptionskontrolle von NF-ϰB nicht synthetisieren. Die Infarktgrößen und neurologischen Defizite der transgenen Tiere waren überraschenderweise vergleichbar mit wildtypischen Wurfgeschwistern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Makrophagen zumindest nicht durch die Synthese von inflammatorischen Zytokinen zum Gewebeschaden und zu neurologischen Defiziten in der Frühphase nach Schlaganfall beitragen, während Sn, das initial nur auf perivaskulären Makrophagen exprimiert und später im ischämischen Parenchym auf Makrophagen/Mikroglia hochreguliert wird, Einfluss auf das funktionelle Outcome hatte. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Thrombose KW - Entzündung KW - Schlaganfall KW - Makrophage KW - C1-inibitor KW - Sialoadhesin KW - Contact-Kinin System KW - Ischämischer Schlaganfall KW - Bluthirnschranke Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94534 ER - TY - THES A1 - Konopik, Oliver T1 - The impact of logging and conversion to oil palm plantation on Bornean stream-dependent frogs and their role as meso-predators T1 - Die Auswirkungen von Abholzung des Regenwalds und Umwandlung zu Ölpalmplantagen auf bachbewohnende Frösche und ihre Rolle als Mesoprädatoren in Borneo N2 - I. Nowadays, tropical landscapes experience large-scale land use intensification and land conversion driven by increasing demand for resourses. Due to the continuously high demand for tropical timber and politically intended step increase in palm oil production, multiple rounds of logging and subsequent conversion to oil palm plantations became a regionally wide-spread land conversion pattern in Southeast Asia. Although many tree species and some animals are highly threatened by logging, a great number of species groups, such as birds or mammals, have been shown to persist in logged forests. Accordingly, many ecosystem services, such as dung removal, seed dispersal or the activity of scavengers, are functionally maintained in logged forests. In contrast, oil palm plantations have been shown to not only dramatically alter the species composition and reduce biodiversity, but also curtail many crucial biotic and abiotic ecosystem functions. The focus of this dissertation was to investigate the response of anuran species richness and community composition to logging and conversion to oil palm plantation in northern Borneo (chapter II). I analysed the diet of various frog species and their change with habitat degradation. Furthermore, I assessed the shift in the trophic position of the anuran community as well as the response of anuran phylogenetic, dietary, and functional diversity to logging and conversion to oil palm plantations (chapter III). Finally, the resilience of the predator-prey interaction between an ant-specialist toad and its ant prey was analysed using shifts in species-level interactions (chapter IV). II. This part of the study compares the species richness, relative abundance and community composition of stream anuran assemblages among primary forests, repeatedly logged forests and oil palm plantations. I used a highly standardised sampling setup applying transect-based sampling. Surprisingly, most of the anuran species native to primary forests were able to survive in logged forest streams. In contrast, on average only one third of the forest species richness was found in oil palm plantation streams. However, a high percentage of canopy cover above the plantation streams was able to mitigate this loss substantially. This study demonstrates the high conservation value of logged forests for Southeast Asian anurans. In contrast, the conversion to oil palm plantations leads to a dramatic decline of forest species. However, they have a mainly unused potential to contribute to the protection of parts of the regional anuran biodiversity if conservation-oriented management options are implemented. III. In this part, I analysed the shifts in trophic position and multiple diversity layers of Southeast Asian stream-dependent anuran species across a gradient of disturbance from primary forest through intensively logged forest to oil palm plantation. For this purpose, I identified the diet composition of 59 anuran species by means of stomach flushing. Furthermore, I use diet composition of frog species as well as species traits to calculate dietary and functional diversity, respectively. I found that the trophic position of the entire anuran community is elevated in heavily disturbed habitats. Furthermore, species diversity, phylogenetic species variation, dietary diversity, and functional diversity were reduced. However, beyond the effect of the decreased species richness, only phylogenetic species variability and functional diversity were significantly impacted by land conversion, indicating a non-random loss of phylogenetic groups and functionally unique species. Overall, the observed changes to species interactions and functional composition suggest a greatly modified role of anurans in altered habitats and major foodweb reorganisation. Such far-reaching changes to the way species groups interact are likely to threaten local biodiversity and ecosystem functioning in natural and particularly modified habitats. However, I could also show, that small-scale habitat quality, provided by riparian reserves, is able to mitigate the negative consequences of land conversion considerably. IV. Here I assess how logging of rain forest and conversion to oil palm plantations affect the populations of the ant-specialist giant river toad (Phrynoidis juxtaspera), and availability and composition of its ant prey. I measured canopy cover as an estimate for the degree of disturbance. I found that toad abundance decreased with increasing disturbance. At the same time, ant community composition was altered, and local ground-foraging ant species richness increased with disturbance. However, for a given amount of canopy cover, primary forest supported more ant species than altered habitats. Despite these changes, composition of ants consumed by toads was only weakly affected by habitat change, with the exception of the invasive yellow crazy ant (Anoplolepis gracilipes), which was positively selected in oil palm plantations. This suggests that predator-prey interactions can be mostly maintained with habitat disturbance despite shifts in community composition, and even that some predators are capable of exploiting new prey sources in novel ecosystems. V. I could show that anuran diversity and their trophic interaction is negatively impacted by logging and in particular by conversion to oil palm plantations. From species richness and community composition, my study expanded to phylogenetic, dietary and functional diversity. Furthermore, I investigated the interaction of a particular toad species with its preferred prey (ants), on species level. This increasing degree of detail in my study provided comprehensive results, beyond the detail of many related studies. Overall, conservation of the remaining forest in Southeast Asia is urgently required to protect anuran biodiversity and their trophic interactions. N2 - I. Durch den stetig steigenden Bedarf an vielfältigen Ressourcen stehen heutzutage vor allem tropische Ökosysteme unter enormem Druck hin zu intensiver Landwirtschaft und der Umwandlung von natürlichen Lebensräumen. Getrieben durch die hohe Nachfrage an Tropenhölzern und dem politisch gewollten Anstieg der Palmölproduktion, etablierte sich in Südostasien eine weit verbreitete Landnutzungsumwandlung charakterisiert durch wiederkehrende Holznutzung und die anschließende Umwandlung zu Ölpalmplantagen. Manche Tiergruppen und vor allem Baumarten sind dadurch stark gefährdet. Dennoch können andere Organismengruppen wie Vögel oder Säuger auch in genutzten Wäldern überleben. Auch Ökosystemdienstleistungen, wie Kotbeseitigung oder die Aktivität von Aasfressern bleiben vielfach in genutzten Wäldern erhalten. Im Gegensatz dazu stellen Ölpalmplantagen keinen geeigneten Lebensraum für viele Tier und Pflanzenarten dar und viele Ökosystemserviceleistungen können in diesen Plantagen nicht aufrecht erhalten werden. Ziel dieser Arbeit war die Auswirkungen dieser massiven Habitatumwandlung auf die Artenzahl und die Artenzusammensetzungen von Fröschen und Kröten in Nordborneo zu untersuchen (Kapitel II). Ich untersuchte die Nahrungszusammensetzung von mehreren Froscharten und wie sich diese mit Habitatumwandlung verändert. Zusätzlich habe ich die Stellung von Fröschen in der Nahrungskette sowie ihre phylogenetische, nahrungs- und funktionelle Diversität untersucht (Kapitel III). Schließlich habe die Interaktion von Fröschen mit ihrer Beute (in diesem Fall Ameisen) auch auf Artebene untersucht (Kapitel IV). II. Dieser Teil der Arbeit vergleicht die Artenzahl, relative Häufigkeit und die Artenzusammensetzung der bachlebenden Froscharten zwischen Primärwäldern, genutzten Wäldern und Ölpalmplantagen. Dazu nahm ich die Froschbestände mit einer standardisierten Transektmethode auf. Ich fand heraus, dass die meisten Froscharten aus Primärwäldern auch in forstwirtschaftlich intensiv genutzten Wäldern überleben konnten. Im Gegensatz dazu wiesen Ölpalmplantagen nur durchschnittlich ein drittel der Froscharten aus Wäldern auf. Jedoch konnte dieser Artenschwund durch einen hohen Kronenschluss über den Plantagenbächen reduziert werden. Diese Studie belegt den hohen naturschutzfachlichen Wert von genutzten Wäldern in Südostasien und die geringe Bedeutung von Ölpalmplantagen in diesem Zusammenhang. Jedoch zeigt es auch Wege auf, wie Ölpalmplantagen naturschutzfachlich aufgewertet werden können. III. Dieser Teil der Arbeit befasst sich mit den Auswirkungen der Habitatumwandlung auf die trophischen Interaktionen und mehrere Ebenen der Froschbiodiversität. Dazu untersuchte ich die Nahrungszusammensetzung von 59 Froscharten mittels Magenspülung. Darüber hinaus nutzte ich diese Daten um die Nahrungsvielfalt zu untersuchen und Daten aus der Literatur und die funktionelle Diversität zu erfassen. Dabei fand ich heraus, dass Frösche bei zunehmender Habitatzerstörung eine höhere Stellung in der Nahrungskette einnahmen. Darüber hinaus sank die allgemeine Diversität, die phylogenetische Verwandtschaft, die Nahrungsvielfalt und die funktionelle Diversität der Frösche. Also lässt sich schließen, dass diese tiefgreifenden Veränderungen eine deutlich andere Rolle der Frösche in den umgewandelten Habitaten zur Folge hat. Solche dramatischen Eingriffe in das Nahrungsnetz können negative Auswirkungen auf die Stabilität von Ökosystemen haben, jedoch zeigt sich auch hier, dass diese durch die Erhöhung des Kronenschlusses deutlich abgemildert werden können. IV. In diesem Abschnitt befasse ich mich auf die Auswirkungen der Habitatumwandlung auf die Häufigkeit der Kröte Phrynoidis juxtaspera, ihre Beute (Ameisen), sowie die Interaktion von Räuber und Beute. Dabei fand ich heraus, dass die Kröte in ungestörten Bächen am häufigsten war und gleichzeitig mehr (und andere) Ameisenarten in Ölpalmplantagen vorkamen. Jedoch war die Artenzahl von Ameisen bei konstantem Kronenschluss in Primärwäldern immer höher als in Ölpalmplantagen. Im großen Gegensatz zu diesen Veränderungen, war die Nahrungszusammensetzung der verbleibenden Kröten in den Plantagenbächen kaum unterschiedlich im Vergleich mit Primärwaldbächen. Eine Ausnahme war ein deutlich gestiegener Anteil der invasiven Ameisenart Anoplolepis gracilipes. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Räuber-Beute Interaktion unter Umständen unverändert die Habitatumwandlung überstehen können, aber auch in gewissem Umfang neue Ressourcen erschlossen werden können. V. Mit dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass sich die großflächige Habitatumwandlung von Wäldern hin zu Ölpalmplantagen negativ auf die Froschbiodiversität, wie auch die Räuber-Beute Interaktionen von Fröschen auswirkt. Ausgehend von Artenzahl und Artenzusammensetzung konnte ich in meiner Arbeit darüber hinaus auch die Biodiversität der Frösche auf verschiedenen Ebenen beleuchten und schließlich sogar die Räuber-Beute Interaktion auf Artebene untersuchen. Dadurch konnte ich diesen komplexen Zusammenhang in ganz besonderer Tiefe beleuchten. Insgesamt liefert diese Arbeit einen weiteren wichtigen Beleg dafür, dass Primärwälder, aber neuerdings auch immer mehr genutzte Wälder entscheidend für den Erhalt von tropischer Biodiversität sind. KW - Froschlurche KW - Biodiversität KW - Borneo KW - Ölpalmenanbau KW - Bach KW - amphibia KW - Borneo KW - logging KW - oilpalm plantation KW - frogs KW - stream KW - Rodung KW - Südostasien Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111749 ER - TY - THES A1 - Srinivasan, Aruna T1 - RS1 protein dependent and independent short and long term regulation of sodium dependent glucose transporter -1 T1 - RS1 Protein abhängige und unabhängige Kurz- und Langzeitregulation des Natrium-abhängigen Glukosetransporter -1 N2 - The Na+-D-glucose cotransporter in small intestine is regulated in response to food composition. Short term regulation of SGLT1 occurs post-transcriptionally in response to changes in luminal glucose. Adaptation to dietary carbohydrate involves long term regulation at the transcriptional level. The intracellular protein RS1 (gene RSC1A1) is involved in transcriptional and post-transcriptional regulation of SGLT1. RS1 contains an N-terminal domain with many putative phosphorylation sites. By Expressing SGLT1 in oocytes of Xenopus laevis it was previously demonstrated that the post-transcriptional down-regulation of SGLT1 by RS1 was dependent on the intracellular glucose concentration and activated by protein kinase C (PKC). The role of RS1 for short term regulation of SGLT1 in mouse small intestine in response to glucose and PKC was investigated comparing effects in RS1-/- mice and wildtype mice. Effects on SGLT1 activity were determined by measuring phlorizin inhibited uptake of α-methylglucoside (AMG). The involvement of RS1 in glucose dependent short term regulation could not be elucidated for technical reasons. However, evidence for RS1 independent short-term downregulation of SGLT1 after stimulation of PKC could be provided. It was shown that this downregulation includes decrease in the amount and/or in turnover of SGLT1 in the brush-border membrane as well as an increase of substrate affinity for AMG transport. Trying to elucidate the role of RS1 in long term regulation of SGLT1 in small intestine in response to glucose and fat content of the diet, wildtype and RS1-/- mice were kept for 2 months on a normo-caloric standard diet with high glucose and low fat content (ND), on a hyper-caloric glucose-galactose reduced diet with high fat content (GGRD) or on a hyper-caloric diet with a high fat and high glucose content (HFHGD). Thereafter the animals were starved overnight and SGLT1 mediated AMG uptake was measured. Independent of diet AMG uptake in ileum was smaller compared to duodenum and jejunum. In jejunum of wildtype and RS1-/- mice kept on the fat rich diets (GGRD and HFHGH) transport activity of SGLT1 was lower compared to mice kept on ND with low fat content. This result suggests an RS1 independent downregulation due to fat content of diet. Different to RS1-/- mice, the duodenum of wildtype mice showed transport activity of SGLT1 smaller in mice kept on glucose galactose reduced diet (GGRD) compared to the glucose galactose rich diets (ND and HFHGG). These data indicate that RS1 is involved in glucose dependent long term regulation in duodenum. N2 - Der Na+-Glukose-Cotransporter SGLT1 im Dünndarm wird in Abhängigkeit zur Nahrungszusammensetzung reguliert. Kurzzeitregulation von SGLT1 tritt posttranskritionell als Antwort zu sich ändernden Glukosekonzentrationen im Darmlumen auf. Anpassung an Nahrungskohlenhydrate beinhaltet die Langzeitregulation auf transkripionellem Level. Das intrazelluläre Protein RS1 (Gen RSC1A1) ist an der transkriptionellen und post-transkriptionellen Regulation von SGLT1 beteiligt. Es enthält eine N-terminale Domäne mit vielen putativen Phosphorylierungsstellen. Bei der Expression von SGLT1 im Xenopus leavis Oocytensystem wurde gezeigt, dass die posttranskriptionelle Herunterregulation von SGLT1 durch RS1 von der intrazelluläre Glukosekonzentration abhängt und durch Proteinkinase C (PKC) aktiviert wird. Die Rolle von RS1 in der Kurzzeitregulation von SGLT1 im Dünndarm der Maus als Antwort auf Glukose und PKC wurde durch vergleichende Studien zwischen RS1- knockout (RS1-/-)- Mäusen und Wildtyp-Mäusen untersucht. Effekte auf die SGLT1-Aktivität wurden durch Messung der durch Phlorizin inhibierbaren Aufnahme des SGLT1-spezifischen Substrats α-Methyl-Glycopyranosid (AMG) bestimmt. Der Einfluss von RS1 in der Glukose-abhängigen Kurzzeitregulation konnte aus technischen Gründen nicht untersucht werden, jedoch gab es Anzeichen für eine von RS1 unabhängige Kurzzeitregulation von SGLT1 durch PKC. Es wurde gezeigt, dass diese Herunterregulation sowohl eine Abnahme der Menge und/oder der Umsatzrate von SGLT1 in der Bürstensaummembran wie auch eine Zunahme der Substrat-Affinität für den AMG-Transport beinhaltet. Um die Rolle von RS1 auf die Langzeitregulation von SGLT1 in Dünndarm als Antwort auf den Glukose- und Fettgehalt der Nahrung zu untersuchen, wurden Wildtyp- und RS1-/- Mäuse für 2 Monate entweder auf einer normalenergetischen Standarddiät mit hohem Glukose- und niedrigem Fettgehalt (ND), auf einer hochenergetischen Diät mit reduziertem Glukose und Galaktose-Gehalt (GGRD) oder auf einer hochenergetischen Diät mit hohem Fett- und Glukosegehalt (HFHGD) gehalten. Danach wurden die Tiere über Nacht gefastet und die durch SGLT1 vermittelte AMG –Aufnahme gemessen. Unabhängig der Diät war die AMG-Aufnahme im Ileum geringer als in Duodenum und Jejunum. Im Jejunum von Wildtyp- und RS1-/- Mäusen die auf einer fettreichen Diät (GGRD und HFHGD) gehalten wurden war die Transportaktivität von SGLT1 geringer verglichen mit der Aktivität von Mäusen auf ND. Dieses Ergebnis lässt eine RS1-unabhängige Herunterregulation die durch den Fettgehalt hervorgerufen wird vermuten. Anders als in RS1-/- Mäusen war die Transportaktivität von SGLT1 im Duodenum von Wildtypmäusen bei der Glukose-Galaktose- reduzierten Diät niedriger verglichen mit den Glukose-Galaktose-reichen Diäten (ND und HFHGD). Diese Daten legend die Vermutung nahen, das RS1 an der Glukose-abhängigen Langzeitregulation im Duodenum beteiligt ist. KW - Glucosetransportproteine KW - Regulation KW - Natrium-abhängigen Glukosetransporter-1 KW - Sodium dependent glucose transporter-1 KW - Dünndarm KW - Glukose KW - Glukosetransporter -1 Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85665 ER - TY - THES A1 - Ewald, Heike T1 - Influence of context and contingency awareness on fear conditioning – an investigation in virtual reality T1 - Der Einfluss von Kontext und Kontingenzbewusstsein auf Furchtkonditionierung – eine Untersuchung in virtueller Realität N2 - Fear conditioning is an efficient model of associative learning, which has greatly improved our knowledge of processes underlying the development and maintenance of pathological fear and anxiety. In a differential fear conditioning paradigm, one initially neutral stimulus (NS) is paired with an aversive event (unconditioned stimulus, US), whereas another stimulus does not have any consequences. After a few pairings the NS is associated with the US and consequently becomes a conditioned stimulus (CS+), which elicits a conditioned response (CR). The formation of explicit knowledge of the CS/US association during conditioning is referred to as contingency awareness. Findings about its role in fear conditioning are ambiguous. The development of a CR without contingency awareness has been shown in delay fear conditioning studies. One speaks of delay conditioning, when the US coterminates with or follows directly on the CS+. In trace conditioning, a temporal gap or “trace interval” lies between CS+ and US. According to existing evidence, trace conditioning is not possible on an implicit level and requires more cognitive resources than delay conditioning. The associations formed during fear conditioning are not exclusively associations between specific cues and aversive events. Contextual cues form the background milieu of the learning process and play an important role in both acquisition and the extinction of conditioned fear and anxiety. A common limitation in human fear conditioning studies is the lack of ecological validity, especially regarding contextual information. The use of Virtual Reality (VR) is a promising approach for creating a more complex environment which is close to a real life situation. I conducted three studies to examine cue and contextual fear conditioning with regard to the role of contingency awareness. For this purpose a VR paradigm was created, which allowed for exact manipulation of cues and contexts as well as timing of events. In all three experiments, participants were guided through one or more virtual rooms serving as contexts, in which two different lights served as CS and an electric stimulus as US. Fear potentiated startle (FPS) responses were measured as an indicator of implicit fear conditioning. To test whether participants had developed explicit awareness of the CS-US contingencies, subjective ratings were collected. The first study was designed as a pilot study to test the VR paradigm as well as the conditioning protocol. Additionally, I was interested in the effect of contingency awareness. Results provided evidence, that eye blink conditioning is possible in the virtual environment and that it does not depend on contingency awareness. Evaluative conditioning, as measured by subjective ratings, was only present in the group of participants who explicitly learned the association between CS and US. To examine acquisition and extinction of both fear associated cues and contexts, a novel cue-context generalization paradigm was applied in the second study. Besides the interplay of cues and contexts I was again interested in the effect of contingency awareness. Two different virtual offices served as fear and safety context, respectively. During acquisition, the CS+ was always followed by the US in the fear context. In the safety context, none of the lights had any consequences. During extinction, a additional (novel) context was introduced, no US was delivered in any of the contexts. Participants showed enhanced startle responses to the CS+ compared to the CS- in the fear context. Thus, discriminative learning took place regarding both cues and contexts during acquisition. This was confirmed by subjective ratings, although only for participants with explicit contingency awareness. Generalization of fear to the novel context after conditioning did not depend on awareness and was observable only on trend level. In a third experiment I looked at neuronal correlates involved in extinction of fear memory by means of functional magnetic resonance imaging (fMRI). Of particular interest were differences between extinction of delay and trace fear conditioning. I applied the paradigm tested in the pilot study and additionally manipulated timing of the stimuli: In the delay conditioning group (DCG) the US was administered with offset of one light (CS+), in the trace conditioning group (TCG) the US was presented 4s after CS+ offset. Most importantly, prefrontal activation differed between the two groups. In line with existing evidence, the ventromedial prefrontal cortex (vmPFC) was activated in the DCG. In the TCG I found activation of the dorsolateral prefrontal cortex (dlPFC), which might be associated with modulation of working memory processes necessary for bridging the trace interval and holding information in short term memory. Taken together, virtual reality proved to be an elegant tool for examining human fear conditioning in complex environments, and especially for manipulating contextual information. Results indicate that explicit knowledge of contingencies is necessary for attitude formation in fear conditioning, but not for a CR on an implicit level as measured by FPS responses. They provide evidence for a two level account of fear conditioning. Discriminative learning was successful regarding both cues and contexts. Imaging results speak for different extinction processes in delay and trace conditioning, hinting that higher working memory contribution is required for trace than for delay conditioning. N2 - Furchtkonditionierung ist ein effizientes Modell für assoziatives Lernen und hat unser Wissen über Prozesse, die der Entstehung und Aufrechterhaltung von pathologischer Furcht und Angst zugrunde liegen, entscheidend vergrößert. In einem differentiellen Furchtkonditionierungparadigma wird ein zunächst neutraler Reiz (NS) gemeinsam mit einem aversiven Ereignis (unbedingter Reiz, US) dargeboten, während ein zweiter Stimulus nicht mit dem Ereignis gepaart wird. Nach mehrmaliger gemeinsamer Darbietung wird der NS mit dem US assoziiert. Dadurch wird er zu einem bedingten Reiz (CS+) und löst eine konditionierte Furchtreaktion (CR) aus. Die Bildung expliziten Wissens über die CS/US-Assoziation während der Konditionierung bezeichnet man als Kontingenzbewusstsein. Befunde über die Rolle dieses Bewusstseins in der Furchtkonditionieung sind uneinheitlich. In Delay-Furchtkonditionierungsstudien konnte die Entwicklung einer CR unabhängig von Kontingenzbewusstsein gezeigt werden. Man spricht von Delay-Konditionierung, wenn der US direkt auf den CS+ folgt. Bei der Trace-Konditionierung liegt zwischen dem CS und dem US ein kurzer zeitlicher Abstand (Trace-Interval). Für Trace-Konditionierung werden mehr kognitive Ressourcen benötigt als für Delay-Konditionierung. Auf einer impliziten Ebene ist Trace-Konditionierung nicht möglich. Die Assoziationen, die während der Furchtkonditionierung gebildet werden, beschränken sich nicht auf Assoziationen zwischen spezifischen Reizen und aversiven Ereignissen. Kontextuelle Reize bilden den Hintergrund des Lernprozesses und spielen sowohl bei der Akquisition als auch bei der Extinktion von Furcht und Angst eine wichtige Rolle. Eine häufige Einschränkung in Furchtkonditionierungsstudien beim Menschen ist der Mangel an ökologischer Validität, besonders hinsichtlich der Kontextinformationen. Der Einsatz von virtuellen Realtitäten (VR) stellt einen vielversprechenden Ansatz dar um komplexe Umgebungen nachzubilden, die nahe an Alltagssituationen sind. Um Hinweisreiz- und Kontextkonditionierung unter Berücksichtigung des Kontingenzbewusstseins zu untersuchen habe ich drei Experimente durchgeführt. Dafür wurde ein Paradigma in virtueller Realität entwickelt, das es ermöglicht, Reize, Kontexte sowie zusätzlich das Timing der Ereignisse exakt zu manipulieren. In allen drei Studien wurden Versuchspersonen durch einen oder mehrere virtuelle Räume geführt, in denen zwei verschiedene Lichter als bedingte Reize und ein elektrischer Reiz als unbedingter Reiz dienten. Furchtpotenzierte Startlereaktionen wurden gemessen als Indikator für implizite Furchtkonditionierung. Um zu überprüfen, ob die Versuchspersonen auch explizites Kontingenzbewusstsein erwoben hatten, wurden subjektive Ratings erfasst. Die erste Studie wurde als Pilotstudie konstruiert, um sowohl das VR Paradigma als auch das Konditionierungsprotokoll zu testen. Zusätzlich hat mich der Effekt des Kontingenzbewusstseins interessiert. Die Ergebnisse zeigten, dass Lidschlag-konditionierung im VR Paradigma möglich ist und dass sie nicht vom Kontingenz-bewusstsein abhängt. Allerdings war evaluative Konditionierung, gemessen durch subjektive Ratings, nur erkennbar bei Personen, die die Assoziation von CS und US explizit gelernt hatten. Um Akquisition und Extinktion sowohl furchtassoziierter Reize als auch furchtassoziierter Kontexte zu untersuchen, wurde in der zweiten Studie ein neues Reiz-Kontext-Generalisierungsparadigma eingesetzt. Neben dem Zusammenspiel von Reizen und Kontexten war ich auch hier an der Rolle des Kontingenzbewusstseins interessiert. Zwei verschiedene virtuelle Büros dienten als Furcht- bzw. Sicherheitskontext. Während der Akquisition folgte auf den CS+ im Furchtkontext immer ein US. Im Sicherheitskontext hatte keines der Lichter Konsequenzen. In der Extinktionsphase wurde zusätzlich ein neuer Kontext eingeführt. In keinem der Kontexte wurde ein US appliziert. Die Versuchspersonen reagierten nur im Furchtkontext mit erhöhter Startlereaktion auf den CS+ im Vergleich zum CS-. Diskriminatives Lernen hat sowohl hinsichtlich der Reize als auch hinsichtlich der Kontexte stattgefunden. Dies wurde bestätigt durch die subjektiven Ratings, allerdings nur bei Probanden mit Kontingenzbewusstsein. Eine Generalisierung der Angst vom Furchtkontext auf den neuen Kontext war nicht abhängig vom Kontingenzbewusstsein, konnte allerdings in der Gesamtgruppe nur tendenziell beobachtet werden. In der dritten Studie betrachtete ich neuronale Korrelate der Extinktion von Furchtgedächtnis mit Hilfe von funktioneller Magnetresonanztomographie (fMRI). Von besonderem Interesse waren dabei die Unterschiede zwischen der Extinktion von Delay- und Trace-Konditionierung. Ich habe das Paradigma aus der Pilotstudie angewendet und zusätzlich das Timing der Reize manipuliert. In der Delay-Konditionierungsgruppe (DCG) wurde der US zeitgleich mit dem Ende des CS+ appliziert, in der Trace-Konditionierungsgruppe (TCG) vier Sekunden nach Ende des CS+. Interessanterweise unterschieden sich die beiden Gruppen in ihrer präfrontalen Aktivierung. In Übereinstimmung mit der Literatur war der ventromediale Präfrontalkortex (vmPFC) in der DCG aktiviert. In der TCG konnte man Aktivierung des dorsolateralen Präfrontalkortex (dlPFC) beobachten. Dies könnte mit erhöhter Beteiligung des Arbeitsgedächtnisses zusammenhängen, die notwendig ist, um das Trace-Interval zu überbrücken und die Informationen im Kurzzeitgedächtnis zu halten. Zusammengefasst hat sich virtuelle Realität als ein elegantes Instrument zur Fuchtkonditionierung beim Menschen herausgestellt, besonders zur Manipulation von Kontextinformation. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass explizites Kontingenzwissen notwendig ist für evaluative Furchtkonditionierung, nicht jedoch für eine implizite CR gemessen an FPS Reaktionen. Außerdem liefern sie Evidenz für den “two level account of fear conditioning”. Die Ergebnisse der Bildgebung sprechen für zwei unterschiedliche Extinktionsprozesse bei Delay- und Trace-Konditionierung und weisen darauf hin, dass für Trace-Konditionierung eine höhere Beteiligung des Arbeitsgedächtnisses notwendig ist als für Delay-Konditionierung. KW - Klassische Konditionierung KW - Angst KW - Virtuelle Realität KW - Schreckreaktion KW - Funktionelle Kernspintomographie KW - Fear conditioning KW - virtual reality KW - contingency awareness KW - contextual conditioning KW - fMRI KW - fear potentiated startle response KW - Assoziation KW - Lernen KW - Kontingenz Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111226 ER - TY - THES A1 - Wetzel, Andrea T1 - The role of TrkB and NaV1.9 in activity-dependent axon growth in motoneurons T1 - Die Rolle von TrkB und NaV1.9 in aktivitätsabhängigem Axonwachstum von Motoneuronen N2 - Während der Entwicklung des Nervensystems lassen sich bei Motoneuronen aktivitätsabhängige Kalziumströme eobachten, die das Axonwachstum regulieren. Diese Form der neuronalen Spontanaktivität sowie das Auswachsen von Axonen sind bei Motoneuronen, die aus Tiermodellen der Spinalen Muskelatrophie isoliert werden, gestört. Experimente aus unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass spontane Erregbarkeit und aktivitätsabhängiges Axonwachstum von kultivierten Motoneuronen auch unter Verwendung von Toxinen beeinträchtigt sind, welche die Aktivität von spannungsabhängigen Natriumkanälen blockieren. In diesen Versuchen war die Wirkung von Saxitoxin effizienter als die Wirkung von Tetrodotoxin. Wir identifizierten den Saxitoxin-sensitiven/Tetrodotoxin-insensitiven spannungsabhängigen Natriumkanal NaV1.9 als Trigger für das Öffnen spannungsabhängiger Kalziumkanäle. Die Expression von NaV1.9 in Motoneuronen konnte über quantitative RT-PCR nachgewiesen werden und antikörperfärbungen offenbarten eine Anreicherung des Kanals im axonalen Wachstumskegel sowie an Ranvier'schen Schnürringen von isolierten Nervenfasern wildtypischer Mäuse. Motoneurone von NaV1.9 knock-out Mäusen zeigen reduzierte Spontanaktivität und eine Reduktion des Axonwachstums, welche durch NaV1.9 Überexpression normalisiert werden kann. In Motoneuronen von Smn-defizienten Mäusen konnte keine Abweichung der NaV1.9 Proteinverteilung nachgewiesen werden. Kürzlich wurden Patienten identifiziert, die eine missense-Mutation im NaV1.9 kodierenden SCN11A Gen tragen. Diese Patienten können keinerlei Schmerz empfinden und leiden zudem an Muskelschwäche in Kombination mit einer verzögerten motorischen Entwicklung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnten molekularbiologische Untersuchungen an Mäusen, welche die Mutation im orthologen Scn11a Gen tragen, zur Aufklärung des Krankheitsmechanismus beitragen. Die Kooperationsstudie zeigte, dass eine gesteigerte Funktion von NaV1.9 diese spezifische Kanalerkrankung auslöst, was die Wichtigkeit von NaV1.9 in menschlichen Motoneuronen unterstreicht. Eine frühere Studie beschrieb an hippocampalen Neuronen, dass die Rezeptortyrosinkinase tropomyosin receptor kinase B (TrkB) den NaV1.9 Kanal öffnen kann. Im Wachstumskegel von Motoneuronen ist TrkB nachweisbar und folglich in räumlicher Nähe zu NaV1.9 zu finden. Um zu prüfen, ob TrkB in die spontane Erregbarkeit von Motoneuronen involviert ist, wurden TrkB knock-out Mäuse untersucht. Isolierte Motoneurone von TrkB knock-out Mäusen weisen eine Reduktion der Spontanaktivität und eine Verringerung des Axonwachstums auf. Ob TrkB und NaV1.9 hierbei funktionell gekoppelt sind, ist Gegenstand künftiger Forschung. N2 - During development of the nervous system, spontaneous Ca2+ transients are observed that regulate the axon growth of motoneurons. This form of spontaneous neuronal activity is reduced in motoneurons from a mouse model of spinal muscular atrophy and this defect correlates with reduced axon elongation. Experiments from our group demonstrated that voltage-gated sodium channel pore blockers decrease spontaneous neuronal activity and axon growth in cultured motoneurons, too. In these experiments, saxitoxin was more potent than tetrodotoxin. We identified the saxitoxin-sensitive/tetrodotoxin-insensitive voltage-gated sodium channel NaV1.9 as trigger for the opening of voltage-gated calcium channels. In motoneurons, expression of NaV1.9 was verified via quantitative RT-PCR. Immuno labelling experiments revealed enrichment of the channel in axonal growth cones and at the nodes of Ranvier of isolated nerve fibres from wild type mice. Motoneurons from NaV1.9 knock-out mice show decreased spontaneous activity and reduced axonal elongation. This growth defect can be rescued by NaV1.9 overexpression. In motoneurons from Smn-deficient mice, NaV1.9 distribution appeared to be normal. Recently, patients carrying a missense mutation in the NaV1.9-encoding gene SCN11A were identified. These patients are not able to feel pain and suffer from muscular weakness and a delayed motor development. Molecular biological work during this dissertation supported the analysis of this mutation in a mouse model carrying the orthologous alteration in the Scn11a locus. The cooperation study confirmed that a gain-of-function mechanism underlies the NaV1.9-mediated channelopathy, thus suggesting a functional role of NaV1.9 in human motoneurons. An earlier study showed in hippocampal neurons that the receptor tyrosine kinase tropomyosin receptor kinase B (TrkB) can open the NaV1.9 channel. TrkB is localized in growth cones of motoneurons and subsequently found in close proximity to NaV1.9. In order to proof whether TrkB is involved in spontaneous excitability in motoneurons, TrkB knock-out mice were analysed. Isolated motoneurons from TrkB knock-out mice show a reduced spontaneous activity and axon elongation. It remains to be studied whether TrkB and NaV1.9 are functionally connected. KW - Motoneuron KW - Neurotrophic factors KW - NaV1.9 KW - motoneuron KW - spontaneous neuronal activity KW - Axon KW - Wachstum KW - Natriumkanal KW - TrkB Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-92877 ER - TY - THES A1 - Samtleben, Samira T1 - Investigation of homeostatic calcium fluxes in hippocampal neurons by means of targeted-esterase induced dye loading (TED) T1 - Untersuchung von homöostatischen Kalziumströmen in hippokampalen Neuronen mittels “targeted-esterase induced dye loading (TED)” N2 - Calcium ions can activate intracellular signalling cascades that control key functions in all types of neurons. These functions include neuronal excitability and excitation, synaptic plasticity, cell migration, transmitter release, gene transcription, and apoptosis. The major intracellular neuronal store for calcium is the endoplasmic reticulum (ER), a continuous and dynamic, membranous organelle that extends through all parts of neurons, from axons to dendrites. The calcium concentration in the ER is appr. one thousand fold higher than in the cytosol and this calcium gradient is built up by the sarco-/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump that pumps calcium from the cytosol into the ER. Despite detailed knowledge about various induced calcium signals within neurons, it was still elusive, how resting neurons maintain their ER calcium content at rest. In order to shed light on the calcium homeostasis at rest, the targeted-esterase induced dye loading (TED) technique was improved. TED allows the direct and non-disruptive visualization of ER calcium in presence of extracellular calcium, thus enabling to visualize the dynamic flow of ER calcium. TED is based on the overexpression of an ER-targeted mouse carboxylesterase. Inside the ER the carboxylesterase cleaves the acetoxymethyl ester calcium dye Fluo5N, AM, thereby converting this dye into a calcium sensitive, low-affinity, cell membrane impermeable calcium indicator that is trapped in the ER. When bound to calcium ions and excited by fluorescent light, its fluorescence intensity increases one hundredfold compared to the calcium-free state. It was observed that calcium withdrawal from resting neurons led to a rapid loss of calcium from both the ER and the cytosol, which recovered upon calcium re-addition. It was concluded that a strong calcium influx and efflux must exist under resting conditions that maintain a constant calcium concentration in neurons at rest. TED calcium imaging could visualize this resting calcium influx event. When the inhibitor of store-operated calcium entry (SOCE), SKF-96365, was acutely added to neurons an immediate decline in ER calcium levels was observed, whereas cytosolic calcium levels remained constant. Based on these findings, a novel calcium homeostasis model is proposed in which a strong SOCE-like calcium influx and a corresponding calcium efflux maintain the ER calcium levels at rest. These fluxes are adapted to disturbances in order to maintain a constant calcium level in resting neurons. This study visualizes for the first time the resting calcium flow into the ER. The calcium enters the neurons via a store-operated calcium entry-like mechanism, a form of calcium influx that was thought to be induced by signalling events. N2 - Kalzium kann intrazelluläre Signalkaskaden aktivieren und somit Schlüsselfunktionen in allen Typen von Neuronen kontrollieren. Diese Schlüsselfunktionen umfassen Zellmigration, Freisetzung von Neurotransmittern, synaptische Plastizität, Transkription von Genen und Apoptose. Der wichtigste Speicher für Kalzium in Neuronen ist das endoplasmatische Retikulum (ER); ein kontinuierliches, membranumschlossenes Zellorganell, das sich in alle Teile von Neuronen erstreckt, von Axonen bis zu Dendriten. Im ER ist die Kalziumkonzentration ca. eintausendmal höher als im Zytosol. Dieser Kalziumgradient wird von der sogenannten SERCA, der sarco-/endoplasmic reticulum calcium ATPase, Kalziumpumpe aufrechterhalten, die Kalziumionen aktiv vom Zytosol in das Innere des ER pumpt. Obwohl die einzelnen induzierten Kalziumsignalwege in Neuronen gut untersucht sind, war es lange nicht bekannt wie es Neuronen gelingt die hohe Kalziumkonzentration des ERs in Ruhe aufrechtzuerhalten. Um diese Frage zu klären wurde die sogenannte targeted-esterase induced dye loading (TED) Technik verbessert. TED ermöglicht es ER Kalzium direkt, in intakten Neuronen und in Gegenwart von extrazellulärem Kalzium sichtbar zu machen. Dadurch wird es möglich den Kalziumstrom des ERs direkt zu beobachten. TED beruht darauf, dass eine für das ER bestimmte Carboxylesterase der Maus überexprimiert wird, die sich im ER ansammelt. Im Inneren des ERs wandelt dieses Enzym den synthetischen Kalziumfarbstoff Fluo5N, AM um, der zur Gruppe der Acetoxymethyl-ester gehört. Dadurch wird aus diesem Farbstoff ein kalzium-sensitiver, niedrig-affiner Kalziumindikator, der nicht mehr permeabel für biologische Membranen ist und daher im ER verbleibt. In seiner Kalzium-gebunden Form erhöht sich die Fluoreszenz dieses Indikators einhundertfach im Vergleich zur Kalzium-ungebunden Form, wenn er durch Fluoreszenzlicht angeregt wird. Es wurde beobachtet, dass der Entzug von extrazellulärem Kalzium zu Verlust von Kalzium im ER und Zytosol von Neuronen führt. Bei Rückgabe des Kalziums erholt sich die Kalziumkonzentration wieder. Daraus wurde gefolgert, dass es bei Neuronen in Ruhe einen starken Einstrom und Ausstrom von Kalzium geben muss. Diese Ströme halten den Kalziumgehalt der Neurone konstant. Wenn SKF-96365, ein Inhibitor des sogenannten store-operated calcium entry (SOCE), akut auf die Neurone appliziert wurde, wurde sofort ein Abfall der ER Kalziumkonzentration beobachtet, wohingegen die Kalziumkonzentration des Zytosols gleich blieb. Aufgrund dieser Ergebnisse kann ein neues Kalziumhomöostase-Modell für Neurone vorgeschlagen werden: In ruhenden Neuronen halten ein starker SOCE-ähnlicher Kalziumeinstrom und ein entsprechender Kalziumausstrom den Kalziumgehalt des ERs aufrecht. Diese Ströme werden an Störungen angepasst um eine konstante Kalziumkonzentration zu erreichen. In dieser Studie wird zum ersten Mal der Ruhestrom von Kalzium in das ER sichtbar gemacht. Kalzium gelangt über einen store-operated calcium entry -ähnlichen Mechanismus in die Neurone. Bisher dachte man, dass diese Art von Kalziumeinstrom nur nach Aktivierung von Signalen stattfindet. KW - Calciumhomöostase KW - Nervenzelle KW - neuron KW - calcium homeostasis KW - calcium imaging KW - Calcium Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110332 ER - TY - THES A1 - Premachandran Nair, Anoop Chandran T1 - Identification and functional characterization of TGF-β inducible, immunosuppressive miRNAs in human CD8+ T cells T1 - Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von TGF-β induzierbaren, immunsuppressiven miRNAs in humanen CD8+ T Zellen N2 - While TGF-β is able to regulate miRNA expression in numerous cell types, TGF-β-dependent changes in the miRNA profile of CD8+ T cells had not been studied before. Considering that TGF-β suppresses CD8+ T cell effector functions in numerous ways, we wondered whether induction of immune-regulatory miRNAs could add to the known transcriptional effects of TGF-β on immune effector molecules. In this study, we used miRNA arrays, deep sequencing and qRT-PCR to identify miRNAs that are modulated by TGF-β in human CD8+ T cells. Having found that the TGF-β-dependent downregulation of NKG2D surface expression in NK cells and CD8+ T cells does not go along with a corresponding reduction in mRNA levels, this pathway appeared to be a possible target of TGF-β-inducible miRNAs. However, this hypothesis could not be confirmed by miRNA reporter assays. Instead, we observed that DAP10 transcription is suppressed by TGF-β which in turn negatively affects NKG2D surface expression. In spite of promising preliminary experiments, technical difficulties associated with the transfection of primary NK cells and NK cell lines unfortunately precluded the final proof of this hypothesis. Instead, we focused on the TGF-β-induced changes in the miRNome of CD8+ T cells and confirmed the induction of the miR-23a cluster members, namely miR-23a, miR-27a and miR-24 by three different techniques. Searching for potential targets of these miRNAs which could contribute to the immunosuppressive action of TGF-β in T cells, we identified and confirmed a previously unknown regulation of IFN-γ mRNA by miR-27a and miR-24. Newly generated miRNA reporter constructs further revealed that LAMP1 mRNA is a target of miR-23a. Upon modulation of the miR-23a cluster in CD8+ T cells by the respective miRNA antagomirs and mimics, significant changes in IFN-γ expression confirmed the functional relevance of our findings. Effects on CD107a/LAMP1 expression were, in contrast, rather minimal. Still, overexpression of the miR-23a cluster attenuated the cytotoxic activity of antigen-specific CD8+ T cells. Taken together, these functional data reveal that the miR-23a cluster not only is induced by TGF-β, but also exerts a suppressive effect on CD8+ T-cell effector functions, even in the absence of TGF-β signaling. N2 - Obwohl bekannt war, dass TGF- die miRNA Expression in zahlreichen Zelltypen moduliert, waren TGF- abhängige Veränderung des miRNA Profils in CD8+ T Zellen noch nicht untersucht worden. Da TGF-β die Effektorfunktionen von CD8+ T Zellen aber in vielfältiger Weise inhibiert, fragten wir uns, ob die transkriptionellen Effekte, die TGF-β bekanntermaßen auf Immuneffektormoleküle ausübt, noch durch die Induktion immunregulatorischer miRNAs ergänzt werden. Daher nutzten wir miRNA Arrays, Genomsequenzierungstechniken und Echtzeit-PCR um miRNAs zu identifizieren, welche in humane CD8+ T Zellen von TGF- moduliert werden. Die Beobachtung, dass die TGF--abhängige Herunterregulation der NKG2D Oberflächenexpression in Natürlichen Killerzellen und CD8+ T Zellen nicht mit einer entsprechenden Verringerung der mRNA Menge einhergeht, ließ zudem vermuten, dass dieser Signalweg über miRNAs reguliert werden könnte. Nach verschiedenen miRNA Reporterassays musste diese Hpothese jedoch verworfen werden. Stattdessen zeigte sich, dass TGF- die Transkription von DAP10 inhibiert was wiederum die Oberflächenexpression von NKG2D limitieren sollte. Trotz viel versprechender initialer Experimente scheiterte der letzgültige Beweis dieser Hypothese aber an der ungenügenden Transfizierbarkeit von primären NK Zellen sowie von NK Zelllinien. Daher konzentrierten wir uns im Weiteren auf die durch TGF- induzierten Veränderungen im miRNom von CD8+ T Zellen und konnten mit drei verschiedenen Techniken die Induktion des miR-23a Clusters (mit den einzelnen miRNAs miR-23a, miR-27a und miR-24) bestätigen. Auf der Suche nach potentiellen immunregulatorisch relevanten Zielgenen dieser miRNAs konnten wir erstmals eine Regulation von IFN- durch miR-27a und miR-24 nachweisen. Zu diesem Zweck generierte miRNA Reporterkonstrukte zeigten zudem, dass LAMP1 durch miR-23a reguliert wird. Nach Modulation des miR-23a Clusters durch die entsprechenden miRNA Antagomir und Surrogat-Konstrukte konnten wir auch in CD8+ T Zellen signifikante Veränderungen der IFN-γ Expression nachweisen und somit die funktionelle Relevanz unserer Befunde bestätigen. Die Effekte auf die Expression von CD107a/LAMP1 waren hingegen nur minimal. Trotzdem führte die Überexpression des miR-23a Clusters zu einer Verringerung der zytotoxischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T Zellen. Zusammen genommen belegen diese funktionellen Untersuchungen, dass das miRNA-23a Cluster, welches durch TGF-β induziert wird, zur Hemung der Effektorfunktionen in CD8+ T Zellen beiträgt, und zwar sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von TGF-β. KW - Transforming Growth Factor beta KW - Antigen CD8 KW - miRNS KW - Interferon KW - Immunsystem KW - miR-23a cluster KW - T cell cytotoxicity KW - Regulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109741 ER - TY - THES A1 - Weirather, Johannes T1 - Role of CD4+ T lymphocytes in cardiac wound healing and remodeling after experimental myocardial infarction in mice T1 - Die Bedeutung von CD4+ T-Lymphozyten für die kardiale Wundheilung und Remodeling nach experimentellem Herzinfarkt im Mausmodell N2 - Cardiac healing after myocardial infarction (MI) represents the cardinal prerequisite for proper replacement of the irreversibly injured myocardium. In contrast to innate immunity, the functional role of adaptive immunity in postinfarction healing has not been systematically addressed. The present study focused on the influence of CD4+ T lymphocytes on wound healing and cardiac remodeling after experimental myocardial infarction in mice. Both conventional and Foxp3+ regulatory CD4+ T cells (Treg cells) became activated in heart draining lymph nodes after MI and accumulated in the infarcted myocardium. T cell activation was strictly antigen-dependant as T cell receptor-transgenic OT-II mice in which CD4+ T cells exhibit a highly limited T cell receptor repertoire did not expand in heart-draining lymph nodes post-MI. Both OT-II and major histocompatibility complex class II-deficient mice lacking a CD4+ T cell compartment showed a fatal clinical postinfarction outcome characterized by disturbed scar tissue construction that resulted in impaired survival due to a prevalence of left-ventricular ruptures. To assess the contribution of anti-inflammatory Treg cells on wound healing after MI, the Treg cell compartment was depleted using DEREG mice that specifically express the human diphtheria toxin receptor in Foxp3-positive cells, resulting in Treg cell ablation after diphtheria toxin administration. In a parallel line of experiments, a second model of anti-CD25 antibody-mediated Treg cell immuno-depletion was used. Treg cell ablation prior to MI resulted in adverse postinfarction left-ventricular dilatation associated with cardiac deterioration. Mechanistically, Treg cell depletion resulted in an increased recruitment of pro-inflammatory neutrophils and Ly-6Chigh monocytes into the healing myocardium. Furthermore, Treg cell-ablated mice exhibited an adverse activation of conventional non-regulatory CD4+ and CD8+ T cells that showed a reinforced infiltration into the infarct zone. Increased synthesis of TNFα and IFNγ by conventional CD4+ and CD8+ T cells in hearts of Treg cell-depleted mice provoked an M1-like macrophage polarization characterized by heightened expression of healing-compromising induced NO synthase, in line with a reduced synthesis of healing-promoting transglutaminase factor XIII (FXIII), osteopontin (OPN) and transforming growth factor beta 1 (TGFβ1). Therapeutic Treg cell activation by a superagonistic anti-CD28 monoclonal antibody stimulated Treg cell accumulation in the infarct zone and led to an increased expression of mediators inducing an M2-like macrophage polarization state, i.e. interleukin-10, interleukin-13 and TGFβ1. M2-like macrophage differentiation in the healing infarct was associated with heightened expression of scar-forming procollagens as well as scar-stabilizing FXIII and OPN, resulting in improved survival due to a reduced incidence of left-ventricular ruptures. Therapeutic Treg cell activation and the induction of a beneficial M2-like macrophage polarization was further achieved by employing a treatment modality of high clinical potential, i.e. by therapeutic administration of IL-2/ anti-IL-2 monoclonal antibody complexes. The findings of the present study suggest that therapeutic Treg cell activation and the resulting improvement of healing may represent a suitable strategy to attenuate adverse infarct expansion, left-ventricular remodeling, or infarct ruptures in patients with MI. N2 - Die kardiale Wundheilung nach einem Herzinfarkt ist unabdingbare Voraussetzung um das unwideruflich beschädigte Myokard zu ersetzen. Im Gegensatz zur Rolle der angeborenen Immunität ist zur Bedeutung der adaptiven Immunität für die kardiale Wundheilung nur wenig bekannt. Im Fokus der Studie stand deshalb die Rolle von CD4+ T-Zellen bei der Wundheilung und kardialem Remodeling nach einem experimentellen Herzinfarkt im Mausmodell. Sowohl konventionelle, als auch Foxp3-positive regulatorische CD4+ T Zellen (Treg-Zellen) wurden im Lymphknoten infarzierter Tiere aktiviert und akkumulierten im Infarktareal. Die Aktivierung von CD4+ T Zellen nach MI setzte die Erkennung von Selbstantigenen voraus, da OT-II Tiere, die ein stark eingeschränktes T-Zell-Rezeptor-Repertoire aufweisen, keine T-Zell-Aktivierung zeigten. Sowohl OT-II Tiere, als auch Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Knock-out Mäuse, die kein CD4+ T-Zell Kompartment aufweisen, zeigten einen fatalen klinischen Phänotyp, welcher durch eine gestörte Narbenbildung und damit verbunden einem verstärkten Auftreten linksventrikulärer Rupturen verbunden war. Um den Einfluss anti-inflammatorischer Treg-Zellen auf die kardiale Wundheilung nach Herzinfarkt zu untersuchen, wurde das Treg-Zell Kompartment vor MI Induktion depletiert. Hierzu wurden DEREG Mäuse verwendet, in denen Foxp3-positive Zellen den humanen Diphtherietoxin-Rezeptor exprimieren, sodass nach nach Diphtierietoxin-Applikation die Treg-Zellen spezifisch depletiert werden. In einer dazu parallel verlaufenden Versuchsreihe wurden die Treg-Zellen mittels anti-CD25 monoklonaler Antikörper depletiert. Die Depletion des Treg-Zell Kompartments 2 Tage vor MI Induktion bewirkte ein verschlechtertes links-ventrikuläres Remodeling und damit einhergehend eine signifikante Verschlechterung der Herzfunktion. Mechanistisch führte die Treg-Zell Depletion zu einer verstärkten Rekrutierung pro-inflammatorischer Ly-6Chigh Monozyten und neutrophilen Granulozyten ins Infarktareal. Die Depletion von Treg-Zellen war weiterhin mit einer adversen Aktivierung konventioneller CD4+ und CD8+ T-Zellen assoziiert, die eine verstärkte Infiltration ins infarzierte Myokard zeigten. Die erhöhte Synthese von TNFα und IFNγ in konventionellen T-Zellen führte zu einer M1-Makrophagen Polarisierung, welche durch eine verstärkte Expression der induzierbaren NO Synthase charakterisiert war. Weiterhin exprimierten diese M1 Makrophagen signifikant weniger der für eine geordnete Heilung essentiellen Faktoren Osteopontin, Transglutaminase Faktor XIII und transforming growth factor beta 1 (TGFβ1). Im Gegensatz zu den Depletionsversuchen führte die therapeutische Aktivierung der Treg-Zellen durch einen superagonistischen anti-CD28 monoklonalen Antikörper zu einer verstärkten Rekrutierung von Treg-Zellen ins Infarktareal und bewirkte eine erhöhte Synthese von Interleukin (IL)-10, IL-13 sowie TGFβ1. Die damit einhergehende M2 Makrophagenpolarisierung im Infarktareal war mit einer verstärkten Narbenbildung sowie der Synthese von Osteopontin und Transglutaminase Faktor XIII verbunden, welche sich stabilisierend auf die Narbenbildung auswirken. Folgerichtig zeigten die behandelten Tiere ein verbessertes Überleben aufgrund einer signifikant verringerten Inzidenz linksventrikulärer Rupturen. Alternativ zum superagonistischen anti-CD28 monoklonalen Antikörper wurde ein weiterer klinisch relevanter Ansatz zur therapeutischen Aktivierung von Treg-Zellen verfolgt. Durch die Applikation von IL-2/ anti-IL-2 Antikörper-Komplexen konnte ebenfalls eine M2 Makrophagenpolarisierung hervorgerufen werden, die mit einer verstärkten Narbenbildung einherging. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie deuten darauf hin, dass eine therapeutische Aktivierung von Treg-Zellen bei Infarktpatienten und die dadurch hervorgerufene Verbesserung der Wundheilung potentiell einen geeigneten Ansatz darstellt, durch welchen adverses linksventrikuläres Remodeling sowie Infarktrupturen verhindert werden können. KW - Antigen CD4 KW - T-Lymphozyt KW - Herzinfarkt KW - Wundheilung KW - wound healing KW - Foxp3+CD4+ regulatory T cell KW - myocardial infarction KW - macrophage KW - Maus KW - Myokardinfarkt KW - T-Zelle KW - Makrophagen KW - Heilung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107225 ER - TY - THES A1 - Zancolli, Giulia T1 - Amphibian diversity along the slope of Mount Kilimanjaro: from species to genes T1 - Diversität von Amphibien im Höhengradienten des Mount Kilimanjaro: von Arten zu Genen N2 - 1. Since the early nineteenth century describing (and understanding) patterns of distribution of biodiversity across the Earth has represented one of the most significant intellectual challenges to ecologists and biogeographers. Among the most striking patterns of species richness are: the latitudinal and elevational gradients, with peaks in number of species at low latitudes and somewhere at mid altitudes, although other patterns, e.g. declines with increasing elevation, are often observed. Even in highly diverse tropical regions, species richness is not evenly distributed but there are “hotspots” of biodiversity where an exceptional number of species, especially endemics, are concentrated. Unfortunately, such areas are also experiencing dramatic loss of habitat. Among vertebrate taxa, amphibians are facing the most alarming number of extinctions. Habitat destruction, pollution and emergence of infectious diseases such as chytridiomycosis, are causing worldwide population declines. Responses to these drivers can be multidirectional and subtle, i.e. they may not be captured at the species but at the genetic level. Moreover, present patterns of diversity can result from the influence of past geological, climatic and environmental changes. In this study, I used a multidisciplinary and multilevel approach to understand how and to which extent the landscape influences amphibian diversity. Mount Kilimanjaro is an exceptional tropical region where the landscape is rapidly evolving due to land use changes; additionally, there is a broad lack of knowledge of its amphibian fauna. During two rainy seasons in 2011, I recorded anurans from the foothills to 3500 m altitude; in addition, I focused on two river frog species and collected tissue samples for genetic analysis and swabs for detection of chytridiomycosis, the deadly disease caused by Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). 2. I analyzed how species richness and composition change with increasing elevation and anthropogenic disturbance. In order to disentangle the observed patterns of species diversity and distribution, I incorporated inferences from historical biogeography and compared the assemblage of Mt. Kilimanjaro and Mt. Meru (both recent volcanoes) with those of the older Eastern Arc Mountains. Species richness decreased with elevation and locally increased in presence of water bodies, but I did not detect effects of either anthropogenic disturbance or vegetation structure on species richness and composition. Moreover, I found a surprisingly low number of forest species. Historical events seem to underlie the current pattern of species distribution; the young age of Mt. Kilimanjaro and the complex biogeographic processes which occurred in East Africa during the last 20 million years prevented montane forest frogs from colonizing the volcano. 3. I focused on the genetic level of biodiversity and investigated how the landscape, i.e. elevation, topographic relief and land cover, influence genetic variation, population structure and gene flow of two ecologically similar and closely related river frog species, namely Amietia angolensis and Amietia wittei. I detected greater genetic differentiation among populations in the highland species (A. wittei) and higher genetic variation in the lowland species (A. angolensis), although genetic diversity was not significantly correlated with elevation. Importantly, human settlements seemed to restrict gene flow in A. angolensis, whereas steep slopes were positively correlated with gene flow in A. wittei. This results show that even ecologically similar species can respond differently to landscape processes and that the spatial configuration of topographic features combined with species-specific biological attributes can affect dispersal and gene flow in disparate ways. 4. River frogs of the genus Amietia seem to be particularly susceptible to chytridiomycosis, showing the highest pathogen load in Kenya and other African countries. In the last study, I collected swab samples from larvae of A. angolensis and A. wittei for Bd detection. Both species resulted Bd-positive. The presence of Bd on Mt. Kilimanjaro has serious implication. For instance, Bd can be transported by footwear of hikers from contaminated water and soil. Tourists visiting Mt. Kilimanjaro may translocate Bd zoospores to other areas such as the nearby Eastern Arc Mts. where endemic and vulnerable species may still be naïve to the fungus and thus suffer of population declines. 5. My study significantly contributed to the knowledge of the amphibian fauna of Mt. Kilimanjaro and of East Africa in general, and it represents a valuable tool for future conservation actions and measures. Finally, it highlights the importance of using a multidisciplinary (i.e. community ecology, historical biogeography, landscape genetics, disease ecology) and multilevel (i.e. community, species, population, gene) approach to disentangle patterns of biodiversity. N2 - Seit Ende des 19. Jahrhunderts ist es eine der größten intellektuellen Herausforderungen für Ökologen und Biogeographen, die Verteilungsmuster der Biodiversität auf der Erde zu beschreiben und letztlich zu verstehen. Zu den auffälligsten Mustern des Artenreichtums gehören die Gradienten, die sich in Abhängigkeit von der geographischer Breite und der Höhe über dem Meeresspiegel ergeben. Dabei treten Maxima der Artenzahl in den niederen Breiten und stellenweise in mittleren Höhenregionen auf; es lassen sich aber auch andere Muster beobachten, z.B. eine Abnahme der Artenzahl mit zunehmender Höhe. Selbst in den hochdiversen Tropen sind Arten nicht gleichmäßig verteilt. So gibt es sog. „hotspots“ der Biodiversität mit einer außergewöhnlich großen Zahl von Arten (meist Endemiten). Gerade diese Regionen sind es, die heute dramatische 1. Seit Ende des 19. Jahrhunderts ist es eine der größten intellektuellen Herausforderungen für Ökologen und Biogeographen, die Verteilungsmuster der Biodiversität auf der Erde zu beschreiben und letztlich zu verstehen. Zu den auffälligsten Mustern des Artenreichtums gehören die Gradienten, die sich in Abhängigkeit von der geographischer Breite und der Höhe über dem Meeresspiegel ergeben. Dabei treten Maxima der Artenzahl in den niederen Breiten und stellenweise in mittleren Höhenregionen auf; es lassen sich aber auch andere Muster beobachten, z.B. eine Abnahme der Artenzahl mit zunehmender Höhe. Selbst in den hochdiversen Tropen sind Arten nicht gleichmäßig verteilt. So gibt es sog. „hotspots“ der Biodiversität mit einer außergewöhnlich großen Zahl von Arten (meist Endemiten). Gerade diese Regionen sind es, die heute dramatische Habitatverluste verzeichnen. Unter den Wirbeltieren sind es die Amphibien, die dabei die höchsten Aussterberaten aufweisen. Ihre Populationen gehen weltweit zurück, wofür neben Lebensraumzerstörung auch Umweltverschmutzung und die Ausbreitung von Infektionskrankheiten, z.B. Chytridiomykose, verantwortlich sind. Reaktionen auf solche Faktoren können vielschichtig sein und fast unmerklich bleiben, was bedeutet, dass sie nicht auf Artniveau, sondern nur auf genetischer Ebene erfasst werden können. Hinzu kommt, dass die aktuellen Muster der Biodiversität auf den Einfluss vergangener Veränderungen hinsichtlich Geologie, Klima und Umwelt zurückgeführt werden können ... KW - Kilimandscharo KW - biodiversity KW - Amphibien KW - Lurche KW - Biodiversität KW - Vielfalt Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91792 ER - TY - THES A1 - Werner, Christian T1 - Effect of autoantibodies targeting amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 on synaptic transmission of GABAergic neurons T1 - Einfluss von Autoantikörpern gegen Amphiphysin oder Glutamatdecarboxylase 65 auf synaptische Transmission GABAerger Neurone N2 - The number of newly detected autoantibodies (AB) targeting synaptic proteins in neurological disorders of the central nervous system (CNS) is steadily increasing. Direct interactions of AB with their target antigens have been shown in first studies but the exact pathomecha-nisms for most of the already discovered AB are still unclear. The present study investigates pathophysiological mechanisms of AB-fractions that are associated with the enigmatic CNS disease Stiff person syndrome (SPS) and target the synaptically located proteins amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 (GAD65). In the first part of the project, effects of AB to the presynaptic endocytic protein amphiphysin were investigated. Ultrastructural investigations of spinal cord presynaptic boutons in an es-tablished in-vivo passive-transfer model after intrathecal application of human anti-amphiphysin AB showed a defect of endocytosis. This defect was apparent at high synaptic activity and was characterized by reduction of the synaptic vesicle pool, clathrin coated vesi-cles (CCVs), and endosome like structures (ELS) in comparison to controls. Molecular inves-tigation of presynaptic boutons in cultured murine hippocampal neurons with dSTORM microscopy after pretreatment with AB to amphiphysin revealed that marker proteins involved in vesicle exocytosis (synaptobrevin 2 and synaptobrevin 7) had an altered expression in GA-BAergic presynapses. Endophilin, a direct binding partner of amphiphysin also displayed a disturbed expression pattern. Together, these results point towards an anti-amphiphysin AB-induced defective organization in GABAergic synapses and a presumably compensatory rearrangement of proteins responsible for CME. In the second part, functional consequences of SPS patient derived IgG fractions containing AB to GAD65, the rate limiting enzyme for GABA synthesis, were investigated by patch clamp electrophysiology and immunohistology. GABAergic neurotransmission at low and high activity as well as short term plasticity appeared normal but miniature synaptic potentials showed an enhanced frequency with constant amplitudes. SPS patient IgG after preabsorption of GAD65-AB using recombinant GAD65 still showed specific synaptic binding to neu-rons and brain slices supporting the hypothesis that additional, not yet characterized AB are present in patient IgG responsible for the exclusive effect on frequency of miniature potentials. In conclusion, the present thesis uncovered basal pathophysiological mechanisms underlying paraneoplastic SPS induced by AB to amphiphysin leading to disturbed presynaptic architec-ture. In idiopathic SPS, the hypothesis of a direct pathophysiological role of AB to GAD65 was not supported and additional IgG AB are suspected to induce distinct synaptic malfunction. N2 - Die Anzahl neu charakterisierter Autoantikörper (AAK) gegen synaptische Proteine bei Er-krankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist stetig wachsend. Direkte Interaktionen der AAK mit ihren Zielantigenen konnten in ersten Studien belegt werden, jedoch besteht weiterhin Unklarheit über die exakten zugrunde liegenden Pathomechanismen. In der vorliegenden Arbeit wurden pathophysiologische Mechanismen von AAK gegen die synaptisch lokalisierten Proteine Amphiphysin und Glutamatdecarboxylase 65 (GAD65) untersucht, die mit der ZNS Erkrankung Stiff Person Syndrom (SPS) assoziiert sind. Im ersten Projektteil wurden die Effekte von AAK gegen das Endozytoseprotein Amphiphysin analysiert: in einem etablierten in-vivo Tiermodell konnten nach intrathekalem passiven Transfer von AAK gegen Amphiphysin ultrastrukturelle Untersuchungen von präsynaptischen Terminalen im Rückenmark eine Störung der Endozytose aufzeigen. Dieser Defekt, der bei hoher synaptischer Aktivität eintrat, war durch eine Verminderung synaptischen Vesikelpools, Clathrin-ummantelter Vesikel und endosomähnlicher Strukturen charakterisiert. Molekulare Untersuchungen präsynaptischer Terminale kultivierter hippokampaler Zellkulturen mit dSTORM Mikroskopie zeigten, dass an der Exozytose beteiligte synaptische Vesikelproteine (Synaptobrevin 2 und Synaptobrevin 7) ein verändertes Expressionsmuster innerhalb GA-BAerger Synapsen aufweisen. Die Expression von Endophilin, einem direkten Bindungs-partner von Amphiphysin, war ebenso verändert. Zusammengefasst weisen diese Ergebnis-se auf einen Organisationsdefekt GABAerger Synapsen hin, die durch anti-Amphiphysin AAK induziert sind und eine kompensatorische Umverteilung von Endozytoseproteinen vermuten lassen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die funktionellen Effekte von SPS AAK gegen GAD65, dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der GABA-Synthese, mittels Patch-Clamp Mes-sungen und Immunhistologie untersucht. Die GABAerge synaptische Übertragung bei niedri-ger als auch hoher synaptischer Aktivität sowie die synaptische Kurzzeitplastizität wurden durch die IgG Fraktionen mit GAD65-AAK nicht beeinträchtigt. Die Frequenz von GABAergen Miniaturpotentialen war jedoch bei ansonsten gleichbleibender Amplitude erhöht. SPS-Patienten-IgG zeigte allerdings auch nach Präabsorbtion von GAD65-AAK mit Hilfe von rekombinanten GAD65 eine spezifische Anfärbung neuronaler Synapsen, was die Hypothese von weiteren, funktionell wirksamen, aber noch nicht identifizierten AAK im Patienten-IgG unterstützt. Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit grundlegende pathophysiologische Mechanismen aufgezeigt werden, wie pathogene Antikörper gegen Amphiphysin die Struktur präsynaptischer Boutons beeinträchtigen können. Im Falle des idiopathischen SPS konnte keine unterstützenden Befunde für die Hypothese einer direkten pathophysiologischen Rolle von GAD65 AAK erhoben werden. Nach den vorliegenden Ergebnissen wird das Vorhandensein weiterer, derzeit noch nicht beschriebener IgG AAK postuliert, die die synaptische Fehlfunktion erklären können. KW - Autoaggressionskrankheit KW - Zentralnervensystem KW - Stiff person syndrome KW - autoimmunity KW - glutamate decarboxylase 65 KW - amphiphysin KW - Synapse KW - Glutamat-Decarboxylase KW - Autoimmunität KW - Endocytose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105648 ER - TY - THES A1 - Meule, Adrian T1 - Food craving as a central construct in the self-regulation of eating behavior T1 - Craving nach Nahrungsmitteln als zentrales Konstrukt bei der Selbst-Regulation des Essverhaltens N2 - Background: Food craving refers to an intense desire to consume a specific kind of food of which chocolate is the most often craved one. It is this intensity and specificity that differentiates food craving from feelings of hunger. Although food craving and hunger often co-occur, an energy deficit is not a prerequisite for experiencing food craving, that is, it can also occur without being hungry. Food craving often precedes and predicts over- or binge eating which makes it a reasonable target in the treatment of eating disorders or obesity. One of the arguably most extensively validated measures for the assessment of food craving are the Food Cravings Questionnaires (FCQs), which measure food craving on a state (FCQ-S) and trait (FCQ-T) level. Specifically, the FCQ-S measures the intensity of current food craving whereas the FCQ-T measures the frequency of food craving experiences in general. The aims of the present thesis were to provide a German measure for the assessment of food craving and to investigate cognitive, behavioral, and physiological correlates of food craving. For this purpose, a German version of the FCQs was presented and its reliability and validity was evaluated. Using self-reports, relationships between trait food craving and dieting were examined. Cognitive-behavioral correlates of food craving were investigated using food-related tasks assessing executive functions. Psychophysiological correlates of food craving were investigated using event-related potentials (ERPs) in the electroencephalogram and heart rate variability (HRV). Possible intervention approaches to reduce food craving were derived from results of those studies. Methods: The FCQs were translated into German and their psychometric properties and correlates were investigated in a questionnaire-based study (articles #1 & #2). The relationship between state and trait food craving with executive functioning was examined with behavioral tasks measuring working memory performance and behavioral inhibition which involved highly palatable food-cues (articles #3 & #4). Electrophysiological correlates of food craving were tested with ERPs during a craving regulation task (article #5). Finally, a pilot study on the effects of HRV-biofeedback for reducing food craving was conducted (article #6). Results: The FCQs demonstrated high internal consistency while their factorial structure could only partially be replicated. The FCQ-T also had high retest-reliability which, expectedly, was lower for the FCQ-S. Validity of the FCQ-S was shown by positive relationships with current food deprivation and negative affect. Validity of the FCQ-T was shown by positive correlations with related constructs. Importantly, scores on the subscales of the FCQ-T were able to discriminate between non-dieters and successful and unsuccessful dieters (article #1). Furthermore, scores on the FCQ-T mediated the relationship between rigid dietary control strategies and low dieting success (article #2). With regard to executive functioning, high-calorie food-cues impaired working memory performance, yet this was independent of trait food craving and rarely related to state food craving (article #3). Behavioral disinhibition in response to high-calorie food-cues was predicted by trait food craving, particularly when participants were also impulsive (article #4). Downregulation of food craving by cognitive strategies in response to high-calorie food-cues increased early, but not later, segments of the Late Positive Potential (LPP) (article #5). Few sessions of HRV-biofeedback reduced self-reported food cravings and eating and weight concerns in high trait food cravers (article #6). Conclusions: The German FCQs represent sound measures with good psychometric properties for the assessment of state and trait food craving. Although state food craving increases during cognitive tasks involving highly palatable food-cues, impairment of task performance does not appear to be mediated by current food craving experiences. Instead, trait food craving is associated with low behavioral inhibition in response to high-calorie food-cues, but not with impaired working memory performance. Future studies need to examine if trait food craving and, subsequently, food-cue affected behavioral inhibition can be reduced by using food-related inhibition tasks as a training. Current food craving and ERPs in response to food-cues can easily be modulated by cognitive strategies, yet the LPP probably does not represent a direct index of food craving. Finally, HRV-biofeedback may be a useful add-on element in the treatment of disorders in which food cravings are elevated. To conclude, the current thesis provided measures for the assessment of food craving in German and showed differential relationships between state and trait food craving with self-reported dieting behavior, food-cue affected executive functioning, ERPs and HRV-biofeedback. These results provide promising starting points for interventions to reduce food craving based on (1) food-cue-related behavioral trainings of executive functions, (2) cognitive craving regulation strategies, and (3) physiological parameters such as HRV-biofeedback. N2 - Hintergrund: Craving nach Essen bezeichnet ein starkes Verlangen ein bestimmtes Nahrungsmittel zu konsumieren, welches sich meist auf Schokolade bezieht. Diese Intensität und Spezifität unterscheidet Craving nach Nahrungsmitteln von generellen Hungergefühlen. Obwohl Craving und Hunger häufig Hand in Hand gehen, ist ein Energiedefizit keine Voraussetzung dafür, Craving zu erleben; das bedeutet, es kann ebenfalls auftreten, obwohl man nicht hungrig ist. Craving geht häufig Überessen oder Essanfällen voraus, was es zu einem plausiblen Ansatzpunkt in der Therapie von Essstörungen und Adipositas macht. Eines der wohl am umfangreichsten validierten Maße zur Erfassung von Craving nach Nahrungsmitteln sind die Food Cravings Questionnaires (FCQs), die Craving als momentanen Zustand (engl. state, FCQ-S) und überdauerndes Merkmal (engl. trait, FCQ-T) erfassen. Genauer gesagt misst der FCQ-S die Intensität von aktuellem Craving nach Nahrungsmitteln, während der FCQ-T die Häufigkeit des Erlebens von Craving im Allgemeinen erfasst. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren die Bereitstellung eines deutschen Fragebogens zur Erfassung von Craving nach Nahrungsmitteln und die Untersuchung von kognitiven, behavioralen, und physiologischen Korrelaten von Craving. Hierfür wurde eine deutsche Version der FCQs präsentiert und deren Reliabilität und Validität überprüft. Zusammenhänge zwischen der Häufigkeit des Erlebens von Craving und Diätverhalten wurden mit Selbstberichtsfragebögen getestet. Kognitiv-behaviorale Korrelate von Craving wurden anhand von essensbezogenen Aufgaben zur Erfassung von exekutiven Funktionen untersucht. Psychophysiologische Korrelate von Craving wurden anhand von ereigniskorrelierten Potentialen (EKPs) im Elektroenzephalogramm und der Herzratenvariabilität (HRV) erforscht. Mögliche Interventionsansätze zur Reduktion von Craving wurden aus den Ergebnissen dieser Studien abgeleitet. Methoden: Die FCQs wurden auf Deutsch übersetzt und deren psychometrische Eigenschaften und Korrelate wurden in einer Fragebogenstudie untersucht (Artikel #1 & #2). Der Zusammenhang zwischen momentanem und habituellem Craving mit exekutiven Funktionen wurde anhand von behavioralen Aufgaben zur Erfassung der Arbeitsgedächtnisleistung und Verhaltenshemmung, die sehr schmackhafte Essensreize enthielten, überprüft (Artikel #3 & #4). Elektrophysiologische Korrelate von Craving wurden mit Hilfe von EKPs während einer Aufgabe zur Regulation von Craving getestet (Artikel #5). Schließlich wurde eine Pilotstudie zu den Effekten von HRV-Biofeedback zur Reduktion von Craving durchgeführt (Artikel #6). Ergebnisse: Die FCQs zeigten eine sehr hohe interne Konsistenz, wohingegen deren Faktorenstruktur nur teilweise repliziert werden konnte. Der FCQ-T hatte außerdem eine hohe Retest-Reliabilität, welche erwartungsgemäß geringer für den FCQ-S ausfiel. Validität des FCQ-S zeigte sich durch positive Zusammenhänge mit aktueller Essensdeprivation und momentaner negativer Stimmung. Validität des FCQ-T zeigte sich durch positive Korrelationen mit verwandten Konstrukten. Zudem konnte anhand der Subskalen des FCQ-T zwischen nicht-diäthaltenden und erfolgreichen und erfolglosen diäthaltenden Personen diskriminiert werden (Artikel #1). Weiterhin zeigte sich, dass der Zusammenhang zwischen rigiden Diätstrategien und geringem Diäterfolg durch Werte des FCQ-T vermittelt wurde (Artikel #2). Bezüglich der exekutiven Funktionen ergab sich, dass die Arbeitsgedächtnisleistung durch das darbieten von hochkalorischen Essensreizen vermindert wurde, allerdings war dies unabhängig von habituellem Craving und stand kaum mit momentanem Craving in Verbindung (Artikel #3). Häufiges Erleben von Craving konnte dahingegen eine behaviorale Enthemmung als Reaktion auf hochkalorische Essensreize vorhersagen, insbesondere wenn die Teilnehmer ebenfalls eine hohe Impulsivität berichteten (Artikel #4). Die Herunterregulierung von Craving während der Präsentation hochkalorischer Essensreize mit Hilfe kognitiver Strategien führte zu einer Erhöhung von früheren, nicht jedoch von späteren, Abschnitten des Late Positive Potential (LPP) (Artikel #5). Bereits wenige Übungssitzungen von HRV-Biofeedback resultierten in einer Reduktion selbstberichteter Cravings sowie essens- und gewichtsbezogener Sorgen bei Menschen mit häufigem Erleben von Cravings (Artikel #6). Schlussfolgerungen: Die deutschen FCQs stellen brauchbare Maße mit guten psychometrischen Eigenschaften zur Erfassung von Craving auf aktueller und habitueller Ebene dar. Obwohl momentanes Craving während kognitiven Aufgaben, die sehr schmackhafte Essensreize beinhalten, ansteigt, scheint eine Verminderung der Aufgabenleistung nicht durch das momentane Erleben solcher Cravings vermittelt zu sein. Habituelles Erleben von Craving ist dahingegen mit einer geringen Inhibitionsleistung auf hochkalorische Essensreize assoziiert, allerdings nicht mit einer eingeschränkten Arbeitsgedächtnisleistung. Zukünftige Studien sollten sich der Frage widmen, ob häufiges Erleben von Craving, und entsprechend auch der Einfluss von Essensreizen auf die Verhaltenshemmung, durch essensbezogene Inhibitionstrainings reduziert werden kann. Momentanes Craving und EKPs während der Präsentation von Essensreizen können leicht durch kognitive Strategien moduliert werden. Die LPP stellt hier wohl allerdings kein direktes Maß des Erlebens von Craving dar. Zu guter Letzt könnte HRV-Biofeedback ein nützliches, zusätzliches Therapieelement bei Störungen, die mit häufigem und intensivem Craving nach Nahrungsmitteln einhergehen, darstellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Arbeit Instrumente zur Erfassung von Craving nach Nahrungsmitteln im deutschen Sprachraum bereitgestellt hat und differenzielle Zusammenhänge zwischen momentanem und habituellem Craving mit selbstberichtetem Diätverhalten, durch Essensreize beeinträchtige exekutive Funktionen, EKPs und HRV-Biofeedback, aufgezeigt wurden. Diese Ergebnisse stellen vielversprechende Ansatzpunkte für Interventionen zur Reduktion von Craving nach Nahrungsmitteln dar, die auf (1) essensbezogenen Verhaltenstrainings der exekutiven Funktionen, (2) kognitiven Craving-Regulationsstrategien, und (3) physiologischen Parametern wie beispielsweise HRV-Biofeedback, basieren. KW - Craving KW - Essgewohnheit KW - Nahrung KW - food craving KW - Heißhunger KW - eating behavior KW - self-regulation KW - Essverhalten KW - Selbstregulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104597 ER - TY - THES A1 - Hertlein, Tobias T1 - Visualization of Staphylococcus aureus infections and antibiotic therapy by bioluminescence and 19F magnetic resonance imaging with perfluorocarbon emulsions T1 - Darstellung von Staphylococcus aureus Infektionen und Antibiotikatherapie durch Biolumineszenzbildgebung und 19F-Kernspintomografie mit Perfluorcarbon-Emulsionen N2 - Staphylococcus aureus is a major threat to public health systems all over the globe. This second most cause of nosocomial infections is able to provoke a wide variety of different types of infection in humans and animals, ranging from superficial skin and skin structure infections to invasive disease like sepsis or pneumonia. But not enough, this pathogen is also notorious in acquiring and/or developing resistance to antimicrobial compounds, thus limiting available treatment options severely. Therefore, development of new compounds and strategies to fight S. aureus is of paramount importance. But since only 1 out of 5 compounds, which entered clinical trials, becomes a drug, the preclinical evaluation of promising compounds has to be reconsidered, too. The aim of this thesis was to address both sides of this problem: first, to improve preclinical testing by incorporating in vivo imaging technologies to the preclinical testing procedure in order to acquire additional and clearer data about efficacy of promising compounds and second, by evaluating lysostaphin, which is a promising, new option to fight S. aureus infections. The first aim of this thesis focused on the establishment of a dual modality in vivo imaging platform, consisting of Bioluminescence Imaging (BLI) and Magnetic Resonance Imaging (MRI), to offer detailed insights into the course and gravity of S. aureus infection in the murine thigh infection model. Since luciferase-expressing S. aureus strains were generated in former studies and enabled thus bioluminescence imaging of bacterial infection, this technology should be implemented into the compound evaluation platform in order to non-invasively track the bacterial burden over time. MRI, in contrast, was only rarely used in earlier studies to visualize and measure the course of infection or efficacy of anti-bacterial therapy. Thus, the first set of experiments was performed to identify benefits and drawbacks of visualizing S. aureus infections in the mouse model by different MR methods. Native, proton-based MR imaging showed in this regard increased T2 relaxation times in the infected thigh muscles, but it was not possible to define a clear border between infected and uninfected tissue. Iron oxide nanoparticles and perfluorocarbon emulsions, two MR contrast agents or tracer, in contrast, offered this distinction. Iron oxide particles were detected in this regard by their distortion of 1H signal in proton-based MRI, while perfluorocarbon emulsion was identified by 19F MRI. Mammals do not harbor sufficient intrinsic amounts of 19F to deliver specific signal and therefore, 19F MR imaging visualizes only the signal of administered perfluorocarbon emulsion. The in vivo accumulation of perfluorocarbon emulsion can be imaged by 19F MRI and overlayed on a simultaneously acquired 1H MR image, which shows the anatomical context in clear detail. Since this is advantageous compared to contrast agent based MR methods like iron oxide particle-based MRI, further experiments were performed with perfluorocarbon emulsions and 19F MRI. Experimental studies to elucidate the accumulation of perfluorocarbon emulsion at the site of infection showed robust 19F MR signals after administration between day 2 and at least day 8 p.i.. Perfluorocarbon emulsion accumulated in all investigated mice in the shape of a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and the signal remained stable as long as the infection prevailed. In order to identify the mechanism of accumulation, flow cytometry, cell sorting and histology studies were performed. Flow cytometry and cell sorting analysis of immune cells at the site of infection showed that neutrophils, monocytes, macrophages and dendritic cells carried contrast media at the site of infection with neutrophils accounting for the overwhelming portion of perfluorocarbon signal. In general, most of the signal was associated with immune cells, thus indicating specific immune cell dependent accumulation. Histology supported this observation since perfluorocarbon emulsion related fluorescence could only be visualized in close proximity to immune cell nuclei. After establishing and testing of 19F MRI with perfluorocarbon emulsions as infection imaging modality, the effects of antibiotic therapy upon MR signal was investigated in order to evaluate the capability of this modality for preclinical testing procedure. Thus, the efficacy of vancomycin and linezolid, two clinically highly relevant anti - S. aureus compounds, were tested in the murine thigh infection model. Both of them showed reduction of the colony forming units and bioluminescence signal, but also of perfluorocarbon emulsion accumulation strength and volume at the site of infection, which was visualized and quantified by 19F MRI. The efficacy pattern with linezolid being more efficient in clearing bacterial infection was shown similarly by all three methods. In consequence, 19F MRI with perfluorocarbon emulsion as MR tracer proved to be capable to visualize antibacterial therapy in preclinical testing models. The next step was consequently to evaluate a promising new compound against S. aureus infections. Thus, lysostaphin, an endo-peptidase that cleaves the cell wall of S. aureus, was tested in different concentrations alone or in combination with oxacillin for efficacy in murine thigh and catheter associated infection models. Lysostaphin only in the concentration of 5 mg/kg body weight or combined with oxacillin in the concentration of 2 mg/kg showed strong reduction of bacterial burden by colony forming unit determination and bioluminescence imaging in both models. The perfluorocarbon accumulation was investigated in the thigh infection model by 19F MRI and was strongly reduced in terms of volume and signal strength in both above-mentioned groups. In general, lysostaphin showed comparable or superior efficacy than vancomycin or oxacillin alone. Therefore, further development of lysostaphin for the treatment of S. aureus infections is recommended by these experiments. Overall, the antibiotic efficacy pattern of all applied antibiotic regimens was similar with all three applied methods, demonstrating the usefulness of MRI for antibiotic efficacy testing. Importantly, treatment with oxacillin either alone or in combination with lysostaphin resulted in stronger perfluorocarbon emulsion accumulation at the site of infection than expected compared to the results from bioluminescence imaging and colony forming unit determination. This might be an indication for immunomodulatory properties of oxacillin. Further murine infection experiments demonstrated in this context a differential release of cytokine and chemokines in the infected thigh muscle in dependence of the applied antibacterial therapy. Especially treatment with oxacillin, but to a less degree with minocycline or linezolid, too, exhibited high levels of various cytokines and chemokines, although they reduced the bacterial burden efficiently. In consequence, possible immunomodulatory effects of antibacterial compounds have to be taken into account for future applications of imaging platforms relying on the visualization of the immune response. However, this observation opens a new field for these imaging modalities since it might be extraordinary interesting to study the immunomodulatory effects of compounds or even bacterial factors in vivo. And finally, a two modality imaging platform which combines methods to visualize on the one hand the bacterial burden and on the other hand the immune response offers an innovative, new platform to study host-pathogen interaction in vivo in a non-invasive fashion. In summary, it could be shown that perfluorocarbon emulsions accumulate in immune cells at the site of infection in the murine S. aureus thigh infection model. The accumulation pattern shapes a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and its size and perfluorocarbon content is dependent on the severity of disease and/or efficacy of antibiotic therapy. Thus, 19F MRI with perfluorocarbon emulsions is a useful imaging modality to visualize sites and course of infection as well as to evaluate promising antibacterial drug candidates. Furthermore, since the accumulation of tracer depends on immune cells, it might be additionally interesting for studies regarding the immune response to infections, auto-immune diseases or cancer, but also to investigate the efficacy of immunomodulatory compounds and immunization. N2 - Staphylococcus aureus ist als zweithäufigste Ursache nosokomialer Infektionen eine ernste Bedrohung für Gesundheitssysteme weltweit. Dieses Pathogen ist in der Lage eine Vielzahl verschiedener Krankheitsformen, von oberflächlichen Wund- und Gewebsinfektionen bis hin zu invasiven Erkrankungen wie Bakteriämie oder Pneumonie, in Mensch und Tier zu verursachen. Zudem erwies sich dieser Krankheitserreger in der Vergangenheit als höchst anpassungsfähig durch den Erwerb oder die Entwicklung von Resistenzen gegenüber antibakterieller Substanzen, wodurch die Verfügbarkeit wirksamer Therapiemöglichkeiten drastisch eingeschränkt wurde. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Antibiotika und Behandlungsstrategien gegen S. aureus Infektionen von enormem gesellschaftlichem Interesse. Da aber lediglich eine von fünf Substanzen, die in klinische Studien eintreten, später als Medikament zugelassen wird, sollte die präklinische Evaluierung neuer, vielversprechender Therapeutika ebenso verbessert und überdacht werden. Diese Doktorarbeit addressiert in diesem Zusammenhang beide Facetten: zum einen wurde durch Einbeziehung von in vivo Bildgebungstechnologien ein deutlicheres Bild von der Effizienz neuer Substanzen während der präklinischen Evaluierung ermöglicht, zum anderen wurde mit Lysostaphin eine neuartige Substanzklasse zur Behandlung von S. aureus Infektionen getestet. Primärziel dieser Arbeit war deshalb die Entwicklung und Etablierung einer dualen Bildgebungsplattform bestehend aus Biolumineszenz- (BLI) und Kernspintomografischer (MRI) Bildgebung, um detaillierte Einblicke in Verlauf und Schwere von S. aureus Infektionen im Muskelinfektionsmodell der Maus zu ermöglichen. Die Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen wurde durch die Entwicklung von Luziferase-exprimierenden S. aureus Stämmen bereits in früheren Arbeiten ermöglicht und wurde in die Bildgebungsplatform integriert, um die Entwicklung der Bakterienlast nicht-invasiv verfolgen zu können. Kernspintomografie wurde in früheren Arbeiten hingegen kaum zur Darstellung der Effizienz anti-bakterieller Therapien während der Präklinik verwendet. Aus diesem Grund dienten die ersten Experimente zur Erkennung von Vor- und Nachteilen der Darstellung von S. aureus Infektionen im Tiermodell durch verschiedene Kernspintomografische Bildgebungsmethoden. Native, Protonen-basierte Kernspintomografie wies verlängerte T2 Relaxationszeiten im infizierten Muskelgewebe nach, doch eine klare Eingrenzung des infizierten Bereiches war nicht möglich. Die Anwendung von Eisenoxid und Perfluorcarbon Nanopartikeln, zwei Kontrastmittel zur Kernspintomografie, ermöglichte ebendiese. Eisenoxid Nanopartikel wurden durch ihren Signalstöreffekt auf das MR Protonensignal detektiert, während Perfluorcarbon Emulsionen durch 19F basierte Kernspintomografie nachgewiesen wurden. Säugetiere verfügen nicht über ausreichende Mengen von 19F Atomen, um ein spezifisches Signal zu liefern, weshalb 19F Kernspintomografie lediglich applizierte Perfluorcarbon Emulsion in vivo abbilden kann. Dieses Bild kann dann über ein zugleich aufgenommenes Protonen MR Bild gelegt werden, wodurch die Akkumulation des Kontrastmittels im Detail in anatomischer Umgebung dargestellt werden kann. Da es sich hierbei um einen Vorteil gegenüber anderen Kontrastmittel-basierten MR Bildgebungsmethoden wie Eisenoxid Nanopartikel gestützter Kernspintomografie handelt, wurden nachfolgende Experimente mit Perfluorcarbon Emulsionen durchgeführt. Studien zur Bildgebung der Perfluorcarbon Akkumulation am Infektionsherd des Muskelabszessmodels von S. aureus in der Maus zeigten deutliches 19F MR Signal nach Gabe zwischen Tag 2 und Tag 8 p.i.. In allen untersuchten Tieren zeigte sich eine Ansammlung des Kontrastmittels in Form einer Hohlkugel um den Abszessbereich, wobei das Signal während der gesamten Infektion stabil war. Um den Akkumulationsmechanismus zu identifizieren, wurden Durchflusszytometrie-, Zellseparations- und histologische Experimente durchgeführt. In diesem Zusammenhang erwiesen sich Neutrophile, Makrophagen, Monozyten und Dendritische Zellen als Perfluorcarbon-tragende Immunzelltypen, wobei das Gros an Kontrastmittel in Neutrophilen nachgewiesen werden konnte. Im Allgemeinen war der Großteil des Perfluorcarbonsignals mit Immunzellen assoziert, weshalb eine spezifische Immunzell-abhängige Akkumulation wahrscheinlich erscheint. Die histologischen Untersuchungen stützten diese Beobachtung, da die Kontrastmittel assoziierten Fluoreszenzmarker nur in der Nähe von Immunzellnuclei gefunden werden konnten. Die Etablierung von 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als Infektionsbildgebungsmethode ermöglichte im nächsten Schritt die Untersuchung von antibakterieller Therapie auf das MR Signal, um die Eignung dieser Methode für die Präklinik zu evaluieren. Deshalb wurden die Wirksamkeit von Vancomycin und Linezolid, zweier klinisch höchst relevanter Antibiotika zur Behandlung von S. aureus Infektionen, im Muskelabszessmodel der Maus untersucht. Beide erwiesen sich als effizient in der Verringerung der bakteriellen Last im infizierten Muskel und des Bakterien-Biolumineszenzsignals, aber auch bei der Reduktion der Stärke und des Volumens der Perfluorcarbon Akkumulation am Infektionsherd, die durch 19F Kernspintomografie dargestellt und vermessen wurde. Alle drei Methoden zeigten dabei das gleiche Effizienzmuster nach dem Linezolid wirksamer bei der Bekämpfung der Infektion war. Folglich erwies sich 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als effektiv um den antibakteriellen Effekt von Antibiotika in präklinischen Modellen zu untersuchen. Konsequenterweise wurde im nächsten Schritt eine neuartige Substanz zur Behandlung von S. aureus Infektionen mit Hilfe der Bildgebungsplattform untersucht: Lyostaphin. Diese Endopeptidase schneidet spezifisch die Zellwand von S. aureus und wurde in verschiedenen Konzentrationen oder in Kombination mit Oxacillin im Muskelabszess- oder Katheterinfektionsmodell der Maus gestestet. Lysostaphin in der Konzentration von 5 mg/kg Körpergewicht (Maus) oder Lysostaphin in der Konzentration von 2 mg/kg in Kombination mit Oxacillin führten zu einer starken Verringerung der Bakterienlast und des Biolumineszenzsignals in beiden Modellen. Die Ansammlung von Perfluorcarbon Kontrastmittel war zudem in diesen beiden Gruppen stark reduziert im Vergleich zur Negativkontrolle und den mit Vancomycin und Oxacillin behandelten Tieren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Lysostaphin eine vergleichbare oder bessere Wirksamkeit als Vancomycin oder Oxacillin alleine lieferte. Aus diesem Grund scheint eine Weiterentwicklung dieser Substanz zur Behandlung von S. aureus empfohlen. Der Nutzen der Bildgebungsplattform wurde in diesen Experimenten zudem dadurch deutlich, dass alle drei Methoden zur Bestimmung der Schwere der Erkrankung ähnliche Wirksamkeiten der Antibiotika anzeigten. Dennoch muss festgestellt werden, dass die Gruppen, die Oxacillin entweder alleine oder in Kombination mit Lysostaphin erhielten, stärkere Perfluorocarbon Akkumulation am Infektionsherd aufwiesen als von den Bakterienlast- oder Biolumineszenz-Ergebnissen zu erwarten gewesen wäre. Ein Grund hierfür könnten mögliche immunomodulatorischen Effekte von Oxacillin sein. Tatsächlich zeigten weitere Experimente Variationen in den Konzentrationen von Cytokinen und Chemokinen im infizierten Muskel in Abhängigkeit der verwendeten Antibiotikatherapie. Besonders die Behandlung mit Oxacillin, in geringerem Maße aber auch mit Minocyclin oder Linezolid, führte zu erhöhten Konzentrationen, wenngleich die Bakterienlast deutlich reduziert werden konnte. Folglich sollten mögliche immuno-modulatorischen Effekte antibakterieller Substanzen bei zukünftiger Anwendung von Bildgebungsplattform, die auf dem Markieren von Immunzellen basieren, mit ins Kalkül gezogen werden. Auf der anderen Seite eröffnet diese Beobachtung ein neues Anwendungsfeld für diese Bildgebungsmethoden, da es außerordentlich interessant erscheint, damit immuno-modulatorische Substanzen oder bakterielle Faktoren in vivo zu untersuchen. Zu guter Letzt, ermöglicht diese Bildgebungsplattform, die Methoden zur Darstellung der bakteriellen Last auf der einen und des Immunsystems auf der anderen Seite verknüpft, eine innovative, neue Möglichkeit Wirt-Pathogen Interaktionen nicht-invasiv und in vivo studieren zu können. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Perfluorcarbon Emulsionen in Immunzellen am Infektionsherd des S. aureus Muskelabszessmodells der Maus akkumulieren. Die Ansammlung formt eine Hohlkugel am Rand des Abszessbereiches, deren Größe und Fluorgehalt von der Schwere der Erkrankung und/oder der Wirksamkeit der angewandten Antibiotikatherapie abhängt. Aus diesem Grund erwies sich 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als Kontrastmittel als nützliche Platform zur präklinischen Evaluierung antibakterieller Substanzen. Weiterhin erscheint diese Methode wegen der Akkumulation des Kontrastmittels in Immunzellen, als interessant zum Studium der Immunantwort gegenüber Infektionen, aber auch Krebs oder Autoimmunerkrankungen sowie zur Erforschung von immuno-modulatorischen Substanzen und Impfansätzen. KW - Staphylococcus aureus KW - Kernspintomographie KW - Infektion KW - In vivo Imaging KW - Infection imaging KW - Infektionsbildgebung KW - Antibiotikum KW - Bilderzeugung KW - Molekulare Bildgebung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105349 ER - TY - THES A1 - Li, Xiang T1 - Molecular imaging of inflammation in atherosclerosis: Preclinical study in Apolipoprotein E-Deficient mice and preliminary evaluation in human using positron emission tomography T1 - Molekulare Bildgebung inflammatorischer Prozesse bei Atherosklerose: Präklinische Studie in Apolipoprotein-E Knockout-Mäusen sowie erste Evaluation humaner PET-Studien N2 - Motivation and Aim: Cardiovascular disease has been the leading cause of mortality and morbidity throughout the world. In developed countries, cardiovascular diseases are already responsible for a majority of deaths and will become the pre-eminent health problem worldwide (1,2). Rupture of atherosclerotic plaque accounts for approximately 70% of fatal acute myocardial infarction and sudden heart deaths. Conventional criterias for the diagnosis of “vulnerable plaques” are calcified nodules, yellow appearance of plaque, a thin cap, a large lipid core, severe luminal stenosis, intraplaque hemorrhage, inflammation, thrombogenicity, and plaque injury (3-5). Noninvasive diagnosis of vulnerable plaque still remains a great challenge and a huge research prospect, which triggered us to investigate the feasibility of PET imaging on the evaluation of atherosclerosis. Nuclear imaging of atherosclerosis， especially co-registered imaging modalities, could provide a promising diagnostic tool including both anatomy and activities to identify vulnerable atherosclerotic plaque or early detection of inflammatory endothelium at risk. Furthermore, the development of specific imaging tracers for clinical applications is also a challenging task. The aim of this work was to assess the potential of novel PET imaging probes associated with intra-plaque inflammation on animal models and in human respectively. Methods In this work, several molecular imaging modalities were employed for evaluation of atherosclerosis. They included Positron emission tomography / Computed tomography (PET/CT) for human studies, and micro-PET, autoradiography and high-resolution magnetic resonance imaging (MRI) for animal studies. Radiotracers for PET imaging included the glucose analogue 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG), the somatostatin receptor avide tracer 68Ga-DOTATATE, and the Gallium-68 labeled fucoidan (68Ga-Fucoidan), which was developed as a PET tracer to detect endothelial P-selectin, which overexpressed at early stage of atherosclerosis and endothelial overlying activated plaque. Tracer’s capabilities were firstly assessed on cellular level in vitro. Subsequently, Animal studies were conducted in two animal models: 1, Apolipoprotein E (ApoE-/-) mice having severe atherosclerotic plaque; 2, Lipopolysaccharide (LPS) -induced mice for receiving acute vascular inflammation. Corresponding analyses on protein and histological level were conducted as well to confirm our results. In human study, 16 patients with neuroendocrine tumors (NETs) were investigated on imaging vascular inflammation. These patients had undergone both 68Ga-DOTATATE PET/CT and 18F-FDG PET/CT for staging or restaging within 6 weeks. 16 patients were randomized into two groups: high-risk group and low-risk group. Uptake ratio of both tracers from two groups were compared and correlated with common cardiovascular risk factors. Results and Conclusion In murine study, the expression of somatostatin receptor 2, which is the main bio-target of 68Ga-DOTATATE on macrophage/monocyte was confirmed by flow cytometry and immunohistochemistry. Prospectively, high specific accumulation of 68Ga-DOTATATE to the macrophage within the plaques was observed in aorta lesions by autoradiography and by micro-PET. In study with 68Ga-fucoidan, a strong expression of P-selectin on active endothelium overlying on inflamed plaque but weaker on inactive plaques was confirmed. Specific focal uptake of 68Ga-fucoidan were detected at aorta segments by micro-PET, and correlated with high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), which was used to characterize the morphology of plaques. 68Ga-fucoidan also showed a greater affinity to active inflamed plaque in comparison of inactive fibrous plaque, which was assessed by autoradiography. Specificity of 68Ga-DOTATATE and 68Ga-fucoidan were confirmed by ex-vivo blocking autoradiography and in vivo blocking PET imaging respectively. In human study, focal uptake of both 18F-FDG and 68Ga-DOTATATE was detected. Analyzing concordance of two tracers’ uptake ratio, Out of the 37 sites with highest focal 68Ga-DOTATATE uptake, 16 (43.2%) also had focal 18F-FDG uptake. Of 39 sites with highest 18F-FDG uptake, only 11 (28.2%) had a colocalized 68Ga-DOTATATE accumulation. Correlated tracers’ uptake and calcium burden and risk factors, Mean target-to-background ratio (TBR) of 68Ga-DOTATATE correlated significantly with the presence of calcified plaques (r=0.52), hypertension (r=0.60), age (r=0.56) and uptake of 18F-FDG (r=0.64). TBRmean of 18F-FDG correlated significantly only with hypertension (r=0.58; p<0.05). Additionally, TBRmean of 68Ga-DOTATATE is significant higher in the high risk group while TBRmean of 18F-FDG is not. In conclusion, we evaluated vascular inflammation of atherosclerosis non-invasively using the two PET tracers: 68Ga-DOTATATE and 68Ga-Fucoidan. 68Ga-DOTATATE show specific affinity to infiltrated macrophage within the plaques. 68Ga-Fucoidan may hold the potential to discriminate between active and inactive atherosclerotic plaques in terms of variant accumulation on different-types of plaques. PET as leading molecular imaging technique provides superiority in assessing cellular activity, which is pivotal for understanding internal activity of atherosclerotic plaques. Since diagnosis of atherosclerosis is a complex and multi-dimensional task. More integrated imaging technology such as PET/MRI, faster imaging algorithm, more efficient radiotracer are required for further development of atherosclerosis imaging, N2 - Ziel: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen die häufigste Todesursache der westlichen Industrieländer dar und führen zu einem zunehmenden Gesundheitsproblem weltweit. (1,2). Ca. 70 % aller akuten Myocardinfarkte sind auf die Ruptur atherosklerotischer Plaques zurück zuführen, deren typische Charakteristika ein kalzifizierter, lipidhaltiger Kern, überzogen von einer dünnen fibrösen Kappe, darstellt. Innerhalb der atherosklerotischer Plaques kommt es zu Makrophageneinlagerung und im weiteren Verlauf zu entzündlichen und angiogentischen Prozesse, die zu Einblutungen führen und die Instabilität der Plaques zur Folge hat (3-5). Die nichtinvasive Diagnostik rupturgefährdeter Plaques stellt immer noch eine große medizinische Herausforderung dar. Die nuklearmedizinische Bildgebung, kombiniert mit MRT/CT zur anatomischen Co-Registrierung, könnte eine verbesserte diagnostische Methode zur Darstellung rupturgefährdeter atherosklerotischen Plaques und frühzeitiger entzündlicher Prozesse darstellen. Ziel dieser Arbeit war es daher, atherosklerosische Plaques mittels Positronen¬emissions¬tomografie (PET) unter Verwendung neuer PET Tracer für die Darstellung von Entzündungs¬prozesse im Tiermodell und der humanen Anwendung zu untersuchen. Material und Methoden: Im Rahmen dieser Arbeit kamen verschiedene bildgebende Verfahren zur Anwendung. Im Einzelnen waren dies PET/CT bei humanen Studien sowie micro-PET, Autoradiografie und hochauflösende Magnetresonanztomografie (MRT) bei Untersuchungen im Tiermodell. Als PET-Tracer wurden das Glukosederivat 18F-Flurodesoxyglukose (18F-FDG), 68Ga-DOTATATE, das an Somatostatin-Rezeptoren bindet sowie Gallium-68 markiertes Fucoidan (68Ga-Fucoidan) verwendet. Bei 68Ga-Fucoidan handelt es sich um einen neu entwickelten PET-Tracer zur Darstellung von P-Selectin, welches an aktivieren Plaques im frühen Stadium der Atherosklerose überexprimiert wird. Die Untersuchungen im Tiermodell fanden sowohl an Apolipoprotein E Knockout-Mäusen (ApoE-/-) als auch an Lipopolysaccharid- (LPS) induzierten Mäusen statt. Des Weiteren wurden uptake-Untersuchungen auf in Zellkulturexperimenten durchgeführt. Zur Bestätigung der der Untersuchungsergebnisse wurden zusätzlich histochemische Untersuchungen durchgeführt. Im Rahmen der humanen Studien wurden 16 Patienten mit neuroendokrinenen Tumoren (NET) hinsichtlich vaskulärer Entzündungsprozesse untersucht. Alle Patienten erhielten ein 68Ga-DOTATATE PET/CT und 18F-FDG PET/CT zum Staging bzw. Restaging innerhalb von 6 Wochen. Die Einteilung der Patienten erfolgte in zwei Gruppen: hohes Risiko und geringes Risiko. Die uptake-Verhältnisse beider Tracer in beiden Gruppen wurden mit einander verglichen und hinsichtlich bekannter cardiocaskulärer Risikofaktoren in Beziehung gesetzt. Ergebnisse und Zusammenfassung: Die Expression der Somatostatin-Rezeptor Subtyps 2, an den 68Ga-DOTATATE an Makrophagen/Monocyten bindet, konnte mittels flow cytometrischer und immunhistochemischer Experimente im Mausmodell bestätigt werden. Mit Hilfe von micro-PET Untersuchungen und Autoradiografie wurde eine hohe spezifische Anreicherung von 68Ga-DOTATATE an Makrophagen innerhalb der Plaques beobachtet.Im Rahmen der Untersuchungen mit 68Ga-Fucoidan konnte eine hohe P-Selectin-Expression an aktiviertem Endothelium, welches die entzündlichen Plaques überlagert festgestellt werden. Bei inaktiven Plaques hingegen zeigte sich eine geringe P-Selectin-Expression. In micro-PET-Studien konnte ein spezifischer fokaler uptake von 68Ga-Fucoidan in der Aorta nachgewiesen werden. Dieser korrelierte mit den zusätzlich durchgeführten MRT-Unter¬suchungen zur Charakterisierung der Plaquemorphologie. Mittels Autoradiografie konnte nachgewiesen werden, dass 68Ga-Fucoidan eine höhere Affinität zu aktivierten entzündlichen Plaques im Vergleich zu inaktivieren fibrösen Plaques zeigt. Die spezifische Bindung von 68Ga-DOTATATE und 68Ga-Fucoidan wurde über Blockadeexperimente mittels Autoradiografie und PET bestätigt. In der humanen Anwendung wurde ein fokaler uptake von 18F-FDG und 68Ga-DOTATATE detektiert. Die Analyse der Übereinstimmung des uptakes beider Tracer ergab: Von 37 spots mit hohem 68Ga-DOTATATE-uptake zeigten 16 (43,2 %) ebenfalls einen fokalen 18F-FDG -uptake. Von 39 spots mit hohem 18F-FDG -uptake zeigten nur 11(28,2%) eine 68Ga-DOTATATE-Anreicherung. Betrachtet man den Tracer-uptake hinsichtlich des Calcium-burden und weiterer Risikofakoren, so ergeben sich folgende Korrelationskoeffizienten: TBRmean of 68Ga-DOTATATE korreliert signifikant mit der Anwesenheit von kalzifizierten Plaques (r=0,52), Blutdruck (r=0,60), Alter (r=0,56) und 18F-FDG uptake (r=0,64). Eine signifikante Korrelation von TBRmean 18F-FDG konnte lediglich beim Risikofaktor Blutdruck (r=0,58, p<0,05) festgestellt werden. Weiterhin zeigte sich, dass der TBRmean von Ga-DOTATATE in der Hoch-Risiko-Gruppe signifikant höher, dies gilt jedoch nicht für TBRmean 18F-FDG. Zusammenfassung: In dieser Arbeit wurden die vaskulären Entzündungsprozessen der Atherosklerose mittels der nichtinvasiven PET unter Verwendung von 68Ga-DOTATATE und 68Ga-Fucoidan untersucht und bewertet. 68Ga-DOTATATE zeigte eine spezifische Affinität zu Makrophagen innerhalb der atherosklerotischen Plaques. Mit 68Ga-Fucoidan konnt zwischen aktiven und inaktiven Plaques unterschieden werden. Die molekulare Bildgebung mittels PET eignet sich hervorragend zur Darstellung und Untersuchung molekularer Prozesse innerhalb atheroskerotischer Plaques. Dennoch sind weiterführende Technologien wie PET/MR, schnellere Algorithmen, hoch spezifische Radiotracer zur Weiterentwicklung der PET-Bildgebung atherosklerotischer Plaques notwendig. KW - Arteriosklerose KW - Entzündung KW - Makrophage KW - Positronen-Emissions-Tomographie KW - Non-invasive imaging KW - Atherosclerosis KW - PET KW - Nuclear imaging KW - Inflammation KW - Positron emission tomography KW - Vulnerable plaque KW - Macrophage Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104622 ER - TY - THES A1 - Moitinho e Silva, Lucas T1 - Exploration of microbial diversity and function in Red Sea sponges by deep sequencing T1 - Untersuchungen zur mikrobiellen Diversität und Funktion in Schwämmen aus dem Roten Meer mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung N2 - Marine sponges (phylum Porifera) are simple, sessile, filter-feeder animals. Microbial symbionts are commonly found in the sponge internal tissue, termed the mesohyl. With respect to the microbial content, sponges are classified as either low-microbial abundance sponges (LMA), or high-microbial abundance sponges (HMA). The HMA/LMA dichotomy was explored in this Thesis using the Red Sea sponges as experimental models. A range of methods encompassing transmission electron microscopy, 16S rRNA gene deep sequencing, and metatranscriptomics was employed towards this goal. Here, particular emphasis was placed on the functional analysis of sponge microbiomes. The Red Sea sponges Stylissa carteri, Xestospongia testudinaria, Amphimedon ochracea, and Crella cyathophora were classified as HMA or LMA sponges using transmission electron microscopy. The diversity, specificity, and transcriptional activity of microbes associated with the sponges S. carteri (LMA) and X. testudinaria (HMA) and seawater were investigated using 16S rRNA amplicon pyrosequencing. The microbial composition of S. carteri was more similar to that of seawater than to that of X. testudinaria, which is consistent with the observation that the sequence data set of S. carteri contained many more possibly seawater sequences (~24%) than the X. testudinaria data set (~6%). The most abundant operational taxonomic units (OTUs) were shared between all three sources (S. carteri, X. testudinaria, seawater), while rare OTUs were unique to any given source. Despite this high degree of overlap, each sponge species contained its own specific microbiota. S. carteri microbiomes were enriched of Gammaproteobacteria and members of the genus Synechococcus and Nitrospira. Enriched members of X. testudinaria microbiomes included Chloroflexi, Deferribacteres, and Actinobacteria. The transcriptional activity of sponge-associated microorganisms was assessed by comparing 16S rRNA gene with transcript amplicons, which showed a good correlation. The microbial functional gene repertoire of sponges and seawater from the Red Sea (X. testudinaria, S. carteri) and the Mediterranean (Aplysina aerophoba, Dysidea avara) were investigated with the environmental microarray GeoChip 4. Amplicon sequencing was performed alongside in order to assess microbial diversity. The typical microbial diversity patterns characteristic of HMA (abundance of Gammaproteobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria, Deferribacteres, and others) and LMA sponges (abundance of Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Cyanobacteria, and Bacteroidetes) were confirmed. The HMA/LMA dichotomy was stronger than any possible geographic pattern based on microbial diversity (amplicon) and functional genes (GeoChip). However upon inspection of individual genes detected by GeoChip, very few specific differences were discernible, including differences related to microbial ammonia oxidation, ammonification (higher gene abundance in sponges over seawater) as well as denitrification (lower gene abundance). Furthermore, a higher abundance of a gene, pcc, representative of archaeal autotrophic carbon fixation was noted in sponges over seawater. Thirdly, stress-related genes, in particular those related to radiation, were found in lower abundances in sponge microbiomes than in seawater. With the exception of few documented specific differences, the functional gene repertoire between the different sources appeared largely similar. The most actively expressed genes of S. carteri microbiomes were investigated with metatranscriptomics. Prokaryotic mRNA was enriched from sponge total RNA, sequenced using Illumina HiSeq technology, and annotated with the metagenomics Rapid Annotation using Subsystem Technology (MG-RAST) pipeline. High expression of archaeal ammonia oxidation and photosynthetic carbon fixation by members of the genus Synechococcus was detected. Functions related to stress response and membrane transporters were among the most highly expressed by S. carteri symbionts. Unexpectedly, gene functions related to methylotrophy were highly expressed by gammaproteobacterial symbionts. The presence of seawater-derived microbes is indicated by the phylogenetic proximity of organic carbon transporters to orthologs of members from the SAR11 clade. In summary, the most expressed functions of the S. carteri-associated microbial community were revealed and linked to the dominant taxonomic members of the microbiome. In conclusion, HMA and LMA Red Sea sponges were used as models to gain insights into relevant themes in sponge microbiology, i.e. diversity, specificity, and functional activities. Overall, my Thesis contributes to a better understanding of sponge-associated microbial communities, and the implications of this association to marine ecology. N2 - Marine Schwämme (phylum Porifera) sind einfache, sessile, sich mittels Filtration von Meerwasser ernährende Tiere. Das Schwammgewebe, als Mesohyl definiert, ist häufig durch mikrobielle Symbionten besiedelt. Im Hinblick auf die mikrobielle Abundanz werden Schwämme in sogenannte „low-microbial abundance“ (LMA) oder „high microbial abundance“ (HMA) Kategorien unterteilt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die „HMA/LMA-Dichotomie“ anhand von Schwämmen aus dem Roten Meer untersucht. Verschiedene Methoden, wie die Transmissions-Elektronenmikroskopie, 16S rRNA Gen-Hochdurchsatz-Sequenzierung sowie die Metatranskriptomik kamen zum Einsatz. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die funktionale Analyse der Schwammsymbionten gelegt. Die Schwämme Stylissa carteri, Xestospongia testudinaria, Amphimedon ochracea und Crella cyathophora aus dem Roten Meer wurden zunächst mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie als HMA oder LMA-Schwämme klassifiziert. Die Diversität, Spezifizität sowie transkriptionelle Aktivität von mit S. carteri (LMA), X. testudinaria (HMA) oder Meerwasser-assoziierten Mikroorganismen wurde mittels 16S rRNA Gen-Ampliconsequenzierung untersucht. Die mikrobielle Zusammensetzung von S. carteri ähnelte mehr der des Meerwassers als der von X. testudinaria, was mit dem Befund übereinstimmt, dass der Sequenzdatensatz von S. carteri deutlich mehr Meerwassersequenzen enthielt (~ 24%) als der von X. testudinaria (6%). Die am häufigsten vorliegenden „operational taxonomic units“ (OTUs) lagen gleichermaßen im Probenmaterial (S. carteri, X. testudinaria, Meerwasser) vor, während die am wenigsten häufigen OTUs jeweils spezifisch für eine Probe waren. Trotz der hohen Gemeinsamkeiten enthielt jede Schwammart ein eigenes Bakterienprofil. Die Mikrobiome von S. carteri waren durch Gammaproteobacteria, sowie Vertreter der Gattung Synechococcus und Nitrospira angereichert. Häufige Vertreter des X. testudinaria Mikrobioms waren Chloroflexi, Deferribacteres und Actinobacteria. Die transcriptionelle Aktivität von Schwamm-assoziierten Mikroorganismen wurde auf der Basis von 16S rRNA-Genen und 16S rRNA-Transkripten verglichen und zeigte eine gute Korrelation. Das funktionale Genrepertoire von Schwämmen und Meerwasser aus dem Roten Meer (X. testudinaria, S. carteri) und dem Mittelmeer (Aplysina aerophoba, Dysidea avara) wurde mittels des Mikroarrays GeoChip 4 verglichen. Die Ampliconsequenzierung wurde begleitend zur Charakterisierung der mikrobiellen Diversität durchgeführt. Die charakteristischen Diversitätsmuster von HMA-Schwämmen (Gammaproteobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria, Deferribacteres und weitere) und LMA-Schwämmen (Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes) konnten bestätigt werden. Die HMA/LMA-Dichotomie war sowohl im Bezug auf die Diversität (Amplikon-Daten) als auch auf das funktionale Genrepertoire (GeoChip) deutlich stärker ausgeprägt als ein mögliches geographisches Muster. Jedoch konnten nach Analyse einzelner Gene nur wenige spezifische Unterschiede definiert werden. Diese betrafen beispielsweise die mikrobielle Ammonium-Oxidation, Ammonifikation (höhere Genabundanz in Schwämmen als Meerwasser) oder die Denitrifikation (niedrigere Genabundanz in Schwämmen als Meerwasser). Weiterhin wurde eine höhere Genabundanz des pcc -Gens in Schwämmen als im Meerwasser beschrieben. Dieses Gen gilt als Indikator für archaeale, autotrophe Kohlenstoff-Fixierung. Drittens wurde eine niedrige Genabundanz von Stress-Genen, insbesondere im Bezug auf UV-Strahlung, in Schwämmen als im Meerwasser beobachtet. Von wenigen spezifischen Ausnahmen abgesehen war das funktionale Genrepertoire zwischen dem Probenmaterial jedoch sehr ähnlich. Die am häufigsten exprimierten Gene des S. carteri Mikrobioms wurden mittels Metatranskriptomik untersucht. Zu diesem Zweck wurde die prokaryotische mRNA aus der Gesamt-Schwamm RNA angereichert, mittels Illumina HiSeq-Technologie sequenziert und mittels der MG-RAST-Software annotiert. Die mit am häufigsten exprimierten Gene betrafen die archaeale Ammonium-Oxidation und die photosynthetische Kohlenstoff-Fixierung durch Synechococcus. Weiterhin waren Stress- und Membrantransport-relevane Gene mit am häufigsten exprimiert. Unerwartet war der Befund, dass Methylotrophie-verwandte Gene ebenfalls sehr häufig exprimiert wurden. Das Vorliegen von Meerwasserbakterien ist durch die phylogenetische Nähe von organischen Kohlenstoff-Transportern zu Genen der SAR11-Klade belegt. Zusammenfassend wurden in dieser Studie die am häufigsten transkribierten Funktionen des S. carteri Mikrobioms beschrieben und bezüglich ihrer taxonomischen Zugehörigkeit analysiert. Zusammenfassend wurden HMA und LMA-Schwämme aus dem Roten Meer als experimentelle Modellsysteme verwendet, um Einblicke in für die Schwamm-Mikrobiologie relevante Fragen bezüglich der mikrobiellen Diversität, Spezifität und funktionalen Aktivität zu gewinnen. Diese PhD-Arbeit trägt zu einem verbesserten Verständnis der Mikrobiologie von Schwämmen sowie deren Bedeutung für die marine Ökologie im Allgemeinen bei. KW - Meeresschwämme KW - Rotes Meer KW - Bakterien KW - Marine sponge KW - Symbiosis KW - Red Sea KW - Deep sequencing KW - Bacteria KW - Microbial community KW - Diversity KW - Metatranscriptomics KW - Function Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103836 ER - TY - THES A1 - Michalska, Marta T1 - Molecular Imaging of atherosclerosis T1 - Molekulare Bildgebung der Atherosklerose N2 - Atherosklerose ist eine aktive und progressive Erkrankung, bei der vaskuläre Adhäsionsmoleküle wie VCAM-1 eine entscheidende Rolle durch Steuerung der Rekrutierung von Immunzellen in den frühen und fortgeschrittenen Plaques spielen. Ein zielgerichteter Einsatz von VCAM-1-Molekülen mit spezifischen Kontrastmitteln ist daher eine Möglichkeit, die VCAM-1-Expression zu kontrollieren, Plaquewachstum ab einem frühen Zeitpunkt zu visualisieren und eine frühe Prävention von Atherosklerose vor Beginn der Thrombusbildung zu etablieren. Des Weiteren bietet die nichtinvasive Magnetresonanz (MR)-Bildgebung den Vorteil der Kombination molekularer und morphologischer Daten. Sie ermöglicht, mithilfe von entwickelten VCAM-1-markierten Eisenoxidpartikeln, den spezifischen Nachweis entzündlicher Prozesse während der Atherosklerose. Diese Arbeit belegt, dass mit dem VCAM-1-Konzept eine vielversprechende Herangehensweise gefunden wurde und dass das, mit spezifischen superparamagnetischen Eisenoxid (USPIO) konjugierte VCAM-1-Peptid, gegenüber unspezifischer USPIOs ein erhöhtes Potenzial bei der Untersuchung der Atherosklerose in sich trägt. Im ersten Teil der Arbeit konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass gerade das VCAM-1-Molekül ein sinnvoller Ansatzpunkt zur Darstellung und Bildgebung von Atherosklerose ist, da in der frühen Phase der Entzündung die vaskulären Zelladhäsionsmoleküle überexprimiert und auch kontinuierlich, während der fortschreitenden Plaquebildung, hochreguliert werden. Weiterhin beschreibt diese Arbeit die Funktionstüchtigkeit und das Vermögen des neu gestalteten USPIO Kontrastmittels mit dem zyklischen Peptid, in seiner Spezialisierung auf die VCAM-1 Erkennung. Experimentelle Studien mit ultra-Hochfeld-MRT ermöglichten weitere ex vivo und in vivo Nachweise der eingesetzten USPIO-VCAM-1-Partikel innerhalb der Region um die Aortenwurzel in frühen und fortgeschrittenen atherosklerotischen Plaques von 12 und 30 Wochen alten Apolipoprotein E-defizienten (ApoE-/-) Mäusen. Mit ihrer Kombination aus Histologie und Elektronenmikroskopie zeigt diese Studie zum ersten Mal die Verteilung von VCAM-1-markierten USPIO Partikeln nicht nur in luminalem Bereich der Plaques, sondern auch in tieferen Bereichen der medialen Muskelzellen. Dieser spezifische und sensitive Nachweis der frühen und fortgeschrittenen Stadien der Plaquebildung bringt auf molekularer Ebene neue Möglichkeiten zur Früherkennung von atherosklerotischen Plaques vor dem Entstehen von 8 Rupturen. Im Gegensatz zum USPIO-VCAM-1-Kontrastmittel scheiterten unspezifische USPIO Partikel an der Identifikation früher Plaqueformen und begrenzten die Visualisierung von Atherosklerose auf fortgeschrittene Stadien in ApoE-/- Mäusen. N2 - Atherosclerosis is an active and progressive condition where the vascular cell adhesion molecules as VCAM-1 play a vital role controlling the recruitment of immune cells within the early and advanced plaques. Therefore targeting of VCAM-1 molecules with specific contrast agent bears the possibility to monitor the VCAM-1 expression, visualize the plaque progression starting at the early alterations, and help to establish early prevention of atherosclerosis before the origin of the thrombus formation, of which late recognition leads to myocardial infarction. Furthermore noninvasive magnetic resonance imaging (MRI) offers the benefit of combining the molecular and anatomic data and would thus enable specific detection of VCAM-1 targeted iron oxide contrast agent within inflammatory process of atherosclerosis. This thesis exactly presents the VCAM-1 concept as a suitable molecular approach and the potential of specific ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO) conjugated to the VCAM-1 binding peptide over unspecific non-targeted USPIO particles for evaluation of atherosclerosis. This work firstly demonstrated that selection of VCAM-1 molecules offers a good and potential strategy for imaging of atherosclerosis, as these vascular cell adhesion molecules are highly expressed in the early phase of inflammation and also continuously up-regulated within the advanced plaques. Secondly, this thesis showed the proof of principle and capability of the newly designed USPIO contrast agent conjugated to the specific cyclic peptide for VCAM-1 recognition. The experimental studies including ultra-high field MRI enabled further ex vivo and in vivo detection of applied USPIO-VCAM-1 particles within the aortic root region of early and advanced atherosclerotic plaques of 12 and 30 week old apolipoprotein E deficient (ApoE-/-) mice. Using a combination of histology and electron microscopy, this study for the first time pointed to distribution of targeted USPIO-VCAM-1 particles within plaque cells expressing VCAM-1 not only in luminal regions but also in deeper medial smooth muscle cell areas. Hence functionalized USPIO particles targeting VCAM-1 molecules allow specific and sensitive detection of early and advanced plaques at the molecular level, giving the new possibilities for early recognition of atherosclerotic plaques before the appearance of advanced and prone to rupture lesions. In contrast to the functionalized USPIO-VCAM-1, utilized non-targeted USPIO particles did not succeed in early plaque 6 identification limiting visualization of atherosclerosis to advanced forms in atherosclerotic ApoE-/- mice. KW - VCAM KW - Arteriosklerose KW - Superparamagnetische Eisenoxid Kontrastmittel KW - vaskuläre Adhäsionsmoleküle KW - Atherosklerose KW - superparamagnetische Eisenoxid Kontrastmittel KW - vascular cell adhesion molecules KW - atherosclerosis KW - iron oxide contrast agent KW - Kontrastmittel Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73243 ER - TY - THES A1 - Nono, Justin T1 - Immunomodulation through Excretory/Secretory Products of the parasitic Helminth Echinococcus multilocularis T1 - Immunmodulation durch Exkretorisch/Sekretorischen Produkten der parasitären Helminthen Echinococcus multilocularis N2 - Die Alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Zoonose, die durch das Metazestoden-Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis ausgelöst wird. Nach Eintritt des Parasiten in den Zwischenwirt wird zunächst eine potentiell anti-parasitische, Th1-dominierte Immunantwort ausgelöst, welche anschließend in der chronischen Phase graduell durch eine permissive, Th2-dominierte Antwort ersetzt wird. Als Ergebnis einer zugrunde liegenden Immunmodulation durch den Parasiten können Echinococcus-Larven für Jahre bis Jahrzehnte im Wirt persistieren und verhalten sich ähnlich einem perfekt transplantierten Organ. Über die molekulare Basis der Immunmodulation durch den Parasiten ist derzeit wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden geeignete Kultursysteme für verschiedene E. multilocularis Larvenstadien verwendet, um den Einfluss exkretorisch/sekretorischer Metaboliten (E/S-Produkte) auf Wirts-Immuneffektor-Zellen zu studieren. E/S-Produkte kultivierter Larven, die die frühe (Primärzellen) und chronische (Metazestode) Phase der Infektion repräsentieren induzierten Apoptose und tolerogene Eigenschaften in Dendritischen Zellen (DC) des Wirts, während solche von Kontroll-Larven (Protoskolizes) keine derartigen Effekte zeigten. Dies zeigt, dass die frühen infektiösen Stadien von E. multilocularis in DC ein tolerierendes Milieu erzeugen, welches sehr wahrscheinlich die initiale Etablierung des Parasiten in einer Phase begünstigt, in der er höchst sensitiv gegenüber Wirtsangriffen ist. Interessanterweise förderten E/S-Produkte des Metazestoden in vitro die Konversion von CD4+ T-Zellen in Foxp3+, regulatorische T-Zellen (Treg) während E/S-Produkte von Primärzellen oder Protoskolizes dies nicht vermochten. Da Foxp3+ Tregs generell als immunosuppressorisch bekannt sind, deuten diese Daten an, dass der Metazestode aktiv eine Induktion von Tregs herbeiführt, um eine permissive Immunsuppression während einer Infektion zu erreichen. Eine substantielle Zunahme von Anzahl und Frequenz Foxp3+ Tregs konnte zudem in Peritoneal-Exsudaten von Mäuuen nach intraperitonealer Injektion von Parasitengewebe gemessen werden, was anzeigt, dass eine Expansion von Foxp3+ Tregs auch während der in vivo Infektion von Bedeutung ist. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit ein Activin-Orthologes des Parasiten, EmACT, identifiziert werden, weleches vom Metazestoden sekretiert wird und ähnlich wie humanes Activin in der Lage ist, eine TGF-β-abhängige Expansion von Tregs in vitro zu induzieren. Dies zeigt an, dass E. multilocularis evolutionsgeschichtlich konservierte Zytokine nutzt, um aktiv die Wirts-Immunantwort zu beeinflussen. Zusammenfassend deuten die gewonnenen Daten auf eine wichtige Rolle Foxp3+ Tregs, welche u.a. durch EmACT induziert werden, im immunologischen geschehen der AE hin. Ein weiterer Parasiten-Faktor, EmTIP, mit signifikanten Homologien zum T-cell Immunomodulatory Protein (TIP) des Menschen wurde in dieser Arbeit näher charakterisiert. EmTIP konnte in der E/S-Fraktion von Primärzellen nachgewiesen werden und induzierte die Freisetzung von IFN-γ in CD4+ T-Helferzellen. Durch Zugabe von anti-EmTIP-Antikörpern konnte zudem die Entwicklung des Parasiten zum Metazestoden in vitro gehemmt werden. EmTIP dürfte daher einerseits bei der frühen Parasiten-Entwicklung im Zwischenwirt eine Rolle spielen und könnte im Zuge dessen auch die Ausprägung der frühen, Th-1-dominierten Immunantwort während der AE begünstigen. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei E. multilocularis E/S-Faktoren identifiziert, EmACT und EmTIP, die ein hohes immunmodulatorisches Potential besitzen. Die hier vorgestellten Daten liefern neue, fundamentale Einsichten in die molekularen Mechanismen der Parasiten-induzierten Immunmodulation bei der AE und sind hoch relevant für die Entwicklung anti-parasitischer Immuntherapien. N2 - Alveolar echinococcosis (AE) is a severe and life-threatening disease caused by the metacestode larva of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis. Parasite entry into the host evokes an early and potentially parasiticidal Th1 immune response that is gradually replaced by a permissive Th2 response. An immunoregulatory environment has also been reported in the host as the disease progresses. As a result of immunomodulation, E. multilocularis larvae persist in the host for decades without being expelled, and thus almost act like a perfect transplant. Very little is currently known on the molecular basis of the host immunomodulation by E. multilocularis. In this work, in vitro cultivation systems were used to assess the influence of metabolites released by the parasite larvae (E/S products) on host immune effector cells. E/S products of cultivated larvae that respresent the early (primary cells) and chronic (metacestode vesicles) phase of AE induced apoptosis and tolerogenic properties (poor responsiveness to LPS stimulation) in host dendritic cells (DC) whereas those of control larvae (protoscoleces) failed to do so. These findings show that the early infective stage of E. multilocularis induces tolerogenicity in host DC, which is most probably important for generating an immunosuppressive environment at an infection phase in which the parasite is highly vulnerable to host attacks. Interestingly, metacestode E/S products promoted the conversion of naïve CD4+ T-cells into Foxp3+ regulatory T-cells in vitro, whereas primary cell and protoscolex E/S products failed to do it. Since Foxp3+ regulatory T-cells are generally known to mediate immunosuppression, the present finding indicates that Foxp3+ regulatory T-cells, expanded by E/S products of the metacestode larva, could play a role in the parasite-driven immunomodulation of the host observed during AE. Furthermore, a substantial increase in number and frequency of suppressive Foxp3+ regulatory T-cells could be observed within peritoneal exudates of mice following intraperitoneal injection of E. multilocularis metacestodes, indicating that Foxp3+ regulatory T-cells could also play an important role in E. multilocularis-driven immunomodulation in vivo. Interestingly, a parasite activin ortholog, EmACT, secreted by metacestodes, was shown to expand host regulatory T-cells in a TGF-β-dependent manner, similarly to mammalian activin A. This observation indicated that E. multilocularis utilizes evolutionarily conserved TGF-β superfamily ligands, like EmACT, to expand host regulatory T-cells. Taken together, the present findings suggest EmACT, a parasite activin secreted by the metacestode and capable of expanding host regulatory T-cells, as an important player in the host immunomodulation by E. multilocularis larvae. Another parasite factor EmTIP, homologous to mammalian T-cell immunomodulatory protein (TIP) was characterized in this work. EmTIP could be detected in the secretions of the parasite primary cells and localized to the intercellular space within the parasite larvae. EmTIP blockade inhibited the proliferation of E. multilocularis primary cells and the formation of metacestode vesicles indicating a major role for parasite development. Furthermore, EmTIP evoked a strong release of IFN-γ by CD4+ T-cells hence suggesting that the secretion of this factor as a result of its role in parasite development could “secondarily” induce a potentially protective Th1 response. In conclusion, this work identified two molecules, EmACT and EmTIP, with high immunomodulatory potential that are released by E. multilocularis larvae. The data presented do provide insights into the mechanisms of parasite-driven host immunomodulation during AE that are highly relevant for the development of anti-parasitic immune therapies. KW - Immunmodulation KW - Fuchsbandwurm KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Dendritische Zelle KW - Immunomodulation KW - Helminths KW - Tapeworm KW - Echinococcus KW - Regulatory T-cell KW - Dendritic cell KW - Würmer Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85449 ER - TY - THES A1 - Wangorsch, Gaby T1 - Mathematical modeling of cellular signal transduction T1 - Mathematische Modellierung der zellulären Signaltransduktion N2 - A subtly regulated and controlled course of cellular processes is essential for the healthy functioning not only of single cells, but also of organs being constituted thereof. In return, this entails the proper functioning of the whole organism. This implies a complex intra- and inter-cellular communication and signal processing that require equally multi-faceted methods to describe and investigate the underlying processes. Within the scope of this thesis, mathematical modeling of cellular signaling finds its application in the analysis of cellular processes and signaling cascades in different organisms. ... N2 - Das fein regulierte und kontrollierte Ablaufen zellulärer Prozesse ist essentiell für das gesunde Funktionieren einzelner Zellen, sowie der aus ihnen bestehenden Organe. Diese wiederum bedingen das Funktionieren des gesamten Organismus. Genauso vielschichtig wie die Kommunikation und Signalverarbeitung innerhalb und zwischen den Zellen, sind die Methoden um diese Vorgänge zu beschreiben und zu untersuchen. Die mathematische Modellierung zellulärer Signalverarbeitung findet im Rahmen dieser Arbeit Anwendung in der Analyse zellulärer Prozesse und Signalkaskaden in verschiedenen Organismen.... KW - Mathematische Modellierung KW - Thrombozyt KW - Systembiologie KW - Mathematische Modellierung KW - Mathematical modeling KW - platelets KW - signaling pathway KW - systems biology KW - Signaltransduktion Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87746 ER - TY - THES A1 - Zude, Ingmar T1 - Characterization of virulence-associated traits of Escherichia coli bovine mastitis isolates T1 - Charakterisierung Virulenz-assozierter Eigenschaften von Escherichia coli Isolaten boviner Mastitis N2 - Bacterial mastitis is caused by invasion of the udder, bacterial multiplication and induction of inflammatory responses in the bovine mammary gland. Disease severity and the cause of disease are influenced by environmental factors, the cow’s immune response as well as bacterial traits. Escherichia coli (E. coli) is one of the main causes of acute bovine mastitis, but although pathogenic E. coli strains can be classified into different pathotypes, E. coli causing mastitis cannot unambiguously be distinguished from commensal E. coli nor has a common set of virulence factors been described for mastitis isolates. This project focussed on the characterization of virulence- associated traits of E. coli mastitis isolates in comprehensive analyses under conditions either mimicking initial pathogenesis or conditions that E. coli mastitis isolates should encounter while entering the udder. Virulence-associated traits as well as fitness traits of selected bovine mastitis or faecal E. coli strains were identified and analyzed in comparative phenotypic assays. Raw milk whey was introduced to test bacterial fitness in native mammary secretion known to confer antimicrobial effects. Accordingly, E. coli isolates from bovine faeces represented a heterogeneous group of which some isolates showed reduced ability to survive in milk whey whereas others phenotypically resembled mastitis isolates that represented a homogeneous group in that they showed similar survival and growth characteristics in milk whey. In contrast, mastitis isolates did not exhibit such a uniform phenotype when challenged with iron shortage, lactose as sole carbon source and lingual antimicrobial peptide (LAP) as a main defensin of milk. Reduced bacterial fitness could be related to LAP suggesting that bacterial adaptation to an intramammary lifestyle requires resistance to host defensins present in mammary secretions, at least LAP. E. coli strain 1303 and ECC-1470 lack particular virulence genes associated to mastitis isolates. To find out whether differences in gene expression may contribute to the ability of E. coli variants to cause mastitis, the transcriptome of E. coli model mastitis isolates 1303 and ECC-1470 were analyzed to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction, fitness or even pathogenicity during bovine mastitis. DNA microarray analysis was employed to assess the transcriptional response of E. coli 1303 and ECC-1470 upon cocultivation with MAC-T immortalized bovine mammary gland epithelial cells to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction. Additionally, the cell adhesion and invasion ability of E. coli strain 1303 and ECC-1470 was investigated. The transcriptonal response to the presence of host cells rather suggested competition for nutrients and oxygen between E. coli and MAC-T cells than marked signs of adhesion and invasion. Accordingly, mostly fitness traits that may also contribute to efficient colonization of the E. coli primary habitat, the gut, have been utilized by the mastitis isolates under these conditions. In this study, RNA-Seq was employed to assess the bacterial transcriptional response to milk whey. According to our transcriptome data, the lack of positively deregulated and also of true virulence-associated determinants in both of the mastitis isolates indicated that E. coli might have adapted by other means to the udder (or at least mammary secretion) as an inflammatory site. We identified traits that promote bacterial growth and survival in milk whey. The ability to utilize citrate promotes fitness and survival of E. coli that are thriving in mammary secretions. According to our results, lactoferrin has only weak impact on E. coli in mammary secretions. At the same time bacterial determinants involved in iron assimilation were negatively regulated, suggesting that, at least during the first hours, iron assimilation is not a challenge to E. coli colonizing the mammary gland. It has been hypothesized that cellular iron stores cause temporary independency to extracellular accessible iron. According to our transcriptome data, this hypothesis was supported and places iron uptake systems beyond the speculative importance that has been suggested before, at least during early phases of infection. It has also been shown that the ability to resist extracytoplasmic stress, by oxidative conditions as well as host defensins, is of substantial importance for bacterial survival in mammary secretions. In summary, the presented thesis addresses important aspects of host-pathogen interaction and bacterial conversion to hostile conditions during colonization of the mastitis inflammatory site, the mammary gland. N2 - Bei der bakteriellen Mastitis handelt es sich um eine Infektion der bovinen Milchdrüse, ausgelöst durch Eintritt und Wachstum der Bakterien im Euter der Kuh. Krankheitsverlauf und Ursache werden beeinflusst durch Umweltfaktoren, das Immunsystem des Wirtes und die Eigenschaften des bakteriellen Erregers. Die Spezies Escherichia coli (E. coli) ist einer der häufigsten Erreger der akuten bovinen Mastitis. Generell können pathogene E. coli -Stämme entsprechend ihres Infektionsortes in verschiedene Pathotypen klassifiziert werden, die durch eine individuelle Kombination verschiedener Virulenzfaktoren gekennzeichnet sind. Eine eindeutige Unterscheidung von E. coli –Mastitiserregern und kommensalen E. coli -Stämmen ist bisher nicht beschrieben. Diese Studie befasst sich mit der Charakterisierung virulenz-assozierter Eigenschaften von E. coli –Isolaten der bovinen Mastitis. Dazu wurden Untersuchungen unter Bedingungen durchgeführt, die denen während der Anfangsphase der Mastitis entsprechen. Die Virulenz und Fitness-assoziierten Eigenschaften ausgewählter E. coli Mastitis- und Fäkalisolate wurden in vergleichenden phenotypischen Assays identifiziert und analysiert. Zur Untersuchung der bakteriellen Fitness in Milchdrüsensekreten wurde native Molke mit antimikrobiellen Eigenschaften von Rohmilch genutzt. Dabei stellte sich heraus dass E. coli Fäkalisolate eine heterogene Gruppe bilden. Innerhalb dieser Gruppe wiesen einige Isolate eine verminderte Überlebensrate auf. Andere Fäkalisolate zeigten eine höhere Überlebensrate, ähnlich der Überlebensrate von Mastitiserregern. Im Gegensatz zum ihrem grundsätzlich guten Überleben in Molke zeigten Mastitisisolate keine einheitlichen phänotypischen Merkmale bei Wachstum mit 1) Lactose als einziger Kohlenstoffquelle, 2) Eisenlimitierung, oder 3) unter Einfluss von lingualem antimikrobiellem Peptid (LAP), einem bedeutenden Defensin der Wirtsantwort im Euter. Die verminderte Fähigkeit in Milchdrüsensekreten zu überleben korrelierte mit der konzentrationsabhängigen Überlebensfähigkeit in Gegenwart von LAP. Dies lässt vermuten dass eine Anpassung der Bakterien an die Lebensbedingungen in der bovinen Milchdrüse der Resistenz gegenüber Defensinen (u.a. LAP) bedarf. Den Mastitis-isolaten E. coli 1303 und ECC 1470 fehlen diverse Virulenzgene die bereits mit Mastitis assoziiert werden konnten. Um zu bestimmen ob Unterschiede in der Genexpression beider E. coli Isolate dazu beitragen Mastitis auszulösen, wurden Transkriptomanalysen durchgeführt. Dabei sollten vor allem Kandidatengene bestimmt werden, die an der Wirt-Pathogen-Interaktion beteiligt sind oder zur bakteriellen Fitness oder Virulenz der Erreger beitragen. Auf der Basis von DNA Microarrays wurde die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Gegenwart von immortalisierten Zellen des bovinen Milchdrüsenepithels (MAC-T) bestimmt. Zusätzlich wurde die Fähigkeit zur Zelladhäsion und Internalisierung beider Isolate untersucht. Die bakterielle Transkriptionsantwort in Gegenwart der Wirtszellen ergab, dass Erreger und Wirtszellen eher um den Bedarf an Nährstoffen und Sauerstoff konkurrierten, anstatt deutliche Anzeichen der Zelladhäsion oder Invasion zu zeigen. Beide Isolate nutzten vornehmlich Fitnesseigenschaften, die auch bei der Besiedlung des Darms als dem primären Habitat von E. coli verwendet werden. In dieser Studie wurde außerdem die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Reaktion auf Molke aus Rohmilch mittels Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung (RNA Seq) untersucht. Die Transkriptomanalyse ergab keine wirklich deregulierten virulenz-assozierten Gene in einer der beiden E. coli Mastitis Isolate. Ferner konnten Eigenschaften identifiziert werden, die zum Wachstum und Überleben in nativer Molke beitragen. Die Fähigkeit, Citrat zu verwerten, begünstigt das erfolgreiche Überleben in Milchdrüsensekten und stellt einen wichtigen Fitnessfaktor dar. Unsere Transkriptomdaten bestätigen dass Lactoferrin nur geringen Einfluss auf das Wachstum, von E. coli in Milchdrüsensekreten, hat. Die Expression bakterieller Determinanten, die an der Aufnahme von Eisen beteiligt sind, wurde herunterreguliert. Dies lässt darauf schließen dass Eisenaufnahme in den ersten Stunden der Kolonisierung durch die Erreger keine essentielle Fitnesseigenschaft darstellt. Vermutlich reicht die intrazelluläre Menge an Eisen aus, um eine zeitweise Unabhängigkeit von extrazellular verfügbarem Eisen zu ermöglichen. Diese These konnte durch unsere Transkriptomdaten gestützt werden und stellt eine wichtige Entdeckung in Bezug auf die Verfügbarkeit von Eisen während der Kolonisierung der Milchdrüse dar. Unsere Daten zeigen, dass die Resistenz gegenüber extrazellulärem Stress durch oxidative Bedingungen und Defensine des Wirtes von großer Bedeutung für das bakterielle Überleben in Milchdrüsensekreten ist. Die vorliegende Thesis befasst sich mit wichtigen Aspekten der Wirt-Pathogen-Interaktion und der Anpassung an die antimikrobiellen Bedingungen während der Kolonisierung der Milchdrüse als Ort der Infektion. KW - Escherichia coli KW - mastitis KW - infection KW - virulence KW - transcriptome analysis KW - Kuh KW - Brustdrüsenentzündung KW - Virulenz Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100934 ER - TY - THES A1 - Kumari, Geeta T1 - Molecular Characterization of the Induction of Cell Cycle Inhibitor p21 in Response to Inhibition of the Mitotic Kinase Aurora B T1 - Untersuchungen zur Induktion des Zellzyklusinhibitors p21 nach Inhibition der Mitotischen Kinase Aurora B N2 - Aurora B ist eine mitotische Kinase, die entscheidende Funktionen in der Zellteilung ausübt. Aurora B ist außerdem in einer Vielzahl von Krebsarten mutiert oder überexprimiert. Daher ist die Aurora B Kinase ein attraktives Ziel für die Tumortherapie. Gegenwärtig werden Aurora B-Inhibitoren zur Behandlung von soliden Tumoren und Leukämien in verschiedenen klinischen Studien getestet. Es fehlen jedoch Informationen, welche molekularen Mechanismen den beschriebenen Phänotypen wie Zellzyklusarrest, Aktivierung des Tumorsuppressors p53 und seines Zielgens p21 nach Aurora B-Hemmung zugrunde liegen. Hauptziel dieser Arbeit war es die Mechanismen der p21-Induktion nach Hemmung von Aurora B zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass nach Hemmung von Aurora B die p38 MAPK phosphoryliert und somit aktiviert wird. Experimente mit p38-Inhbitoren belegen, dass p38 für die Induktion von p21 und den Zellzyklusarrest benötigt wird. Die Stabilisierung von p53 nach Aurora B-Inhibition und die Rekrutierung von p53 an den p21-Genpromotor erfolgen jedoch unabhängig vom p38-Signalweg. Stattdessen ist p38 für die Anreicherung der elongierenden RNA-Polymerase II in der kodierenden Region des p21-Gens und für die Bildung des p21 mRNA Transkripts notwendig. Diese Daten zeigen, dass p38 transkriptionelle Elongation des p21-Gens nach Aurora B Hemmung fördert. In weiteren Untersuchungen konnte ich zeigen, dass die Aurora B-Hemmung zu einer Dephosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins führt und dadurch eine Abnahme der E2F-abhängigen Transkription bewirkt. Dies löst indirekt einen Zellzyklusarrest aus. Weiterhin konnte mit Hilfe von synchronisierten Zellen gezeigt werden, dass p21 nach Durchlaufen einer abnormalen Mitose induziert wird, jedoch nicht nach Aurora B-Hemmung in der Interphase. Interessanterweise werden p38, p53 und p21 schon bei partieller Inhibition von Aurora B aktiviert. Die partielle Inhibition von Aurora B führt zu chromosomaler Instabilität aber nicht zum Versagen der Zytokinese und zur Bildung polyploider Zellen. Damit korreliert die Aktivierung des p38-p53-p21-Signalweges nicht mit Tetraploidie sondern mit vermehrter Aneuploidie. Die partielle Hemmung von Aurora B führt außerdem zur vermehrten Entstehung von reaktive Sauerstoffspezies (ROS), welche für die Aktivierung von p38, p21 und für den Zellzyklusarrest benötigt werden. Basierend auf diesen Beobachtungen kann folgendes Modell postuliert werden: Die Hemmung von Aurora B führt zu Fehlern in der Chromosomenverteilung in der Mitose und damit zu Aneuploidie. Dies führt zu vermehrter Produktion von ROS, möglicherweise durch proteotoxischer Stress, hervorgerufen durch die Imbalanz der Proteinbiosynthese in aneuploiden Zellen. ROS bewirkt eine Aktivierung der p38 MAPK und trägt damit zur Induktion von p21 und dem resultierenden Zellzyklusarrest bei. Aneuploidie, proteotoxischer und oxidativer Stress stellen Schlüsselmerkmale von Tumorkrankungen dar. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit könnte die Kombination von Aurora B-Hemmstoffen mit Medikamenten, die gezielt aneuploide Zellen angreifen, in Tumorerkrankungen therapeutisch wirksam sein. N2 - Aurora B is a mitotic kinase that is essential for cell division. Because it is mutated or overexpressed in a range of cancer types, it has been suggested as a novel therapeutic target. Currently chemical inhibitors against Aurora B are in various phases of clinical trials for treatment of solid tumors and leukemia. Information regarding the molecular requirements for the reported phenotypes of Aurora B inhibition such as cell cycle arrest, activation of the tumor suppressor p53 and its target p21 are not well understood. In this study, I investigated the requirements for p21 induction after Aurora B inhibition. I found that p38 is phosphorylated and activated when Aurora B is inhibited. Experiments with chemical inhibitors against p38 indicate that p38 is required for p21 induction and cell cycle arrest in response to Aurora B inhibition. p53 induction after impairment of Aurora B function and the recruitment of p53 to its binding site in the p21 gene promoter occur independently of p38 signaling. Instead, I found that p38 is required for the enrichment of the elongating RNA Polymerase II in the coding region of the p21 gene. Furthermore, p38 is required for formation of the full-length p21 mRNA transcript. These data indicate that p38 promotes the transcriptional elongation of p21 gene in response to Aurora B inhibition. In further experiments I could show that the p21 causes cell cycle arrest due to a decrease in E2F-dependent transcription by promoting the dephosphorylation of the retinoblastoma protein. Using synchronized cells I could show that the induction of p21 in response to Aurora B inhibition requires transition through an aberrant mitosis and does not occur in cells that are arrested in interphase. Interestingly, p38, p53 and p21 are already induced by partial inhibition of Aurora B, which results in aneuploidy but not in cytokinesis failure and in tetraploidy. This supports the notion that activation of p38-p53-p21 signaling correlates with aneuploidy but not with tetraploidy or binucleation. Partial inhibition of Aurora B also leads to increased generation of reactive oxygen species (ROS), which are required for the activation of p38, p21 and cell cycle arrest. Based on these observations I propose the following model: Inhibition of Aurora B leads to chromosome missegregation resulting in aneuploidy. This results in increased generation of ROS (reactive oxygen species) possibly through proteotoxic stress caused by an imbalance of protein synthesis in aneuploid cells. ROS triggers the activation of p38, which then stimulates the transcriptional elongation of p21 resulting in cell cycle arrest. Aneuploidy, proteotoxic stress and oxidative stress are hallmarks of cancer cells. Based on my results reported in this study, I suggest that the combination of Aurora B inhibitors with drugs that specifically target aneuploid cells might be a novel strategy for cancer therapy, as this is a lethal combination for proliferation of cancer cells. KW - Zellzyklus KW - Biomedicine KW - Inhibitor KW - Cell Cycle KW - Aneuploidy KW - Aurora B Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101327 ER - TY - THES A1 - Ganesan, Jayavarshni T1 - The role of microRNA-378 in cardiac hypertrophy T1 - Untersuchungen zur Rolle der MikroRNA-378 bei kardialer Hypertrophie N2 - MicroRNAs are endogenous ≈22 nt long non coding RNA molecules that modulate gene expression at the post transcriptional level by targeting mRNAs for cleavage or translational repression. MicroRNA-mRNA interaction involves a contiguous and perfect pairing within complementary sites usually in the 3’ UTR of the target mRNA. Heart failure is associated with myocyte hypertrophy and death, due to compensatory pathological remodeling and minimal functional repair along with microRNA deregulation. In this study, we identified candidate microRNAs based on their expression strength in cardiomyocytes and by their ability to regulate hypertrophy. Expression profiling from early and late stages of heart failure showed several deregulated microRNAs. Of these microRNAs, miR-378 emerged as a potentially interesting microRNA that was highly expressed in the mouse heart and downregulated in the failing heart. Antihypertrophic activity of miR-378 was first observed by screening a synthetic miR library for morphologic effects on cardiomyocytes, and validated in vitro proving the tight control of hypertrophy by this miR. We combined bioinformatic target prediction analysis and microarray analysis to identify the targets of miR-378. These analyses suggested that factors of the MAP kinase pathway were enriched among miR-378 targets, namely MAPK1 itself (also termed ERK2), the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF1R), growth factor receptor bound protein 2 (GRB2) and kinase suppressor of ras 1 (KSR1). Regulation of these targets by miR-378 was then confirmed by mRNA and protein expression analysis. The use of luciferase reporter constructs with natural or mutated miR-378 binding sites further validated these four proteins as direct targets of miR-378. RNA interference with MAPK1 and the other three targets prevented the prohypertrophic effect of antimiR-378, suggesting that they functionally relate to miR-378. In vivo restoration of disease induced loss of miR-378 in a pressure overload mouse model of hypertrophy using adeno associated virus resulted in partial attenuation cardiac hypertrophy and significant improvement in cardiac function along with reduced expression of the four targets in heart. We conclude from these findings that miR-378 is an antihypertrophic microRNA in cardiomyocytes, and the main mechanism underlying this effect is the suppression of the MAP kinase-signaling pathway on four distinct levels. Restoration of disease-associated loss of miR-378 through cardiomyocyte-targeted AAV-miR-378 may prove as an effective therapeutic strategy in myocardial disease. N2 - MicroRNAs sind ca. 22 Nukleotide lange endogene, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die Expression von Genen posttranskriptionell regulieren, indem sie den Abbau der Ziel-mRNA herbeiführen oder deren Translation hemmen. Die Interaktion von microRNA und mRNA erfolgt durch perfekt komplementäre Bindung in der 3’-untranslatierten Region der Ziel-mRNA. Eine Deregulation der Expression verschiedener microRNAs lässt sich bei Herzinsuffizienz beobachten. Im insuffizienten Herzen laufen kompensatorische pathologische Remodellingprozesse ab und es kommt unter anderem zu Hypertrophie und Apoptose von Kardiomyozyten. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir Kandidaten-microRNAs nach folgenden Kriterien identifiziert: 1) Expr e s s ions s t ä rke in Ka rdiomyozyt en, 2) Fähigke i t zur Regul a t ion von Kardiomyozytenhypertrophie im Screening einer synthetischen microRNA-Bibliothek auf Kardiomyozytengröße und 3) Regulation ihrer Expression in frühem und späten Stadium eines murinen Herzinsuffizienzmodells. Aus den resultierenden Kandidaten-microRNAs wurde im folgenden miR-378 näher untersucht. MiR-378 war im gesunden Mausherz stark exprimiert. Die Expression nahm bei Herzinsuffizienz ab. Weiterhin hatte die Überexpression von miR-378 in neonatalen Kardiomyozyten einen antihypertrophen Effekt. Im Gegenzug führte die Expression von antimiR-378 zu einer verstärkten Hypertrophie. Zur Target-Suche wurden zum einen bioinformatische Vorhersage-Datenbanken verwendet und zum anderen ein Microarray durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine Anreicherung von Faktoren des MAP-Kinase- Signalweges: Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1 (MAPK1, auch als ERK2 bezeichnet), Insulinähnlicher Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGF1R), Wachstumsfaktorbindeprotein 2 (GRB2) und Kinasesuppressor von Ras 1 (KSR1). Die Regulation dieser Targets durch miR-378 wurde durch Bestimmung der mRNA- und Proteinexpression nach Überexpression bzw. Inhibition von miR-378 bestätigt. Durch Luziferaseassays mit Reporterkonstrukten, die jeweils die exakten oder mutierte Bindungsstellen der vier Targets enthielten, konnte gezeigt werden, dass die mRNAs der vier Faktoren direkte Targets von miR-378 darstellen. Durch siRNA-mediierte Herabregulation der Zielproteine konnte der prohypertrophe Effekt von antimiR-378 inhibiert werden. Daraus lässt sich schließen, dass der Hypertrophie-Phänotyp direkt auf miR-378 zurückzuführen ist. Schließlich wurde der Effekt von miR-378 im murinen Herzinsuffizienzmodell (Konstriktion der Aorta, TAC) untersucht. TAC führte zu einer Abnahme der Expression von miR-378 im Herzen. Durch Adenoassoziierten Virus (AAV) vermittelte exogene Expression von miR-378 wurde das Expressionslevel des gesunden Herzens im TAC-Modell wiederhergestellt und die Expression der vier Targets herabgesetzt. Dies resultierte in weniger ausgeprägten Kardiomyozytenhypertrophie sowie in einer signifikanten Verbesserung der Herzfunktion. Aus diesen Daten schließen wir, dass miR-378 einen antihypertrophen Effekt auf Kardiomyozyten hat, der wesentlich durch die Suppression des MAP-Kinase-Signalweges an vier Angriffspunkten vermittelt wird. Die Wiederherstellung des “gesunden” Expressionsniveaus von miR-378 im kranken Herzen durch Kardiomyozyten-spezifische Expression mit AAV-miR-378 könnte eine Therapieoption bei Herzerkrankungen sein. KW - Hypertrophie KW - Herzinsuffizienz KW - miRNS KW - Herzmuskelzelle KW - Cardiomyocytes KW - Gene therapy KW - MicroRNA KW - Cardiac hypertrophy KW - Hypertrophy Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100918 ER - TY - THES A1 - Biehl, Stefanie T1 - The Impact of Adult Attention Deficit/ Hyperactivity Disorder, Methylphenidate, and the COMT Val158Met Polymorphism on Selective Attention and Working Memory T1 - Der Einfluss von Aufmerksamkeitsdefizit-/ Hyperaktivitätsstörung bei Erwachsenen, Methylphenidat, und des COMT Val158Met Polymorphismus auf selektive Aufmerksamkeit und Arbeisgedächtnis N2 - Theories of attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) aetiology have placed a focus on impaired behavioural inhibition presumably leading to executive function (EF) deficits. Neuroimaging studies report neurophysiological findings consistent with these hypothesised impairments, and investigations of functional brain activation from a network perspective report hypoactivation in the frontoparietal network as well as hyperactivation in the dorsal attention network. Studies investigating the acute effects of stimulant medication on EF show an improvement on behavioural EF measures including working memory. In addition, methylphenidate (MPH) was shown to up-regulate the task-positive/ frontoparietal network in children and adolescents with ADHD. So far, there are only few studies investigating the impact of ADHD on behavioural and neurophysiological EF measures as well as the effect of several weeks of stimulant medication in adult patients. The importance of the catechol-O-methyltransferase (COMT) enzyme for subcortical and cortical dopaminergic and noradrenergic functioning furthermore led to studies investigating a potential interactive impact of COMT genotype and ADHD on neuropsychological functioning, with a particular focus on working memory. The results of these studies were very heterogeneous. In addition, as none of the studies compared the results of ADHD patients to those of a healthy control group, possible differential effects of COMT in patients and healthy controls could not be examined. The aim of this dissertation was to investigate selective attention properties of the central executive component during a working memory task and to transfer this task to fMRI. A third study then aimed to investigate the effects of adult ADHD (aADHD), MPH, and COMT genotype on working memory with a particular focus on activation of the task-positive network during the analysis of the fMRI data. The first study (EEG) could replicate and extend the results from previous research. This study could furthermore connect the overall activation in frontal areas to suppression efficiency in posterior visual areas as well as establish the impact of hyperactive/ impulsive ADHD symptoms on task performance. The second study (fMRI) allowed the successful transfer of the paradigm to fMRI, and the further replication and extension of previous findings. In addition, this study showed the sensitivity of the task to the effects of the COMT genotype. The third study (fMRI) was one of the first studies that exploratorily investigated the effects COMT in a sample of aADHD patients and a comparable healthy control group. This study showed an interactive effect of these two factors on neuropsychological measures as well as on fMRI activation during a classic n-back working memory task. In addition, this task led to more activation in the task-positive network of the aADHD group compared to a healthy control group in the absence of performance differences, pointing towards compensatory activation in the aADHD group. Furthermore, activation in the frontal cortex was increased in patients taking MPH compared to a placebo. The fMRI data from the selective attention task moreover showed decreased activation in the right DLPFC of the patient group, which was associated with reduced suppression efficiency across all participants. The clinical effect of MPH in the third study was visible but did not reach significance, which is probably attributable to a lack of experimental power. The studies in this dissertation could successfully replicate and extend previous findings. A goal for future studies should be the further investigation of the interactive effects of COMT genotype and aADHD on neuropsychological test results and fMRI activation, but also on medication response and adverse effects. In this context, the adaptation of a network perspective during the analysis of fMRI data seems to be the best way to detect existing between-group differences. N2 - Theorien zur Ätiologie der Aufmerksamkeitsdefizit-/ Hyperaktivitätsstö-rung (ADHS) konzentrieren sich oft auf defizitäre Prozesse der Verhaltensinhibition, die wiederum zu Defiziten der Exekutivfunktionen (EF) führen. Übereinstimmend mit diesen Beeinträchtigungen berichteten Neuroimaging-Studien von Hypoaktivierung im frontoparietalen Netzwerk sowie Hyperaktivierung im dorsalen Aufmerksamkeitsnetzwerk. Studien zur Wirkung von Stimulanzien zeigten eine Verbesserung von EF-Maßen einschließlich des Arbeitsgedächtnisses sowie eine Hochregulierung des aufgabenpositiven/ frontoparietalen Netzwerks durch Methylphenidat (MPH). Bis jetzt untersuchten nur wenige Studien die Auswirkungen von ADHS auf neurophysiologische und Verhaltensmaße der EF sowie den Effekt von länger andauernder Stimulanziengabe bei erwachsenen Patienten. Die Wichtigkeit des Enzyms Catechol-O-Methyltransferase (COMT) für subkortikale und kortikale dopaminerge und noradrenerge Funktionen führte darüber hinaus zu Studien, die eine potentielle Interaktion in der Wirkung des COMT Genotyps und ADHS auf neuropsychologische Funktionen und insbesondere auf das Arbeitsgedächtnis untersuchten. Die Ergebnisse dieser Studien waren recht heterogen. Da zudem keine der Studien die Ergebnisse der ADHS-Patienten mit denen einer gesunden Kontrollgruppe verglich, konnten möglicherweise vorhandene unterschiedliche Einflüsse von COMT bei Patienten und gesunden Kontrollprobanden nicht angemessen ermittelt werden. Das Ziel dieser Dissertation waren zunächst die Untersuchung von selektiven Aufmerksamkeitsprozessen, die durch die Zentrale Exekutive vermittelt werden, sowie die Übertragung der dazu verwendeten Arbeitsgedächtnisaufgabe ins fMRT. Eine dritte Studie strebte die Untersuchung der Auswirkungen von ADHS bei Erwachsenen (aADHS), MPH und COMT Genotyp auf das Arbeitsgedächtnis an. Ein besonderer Fokus bei der Analyse der fMRT-Daten lag hierbei auf der Aktivierung des aufgabenpositiven Netzwerks. Die erste Studie (EEG) konnte bisherige Forschungsergebnisse replizieren und erweitern. Zudem konnte diese Studie die Gesamtaktivierung in frontalen Bereichen mit der Unterdrückungseffizienz in posterioren visuellen Bereichen in Verbindung bringen sowie einen Einfluss von hyperaktiv/ impulsiver ADHS-Symptomatik auf die Verhaltensleistung feststellen. Die zweite Studie (fMRT) zeigte eine erfolgreiche Übertragung des Paradigmas auf das fMRT und eine weitergehende Replizierung und Erweiterung vorheriger Forschungsergebnisse. Es konnte außerdem die Sensitivität der Aufgabe für die Effekte des COMT Genotyps gezeigt werden. Die dritte Studie (fMRT) war eine der ersten Studien, die exploratorisch die Effekte von COMT in einer Stichprobe von aADHS-Patienten und einer vergleichbaren gesunden Kontrollgruppe untersuchte. Hier zeigte sich eine Interaktion von COMT Genotyp und aADHS auf die erhobenen neuropsychologischen Maße sowie auf die fMRT-Aktivierung während einer n-back Arbeitsgedächtnisaufgabe. Die Aufgabe führte zu mehr Aktivierung im aufgabenpositiven Netzwerk der aADHS-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Da keine Leistungsunterschiede zwischen den Gruppen zu erkennen waren, weist diese Hyperaktivierung auf eine kompensatorische Aktivierung in der aADHS-Gruppe hin. Zudem zeigte sich eine erhöhte Aktivierung im Frontalkortex bei Patienten, die MPH statt einem Placebo einnahmen. Die fMRT-Daten der Aufgabe zur selektiven Aufmerksamkeit zeigten außerdem eine reduzierte Aktivierung im rechten DLPFC der Patientengruppe, die über alle Probanden hinweg mit einer reduzierten Unterdrückungseffizienz assoziiert war. Der klinische Effekt von MPH in der Patientenstichprobe war sichtbar, erreichte aber keine Signifikanz, was vermutlich auf eine zu geringe experimentelle Power zurückzuführen ist. Die Studien in dieser Dissertation konnten vorherige Befunde erfolgreich replizieren und erweitern. Ein Ziel für zukünftige Studien sollte die weitergehende Untersuchung dieser Fragestellungen sein. Vor allem in Bezug auf eine Interaktion von COMT Genotyp und aADHS auf neuropsychologische Testergebnisse und fMRT-Aktivierung, aber auch auf Medikamenten-Response und Nebenwirkungen ist dies von großer Bedeutung. Die Übernahme einer Netzwerkperspektive bei der Analyse von fMRT-Daten scheint zudem der beste Weg, existierende Unterschiede zwischen den Gruppen zu finden. KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom KW - adult attention deficit hyperactivity disorder (aADHD) KW - COMT polymorphism KW - methylphenidate KW - working memory KW - Erwachsener KW - Methylphenidat KW - Catecholmethyltransferase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100959 ER - TY - THES A1 - Merker, Sören T1 - Genome-wide screenings in attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD): investigation of novel candidate genes SLC2A3 and LPHN3 T1 - Genomweite Untersuchungen des Aufmerksamkeitsdefizit/ Hyperaktivitätssyndroms (ADHS): Analyse der neuen Kandidatengene SLC2A3 und LPHN3 N2 - Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is a highly prevalent childhood-onset neurodevelopmental disorder that involves a substantial risk of persisting into adolescence and adulthood. A number of genome-wide screening studies in ADHD have been conducted in recent years, giving rise to the discovery of several variants at distinct chromosomal loci, thus emphasising the genetically complex and polygenic nature of this disorder. Accordingly, promising novel candidate genes have emerged, such as the gene encoding the glucose transporter isoform 3 (SLC2A3) and the gene encoding the latrophilin isoform 3 (LPHN3). In this thesis, both genes were investigated in form of two separated projects. The first focused on SLC2A3 polymorphisms associated with ADHD and their potential physiological impact. For this purpose, gene expression analyses in peripheral cell models were performed as well as functional EEG measurements in humans. The second project concerned the murine gene Lphn3 including the goal of developing a mouse line containing a genetically modified Lphn3 with conditional knockout potential. In this respect, a specific DNA vector was applied to target the Lphn3 gene locus in murine embryonic stem (ES) cells as a prerequisite for the generation of appropriate chimeric mice. The results of the first project showed that SLC2A3 duplication carriers displayed increased SLC2A3 mRNA expression in peripheral blood cells and significantly altered event-related potentials (ERPs) during tests of cognitive response control and working memory, possibly involving changes in prefrontal brain activity and memory processing. Interestingly, ADHD patients with the rs12842 T-allele, located within and tagging the SLC2A3 gene, also exhibited remarkable effects during these EEG measurements. However, such effects reflected a reversed pattern to the aforementioned SLC2A3 duplication carriers with ADHD, thus indicative of an opposed molecular mechanism. Besides, it emerged that the impact of the aforementioned SLC2A3 variants on different EEG parameters was generally much more pronounced in the group of ADHD patients than the healthy control group, implying a considerable interaction effect. Concerning the second project, preliminary results were gathered including the successful targeting of Lphn3 in murine ES cells as well as the production of highly chimeric, phenotypically unremarkable and mostly fertile mouse chimeras. While germline transmission of the modified Lphn3 allele has not yet occurred, there are still several newborn chimeric mice that will be tested in the near future. In conclusion, the findings suggest that SLC2A3 variants associated with ADHD are accompanied by transcriptional and functional changes in humans. Future research will help to elucidate the molecular network and neurobiological basis involved in these effects and apparently contributing to the complex clinical picture of ADHD. Moreover, given the increasing number of publications concerning latrophilins in recent years and the multitude of research opportunities provided by a conditional knockout of Lphn3 in mice, the establishment of a respective mouse line, which currently is in progress, constitutes a promising approach for the investigation of this gene and its role in ADHD. N2 - Das Aufmerksamkeitsdefizit/Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) ist eine hoch prävalente und bereits in der Kindheit beginnende Neuroentwicklungsstörung, die eine erhebliche Persistenz ins Jugend- und Erwachsenenalter aufweist. In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von genomweiten Studien zu ADHS durchgeführt, welche zur Identifizierung zahlreicher genetischer Varianten an unterschiedlichen chromosomalen Loci geführt und somit die genetisch komplexe polygene Natur dieser Störung zur Geltung gebracht haben. Auf diese Weise traten auch neue Kandidatengene zutage, wie zum Beispiel das Gen für die Glukosetransporter-Isoform-3 (SLC2A3) und das Gen, welches Latrophilin-3 kodiert (LPHN3). Innerhalb dieser Thesis wurden beide Gene in Form von zwei voneinander getrennten Projekten untersucht. Das erste Projekt beschäftigte sich mit humanen ADHS-assoziierten SLC2A3-Polymorphismen und ihrer potentiellen physiologischen Bedeutung. Für diesen Zweck wurden Genexpressionsanalysen in peripheren Zellmodellen sowie funktionelle EEG-Messungen im Menschen durchgeführt. Im zweiten Projekt ging es um das murine Gen Lphn3 mit dem Ziel, eine Mauslinie zu entwickeln, die ein genetisch verändertes Lphn3 mit konditionalem Knockout-Potenzial aufweist. In diesem Zusammenhang wurde ein spezifischer DNA-Vektor verwendet, der auf den Lphn3-Genlocus in murinen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) abzielte, was eine Voraussetzung für die Erzeugung von geeigneten chimären Mäusen darstellt. Die Ergebnisse des ersten Projektes legten nahe, dass SLC2A3-Duplikationsträger erhöhte SLC2A3-mRNA-Expression in peripheren Blutzellen aufweisen sowie signifikant veränderte ereigniskorrelierte Potentiale während eines Tests kognitiver Reaktionskontrolle sowie eines Arbeitsgedächtnis-Tests, was möglicherweise von veränderter präfrontaler Hirnaktiviät bzw. Gedächtnis-Prozessierung begleitet wird. Interessanterweise zeigten ADHS-Patienten mit T-Allel des im SLC2A3-Gen liegenden SNPs rs12842 ebenfalls deutliche Effekte während dieser EEG-Messungen, allerdings in entgegengesetzter Form zu den zuvor genannten SLC2A3-Duplikationsträgern mit ADHS, was auf einen gegensätzlichen molekularen Mechanismus hindeutet. Zudem stellte sich heraus, dass der Einfluss der zuvor genannten SLC2A3-Varianten auf verschiedene EEG-Parameter innerhalb der ADHS-Gruppe generell deutlich stärker ausgeprägt war als in der gesunden Kontrollgruppe, also einen beachtlichen Interaktionseffekt impliziert. Bezüglich des zweiten Projektes konnten bisher Zwischenergebnisse erzielt werden: das erfolgreiche Targeting des Lphn3-Gens in murinen ES-Zellen sowie die Produktion hochchimärer, phänotypisch unauffälliger und größtenteils fertiler Maus-Chimären. Obgleich die Keimbahntransmission des modifizierten Lphn3-Allels bislang noch nicht eingetreten ist, gibt es noch eine Reihe an neugeborenen chimären Mäusen, die in nächster Zeit erst noch getestet werden müssen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Variationen des SLC2A3-Gens, die mit ADHS assoziiert sind, mit transkriptionellen und funktionellen Veränderungen im Menschen einhergehen. Zukünftige Forschungsarbeiten werden dabei helfen, die molekularen Netzwerke und neurobiologischen Grundlagen zu verdeutlichen, die an diesen Effekten beteiligt sind und offenbar zu dem komplexen klinischen Bild von ADHS beitragen. Angesichts der steigenden Zahl an Publikationen über Latrophiline in den letzten Jahren und der unzähligen Forschungsmöglichkeiten, die ein konditionaler Knockout von Lphn3 in Mäusen bietet, stellt die derzeit laufende Etablierung einer entsprechenden Mauslinie einen vielversprechenden Ansatz dar, dieses Gen und seine Rolle für ADHS zu untersuchen. KW - Genexpression KW - Glucosetransportproteine KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom KW - Latrophilin receptor KW - Knockout-Maus KW - ADHD KW - Genetics KW - Glucosetransporter Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100129 ER - TY - THES A1 - El-Mesery, Mohamed T1 - Development of CD40-targeted bifunctional scFv-TRAIL fusion proteins that induce TRAILR1- and TRAILR2-specifc cell death and dendritic cells activation T1 - Entwicklung CD40 gerichteter bifunktioneller scFv-TRAIL Fusionsproteine die TRAILR1- und TRAILR2-spezifischen Zelltod und dendritischen Zellaktivierung induzieren N2 - TRAIL is a member of TNF superfamily and mediates apoptosis by binding to two DRs, TRAILR1 and TRAILR2. Despite the fact that there are other TRAILRs, TRAILR1 and TRAILR2 receive the major research interest due to their ability to trigger apoptosis and their possible use as targets in tumor therapy. Due to the potential advantages of TRAILR1- or TRAILR2-specific targeting, we investigated recently published TRAIL DR-specific mutants, one conferring specificity for TRAILR1 (TRAILmutR1) and one for TRAILR2 (TRAILmutR2). It was well proved in this work that TRAILmutR1 shows specific binding to TRAILR1 and no specific binding to TRAILR2. TRAILmutR2 vice versa shows specific binding to TRAILR2 and no significant binding to TRAILR1. Moreover, these mutants were able to induce caspase activation and cell death in a TRAILR1/2-specific manner. Moreover, the enhancement of TRAILR2-induced apoptosis by secondary oligomerization of soluble wild-type TRAIL was confirmed for the TRAILR2-specifc TRAIL mutant and similar findings were made with the TRAILR1-specific TRAIL mutant. The soluble form of TRAIL exhibits weak apoptotic activity as compared to transmembrane TRAIL. Therefore, there is the challenge in clinical research to improve the activity of soluble TRAIL. A second strategy besides the above mentioned oligomerization to improve soluble TRAIL activity is anchoring of the molecule to the cell surface, e.g. through the genetic fusion with a scFv domain recognizing a cell surface antigen. In this work, we generated fusion proteins of TRAIL, TRAILmutR1 and TRAILmutR2 with a scFv recognizing CD40 (scFv:G28). Initially, we analyzed the functionality of both the TRAIL domain and the scFv:G28 domain of the corresponding fusion proteins. TRAIL functionality was well proved through its ability to induce cell death in TRAIL sensitive cells such as Jurkat cells, provided that scFv:G28-TRAIL fusion proteins were oligomerized by anti-Flag mAb M2. Concerning the scFv:G28 domain, the fusion proteins showed enhanced binding affinity to cell lines expressing CD40 as compared to their parental CD40-negative cells. Consistent with previous studies investigating TRAIL fusion proteins with other cell surface antigen-targeting scFvs, the scFv:G28 fusion proteins with TRAIL, TRAILmutR1 and TRAILmutR2 showed enhanced induction of cell death in a CD40-dependent manner. Moreover, our results revealed that these fusion proteins have a significant paracrine apoptotic effect on CD40-negative bystander cells upon anchoring to CD40-positive cells which are TRAIL resistant. Thus, the current work provides for the first time scFv fusion proteins of TRAIL and TRAILR1- and TRAILR2-specific TRAIL mutants with CD40-restricted activity. These fusion proteins provide the advantage of attenuating the off-target effects and the potential side effects of per se highly active TRAIL variants on one hand due to the CD40-binding dependent enhancement of activity and on the other hand due to the differential use of TRAILR1 and TRAILR2. CD40 represents a tumor associated marker which is expressed on many tumor cells but also on immune cells. Therefore, the last part of this work focused on the analysis of the ability of scFv:G28-TRAIL fusion proteins to induce CD40 signaling both in tumor cells and also in immune cells. It turned out that the scFv:G28-TRAIL fusion proteins are able to induce CD40 signaling in CD40-positive tumor cells but especially also in immune cells such as iDCs leading to their maturation and further activation of immune responses. Taken together, this work provides novel bifunctional scFv-TRAIL fusion proteins which combine the induction of apoptosis via TRAIL DR with stimulation of CD40 signaling which possibly enhances antitumor immunity. N2 - TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Superfamilie und vermittelt Apoptose durch die Aktivierung der Todesrezeptoren, TRAILR1 und TRAILR2. Obwohl es weitere TRAIL-Rezeptoren gibt, liegt das Hauptaugenmerk auf den beiden Apoptose induzierenden Rezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 auf Grund ihrer möglichen Anwendung in der Tumortherapie. Wegen der möglichen Vorteile eines spezifischen TRAILR1- und TRAILR2-Targetings, haben wir kürzlich publizierte TRAIL-Todesrezeptor spezifische TRAIL Mutanten untersucht, von denen eine spezifisch für TRAILR1 (TRAILmutR1) und die andere spezifisch für TRAILR2 (TRAILmutR2) ist. Es konnte in dieser Arbeit sehr gut belegt werden, dass TRAILmutR1 spezifisch an TRAILR1 bindet und keine Bindung an TRAILR2 zeigte. Dem entsprechend zeigte die Variante TRAILmutR2 nur eine spezifische Bindung an TRAILR2 und keine signifikante Bindung an TRAILR1. Des Weiteren waren die Mutanten in der Lage, die Caspase-Aktivierung und den Zelltod TRAILR1/2-abhängig zu induzieren. Außerdem konnte eine Erhöhung der TRAILR2-induzierten Apoptose durch eine sekundäre Oligomerisierung der TRAILR2-spezifische TRAIL-Mutante erzielt werden. Ähnliche Ergebnisse zeigte die TRAILR1-spezifische TRAIL-Mutante. Um die Aktivität des löslichen TRAIL Oligomerisierung unabhängig zu erhöhen, wurden in dieser Arbeit TRAIL-Fusionsproteine mit einem scFv (scFv:G28), der CD40 erkennt generiert. In Übereinstimmung mit früheren Studien, die mit TRAIL-Fusionsproteinen von anderen Zelloberflächenantigen-spezifischen scFvs wurden, zeigten die CD40-spezifischen scFv:G28 Fusionsproteine mit TRAIL, TRAILmutR1 und TRAILmutR2 eine verstärkte CD40-abhängige Induktion des Zelltods. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass diese Fusionsproteine nach Bindung an CD40-positive Zellen einen parakrinen apoptotischen Effekt, auf umliegende CD40-negative Zellen haben. Diese Arbeit beschreibt somit zum ersten Mal scFv-TRAIL Fusionsproteine mit einer CD40-abhängigen TRAILR1- und TRAILR2-spezifischen Aktivität. CD40 repräsentiert einen tumorassoziierten Marker, der in vielen Tumorzellen aber auch in Zellen des Immunsystems exprimiert wird. Aus diesem Grund fokussierte sich der zweite Teil dieser Arbeit auf die Analyse der Fähigkeit der scFv:G28-TRAIL Fusionsproteine, CD40-Signaling sowohl in Tumor- als auch in Immunzellen zu stimulieren. Es konnte festgestellt werden, dass die scFv:G28-TRAIL Fusionsproteine in der Lage sind, CD40-Signaling in CD40-positiven Tumorzellen, aber auch in Immunzellen, z.B. in iDCs, in denen die ScFv-TRAIL Fusionsproteine die Reifung und Aktivierung induzieren ohne Zelltod auszulösen. Zusammengefasst beschreibt diese Arbeit neue bifunktionelle scFv-TRAIL Fusionsproteine, die die Induktion der Apoptose via TRAIL-Todesrezeptoren und die Stimulation des kostimulatorischen CD40-Moleküls kombinieren, was zu einer synergistischen dualen Antitumor-Aktivität führen kann. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Antigen CD40 KW - CD40-targeted bifunctional scFv-TRAIL fusion proteins KW - development KW - TRAIL mutants KW - CD40 gerichteter bifunktioneller scFv-TRAIL Fusionsproteine KW - Entwicklung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100114 ER - TY - THES A1 - Karunakaran, Mohindar Murugesh T1 - Evolution of Vγ9Vδ2 T-cells T1 - Die Evolution der Vγ9Vδ2 T-Zellen N2 - Human Vγ9Vδ2 T cells are the major subset of blood γδ T cells and account for 1-5% of blood T cells. Pyrophosphorylated metabolites of isoprenoid biosynthesis are recognized by human Vγ9Vδ2 T cells and are called as phosphoantigens (PAg). Isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP) are among the few well studied PAg. IPP is found in all organisms while HMBPP is a precursor of IPP found only in eubacteria, plants and apicomplexaen parasite. Interestingly, the PAg reactive Vγ9Vδ2 T cells are so far identified only in human and higher primates but not in rodents. Hence, Vγ9Vδ2 T cells are believed to be restricted to primates. With regard to PAg recognition, a Vγ9JP recombined TCRγ chain and certain CDR3 motifs of the TCR chain are mandatory. The BTN3A1 molecule is essential for a response to PAg. BTN3 is a trans-membrane protein belonging to butyrophilin family of proteins. Though BTN3A1 was found to be essential for PAg presentation, the exact molecular basis of PAg presentation still remains unclear. This thesis presents new data on the evolution of Vγ9Vδ2 TCR and its ligands (BTN3) as well as the genetic basis of PAg presentation to Vγ9Vδ2 TCR. The comprehensive analysis of genomic database sequences at NCBI and other public domain databases revealed for the first time that Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes emerged and co-evolved along with the placental mammals. Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes are scattered across mammalian species and not restricted to primates. But interestingly, all three genes are highly conserved between phylogenetically distinct species. Moreover, the distribution pattern of Vγ9, Vδ2 TCR genes and BTN3 genes suggests a functional association between these genes representing the TCR - ligand relationship. Alpaca (Vicugna pacos), a member of the camelid family, is one among the 6 candidate non-primate species which were found to possess functional Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes. From peripheral lymphocytes of alpaca, Vγ9 chain transcripts with a characteristic JP rearrangement and transcripts of Vδ2 chains with a CDR3 typical for PAg-reactive TCR were identified. The transduction of αβ TCR negative mouse thymoma BW cells with alpaca Vγ9 and Vδ2 TCR chains resulted in surface expression of the TCR complex as it was deduced from detection of cell surface expression of mouse CD3. Cross-linking of alpaca Vγ9Vδ2 TCR transductants with anti-CD3ε led to IL-2 production which confirmed that alpaca Vγ9 and Vδ2 TCR chains pair to form a functional TCR. Besides the conservation of human like Vγ9 and Vδ2 TCR chains, alpaca has conserved an orthologue for human BTN33A1 as well. Interestingly, the predicted PAg binding sites of human BTN3A1 was 100% conserved in deduced amino acid sequence of alpaca BTN3A1. All together alpaca is a promising candidate for further studies as it might have preserved Vγ9Vδ2 T cells to function in surveillance of stress and infections. This thesis also provides the sequence of Vγ9Vδ2 TCR of African green monkey (Chlorocebus aethiops), which was previously unknown. Moreover, our data indicates the lack of any species specific barrier which could hinder the PAg presentation by African monkey derived COS cells to human Vγ9Vδ2 TCR and vice versa of human cells to African green monkey Vγ9Vδ2 TCR which was in contradiction to previously reported findings. Apart from the above, the thesis also presents new data on the genetic basis of PAg presentation to Vγ9Vδ2 T cells, which revealed that human chromosome 6 is sufficient for the presentation of exogenous and endogenous PAg. By employing human/mouse somatic hybrids, we identified the role of human chromosome 6 in PAg presentation and in addition, we observed the lack of capacity of human chromosome 6 positive hybrids to activate Vγ9Vδ2 TCR transductants in the presence of the alkylamine sec-butylamine (SBA). Investigation of Chinese hamster ovary (CHO) cells containing the human chromosome 6 also yielded similar results. This suggests that aminobisphosphonates (zoledronate) and alkylamines employ different mechanisms for activation of Vγ9Vδ2 T cells although both have been described to act by inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase activity which is known to increase intracellular levels of the IPP. In conclusion, this thesis suggests that Vγ9, Vδ2 and BTN3 genes controlling Vγ9Vδ2 TCR- ligand relationship emerged and co-evolved along with placental mammals; and also identified candidate non-primate species which could possess Vγ9Vδ2 T cells. Furthermore, it suggests alpaca as a promising non-primate species to investigate the physiological function of Vγ9Vδ2 T cells. With respect to PAg antigen presentation it was shown that chromosome 6 is essential and sufficient for exogenous and endogenous PAg presentation. Moreover, the alkylamine SBA and aminobisphosphonate zoledronate may engage different cellular mechanism to exert inhibition over IPP consumption. The thesis raises interesting questions which need to be addressed in future: 1) What are the environmental and evolutionary factors involved in preservation of Vγ9Vδ2 T cells only by few species? 2) What could be the functional nature and antigen recognition properties of such a conserved T cell subset? 3) What is the genetic and molecular basis of the differential capacity of human chromosome 6 bearing rodent-human hybridoma cells in activating Vγ9Vδ2 T cells in presence of SBA and aminobisphosphonates? N2 - Vγ9Vδ2 T Zellen stellen im Menschen die größte Population an γδ T Zellen im Blut dar. Ihr Anteil an den Blut-T Zellen beträgt 1-5%. Humane Vγ9Vδ2 T Zellen erkennen als Phosphoantigene (PAg) bezeichnete pyrophosphorylierte Metabolite der Isoprenoidbiosynthese wobei Isopentenylpyrophosphat (IPP) und (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphat (HMBPP) zu den wenigen gut erforschten PAg gehören. IPP ist in allen Organismen zu finden während HMBPP ein IPP Vorläufer ist, der nur in Eubakterien, Pflanzen und Apikomplexa vorkommt. Interessanterweise wurden PAg-reaktive Vγ9Vδ2 T Zellen bisher nur im Menschen und höheren Primaten gefunden, aber nicht in Nagern. Daher wurde angenommen, dass Vγ9Vδ2 T Zellen eine exklusiv in Primaten vorkommende Population darstellt. Hinsichtlich der PAg-Bindung sind TCR  Ketten mit einer Rekombination von Vγ9 und JP zwingend notwendig und bestimmte CDR3 Motive der V2 TCR Kette, wobei die Erkennung der PAg von der Präsenz des BTN3A1 Moleküls abhängt. BTN3 ist ein Transmembranprotein und gehört zur Butyrophilinfamilie. Obwohl gezeigt wurde, das BTN3A für die PAg-Präsentierung unerlässlich ist, ist deren molekularer Mechanismus noch immer unklar. Die vorgelegte Arbeit beinhaltet sowohl neue Daten über die Evolution des Vγ9Vδ2 TCR und dessen Liganden (BTN3), als auch über die genetischen Grundlagen der PAg-Präsentierung. Eine umfassende Analyse genomischer Datenbanksequenzen des NCBI sowie anderer öffentlicher Datenbanken zeigte erstmals, dass Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene zusammen mit den höheren Säugetieren (Placentalia) entstanden und sich gemeinsam weiter entwickelten. Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene existieren über die gesamten Placentalia verteilt und nicht allein in Primaten. Erstaunlicherweise sind alle drei Gene auch zwischen phylogenetisch unterschiedlichen Spezies hoch konserviert und das Verteilungsmuster von Vγ9, Vδ2 und BTN3 Genen lässt auf eine funktionale Verbindung dieser Gene schliessen, wie sie die TCR/Ligand Interaktion darstellt. Weitergehende Analysen resultierten in der Identifizierung von sechs möglichen Kandidatenspezies, die nicht zu den Primaten gehören und funktionelle Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene besitzen. Hierzu gehört auch das Alpaka (Vicugna pacos), ein Mitglied der Famile der Kamele. Aus periphären Alpakalymphozyten wurden TCR-γ-Kettentranskripte mit charakteristischem Vγ9JP Rearrangement sowie TCR-δ-Kettentranskripte mit für PAg-reaktive Zellen typischen CDR3 amplifiziert. Die Transduktion der Alpaka-Vγ9 und Vδ2 Ketten in die TCR-negativen Maus T-Zell Hybridomlinie BW resultierte in einer Oberflächenexpression des TCR Komplex wie aus der Zelloberflächenexpression von Maus CD3 geschlossen werde konnte. Die Aktivierung dieses TCR Komplexes mittels anti-CD3ε Antikörpern führte zur Produktion von IL-2 durch die TCR-Transduktante, was die funktionelle Paarung der Alpaka Vγ9 und Vδ2 TCR-Ketten bestätigte. Neben den Vγ9 und Vδ2 TCR-Kettengenen existiert im Alpakagenom ebenso ein konserviertes Ortholog des humanen BTN3. Interessanterweise sind die mutmaßlichen PAg-Bindungsstellen des humanen BTN3A1 in dessen abgeleiteter Aminosäuresequenz zu 100% konserviert. Diese Daten machen das Alpaka zu einen vielversprechenden Kandidaten für weitere Untersuchungen, da hier möglicherweise die Population der Vγ9Vδ2 Zellen in ihrer Funktion zur Überwachung von Stress und Infektionen erhalten geblieben ist. Ebenso liefert diese Arbeit die Sequenz des Vγ9Vδ2 TCR der Grünen Meerkatze (Chlorocebus aethiops), welche zuvor nicht bekannt war. Darüber hinaus wurde keine Speziesspezifität in der Präsentierung von PAg durch COS Zellen der Grünen Meerkatze für den humanen Vγ9Vδ2 TCR oder umgekehrt der Präsentierung von PAg durch Meerkatzenzellen für humane Vγ9Vδ2 TCRs gefunden, was im im Widerspruch zu bisher veröffentlichten Ergebnissen steht. Zudem liefert diese Arbeit auch neue Ergebnisse zur genetischen Grundlage der PAg- Präsentierung für die Vγ9Vδ2 T Zellen. Hier zeigte sich, dass das humane Chromosom 6 für die Präsentierung exogener sowie endogener PAg ausreicht. Durch die Generierung somatischer Mensch/Maus Hybride konnten wir die Rolle des humanen Chromosom 6 in der Phosphoantigenpräsentierung ermitteln und zudem beobachten, dass Chromosom 6 positive Hybride nicht in der Lage waren, Vγ9Vδ2 TCR Transduktanten in Anwesenheit des Alkylamins sec-Butylamin (SBA) zu aktivieren. Desweiteren brachten Versuche mit Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), die das humane Chromosom 6 enthielten, ähnliche Ergebnisse. Dies legt nahe, dass Aminobisphosphonate (Zoledronat) und Alkylamine unterschiedliche Mechanismen der Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen nutzen obwohl für beide beschrieben ist, dass sie durch Inhibition der Farnesylpyrophosphatsynthase wirken, die wiederum zum Anstieg des intrazellulären IPP-Spiegels führt. Zusammengefasst legt diese Arbeit die Co-Evolution der die Vγ9Vδ2 TCR/Ligand Interaktion kontrollierenden Vγ9, Vδ2 und BTN3 Gene in Placentalia nahe und identifiziert nicht den Primaten zugehörige Spezies als Kandidaten, die Vγ9Vδ2T Zellen besitzen könnten, von denen das Alpaka als vielversprechend für die Untersuchung der physiologischen Rolle von Vγ9Vδ2 T Zellen vorgeschlagen wird. Hinsichtlich der PAg-Präsentierung bestätigen die vorliegenden Ergebnisse, dass das humane Chromosom 6 zugleich nötig und ausreichend ist, endogene sowie exogene PAg zu präsentieren. Zudem könnten das Alkylamin SBA und Aminobiosphonat Zoledronat verschiedene Mechanismen zur Inhibierung des IPP Verbrauchs nutzen. Diese Ergebnisse werfen einige Fragen auf, die es in Zukunft zu beantworten gilt: 1) Was sind die Umwelt- und Evolutionsfaktoren, die dazu geführt haben, dass Vγ9Vδ2 T Zellen nur in wenigen Spezies erhalten blieben? 2) Was könnte die funktionale Natur und die Antigenbindungseigenschaften einer solchen konservierten T Zell Population sein? 3) Was ist die genetische und molekulare Grundlage für die unterschiedliche Fähigkeit von das humane Chromosom 6 tragenden Mensch-Nager Hybridomazellen, Vγ9Vδ2 T Zellen in Anwesenheit von SBA und Aminobisphosphonaten zu aktivieren? KW - Evolution KW - γδ T cells KW - Vγ9Vδ2 T cells KW - Alpaca KW - Chromosome 6 KW - BTN3A1 and Phospho-antigen presentation KW - T-Lymphozyt KW - Chromosom 6 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99871 ER - TY - THES A1 - Morowski, Martina T1 - Relevance of platelet count and ITAM-signalling pathway in murine models of haemostasis, thrombosis and thrombo-inflammation T1 - Relevanz der Thrombozytenzahl und des ITAM-Signalwegs in Mausmodellen der Hämostase, Thrombose und Thromboinflammation N2 - Platelets are important players in haemostasis and their activation is essential to limit post-traumatic blood loss upon vessel injury. On the other hand, pathological platelet activation may lead to thrombosis resulting in myocardial infarction and stroke. Platelet activation and subsequent thrombus formation are, therefore, tightly regulated and require a well-defined interplay of platelet surface receptors, intracellular signalling molecules, cytoskeletal rearrangements and the activation of the coagulation cascade. In vivo thrombosis and haemostasis models mimic thrombus formation at sites of vascular lesions and are frequently used to assess thrombotic and haemostatic functions of platelets. In this dissertation, different in vivo models were used in mice to address the question at what level a reduced platelet count (PC) compromises stable thrombus formation. To study this, mice were rendered thrombocytopenic by low-dose anti-GPIbα antibody treatment and subjected to a tail bleeding time assay as well as to four different in vivo thrombosis models. Haemostasis and occlusive thrombus formation in small vessels were only mildly affected even at severe reductions of the PC. In contrast, occlusive thrombus formation in larger arteries required higher PCs demonstrating that considerable differences in the sensitivity for PC reductions exist between these models. In a second part of this study, mice were rendered thrombocytopenic by injection of high-dose anti-GPIbα antibody which led to the complete loss of all platelets from the circulation for several days. During recovery from thrombocytopenia, the newly generated platelet population was characterised and revealed a defect in immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-signalling. This defect translated into impaired arterial thrombus formation. To further investigate ITAM-signalling in vivo, genetically modified mice were analysed which display a positive or negative regulation of platelet ITAM-signalling in vitro. Whereas mice lacking the adapter Grb2 in platelets showed a delayed thrombus formation in vivo after acetylsalicylic acid treatment, Clp36ΔLIM bone marrow chimeric mice and SLAP/SLAP2-deficient mice displayed pro-thrombotic properties in vivo. Finally, mice lacking the adapter protein EFhd2 were analysed in vitro and in vivo. However, EFhd2-deficient platelets showed only a minor increase in the procoagulant activity compared to control. N2 - Thrombozyten sind wichtige Zellen für die Hämostase, die bei einer Verletzung der Gefäßwand aktiviert werden, um den Blutverlust zu begrenzen. Auf der anderen Seite kann die pathologische Aktvierung von Thrombozyten jedoch zu Thromboseereignissen und in Konsequenz zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen. Die Aktivierung von Thrombozyten und die nachfolgende Thrombusbildung sind daher streng reguliert und setzen ein enges Zusammenspiel von Thrombozytenoberflächenrezeptoren, intrazellulären Signalmolekülen, Zytoskelettumstrukturierungen und die Aktivierung der Koagulationskaskade voraus. In vivo Thrombose- und Hämostase-Modelle ahmen die Thrombusbildung in Gefäßen nach und werden häufig benutzt um die hämostatische und thrombotische Funktion von Thrombozyten zu untersuchen. In dieser Dissertation wurden verschiedene in vivo Modelle in Mäusen genutzt, um zu klären, ab welcher Thrombozytenzahl eine stabile Thrombusbildung beeinträchtigt ist. Für diese Untersuchung wurden Mäuse mit geringen Dosen anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einer Reduktion der Thrombozytenzahl führen. Anschließend wurden die Mäuse in einem Blutungszeitmodel und vier verschiedenen thrombotischen Modellen untersucht. Hämostase oder okklusive Thrombusbildung in kleinen Gefäßen waren auch bei einer sehr starken Reduktion der Thrombozytenzahl kaum beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu war für eine normale Thrombusbildung in größeren Gefäßen eine höhere Thrombozytenzahl nötig. Verschiedene in vivo Modelle zeigen daher eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber einer Reduktion der Thrombozytenzahl. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Mäuse mit einer hohen Dosis anti-GPIbα Antikörper behandelt, die zu einem völligen, mehrtägigen Verlust aller Thrombozyten im Blutkreislauf führte. Während sich die Thrombozytenzahl erholte, wurden neu generierte Thrombozyten charakterisiert, die einen deutlichen Defekt im ITAM-Signalweg zeigten. Dieser Defekt führte zu einer verminderten arteriellen Thrombusbildung. Um Auswirkungen eines Defektes im ITAM-Signalweg detaillierter in vivo zu untersuchen, wurden genetisch veränderte Mäuse, die in vitro eine reduzierte oder verstärkte ITAM-Signaltransduktion in Thrombozyten zeigen, untersucht. Während Mäuse, die in Thrombozyten kein Grb2 exprimieren nach Acetylsalicylsäurebehandlung in vivo eine verlangsamte Thrombusbildung zeigten, war die Thrombusbildung in Clp36ΔLIM Knochenmarkchimären und SLAP/SLAP2-defizienten Mäusen beschleunigt. Darüber hinaus wurden EFhd2-defiziente Mäuse in vitro und in vivo analysiert. EFhd2-defiziente Thrombozyten zeigten jedoch nur eine geringe Steigerung in der prokoagulatorischen Aktivität im Vergleich zu Kontrolltieren. KW - Thrombozyt KW - Platelet count KW - ITAM-signalling KW - Murine models of thrombosis and haemostasis KW - Maus KW - Blutstillung KW - Thrombose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99193 ER - TY - THES A1 - Thielmann, Ina T1 - Function and regulation of phospholipase D in blood platelets: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Funktion und Regulation von Phospholipase D in Thrombozyten: in vitro und in vivo Studien in Mäusen N2 - Summary Platelet activation and aggregation are crucial for primary hemostasis but can also result in occlusive thrombus formation. Agonist induced platelet activation involves different signaling pathways leading to the activation of phospholipases (PL) which produce second messengers. While the role of PLCs in platelet activation is well established, less is known about the relevance of PLDs. In the current study, the function and regulation of PLD in platelets was investigated using genetic and pharmacological approaches. In the first part of this thesis, adhesion, activation and aggregation of platelets from mice lacking PLD2 or both PLD1 and PLD2 were analyzed in vitro and in vivo. While the absence of PLD2 resulted in slightly reduced PLD activity in platelets, it had no detectable effect on the platelet function in vitro and in vivo. However, the combined deficiency of both PLD isoforms resulted in defective alpha-granule release and protection in a model of ferric chloride induced arteriolar thrombosis, effects that were not observed in mice lacking only one PLD isoform. These results revealed, for the first time, redundant roles of PLD1 and PLD2 in platelet alpha-granule secretion and indicate that this may be relevant for pathological thrombus formation. Thus, PLD might represent a promising target for antithrombotic therapy. Thus, this hypothesis was tested more directly in the second part of this thesis. The effects of pharmacological inhibition of PLD activity on hemostasis, thrombosis and thrombo-inflammatory brain infarction in mice were assessed. Treatment of platelets with the reversible, small molecule PLD inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) led to a specific blockade of PLD activity that was associated with reduced -granule release and integrin activation. Mice that received FIPI at a dose of 3 mg/kg displayed reduced occlusive thrombus formation upon chemical injury of carotid arteries or mesenterial arterioles. Similarly, FIPI-treated mice had smaller infarct sizes and significantly better motor and neurological function 24 hours after transient middle cerebral artery occlusion. This protective effect was not associated with major intracerebral hemorrhage or prolonged tail bleeding times. Thus, pharmacological PLD inhibition might represent a safe therapeutic strategy to prevent arterial thrombosis or ischemic stroke. After revealing a central role for PLD in thrombo-inflammation, the regulation of PLD activity in platelets was analyzed in the last part of the thesis. Up to date, most studies made use of inhibitors potentially exerting off-target effects and consequently PLD regulation is discussed controversially. Therefore, PLD activity in mice genetically lacking potential modulators of PLD activity was determined to address these controversies. These studies revealed that PLD is tightly regulated during initial platelet activation. While integrin outside-in signaling and Gi signaling was dispensable for PLD activation, it was found that PLC dependent pathways were relevant for the regulation of PLD enzyme activity. N2 - Zusammenfassung Thrombozytenaktivierung und -aggregation sowie die anschließende Thrombusbildung sind essentielle Prozesse während der primären Hämostase. Andererseits kann unkontrollierte Thrombozytenaktivierung zum Gefäßverschluss und somit zu Schlaganfall oder Herzinfarkt führen. Verschiedene Signalwege, die für die Thrombozytenaktivierung von Bedeutung sind, führen zur Aktivierung von Phospholipasen (PL), die daraufhin sekundäre intrazelluläre Botenstoffe generieren. Während die Rolle von PLCs für die Thrombozytenaktivierung bekannt ist, ist die Relevanz der PLDs noch ungeklärt. Die vorliegende Arbeit untersucht die Funktion und Regulation von PLD in der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung mittels genetisch veränderter Mäuse. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Adhäsion, Aktivierung und Aggregation von Pld2-/- und Pld1-/-/Pld2-/- Thrombozyten in vitro und in vivo untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Abwesenheit von PLD2 zu einer verminderten PLD Aktivität in Thrombozyten führte. Dies hatte allerdings keinen erkennbaren Effekt auf die Funktion der Thrombozyten in vitro und in vivo. Die PLD doppel-defizienten Thrombozyten hingegen wiesen Defekte bei der Sekretion der α-Granula auf, was zur Bildung von instabilen FeCl3-induzierten Thromben in einem in vivo Thrombosemodell führte. Diese Effekte waren in den einzeldefizienten Mäusen nicht vorhanden, was auf redundante Funktionen von PLD1 und PLD2 in diesem Prozess schließen lässt. Interessanterweise wurden keine hämostatischen Defekte durch die Doppeldefizienz hervorgerufen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass PLD eine neue potentielle antithrombotische Zielstruktur darstellt. Diese Hypothese wurde im zweiten Teil der Arbeit weiter überprüft. Der Effekt einer PLD Hemmung durch den reversiblen PLD Inhibitor 5-Fluoro-2-indolyl des-chlorohalopemide (FIPI) auf Hämostase und Thrombose wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit FIPI zu einer spezifischen Blockade von PLD führte, die die alpha-Degranulierung und Integrinaktivierung, im ähnlichen Ausmaß wie in den doppeldefizienten Mäusen, beeinträchtigte. Des Weiteren zeigten Mäuse, die mit 3 mg/kg FIPI behandelt wurden, starke Defekte in der arteriellen Thrombusbildung in Makro- und Mikrogefäßen. FIPI vermittelte PLD Inhibition führte außerdem zu einem Schutz der Mäuse in einem Modell des ischämischen Schlaganfalls, ohne intrazerebrale Blutungen hervorzurufen. Diese Ergebnisse etablieren FIPI als potentiellen antithrombotischen Wirkstoff für eine effektive und sichere Behandlung von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen. Da PLD eine zentrale Rolle während der Thrombusbildung hat, wurde im letzten Teil der Arbeit auf die Regulation von PLD während der Thrombozytenaktivierung eingegangen. Bisherige Studien verwendeten häufig Inhibitoren, die zu unspezifischen Effekten führen können. Daher wird die Regulation von PLD in der Literatur kontrovers diskutiert. Die Untersuchung der PLD Aktivität in verschiedenen knockout Mauslinien stellt einen nützlichen Ansatz dar, um die kontrovers diskutierte PLD Regulation aufzuklären. Zu diesem Zweck wurde die PLD Aktivität in genetisch veränderten Mäusen, denen potentielle Regulatoren von PLD fehlen, gemessen. Im Zuge diesen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass integrinabhängige- und Gi-vermittelte Signalwege keinen Einfluss auf die Regulation von PLD hatten, während PLC vermittelte Signale von Bedeutung waren. KW - Phospholipase D KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Schlaganfall KW - Hämsotase KW - Phospholipase D KW - Thrombose KW - Hämostase KW - Schlaganfall KW - Blutstillung KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99179 ER - TY - THES A1 - Wang, Ying T1 - Immune and peripheral endogenous opioid mechanisms of electroacupuncture analgesia T1 - Immunologische und periphere endogene Opioidmechanismen bei Analgesie durch Elektroakupunktur N2 - A precious treasure in traditional Chinese medicine (TCM), acupuncture played a vital and irreplaceable role in contributing to people’s health in the thousands of years of Chinese history, and in 2010 was officially added to the “Representative List of the Intangible Cultural Heritage of Humanity” by the United Nations. Because of the side-effects of long-term drug therapy for pain, and the risks of dependency, acupuncture has been widely accepted as one of the most important alternative choice therapies for treating varieties of acute and chronic pain-related disorders. The clinical application and scientific mechanism research of acupuncture have therefore increased intensively in the last few decades. Besides hand acupuncture, other treatment approaches e.g. electroacupuncture (EA) have been widely accepted and applied as an important acupuncture-related technique for acupuncture analgesia (AA) research. The involvement of opioid peptides and receptors in acute AA has been shown via pre-EA application of opioid receptor/peptide antagonists. However, existing publications still cannot illuminate the answer to the following question: how does sustained antinociception happen by EA treatment? The hypothesis of opioid peptide-mediated tonic AA might be able to answer the question. In the first part of this thesis, the institution of a reproducible acupuncture treatment model as well as the endogenous opioid-related mechanisms was demonstrated. An anatomically-based three-dimensional (3D) rat model was established to exhibit a digital true-to-life organism, accurate acupoint position and EA treatment protocol on bilateral acupoint GB-30 Huantiao. The optimal EA treatment protocol (100 Hz, 2-3 mA, 0.1 ms, 20 min) at 0 and 24 h after induction of inflammatory pain by complete Freund’s adjuvant (CFA) on conscious free-moving rats was then established. EA elicited significant sustained mechanical and thermal antinociception up to 144 h. Post-EA application of opioid receptors (mu opioid receptor, MOR; delta opioid receptor, DOR) antagonists naloxone (NLX) and naltrindole (NTI), or opioid peptide antibodies anti-beta-endorphin (anti-END), met-enkephalin (anti-ENK) or -dynorphin A (anti-DYN) could also block this effect at a late phase (96 h) of CFA post-EA, which suggested opioid-dependent tonic analgesia was produced by EA. Meanwhile, EA also reduced paw temperature and volume at 72-144 h post CFA indicating anti-inflammatory effects. Nociceptive thresholds were assessed by paw pressure threshold (Randall-Sellito) or paw withdrawal latency (Hargreaves) and an anti-inflammatory effect was evaluated by measurement of plantar temperature and volume of inflamed paw. The second part of the thesis further suggests the correlation between the chemokine CXCL10 (= interferon-gamma inducible protein 10, IP-10) and opioid peptides in EA-induced antinociception. Based on a comprehensive Cytokine Array of 29 cytokines, targeted cytokines interleukin (IL)-1alpha, interleukin (IL)-1beta, tumor necrosis factor (TNF)-alpha, interleukin (IL)-4, interleukin (IL)-13, interferon (IFN)-gamma as well as CXCL10 were selected and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and real time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) quantification confirmed upregulation of CXCL10 mRNA at both 72 and 96 h. The following hyperalgesic assessment suggested the antinociceptive effect of CXCL10. The double immunostaining localizing opioid peptides with macrophages expressed the evident upregulation of CXCR3-receptor of CXCL10 in EA treated samples as well as the significant upregulation or downregulation of opioid peptides by repeated treatment of CXCL10 or antibody of CXCL10 via behavioral tests and immune staining. Subsequent immunoblotting measurements showed non-alteration of opioid receptor level by EA, indicating that the opioid receptors did not apparently contribute to AA in the present studies. In vitro, CXCL10 did not directly trigger opioid peptide END release from freshly isolated rat macrophages. This might implicate an indirect property of CXCL10 in vitro stimulating the opioid peptide-containing macrophages by requiring additional mediators in inflammatory tissue. In summary, this project intended to explore the peripheral opioid-dependent analgesic mechanisms of acupuncture with a novel 3D treatment rat model and put forward new information to support the pivot role of chemokine CXCL10 in mediating EA-induced tonic antinociception via peripheral opioid peptides. N2 - Als wertvoller Schatz in der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) spielt die Akupunktur eine wichtige und unersetzliche Rolle für die Gesundheit der Menschen in der über tausendjährigen Geschichte von China und wurde im Jahr 2010 offiziell in das "Weltkulturerbe" der Vereinten Nationen aufgenommen. Aufgrund der Nebenwirkungen von Langzeittherapien zur Schmerzbehandlung und dem Risiko der Abhängigkeit wird Akupunktur weithin als eine wichtigste Alternative für die Behandlung von akuten und chronischen Schmerzen eingesetzt. Die klinische Anwendung und Forschung in der Akupunktur wurden in den letzten Jahrzehnten intensiv vorangetrieben. Neben Handakupunktur gibt es noch andere Behandlungsmöglichkeiten, wie z.B. die Elektroakupunktur (EA). EA ist vor allem eine allgemein akzeptierte und wichtige akupunkturbezogene Technik für die Akupunkturanalgesie (AA) in der Forschung. Die Beteiligung von Opioidpeptiden und Opioidrezeptoren in der akuten AA wurde mittels Anwendung von Opioidrezeptorantagonisten/Opioidpeptidantikörpern appliziert vor EA gezeigt. Nach dem aktuellen Forschungsstand kann man jedoch nicht die Frage beantworten, wie die längerfristige (tonische) Antinozizeption nach EA-Behandlung funktioniert. Mit einer Hypothese zur Opioidpeptid vermittelten tonischen AA könnte man die Frage hierzu beantworten. In der vorliegenden Arbeit wurden in einem Modell der Akupunktur zum ersten Mal endogene Opioid-vermittelte Mechanismen reproduzierbar nachgewiesen. Es wurde ein dreidimensionales (3D) anatomisch-basiertes Rattenmodell entworfen, um am wachen Tier ein genaue Akupunkturbehandlung (EA) an den Akupunkten GB-30 Huantiao beidseitig durchzuführen. Darüber hinaus wurde ein optimiertes Behandlungsprotokoll von EA (100 Hz, 2-3 mA, 0.1 ms, 20 min) bei Ratten 0 und 24 h nach intraplantarer Injektion von komplettem Freunds Adjuvans (CFA) etabliert. Nozizeptive Schwellen wurden mittels Pfotendruckschwelle (Randall-Sellito) oder Pfotenrückzugslatenzzeit (Hargreaves) gemessen und die entzündungshemmende Wirkung durch Messung der Pfotentemperatur und Volumen der entzündeten Pfote ausgewertet. EA bewirkte eine signifikante mechanische und thermische Antinozizeption, welche bis zu 144 h anhielt. Die antinozizeptive Wirkung durch EA war nach Injektion von Opioidrezeptorantagonisten (mu opioid receptor, MOR; delta opioid receptor, DOR) Naloxon (NLX) und Naltrindol (NTI) oder Antikörpern gegen die Opioidpeptide beta-Endorphin (anti-END), Met-Enkephalin (anti-ENK) oder Dynorphin A (anti-DYN) während der späten Entzündungsphase (96 h) mit CFA blockierbar. Dies lässt auf eine durch EA induzierte tonische Analgesie schließen. Darüber hinaus reduzierte EA auch die erhöhte Pfotentemperatur und das erhöhte Pfotenvolumen, welche sehr typisch ist für eine 96-144 h Entzündung mit CFA. Dies spricht für eine entzündungshemmende Wirkung von EA. Nachfolgend wurde die Beteiligung von Opioidpeptiden und dem Chemokin CXCL10 (= Interferon-gamma induziertes Protein 10, IP-10) sowie die Korrelationen zwischen beiden geklärt. Basierend auf umfangreichenden Zytokinarrays mit 29 Zytokinen, wurden die Zytokine Interleukin (IL)-1alpha, Interleukin (IL)-1beta, Tumornekrosefaktor (TNF)-alpha, Interleukin (IL)-4, Interleukin (IL)-13, Interferon (IFN)-gamma und CXCL10 gezielt ausgewählt und im Enzym Immunoassay (ELISA) sowie durch eine Echtzeit Reverse Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) quantifiziert. Die Quantifizierung auf mRNA-Ebene zeigte eine Hochregulation von CXCL10 bei 96 h und zum früheren Zeitpunkt von 72 h. Nachfolgende Schmerzschwellenmessungen wiesen auf eine antinozizeptive Wirkung von CXCL10 hin. Eine Doppelimmunfärbung zeigte die Lokalisation von Opioidpeptiden in Makrophagen. Nachweislich wurde die Expression des CXCR3-Rezeptor von CXCL10 in EA behandelten Pfoten erhöht. Ebenso kam es zu einer signifikanten Hochregulation von Opioidpeptiden durch wiederholte Behandlung mit CXCL10 bzw. Herunterregulation der Opioidpeptide nach wiederholter Behandlung mit anti-CXCL10 Antikörper. Dies wurde sowohl in Verhaltenstests als auch in der Immunfärbung zu beobachtet. Immunoblotting zeigte keine Veränderung der Expression von Opioidrezeptoren nach EA, was schließen lässt, dass die Menge an Opioidrezeptoren in den vorliegenden Untersuchungen keine Rolle spielen. Da CXCL10 in vitro keine direkten Effekt auf die Freisetzung des Opioidpeptides beta-END aus frisch isolierten Rattenmakrophagen hat, liegt die Vermutung nahe, dass CXCL10 in vitro eine indirekte Rolle als Mediator zukommt und indirekt die Opioidpeptidfreisetzung aus Makrophagen in entzündlichen Gewebe stimuliert wird. Zusammenfassend wurden in dem hier vorgestellten Projekt die Opioidpeptid-abhängigen analgetischen und peripheren Mechanismen der Akupunktur mit einem neuartigem 3D-Behandlungsmodell der Ratte untersucht und eine Schlüsselrolle des Chemokins CXCL10 bei der Vermittlung der EA-induzierten tonischen Antinozizeption in Abhändigkeit von peripheren Opioidpeptiden. (Translated by Dr. Dagmar Hackel and revised by Priv.-Doz. Dr. Heike Rittner) KW - Elektroakupunktur KW - electroacupuncture KW - peripheral analgesia KW - Chemokin CXCL10 KW - Analgesie KW - Cytokine KW - Ratte KW - opioid peptide KW - cytokines KW - Periphere Analgesie KW - Opioidpeptide Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98326 ER - TY - THES A1 - Kühn, Andrea T1 - The molecular interplay of proteins expressed in the sexual stages and the induction of gamete formation in the malaria parasite Plasmodium falciparum T1 - Molekulare Wechselwirkungen in den Sexualstadien exprimierter Proteine und die Induktion der Gametenbildung im Malariaerreger Plasmodium falciparum N2 - Transmission of the malaria parasite from man to the mosquito requires the formation of sexual parasite stages, the gametocytes. The gametocytes are the only parasite stage that is able to survive in the mosquito midgut and to undergo further development – gamete formation and fertilization. Numerous sexual stage-specific proteins have been discovered, some of which play crucial roles for parasite transmission. However, the functions of many sexual stage proteins remain elusive. Amongst the sexual stage-specific proteins are the proteins of the PfCCp proteins family, which exhibit numerous adhesion domains in their protein structures. For four members of the protein family, PfCCp1 to PfCCp4 gene-disruptant parasite lines had been already studied. Amongst these, PfCCp2 and PfCCp3 showed an important role for development of the parasites in the mosquito. In the present work the study of gene-disrupted parasites of the PfCCp Protein family was completed. PfCCp5-KO and PfFNPA-KO parasite lines were characterized to a great extent and many properties were similar to those of other PfCCp proteins. The co-dependent expression previously reported to be a phenomenon of PfCCp proteins was also observed in these two mutants, although to lesser extent. When either PfCCp5 or PfFNPA were absent, all other proteins were detected in reduced abundance only. Co-dependent expression manifests exclusively on the protein level. Transcript levels were not altered as RT-PCR showed. Amongst PfCCp proteins numerous proteinproteins interactions are taking place. The previously described multimeric protein complexes also include further sexual stage-specific proteins like Pfs230, Pfs48/45 and Pfs25. Recently, a new component of PfCCp-based multimeric protein complexes had been identified. The protein was named PfWLP1 (WD repeat protein-like protein 1) due to its possession of several WD40 repeats. In the present study expression of this uncharacterized protein was investigated via indirect IFA. It was expressed in asexual blood stages and gametocytes. Upon gamete formation and fertilization its expression ceased. Another sexual stage protein studied in this work was PfactinII. It was shown to be exclusively expressed in sexual stages. In gametocytes it co-localizes with Pfs230 and correct localization of PfactinII depends on presence of Pfs230. Transcript analysis by means of RT-PCR revealed the expression of several components of the IMC in gametocytes. Furthermore, five or six myosin genes encoded in the P. falciparum genome were detected in gametocytes. Gametocyte egress was studied on the ultrastructural level via transmission electron microscopy and an inside-out type of egress was observed. Firstly, the membrane of the parasitophorous vacuole (PVM) was lysed and only thereafter the membrane of the red blood cell (RBCM) ruptured. Furthermore, a new inductor of gametogenesis was identified: The K+/H+ ionophore nigericin induced gametocytes activation in the absence of xanthurenic acid (XA), which is responsible for gamtetocyte activation in the mosquito midgut. Selective permeabilization of RBCM and PVM by the mild detergent saponin, showed that in the absence of these membranes male gametocytes were still able to perceive both XA and the drop in temperature. Thus, the receptors for both factors signaling the parasite transmission to the mosquito, seem to be of parasitic origin. LC/MS/MS analysis confirmed the ability of RBCs to take up XA. With malaria eradication on the agenda of malaria research targeting the sexual stages becomes a crucial part of intervention strategies. The sexual stages are especially attractive target as they represent a population bottleneck. The here reported findings on P. falciparum gametocytes provide several potential candidate proteins for developing tools to interrupt transmission from man to mosquito. Such tools might include Transmission blocking vaccines and drugs. N2 - Die Übertragung der Malaria vom menschlichen Wirt auf die Überträgermücke erfordert die Bildung von Sexualstadien, der Gametozyten. Dieses Parasitenstadium ist in der Lage im Mitteldarm der Mücke zu überleben und sich zu Gameten zu entwickeln, gefolgt von Befruchtung und ygotenbildung. Eine Vielzahl von in den Sexualstadien exprimierter Proteine wurde bereits entdeckt. Einige von diesen haben essentielle Funktionen für die Transmission der Parasiten auf die Mücke. Die Rolle der meisten dieser spezifisch exprimierter Protein ist jedoch ungeklärt. Zu den sexualstadienspezifischen Proteinen gehören die Proteine der PfCCp-Proteinfamilie. Für vier Proteine diese Proteinfamilie wurden bereits KO-Mutanten untersucht. Zwei Mutanten, PfCCp2-KO und PfCCp3-KO besitzen eine wichtige Funktion während der Entwicklung der Parasiten in der Mücke. In der vorliegenden Arbeit wurde die Studie der PfCCp-Proteine komplettiert. PfCCp5- und PfFNPA-defiziente Parasitenlinien wurden zu einem Großteil charakterisiert. Viele Eigenschaften dieser beiden Parasitenlinien wiesen Ähnlichkeiten zu den bisher untersuchten PfCCp-KO-Mutanten auf. Die ko-abhängige Expression welche in der PfCCp-Proteinfamilie vorkommt, wurde auch in diesen beiden Mutanten beobachtet, wenngleich in geringerem Ausmaß. In den Mutanten, in welchem entweder PfCCp5 oder PfFNPA fehlten, waren alle übrigen PfCCp-Proteine nur in reduzierter Menge nachzuweisen. Diese ko-abhängige Expression ist ausschließlich auf dem Proteinlevel zu beobachten. Die Transkription der jeweiligen Gene hingegen ist unbeeinflusst. Zahlreiche Protein-Protein-Interaktionen finden zwischen den Proteinen der Proteinfamilie statt. The zuvor beschriebenen multimeren Proteinkomplexe schließen auch weitere sexualstadienspezifische Proteine ein, wie Pfs230, Pfs48/45 und Pfs25. Kürzlich wurde eine neue Komponente der PfCCp-basierten Multiproteinkomplexe identifiziert. Dieses Protein wurde PfWLP1 (WD repeat protein-like protein 1) genannt, da es mehrere WD40 repeat Domänen besitzt. In der vorliegenden Arbeit wurde das bisher unbeschriebene Protein mittels indirekter immunfluoreszenzstudien charakterisiert. PfWLP1 ist sowohl in asexuellen Blutstadien als auch in Gametozyten exprimiert. Nach der Gametenbildung und Fertilisation nimmt die Expression des Proteins ab. Ein weiteres Protein der Sexualstadien, welches in dieser Arbeit untersucht wurde, ist PfactinII. Es wurde gezeigt, dass dieses Protein ausschließlich in den Sexualstadien vorliegt. In Gametozyten ko-lokalisiert es mit Pfs230 und die korrekte Lokalisierung ist abhängig von der Anwesenheit von Pfs230. Mittels RT-PCR wurden mehrere Komponenten des inneren Membrankomplexes in Gametozyten nachgewiesen. Weiterhin wurden Transkripte für fünf der sechs Myosin-Gene, welche im Genom von P. falciparum exprimiert sind, nachgewiesen. Der Austritt der Gametozyten aus der Wirtszelle wurde auf ultrastruktureller Ebene mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Hierbei wurde gezeigt, dass die Lyse der den Parasiten umgebenden Membranen von innen nach außen geschieht. Das heißt, dass zunächst die Membran der parasitophoren Vakuole (PVM) lysiert wird, und erst anschließend die Erythrozyten-Plasmamembran (RBCM). Als neuer Induktor der Gametozytenaktivierung wurde Nigericin identifiziert. Nigericin ist ein K+/H+-Ionophor, welcher in Abwesenheit von XA in der Lage ist, die Gametenbildung zu identifizieren. Die selektive Permeabilisierung der beiden den Gametozyten umgebenden Membranen, PVM und RBCM, zeigte, dass männliche Gametozyten nach Entfernung der beiden Membranen, in der Lage sind, den Temperaturabfall und XA zu perzipieren. Somit kann geschlussfolgert werden, dass die Rezeptoren beider Stimuli parasitischen Ursprungs sind. LC/MS/MS-Analysen bestätigten, dass Erythrozyten in der Lage sind, XA aufzunehmen. Die Sexualstadien des Malariaparasiten nehmen mehr und mehr an Bedeutung zu, da langfristig nicht nur eine Eindämmung der Malaria in endemischen Gebieten sondern die Auslöschung der Malaria angestrebt wird. Die Sexualstadien sind ein attraktiver Angriffspunkt aufgrund ihrer Bedeutung für die Transmission der Krankheit. Zum anderen ist die auf den Vektor übertragene Parasitenanzahl vergleichsweise gering. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen mehrere potentielle Kandidatenproteine auf, welche für die Entwicklung von Interventionsstrategien von Bedeutung sein könnten. Als Interventionsstrategien wären sowohl transmissionsblockierenden Vakzine als auch transmissionsblockierende Wirkstoffe denkbar. KW - Malaria KW - Multiproteinkomplex KW - Gametocyt KW - Gametogenese KW - Plasmodium falciparum KW - malaria KW - Plasmodium falciparum KW - gametogenesis KW - co-dependent expression KW - gametocyt Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98028 ER - TY - THES A1 - Förster, Sabine T1 - Nuclear Hormone Receptors and Fibroblast Growth Factor Receptor Signaling in Echinococcus multilocularis T1 - Signalwege in Echinococcus multilocularis am Beispiel der Nukleären Hormonrezeptoren und des Fibroblast Growth Factor Rezeptors N2 - Parasitic helminths share a large degree of common genetic heritage with their various hosts. This includes cell-cell-communication mechanisms mediated by small peptide cytokines and lipophilic/steroid hormones. These cytokines are candidate molecules for host-parasite cross-communication in helminth diseases. In this work the function of two evolutionary conserved signaling pathways in the model cestode Echinococcus multilocularis has been studied. First, signaling mechanisms mediated through fibroblast growth factors (FGF) and their cognate receptors (FGFR) which influence a multitude of biological functions, like homeostasis and differentiation, were studied. I herein investigated the role of EmFR which is the only FGFR homolog in E. multilocularis. Functional analyses using the Xenopus oocyte expression system clearly indicate that EmFR can sense both acidic and basic FGF of human origin, resulting in an activation of the EmFR tyrosine kinase domain. In vitro experiments demonstrate that mammalian FGF significantly stimulates proliferation and development of E. multilocularis metacestode vesicles and primary cells. Furthermore, DNA synthesis and the parasite’s Erk-like MAPK cascade module was stimulated in the presence of exogenously added mammalian FGF. By using the FGFR inhibitor BIBF1120 the activity of EmFR in the Xenopus oocyte system was effectively blocked. Addition of BIBF1120 to in vitro cultivated Echinococcus larval material led to detrimental effects concerning the generation of metacestode vesicles from parasite stem cells, the proliferation and survival of metacestode vesicles, and the dedifferentiation of protoscoleces towards the metacestode. In conclusion, these data demonstrate the presence of a functional EmFR-mediated signaling pathway in E. multilocularis that is able to interact with host-derived cytokines and that plays an important role in larval parasite development. Secondly, the role of nuclear hormone receptor (NHR) signaling was addressed. Lipophilic and steroid hormone signaling contributes to the regulation of metazoan development. By means of in silico analyses I demonstrate that E. multilocularis expresses a set of 17 NHRs that broadly overlaps with that of the related flatworms Schistosoma mansoni and S. japonicum, but also contains several NHR encoding genes that are unique to this parasite. One of these, EmNHR1, is homolog to the DAF-12/HR-96 subfamily of NHRs which regulate cholesterol homeostasis in metazoans. Modified yeast-two hybrid analyses revealed that host serum contains a ligand which induces homodimerization of the EmNHR1 ligand-binding domain. Also, a HNF4-like homolog, EmHNF4, was characterized. Human HNF4 plays an important role in liver development. RT-PCR experiments showed that both isoforms of the EmHNF4 encoding gene are expressed stage-dependently suggesting distinct functions of the two isoforms in the parasite. Moreover, specific regulatory mechanisms on the convergence of NHR signaling and TGF-β/BMP signaling pathways in E. multilocularis have been identified. On the one hand, EmNHR1 directly interacted with the EmSmadC and on the other hand EmHNF4b interacted with EmSmadD, EmSmadE which are all downstream signaling components of the TGF-β/BMP signaling pathway. This suggests cross-communication in order to regulate target gene expression. With these results, further studies on the role of NHR signaling in the cestode will be facilitated. Also, the first serum-free in vitro cultivation system for E. multilocularis was established using PanserinTM401 as medium. Serum-free co-cultivation with RH-feeder cells and an axenic cultivation method have been established. With the help of this serum-free cultivation system investigations on the role of specific peptide hormones, like FGFs, or lipophilic/steroid hormones, like cholesterol, for the development of helminths will be much easier. N2 - Parasitäre Würmer weisen eine große genetische Verwandtschaft mit ihren Wirten auf. Diese schließt auch Zell-Zell-Kommunikationsmechanismen ein, die sowohl durch Peptidhormone als auch durch lipophile/steroidale Hormone vermittelt werden. Man vermutet, dass diese Stoffe eine wichtige Rolle bei der Wirt-Parasiten-Kreuzkommunikation spielen. Deshalb untersuchte diese Arbeit die Funktion von zwei konservierten Signalwegen im Modellorganismus Echinococcus multilocularis. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit den Fibroblast Growth Factors (FGF). Diese steuern durch die Bindung an spezifische FGF-Rezeptoren (FGFR) eine Vielzahl von biologischen Funktionen, wie beispielsweise Homöostase- und Differenzierungsprozesse. Zunächst wurde EmFR, das einzige FGFR-Homolog im Fuchsbandwurm in Xenopus Oozyten heterolog exprimiert. Dabei wurde nachgewiesen, dass der Rezeptor sowohl acidic als auch basic FGF erkennen kann und dies zur Aktivierung der Tyrosinkinasedomäne führt. Außerdem förderte im in vitro Experiment die exogene Zugabe dieser Wirtsfaktoren die Proliferation und Entwicklung von Metacestodenvesikeln und Primärzellen. Darüber hinaus wurden die DNA-Synthese und die Erk-MAPK-Kaskade des Parasiten stimuliert. Im Gegensatz dazu konnte durch die Hinzugabe des FGFR-Inhibitor BIBF1120 die Aktivität des Rezeptors im Xenopus Oozytensystem erfolgreich blockieret werden. Durch den Inhibitor wurde die Regeneration von Metacestodenvesikeln aus Stammzellen, die Proliferation und das Überleben von Metacestodenvesikeln verhindert und eine Dedifferenzierung von Protoskolizes verursacht. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass E. multilocularis einen funktionellen durch EmFR-vermittelten Signalweg besitzt, welcher in der Lage ist, mit Wirtszytokinen zu interagieren und eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Echinococcus Larvenstadien spielt. Außerdem wurde die Bedeutung der Nukleären Hormon Rezeptoren (NHR) für den Parasiten untersucht. Lipophile und steroidale Hormone regulieren viele Entwicklungsprozesse in Metazoen. Mittels in silico Analyse konnten 17 Rezeptoren der NHR-Familie in E. multilocularis identifiziert werden, die größtenteils mit dem NHR Repertoire von Schistosoma mansoni und S. japonicum übereinstimmen. Allerdings wurden auch Rezeptoren identifiziert, die einzigartig für E. multilocularis sind. Einer dieser Rezeptoren, EmNHR1, ist homolog zur DAF-12/HR-96 Familie, die den Cholesterinstoffwechsel in Metazoen reguliert. Yeast-Two Hybrid Experimente zeigten, dass Wirtsserum den putativen Liganden von EmNHR1 enthält, da dessen Zugabe zur Homodimerisierung der EmNHR1-Liganden-bindungsdomäne führte. Außerdem wurde mit EmHNF4 ein weiterer Rezeptor charakterisiert, dessen humanes Homolog die Entwicklung der Leber beeinflusst. RT-PCR-Experimente zeigten, dass die zwei entdeckten Isoformen von EmHNF4 stadienspezifisch exprimiert werden, was auf mögliche Funktionsunterschiede deutet. Darüber hinaus wurde sowohl für EmNHR1, als auch für EmHNF4 beobachtet, dass die DNA-Bindungsdomänen mit Komponenten des TGF-β/BMP-Signalwegs direkte Proteininteraktionen eingehen. Während EmNHR1 mit EmSmadC interagiert, zeigte EmHNF4b eine Reaktion mit EmSmadD und EmSmadE, was auf eine Kreuzkommunikation zwischen beiden Signalwegen deutet. Diese Ergebnisse werden zukünftige Studien bezüglich der Funktion von NHR-Signalwegen in Zestoden deutlich erleichtern. Weiterhin wurde in dieser Arbeit das erste serum-freie in vitro Kultivierungssystem für E. multilocularis etabliert. PanserinTM401 diente als Medium sowohl für die Kultur mit Fütterzellen als auch für eine axenische Kulturmethode. Mit Hilfe dieses Systems können in Zukunft Untersuchungen über die Rolle von Peptidhormonen wie FGF, oder lipophilen bzw. steroidalen Substanzen, wie Cholesterin, bei der Parasitenentwicklung besser untersucht werden. KW - Signaltransduktion KW - Fuchsbandwurm KW - Echinococcus multilocularis KW - Alveoläre Echinokokkose KW - FGF KW - Nukleäre Hormonrezeptoren KW - Echinococcus multilocularis KW - Alveolar Echinococcosis KW - FGF Signaling KW - Hormone Receptor Signaling KW - Fibroblastenwachstumsfaktor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85832 ER - TY - JOUR A1 - Bäuerlein, Carina A. A1 - Riedel, Simone S. A1 - Baker, Jeanette A1 - Brede, Christian A1 - Jordán Garrote, Ana-Laura A1 - Chopra, Martin A1 - Ritz, Miriam A1 - Beilhack, Georg F. A1 - Schulz, Stephan A1 - Zeiser, Robert A1 - Schlegel, Paul G. A1 - Einsele, Hermann A1 - Negrin, Robert S. A1 - Beilhack, Andreas T1 - A diagnostic window for the treatment of acute graft-versus-host disease prior to visible clinical symptoms in a murine model JF - BMC Medicine N2 - Background Acute graft-versus-host disease (aGVHD) poses a major limitation for broader therapeutic application of allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). Early diagnosis of aGVHD remains difficult and is based on clinical symptoms and histopathological evaluation of tissue biopsies. Thus, current aGVHD diagnosis is limited to patients with established disease manifestation. Therefore, for improved disease prevention it is important to develop predictive assays to identify patients at risk of developing aGVHD. Here we address whether insights into the timing of the aGVHD initiation and effector phases could allow for the detection of migrating alloreactive T cells before clinical aGVHD onset to permit for efficient therapeutic intervention. Methods Murine major histocompatibility complex (MHC) mismatched and minor histocompatibility antigen (miHAg) mismatched allo-HCT models were employed to assess the spatiotemporal distribution of donor T cells with flow cytometry and in vivo bioluminescence imaging (BLI). Daily flow cytometry analysis of peripheral blood mononuclear cells allowed us to identify migrating alloreactive T cells based on homing receptor expression profiles. Results We identified a time period of 2 weeks of massive alloreactive donor T cell migration in the blood after miHAg mismatch allo-HCT before clinical aGVHD symptoms appeared. Alloreactive T cells upregulated α4β7 integrin and P-selectin ligand during this migration phase. Consequently, targeted preemptive treatment with rapamycin, starting at the earliest detection time of alloreactive donor T cells in the peripheral blood, prevented lethal aGVHD. Conclusions Based on this data we propose a critical time frame prior to the onset of aGVHD symptoms to identify alloreactive T cells in the peripheral blood for timely and effective therapeutic intervention. KW - Allogeneic stem cell transplantation KW - Graft-versus-host disease KW - Minor histocompatibility antigen mismatch transplantation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96797 UR - http://www.biomedcentral.com/1741-7015/11/134 ER - TY - THES A1 - Thakur, Chitra T1 - Lineage tracing of metastasis in a mouse model for Non-small cell lung cancer (NSCLC) T1 - Untersuchung metastatischer Prozesse durchgenetische Zellmarkierung in einem Mausmodelldes nichtkleinzelligen Lungenkarzinoms (NSCLC) N2 - Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the deadliest form of lung cancer and has a poor prognosis due to its high rate of metastasis. Notably, metastasis is one of the leading causes of death among cancer patients. Despite the clinical importance, the cellular and molecular mechanisms that govern the initiation, establishment and progression of metastasis remain unclear. Moreover, knowledge gained on metastatic process was largely based on cultured or in vitro manipulated cells that were reintroduced into immune-compromised recipient mice. In the present study, a spontaneous metastasis mouse model for NSCLC was generated with a heritable fluorescent tag (DsRed) driven by CAG (combination of cytomegalovirus early enhancing element and chicken beta actin) promoter in alveolar type II cells (SpC-rtTA/TetO-Cre/LSL-DsRed). This approach is essential, keeping in mind the reprogramming nature of Myc oncogene (Rapp et al, 2009). Such genetic lineage tracing approach not only allowed us to monitor molecular and cellular changes during development of primary tumor but also led us to identify the different stages of secondary tumor development in distant organs. Upon combined expression of oncogenic C Raf-BXB and c-Myc (MYC-BXB-DsRed) in lung alveolar type II epithelial cells, macroscopic lung tumors arose comprising of both cuboidal and columnal cellular features. C Raf-BXB induced tumors (CRAF-DsRed) exhibit cuboidal morphology and is non-metastatic whereas Myc-BXB induced lung tumors (Myc-BXB-DsRed) present cuboidal-columnar cellular features and is able to undergo metastasis mainly in liver. Surprisingly, cystic lesions which were negative for SpC (Surfactant protein C) and CCSP (Clara cell secretory protein), strongly expressed DsRed proteins indicating its origin from lung alveolar type II cells. Moreover, early lung progenitor markers such as GATA4 (GATA-binding protein 4) and TTF1 (Thyroid Transcription Factor 1) were still expressed in these early cystic lesions suggesting metastasis as a faulty recapitulation of ontogeny (Rapp et al, 2008). Interestingly, mixed cystic lesions and metastatic tumors contained DsRed and SpC positive cells. These results demonstrate secondary tumor progression from cystic, mixed cystic to malignant transformation. Our results shed tremendous light on reprogramming of metastasizing cells during secondary tumor development. Moreover, such fluorescent tagged metastatic mice model can also be used to track the migration ability of metastatic cancer cell to different organs and its potential to differentiate into other cell types such as blood vessel or stromal cell within the primary tumor. N2 - Das nichtkleinzellige Lungenkarzinom (‚non-small cell lung cancer‘, NSCLC) ist die tödlichste Form des Lungenkrebses mit schlechter Prognose aufgrund hoher Metastasierungsneigung. Metastasierung ist eine der häufigsten Todesursachen bei Krebspatienten. Trotz ihrer klinischen Bedeutung sind die zellulären und molekularen Mechanismen der Entstehung, Etablierung und Progression von Metastasen weiterhin unklar. Darüberhinaus basiert das bisherige Wissen über den Metastasierungsprozess überwiegend auf Zellen, die entweder in vitro kultiviert oder manipuliert und danach in immundefiziente Mäuse rückübertragen wurden.In der vorliegenden Studie wurde ein Mausmodell mit erblichem Fluoreszenzmarker (DsRed) zur spontanen Metastasierung bei NSCLC entwickelt, der durch den CAG-Promotor (‚combination of cytomegalovirus early enhancing element and chicken beta actin‘) in alveolären Typ II-Zellen (SpC-rtTA/TetO-Cre/LSL-DsRed) exprimiert wird. Aufgrund des Reprogrammierungscharakters des Myc-Onkogens war dieser Ansatz essentiell (Rapp et al, 2009). Die Markierung der Zellpopulation auf genetischem Weg erlaubte uns zum einen, die molekularen und zellulären Veränderungen während der Bildung des Primärtumors zu verfolgen, zum anderen konnte so die Entwicklung von Sekundärtumoren unterschiedlicher Stadien in entfernten Organen identifiziert werden. Bei kombinierter Expression von onkogenem C Raf-BXB und c-Myc (MYC-BXB-DsRed) in Lungenalveolar-Epithelzellen vom Typ II entstanden makroskopische Tumore in der Lunge, die auf zellulärer Ebene sowohl kuboidalen als auch kolumnaren Charakter aufwiesen und Metastasen, vorwiegend in der Leber, ausbildeten. Durch C Raf-BXB (CRAF-DsRed) induzierte Tumore erschienen morphologisch als kuboidal ohne Metastasierungsneigung. Überraschenderweise exprimierten zystische Läsionen in der Leber, obwohl negativ für SpC (‚surfactant protein C‘) und CCSP (‚Clara cell secretory protein‘), als Kennzeichen für deren Ursprung aus Lungenalveolarzellen Typ II stark das DsRed-Protein. Darüberhinaus sind in den frühen zystischen Läsionen Marker für frühe Lungenvorläuferzellen wie GATA4 (‚GATA-binding protein 4‘) und TTF1 (‚thyroid transcription factor 1‘) weiterhin exprimiert, was auf den Metastasierungsprozess als gestörte Rekapitulation der Ontogenese hindeutet (Rapp et al, 2008). Metastatische Tumore und Mischformen zu zystischen Läsionen enthielten DsRed- und SpC-positive Zellpopulationen. Diese Ergebnisse weisen in Sekundärtumoren den Übergang von zystischer Läsion zur Mischform mit zystischem Anteil und zur malignen Transformation nach.Unsere Resultate werfen ein neues Licht auf Reprogrammierungsprozesse metastasierender Zellen bei der Bildung von Sekundärtumoren. Das vorgestellte fluoreszenzmarkierte und metastasenbildende Mausmodell kann zum einen zur Untersuchung der Migrationsfähigkeit metastasierender Krebszellen in unterschiedliche Organe verwendet werden. Darüberhinaus ermöglicht dieses Mausmodell die Untersuchung des Differenzierungspotenzials markierter Zellen in andere Zelltypen wie Blutgefäße oder Stromazellen im Primärtumor. KW - Lungenkrebs KW - Metastase KW - Lungenkrebs KW - Metastasierung KW - Lung Cancer metastasis KW - Maus Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85420 ER - TY - THES A1 - Blanco Redondo, Beatriz T1 - Studies of synapsin phosphorylation and characterization of monoclonal antibodies from the Würzburg Hybridoma Library in Drosophila melanogaster T1 - Untersuchungen der Phosphorylierung von Synapsin und Charakterisierung monoklonaler Antikörper der Würzburg Hybridoma Library in Drosophila melanogaster N2 - Synapsins are conserved synapse-associated hosphoproteins involved in the fine regulation of neurotransmitter release. The aim of the present project is to study the phosphorylation of synapsins and the distribution of phospho-synapsin in the brain of Drosophila melanogaster. Three antibodies served as important tools in this work, a monoclonal antibody (3C11/α-Syn) that recognizes all known synapsin isoforms and two antisera against phosphorylated synapsin peptides (antiserum PSyn(S6) against phospho-serine 6 and antiserum PSyn(S464) against phospho-serine 464). These antisera were recently generated in collaboration with Bertram Gerber and Eurogentec. ... N2 - Synapsine sind konservierte, Synapsen-assoziierte Phosphoproteine, die an der Feinregulation der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind. Das Ziel des Projektes ist, die Phosphorylierung der Synapsine und die Verteilung des Phospho-Synapsins im Gehirn von Drosophila melanogaster zu untersuchen. Aus diesem Grunde wurden drei bestimmte Antikörper in dieser Arbeit verwendet: Ein monoklonaler Antikörper (3C11/α-Syn), der alle bekannten Isoformen von Synapsin erkennt, und zwei Antiseren gegen phosphorylierte Synapsinpeptide (das Antiserum PSyn(S6) gegen Phosphoserin 6 und das Antiserum PSyn(S464) gegen Phosphoserin 464). Diese Antiseren wurden unlängst in Zusammenarbeit mit Bertram Gerber und Eurogentec hergestellt. KW - Synapsine KW - neuroscience KW - Taufliege KW - Monoklonaler Antikörper KW - Neurowissenschaften Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93766 ER - TY - THES A1 - Tupak, Sara T1 - Modulators of Prefrontal Fear Network Function: An Integrative View T1 - Modulatoren präfrontaler Furchtnetzwerkfunktion: Ein integrativer Ansatz N2 - Regulating our immediate feelings, needs, and urges is a task that we are faced with every day in our lives. The effective regulation of our emotions enables us to adapt to society, to deal with our environment, and to achieve long‐term goals. Deficient emotion regulation, in contrast, is a common characteristic of many psychiatric and neurological conditions. Particularly anxiety disorders and subclinical states of increased anxiety are characterized by a range of behavioral, autonomic, and neural alterations impeding the efficient down‐regulation of acute fear. Established fear network models propose a downstream prefrontal‐amygdala circuit for the control of fear reactions but recent research has shown that there are a range of factors acting on this network. The specific prefrontal cortical networks involved in effective regulation and potential mediators and modulators are still a subject of ongoing research in both the animal and human model. The present research focused on the particular role of different prefrontal cortical regions during the processing of fear‐relevant stimuli in healthy subjects. It is based on four studies, three of them investigating a different potential modulator of prefrontal top‐down function and one directly challenging prefrontal regulatory processes. Summarizing the results of all four studies, it was shown that prefrontal functioning is linked to individual differences in state anxiety, autonomic flexibility, and genetic predisposition. The T risk allele of the neuropeptide S receptor gene, a recently suggested candidate gene for pathologically elevated anxiety, for instance, was associated with decreased prefrontal cortex activation to particularly fear‐relevant stimuli. Furthermore, the way of processing has been found to crucially determine if regulatory processes are engaged at all and it was shown that anxious individuals display generally reduced prefrontal activation but may engage in regulatory processes earlier than non‐anxious subjects. However, active manipulation of prefrontal functioning in healthy subjects did not lead to the typical behavioral and neural patterns observed in anxiety disorder patients suggesting that other subcortical or prefrontal structures can compensate for an activation loss in one specific region. Taken together, the current studies support prevailing theories of the central role of the prefrontal cortex for regulatory processes in response to fear‐eliciting stimuli but point out that there are a range of both individual differences and peculiarities in experimental design that impact on or may even mask potential effects in neuroimaging research on fear regulation. N2 - Tagtäglich sind wir gefordert, die Kontrolle über unsere unmittelbaren Gefühle und Bedürfnisse zu bewahren und diese zu regulieren. Die effektive Kontrolle unserer Emotionen ermöglicht es uns, uns unserer Umgebung und Gesellschaft anzupassen und langfristige Ziele zu erreichen. Defizitäre Emotionsregulation, im Gegensatz, charakterisiert eine Reihe von psychiatrischen und neurologischen Erkrankungen. Vor allem Angststörungen und subklinisch erhöhte Ängstlichkeit zeichnen sich durch eine Reihe von behavioralen, vegetativen und neuronalen Abweichungen aus, welche sich störend auf die effiziente Furchtregulation auswirken. Gängige Modelle des Furchtnetzwerks gehen davon aus, dass Furchtreaktionen durch eine top‐down Verschaltung von Präfrontalkortex und Amygdala reguliert werden. Neure Studien jedoch haben gezeigt, dass dieses Netzwerk durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst wird. Die spezifischen präfrontalen kortikalen Netzwerke, die an einer effektiven Regulation beteiligt sind und deren potentielle Mediatoren und Modulatoren sind jedoch noch immer Gegenstand heutiger Forschung, sowohl im Tier‐, als auch im Menschenmodell. Der Fokus der vorliegenden Arbeit richtete sich speziell auf die Rolle verschiedener Regionen des Präfrontalkortex während der Verarbeitung furchtrelevanter Reize bei gesunden Probanden. Die Arbeit basiert auf vier Studien, von denen drei jeweils einen potentiellen Modulator präfrontaler top-down Funktion näher untersuchten, während jene regulatorischen Prozesse in einer weiteren Studie gezielt manipuliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Präfrontalfunktion mit individuellen Unterschieden in Ängstlichkeit, vegetativer Flexibilität und genetischer Prädisposition assoziiert ist. So wurde beispielsweise das T Risikoallel des Neuropeptid S Rezeptor Gens, ein erst kürzlich entdecktes Kandidatengen für pathologisch erhöhte Ängstlichkeit, speziell während der Darbietung furchtrelevanter Reize mit geringerer Präfrontalkortex Aktivierung in Verbindung gebracht. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Art der Verarbeitung im Wesentlichen bestimmt, ob überhaupt regulatorische Vorgänge in Gang gesetzt werden und dass insbesondere ängstliche Probanden eine allgemein verminderte präfrontale Aktivierung zeigen. Die Ergebnisse deuten jedoch auch darauf hin, dass diese regulatorischen Prozesse bei Ängstlichen möglicherweise früher aktiviert werden als bei weniger Ängstlichen. Das aktive Eingreifen in die Präfrontalfunktion bei Gesunden führte jedoch nicht zu den typischen neuronalen und Verhaltensmustern, wie sie bei Patienten mit Angststörungen beobachtet werden, was wiederum die Annahme nahe legt, dass andere subkortikale oder präfrontale Strukturen für eine Aktivitätsverringerung in einer bestimmten Region kompensieren können. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die vorliegenden Ergebnisse aktuelle Theorien einer zentralen Rolle des Präfrontalkortex in Bezug auf regulatorische Prozesse während der Konfrontation mit furchtrelevanten Reizen untermauern, jedoch auch zeigen, dass es eine Reihe an individuellen Charakteristika und Feinheiten im jeweiligen experimentellen Design gibt, die potentielle Effekte in Bildgebungsstudien zur Furchtregulation beeinflussen oder sogar maskieren können. KW - Neurogenetik KW - NIR-Spektroskopie KW - Furcht KW - Herzfrequenzvariabilität KW - ranskranielle magnetische Stimulation KW - Emotionsregulation KW - Präfrontaler Cortex KW - Theta Burst Stimulation KW - Neuropeptid S Rezeptor Gen KW - emotionale Interferenz KW - emotion regulation KW - prefrontal cortex KW - theta burst stimulation KW - neuropeptide S receptor gene KW - emotional interference KW - Angst KW - Neurowissenschaften Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85673 ER - TY - THES A1 - Fronhofer, Emanuel Alexis T1 - Beyond classical metapopulations: trade-offs and information use in dispersal ecology T1 - Differentielle Energieallokation und informierte Emigration: Eine Erweiterung des Metapopulationskonzeptes N2 - All animal and plant species must disperse in order to survive. Although this fact may seem trivial, and the importance of the dispersal process is generally accepted, the eco-evolutionary forces influencing dispersal, and the underlying movement elements, are far from being comprehensively understood. Beginning in the 1950s scientists became aware of the central role of dispersal behaviour and landscape connectivity for population viability and species diversity. Subsequently, dispersal has mainly been studied in the context of metapopulations. This has allowed researchers to take into account the landscape level, e.g. for determining conservation measures. However, a majority of theses studies classically did not include dispersal evolution. Yet, it is well known that dispersal is subject to evolution and that this process may occur (very) rapidly, i.e. over short ecological time-scales. Studies that do take dispersal evolution into account, mostly focus on eco-evolutionary forces arising at the level of populations - intra-specific competition or Allee effects, for example - and at the level of landscapes - e.g. connectivity, patch area and fragmentation. Yet, relevant ecological and evolutionary forces can emerge at all levels of biological complexity, from genes and individuals to populations, communities and landscapes. Here, I focus on eco-evolutionary forces arising at the gene- and especially at the individual level. Combining individual-based modelling and empirical field work, I explicitly analyse the influence of mobility trade-offs and information use for dispersal decisions - i.e. individual level factors - during the three phases of dispersal - emigration, transfer and immigration. I additionally take into account gene level factors such as ploidy, sexual reproduction (recombination) and dominance. Mobility-fertility trade-offs may shape evolutionarily stable dispersal strategies and lead to the coexistence of two or more dispersal strategies, i.e. polymorphisms and polyphenisms. This holds true for both dispersal distances (chapter 3) and emigration rates (chapter 4). In sessile organisms - such as trees or corals - maternal investment, i.e. transgenerational trade-offs between maternal fertility and propagule dispersiveness, can be the cause of bimodal and fat-tailed dispersal kernels. However, the coexistence of two or more dispersal strategies may be critically dependent on gene level factors, such as ploidy or dominance (chapter 4). Passively dispersing individuals may realize such multimodal dispersal kernels by mixing different dispersal vectors. Active choice of these vectors allows to optimize the kernel. As most animals have evolved some kind of memory and sensory apparatus - chemical, acoustic or optical sensors - it is obvious that these capacities should be used for dispersal decisions. Chapter 5 explores the use of chemical cues for vector choice in passively dispersed animals. I find that the neotropical phoretic flower mites Spadiseius calyptrogynae non-randomly mix different dispersal vectors, i.e. one short- and one long-distance disperser, in order to achieve fat-tailed dispersal kernels. Such kernels allow an optimal exploitation of patchily distributed habitats. In addition, this strategy increases the probability of successful immigration as the short-distance dispersal vectors show directed dispersal towards suitable habitats. Results from individual-based simulations support and explain my empirical findings. The use of memory and sensory apparatus in dispersal is also the main topic of chapter 6 which strives to bridge the gap between dispersal and movement ecology. In this part of my thesis I develop a model of non-random, memory-based animal movement strategies. Extending the movement ecology paradigm of Nathan (2008a) I postulate that four elements may be relevant for the emergence of efficient movement strategies: perception, memory, inference and anticipation. Movement strategies including these four elements optimize search efficiency at two scales: within patches and between patches. This leads to a significantly increased search efficiency over a comparable area restricted search strategy. These four chapters are completed by a general analysis of metapopulation dynamics (chapter 2). I find that although the metapopulation concept is very popular in theoretical ecology, classical metapopulations can be predicted to be rare in nature, as suggested by lacking empirical evidence. This is especially the case when gene level factors, such as ploidy and sex, are taken into account. In summary, my work analyses the effects of ecological and evolutionary forces arising at the gene- and individual level on the evolution of dispersal and movement strategies. I highlight the importance of including these limiting factors, mechanisms and processes and show how they impact the evolution of dispersal in spatially structured populations. All chapters demonstrate that these forces may have dramatic effects on resulting ecological and evolutionary dynamics. If we intend to understand animal and plant dispersal or movement, it is crucial to include eco-evolutionary forces emerging at all levels of complexity, from genes to communities and landscapes. This endeavour is certainly not purely academic. Particularly nowadays, with rapidly changing landscape structures and anticipated drastic shifts of climatic zones due to global change, dispersal is a factor that cannot be overestimated. N2 - Alle Tier- und Pflanzenarten müssen sich ausbreiten, um ihr Überleben zu sichern. Diese Feststellung mag trivial erscheinen und es wird inzwischen allgemein anerkannt, dass Ausbreitungsverhalten von groß er Relevanz ist. Trotzdem sind wir weit davon entfernt, die öko-evolutionären Kräfte zu verstehen, die Ausbreitungsverhalten und zu Grunde liegende Bewegungsstrategien determinieren. Erst in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts begannen Ökologen die zentrale Rolle von Ausbreitungsverhalten und Konnektivität für die langfristige Überlebensfähigkeit von Populationen sowie für die Entstehung und Aufrechterhaltung von Artenvielfalt zu begreifen. Bis heute wurde Ausbreitungsverhalten vor allem im Kontext von Metapopulationen analysiert. So konnte, über die Untersuchung der Dynamik von lokalen Populationen hinaus, die Landschaftsebene mit einbezogen werden, um beispielsweise effiziente Naturschutzmaßnahmen abzuleiten. Die Evolution von Ausbreitungsverhalten wurde in diesen Studien allerdings traditionellerweise nicht berücksichtigt. Inzwischen ist jedoch zweifelsfrei erwiesen, dass Ausbreitungsverhalten sehr schnell evolvieren kann, wodurch dieser Prozess bereits auf kurzen ökologischen Zeitskalen von Bedeutung ist. Untersuchungen zur Evolution von Ausbreitungsverhalten berücksichtigen aber meist nur öko-evolutionäre Kräfte die auf der Populations- und Landschaftsebene entstehen, wie etwa intra-spezifische Konkurrenz oder Allee Effekte beziehungsweise Konnektivität, Habitatgröße und Fragmentierungsgrad. Es ist jedoch einleuchtend, dass ökologische und evolutionäre Kräfte auf allen Ebenen biologischer Komplexität, von Genen und Individuen über Populationen und Artengemeinschaften bis hin zu Landschaften, entstehen können. In dieser Arbeit möchte ich die Bedeutung von öko-evolutionären Kräften, die speziell auf der individuellen und genetischen Ebene begründet sind, näher beleuchten. Ich verbinde einen individuen-basierten Modellierungsansatz mit empirischer Feldforschung, um den Einfluss von differentieller Energieallokation (“life-history trade-offs'”) und Informationsnutzung für Ausbreitungsentscheidungen während der drei Ausbreitungsphasen - Emigration, Transition und Immigration - zu untersuchen. Zusätzlich berücksichtige ich genetische Mechanismen und Rahmenbedigungen wie Ploidie, sexuelle Reproduktion (Rekombination) und Dominanz. Differentielle Allokation von Energie für Ausbreitungsverhalten und Reproduktion kann evolutionär stabile Ausbreitungsstrategien entscheidend beeinflussen und zur stabilen Koexistenz zweier oder mehrerer Strategien führen, also Polymorphismen und Polyphenismen bedingen. Dies gilt sowohl für Ausbreitungsdistanzen (Kapitel 3) als auch für Ausbreitungsraten (Kapitel 4). In sessilen Organismen, wie beispielsweise Bäumen oder Korallen, kann mütterliche Investition in die Ausbreitungsfähigkeit von Propagulen zu Bimodalität und zu einer Häufung von besonders langen Ausbreitungsdistanzen (“fat tail”) in der evolutionär stabilen Häufigkeitsverteilung der Ausbreitungsdistanzen (“dispersal kernel”) führen. Die stabile Koexistenz zweier oder mehrerer Ausbreitungsstrategien kann jedoch sehr stark von genetischen Faktoren, wie Ploidie oder Dominanz, abhängen. Arten, die sich aufgrund zu geringer Mobilität nicht selbst aktiv ausbreiten können, werden solch bimodale Häufigkeitsverteilungen von Ausbreitungsdistanzen, z.B. durch eine gezielte Mischstrategie mit zwei Vektoren, realisieren. Eine aktive Auswahl der entsprechenden Vektoren ermöglicht es, die resultierende Verteilung der Ausbreitungsdistanzen zu optimieren. Da die meisten Tiere über eine Form von Gedächtnis und sensorischem Apparat verfügen - um chemische, akustische oder optische Reize aufzunehmen und zu verarbeiten - ist es naheliegend, dass diese Fähigkeiten auch für Ausbreitungsentscheidungen genutzt werden. In Kapitel 5 untersuche ich die Nutzung chemischer Signale für die Auswahl von Ausbreitungsvektoren bei Tieren mit passiver Ausbreitung. Ich zeige, dass die neotropischen, phoretischen Blütenmilben der Art Spadiseius calyptrogynae gezielt zwei Ausbreitungsvektoren nutzen - einen Vektor, der v.a. kurze Strecken, und einen, der besonders lange Strecken zurücklegt - und damit, wie oben beschrieben, eine Häufung von groß en Werten in der Häufigkeitsverteilung der Ausbreitungdistanzen (“fat-tailed dispersal kernel”) erzielen. Solche Strategien sind optimal an die Ausbreitung in fragmentierten Habitaten angepasst. Zusätzlich erhöhen diese Blütenmilben durch ihre Vektorwahl die Wahrscheinlichkeit, sich erfolgreich auszubreiten, da einer der beiden Vektoren bevorzugt die Futterpflanze der Milben, also geeignetes Habitat, anfliegt. Diese empirische Studie wird durch eine individuen-basierte Simulation des Systems vervollständigt, deren Ergebnisse die empirischen Befunde erklären und deren Interpretation bestätigen. Die Nutzung von Gedächtnis und sensorischen Kapazitäten steht auch in Kapitel 6 im Vordergrund. In diesem Teil meiner Arbeit entwickle ich ein individuen-basiertes Modell für Bewegungs- und Suchstrategien, das, im Gegensatz zu den meisten Modellen in diesem Bereich, nicht auf Diffusionsprozessen (“random walks”) sondern auf der Nutzung von mentalen und sensorischen Kapazitäten basiert. Ziel ist es, ein mechanistisches Bewegungsmodell im Sinne von Nathan und Kollegen (2008a) zu schaffen und dadurch Ausbreitungs- und Bewegungsökologie zu vereinen. Ich postuliere, dass vier Elemente für die Emergenz von effizienten Bewegungs- und Suchstrategien von zentraler Bedeutung sind: Wahrnehmung, Erinnerung, Inferenz und Antizipation. Suchstrategien, die diese vier Elemente berücksichtigen, sind im Vergleich zu analogen Modellen, die auf Diffusionsprozessen basieren, besonders effizient, da sie ihre Sucheffizienz auf zwei Skalen, nämlich innerhalb und außerhalb von Ressourcenansammlungen, optimieren. Diese vier Kapitel werden durch eine allgemeine Analyse von Metapopulationsdynamiken in Kapitel 2 ergänzt. Hier zeige ich, dass, obwohl sich das Metapopulationskonzept in der theoretischen Ökologie großer Beliebtheit erfreut, klassische Metapopulationsdynamiken in natürlichen Systemen selten zu erwarten sind. Damit bestätigen sich Hinweise empirischer Studien, die seit Längerem berichten, dass klassische Metapopulationen wenig häufig aufzutreten scheinen. Klassische Metapopulationsdynamiken entstehen auch in Modellen besonders selten, wenn diese evolutionäre Faktoren, die auf der Genebene begründet sind, wie Ploidie und Rekombination, berücksichtigen. In der vorliegenden Arbeit analysiere ich die Effekte von ökologischen und evolutionären Kräften, die auf der Gen- und Individuenebene entstehen und evolutionär stabile Ausbreitungs- und Suchstrategien bestimmen. Ich hebe die zentrale Bedeutung dieser Rahmenbedigungen, Mechanismen und Prozesse hervor und zeige, wie sie die Evolution von Ausbreitungsstrategien in räumlich strukturierten Populationen maßgeblich beeinflussen. Aus meiner Arbeit wird unmittelbar ersichtlich, dass die Berücksichtigung öko-evolutionärer Kräfte auf allen Ebenen, von Genen bis hin zu Artengemeinschaften und Landschaften, von zentraler Bedeutung ist, wenn wir Ausbreitungsstrategien von Tieren und Pflanzen verstehen wollen. Dieses Ziel ist über den rein akademischen Bereich hinaus, z.B. auch für den Naturschutz, von großer Relevanz, denn besonders heutzutage, in Anbetracht schneller, anthropogener Veränderungen von Landschaftsstrukturen und des globalen Klimawandels ist die Fähigkeit zur Ausbreitung essentiell. KW - Metapopulation KW - Verbreitungsökologie KW - Ressourcenallokation KW - metapopulation KW - dispersal KW - trade-offs KW - information use KW - Differentielle Ressourcenallokation KW - Ausbreitungsverhalten KW - Informationsnutzung Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85816 ER - TY - THES A1 - Hein, Melanie T1 - Functional analysis of angiogenic factors in tumor cells and endothelia T1 - Funktionelle Analyse angiogener Faktoren in Tumorzellen und Endothelien N2 - Tumor angiogenesis is essential for the growth of solid tumors as their proliferation and survival is dependent on consistent oxygen and nutrient supply. Anti-angiogenic treatments represent a therapeutic strategy to inhibit tumor growth by preventing the formation of new blood vessels leading to starvation of the tumor. One of the best characterized anti angiogenic therapeutics is the monoclonal antibody bevacizumab (Avastin), which targets and neutralizes VEGF leading to disruption of the VEGF signaling pathway. Until today, bevacizumab has found its way into clinical practice and has gained approval for treatment of different types of cancer including colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer and renal cell carcinoma. Signaling of VEGF is mediated through VEGF receptors, mainly VEGFR2, which are primarily located on the cell surface of endothelial cells. However, there has been evidence that expression of VEGF receptors can also be found on tumor cells themselves raising the possibility of autocrine and/or paracrine signaling loops. Thus, tumor cells could also benefit from VEGF signaling, which would promote tumor growth. The aim of this study was to investigate if bevacizumab has a direct effect on tumor cells in vitro. To this end, tumor cell lines from the NCI-60 panel derived from four different tumor types were treated with bevacizumab and angiogenic gene and protein expression as well as biological outputs including proliferation, migration and apoptosis were investigated. Most of the experiments were performed under hypoxia to mimic the in vivo state of tumors. Overall, there was a limited measurable effect of bevacizumab on treated tumor cell lines according to gene and protein expression changes as well as biological functions when compared to endothelial controls. Minor changes in terms of proliferation or gene regulation were evident in a single tumor cell line after VEGF-A blockade by bevacizumab, which partially demonstrated a direct effect on tumor cells. However, the overall analysis revealed that tumor cell lines are not intrinsically affected in an adverse manner by bevacizumab treatment. Besides the functional analysis of tumor cells, embryonic stem cell derived endothelial cells were characterized to delineate vascular Hey gene functions. Hey and Hes proteins are the best characterized downstream effectors of the evolutionary conserved Notch signaling pathway, which mainly act as transcriptional repressors regulating downstream target genes. Hey proteins play a crucial role in embryonic development as loss of Hey1 and Hey2 in mice in vivo leads to a severe vascular phenotype resulting in early embryonic lethality. The major aim of this part of the thesis was to identify vascular Hey target genes using embryonic stem cell derived endothelial cells utilizing a directed endothelial differentiation approach, as ES cells and their differentiation ability provide a powerful in vitro system to study developmental processes. To this end, Hey deficient and Hey wildtype embryonic stem cells were stably transfected with an antibiotic selection marker driven by an endothelial specific promoter, which allows selection for endothelial cells. ESC-derived endothelial cells exhibited typical endothelial characteristics as shown by marker gene expression, immunofluorescent staining and tube formation ability. In a second step, Hey deficient ES cells were stably transfected with doxycycline inducible Flag-tagged Hey1 and Hey2 transgenes to re-express Hey proteins in the respective cell line. RNA-Sequencing of Hey deficient and Hey overexpressing ES cells as well as ESC-derived endothelial cells revealed many Hey downstream target genes in ES cells and fewer target genes in endothelial cells. Hey1 and Hey2 more or less redundantly regulate target genes in ES cells, but some genes were regulated by Hey2 alone. According to Gene Ontology term analysis, Hey target genes are mainly involved in embryonic development and transcriptional regulation. However, the response of ESC-derived endothelial cells in regulating Hey downstream target genes was rather limited when compared to ES cells, which could be due to lower transgene expression in endothelial cells. The limited response also raises the possibility that target gene regulation in endothelial cells is not only dependent on Hey gene functions alone and thus loss or overexpression of Hey genes in this in vitro setting does not influence target gene regulation. N2 - Tumorangiogenese ist essential für das Wachstum von Tumoren, da ihr Überleben und ihre Proliferation von einer dauerhaften Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen abhängig sind. Anti-angiogene Therapeutika inhibieren das Wachstum von Tumoren, indem sie die Bildung von neuen Blutgefäßen unterbinden, was zu einem „Verhungern“ des Tumors führt. Zu den am besten untersuchten anti-angiogenen Therapeutika gehört der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin), welcher den Wachstumsfaktor VEGF bindet und neutralisiert, was schließlich zu einer Unterbrechung des VEGF-Signalweges führt. Bevacizumab wird aktuell zur Behandlung verschiedener Tumortypen, unter anderem Colonkarzinom, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, Brustkrebs und Nierenzellkarzinom in der Praxis angewandt. VEGF bindet an VEGFR2 und andere VEGF-Rezeptoren, welche primär an der Oberfläche von Endothelzellen lokalisiert sind. Dennoch gibt es Hinweise, dass die Expression von VEGF-Rezeptoren nicht ausschließlich auf Endothelzellen begrenzt ist, sondern auch auf Tumorzellen nachgewiesen werden konnte. Die tumorale Expression von VEGF-Rezeptoren ermöglicht eine direkte autokrine und/oder parakrine Stimulation von Tumorzellen. Tumorzellen könnten dadurch selbst vom VEGF-Signalweg profitieren, was das Tumorwachstum fördern würde. Das Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob Bevacizumab in vitro einen direkten Einfluss auf Tumorzellen ausübt. Dazu wurden verschiedene Tumorzelllinien von vier unterschiedlichen Tumortypen aus der NCI-60 Sammlung mit Bevacizumab behandelt und anschließend die Gen- und Proteinexpression von angiogenen Markern sowie biologische Funktionen wie Proliferation, Migration und Apoptose untersucht. Die Experimente wurden hauptsächlich unter Hypoxie durchgeführt, um den in vivo Status von Tumoren nachzuahmen. Insgesamt war ein direkter Effekt von Bevacizumab auf Tumorzellen im Vergleich zu Endothelzellen nicht nachweisbar. Gen- und Proteinexpression sowie biologische Funktionen waren in Tumorzellen nach Bevacizumab Behandlung bis auf wenige Ausnahmen unverändert. Geringe Veränderungen in der Proliferationsrate sowie in der Genregulation nach Inhibition von VEGF durch Bevacizumab konnten jeweils in einer einzelnen Zelllinie nachgewiesen werden, wodurch zumindest teilweise eine direkte Wirkung von Bevacizumab auf Tumorzellen gezeigt werden konnte. Dennoch zeigt die umfassende Analyse der verschiedenen Tumorzellen, dass die Bevacizumab-Behandlung sich insgesamt nicht negativ auf Tumorzellen auswirkt und diese nicht intrinsisch beeinflusst werden. Neben der funktionellen Analyse von Tumorzellen wurden Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen gewonnen wurden, charakterisiert, um anhand derer die Rolle der Hey Gene in der vaskulären Entwicklung näher zu bestimmen. Hey und Hes Proteine sind die am besten charakterisierten nachgeschalteten Effektoren des evolutionär konservierten Notch-Signalweges. Als Transkriptionsfaktoren sind Hey Proteine an der Regulation von Zielgenen beteiligt, wobei sie meist als transkriptionelle Repressoren fungieren. Hey Proteine spielen eine sehr wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, da der gemeinsame Verlust von Hey1 und Hey2 in Mäusen in vivo einen vaskulären Phenotyp hervorruft, der in sehr früher embryonaler Letalität endet. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, vaskuläre Hey Zielgene mit Hilfe von Endothelzellen, die aus embryonalen Stammzellen differenziert wurden, zu identifizieren. Die Fähigkeit embryonaler Stammzellen verschiedene Zelltypen zu bilden, liefert dabei ein wertvolles in vitro System, um entwicklungsbiologische Prozesse zu analysieren. Dazu wurden Hey-defiziente und Hey-Wildtyp embryonale Stammzellen mit einem antibiotischen Selektionsmarker versehen, dessen Expression von einem Endothel spezifischen Promoter kontrolliert wird und daher die Selektion von Endothelzellen erlaubt. Die differenzierten Endothelzellen wiesen typische endotheliale Charakteristika auf, was durch Markergen-Expression, Immunfluoreszenzfärbungen und der Bildung netzwerkähnlicher Strukturen gezeigt werden konnte. In einem zweiten Schritt wurden Doxyzyklin-induzierbare Flag-markierte Hey1 bzw. Hey2 Konstrukte stabil in Hey-defiziente Zellen integriert, um Hey1 bzw. Hey2 kontrollierbar zu re-exprimieren. Die Zielgensuche mittels RNA-Seq Analyse lieferte viele Hey Zielgene in embryonalen Stammzellen, jedoch weitaus weniger Zielgene in ausdifferenzierten Endothelzellen. Zusammengefasst zeigten Hey1 und Hey2 eine redundante Regulation von Zielgenen in embryonalen Stammzellen, wobei einige wenige Gene alleine durch Hey2 reguliert wurden. Die Gen-Ontologie Analyse zeigte, dass diese Zielgene hauptsächlich an der embryonalen Entwicklung und der transkriptionellen Regulation von anderen Genen beteiligt sind. Dennoch war die Anzahl der Hey regulierten Gene in Endothelzellen weitaus geringer als in embryonalen Stammzellen. Das könnte auf eine geringere Transgen-Expression in Endothelzellen im Vergleich zu embryonalen Stammzellen zurückzuführen sein. Die weitaus geringere Anzahl an Hey Zielgenen in Endothelzellen lässt außerdem vermuten, dass die Regulation von Zielgenen in Endothelzellen nicht ausschließlich von der Funktion der Hey Gene abhängig ist. Die Regulation von Hey Zielgenen in Endothelien wurde durch den Verlust bzw. die Überexpression von Hey1 und Hey2 in dem angewandten in vitro System nur geringfügig beeinflusst. KW - Krebs KW - Angiogenese KW - Cancer KW - Angiogenesis KW - Bevacizumab KW - Monoklonaler Antikörper KW - Antiangiogenese Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93863 ER - TY - THES A1 - Eman, Maher Othman Sholkamy T1 - In Vitro and In Vivo Analysis of Insulin-Induced Oxidative Stress and DNA Damage T1 - In vitro und in vivo Untersuchungen von Insulin-induzierten oxidativen Stress und DNA-Schäden N2 - Hyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) and peripheral lymphocytes, and to confirm the genotoxicity of insulin in other cells from different tissues. To ascertain that the insulin effects were not only limited to permanent cell lines, rat primary colon, kidney, liver and fatty tissue cells were also studied. To connect the study and the findings to in vivo conditions, two in vivo models for hyperinsulinemia were used; Zucker diabetic fatty rats in a lean and diabetic state infused with different insulin concentrations and peripheral lymphocytes from type 2 diabetes mellitus patients. First, the human colon adenocarcinoma cells (HT29) showed significant elevation of DNA damage using comet assay and micronucleus frequency analysis upon treatment with 5 nM insulin in standard protocols. Extension of the treatment to 6 days lowered the concentration needed to reach significance to 0.5-1 nM. Insulin enhanced the cellular ROS production as examined by the oxidation of the dyes 2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and dihydroethidium (DHE). The FPG modified comet assay and the reduction of damage by the radical scavenger tempol connected the insulin-mediatedDNA damage to ROS production. To investigate the sources of ROS upon insulin stimulation, apocynin and VAS2870 as NADPH oxidase inhibitors and rotenone as mitochondrial inhibitor were applied in combination with insulin and all of them led to a reduction of the genomic damage. Investigation of the signaling pathway started by evaluation of the binding of insulin to its receptor and to the IGF-1 receptor. The results showed the involvement of both receptors in the signaling mechanism. Following the activation of both receptors, PI3K activation occurs leading to phosphorylation of AKT which in turn activates two pathways for ROS production, the first related to mitochondria and the second through activation of Rac1 , resulting in the activation of Nox1. Both pathways could be activated through AKT or through the mitochondrial ROS which in turn could activates Nox1. Studying another human colon cancer cell line, Caco-2 and rat primary colon cells in vitro confirmed the effect of insulin on cellular chromatin. We conclude that pathophysiological levels of insulin can cause DNA damage in colon cells, which may contribute to the induction or progression of colon cancer. Second, in kidney cells, insulin at a concentration of 5 nM caused a significant increase in DNA damage in vitro. This was associated with the formation of reactive oxygen species (ROS). In the presence of antioxidants, blockers of the insulin and IGF-1 receptors, and a phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) inhibitor, the insulin mediated DNA damage was reduced. Phosphorylation of AKT was increased and p53 accumulated. Inhibition of the mitochondrial and NADPH oxidase related ROS production reduced the insulin mediated damage. In primary rat cells insulin also induced genomic damage. HK2 cells were used to investigate the mechanistic pathway in the kidney The signaling is identical to the one in the colon cells untill the activation of the mitochondrial ROS production, because after the activation of PI3K activation of Nox4 occurs at the same time across talk between mitochondria and Nox4 activation has been suggested and might play a role in the observed effects. In the in vivo model, kidneys from healthy, lean ZDF rats, which were infused with insulin to yield normal or high blood insulin levels, while keeping blood glucose levels constant, the amounts of ROS and p53 were elevated in the high insulin group compared to the control level group. ROS and p53 were also elevated in diabetic obese ZDF rats. The treatment of the diabetic rats with metformin reduced the DNA oxidation measured as 8-oxodG as well as the ROS production in that group. HL60 the human premyelocytic cells and cultured lymphocytes as models for the hemopoietic system cells showed a significant induction for DNA damage upon treatment with insulin. The diabetic patients also exhibited an increase in the micronucleus formation over the healthy individuals. In the present study, we showed for the first time that insulin induced oxidative stress resulting in genomic damage in different tissues, and that the source of the produced ROS differs between the tissues. If the same mechanisms are active in patients, hyperinsulinemia might cause genomic damage through the induction of ROS contributing to the increased cancer risk, against which the use of antioxidants as well as mitochondrial and NADPH oxidase inhibitors might exert protective effects with cancer preventive potential under certain conditions. Normal healthy human plasma insulin concentrations are in the order of 0.04 nM after overnight fasting and increase to less than about 0.2 nM after a meal. Pathophysiological levels can reach 1 nM and can stay above 0.2 nM for the majority of the daytime yielding condictions close to the insulin concentrations determined in the present study. Whether the observed effects also occur in vivo and whether they actually initiate or promote tumor formation remains to be determined. However, if proof of that can be obtained, our experiments with inhibitors indicate chances for pharmacological intervention applying antioxidants or enzyme inhibitors. It will not be the aim to reduce ROS in any case or as much as possible because ROS have now been recognized as important signaling molecules and participatants in immune defense, but a reduction to physiological levels instead of pathophysiological levels in the context of a disease associated with ROS overproduction might be beneficial. N2 - Hyperinsulinämie, ein Zustand mit sehr hohen Blutspiegeln an Insulin, ist mit einer erhöhten Krebsinzidenz verbunden. Diabetes mellitus, das metabolische Syndrom, Adipositas und das polyzystische Ovarialsyndrom sind die häufigsten Krankheiten, die mit Hyperinsulinämie einhergehen. Da ein erhöhtes Krebsrisiko insbesondere für Krebserkrankungen des Dickdarms und der Niere beobachtet wurde, untersuchten wir erstmals die Induktion von Genomschäden durch Insulin in HT29-Zellen (humane Dickdarmzellen), LLC-PK1-Zellen (Nierenzellen vom Schwein), HK2-Zellen (humane Nierenzellen) und peripheren humanen Lymphozyten. Um die Gentoxizität von Insulin zu bestätigen, wurden auch andere Zellen aus unterschiedlichen Geweben untersucht. Um sicherzustellen, dass die Effekte durch Insulin nicht auf permanente Zelllinien beschränkt sind, wurden außerdem primäre Rattenzellen aus Dickdarm, Niere, Leber und Fettgewebe untersucht. Um die Befunde auf die in-vivo-Situation übertragen zu können, kamen zwei Hyperinsulinämie-Modelle zum Einsatz: mit Insulin infundierte ZDF-Ratten (Zucker Diabetic Fatty Rats) und periphere Lymphozyten von Patienten mit Diabetes Typ 2. Zuerst konnte in humanen Adenokarzinomzellen des Dickdarms (HT29) eine signifikante Erhöhung des DNA-Schadens in Standard-Protokollen des Comet Assays und des Mikrokerntests nach Behandlung mit 5 nM Insulin gezeigt werden. Bei Verlängerung der Behandlungszeit auf 6 Tage wurden signifikante Effekte bereits ab 0,5 nM beobachtet. Insulin erhöhte die zelluläre ROS-Produktion, die als Oxidation der Farbstoffe 2‘,7‘-Dichlorodihydrofluoresceindiacetat (H2DCF-DA) und Dihydroethidium (DHE) nachgewiesen wurde. Befunde aus dem FPG-modifizierten Comet Assay und das Ergebnis, dass der Radikalfänger Tempol die Zellen schützte stellen die Verbindung zwischen Insulin-verursachtem DNA-Schaden und ROS produktion her. Um die ROS-Quelle nach Stimulation mit Insulin zu untersuchen, wurden Apocynin und VAS2870 als NADPH-Oxidase-Inhibitoren und Rotenon als Inhibitor der Mitochondrien mit Insulin kombiniert. Alle diese Stoffe reduzierten den Genomschaden. Zur Charakterisierung der Signalwege wurde zunächst die Bindung von Insulin an seinen Rezeptor und an den IGF1-Rezeptor untersucht. Beide Rezeptoren sind an der Signaltransduktion beteiligt. Nach Aktivierung der Rezeptoren wird die PI3K aktiviert, dies führt zur Phosphorylierung von AKT. Dadurch werden zwei Wege zur ROS-Produktion aktiviert, der erste involviert die mitochondriale Atmungskette , der zweite agiert durch Rac1-Aktivierung. Letzteres resultiert in der Aktivierung der NADPH-Oxidase Isoform Nox1. Der Effekt von Insulin auf zelluläres Chromatin konnte in einer weiteren humanen Dickdarmkrebs-Zelllinie und in primären Dickdarmzellen der Ratte in vitro bestätigt werden. Wir schlussfolgern aus diesen Ergebnissen, dass pathophysiologische Insulin-Blutspiegel DNA-Schäden im Dickdarm verursachen können. Dies könnte zur Induktion oder Progression von Dickdarmkrebs beitragen. Weiterhin verursachte Insulin bei einer Konzentration von 5 nM einen signifikanten Anstieg von DNA-Schäden in vitro. Dies war verbunden mit der Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Bei Anwesenheit von Antioxidantien, von Inhibitoren des Insulin-Rezeptors bzw. des IGF-1-Rezeptors und eines Phosphatidylinositol-3-Kinase(PI3K)-Inhibitors war der Insulin-vermittelte DNA-Schaden reduziert. Phosphorylierung von AKT war erhöht und das Protein P53 akkumulierte. Inhibierung der ROS-Produktion der Mitochondrien bzw. der NADPH-Oxidase reduzierte den Insulin-vermittelten Schaden. In primären Rattenzellen induzierte Insulin ebenfalls Genomschaden. HK2-Zellen wurden zur Untersuchung der mechanistischen Signalwege in der Niere eingesetzt. Die Signalwege entsprechen denen der Dickdarmzellen bis zur Aktivierung der ROS-Produktion in den Mitochondrien. Als Folge der Aktivierung von PI3K wird Nox4 aktiviert. Eine Verbindung zwischen Mitochondrien und Nox4-Aktivierung wird vorgeschlagen. Als in-vivo-Modell wurden gesunde ZDF-Ratten mit Insulin infundiert, um normale bzw. erhöhte Insulin-Blutspiegel bei konstanten Glukose-Blutspiegeln zu erreichen. In den Nieren war der Gehalt an ROS und an P53 in der Gruppe mit erhöhten Insulin-Blutspiegeln im Vergleich zur Kontrolle erhöht. ROS und P53 waren ebenfalls in den diabetischen und adipösen ZDF-Ratten erhöht. Die Behandlung der diabetischen Ratten mit Metformin reduzierte die DNA-Oxidation, die in Form von 8-oxodG bestimmt wurde, und die ROS-Produktion in dieser Gruppe. HL60-Zellen und kultivierte Lymphozyten als Modelle für das hämatopoetische System zeigten eine signifikante Induktion von DNA-Schäden nach Behandlung mit Insulin. Diabetes-Patienten zeigten eine erhöhte Mikrokern-Bildung im Vergleich zu gesunden Probanden. In der vorliegenden Studie konnten wir erstmals zeigen, dass Insulin-induzierter oxidativer Stress zu Genomschaden führt, und dass in unterschiedlichen Geweben ROS aus verschiedenen Quellen stammten. Falls diese Mechanismen auch in Patienten auftreten, könnte Hyperinsulinämie durch ROS-Induktion zu Genomschaden führen und damit zu einem erhöhten Krebsrisiko beitragen. Unter bestimmten Bedingungen könnten Antioxidantien bzw. Inhibitoren der Mitochondrien oder der NADPH-Oxidase protektive Effekte ausüben. KW - Insulin KW - Oxidativer Stress KW - DNS-Schädigung KW - oxidativer Stress KW - DNA Schaden KW - Insulin KW - Insulin KW - Oxidative Stress KW - DNA Damage Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69274 ER - TY - THES A1 - Alexander, Stephanie T1 - Collective cancer cell invasion \(in\) \(vivo\): function of β1 and β3 integrins in perivascular invasion and resistance to therapy T1 - Kollektive Tumorzellinvasion \(in\) \(vivo\): Funktion von β1 und β3 Integrinen in perivaskulärer Invasion und Therapieresistenz N2 - Pro-migratory signals mediated by the tumor microenvironment contribute to the cancer progression cascade, including invasion, metastasis and resistance to therapy. Derived from in vitro studies, isolated molecular steps of cancer invasion programs have been identified but their integration into the tumor microenvironment and suitability as molecular targets remain elusive. The purpose of the study was to visualize central aspects of tumor progression, including proliferation, survival and invasion by real-time intravital microscopy. The specific aims were to monitor the kinetics, mode, adhesion and chemoattraction mechanisms of tumor cell invasion, the involved guidance structures, and the response of invasion zones to anti-cancer therapy. To reach deeper tumor regions by optical imaging with subcellular resolution, near-infrared and infrared excited multiphoton microscopy was combined with a modified dorsal skinfold chamber model. Implanted HT-1080 fibrosarcoma and B16/F10 and MV3 melanoma tumors developed zones of invasive growth consisting of collective invasion strands that retained cell-cell contacts and high mitotic activity while invading at velocities of up to 200 μm per day. Collective invasion occurred predominantly along preexisting tissue structures, including blood and lymph vessels, collagen fibers and muscle strands of the deep dermis, and was thereby insensitive to RNAi based knockdown and/or antibody-based treatment against β1 and β3 integrins, chemokine (SDF-1/CXCL12) and growth factor (EGF) signaling. Therapeutic hypofractionated irradiation induced partial to complete regression of the tumor main mass, yet failed to eradicate the collective invasion strands, suggesting a microenvironmentally privileged niche. Whereas no radiosensitization was achieved by interference with EGFR or doxorubicin, the simultaneous inhibition of β1 and β3 integrins impaired cell proliferation and survival in spontaneously growing tumors and strongly enhanced the radiation response up to complete eradication of both main tumor and invasion strands. In conclusion, collective invasion in vivo is a robust process which follows preexisting tissue structures and is mainly independent of established adhesion and chemoattractant signaling. Due to its altered biological response to irradiation, collective invasion strands represent a microenvironmentally controlled and clinically relevant resistance niche to therapy. Therefore supportive regimens, such as anoikisinduction by anti-integrin therapy, may serve to enhance radio- and chemoefficacy and complement classical treatment regimens. N2 - Die Progression von Tumorerkrankungen, einschließlich Tumorinvasion, Metastasierung und Therapieresistenz wird unter anderem durch migrationsfördernde Signale aus der Tumorumgebung vermittelt. Zur bisherigen Aufklärung einzelner Schritte des Tumorinvasions- und Progressionsprogramms trugen dabei wesentlich In-vitro-Studien bei, jedoch erfordert die Darstellung der Relevanz molekularer Zielstrukturen und deren Funktion im Tumormikromilieu die Validierung in geeigneten In-vivo-Tumormodellen. Ziel dieser Studie war, zelluläre und molekulare Mechanismen der Tumorprogression inklusive Proliferation, Überleben und Invasion mittels Echtzeit-Intravitalmikroskopie darzustellen. Untersucht wurden insbesondere die Kinetik und Arten der Tumorzellinvasion, die zugrunde liegenden Adhäsionswege und pro-migratorischen Signale (EGF, SDF-1), beteiligte Leitstrukturen des Tumorstromas, und Strategien, therapeutisch gegen Invasionszonen vorzugehen. Um tiefe Tumorareale mittels subzellulär aufgelöster optischer Bildgebung zu erreichen, wurde nah-infrarote und infrarote Multiphotonenmikroskopie mit einem modifizierten Rückenkammermodell kombiniert. Orthotope Xeno- und Allotransplantate von HT-1080-Fibrosarkom- und B16/F10- oder MV3-Melanomzellen entwickelten dabei ausgeprägte invasive Wachstumszonen bestehend aus kollektiven Invasionssträngen mit intakten Zell-Zell-Kontakten und zeitgleicher Mitoseaktivität, die Geschwindigkeiten von bis zu 200 μm pro Tag erreichten. Diese kollektive Invasion orientierte sich bevorzugt entlang von Funktionsstrukturen der tiefen Dermis wie Blut- und Lymphgefäßen, Kollagenfasern und Muskelsträngen. RNAibasierende Herrunterregulation und/oder Injektion blockierender Antikörper gegen β1 und β3 Integrine, wie auch Inhibition von EGF führten nur zu minimaler Änderung der Invasionseffizienz. Therapeutische hypofraktionierte Bestrahlung induzierte partielle bis komplette Regression der Tumorhauptmasse, nicht jedoch der kollektiven Invasionsstränge, was auf eine kombinierte Invasions- und Resistenznische hinweist. Weder Doxorubicin noch gegen EGFR gerichtete Antikörper steigerten die Radiosensitivität, jedoch führte die simultane Inhibition von β1 und β3 Integrinen zu einer starken Hemmung von Proliferation und Überleben spontan wachsender Tumoren (Anoikis) und verstärkte die Strahlungssensitivität bis hin zum kompletten Verschwinden von sowohl Tumorhauptmasse wie auch Invasionsträngen. Kollektive Invasion ist somit ein wichtiger Invasionsmodus, der sich an vorbestehenden Gewebsstrukturen orientiert und unabhängig von Integrinen und EGF- und SDF-1-Signalen erfolgt. Die kollektiven Stränge entwickeln dabei eine vom Haupttumor verschiedene biologische Reaktion auf Bestrahlung und entsprechen damit einer durch die Mikroumgebung kontrollierten und von Integrinsignalen abhängenden Resistenznische. Somit könnte eine zusätzliche anti- Integrin-Therapie die Effizienz von Bestrahlung und Chemotherapie erhöhen und klassische Behandlungsschemen/-programme ergänzen. KW - Tumorzelle KW - Kollektive Invasion KW - Multiphotonenmikroskopie KW - Integrine KW - collective invasion KW - multiphoton microscopy KW - integrins KW - Invasion KW - Integrine Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85435 ER - TY - THES A1 - Maric, Hans-Michael T1 - Molecular Basis of the Multivalent Glycine and γ-Aminobutyric Acid Type A Receptor Anchoring T1 - Molekulare Basis der Multivalenten Verankerung der Glycin und γ-Aminobuttersäure Typ A Rezeptoren N2 - γ-Aminobuttersäure-Rezeptoren vom Typ A (GABAARs) und Glyzin-Rezeptoren (GlyRs) sind die wichtigsten Vermittler der schnellen synaptischen Inhibition im zentralen Nervensystem. Von wesentlicher Bedeutung für ihre ordnungsgemäße Funktion in der inhibitorischen Signalübertragung ist ihre präzise Lokalisation und Konzentration innerhalb der neuronalen Oberflächenmembran. Diese Eigenschaften werden durch Gerüstproteine vermittelt, welche direkt an die großen intrazellulären Schleifen der Rezeptoren, sowie an Bausteine des neuronalen Zytoskeletts binden. In meiner Dissertation habe ich die molekularen Details mehrerer zugrunde liegenden Protein-Protein Wechselwirkungen untersucht. Im Speziellen habe ich die Interaktion ausgewählter GABAAR und GlyR Untereinheiten mit den Gerüstproteinen Gephyrin, Radixin und Collybistin analysiert. Ich habe kurze lineare Aminosäuren-Motive innerhalb der großen intrazellulären Schleifen der Rezeptoren identifiziert, welche die direkten und Untereinheit-spezifischen Interaktionen vermitteln. Die Quantifizierung der jeweiligen Bindungsstärke ergab, dass Gephyrins E-Domäne vor allem an die GABAAR α1 (Kd = 17 M) und α3 (Kd = 5 M) -Untereinheiten bindet, wohingegen die SH3-Domäne von Collybistin hauptsächlich mit der GABAAR α2-Untereinheit interagiert (Kd = 1 M). Demgegenüber bindet die FERM-Domäne von Radixin fest an die α5-Untereinheit des GABAAR (Kd = 8 µM). Weiterhin zeigt meine Arbeit, dass diese einfache Beziehung durch (i) fehlende oder (ii) überlappende Bindungsspezifitäten zwischen den Gerüstproteinen und den Rezeptor-Untereinheiten komplex reguliert wird. Ferner beschreibe ich hier, wie im Folgenden ausgeführt, die Möglichkeit einer (iii) negativen Modulation mittels posttranslationaler Modifikation, sowie einer Verstärkung der Bindung durch (iv) Aviditäts-Effekte. (i) Als erstes habe ich mit Hilfe biochemischer Methoden die Radixin-GABAAR α5 Interaktion im Detail untersucht. Meine Strukturanalyse und Kompetitionsstudien legen den Schluss nahe, dass Radixin die betreffende Rezeptor-Untereinheit mittels einer universellen Bindungstasche in der F3 Subdomäne innerhalb seiner FERM Domäne bindet. Diese Bindungsstelle wird durch zwei markante Strukturelemente gebildet: Einer α-Helix, die eine große hydrophobe Tasche bildet, welche eine Vielzahl unterschiedlicher hydrophober Reste in verschiedenen Konformationen akzeptiert, sowie ein β-Strang, der Peptidrückgrat-Interaktionen eingehen kann. Es überrascht nicht, dass eine Vielzahl an Studien die Beteiligung dieser Bindungsseite mit unterschiedlichen Liganden beschrieben hat. Diese Promiskuität unterstreicht die Bedeutung des Aktivierungsmechanismus der zuvor für die Radixin FERM GABAAR α5-Untereinheit beschrieben wurde und impliziert weitere Regulationsmechanismen, die eine koordinierte Interaktion in vivo ermöglichen. (ii) Weiterhin habe ich mich ausführlich der Analyse der Gephyrin-vermittelten GABAAR Clusterbildung gewidmet. Meine röntgenkristallographischen Studien und Bindungsstudien zeigen, dass Gephyrin mit den GABAAR α1, α2 und α3 Untereinheiten über eine universelle Bindungsstelle interagiert, welche auch die Wechselwirkungen mit der β-Untereinheit des GlyR vermittelt. Mittels Struktur-basierter Mutagenesestudien konnte ich die Schlüsselreste innerhalb von Gephyrin und der Rezeptor-Untereinheiten identifizieren, die einen entscheidenden Beitrag zur Gesamt-Bindungsstärke liefern. Insbesondere zwei konservierte aromatische Reste in der N-terminalen Hälfte der Rezeptorbindungsregion gehen entscheidende hydrophobe Wechselwirkungen mit Gephyrin ein. Dementsprechend konnte J. Mukherjee, ein Mitarbeiter in der Gruppe unseres Kooperationspartners Steven J. Moss, zeigen, dass der Austausch dieser Reste innerhalb der α2-Untereinheit des GABAAR ausreicht, um einen deutlichen Rückgang der Rezeptor Cluster-Anzahl und ihrer Größe in primären hippokampalen Neuronen zu verursachen. Die Ausweitung meiner Rezeptor-Interaktions-Studien auf Collybistin (CB) ergab, dass dieses Protein im Vergleich zu Gephyrin eine umgekehrte, aber dennoch überlappende Rezeptor-Untereinheiten-Präferenz aufweist. Die GABAAR α3-Untereinheit bindet ausschließlich an Gephyrin (Kd = 5 µM), während die GABAAR α1-Untereinheit zwar vor allem Gephyrin bindet (Kd = 17 µM), zusätzlich jedoch eine schwache Affinität (Kd ≈ 400 µM) für die SH3-Domäne von CB aufweist. Im Gegensatz dazu bindet die GABAAR α2-Untereinheit hochaffin an die SH3-Domäne von CB (Kd = 1 µM) und zeigt zusätzlich eine schwache Gephyrin Affinität (Kd ≈ 500 µM). Interessanterweise konnte ich Synergieeffekte zwischen der GABAAR α2-Untereinheit, Gephyrins E-Domäne und CBs SH3-Domäne ausschließen und statt dessen zeigen, dass diese Rezeptor-Untereinheit exklusiv entweder Gephyrin oder CB bindet. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Rolle von CB in der Rezeptor-Anhäufung allein durch die konkurrierenden Bindungs-Ereignisse seiner konstituierenden Domänen bestimmt wird. Die intramolekulare Assoziation zwischen der PH und der DH-Domäne mit der SH3-Domäne von CB konkurriert mit unterschiedlichen intermolekularen Wechselwirkungen von CB. Und zwar mit der GABAAR α2-Untereinheit-Bindung an die SH3-Domäne, mit der PIP2-Bindung an die PH-Domäne, sowie mit der Gephyrin-Bindung, welche vermutlich von der PH und DH-Domäne von CB vermittelt wird. (iii) Interessanterweise bestätigen frühere Studien, dass die Rezeptor-Motive, die ich hier identifiziert habe und welche direkt mit den Gerüst-Proteinen wechselwirken, in vivo posttranslational modifiziert vorliegen. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Gephyrin-Bindemotive der GABAAR α1-Untereinheit und GlyR β-Untereinheiten Ziele des ERK/MAPK und PKC-Phosphorylierungs-Weges sind, während das Radixin-Bindungs-Motiv innerhalb der GABAAR α5-Untereinheit ubiquitiniert vorliegt. In dieser Dissertation habe ich im Besonderen die ERK-Phosphorylierung von Thr348 in der GABAAR α1-Untereinheit untersucht. Tatsächlich konnten meine Bindungs-Assays eine starke Reduktion der direkten Gephyrin Bindungsstärke beim Einbringen eines phosphomimetischen Restes bestätigen. Darüber hinaus konnte J. Mukherjee eine signifikante Reduktion der Cluster-Anzahl und Größe beim Einführen der gleichen Mutation in die α1-Untereinheit beinhaltenden GABAARs in hippokampalen Neuronen beobachten. Der ERK/MAPK-Regulation-Weg ist daher ein aussichtsreicher Kandidat für die Regulation der GABAergen-Signalübertragung. (iv) In vivo bildet Gephyrin vermutlich durch Selbstorganisation seiner G (GephG) und E-Domänen (GephE) ein multivalentes Gerüst. Angesichts der multimeren Natur Gephyrins und der pentameren Rezeptorarchitektur habe ich die Möglichkeit von Aviditäts-Effekten im Prozess der synaptischen Neurotransmitter-Rezeptor-Anhäufung untersucht. Die Kristallstrukturen von GephE im Komplex mit ausgewählten Peptiden zeigen zwei Rezeptor-Bindungsstellen in räumlicher Nähe (15 Å). Auf der Basis dieser Information habe ich bivalente Peptide entworfen, welche beide Rezeptor-Bindungsstellen in Gephyrin simultan besetzen können und, wie erwartet, konnte ich mit Hilfe verschiedener biophysikalischen Methoden eine unübertroffen hohe, durch Avidität potenzierte, Gephyrin-Affinität nachweisen. Mir gelang es diesen Aviditäts-Effekt für einen schwachen Gephyrin Liganden, ein GABAAR-abgeleitetes Peptid, welcher nicht mit herkömmlichen monomeren Liganden untersucht werden konnte, nutzbar zu machen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass diese Verbindung gezielt die Rezeptor-Bindungsstelle in GephE besetzt und auf diese Weise hemmend auf Gephyrins Rezeptorbindungsaktivität wirkt. Eine weitere Entwicklung dieser Verbindung könnte die Möglichkeit eröffnen, spezifisch die Wirkung der Entkopplung der Gephyrin Rezeptor-Interaktion in der Zellkultur-Experimenten zu analysieren ohne dabei die Anzahl oder die Funktion der Proteine zu beeinträchtigen, was einen Nebeneffekt von konventionellen Methoden wie Gen „knock-out“, RNA-Interferenz oder den Einsatz von Antikörpern darstellt. N2 - γ-Aminobutyric acid type A receptors (GABAARs) and glycine receptors (GlyRs) are the major mediators of fast synaptic inhibition in the central nervous system. For proper synaptic function their precise localization and exact concentration within the neuronal surface membrane is essential. These properties are mediated by scaffolding proteins which directly contact the large intracellular loops of the receptors and tether them to cytoskeletal elements of the neuronal cells. In my thesis I deciphered the molecular details of several underlying protein-protein interactions, namely the interaction of a subset of GABAAR and GlyR subunits with the scaffolding proteins gephyrin, radixin and collybistin. I determined short linear motifs within the large intracellular loops of the receptors that directly engage in subunit specific scaffold protein interactions. My quantitative binding studies revealed that gephyrins E domain primarily recognizes the GABAAR α1 (Kd = 17 M) and α3 (Kd = 5 M) subunits, in contrast, the SH3 domain of collybistin mainly interacts with the GABAAR α2 subunit (Kd = 1 µM), while the FERM domain of radixin tightly binds to the GABAAR α5 subunit (Kd = 8 µM). My work additionally demonstrated that this simple relationship is complicated by (i) missing or (ii) overlapping binding specificities between the scaffold proteins and the receptor subunits. Moreover, this thesis addressed the possibility of (iii) posttranslational negative regulation as well as amplification generated by (iv) avidity effects as summarized below. (i) First, using biochemical methods I mapped the radixin-GABAAR α5 interaction in detail. My structural analysis and competition assays suggest that radixin mediates the receptor subunit binding via a universal binding site within the F3 subdomain of its FERM domain. This binding site is formed by an α-helix that offers a large hydrophobic pocket, which accepts a variety of different hydrophobic residues adopting different conformations, and a β-strand that readily engages in peptide backbone interactions. Not surprisingly, this binding site has been implicated in a wide variety of different scaffold interactions, thus emphasizing the importance of the essential FERM activation mechanism described earlier and suggesting additional pathways to allow tight regulation of this interaction. (ii) Next, I analyzed in detail the process of gephyrin-mediated GABAAR clustering. My X-ray crystallographic studies and binding assays revealed that gephyrin mediates binding of the GABAAR α1, α2 and α3 subunit via a universal binding site that also mediates the interactions with the GlyR β subunit. Using structure-guided mutagenesis I identified key residues within gephyrin and the receptor subunits that act as major contributors to the overall binding strength. Namely, two conserved aromatic residues within the N-terminal half of the receptor binding region engage in crucial hydrophobic interactions with gephyrin. Accordingly, J. Mukherjee from the group of our collaborator Steven J. Moss verified a substantial decrease in GABAAR cluster number and size in primary hippocampal neurons upon exchange of these residues within the GABAAR α2 subunit. Extension of my studies to collybistin (CB) revealed an overlapping but reciprocal subunit preference for this protein in comparison to gephyrin. The GABAAR α3 subunit exclusively binds gephyrin, in contrast the GABAAR α1 subunit mainly targets gephyrin (Kd = 17 µM) but additionally displays a moderate affinity (Kd ≈ 400 µM) towards the SH3 domain of CB. The GABAAR α2 subunit binds tightly to the SH3 domain of CB (Kd = 1 µM) and additionally displays a weak gephyrin affinity (Kd ≈ 500 µM). Notably, I could exclude the possibility of synergistic effects between gephyrins E domain, the SH3 domain of CB and the GABAAR α2 subunit. Instead, I found that the GABAAR α2 subunit binds gephyrin and CB in a mutually exclusive manner. These results suggest that CBs role in receptor clustering is solely determined by competing binding events of its constituting domains. Namely, the intra-molecular association between the PH/DH domain and the SH3 domain within CB competes with different inter-molecular interactions of CB: GABAAR α2 binding to the SH3 domain, PIP2 binding to the PH domain and gephyrin presumably binding to the PH and DH domain of CB. (iii) Interestingly, the receptor motifs, which have been mapped in my thesis to directly interact with the scaffold proteins, were shown in earlier studies to be posttranslationally modified in vivo. In particular, the GABAAR α1 and GlyR β subunits have been implicated as targets of the ERK/MAPK and PKC phosphorylation-pathways, respectively, while the GABAAR α5 subunit motif was shown to be ubiquitinated. In this dissertation, I analyzed Thr348, a possible ERK phosphorylation site within GABAAR α1. My binding assays verified a severe reduction of the direct gephyrin binding strength upon introduction of the respective phosphomimetic residue. The relevance of this in vitro result was highlighted by J. Mukherjee who confirmed a significant reduction in GABAAR cluster number and size upon introduction of the same mutation. The ERK/MAPK pathway is therefore a promising candidate for regulation of GABAergic transmission. (iv) In vivo, gephyrin presumably forms a multivalent scaffold, which is based on the self-association of its G (GephG) and E domains (GephE). Given the multimeric nature of gephyrin and the pentameric receptor architecture, I tested the possibility of avidity in the clustering of inhibitory neurotransmitter receptors. Cocrystallization of selected minimum peptides with GephE and their crystal structure analyses enabled me to define a receptor-derived peptide that offers a maximized gephyrin affinity. The structure of the GephE-GlyR  receptor complex reveals two receptor-binding sites in close spatial vicinity (15 Å). I therefore designed bivalent peptides that enable to target both GephE sites at the same time and, as expected, a variety of biophysical methods verified an avidity-potentiated and unmatched high gephyrin affinity for these bidentate compounds. Notably, I could extend the dimerization approach to low affinity gephyrin ligands, namely short GABAAR-derived peptides that could not be studied using conventional monomeric ligands. Additionally, I verified that this compound specifically targets GephEs receptor binding site, and that it thereby inhibits its receptor binding activity. Further development of this molecule may offer the possibility to specifically analyze the effect of uncoupling the gephyrin-receptor interaction in cell culture-based assays, without altering protein function or expression level that accompanies conventional methods such as protein knock-out, RNA interference or the usage of antibodies. KW - Gephyrin KW - Neurotransmitter-Rezeptor KW - GABAA-Rezeptor KW - Glyzinrezeptor KW - Gephyrin KW - Neurotransmitter Rezeptoren KW - GABA A Rezeptoren KW - Rezeptor Verankerung KW - Glyzin Rezeptoren KW - Gephyrin KW - Neurotransmitter Receptors KW - GABA A Receptors KW - Receptor Anchoring KW - Glycine Receptors Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85712 ER - TY - THES A1 - Reddy, Edamakanti Chandrakanth T1 - Role of differential phosphorylation of c-Jun N-terminal domain in degenerative and inflammatory pathways of CNS T1 - Die Rolle der unterschiedlichen Phosphorylierung von c-Jun N-terminale Domäne bei degenerativen und entzündlichen Wirkungen im Nervengewebe N2 - In this study we have investigated the possible role of c-Jun and it’s activation by the JNK pathway in neuronal cell death and in the inflammatory response of activated astrocytes. The first part of this thesis focuses on the role of site specific phosphorylation of c-Jun in neuronal cell death. The second part focuses on the function of c-Jun in LPS-mediated activation of Bergmann glia cells. In the nervous system, activation of c-Jun transcription factor by different isoforms of c-Jun N-terminal kinase (JNK) functions in various cellular programs, including neurite outgrowth, repair and apoptosis. Yet, the regulatory mechanism underlying the functional dichotomy of c-Jun remains to be elucidated. Serine (S) 63/73 and threonine (T) 91/93 of c-Jun are the target phosphorylation sites for JNKs in response to various stimuli. Yet, these two groups of phosphorylation sites are differentially regulated in vivo, as the S63/73 sites are promptly phosphorylated upon JNK activation, whereas T91/93 phosphorylation requires a priming event at the adjacent T95 site. In our study, we used cerebellar granule cell (CGC) apoptosis by trophic/potassium (TK) deprivation as a model system to investigate the regulation and function of site-specific c-Jun phosphorylation at the S63 and T91/T93 JNK-sites in neuronal cell death. In this model system, JNK induces pro-apoptotic genes through the c-Jun/Ap-1 transcription factor. On the other side, a survival pathway initiated by lithium leads to repression of pro-apoptotic c-Jun/Ap-1 target genes without interfering with JNK activity. Yet, the mechanism by which lithium inhibits c-Jun activity remains to be elucidated. We found that TK-deprivation led to c-Jun phosphorylation at all three JNK sites. However, immunofluorescence analysis of c-Jun phosphorylation at single cell level revealed that the S63 site was phosphorylated in all c-Jun-expressing cells, whereas the response of T91/T93 phosphorylation was more sensitive, mirroring the switch-like apoptotic response of cerebellar granular cells (CGCs). Furthermore, we observed that lithium impaired c-Jun phosphorylation at T91/93, without interfering with S63/73 phosphorylation or JNK activation, suggesting that T91/T93 phosphorylation triggers c-Jun pro-apoptotic activity. Notably, expression of a c-Jun mutant lacking the T95-priming site for T91/93 phosphorylation (c-Jun A95) mimicked the effect of lithium on both cell death and c-Jun site-specific phosphorylation, whereas it was fully able to induce neurite outgrowth in naïve PC12 cells. Vice-versa, a c-Jun mutant bearing aspartate-substitution of T95 overwhelmed lithium-mediate protection of CGCs from TK-deprivation, validating that inhibition of T91/T93/T95 phosphorylation underlies the effect of lithium on cell death. Mass-spectrometry analysis confirmed that c-Jun is phosphorylation at T91/T93/T95 in cells. Moreover, recombinant-JNK phosphorylated c-Jun at T91/T93 in a T95-dependent manner. Based on our results, we propose that T91/T93/T95 phosphorylation of c-Jun functions as a sensitivity amplifier of the JNK cascade, setting the threshold for c-Jun pro-apoptotic activity in neuronal cells. In the central nervous system (CNS), the c-Jun transcription factor has been mainly studied in neuronal cells and coupled to apoptotic and regenerative pathways following brain injury. Besides, several studies have shown a transcriptional role of c-Jun in activated cortical and spinal astrocytes. In contrast, little is known about c-Jun expression and activation in Bergmann glial (BG) cells, the radial cerebellar astrocytes playing crucial roles in cerebellar development and physiology. In this study, we used neuronal/glial cerebellar cultures from neonatal mice to assess putative functions of c-Jun in BG cells. By performing double immunocytochemical staining of c-Jun and two BG specific markers, S100 and GLAST, we observed that c-Jun was highly expressed in radial glial cells derived from Bergmann glia. Bergmann glia-derived cells expressed toll-like receptor (TLR 4) and treatment with bacterial lipopolysaccharide (Le et al.) induced c-Jun phosphorylation at S63, exclusively in BG cells. Moreover, LPS induced IL-1β expression and inhibition of JNK activity abolished both c-Jun phosphorylation and the increase of IL-1β mRNA. Notably, we also observed that LPS failed to induce IL-1β mRNA in neuronal/glial cerebellar cultures generated from conditional knockout mice lacking c-Jun expression in the CNS. These results indicate that c-Jun plays a central role in c-Jun in astroglial-specific induction of IL-1β. Furthermore, we confirmed in vivo that c-Jun is expressed in BG cells, during the formation of the BG monolayer. Altogether, our finding underlines a putative role of c-Jun in astroglia-mediated neuroinflammatory dysfunctions of the cerebellum. N2 - In dieser Studie wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors c-Jun sowie seine Aktivierung durch den JNK Signalweg beim neuronalen Zelltod und bei der entzündlichen Reaktion von aktivierten Astrozyten untersucht. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von mehrfacher c-Jun Phosphorylierung an den Aminosäuren Threonin 91/93/95 beim neuronalen Zelltod. Der zweite Teil konzentriert sich auf die Rolle von c-Jun und seine Transaktivierung in LPS-vermittelter Aktivierung von Bergmann Gliazellen. Als Modellsystem für den neuronalen Zelltod wurde die Apoptose von cerebellären Granularzellen (CGC) durch trophische Granulazellen Kaliumkonzentration-Erniedrigung (TK) verwendet, da es ein Modell der Um das ist, das Zusammenspiel von pro-apoptotischen und pro-Überleben Signalwegen beim neuronalen Zelltod zu studieren. In diesem Modell induziert die c-Jun N-terminale Kinase (JNK) pro-apoptotische Gene durch den c-Jun/Ap-1 Transkriptionsfaktor. Auf der anderen Seite, führt ein Lithium-induzierter Überleben-Signalweg zur Unterdrückung der pro-apoptotischen c-Jun/Ap-1 Zielgene, ohne Interferenz mit JNK Aktivität. Es blieb jedoch der Mechanismus zu klären, durch den Lithium c-Jun-Aktivität hemmt. In der Arbeit wurde dieses Modellsystem benutzt, um die Regulation und Funktion der c-Jun-Phosphorylierung durch JNK an den Stellen S63 und T91/T93 beim neuronalen Zelltod zu studieren. Es wurde gefunden, dass TK-Kaliumerniedrigung zu c-Jun phosphorylierung führte und zwar an allen drei durch JNK phosphorylierbaren Ser/Thr (JNK-Stellen). Immunfluoreszenzanalyse von c-Jun Phosphorylierung auf Einzel-Zell-Ebene ergab jedoch, dass die S63-Stelle in allen c-Jun-exprimierenden Zellen phosphoryliert wurde, während T91/T93 Phosphorylierung empfindlicher war, analog zur Schalter-ähnlichen apoptotischen Antwort von CGCs. Umgekehrt verhinderte Lithium T91 und T93 Phosphorylierung und Zelltod ohne Wirkung auf die S63-Seite, was darauf hindeutet, dass T91/T93 Phosphorylierung durch c-Jun eine pro-apoptotische Aktivität auslöst. Dementsprechend schützte eine c-Jun-Mutation, der die T95 Priming-Stelle für T91/93 Phosphorylierung fehlt (T95A), CGCs vor Apoptose, wohingegen T95A Neuriten-wachstum in PC12-Zellen induzieren konnte. Umgekehrt führte eine c-Jun Mutante mit Aspartat-Substitution von T95 (T95D ) zur Aufhebung der schützenden Wirkung von Lithium auf CGC Apoptose, wodurch bestätigt wurde, dass die Inhibierung der T91/T93/T95 Phosphorylierung der Wirkung von Lithium auf den Zelltod zugrundeliegt. Massenspektrometrie-Analyse bestätigte multiple Phosphorylierung von c-Jun an T91/T93/T95 in den Zellen. Außerdem wurde rekombinantes c-Jun durch JNK an T91/T93 in einer T95-abhängigen Weise phosphoryliert. Basierend auf diesen Ergebnissen wird vorgeschlagen, dass T91/T93/T95 phosphorylierung von c-Jun als Empfindlichkeit-Verstärker der JNK-Kaskade fungiert, der die Schwelle für die pro-apoptotische Aktivität von c-Jun in neuronalen Zellen einstellt. Im zentralen Nervensystem (ZNS) wurde die Rolle des c-Jun Transkriptionsfaktors hauptsächlich bei neuronalem Zelltod und bei neuronaler Regeneration nach Hirnschädigung untersucht. Außerdem wurde auch eine Rolle für c-Jun bei der Transkription in aktivierten kortikalen und spinalen Astrozyten beschrieben. Im Gegensatz dazu ist wenig bekannt über die Expression von c-Jun und dessen Transaktivierung in Bergmann Gliazellen (BG)-Zellen, die eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des Kleinhirns und dessen Physiologie spielen. In dieser Arbeit wurde die putative Rolle von c-Jun bei kultivierten neuronalen/BG-Zellen aus dem Maus-Kleinhirn untersucht. Immunfluoreszenzanalyse von c-Jun und zwei für BG-Zellen spezifische Marker, S100 und GLAST, ergab, dass c-Jun in BG-Zellen hoch exprimiert wurde. Außerdem wurde gefunden, dass der Toll-like Rezeptor TLR4 in BG-Zellen exprimiert ist und dass die Behandlung mit bakteriellem Lipopolysaccharid (Le et al.) die c-Jun- Phosphorylierung an S63 induziert. Zusätzlich wurde gefunden, dass LPS IL-1b Expression induziert und die Inhibierung von JNK Aktivität verhinderte sowohl c-Jun-Phosphorylierung, als auch die Zunahme von IL-1 b mRNA. Insbesondere konnte LPS die IL-1b mRNA-Produktion in neuronalen / BG-Kulturen aus konditionellen Knockout Mäusen, denen c-Jun im ZNS fehlte, nicht induzieren, womit gezeigt wurde, dass c-Jun bei der Astroglia-spezifischen Induktion von IL-1 b essentiell ist. Immunohistochemische Analyse von c-Jun-exprimierenden Zellen im postnatalen Kleinhirn bestätigte in-vivo die Expression von c-Jun in BG Zellen und förderte eine dynamische Expression von c-Jun während der Entwicklung der BG Monolayer zutage. Insgesamt unterstreichen die Befunde dieser Arbeit eine wahrscheinliche Rolle von c-Jun bei Astroglia-vermittelten neuroinflammatorischen Funktionsstörungen des Kleinhirns. KW - Jun KW - c-Jun Phosphorylierung KW - JNK KW - neuronal cell death KW - Licl KW - degeneratives Nervengewebe KW - Zelltod KW - Zentralnervensystem KW - Astrozyt Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90748 ER - TY - THES A1 - Hagedorn, Ina T1 - Novel mechanisms underlying arterial thrombus formation: in vivo studies in (genetically modified) mice T1 - Neue Mechanismen der arteriellen Thrombusbildung: in vivo-Studien in (genetisch veränderten) Mäusen N2 - Thrombus formation at sites of vascular lesions is a dynamic process that requires a defined series of molecular events including the action of platelet adhesion/activation receptors, intracellular signal transduction, cytoskeletal rearrangements and activation of plasma coagulation factors. This process is essential to limit post-traumatic blood loss but may also contribute to acute thrombotic diseases such as myocardial infarction and stroke. With the help of genetically modified mice and the use of specific protein inhibitors and receptordepleting antibodies, the work presented in this thesis identified novel mechanisms underlying thrombus formation in hemostasis and thrombosis. In the first part of the study, it was shown that von Willebrand Factor (vWF) binding to glycoprotein (GP)Iba is critical for the formation of stable pathological thrombi at high shear rates, suggesting GPIba as an attractive pharmacological target for antithrombotic therapy. The subsequent analysis of recently generated phospholipase (PL)D1-deficient mice identified this enzyme, whose role in platelet function had been largely unknown, as a potential target protein downstream of GPIba. This was based on the finding that PLD1- deficient mice displayed severely defective GPIba-dependent thrombus stabilization under high shear conditions in vitro and in vivo without affecting normal hemostasis. The second part of the thesis characterizes the functional relevance of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-bearing collagen receptor GPVI and the recently identified hemITAM-coupled C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) for in vivo thrombus formation. Genetic- and antibody-induced GPVI deficiency was found to similarly protect mice from arterial vessel occlusion in three different thrombosis models. These results confirmed GPVI as a promising antithrombotic target and revealed that antibody-treatment had no obvious off-target effects on platelet function. Similarly, immunodepletion of CLEC-2 by treating mice with the specific antibody INU1 resulted in markedly impaired thrombus growth and stabilization under flow in vitro and in vivo. Furthermore, it could be demonstrated that double-immunodepletion of GPVI and CLEC-2 resulted in severely decreased arterial thrombus formation accompanied by dramatically prolonged bleeding times. These data revealed an unexpected redundant function of the two receptors for in vivo thrombus formation and might have important implications for the potential development of anti-GPVI and anti-CLEC-2 antithrombotic agents. The third part of the thesis provides the first functional analysis of megakaryocyte- and platelet-specific RhoA knockout mice. RhoA-deficient mice displayed a defined signaling defect in platelet activation, leading to a profound protection from arterial thrombosis andand ischemic brain infarction, but at the same time also strongly increased bleeding times. These findings identified the GTPase as an important player for thrombus formation in hemostasis and thrombosis. Based on the previous proposal that the coagulation factor (F)XII might represent an ideal target for safe antithrombotic therapy without causing bleeding side effects, the last part of this thesis assesses the antithrombotic potential of the newly generated FXIIa inhibitor rHAInfestin- 4. It was found that rHA-Infestin-4 injection into mice resulted in virtually abolished arterial thrombus formation but no change in bleeding times. Moreover, rHA-Infestin-4 was similarly efficient in a murine model of ischemic stroke, suggesting that the inhibitor might be a promising agent for effective and safe therapy of cardio- and cerebrovascular diseases. N2 - Thrombusbildung an einer verletzten Gefäßstelle ist ein dynamischer Prozess, der ein definiertes Zusammenspiel von Thrombozytenadhäsions-/aktivierungsrezeptoren, intrazellulären Signalen, Zytoskelettumstrukturierungen sowie die Aktivierung von Plasma Koagulationsfaktoren benötigt. Dieser Prozess ist essenziell um Blutungen nach einer Gefäßverletzung zu stoppen, kann aber auch zu akuten thrombotischen Erkrankungen wie Herzinfarkt und Schlaganfall führen. Mit Hilfe von genetisch veränderten Mäusen und der Verwendung von spezifischen Proteininhibitoren und Rezeptor-depletierenden Antikörpern wurden in der hier vorliegenden Dissertation neue Mechanismen der Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose identifiziert. In dem ersten Teil der Studie konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen von Willebrand Faktor (vWF) und Glykoprotein (GP)Iba entscheidend für die Bildung von pathologischen Thromben bei hohen Scherraten ist, was auf die Eignung von GPIba als eine attraktive pharmakologische Zielstruktur (Target) für eine antithrombotische Therapie hindeutet. Die anschließende Analyse von vor kurzem generierten Phospholipase (PL)D1- defizienten Mäusen identifizierte dieses Enzym, dessen Rolle in der Thrombozytenfunktion bislang unbekannt war, als eine mögliches Targetprotein im Signalweg von GPIba. Dies basierte vor allem auf der Erkenntnis, dass PLD1-defiziente Mäuse eine stark gestörte GPIba-abhängige Thrombusstabilisierung unter hohen Scherbedingungen aufwiesen, ohne jedoch dabei die normale Hämostase zu beeinflussen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die funktionelle Relevanz des immunoreceptor tyrosinebased activation motif (ITAM)-gekoppelten Kollagenrezeptors GPVI und des vor kurzem entdeckten hemITAM-gekoppelten C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) für die in vivo Thrombusbildung charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass genetisch- und durch Antikörperinduzierte GPVI-Defizienz Mäuse gleichermaßen vor arteriellem Gefäßverschluss in drei verschiedenen Thrombosemodellen schützt. Diese Ergebnisse bestätigten GPVI als ein viel versprechendes antithrombotisches Target und zeigten, dass eine Antikörperbehandlung in Mäusen keine offensichtlichen unspezifischen Effekte auf die Thrombozytenfunktion hatte. Eine gleichermaßen induzierte Immunodepletion von CLEC-2 durch die Behandlung von Mäusen mit dem spezifischen Antikörper INU1 führte zu deutlich vermindertem Thrombuswachstum und reduzierter Thrombusstabilisierung unter Flussbedingungen in vitro und in vivo. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Doppel-Immunodepletion von GPVI und CLEC-2 zu einer stark reduzierten arteriellen Thrombusbildung führte, die mit dramatisch verlängerten Blutungszeiten einherging. Diese Ergebnisse machten eineunerwartete funktionelle Redundanz der beiden Rezeptoren deutlich und könnten möglicherweise einen wichtigen Einfluss auf eine eventuelle Entwicklung von anti-GPVI und anti-CLEC-2 antithrombotischen Wirkstoffen haben. Der dritte Teil der Arbeit liefert die erste funktionelle Analyse von Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen RhoA-Knockout Mäusen. RhoA-defiziente Mäuse zeigten einen definierten Signaldefekt in der Thrombozytenaktivierung, der zu einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose und ischämischen Hirninfarkt aber gleichzeitig auch zu stark erhöhten Blutungszeiten führte. Dieses Ergebnis identifizierte die GTPase als einen wichtigen Spieler für die Thrombusbildung in Hämostase und Thrombose. Basierend auf dem vorausgegangenen Vorschlag, dass der Koagulationsfaktor XII (FXII) ein ideales Target für eine sichere antithrombotische Therapie darstellen könnte, ohne Blutungsnebenwirkungen zu verursachen, untersucht der letzte Teil der Arbeit das antithrombotische Potential des neu generierten FXIIa Inhibitors rHA-Infestin-4. Es konnte gezeigt werden, dass eine Injektion von rHA-Infestin-4 in Mäuse die arterielle Thrombusbildung nahezu aufhob aber Blutungszeiten nicht veränderte. Außerdem war rHAInfestin- 4 gleichermaßen effizient in einem Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls, was darauf schließen lässt, dass der Inhibitor ein vielversprechender Wirkstoff für eine effektive und sichere Therapie von kardio- und zerebrovaskulären Erkrankungen sein können KW - Thrombus KW - Gerinnungsfaktor KW - Arterielles Blut KW - Zielstruktur KW - Maus KW - biomedicine KW - cell KW - blood KW - vascular system KW - Allgemeine Zelle KW - Zellkern KW - Blutgefäßsystem KW - Blut-Hirn-Schranke Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85752 ER - TY - THES A1 - Brill, Martin Fritz T1 - Processing and plasticity within the dual olfactory pathway in the honeybee brain T1 - Verarbeitung und Plastizität in der dualen olfaktorischen Bahn im Gehirn der Honigbiene N2 - In their natural environment animals face complex and highly dynamic olfactory input. This requires fast and reliable processing of olfactory information, in vertebrates as well as invertebrates. Parallel processing has been shown to improve processing speed and power in other sensory systems like auditory or visual. In the olfactory system less is known about olfactory coding in general and parallel processing in particular. With its elaborated olfactory system and due to their specialized neuroanatomy, honeybees are well-suited model organism to study parallel olfactory processing. The honeybee possesses a unique neuronal architecture - a dual olfactory pathway. Two mirror-imaged output projection neuron (PN) pathways connect the first olfactory processing stage, the antennal lobe (analog to the vertebrates olfactory bulb, OB), with the second, the mushroom body (MB) known to be involved in orientation and learning and memory, and the lateral horn (LH). The medial antennal lobe-protocerebral tract (m-APT) first innervates the MB and thereafter the LH, while the other, the lateral-APT (l-APT) projects in opposite direction. The neuroanatomy and evolution of these pathways has been analyzed, yet little is known about its physiology. To analyze the function of the dual olfactory pathway a new established recording method was designed and is described in the first chapter of this thesis (multi-unit-recordings). This is now the first time where odor response from several PNs of both tracts is recorded simultaneously and with high temporal precision. In the second chapter the PN odor responses are analyzed. The major findings are: both tracts responded to all tested odors but with differing characteristics. Since recent studies describe the input to the two tracts being rather similar, the results now indicate differential odor processing along the tracts, therefore this is a good indicator for parallel processing. PNs of the m-APT process odors in a sparse manner with delayed response latencies, but with high odor-specificity. PNs of the l-APT in contrast respond to several odor stimuli and respond in general faster. In some PN originating from both tracts, characteristics of odor-identity coding via response latencies were found. Analyzing the over-all dynamic range of the PNs both l- and m-APT PNs were tested over a large odor concentration range (10-6 to 10-2) (3. chapter). The PNs responded with linear and non-linear correlation of the response strength to the odor concentration. In most cases the l-APT is comparatively more sensitive to low odor concentrations. Response latency decreases with increasing odor concentration in both tracts. Alternative coding principles and elaboration on the hypothesis whether the dual olfactory pathway may contribute coincidental innervation to the next higher-order neurons, the Kenyon cells (KC), is subject of the 4. chapter. Cross-correlations and synchronous responses of both tracts show that in principle odors may be coded via temporal coding. Results suggest that odor processing is enhanced if both tracts contribute to olfactory coding together. In another project the distribution of the inhibitory neurotransmitter GABA (gamma-aminobutyric acid) was measured in the bee’s MB during adult maturation (5. chapter). GABAergic inhibition is of high importance in odor coding. An almost threefold decrease in the total amount of GABAergic innervation was found during adult maturation in the l- and m-APT target region, in particular at the change in division of labor during the transition from a young nurse bee to an older forager bee. The results fit well into the current understanding of brain development in the honeybee and other social insects during adult maturation, which was described as presynaptic pruning and KC dendritic outgrowth. Combining anatomical and functional properties of the bee’s dual olfactory pathway suggests that both rate and temporal coding are implemented along two parallel streams. Comparison with recent work on analog output pathways of the vertebrate’s OB indicates that parallel processing of olfactory information may be a common principle across distant taxa. N2 - In ihrem natürlichen Lebensraum sind Lebewesen mit komplexen und hoch dynamischen olfaktorischen Reizen konfrontiert, was eine schnelle und zuverlässige Duft-Verarbeitung sowohl bei Insekten als auch bei Wirbeltieren erfordert. Im visuellen oder auditorischen System wird sensorischer Eingang durch Parallel-Verarbeitung schneller und effektiver an höhere Gehirnzentren übertragen und verarbeitet. Im olfaktorischen System ist generell und im speziellen über Parallel-Verarbeitung noch wenig bekannt. Die Honigbiene stellt jedoch mit ihrer hoch spezialisierten Duftwahrnehmung und ihrem Duft und Pheromon gesteuerten Verhalten aufgrund ihrer Neuroanatomie einen besonderen Modelorganismus für die Erforschung der Duftverarbeitung und insbesondere der olfaktorischen Parallel-Verarbeitung dar. Honigbienen besitzen „duale olfaktorische Bahnen“, die ausschließlich in Hymenopteren (Bienen, Ameisen, Wespen) als Merkmal ausgeprägt sind. Gebildet werden sie aus zwei spiegelbildlichen Projektions-Neuronen (PN) Ausgangs-Trakten, die das erste olfaktorische Verarbeitungs-Zentrum, den Antennal-Lobus (vergleichbar mit dem Olfaktorischen Bulbus der Wirbeltiere, OB) mit sekundären Verarbeitungszentren, dem Pilzkörper (MB) und dem lateralen Horn (LH) verbinden. Der mediale Antennal-Lobusprotocerebrale Trakt (m-APT) innerviert erst den MB und dann das LH, der laterale Trakt (l-APT) projiziert in umgekehrter Reihenfolge. Der MB ist bei Orientierung, Lernen und Gedächtnis involviert, über die Funktion des LH ist in der Biene noch wenig bekannt. Über die Neuroanatomie und Evolution dieser dualen Bahnen wurde viel geforscht, die Funktion und damit ihre Physiologie sind allerdings noch unzureichend aufgeklärt. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich deshalb mit der Duftverarbeitung im Bienengehirn und im Speziellen mit Parallelverarbeitung in der Olfaktorik. Für die Aufklärung wurde eine neu entwickelte und in dieser Dissertation beschriebene Messmethode etabliert (1. Kapitel). Mit Hilfe dieser Messapparatur (Multi-Unit Recordings) ist es jetzt das erste Mal möglich, hoch-zeitaufgelöst simultan aus beiden Trakten mehrere PNs auf unterschiedliche Düfte hin zu untersuchen. Das 2. Kapitel beschäftigt sich eingehender mit der Analyse von Duftanworten der PN. Die Hauptergebnisse sind, dass beide Trakte auf alle getesteten Düfte regieren, dies aber mit unterschiedlichen Charakteristiken tun. Da gezeigt wurde, dass beide Trakte ähnlichen olfaktorischen Eingang erhalten, die Trakte aber Düfte unterschiedlich verarbeiten, stellen diese Ergebnisse ein erstes Indiz für Parallelverarbeitung im olfaktorischen System der Biene dar. M-APT PN reagieren mit Zeitverzögerung und duftspezifisch, d.h. selektiver auf Düfte. Dagegen reagieren l-APT PN vergleichsweise schneller und duft-unspezifischer auf die in dieser Arbeit verwendeten Düfte. In einigen PN beider Trakte wurde gefunden, dass die PN Duft-Identitäten über duftspezifische Antwort-Latenzen abgebildet werden können. Um Aufschluss über die Gesamtdynamik der PN zu gewinnen, wurden l- und m-APT PN Antworten über weite Duftkonzentrationen (10-6 bis 10-2) hin untersucht (3. Kapitel). Die PN reagierten mit linearen und nicht-linearen Korrelationen. Zudem sind in den meisten Fällen l-APT PN bei schwachen Duftkonzentrationen sensitiver. Die Antwort-Latenz ist zur Duftkonzentration in beiden Trakten negativ-proportional. Alternative Kodierungsmöglichkeiten und die Ausarbeitung der Hypothese, dass die dualen Bahnen eine Koinzidenzverschaltung auf die nächst höheren Neurone, die Kenyon Zellen (KC), bilden könnten, wird im 4. Kapitel behandelt. Dazu zeigen Kreuz-Korrelationsanalysen und synchrone Antwortmuster aus beiden Trakten, dass prinzipiell Düfte auch über Zeit-Kodierung verarbeitet werden können. Generell zeigt sich, dass die dualen olfaktorischen Bahnen eine verbesserte Duftkodierung gegenüber einem Trakt gewährleisten. In einem weiteren Ansatz wurde die alterskorrelierte Plastizität der inhibitorischen GABAergen (gamma-Aminobuttersäure) Innervation im Pilzkörper der Biene während der Adult-Reifung bestimmt (5. Kapitel). Inhibition ist für olfaktorische Kodierung sehr wichtig. Eine fast dreifache Reduktion in der Gesamtmenge von GABA wurde während der Adult-Reifung in beiden Zielregionen der dualen olfaktorischen Bahn gleichermaßen gefunden. Dieser Effekt wurde mit einer insgesamt halbierten GABA Innervierung ebenfalls im visuellen Innervationsgebiet des MB gefunden. Die Ergebnisse passen gut in das derzeitige Verständnis von Adultplastizität der Pilzkörper in der Honigbiene, in denen eine Ausdünnung (Pruning) präsynaptischer Endigungen von PN und ein Auswachsen von KC-Dendriten beschrieben wurde. Aus den neuroanatomischen und physiologischen Eigenschaften der dualen olfaktorischen Bahnen lässt sich schlussfolgern, dass Düfte sowohl über Raten- als auch Zeit-Kodierung bis hin zu Koinzidenz-Verschaltungen verarbeitet werden können. Zudem zeigen derzeitige Arbeiten über analoge Ausgangs-Trakte im OB von Wirbeltieren, dass Parallelverarbeitung im olfaktorischen System ein allgemeines Kodierungsprinzip über weit entfernte Taxa zu sein scheint. KW - Tierphysiologie KW - Geruchssinn KW - Nervennetz KW - Nervenzelle KW - Biene KW - Antennallobus KW - antennal lobe KW - olfaction KW - multi-unit recording KW - Insekten KW - Geruch KW - Physiologie Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85600 ER - TY - THES A1 - Asthana, Manish T1 - Associative learning – Genetic modulation of extinction and reconsolidation and the effects of transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) T1 - Assoziatives Lernen - Genetische Modulation der Auslöschung und Rück-verfestigung und die Auswirkungen der transkraniellen Gleichstromstimulation (tDCS) N2 - Scientific surveys provide sufficient evidence that anxiety disorders are one of the most common psy-chiatric disorders in the world. The lifetime prevalence rate of anxiety disorder is 28.8% (Kessler, et al., 2005). The most widely studied anxiety disorders are as follows panic disorder (PD), post-traumatic stress disorder (PTSD), obsessive-compulsive disorder (OCD), social phobia (or social anxiety disorder), specific phobias, and generalized anxiety disorder (GAD). (NIMH Article, 2009). Classical conditioning is the stable paradigm used from the last one century to understand the neurobi-ology of fear learning. Neurobiological mechanism of fear learning is well documented with the condi-tioning studies. In the therapy of anxiety disorders, exposure based therapies are known to be the most effective approaches. Flooding is a form of exposure therapy in which a participant is exposed to the fear situation and kept in that situation until their fear dissipates. The exposure therapy is based on the phenomena of extinction; this means that a conditioned response diminishes if the conditioned stimulus (CS) is repeatedly presented without an unconditioned stimulus (UCS). One problem with extinction as well as with exposure-based therapy is the problem of fear return (for e.g. renewal, spontaneous recov-ery and reinstatement) after successful extinction. Therefore, extinction does not delete the fear memory trace. It has been well documented that memory processes can be modulated or disrupted using several sci-entific paradigms such as behavioral (for e.g. exposure therapy), pharmacological (for e.g. drug manipu-lation), non-invasive stimulation (for e.g. non-invasive stimulation such as electroconvulsive shock (ECS), transcranial magnetic stimulation (TMS), transcranial direct current stimulation (tDCS), etc. However, modulation of memory processes after reactivation or via non-invasive stimulation is still not clear, which is the focus of the current study. In addition, study of genetic variant suggests that genetic differences play a vital role in the psychiatric disorder especially in fear learning. Hence, it is also one of the concerns of the current dissertation to investigate the interaction between gene and reconsolidation of memory. With respect to fear-conditioning, there are three findings in the current dissertation, which are as fol-lows: (i) In the first study we investigated that non-invasive weak electrical stimulation interferes with the consolidation process and disrupts the fear consolidation to attain stable form. This might offer an effective treatment in the pathological memories, for e.g. PTSD, PD, etc. (ii) In the second study we demonstrated whether a brief single presentation of the CS will inhibit the fear recovery. Like earlier studies we also found that reactivation followed by reconsolidation douses fear return. Attenuation of fear recovery was observed in the reminder group compared to the no-reminder group. (iii) Finally, in our third study we found a statistically significant role of brain derived neurotrophic factor (BDNF) polymorphism in reconsolidation. Results of the third study affirm the involvement of BDNF variants (Met vs. Val) in the modulation of conditioned fear memory after its reactivation. In summary, we were able to show in the current thesis modulation of associative learning and recon-solidation via transcranial direct current stimulation and genetic polymorphism. N2 - Mit einer lebenslangen Prävalenz von etwa 28% (Kessler Rc, 2005) stellen Angststörungen eine der häufigsten psychischen Störungen weltweit dar. Zu den am besten untersuchten Angststörungen gehö-ren Panikstörungen (PD), posttraumatische Belastungsstörungen (PTSD), Zwangsstörungen (OCD), soziale Phobien (oder soziale Angststörungen), spezifische Phobien und generalisierte Angststörungen (GAD) (NIMH Artikel, 2009). Die klassische Konditionierung ist das seit dem letzten Jahrhundert gültige Paradigma zur Erforschung der neurobiologischen Mechanismen des Angstlernens. Bei der Behandlung von Angststörungen haben sich Konfrontationstherapien als äußerst wirksam herausgestellt. Reizüberflutung (Flooding) ist bei-spielsweise eine Form der Konfrontationstherapie, bei der der Teilnehmer einer furchteinflößenden Situation ausgesetzt und in ihr gehalten wird, bis seine Furcht vergeht. Die Konfrontationstherapie ba-siert auf dem Phänomen der Extinktion, also dem Rückgang eines konditionierten Verhaltens nach wie-derholter Präsentation eines konditionierten Stimulus (CS) ohne einen unkonditionierten Stimulus (UCS). Ein Problem der Extinktion und der Konfrontationstherapien ist, dass das Furchtgefühl nach einer erfolgreichen Extinktion zurückkehren kann, was darauf hinweist, dass eine Extinktion nicht die Spuren des Angstgedächtnisses löscht. Vieles deutet darauf, dass der Erinnerungsprozess mittels verschiedenener wissenschaftlicher Para-digmen moduliert oder unterbrochen werden kann. Hierzu gehören etwa behavioristische (z.B. Kon-frontationstherapie), pharmakologische oder nicht-invasive Interventionen (z.B. Elektrokonvulsions-therapie (ECS), transkranielle Magnetstimulation (TMS) oder transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS)). Da die Modulation von Erinnerungsprozessen nach einer Reaktivierung oder durch eine nicht-invasive Stimulation derzeit noch unzureichend erforscht ist, wurde der Schwerpunkt der vorliegenden Studie auf diese Thematik gelegt. Ein weiteres Ziel ist es, die Wechselwirkung bestimmter Gene mit der Rekonsolidierung des Gedächtnisses zu untersuchen, also Prozesse, denen eine entscheidende Rolle für Angststörungen im Allgemeinen und Furcht-Lernen im Speziellen zugeschrieben wird. Die vorliegende Dissertation umfasst drei zentrale Ergebnisse zur konditionierten Angst: (i.) In der ers-ten Studie wurde herausgefunden, dass eine nicht-invasive, schwache Stimulation den Konsolidie-rungsprozess beeinflusst und verhindert, dass die Angstkonsolidierung eine stabile Form erreicht. Dies könnte eine neue Möglichkeit darstellen, pathologische Gedächtnisinhalte, die z.B. bei Störungen wie PTSD oder PD vorkommen, effektiv zu behandeln. (ii.) Die zweite Studie untersuchte, ob eine kurze, einfache Präsentation des CS das Wiederaufkommen von Angst hemmen kann. Ähnlich wie in früheren Studien beschrieben, fanden auch wir, dass eine Reaktivierung gefolgt von einer Rekonsolidierung die Rückkehr der Angst unterbindet. Insbesondere wurde in der Gruppe, deren Teilnehmer erneut kon-frontiert wurden (reminder), im Vergleich zur Kontroll-Gruppe (no-reminder) ein verringertes Wieder-aufkommen von Angst beobachtet. (iii.) Die dritte Studie zeigte, dass ein Polymorphismus im BDNF-Gen (Met vs Val) eine signifikante Rolle für die Rekonsolidierung und die Modulation des konditionierten Angstgedächtnisses nach seiner Reaktivierung spielt. KW - Konditionierung KW - Angststörung KW - Associative learning KW - transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) KW - Elektrotherapie KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - Assoziatives Lernen KW - transkranielle Gleichstromstimulation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-84158 ER - TY - THES A1 - Schul, Daniela T1 - Spatio-temporal investigation and quantitative analysis of the BMP signaling pathway T1 - Raum-Zeitliche Untersuchung und quantitative Analyse des BMP-Signaltransduktionsweges N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are key regulators for a lot of diverse cellular processes. During embryonic development these proteins act as morphogens and play a crucial role particularly in organogenesis. BMPs have a direct impact on distinct cellular fates by means of concentration-gradients in the developing embryos. Using the diverse signaling input information within the embryo due to the gradient, the cells transduce the varying extracellular information into distinct gene expression profiles and cell fate decisions. Furthermore, BMP proteins bear important functions in adult organisms like tissue homeostasis or regeneration. In contrast to TGF-ß signaling, currently only little is known about how cells decode and quantify incoming BMP signals. There is poor knowledge about the quantitative relationships between signal input, transducing molecules, their states and location, and finally their ability to incorporate graded systemic inputs and produce qualitative responses. A key requirement for efficient pathway modulation is the complete comprehension of this signaling network on a quantitative level as the BMP signaling pathway, just like many other signaling pathways, is a major target for medicative interference. I therefore at first studied the subcellular distribution of Smad1, which is the main signal transducing protein of the BMP signaling pathway, in a quantitative manner and in response to various types and levels of stimuli in murine c2c12 cells. Results indicate that the subcellular localization of Smad1 is not dependent on the initial BMP input. Surprisingly, only the phospho-Smad1 level is proportionally associated to ligand concentration. Furthermore, the activated transducer proteins were entirely located in the nucleus. Besides the subcellular localization of Smad1, I have analyzed the gene expression profile induced by BMP signaling. Therefore, I examined two endogenous immediate early BMP targets as well as the expression of the stably transgenic Gaussia Luciferase. Interestingly, the results of these independent experimental setups and read-outs suggest oscillating target gene expression. The amplitudes of the oscillations showed a precise concentration-dependence for continuous and transient stimulation. Additionally, even short-time stimulation of 15’ activates oscillating gene-expression pulses that are detectable for at least 30h post-stimulation. Only treatment with a BMP type I receptor kinase inhibitor leads to the complete abolishment of the target gene expression. This indicated that target gene expression oscillations depend directly on BMP type I receptor kinase activity. N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) stellen wichtige Regulatoren für eine Vielzahl von verschiedenen zellulären Prozessen dar. Während der Embryonalentwicklung agieren diese Proteine als Morphogene und spielen daher eine entscheidende Rolle für diesen Prozess, vor allem in der Organogenese. Durch Konzentrationsgradienten üben BMPs einen direkten Einfluss auf verschiedene zelluläre Schicksale im entwickelnden Embryo aus. Aufgrund dieser Gradienten gelangen vielfältige Signalinformationen zu den verschiedenen Zellen, welche die extrazelluläre Information in verschiedene Genexpressionsprofile und Zellschicksalsentscheidungen umwandeln. Darüber hinaus tragen BMPs wichtige Funktionen im erwachsenen Organismus, wie z.B. Gewebshomöostase oder -regeneration. Im Gegensatz zu dem verwandten TGF-ß Signaltransduktionsweg ist derzeit nur wenig über die zelluläre Übersetzung und Quantifizierung eingehender BMP-Signale bekannt. Es gibt wenige Kenntnisse über die quantitative Beziehung zwischen Signaleingang, Überträgerproteinen, ihren Zuständen sowie intrazellulären Positionen, und schließlich ihre Fähigkeit Signaleingänge systemisch zu integrieren und qualitative Antworten der Zelle zu produzieren. Eine wesentliche Voraussetzung für die effiziente Signaltransduktions-modulierung ist das vollständige Verständnis des Signalnetzwerkes auf einer quantitativen Ebene, da der BMP-Signalweg, wie auch viele andere Signalwege, ein wichtiges Ziel für medizinische Anwendungen und Medikamentenentwicklung ist. Daher untersuchte ich zunächst die subzelluläre Verteilung der wichtigsten Signalweiterleitungsproteine des BMP-Signalweges, der Smad1-Proteine, auf quantitativer Ebene und deren Reaktion auf verschiedene Stimulierungsarten und BMP-Konzentrationsstufen in murinen c2c12-Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die subzelluläre Lokalisation von Smad1 unabhängig von der BMP-Konzentration ist und nur das phospho-Smad1 Level proportional zur Konzentration des Liganden steigt. Darüber hinaus befanden sich die aktiven Überträgerproteine nach Stimulierungvollständig im Zellkern. Neben der subzellulären Lokalisation von Smad1, habe ich das Genexpressionsprofil von BMP-Zielgenen analysiert. Ich untersuchte zwei endogene und frühe BMP-Zielgene sowie die Expression der stabil transgenen Gaussia Luciferase. Interessanterweise deuten die Ergebnisse dieser zwei unabhängigen Versuchsaufbauten und Detektionsmethoden auf eine oszillierende Expression der Zielgene hin. Die Amplituden der Schwingungen zeigten eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit bei kontinuierlicher und transienter Stimulation. Außerdem aktiviert eine Kurzzeitstimulierung von 15 Minuten ebenfalls ein oszillierendes Genexpressionsprofil, welches für mindestens 30 Stunden nach der Stimulierung nachweisbar ist. Nur die Behandlung mit einem BMP Typ-I-Rezeptorkinaseinhibitor führt zur vollständigen Aufhebung der Zielgenexpression. Infolgedessen sind die Oszillationen der Zielgenexpression direkt von der Aktivität der BMP Typ-I-Rezeptorkinase abhängig. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Signaltransduktion KW - BMP-Signaltransduktionsweg KW - Analyse KW - BMP signaling pathway KW - analysis Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-84224 ER - TY - THES A1 - Schlipp [verh.: Wölfel], Angela T1 - Characterization of anti-beta1-adrenoceptor antibodies with Förster resonance energy transfer microscopy T1 - Charakterisierung von anti-beta1-Adrenozeptor Antikörpern mittels Förster Resonanz Energie Transfer Mikroskopie N2 - Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data. N2 - Dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine wichtige Subgruppe von Patienten mit Herzinsuffizienz dar und ist vermutlich in etwa einem Drittel der Fälle mit einem Autoimmunmechanismus assoziiert. In diesen Patienten konnten funktionell aktive konformationelle Autoantikörper gegen die zweite extrazelluläre Schleife des β1-adrenergen Rezeptors (Anti-β1ECII-AAK) nachgewiesen werden. Diese AK stimulieren chronisch den β1-AR und induzieren dadurch die adrenerge Signaltransduktionskaskade in Kardiomyozyten, was, auf lange Sicht, zur Verschlimmerung der Herzinsuffizienz beiträgt. Mittels eines Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays analysierten wir die Bildung von cAMP nach aab-vermittelter β1-AR Aktivierung in vitro. Dieser Assay verwendet HEK293 Zellen, die den humanen β1-AR sowie den cAMP-Sensor Epac1-camps stabil exprimieren. Der Assay zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg von cAMP bei Stimulation mit dem vollen Agonisten (-) Isoproterenol. Diese Antwort war mit den Ergebnissen an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten vergleichbar und konnte durch einen selektiven β1-AR Antagonist blockiert werden. In verschiedenen Tieren induzierte poly- und monoklonale Anti-β1¬ECII-abs konnten die adrenerge Signalkaskade in dem gleichen FRET Assay aktivieren, wogegen isotypische Kontroll-AK keine intrazellulären cAMP Änderungen herbeiführten. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir funktionell aktivierende AAK im Serum von Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer und hypertensiver Herzerkrankung sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie nachweisen, jedoch nicht im Serum von gesunden Kontrollpersonen. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen dem stimulierenden Potential der Anti-β1-AAKs und der linksventrikulären Pumpfunktion. Um diesen Assay zur Detektion funktionell aktivierender Anti-β1ECII-aabs in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen, versuchten wir ein automatisiertes Hochdurchsatzverfahren zu etablieren. Weder die Durchflusszytometrie noch die FRET Detektion mittels eines Fluoreszenz Plattenlesegeräts wiesen einen akzeptabelen Signal-zu-Rausch-Quotienten auf. Es gelang mit zwei verschiedenen FRET-Multiwell-Mikroskopsystemen die Aktivierung durch (-) isoproterenol konzentrationsabhängig zu detektieren, allerdings war es aufgrund von Fokusproblemen nicht möglich aktivierende Anti- β1¬ECII-AAKs im Hochdurchsatzverfahren zu detektieren. Einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung der Anti-β1-AAK-assoziierten autoimmunen DCM stellt die Neutralisierung der AAKs mittels korrespondierender Epitop-imitierender Peptide dar. Wir konnten im FRET Assay eine Reduktion des aktivierenden Effekts von Anti-β1¬ECII-AAKs nach in vitro Inkubation mit β1¬ECII-imitierenden Peptiden nachweisen. Hierbei erwiesen sich zyklische (in geringerem Maß als lineare) Peptide in 40-fachem molarem Überschuss als effektive Antikörper-„Fänger“ in vitro. Eine intravenöse Gabe der Zyklopeptide in einem Rattenmodell der DCM neutralisierte funktionell aktivierende Anti-β1¬ECII-abs ebenfalls effizient in vivo. Zur genaueren Analyse des von Anti-β1¬ECII-AAK gebundenen Rezeptor-Epitops setzten wir sequentiell Alanin-mutierte β1ECII-imitierende Zyklopeptide ein. Unsere Daten zeigten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten C209 und C215 des humanen β1¬AR essentiell für die Ausbildung des AAK-Epitops zu sein scheinen. Ein Austausch weiterer AK-bindungsrelevanter Aminosäuren im zyklischen Fängerpeptid durch Alanin verminderte dessen Avidität zum AK und inhibierte dessen Rezeptor-aktivierendes Potential weniger effizient. Im Gegensatz dazu verhinderte das nicht-mutierte Zyklopeptid nahezu vollständig die AK-vermittelte Rezeptoraktivierung. Durch diesen Ala-Scan Ansatz konnten wir ein „NDPK“-Epitop identifizieren, das für die AK-Bindung an β1¬ECII essentiell zu sein scheint. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Neutralisation von konformationellen aktivierenden Anti-β1¬ECII-(A)AKs durch Zyklopeptide ein viel versprechendes Therapiekonzept bei Herzinsuffizienz darstellt, das im Hinblick auf die hier vorgestellten Daten weiter ausgebaut werden sollte. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Beta-1-Rezeptor KW - Antikörper KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - Adrenergic receptor KW - Beta-1-receptor KW - Antibodies KW - Fluorescence-resonance-energy-transfer KW - Dilated cardiomyopathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67162 ER - TY - THES A1 - Romer Roche, Paula Sofia T1 - Separation from self explains failure of circulating T-cells to respond to the CD28 superagonist TGN1412 T1 - Verlust der "Selbst"-Erkennung erklärt die fehlende Reaktion zirkulierender T-Zellen auf den CD28-Superagonisten TGN1412 N2 - Stimulatory or superagonistic (SA) CD28-specific monoclonal antibodies (mAbs) are potent polyclonal activators of regulatory T cells and have proven highly effective as treatment in a wide range of rodent models for autoimmune and inflammatory diseases. In these models, a preferential activation of regulatory T cells was observed by in vivo administration of CD28SA. In stark contrast, human volunteers receiving TGN1412, a humanized CD28-specific mAb, experienced a life-threatening cytokine release syndrome during the first-in-man trial. Preclinical tests employing human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) failed to announce the rapid cytokine release measured in the human volunteers in response to TGN1412. The aim of this thesis project was to find an explanation of why standard PBMC assays failed to predict the unexpected TGN1412-induced "cytokine storm" observed in human volunteers. CD28 superagonists can activate T cells without T cell receptor (TCR) ligation. They do depend, however, on “tonic” TCR signals received by MHC scanning, signals that they amplify. PBMC do not receive these signals in the circulation. Short-term in vitro preculture of human PBMC at a high cell density (HDC) resulted in massive cytokine release during subsequent TGN1412 stimulation. Restoration of reactivity was cell-contact dependent, associated with TCR polarization and tyrosine-phosphorylation, and blocked by HLA-specific mAb. In HDC, both CD4 T cells and monocytes functionally mature in a mutually dependent fashion. However, only CD4 memory T-cells proliferate upon TGN1412 stimulation, and were identified as the main source of pro-inflammatory cytokines. Importantly, responses to other T-cell activating agents were also enhanced if PBMC were first allowed to interact under tissue-like conditions. A new in vitro protocol is provided that returns circulating T-cells to a tissue-like status where they respond to TGN1412 stimulation, and it might represent a more reliable preclinical in vitro test for both activating and inhibitory immunomodulatory drugs. Finally, the surprising observation was made that the IgG1 “sibling” of TGN1412, which is of the poorly Fc receptor-binding IgG4 isotype, has a much lower stimulatory activity. We could exclude steric hindrance as an explanation and provide evidence for removal of TGN1112 from the T-cell surface by trans-endocytosis. N2 - Stimulatorische oder superagonistische (SA) CD28-spezifische monoklonale Antikörper (mAbs) (CD28SA) haben sich in diversen Nagetiermodellen für Autoimmunerkrankungen sowie für inflammatorische Erkrankungen als effektive Behandlungsmöglichkeit erwiesen. In diesen Modellen konnte nachgewiesen werden, dass CD28SA-Injektionen zu einer verstärkten Aktivierung regulatorischer T-Zellen in führen. Entgegen diesen Beobachtungen im Tiermodell reagierten die Teilnehmer einer ersten klinischen Studie auf die Administration des humanisierten CD28SA TGN1412 mit einer akut lebensbedrohlichen systemischen Zytokinausschüttung. Vorklinische Studien an humanen mononukleären Zellen des Blutes (PBMC) hatten keinen Hinweis auf eine mögliche plötzliche Zytokinausschüttungen als Reaktion auf TGN1412 gegeben. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht eine Erklärung zu finden, warum PBMC-basierte Tests, wie sie vorklinischen Studien als Standard eingesetzt werden, nicht auf den unerwarteten TGN1412-induzierten „Zytokinsturm“ der Probanden hinwiesen. CD28SA aktivieren T-Zellen ohne Ligation des T-Zell Rezeptors (TCR). Jedoch werden zur CD28SA-abhängigen Aktivierung von T-Zellen „tonische“ TCR Signale benötigt, die durch MHC Scanning der T-Zellen an der Oberfläche anderer Zellen erzeugt werden. PBMC, welche sich in der Zirkulation befinden, erhalten diese „tonischen“ TCR Signale nicht. Kurzzeitige Vorkultur humaner PBMC bei hoher Zelldichte (high-density culture, HDC) führte zu einer starken Zytokinantwort bei nachfolgender TGN1412 Stimulation. Diese wiedererlangte Reaktivität gegenüber TGN1412 ging mit Tyrosin-Phospholrylierung sowie der Polarisierung von TCR Molekülen einher, war abhängig von Zellkontakten und konnte durch HLA-spezifische mAbs geblockt werden. Während der HDC durchlaufen sowohl CD4 T-Gedächtniszellen, als auch Monozyten eine voneinander abhängige funktionelle Reifung. TGN1412-induzierte Zellproliferation beschränkt sich jedoch auf CD4 T-Gedächtniszellen, die auch die Hauptquelle der proinflammatorische Zytokine sind. Antworten auf weitere T-Zell aktivierende Agenzien waren ebenfalls erhöht, wenn PBMC zunächst auf gewebeartige Bedingungen zurückgesetzt wurden. Die vorliegende Arbeit beschreibt damit ein neuartiges in vitro Protokoll für humane PBMC, welches T-Zellen der Zirkulation in einen gewebeartigen funktionellen Status versetzt, in welchem sie auf TGN1412 antworten. Dieses Protokoll könnte auch einen verlässlicheren vorklinischen in vitro Test sowohl für aktivierende als auch für inhibierende immunmodulatorische Medikamente darstellen. Im letzten Teil der Arbeit wird die erstaunliche Beobachtung vorgestellt, dass TGN1112, ein IgG1 Antikörper mit gleicher Spezifität wie der IgG4 Antikörper Antikörper TGN1412, trotz seiner höheren Affinität für Fc-Rezeptoren eine viel geringere stimulatorische Aktivität zeigt. Sterische Hinderung konnte als eine mögliche Erklärung ausgeschlossen werden. Vielmehr scheint das Entfernen von TGN1112/CD28 Komplexen von der T-Zelloberfläche durch Trans-Endozytose eine mögliche Erklärung für die geringere Aktivität zu sein. KW - T-Lymphozyten-Rezeptor KW - Antigen CD28 KW - Monoklonaler Antikoerper KW - CD28-Superagonist KW - TGN1412 KW - T cell receptor KW - CD28 antigen KW - monoclonal antibody KW - CD28-superagonist KW - TGN1412 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74933 ER - TY - THES A1 - Vidal, Marie T1 - b-adrenergic receptors and Erk1/2-mediated cardiac hypertrophy T1 - b-adrenerge Rezeptoren und Erk1/2-vermittelte Herzhypertrophie N2 - Chronische Aktivierung von b-Adrenorezeptoren (b-ARs) durch Katecholamine ist ein Stimulus für kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Ebenso führt die Expression von b1-ARs oder Gas-Proteinen in genetisch modifizierten Mäusen zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Allerdings führt die direkte Aktivierung dem Gas nachgeschalteten Komponenten des b-adrenergen Signalwegs wie z.B. die Aktivierung der Adenylylcyclase (AC) oder der Proteinkinase A (PKA) nicht im signifikanten Ausmaß zur Herzhypertrophie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zusätzlich zu dem klassischen Signalweg, auch weitere durch Gas-Proteine aktivierte Komponenten in die b-adrenerg vermittelte Hypertrophieentwicklung involviert sind. Interessanterweise wurde vor kurzem ein hypertropher Signalweg beschrieben, der eine direkte Involvierung von Gbg-Untereinheiten bei der Induktion von Herzhypertrophie durch die extrazellulär-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) zeigt: Nach Aktivierung Gaq-gekoppelter Rezeptoren binden Gbg-Untereinheiten an die aktivierte Raf/Mek/Erk Kaskade. Die Bindung der freigesetzten Gbg-Untereinheiten an Erk1/2 führt zu einer Autophosphorylierung von Erk1/2 an Threonin 188 (bzw. Thr208 in Erk1; im folgenden ErkThr188-Phosphorylierung genannt), welche für die Vermittlung kardialer Hypertrophie verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch die Aktivierung von b-ARs in Mäusen sowie von isolierten Kardiomyozyten zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung führt. Darüberhinaus führte die Überexpression von Erk2 Mutanten (Erk2T188S und Erk2T188A), die nicht an Threonin 188 phosphoryliert werden können, zu einer deutlich reduzierten Hypertrophieantwort von Kardiomyozyten auf Isoproterenol. Auch die kardiale Expression der Erk2T188S Mutante im Mäusen verminderte die Hypertrophieantwort auf eine 2-wöchige Isoproterenol-Behandlung deutlich: Die linksventrikuläre Wanddicke, aber auch interstitielle Fibrose und Herzinsuffizienzmarker wie z.B. BNP waren signifikant reduziert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass tatsächlich ein Zusammenspiel von Ga und Gbg-vermittelten Signalen zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung und damit zur Induktion von b-adrenerg vermittelter Hypertrophie notwendig ist. Während die Hemmung von Gbg-Signalen mit dem C-Terminus der GRK2 oder die Hemmung von Adenylylzyklase eine ErkThr188-Phosphorylierung und eine Hypertrophieantwort nach Isoprenalingabe effektiv reduzierten, führt die alleinige Aktivierung von Adenylylzyklase nicht zu einer Hypertrophieantwort. Diese Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer möglicher therapeutischen Strategien zur Therapie b-adrenerg induzierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz helfen. N2 - b-adrenergic receptors (b-ARs) participate strongly in the development of cardiac hypertrophy and human heart failure. Stimulation of b-adrenergic receptors with catecholamines as well as cardiac overexpression of b1-ARs or of Gas-proteins in transgenic mice induces cardiac hypertrophy. However, direct activation of their downstream targets, such as adenylyl cyclase (AC) or protein kinase A do not promote a significant degree of cardiac hypertrophy. These findings suggest that additional events may occur and that these events require Gas-protein activation. A hypertrophic pathway involving Gaq-protein coupled receptors has recently been described. Upon activation of Gaq-coupled receptors Gbg-subunits are released from Gaq and bind directly to the activated Raf/Mek/Erk cascade. Direct interaction between bg-subunits and activated Erk1/2 leads to an additional autophosphorylation of Erk2 at threonine 188, which mediates cardiac hypertrophy. Murine hearts, as well as isolated cardiomyocytes present an increase in Erk2Thr188-phosphorylation upon b-AR activation. Similarly overexpression of phosphorylation deficient Erk2 mutants (Erk2T188S and Erk2T188A) reduces b-AR mediated cardiomyocyte hypertrophy. Increase in left ventricular wall thickness, fibrosis and up-regulation of natriuretic peptide synthesis, which are physiological features for cardiac hypertrophy, are strongly inhibited in transgenic mice with a cardiac expression of Erk2T188S after two weeks of sustained isoproterenol treatment. It could further be shown in this work that b-AR mediated cardiac hypertrophy requires two distinct pathways initiated by Gs-protein activation: the canonical phosphorylation of Erk1/2 via adenylyl cyclase and the direct interaction of released bg-subunits with activated Erk1/2. Coincidence of both events leads to Erk2Thr188-phosphorylation, which activates then different transcription factors responsible for cardiac hypertrophy. Sequestration of bg-subunits by overexpression of the C-terminus of GRK2 bark-ct and inhibition of adenylyl cyclase efficiently reduced the hypertrophic response to isoproterenol, whereas direct activation of AC by forskolin failed to induce Erk2Thr188-phosphorylation and cardiomyocyte hypertrophy. These findings may help to develop new therapeutic strategies for the prevention of cardiac hypertrophy and maladaptive remodeling of the heart. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Herzhypertrophie KW - MAP-Kinase KW - adrenerge Rezeptoren KW - Herzhypertrophie KW - Erk1/2 KW - adrenergic receptors KW - cardiac hypertrophy KW - Erk1/2 Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83671 ER - TY - THES A1 - Gupta, Shuchi T1 - The role of the Canonical transient receptor potential 6 (TRPC6) channel and the C terminal LIM domain protein of 36 kDa (CLP36) for platelet function T1 - Die Rolle des Canonical transient receptor potential 6 (TRPC6) Kanals und des 36 kDa C-terminalen LIM Domänenproteins (CLP36) in der Thrombozytenfunktion N2 - Platelet activation and aggregation are essential to limit posttraumatic blood loss at sites of vascular injury, but also contribute to arterial thrombosis, leading to myocardial infarction and stroke. Thrombus formation is the result of well-defined molecular events, including agonist-induced elevation of intracellular calcium ([Ca2+]i) and series of cytoskeletal rearrangements. With the help of genetically modified mice, the work presented in this thesis identified novel mechanisms underlying the process of platelet activation in hemostasis and thrombosis. Store-operated calcium entry (SOCE) through Orai1 was previously shown to be the main Ca2+ influx pathway in murine platelets. The residual Ca2+ entry in the Orai1 deficient platelets suggested a role for additional non-store-operated Ca2+ (non-SOC) and receptor operated Ca2+ entry (ROCE) in maintaining platelet calcium homeostasis. Canonical transient receptor potential channel 6 (TRPC6), which is expressed in both human and murine platelets, has been attributed to be involved in SOCE as well as in diacylglycerol (DAG)-triggered ROCE. In the first part of the study, the function of TRPC6 in platelet Ca2+ signaling and activation was analyzed by using the TRPC6 knockout mice. In vitro agonist induced Ca2+ responses and in vivo platelet function were unaltered in Trpc6-/- mice. However, Trpc6-/- mice displayed a completely abolished DAG mediated Ca2+-influx but a normal SOCE. These findings identified TRPC6 as the major DAG operated ROC channel in murine platelets, but DAG mediated ROCE has no major functional relevance for hemostasis and thrombosis. In the second part of the thesis, the involvement of the PDLIM family member CLP36 in the signaling pathway of the major platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI was investigated. The GPVI/FcR-chain complex initiates platelet activation through a series of tyrosine phosphorylation events downstream of the FcR-chain-associated immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). GPVI signaling has to be tightly regulated to prevent uncontrolled intravascular platelet activation, but the underlying mechanisms are not fully understood. The present study reports the adaptor protein CLP36 as a major inhibitor of GPVI-ITAM signaling in platelets. Platelets from mice expressing a truncated form of CLP36, (Clp36ΔLIM) and platelets from mice lacking the entire protein (Clp36-/-) displayed profound hyper-activation in response to GPVI-specific agonists, whereas GPCR signaling pathways remained unaffected. These alterations translated into accelerated thrombus formation and enhanced pro-coagulant activity of Clp36ΔLIM platelets and a pro-thrombotic phenotype in vivo. These studies revealed an unexpected inhibitory function of CLP36 in GPVI-ITAM signaling and established it as a key regulator of arterial thrombosis. N2 - Die Aktivierung und die Aggregation von Thrombozyten (Blutplättchen) sind essentielle Prozesse, um Blutverluste nach Verletzungen zu begrenzen, sie spielen jedoch auch eine Rolle bei der arteriellen Thrombose, die zu Herzinfarkt und Schlaganfall führen kann. Die Thrombusbildung ist das Ergebnis wohldefinierter molekularer Vorgänge, die die Agonisten-induzierte Konzentrationserhöhung von intrazellulärem Kalzium ([Ca2+]i) und eine Reihe von Umlagerungen des Zytoskeletts mit einschließen. Die Ergebnisse dieser Arbeit, die mit Hilfe genetisch veränderter Mauslinien erzielt wurden, decken neue Mechanismen der Thrombozytenaktivierung in Thrombose und Hämostase auf. Es wurde bereits gezeigt, dass der durch Orai1 vermittelte Store-operated calcium entry (SOCE) den Haupteintrittsweg für Ca2+ in Mausthrombozyten darstellt. Der verbleibende Ca2+ Einstrom führte zur Annahme, dass zusätzlich non-store-operated Ca2+ (non-SOC) und receptor operated Ca2+ entry (ROCE) eine Rolle in der Aufrechterhaltung der Ca2+ Homöostase spielen. Dem Canonical transient receptor potential channel 6 (TRPC6), der in Thrombozyten des Menschen als auch der Maus exprimiert wird, wurde eine Rolle in dem SOCE und diacylglycerol (DAG)-vermitteltem ROCE zugeschrieben. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion von TRPC6 im Ca2+ Signaling und der Aktivierung von Thrombozyten mit Hilfe der TRPC6 defizienten Mauslinie untersucht. Die Funktion der Trpc6-/- Thrombozyten waren in vitro (z.B. Agonisten-induzierte Ca2+-Antworten) als auch in vivo unverändert. Jedoch zeigten Thrombozyten von Trpc6-/- Mäusen einen komplett fehlenden DAG vermittelten Kalziumeinstrom, aber normalen SOCE. Diese Ergebnisse identifizierten TRPC6 als den Haupt-DAG-aktivierten ROC Kanal in Mausthrombozyten. Jedoch hatte diese DAG vermittelte ROCE keine größere funktionelle Relevanz für Thrombose und Hämostase. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle von CLP36, einem Mitglied der PDLIM Proteinfamilie, im Signalweg des Haupt-Kollagenrezeptors, Glykoprotein (GP) VI, auf Thrombozyten untersucht. Der GPVI/FcRKette Komplex initiiert die Thrombozytenaktivierung durch eine Reihe von Tyrosinphosphorylierungen, die dem FcR-Kette-assoziiertem immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) nachgeschaltet sind. GPVI-vermittelte Signale müssen sorgfältig reguliert sein, um eine unkontrollierte intravaskuläre Thrombozytenaktivierung zu verhindern. Jedoch sind die zugrunde liegenden Mechanismen nicht komplett verstanden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass das Adapterprotein CLP36 als ein wichtiger Inhibitor des GPVI-ITAM Signalwegs wirkt. Thrombozyten von Mäusen, welche eine trunkierte Form von CLP36 exprimieren, der die LIM-Domäne fehlt (Clp36ΔLIM), als auch von Mäusen, denen das komplette Protein fehlt (Clp36-/-), zeigten eine deutlich verstärkte Aktivierung als Antwort auf GPVI-spezifische Agonisten. Andere Signalwege aber waren nicht beeinflusst. Diese Veränderungen resultierten in einer schnelleren Thrombusbildung und erhöhten prokoagulatorischen Aktivität von Clp36ΔLIM Thrombozyten, welche sich letztendlich als prothrombotischer Phänotyp in vivo bemerkbar machten. Diese Ergebnisse deckten eine unerwartete inhibitorische Funktion von CLP36 im GPVI-ITAM Signalweg auf und etablierten CLP36 als einen wichtigen Regulator der arteriellen Thrombose. KW - Thrombozytenaggregation KW - Platelet activating Factor KW - thrombosis KW - TRPC6 KW - Calciumtransport KW - Domänenprotein Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72262 ER - TY - THES A1 - Kaufmann, Tobias T1 - Brain-computer interfaces based on event-related potentials: toward fast, reliable and easy-to-use communication systems for people with neurodegenerative disease T1 - Gehirn-Computer Schnittstellen basierend auf ereigniskorrelierten Potentialen: Entwicklung von schnellen, zuverlässigen und leicht zu bedienenden Kommunikationssystemen für Menschen mit neurodegenerativer Erkrankung N2 - Objective: Brain Computer Interfaces (BCI) provide a muscle independent interaction channel making them particularly valuable for individuals with severe motor impairment. Thus, different BCI systems and applications have been proposed as assistive technology (AT) solutions for such patients. The most prominent system for communication utilizes event-related potentials (ERP) obtained from the electroencephalogram (EEG) to allow for communication on a character-by-character basis. Yet in their current state of technology, daily life use cases of such systems are rare. In addition to the high EEG preparation effort, one of the main reasons is the low information throughput compared to other existing AT solutions. Furthermore, when testing BCI systems in patients, a performance drop is usually observed compared to healthy users. Patients often display a low signal-to-noise ratio of the recorded EEG and detection of brain responses may be aggravated due to internally (e.g. spasm) or externally induced artifacts (e.g. from ventilation devices). Consequently, practical BCI systems need to cope with mani-fold inter-individual differences. Whilst these high demands lead to increasing complexity of the technology, daily life use of BCI systems requires straightforward setup including an easy-to-use graphical user interface that nonprofessionals can handle without expert support. Research questions of this thesis: This dissertation project aimed at bringing forward BCI technology toward a possible integration into end-users' daily life. Four basic research questions were addressed: (1) Can we identify performance predictors so that we can provide users with individual BCI solutions without the need of multiple, demanding testing sessions? (2) Can we provide complex BCI technology in an automated, user-friendly and easy-to-use manner, so that BCIs can be used without expert support at end-users' homes? (3) How can we account for and improve the low information transfer rates as compared to other existing assistive technology solutions? (4) How can we prevent the performance drop often seen when bringing BCI technology that was tested in healthy users to those with severe motor impairment? Results and discussion: (1) Heart rate variability (HRV) as an index of inhibitory control (i.e. the ability to allocate attention resources and inhibit distracting stimuli) was significantly related to ERP-BCI performance and accounted for almost 26% of variance. HRV is easy to assess from short heartbeat recordings and may thus serve as a performance predictor for ERP-BCIs. Due to missing software solutions for appropriate processing of artifacts in heartbeat data (electrocardiogram and inter-beat interval data), our own tool was developed that is available free of charge. To date, more than 100 researchers worldwide have requested the tool. Recently, a new version was developed and released together with a website (www.artiifact.de). (2) Furthermore, a study of this thesis demonstrated that BCI technology can be incorporated into easy-to-use software, including auto-calibration and predictive text entry. Naïve, healthy nonprofessionals were able to control the software without expert support and successfully spelled words using the auto-calibrated BCI. They reported that software handling was straightforward and that they would be able to explain the system to others. However, future research is required to study transfer of the results to patient samples. (3) The commonly used ERP-BCI paradigm was significantly improved. Instead of simply highlighting visually displayed characters as is usually done, pictures of famous faces were used as stimulus material. As a result, specific brain potentials involved in face recognition and face processing were elicited. The event-related EEG thus displayed an increased signal-to-noise ratio, which facilitated the detection of ERPs extremely well. Consequently, BCI performance was significantly increased. (4) The good results of this new face-flashing paradigm achieved with healthy participants transferred well to users with neurodegenerative disease. Using a face paradigm boosted information throughput. Importantly, two users who were highly inefficient with the commonly used paradigm displayed high accuracy when exposed to the face paradigm. The increased signal-to-noise ratio of the recorded EEG thus helped them to overcome their BCI inefficiency. Significance: The presented work at hand (1) successfully identified a physiological predictor of ERP-BCI performance, (2) proved the technology ready to be operated by naïve nonprofessionals without expert support, (3) significantly improved the commonly used spelling paradigm and (4) thereby displayed a way to effectively prevent BCI inefficiency in patients with neurodegenerative disease. Additionally, missing software solutions for appropriate handling of artifacts in heartbeat data encouraged development of our own software tool that is available to the research community free of charge. In sum, this thesis significantly improved current BCI technology and enhanced our understanding of physiological correlates of BCI performance. N2 - Zielsetzung: Gehirn-Computer Schnittstellen (engl. Brain-Computer Interface, BCI) bilden einen muskel-unabhängigen Interaktionskanal, was sie besonders für Menschen mit starken, motorischen Einschränkungen wertvoll macht. Daher wurden verschiedene BCI-Systeme und -Anwendungen als unterstützende Technologien (UT) für diese Patienten vorgeschlagen. Das am häufigsten verwendete System zu Kommunikationszwecken basiert auf ereigniskorrelierten Potentialen (EKP) des Elektroenzephalogramms (EEG) und ermöglicht es Buchstabe für Buchstabe zu kommunizieren. Zum derzeitigen Stand der Technik sind Berichte über alltägliche Verwendung von BCI-Systemen jedoch selten. Zusätzlich zu dem hohen Präparationsaufwand, der mit dem Messen eines EEGs verbunden ist, ist eine der Hauptursachen der verhältnismäßig geringe Informationstransfer im Vergleich zu anderen existierenden UT-Lösungen. Zudem wird häufig beobachtet, dass das BCI-Kontrollvermögen bei Patienten deutlich niedriger ist als bei gesunden Nutzern. Das EEG von Patienten weißt häufig ein niedrigeres Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf und die Erkennung von Hirnantworten kann durch interne (z. B. Spasmus) oder externe Artefakte (z. B. von einem Beatmungsgerät herrührend) zusätzlich erschwert werden. Somit müssen praxisrelevante BCI-Systeme mit einer Vielfalt von interindividuellen Unterschieden klar kommen. Obschon diese hohen Anforderungen zu einer zunehmend komplexeren Technologie führen, erfordert der Alltagsgebrauch von BCI-Systemen einen einfachen Aufbau inklusive leicht zu bedienender, grafischer Benutzeroberfläche, die von Laien, ohne Unterstützung von Experten, bedient werden kann. Forschungsfragestellungen dieser Dissertationsschrift: Das Dissertationsprojekt bezweckte die Weiterentwicklung von BCI-Systemen, um den Weg für eine Integration in das tägliche Leben von Benutzern zu bahnen. Vier grundlegende Forschungsfragestellungen wurden adressiert: (1) Können Prädiktoren des BCI-Kontrollvermögens gefunden werden, sodass Nutzer mit individuell angepassten BCI-Lösungen versorgt werden können, ohne dass mehrfache, anstrengende Testsitzungen notwendig sind? (2) Kann komplexe BCI-Technologie auf automatisierte, nutzerfreundliche und leicht zu bedienende Weise bereitgestellt werden, sodass BCIs, ohne die Unterstützung von Experten, zuhause verwendet werden können? (3) Wie kann man den im Vergleich zu anderen existierenden UT-Lösungen niedrigen Informationstransferraten begegnen und sie erhöhen? (4) Wie kann ein Abfall des Kontrollvermögens verhindert werden, der häufig in Erscheinung tritt, wenn man BCI-Technologie, die an Gesunden getestet wurde, zu Patienten mit starken motorischen Einschränkungen bringt? Ergebnisse und Diskussion: (1) Herzratenvariabilität als Index des inhibitorischen Kontrollvermögens (die Fähigkeit Aufmerksamkeitsressourcen bereitzustellen und ablenkende Reize zu inhibieren) wurde zu EKP-BCI-Kontrollvermögen in einen signifikanten Bezug gesetzt und klärte beinahe 26% der Varianz auf. HRV ist leicht aus kurzen Aufzeichnungen des Herzschlags zu erheben und könnte daher als Prädiktor des EKP-BCI-Kontrollvermögens dienen. Aufgrund fehlender Softwarelösungen für angemessene Artefaktbehandlung in Aufzeichnungen des Herzschlags (Elektrokardiogramm und Interbeat-Intervall Daten) wurde ein eigenes Programm entwickelt, das frei erhältlich ist. Bis heute wurde es von mehr als 100 Wissenschaftlern weltweit angefordert. Unlängst wurde zudem eine neue Version entwickelt, die zusammen mit einer Website veröffentlicht wurde (www.artiifact.de). (2) Des Weiteren zeigte eine Studie dieser Dissertation, dass BCI-Technologie samt Auto-Kalibration und Wortvervollständigung in eine leicht zu bedienende Software integriert werden kann. Ungeschulte, gesunde Probanden waren in der Lage die Software ohne Unterstützung von Experten zu bedienen und buchstabierten mit dem auto-kalibrierten BCI erfolgreich Wörter. Sie gaben an, dass die Bedienung der Software leicht zu tätigen sei und dass sie in der Lage wären, das System anderen zu erklären. Jedoch muss zukünftige Forschung klären, ob sich die Ergebnisse auf Patienten übertragen lassen. (3) Das häufig verwendete EKP-BCI-Paradigma wurde signifikant verbessert. Statt - wie normalerweise getätigt - visuell präsentierte Buchstaben einfach aufleuchten zu lassen, wurden Bilder berühmter Gesichter als Stimulationsmaterial verwendet. Hierdurch wurden spezifische Gehirnpotentiale der Gesichtserkennung und -verarbeitung ausgelöst. Das ereigniskorrelierte EEG wies daher ein höheres Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf, was die Detektion von EKPs stark vereinfachte. Infolgedessen war das BCI-Kontrollvermögen signifikant erhöht. (4) Die guten Ergebnisse dieses neuen Gesichter-Stimulus-Paradigmas, die mit gesunden Probanden erreicht wurden, ließen sich gut auf Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen übertragen. Die Verwendung eines Gesichter-Paradigmas erhöhte den Informationstransfer erheblich. Zwei Nutzer, die sehr ineffizient im Umgang mit dem herkömmlichen BCI-System waren, erreichten zudem ein hohes Kontrollvermögen mit dem Gesichter-Paradigma. Das erhöhte Signal-zu-Rausch-Verhältnis des aufgezeichneten EEGs half ihnen somit ihre BCI Ineffizienz zu überwinden. Signifikanz: Die hier vorgestellte Arbeit (1) identifizierte einen physiologischen Prädiktor des EKP-BCI-Kontrollvermögens, (2) zeigte, dass die Technologie bereit ist für die Verwendung durch ungeschulte Laien ohne Unterstützung von Experten, (3) verbesserte das herkömmliche Kommunikationsparadigma signifikant, und (4) zeigte hierdurch einen Weg auf, die BCI Ineffizienz von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen effektiv zu verhindern. Die fehlende Softwarelösung zur angemessenen Behandlung von Artefakten in Aufzeichnungen des Herzschlags animierte zudem zur Entwicklung einer eigenen Anwendung, die der Wissenschaftsgemeinschaft kostenfrei zur Verfügung gestellt wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass dieses Dissertationsprojekt somit derzeitige BCI-Technologie signifikant verbesserte und unser Verständnis physiologischer Korrelate des BCI-Kontrollvermögens erweiterte. KW - Gehirn-Computer-Schnittstelle KW - Herzfrequenzvariabilität KW - Nervendegeneration KW - BCI KW - HRV Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83441 ER - TY - THES A1 - Emami-Nemini, Alexander Darius T1 - Differential parathyroid hormone receptor signaling directed by adaptor proteins T1 - Steuerung differenzieller Signalgebung des Parathormon Rezeptors durch Adapterproteine N2 - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR) regulates numerous physiological and pathophysiological processes. Hence GPCRs are of significant interest for pharmacological therapy. Embedded into cytoplasmic membranes, GPCRs represent the core of large signaling complexes, which are critical for transduction of exogenous stimuli towards activation of downstream signaling pathways. As a member of the GPCR family B, the parathyroid hormone receptor (PTHR) activates adenylyl cyclases, phospholipases C β as well as mitogen-activated protein kinase-dependent signaling pathways, thereby mediating endocrine and paracrine effects of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), respectively. This regulates, calcium homeostasis, bone metabolism and bone development. Paradoxically, PTH is able to induce both catabolic and anabolic bone metabolism. The anabolic effect of PTH is successfully applied in the therapy of severe osteoporosis. Domination of anabolic or catabolic bone-metabolism is entailed by temporal and cell-type specific determinants. The molecular bases are presumably differential arrangements of adaptor proteins within large signaling complexes that may lead to differential activation of signaling pathways, thereby regulating physiological effects. The molecular mechanisms are largely unclear; thus, there is significant interest in revealing a better understanding of PTHR-related adaptor proteins. To identify novel adaptor proteins which direct PTHR signaling pathways, a proteomic screening approach was developed. In this screening, vav2, a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for small GTPases which regulates cytoskeleton reorganization, was found to interact with intracellular domains of PTHR. Evidence is provided that vav2 impairs PTH-mediated phospholipase C β (PLCβ) signaling pathways by competitive interactions with G protein αq subunits. Vice versa, PTH was shown to regulate phosphorylation and subsequent GEF activity of vav2. These findings may thus shed new light on the molecular mechanisms underlying the effects of PTH on bone metabolism by PLC-signaling, cell migration and cytoskeleton organization. In addition to the understanding of intracellular molecular signaling processes, screening for ligands is a fundamental and demanding prerequisite for modern drug development. To this end, ligand binding assays represent a fundamental technique. As a substitution for expensive and potentially harmful radioligand binding, fluorescence-based ligand-binding assays for PTHR were developed in this work. Based on time-resolved fluorescence, several assay variants were established to facilitate drug development for the PTHR. N2 - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) reguliert eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, was sie bedeutend für die Pharmakotherapie macht. Eingebettet in die Zytoplasmamembran sind GPCRs das Zentrum von Signalkomplexen, die eine Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen ermöglichen. Der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor (PTHR) aktiviert Adenylyl-Zyklasen-, Phospholipasen Cβ- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-abhängige Signalwege, wodurch endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-ähnlichen Peptides (PTHrP) vermittelt werden. Dies ermöglicht die Regulation der Calcium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Knochenentwicklung. Paradoxerweise kann PTH sowohl katabole als auch anabole Effekte auf den Knochenstoffwechsel induzieren. Den anabolen Effekt von PTH nutzt man erfolgreich in der Therapie der schweren Osteoporose. Ob ein anaboler oder kataboler Knochenmetabolismus überwiegt, wird durch zeitliche und Zelltyp-spezifische Faktoren bestimmt. Dem zugrunde liegt vermutlich unter anderem eine differenzielle Anordnung verschiedener Adapterproteine innerhalb der Signalkomplexe, die zur differenziellen Aktivierung von Signalwegen führen und so eine Steuerung bestimmter physiologischer Effekte ermöglichen. Die molekularen Mechanismen sind jedoch noch weitgehend unklar, weshalb großes Interesse besteht, ein besseres Verständnis über die PTHR-assoziierten Adapterproteine zu entwickeln. Zur Identifizierung neuer Adapterproteine, die PTHR-Signalwege beeinflussen, wurde in dieser Arbeit ein auf dem Proteom-basierender Screening-Ansatz entwickelt. Dieser führte zur Entdeckung einer Interaktion von intrazellulären Domänen des PTHR mit vav2, einem Guanin-Nukleotid Austauschfaktor (GEF) für kleine GTPasen, der die Zytoskelett-Reorganisation steuert. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass vav2 über kompetitive Interaktionen mit G Protein αq Untereinheiten PTH-vermittelte Phospholipase Cβ (PLCβ)-abhängige Signalwege beeinflusst. Umgekehrt wurde gezeigt, dass PTH die Phosphorylierung und damit die GEF Aktivität von vav2 reguliert. Diese Befunde können Aufschluss über molekulare Mechanismen geben, die den Wirkungen von PTH auf den Knochenstoffwechsel durch PLC-Signalwege, Zellmigration und Zytoskelett-Reorganisation zugrunde liegen. Neben dem Verständnis über molekulare Prozesse der intrazellulären Signalgebung ist die Suche nach Liganden eine herausfordernde Grundvoraussetzung für die aktuelle Arzneistoffentwicklung. Liganden-Bindungs-Experimente stellen dafür elementare Techniken dar. Zur Substitution kostenintensiver und potentiell gesundheitsschädlicher Radioliganden-Bindungen, wurden in dieser Arbeit Fluoreszenz-basierte Liganden-Bindungs-Experimente für den PTHR entwickelt. Basierend auf Zeit-aufgelöster Fluoreszenz wurden mehrere Varianten dieser Experimente etabliert, um die Arzneistoffentwicklung am PTHR zu unterstützen. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Parathormon KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Parathormon KW - vav2 KW - Guanin Nukleotid Austauschfaktor KW - G protein coupled receptor KW - parathyroid hormone KW - vav2 KW - guanine nucleotide exchange factor KW - Guaninnucleotid-Austauschfaktoren Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72369 ER - TY - THES A1 - Araragi, Naozumi T1 - Electrophysiological investigation of two animal models for emotional disorders - serotonin transporter knockout mice and tryptophan hydroxylase 2 knockout mice T1 - Elektrophysiologische Untersuchung bei zwei Tiermodellen für emotionale Störungen - Serotonin Transporter knockout Mäuse und Tryptophan Hydroxylase 2 knockout Mäuse N2 - Serotonin (5-HT) has been implicated in the regulation of emotions as well as in its pathological states, such as anxiety disorders and depression. Mice with targeted deletion of genes encoding various mediators of central serotonergic neurotransmission therefore provides a powerful tool in understanding contributions of such mediators to homeostatic mechanisms as well as to the development of human emotional disorders. Within this thesis a battery of electrophysiological recordings were conducted in the dorsal raphe nucleus (DRN) and the hippocampus of two murine knockout lines with deficient serotonergic systems. Serotonin transporter knockout mice (5-Htt KO), which lack protein responsible for reuptake of 5-HT from the extracellular space and tryptophan hydroxylase 2 knockout (Tph2 KO) mice, which lack the gene encoding the neuronal 5-HT-synthesising enzyme. First, 5-HT1A receptor-mediated autoinhibition of serotonergic neuron firing in the DRN was assessed using the loose-seal cell-attached configuration. Stimulation of 5-HT1A receptors by a selective agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), showed a mild sensitisation and a marked desensitisation of these receptors in Tph2 KO and 5-Htt KO mice, respectively. While application of tryptophan, a precursor of 5-HT and a substrate of Tph2, did not cause autoinhibition in Tph2 KO mice due to the lack of endogenously produced 5-HT, data from 5-Htt KO mice as well as heterozygous mice of both KO mice lines demonstrated the presence of autoinhibitory mechanisms as normal as seen in wildtype (WT) controls. When the Tph2-dependent step in the 5-HT synthesis pathway was bypassed by application of 5-hydroxytryptophan (5-HTP), serotonergic neurons of both Tph2 KO and 5-Htt KO mice showed decrease in firing rates at lower concentrations of 5-HTP than in WT controls. Elevated responsiveness of serotonergic neurons from Tph2 KO mice correspond to mild sensitisation of 5-HT1A receptors, while responses from 5-Htt KO mice suggest that excess levels of extracellular 5-HT, created by the lack of 5-Htt, stimulates 5-HT1A receptors strong enough to overcome desensitisation of these receptors. Second, the whole-cell patch clamp recording data from serotonergic neurons in the DRN showed no differences in basic electrophysiological properties between Tph2 KO and WT mice, except lower membrane resistances of neurons from KO mice. Moreover, the whole-cell patch clamp recording from CA1 pyramidal neurons in the hippocampus of 5-Htt KO mice showed increased conductance both at a steady state and at action potential generation. Lastly, magnitude of long-term potentiation (LTP) induced by the Schaffer collateral/commissural pathway stimulation in the ventral hippocampus showed no differences among Tph2 KO, 5-Htt KO, and WT counterparts. Taken together, lack and excess of extracellular 5-HT caused sensitisation and desensitisation of autoinhibitory 5-HT1A receptors, respectively. However, this may not directly translate to the level of autoinhibitory regulation of serotonergic neuron firing when these receptors are stimulated by endogenously synthesised 5-HT. In general, KO mice studied here showed an astonishing level of resilience to genetic manipulations of the central serotonergic system, maintaining overall electrophysiological properties and normal LTP inducibility. This may further suggest existence of as-yet-unknown compensatory mechanisms buffering potential alterations induced by genetic manipulations. N2 - Serotonin (5-HT) ist an der Regulation von der Emotionen, sowie ihrer pathologischen Zustände, wie Angststörungen und Depressionen beteiligt. Mäuse denen, mittels einer zielgerichteteten Deletion von Genen, die verschiedenste Proteine involviert in der zentralen serotonergen Nerotransmission fehlen, dienen daher als ein nützliches Tiermodell, um die Rolle dieser Mediatoren bei Homöostasemechanismen und der Entwicklung emotionaler Störungen beim Menschen zu verstehen. Im Rahmen dieser Thesis wurde eine Batterie von elektrophysiologischen Ableitungen im Hippocampus sowie in der dorsalen Raphe Nucleus (DRN) zweier Knockout-Mauslinien mit einem defizienten serotonergen Systems durchgeführt. Serotonintransporter Knockout-Mäuse (5-Htt KO), denen das Protein zur Wiederaufnahme von 5-HT aus dem extrazellulären Raum fehlt und Tryptophanhydroxylase 2 Knockout-Mäuse (Tph2 KO), denen das Gen für das 5-HT-synthetisierende Enzym im Gehirn fehlt. Zunächst wurde mittels der “loose-seal cell-attached” Aufnahmemethode die Eigenhemmung der serotonergen Neuronen untersucht, die durch 5-HT1A Rezeptoren in der DRN vermittelt wird. Stimulierung der 5-HT1A Rezeptoren durch einen selektiven Agonist, R-8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin (R-8-OH-DPAT), zeigte eine milde Sensibilisierung und eine deutliche Desensibilisierung dieser Rezeptoren in Tph2 KO bzw. in 5-Htt KO Mäusen. Während die Anwendung von Tryptophan, eine Vorstufe von 5-HT und ein Substrat der Tph2, keine Eigenhemmung, aufgrund des Mangels an endogen produziertem 5-HT, in Tph2 KO Mäusen verursachte, wiesen Daten von 5-Htt KO Mäusen sowie von heterozygoten Mäusen beider KO Mauslinien die Existenz der Eigenhemmungsmechanismen wie in den Wildtypen (WT) nach. Wurde der Tph2-abhängige Schritt im 5-HT Syntheseweg durch Anwendung von 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) umgangen, zeigten sowohl Tph2 KO als auch 5-Htt KO Mäuse eine Verminderung der serotonergen neuronalen Feuerungsrate bei niedrigeren Konzentrationen von 5-HTP im Vergleich zu den WT. Die erhöhte Reaktionsfähigkeit der serotonergen Neuronen von Tph2 KO Mäusen entsprechen der milden Sensibilisierung der 5-HT1A Rezeptoren. Stattdessen deuten die Reaktionen der serotonergen Neuronen von 5-Htt KO Mäusen darauf hin, dass das überschüssige Niveau von extrazellularem 5-HT, welches durch den Mangel an 5-Htt verursacht wird, 5-HT1A Rezeptoren stark genug stimuliert, um eine Desensibilisierung dieser Rezeptoren zu überwinden. Zweitens zeigten die Daten der whole-cell Patch Clamp Ableitung von serotonergen Neuronen im DRN keine Unterschiede in grundlegenden elektrophysiologischen Eigenschaften zwischen Tph2 KO und WT, außer niedrigen Membranwiderständen in KO Mäusen. Darüber hinaus zeigte die whole-cell Patch Clamp Ableitungen von CA1 Pyramidenzellen im Hippocampus der 5-Htt KO Mäuse eine erhöhte Leitfähigkeit sowohl bei Ruheständen als auch bei Aktionspotentialerzeugungen. Schließlich zeigte die Stärke der Langzeitpotenzierung (long-term potentiation: LTP) durch die Stimulation der Schaffer-Kollateralen/kommissuralen Fasern im ventralen Hippocampus keine Unterschiede zwischen Tph2 KO, 5-Htt KO, und jeweiligen WT. Zusammengefasst verursachten der Mangel und der Überschuss von extrazellularen 5-HT eine Sensibilisierung bzw. Desensibilisierung der autoinhibitorischen 5-HT1A Rezeptoren. Dies kann jedoch nicht direkt in die Regulierung von serotonergen Neuronen Feuerung umgesetzt werden, wenn die 5-HT1A Rezeptoren durch endogen synthetisiertes 5-HT stimuliert werden. Im Allgemeinen zeigten die hier untersuchten KO Mäuse, ein erstaunliches Maß an Widerstandskraft, die die allgemeinen elektrophysiologischen Eigenschaften und die normale LTP Induzierbarkeit trotz genetischer Manipulationen des zentralen serotonergen Systems aufrechterhielt. Weiterhin deutet dies auf die Existenz noch unbekannter Kompensationsmechanismen hin, die diese potentiellen Veränderungen abzudämpfen scheinen. KW - Serotonin KW - Elektrophysiologie KW - Tryptophan hydroxylase 2 KW - Knockout KW - Serotonin transporter KW - Depression KW - Anxiety KW - Knockout KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83265 ER - TY - THES A1 - Dunkel, Nico T1 - Regulation of virulence-associated traits of the human fungal pathogen Candida albicans by nitrogen availability T1 - Regulation Virulenz-assoziierter Faktoren im humanpathogenen Pilz Candida albicans durch Stickstoffverfügbarkeit N2 - Nitrogen-regulated pathogenesis describes the expression of virulence attributes as direct response to the quantity and quality of an available nitrogen source. As consequence of nitrogen availability, the opportunistic human fungal pathogen Candida albicans changes its morphology and secretes aspartic proteases [SAPs], both well characterized virulence attributes. C. albicans, contrarily to its normally non-pathogenic relative Saccharomyces cerevisiae, is able to utilize proteins, which are considered as abundant and important nitrogen source within the human host. To assimilate complex proteinaceous matter, extracellular proteolysis is followed by uptake of the degradation products through dedicated peptide transporters (di-/tripeptide transporters [PTRs] and oligopeptide transporters [OPTs]). The expression of both traits is transcriptionally controlled by Stp1 - the global regulator of protein utilization - in C. albicans. The aim of the present study was to elucidate the regulation of virulence attributes of the pathogenic fungus C. albicans by nitrogen availability in more detail. Within a genome wide binding profile of Stp1, during growth with proteins, more than 600 Stp1 target genes were identified, thereby confirming its role in the usage of proteins, but also other nitrogenous compounds as nitrogen source. Moreover, the revealed targets suggest an involvement of Stp1 in the general adaption to nutrient availability as well as in the environmental stress response. With the focus on protein utilization and nitrogen-regulated pathogenesis, the regulation of the major secreted aspartic protease Sap2 - additionally one of the prime examples of allelic heterogeneity in C. albicans - was investigated in detail. Thereby, the heterogezygous SAP2 promoter helped to identify an unintended genomic alteration as the true cause of a growth defect of a C. albicans mutant. Additionally, the promoter region, which was responsible for the differential activation of the SAP2 alleles, was delimited. Furthermore, general Sap2 induction was demonstrated to be mediated by distinct cis-acting elements that are required for a high or a low activity of SAP2 expression. For the utilization of proteins as nitrogen source it is also crucial to take up the peptides that are produced by extracellular proteolysis. Therefore, the function and importance of specific peptide transporters was investigated in C. albicans mutants, unable to use peptides as nitrogen source (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ septuple null mutants). The overexpression of individual transporters in these mutants revealed differential substrate specificities and expanded the specificity of the OPTs to dipeptides, a completely new facet of these transporters. The peptide-uptake deficient mutants were further used to elucidate, whether indeed proteins and peptides are an important in vivo nitrogen source for C. albicans. It was found that during competitive colonization of the mouse intestine these mutants exhibited wild-type fitness, indicating that neither proteins nor peptides are primary nitrogen sources required to efficiently support growth of C. albicans in the mouse gut. Adequate availability of the preferred nitrogen source ammonium represses the utilization of proteins and other alternative nitrogen sources, but also the expression of virulence attributes, like Sap secretion and nitrogen-starvation induced filamentation. In order to discriminate, whether ammonium availability is externally sensed or determined inside the cell by C. albicans, the response to exterior ammonium concentrations of ammonium-uptake deficient mutants (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ null mutants) was investigated. This study showed that presence of an otherwise suppressing ammonium concentration did not inhibit Sap2 proteases secretion and arginine-induced filamentation in these mutants. Conclusively, ammonium availability is primarily determined inside the cell in order to control the expression of virulence traits. In sum, the present work contributes to the current understanding of how C. albicans regulates expression of virulence-associated traits in response to the presence of available nitrogen sources - especially proteins and peptides - in order to adapt its lifestyle within a human host. N2 - Stickstoffregulierte Pathogenität bezeichnet die Kontrolle von Virulenz-assoziierten Eigenschaften als direkte Folge der verfügbaren Quantität und Qualität einer Stickstoffquelle. Im Zusammenhang mit der Stickstoffverfügbarkeit verändert der opportunistisch krankheitserregende Pilz Candida albicans seine Morphologie und sekretiert Aspartat-Proteasen [SAPs], beides gut charakterisierte Virulenzattribute. Im Gegensatz zu seinem normalerweise apathogenen Verwandten Saccharomyces cerevisiae ist C. albicans in der Lage Proteine zu verwerten, welche als sehr häufige und wichtige Stickstoffquelle im menschlichen Wirt angesehen werden. Zur Nutzung von Proteinen sekretiert C. albicans Aspartat-Proteasen für den außerzellulären Verdau der Proteine und exprimiert Peptidtransporter (Di- /Tripeptidtransporter [PTRs] und Oligopeptidtransporter [OPTs]) um die Abbauprodukte aufzunehmen. Beide Eigenschaften werden transkriptionell von Stp1 - dem globalen Regulator zur Verwertung von Proteinen - kontrolliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation von Virulenzattributen im pathogenen Pilz C. albicans durch die Verfügbarkeit von Stickstoff genauer zu untersuchen. Innerhalb einer genomweiten Bindestudie von Stp1 wurden mehr als 600 Stp1-Zielgene während des Wachstums mit Proteinen identifiziert. Dadurch bestätigte sich die Funktion von Stp1 in der Proteinverwertung und wurde zudem auch auf die allgemeine Verwertung von Stickstoffquellen erweitert. Des Weiteren deuten die aufgedeckten Zielgene an, dass Stp1 womöglich in der Adaption an die generelle Nährstoffverfügbarkeit sowie in der Antwort auf Stresssignale beteiligt ist. Mit dem Fokus auf die Proteinverwertung und stickstoffregulierter Pathogenität wurde die Regulation der wichtigsten sekretierten Protease Sap2 - welche außerdem ein Paradebeispiel für allelische Heterogenität ist - im Detail untersucht. Dabei half der heterogene SAP2-Promoter bei der Identifizierung einer unbeabsichtigten genomischen Veränderung als wahren Grund eines Wachstumsdefektes einer C. albicans Mutante. Zusätzlich wurde der Promotorbereich eingegrenzt, welcher für die unterschiedliche Aktivierung der beiden SAP2 Allele verantwortlich ist. Weiterhin wurden verschiedene cis-aktive Elemente identifiziert, die entweder für eine hohe oder eine niedrige SAP2 Expression benötigt werden. Die Aufnahme von Peptiden, die durch den außerzellulären Verdau entstehen, ist für die Verwertung von Proteinen ebenso wichtig. Deshalb wurde die Funktion und Bedeutung der spezifischen Peptidtransporter anhand von C. albicans Mutanten untersucht, welche Peptide nicht aufnehmen können (opt1Δ/Δ opt2Δ/Δ opt3Δ/Δ opt4Δ/Δ opt5Δ/Δ ptr2Δ/Δ ptr22Δ/Δ Septuplemutanten). Die Überexpression von individuellen Transportern in diesen Septuplemutanten offenbarte unterschiedliche Substratspezifitäten und erweiterte die Spezifität für die OPTs auf Dipeptide, eine komplett neue Facette dieser Transporter. Des Weiteren ermöglichten die Septuplemutanten eine Aufklärung, ob Proteine und Peptide tatsächlich eine wichtige In Vivo Stickstoffquelle für C. albicans sind. Dieses Arbeit zeigte, dass während der kompetitiven Kolonisierung des Mäusedarms die Septuplemutanten wildtypische Fitness aufwiesen. Dies deutet daraufhin, dass weder Proteine noch Peptide eine wichtige Stickstoffquelle für ein effizientes Wachstum in diesem In Vivo Model sind. Die ausreichende Verfügbarkeit der bevorzugten Stickstoffquelle Ammonium unterdrückt die Verwertung von Proteinen und anderen alternativen Stickstoffquellen. Aber auch die Expression von Virulenzattributen, wie die Proteasesekretion und die stickstoffmangel-induzierte Filamentierung, wird durch Ammonium inhibiert. Um zu unterscheiden, ob C. albicans die Ammoniumverfügbarkeit außerzellulär oder in der Zelle bestimmt, wurde das Verhalten auf außerzelluläre Ammoniumkonzentrationen in Mutanten untersucht, welche Ammonium nicht aufnehmen können (mep1Δ/Δ mep2Δ/Δ Mutanten). Diese Arbeit zeigte, dass in diesen Mutanten eine ansonsten inhibierende Ammoniumkonzentration nicht in der Lage war, die Sekretion der Sap2-Protease oder die Arginin-induzierte Hyphenbildung zu unterdrücken. Folglich wird, um die Expression von Virulenzattributen zu regulieren, die Ammoniumverfügbarkeit vorrangig in der Zelle bestimmt. Zusammenfassend erweitert die vorliegende Arbeit das Verständnis zur Regulation der Expression von Virulenzattributen durch die Verfügbarkeit von Stickstoffquellen - insbesondere Proteine und Peptide - die eine Anpassung von C. albicans an ein Leben im menschlichen Wirt ermöglichen. KW - Candida albicans KW - Regulation KW - Stickstoff KW - Virulenz KW - Proteasen KW - Nitrogen KW - SAP2 KW - STP1 KW - peptide KW - transport KW - ammonium KW - protease KW - Proteine Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83076 ER - TY - THES A1 - Geissler, Julia Maria T1 - Neuropsychological Endophenotypes of Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder T1 - Neuropsychologische Endophänotypen des Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätssyndroms N2 - Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) endophenotypes as a link between phenotype and genotype were the focus of the present work. Candidate endophenotypes were investigated via neuropsychological tasks during the simultaneous recording of a 21-channel electroencephalogram. Since endophenotypes are assumed to more closely reflect genetic variation, the influence of ADHD-associated genes Catechol-O-methyl transferase (COMT), the dopamine transporter (DAT, SLC6A3) and Latrophilin-3 (LPHN3) was analysed. Response inhibition was assessed with a cued Continuous Performance Test, for working memory we used an n-back task, sensory gating was measured via the paired clicks paradigm and response time variability (RTV) was quantified by the standard deviation of reaction times. The sample comprised medicated (N=36) and unmedicated (N=42) ADHD patients and matched control children and adolescents (N=41). The electrophysiological correlate of response inhibition was the centroid location during response execution and inhibition, and the degree of anteriorization (NGA). Sensory gating reflects the attenuation of the P50 response to the second of two auditory stimuli presented in short succession. Working memory was examined during target and non-target trials, reflecting specific information processing stages: early sensory processing (P100 and N100), selection of material (P150), memory retrieval (N300), event categorization (P300) and updating of working memory content (P450). Performance was quantified in terms of omission errors reflecting inattention and false alarms reflecting impulsivity, as well as speed and variability of reactions. Unmedicated ADHD patients had more omission errors and more variable reaction times, pointing to difficulties with attention and state regulation. NGA did not prove an optimal endophenotype candidate, since it was not yet developed in approximately half of the examined children and adolescents. It was independent of diagnosis; however ADHD risk alleles for DAT conferred lower NGA as well as more variable reaction times across groups. DAT genotype interacted with diagnosis on the level of centroid location, however, it did not manifest in performance deficits. In the case of sensory gating, homozygosity for the DAT allele associated with ADHD (10R) conferred impairment. ADHD was only relevant in participants without genetic risk, where patients without medication struggled most with suppression. In the working memory task, DAT modulated the timing of material selection in interaction with cognitive load and diagnosis: under high load unmedicated patients showed delayed responses, while under low load risk carriers on medication had faster responses than controls. Early processing and event-categorization were stronger in unmedicated ADHD with risk genotype, but dampened without risk. An interesting trend emerged for LPHN3, where carrying all risk variants was associated with higher NGA in ADHD patients irrespective of medication. This warrants further study, as the haplotype also exerts a positive influence on sensory gating specifically in patients. At the same time within the genetic risk group, unmedicated patients had the weakest NGA. However, the LPHN3 risk haplotype effected more posterior Go centroids, putatively facilitating response execution, which is supported by a higher number of false alarms. When inhibition was required, the risk variants led to more posterior centroids in unmedicated compared to medicated patients as well as controls, speaking to differences in inhibition-related brain activation. While as expected the risk haplotype led to compromised gating in unmedicated ADHD, this was reversed in healthy controls where the haplotype was acting in a protective manner with enhanced filtering. During working memory operations, the risk haplotype showed stronger N300 responses suggesting investment of more resources. While COMT did not exert an influence on NGA directly, carriers of the risk allele (met) had more posterior centroids both during response execution and inhibition, and displayed more variable responses in addition to being more prone to false alarms. Unmedicated patients produced smaller P300 during successful execution of responses than controls in absence of the risk allele, while with risk they had shorter latencies and presumably tend towards premature reactions. Additionally, it brought out impairments in sensory gating, thus making unmedicated patients less able to filter out irrelevant information, while they were able to compensate with the protective genotype. The influence of COMT on sensory gating seems to be specific for ADHD, as this gene was of no consequence in healthy controls. In the working memory task, met was beneficial for updating as reflected by P450 amplitude. In ADHD irrespective of medication COMT did not change P450 strength, but for controls this effect was observed. N2 - Endophänotypen als Bindeglied zwischen Phänotyp und Genotyp des Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätssyndroms (ADHS) besitzen großes Potential als diagnostische Marker. Im Fokus der vorliegenden Arbeit standen Antworthemmung, Arbeitsgedächtnis, Reaktionszeitvariabilität (RTV) und sensorisches Gating als Kandidaten-Endophänotypen, sowie die Untersuchung des Einflusses genetischer Varianten in den ADHS-assoziierten Genen COMT, DAT und LPHN3. Die Stichprobe im Kindes- und Jugendalter bestehend aus medizierten (N=36) und unmedizierten (N=42) ADHS-Patienten sowie gesunden Kontrollen (N=41) wurde neuropsychologisch untersucht bei simultaner Ableitung eines 21-Kanal-EEGs. Die NoGo-Anteriorisierung (NGA) als elektrophysiologisches Korrelat der Antworthemmung basiert auf der Lage der Feldschwerpunkte (Zentroide) der P300 in Antwortausführungs- (Go) und Inhibitionstrials (NoGo). Sensorisches Gating beschreibt die Unterbindung der Reizweiterleitung bei schneller Reizfolge zur Prävention kortikaler Überstimulation, was sich in einer gedämpften P50-Amplitude zeigt. Um sowohl frühe als auch späte Aspekte des arbeitsgedächtnisbezogenen Informationsverarbeitungsprozesses zu erfassen, wurden ereigniskorrelierte Komponenten korrespondieren mit früher sensorischer Verarbeitung (P100 und N100), Materialselektion (P150), Abruf von Gedächtnisinhalten (N300), Ereigniskategorisierung (P300) und Aktualisierung der Arbeitsgedächtnisinhalten (P450) analysiert. Auslassungsfehler dienten als Indikator für Aufmerksamkeitdefizite, Falschalarme als Indikator für Impulsivität. Unmedizierte ADHD-Patienten zeigten neben variableren Reaktionszeiten mehr Auslassungsfehler, was Hinweise auf Defizite in Aufmerksamkeit und Zustandsregulation gibt. Die NGA erwies sich als beschränkt geeigneter Endophänotyp, da viele Probanden im eingeschlossenen Altersspektrum keine NGA aufwiesen. Die NGA war bei Trägern der DAT-Risikovariante (10R) schwächer ausgeprägt. Nur in Anwesenheit eines protektiven 9R-Allels korrespondierte Stimulanzienmedikation mit einer Anteriorisierung beider Zentroide. Während homozygote 10R-Träger Beeinträchtigungen im sensorischen Gating zeigten, kam ohne genetisches Risiko die Diagnose zum Tragen, da hier die Gruppe mit unmedizierten ADHS die größten Defizite aufwies. Während der Arbeitsgedächtnisaufgabe modulierte DAT die Materialauswahl in Interaktion mit kognitivem Load: unter hohem Load zeigten Patienten ohne Medikation genotypunabhängig verzögerte Reaktionen, während bei niedrigem Load medizierte Patienten mit Risikogenotyp die kürzesten Latenzen aufwiesen. Während bei unmediziertem ADHD der DAT-Risikogenotyp mit höheren P150-Amplituden und somit verstärkter Ressourcenallokation zur Materialselektion korrespondierte, zeigte diese Gruppe bei Vorhandensein eines 9R-Allels gedämpfte P100-Amplituden im Vergleich zu medizierten Patienten und Kontrollen, was auf abnorme frühe sensorischen Verarbeitung hinweist. Zuletzt bedeutete der DAT-Risikogenotyp für unmediziertes ADHS höhere P300-Amplituden, während diese Gruppe mit dem protektiven Genotyp die schwächsten P300-Reaktionen (Ereigniskategorisierung) zeigten. Ein interessanter Trend zeigte sich für den LPHN3-Risikohaplotyp, der bei ADHS medikationsunabhängig mit besserer NGA assoziiert war. Auf Zentroidebene zeigten Risikohaplotypträger mehr posterior gelegene Go-Zentroide, was die Reaktionsausführung begünstigt und sich in einer höheren Anzahl an Falschalarmen niederschlägt. Bei erforderlicher Inhibition ging der Risikohaplotyp bei unmedizierten Patienten mit mehr posterioren Zentroiden als in den Vergleichsgruppen einher, was für Unterschiede in inhibitionsspezifischer Gehirnaktivität spricht. In Bezug auf sensorisches Gating erzeugte der LPHN3-Haplotyp gegenläufige Effekte in Patienten und Kontrollen. Während der Risikohaplotyp in der unmedizierten ADHS-Gruppe erwartungsgemäß mit schwächerem Gating assoziiert war, wirkte er in Kontrollen und medizierten Patienten protektiv in Form überlegener Filterfähigkeiten. Der Risikohaplotyp zeigte bei Arbeitsgedächtnisaufgaben höhere N300-Amplituden als Indiz für Ressourceninvestition beim Abruf von Gedächtnisinhalten. Während sich die NGA als unabhängig vom COMT-Genotyp erwies, lagen die Zentroide bei Probanden mit Met-Allel weiter posterior, sie zeigten darüber hinaus eine variablere Leistung mit mehr Falschalarmen. Generell bedeutete die mit ADHS assoziierte COMT-Variante eine erhöhte RTV sowie schlechtere Gatingleistung in unmediziertem ADHD, während sie durch das protektive Val-Allele in die Lage versetzte, dieses Defizit ohne Medikation zu kompensieren. Dieser Einfluss von COMT auf sensorisches Gating war spezifisch für ADHS. In Aufgaben, welche das Arbeitsgedächtnis beanspruchen, war die Met-Variante von Vorteil für Aktualisierungsvorgänge (P450), was im Gegensatz zu den Gating-Effekten nur in Kontrollen auftrat. KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom KW - Elektroencephalographie KW - Arbeitsgedächtnis KW - Endophänotyp KW - Antworthemmung KW - Latrophilin-3 KW - Dopamintransporter KW - Catechol-O-Methyltransferase KW - ADHD KW - Endophenotype KW - Latrophilin-3 KW - Response Inhibition KW - Sensory Gating Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79221 ER - TY - THES A1 - Niemann, Sylvia T1 - Seed Coat Permeability of Active Ingredients T1 - Permeabilität von Samenschalen für Aktivsubstanzen N2 - The seed coat is the barrier controlling exchange of solutes between the plant embryo and its environment. This exchange is of importance for example in the uptake of germination inhibitors or in the uptake of agrochemicals applied as seed treatment. A thorough understanding of the basic mechanisms underlying solute permeation across the seed coat would help to improve the effectiveness of seed treatment formulations. In seed treatment formulations, additives can be used to enhance or decrease mobility or uptake of the active ingredient (AI). In the present study the seed coat barrier properties and the seed coat permeation process was examined with the model species Pisum sativum and with a set of model solutes. The lipophilic fraction of the seed coat was analysed by gas chromatography and mass spectrometry and it was found that the total lipophilic compartment of the seed coat represents 0.61 % of the weight of a swollen seed coat. The seed is covered by a lipophilic cuticle. The seed coat coverage with cuticular waxes is ten to 18-fold lower than wax coverage of pea leaves, though. In order to examine sorption of solutes in the small lipophilic compartment of the seed coat, seed coat/water partition coefficients were determined. These cover a much smaller range than the corresponding n-octanol/water partition coefficients. The lipophilic sorption compartment as calculated from the seed coat/water partition coefficient data is smaller than the analysed total lipophilic compartment of the seed coat since not all of the lipid components can act as sorption compartment. During seed swelling, the pea seed nearly doubles its weight. The uptake of water is driven by the very low water potential of the dry seed and controlled by the seed coat hydraulic conductivity both of which increase during seed swelling. Depending on the available form of water, water uptake can take place by diffusion from air humidity or by mass flow from liquid water. Water uptake by a seed in moist sand takes place by a combination of both uptake mechanisms. The basic transport mechanism underlying solute permeation of seed coats was analysed by steady-state experiments with a newly devised experimental setup. The permeance P for permeation of the set of model compounds across isolated seed coat halves ranged from 3.34 x 10-8 m s-1 for abamectin to 18.9 x 10-8 m s-1 for caffeine. It was found that solute permeation across the seed coat takes aqueous pathways. This was concluded from the facts that molar volume instead of lipophilicity of the solutes determine permeation and that the temperature effect on permeation is very small. This is in contrast to typical leaf and fruit cuticular uptake where lipophilic pathways dominate. Solute uptake across the seed coat can take place by two different mechanisms both of which take aqueous pathways. Uptake can be by diffusion and in the presence of a bulk flow of water driven by a water potential difference also by solvent drag. The presence of the solvent drag uptake mechanism shows that the aqueous pathways form an aqueous continuum across the seed coat. These findings indicate that the seed coat covering cuticle does not form a continuous barrier enclosing the seed. In order to examine solute uptake across the seed coat under conditions close to a situation taking place in the field, the process of uptake of a seed treatment AI in the field was simulated. In the situation of a treated seed in the field, the seed treatment residue dissolves and then the AI can move either into the surrounding soil or across the seed coat into the seed. Uptake across the seed coat can take place either by diffusion or during seed swelling by the solvent drag mechanism. Since the seed treatment residue depletes over time, non-steady-state uptake takes place. To simulate these processes, laboratory scale seed treatment methods were established to produce treated seeds and isolated treated seed coat halves. Experimental setups for non-steady-state uptake experiments were established with whole treated seeds and with isolated treated seed coat halves as simplified screening tool. By modelling of the AI uptake as a first-order process the rate constant k and the final relative uptake amount Mt→∞ M0-1 were obtained. With k and Mt→∞ M0-1 a quantification and comparison of the uptake curves was possible. Both in the experiments with whole treated seeds and with isolated treated seed coats, uptake of metalaxyl-M was much faster than uptake of sedaxane. In the uptake of a seed treatment AI, not only the solute's molar volume but also its water solubility determine uptake. The solute's water solubility is important for dissolution of the AI from the seed treatment residue and thus determines availability of the AI for uptake. Water solubility also controls the possible concentration in solution and thus the driving force for diffusive uptake. Furthermore, the AI amount taken up by solvent drag is determined by concentration in the inflowing water and thus by water solubility. In the experiments with whole treated seeds the additive effects on uptake were smaller than in the experiments with isolated treated seed coats or not significant. Adigor functions as an emulsifier and can lead to a slight increase of AI mobilisation from the seed treatment residue. NeoCryl A-2099 can cause a slowed down release of the AI from the seed treatment residue. The effects of both additives were smaller than the effect caused by different AI physico-chemical properties. Therefore, the most important factor determining uptake of a seed treatment AI are the AI's physico-chemical properties, especially its water solubility. N2 - Die Samenschale fungiert als Barriere, welche den Stoffaustausch zwischen dem pflanzlichen Embryo und seiner Umgebung kontrolliert. Dieser Stoffaustausch ist beispielsweise bei der Aufnahme von keimungshemmenden Substanzen oder aufgebeizten Pestiziden von Bedeutung. Ein besseres Verständnis des zugrundeliegenden Mechanismus bei der Permeation über die Samenschale wäre hilfreich für die Optimierung von Beizmittelformulierungen. Bei der Formulierung von Beizprodukten kann die Mobilität oder Aufnahme der Wirkstoffe je nach Bedarf durch Zugabe von Additiven beschleunigt oder verlangsamt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Barriereeigenschaften der Samenschale und der Permeationsprozess über die Samenschale anhand der Modellpflanze Pisum sativum und mit einem Set von Modellsubstanzen untersucht. Die lipophile Fraktion der Samenschale wurde mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie analysiert. Hierdurch konnte ermittelt werden, dass das komplette lipophile Kompartiment der Samenschale 0.61 % des Gewichtes ausmacht. Die Samenschale wird, wie es auch bei Blättern der Fall ist, von einer lipophilen Kutikula bedeckt. Die Bedeckung mit kutikulären Wachsen ist bei Erbsensamen allerdings zehn- bis 18-fach geringer als bei Blättern von Erbsenpflanzen. Um die Sorption von Substanzen in dem kleinen lipophilen Kompartiment der Samenschale zu untersuchen, wurden Samenschale/Wasser Verteilungskoeffizienten bestimmt. Diese erfassen einen sehr viel kleineren Größenbereich als die entsprechenden n-Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizienten. Das lipophile Sorptionskompartiment, welches mittels der Samenschale/Wasser Verteilungskoeffizienten berechnet wurde, ist kleiner als das analysierte lipophile Kompartiment, da nicht alle analysierten lipophilen Samenschalenbestandteile als Sorptionskompartiment fungieren können. Bei der Quellung von Erbsensamen kommt es nahezu zu einer Verdoppelung des Gewichtes. Die Wasseraufnahme wird durch das sehr niedrige Wasserpotential des trockenen Samens angetrieben und über die hydraulische Leitfähigkeit der Samenschale kontrolliert, wobei beide während der Quellung ansteigen. Je nachdem in welcher Form das verfügbare Wasser vorliegt kann die Wasseraufnahme durch Diffusion aus Luftfeuchte oder über einen Massenfluss aus flüssigem Wasser erfolgen. Ein Same in feuchtem Sand nimmt Wasser mittels einer Kombination beider Mechanismen auf. Der zugrunde liegende Transportmechanismus in der Substanzpermeation über Samenschalen wurde mit einem neu entwickelten Versuchsaufbau in Steady-State Versuchen analysiert. Der Leitwert P für die Permeation der Modellsubstanzen lag hierbei zwischen 3.34 x 10-8 m s-1 für Abamectin und 18.9 x 10-8 m s-1 für Koffein. Die Substanzpermeation über die Samenschale verläuft über wässrige Permeationswege. Dies wurde daraus geschlossen, dass das molare Volumen anstelle der Substanzlipophilie den Leitwert bestimmt und dass der Temperatureffekt auf die Permeation klein ist. Dies ist im Gegensatz zur typischen Permeation über die Kutikeln von Blättern und Früchten, welche meist über lipophile Wege verläuft. Substanzaufnahme kann durch zwei verschiedene Mechanismen über die wässrigen Wege durch die Samenschale stattfinden. Aufnahme kann sowohl durch Diffusion stattfinden oder, in Gegenwart eines Volumenflusses von Wasser welcher durch eine Wasserpotentialdifferenz angetrieben wird, auch durch den solvent drag Mechanismus. Das Vorhandensein des solvent drag Aufnahmemechanismus beweist, dass die wässrigen Wege in der Samenschale ein wässriges Kontinuum durch die Samenschale bilden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kutikula, welche der Samenschale aufliegt, keine kontinuierliche Barriere um den Samen bildet. Um den Aufnahmeprozess von Substanzen unter anwendungsnahen Bedingungen zu untersuchen, wurde die Aufnahme eines aufgebeizten Pflanzenschutzmittelwirkstoffes im Feld in Versuchen simuliert. In der Situation eines gebeizten Samens im Feld löst sich der Beizrückstand an und der Wirkstoff kann sich entweder in Richtung umgebender Erde oder über die Samenschale in das Sameninnere bewegen. Die Aufnahme über die Samenschale kann mittels Diffusion oder durch den solvent drag Mechanismus erfolgen. Da der Beizmittelrückstand auf der Samenoberfläche mit der Zeit verarmt, liegt eine non-steady-state Aufnahmesituation vor. Um diese Prozesse zu simulieren, wurden Versuchsaufbaue für non-steady-state Versuche mit ganzen gebeizten Samen sowie als vereinfachtes Modell mit isolierten gebeizten Samenschalen etabliert. Indem die gemessene Wirkstoffaufnahme als Prozess erster Ordnung modelliert wurde, konnten die Geschwindigkeitskonstante k sowie die finale relative Aufnahmemenge Mt→∞ M0-1 berechnet werden. Mit k und Mt→∞ M0-1 konnten dann die Aufnahmekurven quantifiziert und verglichen werden. Sowohl in den Versuchen mit ganzen gebeizten Samen als auch in den Versuchen mit isolierten gebeizten Samenschalen war die Aufnahme von Metalaxyl-M um ein Vielfaches schneller als die Aufnahme von Sedaxane. Bei der Aufnahme von einem Beizmittelwirkstoff über die Samenschale spielt nicht nur das molare Volumen des Wirkstoffes eine Rolle, sondern auch seine Wasserlöslichkeit. In den Versuchen mit ganzen gebeizten Erbsen war der Effekt der Additive kleiner als in den Versuchen mit isolierten gebeizten Schalen oder nicht signifikant. In beiden Fällen war der Additiv-Effekt kleiner als der Effekt, der durch die Unterschiede in den Substanzeigenschaften hervorgerufen wurde. Daher sind die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Wirkstoffes, insbesondere seine Wasserlöslichkeit, die wichtigsten Faktoren welche die Aufnahme in den gebeizten Samen bestimmen. KW - Samenschale KW - Permeation KW - Saatgutbeizung KW - seed coat KW - permeation KW - seed treatment Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79585 ER - TY - THES A1 - Leikam, Claudia T1 - Oncogene-induced senescence in melanocytes T1 - Onkogen-induzierte Seneszenz in Melanozyten N2 - Melanoma is the most aggressive skin cancer with very limited treatment options. Upon appearance of metastases chemotherapeutics are used to either kill or slow down the growth of cancer cells by inducing apoptosis or senescence, respectively. With melanomas originating from melanocytes, it is vital to elucidate the mechanisms that distinguish senescence induction from proliferation and tumourigenicity. Xmrk (Xiphophorus melanoma receptor kinase), the fish orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR), causes highly aggressive melanoma in fish. Using an inducible variant, HERmrk, I showed that high receptor levels result in melanocyte senescence, whereas low and medium expression allows for cell proliferation and tumourigenicity. Mechanistically, HERmrk leads to increased reactive oxygen species (ROS) levels, which trigger a DNA damage response. Consequently, multinucleated, senescent cells develop by both endomitosis and fusion. Furthermore, oncogenic N‐RAS (N-‐RAS61K) induces a similar multinucleated phenotype in melanocytes. In addition, I found that both overexpression of C‐MYC and the knockdown of miz­‐1 (Myc­‐interacting zinc finger protein 1) diminished HERmrk‐induced senescence entry. C‐MYC prevent ROS induction, DNA damage and senescence, while acting synergistically with HERmrk in conveying tumourigenic features to melanocytes. Further analyses identified cystathionase (CTH) as a novel target gene of Myc and Miz-­1 crucial for senescence prevention. CTH encodes an enzyme involved in the synthesis of cysteine from methionine, thereby allowing for increased ROS detoxification. Even though senescence was thought to be irreversible and hence tumour protective, I demonstrated that prolonged expression of the melanoma oncogene N­‐RAS61K in pigment cells overcomes initial OIS by triggering the emergence of tumour‐initiating, mononucleated stem‐like cells from multinucleated senescent cells. This progeny is dedifferentiated, highly proliferative, anoikis­‐resistant and induces fast­‐growing, metastatic tumours upon transplantation into nude mice. Our data demonstrate that induction of OIS is not only a cellular failsafe mechanism, but also carries the potential to provide a source for highly aggressive, tumour­‐initiating cells. N2 - Das Melanom ist der aggressivste Hautkrebstyp mit aeußerst begrenzten Therapiemoeglichkeiten. Sobald Metastasen diagnostiziert werden, kommen Chemotherapeutika zum Einsatz, deren Aufgabe darin besteht, die Krebszellen durch Apotoseinduktion zu toeten oder ihre Verbreitung mittels Seneszenz zu verlangsamen. Da Melanome aus Melanozyten hervorgehen, ist es essentiell, die Mechanismen zu analysieren, die entscheiden, ob Zellen seneszent oder tumorigen werden. Xmrk, die Xiphophorus­‐Melanom‐Rezeptor­‐Kinase und Fischortholog des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR), verursacht aggressive Melanome in Fischen. Durch den Einsatz von HERmrk, einer induzierbaren Variante des Rezeptors, konnte ich zeigen, dass hohe Expressionslevel Seneszenz in Melanozyten zur Folge haben, wohingegen niedrige oder mittlere Rezeptorlevel mit erhöhter Zellproliferation und Tumorigenitaet der Zellen einhergehen. Mechanistisch gesehen, führt die Aktivierung von HERmrk zu gesteigerten Level an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die wiederum DNA‐Schäden verursachen und dadurch bestimmte Signalwege auslösen. Durch Endomitose und Fusion entstehen letztendlich multinukleaere, seneszente Zellen. Interessanterweise, führte die Expression von onkogenem N‐RAS (N‐RAS61K) in Melanozyten zu einem sehr ähnlichen Phaenotyp. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass sowohl die Überexpression von C-­MYC als auch der Knockdown von miz‐1 (Myc­‐interagierendes Zinkfingerprotein 1) der HERmrk-­induzierten Seneszenz entgegenwirkten. C‐MYC verhindert einerseits die Entstehung von ROS, die dadurch verursachten DNA‐Schaeden und damit die Seneszenz und wirkt andererseits synergistisch mit HERmrk, indem es den Melanozyten tumorigene Eigenschaften verleiht. In weiteren Analysen wurde Cystathionase (CTH) als neues Zielgen von Myc und Miz-­1 identifiziert, dem eine zentrale Rolle in der Seneszenzverhinderung zukommt. CTH kodiert fuer ein Enzym, das die Synthese von Cystein aus Methionin und damit die Entsorgung von ROS ermöglicht. Obwohl man davon ausgeht, dass Seneszenz einen irreversiblen Mechanismus darstellt, der die Tumorentstehung verhindert, konnte ich zeigen, dass die langfristige Expression des Melanomonkogens N‐RAS61K die initiale Seneszenzinduktion durchbricht. Dabei gehen mononukleaere, tumorigene, stammzellaehnliche Zellen aus seneszenten Zellen hervor. Diese Tochterzellen sind dedifferenziert, hochproliferativ, Anoikis­‐resistent und induzieren schnellwachsende, metastasierende Tumoren in Nacktmaeusen. Damit machen meine Daten deutlich, dass Seneszenz nicht nur als zellulaerer Schadensbegrenzungsmechanismus fungiert, sondern auch das Potential hat, aeußerst aggressive Tumorzellen zu generieren. KW - Melanom KW - Altern KW - Onkogen KW - Melanophor KW - Hautkrebs KW - Seneszenz KW - Xmrk KW - N-RAS KW - melanoma KW - senescence KW - OIS KW - skin cancer KW - oncogenes Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-79316 ER - TY - THES A1 - Gan, Qiang T1 - Investigation on Distinct Roles of Smad Proteins in Mediating Bone Morphogenetic Proteins Signals T1 - Untersuchung auf Unterschiedliche Rollen von Smad Proteinen in der Signalübertragung der Knochenmorphogenetischen Proteine N2 - Knochenmorphogenetische Proteine (engl. Bone morphogenetic Proteins, BMPs) sind eine Bestandteil von transforming growth factor-β (TGF-β)-Superfamilie und spielen wichtige Rollen in zahlreichen biologischen Ereignissen in der Entwicklung fast aller mehrzelligen Organismen. Fehlregulierte BMP-Signalweg ist die zugrunde liegenden Ursachen von zahlreichen erblichen und nicht erblichen Krankheiten wie Krebs. Die von BMP induziete breite Palette von biologischen Reaktionen konvergiert auf drei eng verwandten Smad Proteine. Sie vermitteln intrazelluläre Signale von BMP-Rezeptoren in den Zellkern. Die Spezifität des BMP-Signalwegs wurde intensiv auf der Ebene der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen erforscht, aber, wie die verschiedenen Smad Proteine die durch BMPs hervorgerufen differenziellen Signale beitragen, bleibt unklar. In dieser Arbeit haben wir die BMP / Smad Signalweg in verschiedenen Aspektenuntersucht. Auf der Suche nach einem geeigneten Fluoreszenz-Reporter im Zebrafisch, verglichen wir verschiedene photo-schaltbaren Proteine und fand EosFP der beste Kandidat für diesen Modellorganismus im Bezug auf seine schnelle Reifung und Fluoreszenz-Intensität. Wir haben durch molekulare Modifizierung geeignete Vektoren erstellt, die Tol2-Transposon basieren trangenesis im Zebrafisch zu ermöglichen. Damit wurden schließlich transgenzebrafisch-Linien erzeugt. Wir kombinierten Fluoreszenz-Protein-Tagging mit hochauflösender Mikroskopie und untersuchten die Dynamik der Smad-Proteine in Modellsystem Zebrafisch. Es wurde beobachteten, dass Smad5 Kern-Translokation erfährt, als BMP Signalgeber bei Zebrafisch Gastrulation. Wir erkundeten die Beteiligung der Smad Proteine während der Myogenese-zu-Osteogenese Umwandlung von C2C12 Zelllinie, die durch BMP4 induziert wurde. Mit siRNA versuchten wir die endogene Smad Proteine niederzuschlagen, wobei die Auswirkungen auf diesen gekoppelten noch unterschiedlichen Verfahren durch quantitative real-time PCR und Terminal-Marker Färbung ausgewertet. Wir spekulieren, dass verschiedene Smad-Komplex Stöchiometrie für unterschiedliche durch BMPs hervorgerufe zelluläre Signale verantwortlich sein könnte. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) belong to the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily and play important roles in numerous biological events in the development of almost all multi-cellular organisms. Dysregulated BMP signaling is the underlying causes of numerous heritable and non-heritable human diseases including cancer. The vast range of biological responses induced by BMPs converges on three closely related Smad proteins that convey intracellular signals from BMP receptors to the nucleus. The specificity of BMP signaling has been intensively investigated at the level of ligand-receptor interactions, but how the different Smad proteins contribute to differential signals elicited by BMPs remains unclear. In this work, we investigated the BMP/Smad signaling in different aspects. In search for an appropriate fluorescence reporter in zebrafish, we compared different photo-switchable proteins and found EosFP the best candidate this model system for its fast maturation and fluorescence intensity. We modified and created appropriate vectors enabling Tol2-transposon based trangenesis in zebrafish, with which transgenic zebrafish lines were generated. We combined fluorescence protein tagging with high resolution microscopy and investigate the dynamics of Smad proteins in model system zebrafish. We observed that Smad5 undergoes nucleo-translocation as BMP signal transmitter during zebrafish gastrulation. We explored the Smad involvement during myogenic-to-osteogenic conversion of C2C12 cell line induced by BMP4. We created transient loss-of-function of Smads by siRNA-mediated knockdowns and analyzed the effects on these coupled yet distinct procedures by quantitative real-time PCR and terminal marker staining. We found that different Smad-complex stoichiometry might be responsible for distinct cellular signals elicited by BMPs. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Zebrabärbling KW - Signaltransduktion KW - Bone morphogenetic proteins KW - Smad KW - Signaling KW - Zebrafish KW - Cell line KW - Differentiation KW - Differenzierung KW - Zelllinie KW - Zebrafisch Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71127 ER - TY - THES A1 - May, Frauke T1 - The role of the (hem)ITAM-coupled receptors C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and Glycoprotein (GP) VI for platelet function: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Die Rolle der (hem)ITAM-gekoppelten Rezeptoren C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) und Glykoprotein (GP) VI in der Thrombozytenfunktion: in vitro- und in vivo-Studien in Mäusen N2 - Die Thrombozytenaktivierung und –adhäsion sowie die nachfolgende Thrombusbildung ist ein essentieller Prozess in der primären Hämostase, der aber auch irreversible Gefäßverschlüsse und damit Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen kann. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass der C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) auf der Thrombozytenoberfläche exprimiert wird, jedoch wurde für diesen Rezeptor noch keine Funktion in den Prozessen der Hämostase und Thrombose gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von CLEC-2 in der Thrombozytenfunktion und Thrombusbildung im Mausmodel untersucht. In dem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit dem neu generierten monoklonalen Antikörper INU1, der gegen murines CLEC-2 gerichtet ist, zu dem vollständigen und hochspezifischen Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten führte, ein Prozess, der als „Immundepletion“ bezeichnet wird. Die CLEC-2-defizienten Thrombozyten waren nicht mehr durch den CLEC-2-spezifischen Agonisten Rhodozytin aktivierbar, während die Aktivierung durch alle anderen getesteten Agonisten nicht beeinträchtigt war. Dieser selektive Defekt führte unter Flussbedingungen ex vivo zu stark verminderter Aggregatbildung der Thrombozyten. Außerdem zeigten in vivo-Thrombosestudien, dass die gebildeten Thromben instabil waren und vermehrt embolisierten. Infolgedessen war die CLEC-2 Defizienz mit einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose verbunden. Außerdem ließ die in INU1-behandelten Mäusen beobachtete variable Verlängerung der Blutungszeit auf einen moderaten hämostatischen Defekt schließen. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass CLEC-2 in vitro und in vivo signifikant zur Thrombusstabilität beiträgt und eine essentielle Rolle in der Hämostase und arteriellen Thrombose spielt. Daher stellt CLEC-2 eine potentiell neue antithrombotische Zielstruktur dar, die in vivo inaktiviert werden kann. Diese in vivo-Herabregulierung von Thrombozytenoberflächenrezeptoren könnte einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige antithrombotische Therapien darstellen. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelte den Effekt einer Doppelimmundepletion der immunoreceptor tyrosine-based activation motiv (ITAM)- und hemITAM-gekoppelten Rezeptoren Glykoprotein (GP) VI und CLEC-2 auf Hämostase und Thrombose mittels einer Kombination der GPVI- beziehungsweise CLEC-2-spezifischen Antikörper JAQ1 und INU1. Eine Einzeldepletion von GPVI oder CLEC-2 in vivo beeinträchtigte nicht die Expression und Funktion des jeweils anderen Rezeptors. Eine gleichzeitige Behandlung mit beiden Antikörpern führte jedoch zu dem nachhaltigen Verlust der GPVI- und CLEC-2-vermittelten Signale in Thrombozyten, während andere Signalwege nicht betroffen waren. Im Gegensatz zu den Einzeldefizienzen, wiesen die GPVI/CLEC-2 doppeldefizienten Mäuse einen schwerwiegenden Blutungsphänotyp auf. Außerdem führte die Behandlung zu einer starken Beeinträchtigung der arteriellen Thrombusbildung, die die Effekte der Einzeldefizienzen weit übertraf. Von Bedeutung ist auch, dass gleiche Ergebnisse in Gp6-/- Mäusen gefunden wurden, die mittels INU1-Behandlung CLEC-2-depletiert wurden. Dies veranschaulicht, dass der Blutungsphänotyp nicht durch Sekundäreffekte der kombinierten Antikörperbehandlung hervorgerufen wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass GPVI und CLEC-2 sowohl unabhängig voneinander als auch gleichzeitig in vivo von der Thrombozytenoberfläche herabreguliert werden können und lassen unerwartete redundante Funktionen der beiden Rezeptoren in Hämostase und Thrombose erkennen. Da beide Rezeptoren, GPVI und CLEC-2, als neue antithrombotische Zielstrukturen diskutiert werden, könnten diese Ergebnisse wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von anti-GPVI oder anti-CLEC-2-basierenden Antithrombotika haben. N2 - Platelet activation and adhesion results in thrombus formation that is essential for normal hemostasis, but can also cause irreversible vessel occlusion leading to myocardial infarction or stroke. The C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) was recently identified to be expressed on the platelet surface, however, a role for this receptor in hemostasis and thrombosis had not been demonstrated. In the current study, the involvement of CLEC-2 in platelet function and thrombus formation was investigated using mice as a model system. In the first part of the thesis, it was found that treatment of mice with a newly generated monoclonal antibody against murine CLEC-2 (INU1) led to the complete and highly specific loss of the receptor in circulating platelets (a process termed “immunodepletion”). CLEC-2-deficient platelets were completely unresponsive to the CLEC-2-specific agonist rhodocytin, whereas activation induced by all other tested agonists was unaltered. This selective defect translated into severely decreased platelet aggregate formation under flow ex vivo; and in vivo thrombosis models revealed impaired stabilization of formed thrombi with enhanced embolization. Consequently, CLEC-2 deficiency profoundly protected mice from occlusive arterial thrombus formation. Furthermore, variable bleeding times in INU1-treated mice indicated a moderate hemostatic defect. This reveals for the first time that CLEC-2 significantly contributes to thrombus stability in vitro and in vivo and plays a crucial role in hemostasis and arterial thrombosis. Thus, CLEC-2 represents a potential novel anti-thrombotic target that can be functionally inactivated in vivo. This in vivo down-regulation of platelet surface receptors might be a promising approach for future anti-thrombotic therapy. The second part of the work investigated the effect of double-immunodepletion of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)- and hemITAM-coupled receptors, platelet glycoprotein (GP) VI and CLEC-2, on hemostasis and thrombosis using a combination of the GPVI- and CLEC-2-specific antibodies, JAQ1 and INU1, respectively. Isolated targeting of either GPVI or CLEC-2 in vivo did not affect expression or function of the respective other receptor. However, simultaneous treatment with both antibodies resulted in the sustained loss of GPVI and CLEC-2 signaling in platelets, while leaving other activation pathways intact. In contrast to single deficiency of either receptor, GPVI/CLEC-2 double-deficient mice displayed a dramatic hemostatic defect. Furthermore, this treatment resulted in profound impairment of arterial thrombus formation that far exceeded the effects seen in single-depleted animals. Importantly, similar results were obtained in Gp6-/- mice that were depleted of CLEC-2 by INU1-treatment, demonstrating that this severe bleeding phenotype was not caused by secondary effects of combined antibody treatment. These data suggest that GPVI and CLEC-2 can be independently or simultaneously down-regulated in platelets in vivo and reveal an unexpected functional redundancy of the two receptors in hemostasis and thrombosis. Since GPVI and CLEC-2 have intensively been discussed as potential anti-thrombotic targets, these results may have important implications for the development of novel, yet save anti-GPVI or anti-CLEC-2-based therapies. KW - Thrombozyt KW - Rezeptor KW - Thrombose KW - Biologie KW - Zelle KW - Biology KW - Cell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65383 ER - TY - THES A1 - Bäuerlein, Carina T1 - Identification of new predictive markers for an early diagnosis of an imminent acute Graft-versus-Host Disease T1 - Bestimmung neuer prädiktiver Marker zur Früherkennung einer drohenden akuten Graft-versus-Host Disease N2 - Acute graft-versus-host disease (aGvHD) is an immune syndrome associated with allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT) that is mediated by alloreactive donor T cells attacking the gastrointestinal tract, liver, and skin of the host. Early diagnosis remains problematic and to date mainly relies on clinical symptoms and histopathology. Previously, different groups demonstrated that in order to cause aGvHD, alloreactive T cells require the expression of appropriate homing receptors to efficiently migrate from their priming sites to their target tissues. Therefore, the development of a predictive test based on the homing receptor expression profile of peripheral blood T cells seems attractive to identify patients at risk before the onset of aGvHD. The aim of this study was to analyze migrating alloreactive donor T cell kinetics in the peripheral blood early after allo-HCT in a murine model across minor histocompatibility antigens (miHAg) followed by a precise characterization of the homing receptor expression profile of migrating donor lymphocytes in order to identify suitable predictive markers. Combining daily bioluminescence imaging (BLI) and flow cytometry (FC) allowed defining two weeks of massive alloreactive donor T cell migration before clinical aGvHD symptoms became apparent. Peripheral blood donor T lymphocytes highly up-regulated the homing markers α4β7 integrin, and P- and E-selectin-ligand at peak time points of cell migration. The combination with the activation markers CD25 and CD69 and low expression levels of L-selectin allowed alloreactive donor T cell definition. Based on this migration phase we postulated a potential diagnostic window to precisely identify alloreactive donor T cells upon their homing receptor expression profile. Consequently, targeted pre-emptive treatment with rapamycin starting at the earliest detection time point of alloreactive donor T cells in the peripheral blood (day+6) significantly prolonged survival of treated mice. Based on this data, we propose a potential diagnostic window for alloreactive cell detection based on their homing receptor expression profile for a timely and effective therapeutic intervention before the clinical manifestation of aGvHD. N2 - Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation ist oft die einzig mögliche Behandlungsmethode für maligne und nicht-maligne hämatologische Erkrankungen. Die Graft-versus-Host Disease stellt den größten, limitierenden Faktor dieser Therapie dar. Bei diesem Immunsyndrom greifen alloreaktive Spender-T-Zellen gezielt Organe des Empfängers an, insbesondere den Gastrointestinaltrakt, die Leber und die Haut. Die frühe Diagnose einer bevorstehenden, akuten GvHD gestaltet sich nach wie vor schwierig und basiert heutzutage hauptsächlich auf dem Auftreten klinischer Symptome und histopathologischen Befunden. Die Entwicklung eines prädiktiven Tests zur Früherkennung gefährdeter Patienten hat daher hohe Priorität. Verschiedene Gruppen zeigten kürzlich, dass Spender-T-Zellen spezifische Rezeptoren, sogenannte Homing-Rezeptoren, exprimieren müssen, um in die Zielorgane einwandern zu können. Deshalb scheint die Entwicklung eines auf dem spezifischen Homing-Rezeptor-Expressionsmuster der T-Zellen im peripheren Blut basierenden Tests vielversprechend, um gezielt Patienten zu identifizieren, die möglicherweise eine aGvHD entwickeln werden. Das Ziel dieser Arbeit war die genaue Analyse der Migrationskinetik alloreaktiver Spender-T-Zellen im peripheren Blut in einem klinisch relevanten Mausmodell mit Unterschieden in minor Histokompatibilitätsantigenen. Es folgte eine präzise Charakterisierung des Homing-Rezeptor-Expressionsprofils der migrierenden Spenderlymphozyten zu ausgewählten Zeitpunkten nach Transplantation, um mögliche, geeignete Rezeptoren für einen prädiktiven Test zu identifizieren. Die Kombination von täglicher in vivo Bildgebung der transplantierten Mäuse mit durchflusszytometrischen Analysen des peripheren Blutes ermöglichte es, eine zweiwöchige Phase massiver Spenderzellmigration vor dem Auftreten klinischer aGvHD Symptome zu definieren. Die detektierten Spenderlymphozyten zeigten eine stark erhöhte Expression des für die Migration in den Gastrointestinaltrakt wichtigen Moleküls α4β7 Integrin sowie der Liganden für P- und E-Selektin, die in das Haut-Homing involviert sind. Die Kombination dieser Marker mit der stark reduzierten Expression von L-Selektin, einem Marker für naive T-Zellen, sowie der signifikant höheren Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD69 im Vergleich zu syngen transplantierten Kontrolltieren ermöglichte die Definition von alloreaktiven Spender-T-Zellen. Eine gezielte, vorbeugende Behandlung mit Rapamycin, beginnend am Tag der Detektion erster alloreaktiver T-Zellen (Tag+6), erhöhte die Überlebensrate der behandelten Mäuse. Aufgrund dieser Daten schlagen wir ein potentielles, diagnostisches Fenster zur Anwendung prädiktiver Tests vor, um Patienten, mit erhöhtem aGvHD-Risiko rechtzeitig zu identifizieren und vorbeugend behandeln zu können. KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Graft-versus-host disease KW - Mausmodell KW - T-Zellhoming KW - Graft-versus-host disease KW - mouse model KW - T cell homing KW - Maus KW - Blutstammzelle Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78489 ER - TY - THES A1 - Riedel, Simone Stefanie T1 - Characterization of the fluorescence protein FP635 for in vivo imaging and establishment of a murine multiple myeloma model for non-invasive imaging of disease progression and response to therapy T1 - Charakterisierung des Fluoreszenzproteins FP635 für die in vivo Bildgebung und Etablierung eines Maus Modells für die nicht invasive Bildgebung des Krankheitsverlaufes und Ansprechen auf Therapien imMultiplen Myelom N2 - Optical in vivo imaging methods have advanced the fields of stem cell transplantation, graft-versus–host disease and graft-versus-tumor responses. Two well known optical methods, based on the transmission of light through the test animal are bioluminescence imaging (BLI) and fluorescence imaging (FLI). Both methods allow whole body in vivo imaging of the same animal over an extended time span where the cell distribution and proliferation can be visualized. BLI has the advantages of producing almost no unspecific background signals and no necessity for external excitation light. Hence, BLI is a highly sensitive and reliable detection method. Yet, the BLI reporter luciferase is not applicable with common microscopy techniques, therefore abolishing this method for cellular resolution imaging. FLI in turn, presents the appealing possibility to use one fluorescent reporter for whole body imaging as well as cellular resolution applying microscopy techniques. The absorption of light occurs mainly due to melanin and hemoglobin in wavelengths up to 650 nm. Therefore, the wavelength range beyond 650 nm may allow sensitive optical imaging even in deep tissues. For this reason, significant efforts are undertaken to isolate or develop genetically enhanced fluorescent proteins (FP) in this spectral range. “Katushka” also called FP635 has an emission close to this favorable spectrum and is reported as one of the brightest far-red FPs. Our experiments also clearly showed the superiority of BLI for whole body imaging over FLI. Based on these results we applied the superior BLI technique for the establishment of a pre-clinical multiple myeloma (MM) mouse model. MM is a B-cell disease, where malignant plasma cells clonally expand in the bone marrow (BM) of older people, causing significant morbidity and mortality. Chromosomal abnormalities, considered a hallmark of MM, are present in nearly all patients and may accumulate or change during disease progression. The diagnosis of MM is based on clinical symptoms, including the CRAB criteria: increased serum calcium levels, renal insufficiency, anemia, and bone lesions (osteolytic lesions or osteoporosis with compression fractures). Other clinical symptoms include hyperviscosity, amyloidosis, and recurrent bacterial infections. Additionally, patients commonly exhibit more than 30% clonal BM plasma cells and the presence of monoclonal protein is detected in serum and/or urine. With current standard therapies, MM remains incurable and patients diagnosed with MM between 2001 and 2007 had a 5-year relative survival rate of only 41%. Therefore, the development of new drugs or immune cell-based therapies is desirable and necessary. To this end we developed the MOPC-315 cell line based syngeneic MM mouse model. MOPC-315 cells were labeled with luciferase for in vivo detection by BLI. We validated the non-invasively obtained BLI data with histopathology, measurement of idiotype IgA serum levels and flow cytometry. All methods affirmed the reliability of the in vivo BLI data for this model. We found that this orthotopic MM model reflects several key features of the human disease. MOPC-315 cells homed efficiently to the BM compartment including subsequent proliferation. Additionally, cells disseminated to distant skeletal parts, leading to the typical multifocal MM growth. Osteolytic lesions and bone remodeling was also detected. We found evidence that the cell line had retained plasticity seen by dynamic receptor expression regulation in different compartments such as the BM and the spleen. N2 - Optische in vivo bildgebende Verfahren haben die Felder der Stammzelltransplantation, Graft-versus-Host Krankheit und Graft-versus-Tumor Reaktion vorangebracht. Zwei gut bekannte optische Methoden, die auf der transmission von Licht durch das Versuchtier basieren, sind die Biolumineszenz Bildgebung (BLI) und die Fluoreszenz Bildgebung (FLI). Beide Methoden erlauben die in vivo Ganzkörperbildgebung desselben Tieres über lange Zeit wärenddessen die Zellverteilung und Proliferation sichtbar gemacht werden kann. Vorteil der BLI ist, dass beinahe keine unspezifischen Hintergrundsignale erzeugt werden und keine Notwendigkeit für Anregungslicht besteht. Daher ist BLI eine hochsensitive und verlässliche Detektionsmethode. Jedoch erlaubt der BLI Reporter, die Luziferase, keine Anwendung mit gängigen Mikroskopieanwendungen und verhindert daher, dass diese Methode für die Bildgebung auf zellulärer Ebene genutzt werden kann. FLI wiederum bietet die attraktive Möglichkeit einen fluoreszenten Reporter sowohl für die Bildgebung des gesamten Körpers, als auch auf zellulärer Ebene durch die Anwendung von Mikroskopietechniken zu nutzen. Derzeit bestehen noch größere Einschränkungen bei der Arbeit mit fluoreszent markierten Zellen innerhalb eines Tieres. Die allgemeine Autofluoreszenz des umliegenden Gewebes führt zu hohen Hintergrundsignalen. Zusätzlich werden sowohl das Anregungslicht als auch die emittierte Fluoreszenz durch das umliegende Gewebe abgeschwächt. Die Absorption des Lichtes geschieht hauptsächlich durch Melanin und Hämoglobin in Wellenlängen bis zu 650 nm. Daher könnte der Wellenlängenbereich über 650 nm sensitive optische Bildgebung auch in tief liegendem Gewebe ermöglichen. Aus diesem Grund werden erhebliche Anstrenungen unternommen um Fluoreszenzproteine (FP) in diesem spektralen Bereich zu isolieren oder genetisch verbesserte zu entwickeln. „Katushka“ auch FP635 genannt hat eine Emission, die nahe an diesem günstigen Spektrum liegt und wurde als eines der hellsten dunkelroten FPs beschrieben. Wir untersuchten FP635 für die Anwendung als sensitiver Einzelreporter für die Detektion immunologischer Prozesse von der Ganzkörper- bis zur Einzelzellbildgebung. Unsere Experimente zeigten auch deutlich die Überlegenheit der BLI über die FLI für die Ganzkörperbildgebung. Basierend auf diesen Ergebnissen setzten wir die überlegene BLI für die Etablierung eines präklinischen Mausmodells des Multiplen Myeloms (MM) ein. MM ist eine B-Zell Erkrankung wobei maligne Plasmazellen klonal im Knochenmark (BM) älterer Menschen expandieren und erhebliche Morbidität und Sterblichkeit verursacht. Chromosomale Abnormitäten gelten als Kennzeichen des MM, sind bei beinahe allen Patienten vorhanden und können sich während des Krankheitsverlaufes anhäufen oder verändern. Die Diagnose des MM basiert auf klinischen Syptomen inklusive der folgenden Kriterien: erhöhte Serum Kalzium Konzentration, Niereninsuffizienz, Anämie und Knochenläsionen (osteolytische Läsionen oder Osteoporose mit Kompressionsfrakturen). Weitere klinische Symptome beinhalten Hyperviskosität, Amyloidose und wiederkehrende bakterielle Infektionen. Zusätzlich zeigen Patienten verbreitet mehr als 30% klonale BM Plasmazellen und monoklonales Protein ist in Serum und/oder Urin detektierbar. Mit derzeitigen Standardtherapien bleibt MM unheilbar und Patienten, die zwischen 2001 und 2007 mit MM diagnostiziert wurden hatten eine relative 5-jahres Überlebensrate von nur 41%. Daher ist die Entwicklung neuer Medikamente und immunzellbasierten Therapien wünschenswert und notwendig. Zu diesem Zweck entwickelten wir das auf der Zelllinie MOPC-315 basierende syngene MM Mausmodell. Die MOPC-315 Zellen wurden für die in vivo Detektion mittels BLI mit Luziferase markiert. Wir validierten die nichtinvasiv gewonnenen BLI Daten mit Histopathologie, der Messung des idiotypen IgA Spiegels im Serum und Durchflusszytometrie. Alle Methoden bekräftigten die Zuverlässigkeit in vivo BLI Daten für dieses Modell. Wir stellten fest, dass dieses orthotope MM Modell einige Hauptmerkmale der menschlichen Erkrankung widerspiegelt. Die MOPC-315 Zellen wanderten effizient in das BM Kompartiment inklusive darauffolgender Proliferation. Ausserdem, streuten die Zellen in entfernte Teile des Skeletts aus was zum typischen multifokalen MM Wachstum führte. Wir stellten auch osteolytische Läsionen und Knochenumbau fest. Wir fanden Hinweise darauf, dass sich die Zelllinie Plastizität bewahrte was durch die dynamische Regulation der Rezeptorexpression in verschiedenen Kompartimenten, wie dem BM und der Milz, sichtbar wurde. KW - Fluoreszenzproteine KW - Plasmozytom KW - Biolumineszenzmessung KW - Maus KW - Multiple myeloma KW - bioluminescence imaging KW - fluorescence imaging KW - FP635 KW - mouse model KW - nichtinvasive Bildgebung KW - Multiples Myelom Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77894 ER - TY - THES A1 - Kannen Cardoso, Vinicius T1 - The role of Fluoxetine against preneoplastic lesions and tumors in colon tissue T1 - Die Rolle von Fluoxetin gegen präneoplastische Läsionen und Tumoren im Darmgewebe N2 - Introduction: Colon cancer is one of the major human malignancies worldwide, and much effort has been applied to understand the process of colon carcinogenesis, as well as the role of potential treatments and co-therapeutical agents against it. A growing body of evidence suggests that the use of fluoxetine (FLX), an antidepressant belonging to the selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs), may be associated with a reduced colon cancer risk. However, controversial opinions have been published and an identification of the mechanisms of the activity of FLX on colon cells would help in the clarification of this controversy. Objectives: Using several in vitro and in vivo-based methods and analyses, we aimed to verify whether FLX has antioxidant, pro-oxidant or DNA-damaging potential in standard toxicological assays; to check whether and how FLX could prevent and reduce colon preneoplastic lesions; to ascertain whether FLX has any oncostatic potential against colon tumors; and, to investigate whether FLX activity could be comparable with a known and current applied chemotherapeutic agent against colon cancer. Results: FLX did not have any antioxidant potential in our experiments. Although it did not induce reactive oxygen species (ROS) generation or DNA-damage in fibroblast and colon tumor cell lines, FLX reduced dysplasia and proliferation in two different carcinogen models. Further, a significant decrease in colon stromal reactivity and angiogenesis was found in both carcinogen-induced preneoplasia models. In a xenograft model of colon cancer, FLX shrank tumors, reduced tumor proliferation, arrested cancer cells at the G0/G1 cell-cycle phase, and took ROS generation under control. Such effects were detected together with an intracellular acidification and loss of mitochondrial membrane potential in FLX-treated cells. Modulating mitochondrial respiratory chain, HIF-1 expression and Akt/mTOR signaling pathway, FLX was found to reduce colon tumors similar to the widely used chemotherapeutic agent 5-Fluoracil activity. Conclusion: Our collective data suggest that FLX is a remarkable chemopreventive and oncostatic agent against colon preneoplastic lesions and tumors, acting without DNA-damage or ROS generation. N2 - Einleitung: Darmkrebs ist eine der wichtigsten menschlichen Tumorarten weltweit und viel Aufwand wurde unternommen, um den Prozess der Colonkarzinogenese, sowie die Rolle der möglichen Behandlungen und Co-therapeutische Mittel zu verstehen. Eine wachsende Zahl von Hinweisen deuted darauf hin, dass die Verwendung von Fluoxetin (FLX), einem Antidepressivum aus der Klasse der selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs), mit einem reduzierten Dickdarmkrebs-Risiko verbunden sein kann. Allerdings sind auch kontroverse Meinungen veröffentlicht worden und eine Identifizierung der Mechanismen der Aktivität von FLX auf Darmzellen würde bei der Klärung dieser Kontroverse helfen. Ziele: Mit in vitro-und in vivo-Methoden wollten wir prüfen, ob FLX antioxidatives, prooxidatives oder DNA-schädigendes Potential in Standard-toxikologischen Untersuchungen hat; des weiteren sollte analysiert werden, ob und wie FLX präneoplastischen Läsionen verhindern und reduzieren kann, sowie ob FLX onkostatisches Potenzial gegen Darmtumoren hat. Letzteres sollte im direkten Vergleich mit dem etablierten Chemotherapeutikum 5-Fluoruracil untersucht werden. Ergebnisse: FLX zeigte keine direkte antioxidative Kapazität in unseren Testsystemen. Obwohl es keine Bildung reaktiver Sauerstoffspecies (ROS) und keine Induktion von DNA-Schaden in Fibroblasten und Kolon Tumorzellinien verursachte, reduzierte FLX Dysplasien und Proliferation in zwei verschiedenen Kanzerogen-Modellen in vivo. Ferner wurde eine signifikante Abnahme der Reaktivität der Stromazellen und von Angiogenese in beiden Karzinogen-induzierten Präneoplasie-Modellen gefunden. In einem Xenograft Modell des Kolonkarzinoms brachte FLX die Tumoren durch verringerte Proliferation zum Schrumpfen. In vitro wurde in den entsprechenden Zellinien eine Anreicherung der Zellen in der Ga0/G1 Zellzyklus-Phase, eine Reduktion Hypoxie-verursachter ROS-Bildung, intrazelluläre Ansäuerung und Velust des mitochondrialen Membranpotentials nach FLX-Behandlung gefunden. Weitere Aktivitäten waren auf die mitochondriale Atmungskette, HIF-1 Expression und den Akt/mTOR-Sinalweg zu beobachten. Die Reduktion der Kolontumoren war der mit 5-Fluoruracil erzielten vergleichbar. Schlussfolgerung: Unsere Daten deuten darauf hin, dass FLX eine bemerkenswerte chemopräventive und onkostatischen Aktivität gegen präneoplastische Läsionen und Tumore im Darm aufweist, die ohne Induktion von DNA-Schäden ROS stattfindet. KW - Fluoxetin KW - Magenkrebs KW - Fluoxetine KW - Colon cancer Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77589 ER - TY - THES A1 - Kober, Franz-Xaver Wilhelm T1 - Molecular insights into the protein disulfide isomerase family T1 - Molekulare Mechanismen der Protein Disulfid Isomerase Familie N2 - Upon synthesis, nascent polypeptide chains are subject to major rearrangements of their side chains to obtain an energetically more favorable conformation in a process called folding. About one third of all cellular proteins pass through the secretory pathway and undergo oxidative folding in the endoplasmic reticulum (ER). During oxidative folding, the conformational rearrangements are accompanied by the formation of disulfide bonds – covalent bonds between cysteine side chains that form upon oxidation. Protein disulfide isomerase (PDI) assists in the folding of substrates by catalyzing the oxidation of pairs of cysteine residues and the isomerization of disulfide bonds as well as by acting as chaperones. In addition to PDI itself, a family of related ER-resident proteins has formed. All PDI family members share the thioredoxin fold in at least one of their domains and exhibit a subset of the PDI activities. Despite many studies, the role of most PDI family members remains unclear. The project presented in this thesis was aimed to establish tools for the biochemical characterization of single members of the PDI family and their role in the folding process. A combination of fluorescence based assays was developed to selectively study single functions of PDI family members and relate their properties of either catalysis of oxidation or catalysis of isomerization or chaperone activity to the rest of the protein family. A binding assay using isothermal titration calorimetry (ITC) was established to complement the activity assays. Using ITC we could show for the first time that members of the PDI family can distinguish between folded and unfolded proteins selectively binding the latter. The unique information provided by this method also revealed a two-site binding of unfolded proteins by PDI itself. In addition to the functional characterization, experiments were conducted to further investigate the oligomeric state of PDI. We could show that the equilibrium between structurally different states of PDI is heavily influenced by the redox state of the protein and its environment. This new data could help to further our understanding of the interplay between oxidases like PDI and their regenerative enzymes like Ero1, which may be governed by structural changes in response to the change in redox status. Another structural approach was the screening of all investigated PDI family members for suitable crystallization conditions. As a result of this screening we could obtain protein crystals of human ERp27 and were able to solve the structure of this protein with X-ray crystallography. The structure gives insight into the mechanisms of substrate binding domains within the PDI family and helps to understand the interaction of ERp27 with the redox active ERp57. In collaboration with the group of Heike Hermanns we could further show the physiological importance of this interaction under oxidative stress. In conclusion, the project presented in this thesis provides novel tools for an extensive analysis of the activities of single PDI family members as well as a useful set of methods to characterize novel oxidoreductases and chaperones. The initial results obtained with the our novel methods are very promising. At the same time, the structural approach of this project could successfully solve the structure of a PDI family member and give information about the interplay within the PDI family. N2 - Umlagerungsprozess nennt man Proteinfaltung. Schätzungsweise ein Drittel aller zellulären Proteine werden über den sekretorischen Transportweg geschleust und durchlaufen die oxidative Proteinfaltung im endoplasmatischen Retikulum (ER). Während der oxidativen Faltung werden zusätzlich zur Umlagerung von Seitenketten auch Disulfidbrücken gebildet. Dies sind kovalente Bindungen zwischen Zystein-Seitenketten durch Oxidation entstehen. Protein Disulfid Isomerase (PDI) unterstützt die Faltung von Proteinen im ER indem es die Oxidation zweier Zystein- Seitenketten katalysiert. Neben der Oxidation katalysiert PDI ebenfalls die Isomerisierung von fehlverknüpften Disulfidbrücken und wirkt als Chaperon der Aggregation entgegen. Im Laufe der Evolution hat sich zusätzlich zu PDI eine Gruppe verwandter ER-lokalisierter Proteine gebildet. Diese Mitglieder der PDI-Familie weisen alle das Thioredoxin-Faltungsmotiv in mindestens einer ihrer Domänen auf und besitzen mindestens eine der drei PDI-Aktivitäten. Trotz eingehender Untersuchung ist die Rolle der meisten dieser PDI Familienmitglieder weiterhin unklar. Im Rahmen des Projekts, welches dieser Dissertation zugrunde liegt, wurden Methoden zur biochemischen Charakterisierung einzelner Mitglieder der PDI-Familie, und deren Rolle im Faltungsprozess, entwickelt. Eine Kombination von Fluoreszenzexperimenten wurde etabliert mit der selektiv einzelne Aktivitäten von Faltungshelfern analysiert und qualitativ in die PDI- Familie eingeordnet werde können. Diese fluoreszenzbasierten Methoden wurden durch isothermale Titrationkalorimetrie (ITC) ergänzt. Mit ITC konnten wir als Erste zeigen, dass PDI- Familienmitglieder gefaltete von ungefalteten Proteinen unterscheiden können und letztere selektiv binden. Die zusätzlichen Informationen, die in einem ITC-Experiment gewonnen wurden, zeigten, dass PDI mit Substraten mit Hilfe von zwei unterschiedlichen Bindungsstellen interagiert. Neben der funktionellen Analyse der PDI-Familie wurde Experimente durchgeführt um den oligomeren Zustand von PDI näher zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass das Gleichgewicht zwischen strukturell verschiedenen Zuständen entscheidend vom Redox-Status von PDI abhängt. Diese neuen Daten werfen ein neues Licht auf die Interaktion zwischen Oxidasen wie PDI und ihren regenerativen Enzymen wie Ero1. Diese Interaktion könnte sehr wohl durch strukturelle Veränderungen, ausgelöst durch Redox-Reaktionen, reguliert werden. Als weiteren strukturellen Ansatz zur Erforschung der PDI-Familie wurden alle verwendeten Familienmitglieder auf aussichtsreiche Kristallisationsbedingungen hin untersucht. Durch dieses Screening konnte ERp27 kristallisiert und seine Struktur durch Röntgenkristallografie aufgeklärt werden. Die so gewonnene Struktur gibt Aufschluss über die Mechanismen der Substratbindung in der PDI- Familie und hilft ebenfalls dabei, die Interaktion zwischen ERp27 und dem redoxaktiven ERp57 besser zu verstehen. Auf Grund dieser Daten konnten wir gemeinsam mit der Gruppe von Heike Hermanns die physiologische Bedeutung dieser Interaktion bei oxidativem Stress aufzeigen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieses Projektes neue Werkzeuge zur eingehenden Analyse der PDI-Familie etabliert werden, welche auch zur Charakterisierung neuer Oxidoreduktasen und Chaperone verwendet werden können. Die ersten Ergebnisse die mit Hilfe dieser neuen Methoden gewonnen werden konnten sind vielversprechen. Gleichzeitig konnten wir mit ERp27 die Struktur eines weiteren PDI-Familienmitgliedes lösen und so weitere Einblicke in das komplexe Netzwerk der PDI-Familie gewinnen. KW - Biochemie KW - Proteinfaltung KW - Disulfidbrücken KW - Protein Disulfid Isomerase KW - Biochemistry KW - protein folding KW - disulfide bonds KW - protein disulfide isomerase KW - PDI Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72144 ER - TY - THES A1 - Pleines, Irina T1 - The role of the Rho GTPases Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation T1 - Die Rolle der Rho GTPasen Rac1 und Cdc42 in Thrombozytenfunktion und -bildung N2 - Platelet activation induces cytoskeletal rearrangements involving a change from discoid to spheric shape, secretion, and eventually adhesion and spreading on immobilized ligands. Small GTPases of the Rho family, such as Rac1 and Cdc42, are known to be involved in these processes by facilitating the formation of lamellipodia and filopodia, respectively. This thesis focuses on the role Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation from their precursor cells, the megakaryocytes (MKs), using conditional knock-out mice. In the first part of the work, the involvement of Rac1 in the activation of the enzyme phospholipase (PL) C2 in the signaling pathway of the major platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI was investigated. It was found that Rac1 is essential for PLC2 activation independently of tyrosine phosphorylation of the enzyme, resulting in a specific platelet activation defect downstream of GPVI, whereas signaling of other activating receptors remains unaffected. Since Rac1-deficient mice were protected from arterial thrombosis in two different in vivo models, the GTPase might serve as a potential target for the development of new drugs for the treatment and prophylaxis of cardio- and cerebrovascular diseases. The second part of the thesis deals with the first characterization of MK- and platelet-specific Cdc42 knock-out mice. Cdc42-deficient mice displayed mild thrombo-cytopenia and platelet production from mutant MKs was markedly reduced. Unexpectedly, Cdc42-deficient platelets showed increased granule content and release upon activation, leading to accelerated thrombus formation in vitro and in vivo. Furthermore, Cdc42 was not generally required for filopodia formation upon platelet activation. Thus, these results indicate that Cdc42, unlike Rac1, is involved in multiple signaling pathways essential for proper platelet formation and function. Finally, the outcome of combined deletion of Rac1 and Cdc42 was studied. In contrast to single deficiency of either GTPase, platelet production from double-deficient MKs was virtually abrogated, resulting in dramatic macrothrombocytopenia in the animals. Formed platelets were largely non-functional leading to a severe hemostatic defect and defective thrombus formation in double-deficient mice in vivo. These results demonstrate for the first time a functional redundancy of Rac1 and Cdc42 in the hematopoietic system. N2 - Umstrukturierungen des Zytoskeletts spielen eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten und sind in diesem Zusammenhang unerlässlich für Formänderung, Sekretion, sowie für Adhäsion und Ausbreitung auf immobilisierten Adhäsionsproteinen. Es wird vermutet, dass kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. Rac1 und Cdc42, maßgeblich an diesen Prozessen beteiligt sind, indem sie die Bildung von Lamellipodien bzw. Filopodien bewirken. Die hier vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Funktion von Rac1 und Cdc42 sowohl für die Aktivierung von Thrombozyten, als auch für deren Neubildung aus ihren Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs). Zu diesem Zweck wurden konditionale Knock-out-Mäuse generiert und in vitro und in vivo analysiert. Der erste Teil der Arbeit beinhaltete die Untersuchung der Rolle von Rac1 im Signalweg des wichtigsten Thrombozyten-Kollagen-Rezeptors, Glykoprotein (GP) VI, dessen Stimulation zur Aktivierung des Enzyms Phospholipase 2 (PLC2) führt. Es konnte gezeigt werden, dass Rac1 notwendig für PLC2-Aktivierung ist, und zwar unabhängig von der simultan stattfindenden Tyrosin-Phosphorylierung des Enzyms. Dies führte dazu, dass in Rac1-defizienten Thrombozyten spezifisch der GPVI-Signalweg blockiert war, während die Aktivierung durch andere Rezeptoren unverändert funktionierte. Da Rac1-defiziente Mäuse vor arteriellem Gefäßverschluss (Thrombose) in zwei verschiedenen in vivo Modellen geschützt waren, könnte Rac1 einen potenziellen Angriffspunkt für die Entwicklung neuer antithrombotisch wirksamer Medikamente darstellen. Im zweiten Teil der Dissertation wurden erstmals die Auswirkungen eines MK- und Thrombozyten-spezifischen Cdc42-Knock-outs charakterisiert. Cdc42-defiziente Mäuse zeigten eine leichte Thrombozytopenie und die Neubildung von Thrombozyten aus defizienten MKs war merklich beeinträchtigt. Entgegen aller Erwartungen waren sowohl Inhalt, als auch Freisetzung von Granula aus Cdc42-defizienten Thrombozyten stark erhöht, was zu beschleunigter Thrombusbildung in vitro und Gefäßverschluss in vivo führte. Überdies war Cdc42 generell nicht essentiell für die Ausbildung von Filopodien nach Thrombozytenaktivierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cdc42 an einer Vielzahl von Signalwegen beteiligt ist, welche für die korrekte Bildung und Funktion von Thrombozyten unabdingbar sind. Der letzte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit den Auswirkungen einer Doppel-defizienz von Rac1 und Cdc42. Im Gegensatz zur jeweiligen Einfachdefizienz war die Bildung von Thrombozyten aus doppeldefizienten MKs fast komplett blockiert, was eine stark ausgeprägte Makrothrombozytopenie in den betroffenen Tieren zur Folge hatte. Die wenigen gebildeten Thrombozyten waren in ihrer Funktion stark beeinträchtigt. Dies führte zusammen mit den extrem niedrigen Thrombozytenzahlen dazu, dass in doppeldefizienten Mäusen sowohl Hämostase als auch Thrombusbildung defekt waren. Diese Resultate zeigen erstmals eine funktionelle Redundanz von Rac1 und Cdc42 im hämatopoetischen System. KW - Thrombose KW - Rho GTPasen KW - Thrombozyt KW - platelet KW - Rho GTPase KW - platelet KW - Rho GTPase KW - Thrombosis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48572 ER - TY - THES A1 - Pletinckx, Katrien T1 - Dendritic cell maturation and instruction of CD4+ T cell tolerance in vitro T1 - Reifung der dendritischen Zelle und Instruktion der CD4+ T Zell Toleranz in vitro N2 - Effective T cell immunity was believed to occur by mature DC, whereas tolerogenicity was attributed strictly to immature DC phenotypes. However, intermediate DC maturation stages were identified conditioned by inflammatory mediators like TNF. Furthermore, the T cell tolerance mechanisms are dependent on distinct modes and intensities of co-stimulation. Therefore, in this study it was addressed how distinct DC maturation signatures instruct CD4+ T cell tolerance mechanisms. DC acquire antigens from apoptotic cells for self-peptide-MHC presentation and functionally adapt presumed tolerogenic DC phenotypes. Here, immature murine bone-marrow derived DC representing both inflammatory and conventional DC subsets adapted a maturationresistant DC signature upon apoptotic cell recognition but no additional tolerogenic features. Immature DC instruct CD4+ FoxP3+ regulatory T cells in a TGF-β prone micro-environment or generate anergic CD4+ T cells hampered in the TCR-induced proliferation and IL-2 secretion. Secondary stimulation of such anergic CD4+ T cells by immature DC increased primarily IL-10 production and conferred regulatory function. These IL-10+ regulatory T cells expressed high levels of CTLA-4, which is potently induced by immature DC in particular. Data in this work showed that anergic T cells can be re-programmed to become IL-10+ regulatory T cells upon ligation of CTLA-4 and CD28 signalling cascades by B7 costimulatory ligands on immature DC. In contrast, semi-mature DC phenotypes conditioned by the inflammatory mediator TNF prevented autoimmune disorders by induction of IL-10+ Th2 responses as demonstrated previously. Here, it was shown that TNF as an endogenous maturation stimulus and pathogenic Trypanosoma brucei variant-specific surface glycoproteins (VSG) induced highly similar DC gene expression signatures which instructed default effector Th2 responses. Repetitive administration of the differentially conditioned semi-mature DC effectively skewed T cell immunity to IL-10+ Th2 cells, mediating immune deviation and suppression. Collectively, the data presented in this work provide novel insights how immature and partially mature DC phenotypes generate T cell tolerance mechanisms in vitro, which has important implications for the design of effective DC-targeted vaccines. Unravelling the DC maturation signatures is central to the long-standing quest to break tolerance mimicked by malignant tumours or re-establish immune homeostasis in allergic or autoimmune disorders. N2 - Reife DC sind potente Induktoren von T Zell Immunität, wogegen unreife DC Stadien zur Induktion von Immuntoleranz befähigt sind. Zudem sind intermediäre semireife DC Entwicklungsstadien identifiziert worden, wie sie nach Behandlung mit inflammatorischen TNF entstehen. Die bekannten T Zell Toleranzmechanismen sind wiederum abhängig von unterschiedlicher Art und Intensität von Kostimulation. Hier wurde deshalb untersucht wie verschiedene DC Reifungsstadien CD4+ T Zelltoleranz induzieren können. DC nehmen apoptotisches Zellmaterial auf, was als Antigenquelle zur Präsentation von MHC/Selbstpeptid-Komplexen genutzt wird und tolerogene Funktionen in DC hervorrufen kann. Unsere Ergebnisse zeigten dass aus Knochenmark generierte DC der Maus, die sowohl inflammatorische als auch klassische DC Subtypen darstellen, nach Erkennung apoptotischen Zellmaterials reifungsresistent wurden, jedoch unverändert unreif und keine neuen tolerogenen Funktionen erwarben. Unreife DC induzierten in Gegenwart von TGF-β CD4+ FoxP3+ regulatorische T Zellen und in dessen Abwesenheit anergische CD4+ T Zellen. Wiederholte Stimulation anergischer CD4+ T Zellen durch unreife DC, induzierte deren IL-10 Produktion und regulatorische Eigenschaften. Diese IL-10+ regulatorischen T Zellen zeigten keine FoxP3 Expression, jedoch verstärkt CTLA-4, insbesondere nach Interaktion mit unreifen DC. Zusammen zeigten die hier erhaltenen Daten, dass das Reprogrammieren anergischer T Zellen zu IL-10+ regulatorischen T Zellen über CTLA-4 als auch über CD28 Signalkaskaden durch deren B7 Liganden auf der Zelloberfläche unreifer DC gesteuert wird. Frühere Arbeiten zeigten, dass repetitive Injektion semireifer DC, Autoimmunerkrankungen vorbeugen konnten durch die Induktion IL-10+ Th2 Antworten. Hier konnte gezeigt werden dass TNF als endogener Reifungsstimulus sowie pathogene T. brucei Varianten-spezifische Glykoproteine (VSG) sehr ähnliche semireife DC Reifungsqualitäten hervorrufen. Die entsprechend generierten Th2 Effektor Zellen unterschieden sich lediglich geringfügig in deren Zytokinproduktion. Repetitive Injektionen dieser semireifen DC induzierten ebenfalls IL-10+ Th2 Differenzierung und effektive Immundeviation in vivo. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit wichtige Erkenntnisse ergeben, wie unreife und semireife DC die Generierung unterschiedlicher T Zell Toleranzmechanismen in vitro unterstützen. Diese Erkenntnisse sind ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung effektiver DC-basierter Immunvakzinen. Die Definition der verschiedenen DC Reifungsstadien ist von großer Bedeutung bei der Optimierung von Behandlungsverfahren gegen infektiöse Erreger, Krebs oder Autoimmunerkrankungen. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Toleranz KW - Dendritic cell KW - tolerance Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67375 ER - TY - THES A1 - Ahmad, Ruhel T1 - Neurogenesis from parthenogenetic human embryonic stem cells T1 - Neurogenese von parthenogenetischen humanen embryonalen Stammzellen N2 - Imprinted genes play important roles in brain development. As the neural developmental capabilities of human parthenogenetic embryonic stem cells (hpESCs) with only a maternal genome were not assessed in great detail, hence here the potential of hpESCs to differentiate into various neural subtypes was determined. In addition DNA methylation and expression of imprinted genes upon neural differentiation was also investigated. The results demonstrated that hpESC-derived neural stem cells (hpNSCs) showed expression of NSC markers Sox1, Nestin, Pax6, and Musashi1 (MS1), the silencing of pluripotency genes (Oct4, Nanog) and the absence of activation of neural crest (Snai2, FoxD3) and mesodermal (Acta1) markers. Moreover, confocal images of hpNSC cultures exhibited ubiquitous expression of NSC markers Nestin, Sox1, Sox2 and Vimentin. Differentiating hpNSCs for 28 days generated neural subtypes with neural cell type-specific morphology and expression of neuronal and glial markers, including Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 and GABA. hpNSCs also responded to region-specific differentiation signals and differentiated into regional phenotypes such as midbrain dopaminergic- and motoneuron-type cells. hpESC-derived neurons showed typical neuronal Na+/K+ currents in voltage clamp mode, elicited multiple action potentials with a maximum frequency of 30 Hz. Cell depicted a typical neuron-like current pattern that responded to selective pharmacological blockers of sodium (tetrodotoxin) and potassium (tetraethylammonium) channels. Furthermore, in hpESCs and hpNSCs the majority of CpGs of the differentially methylated regions (DMRs) KvDMR1 were methylated whereas DMR1 (H19/Igf2 locus) showed partial or complete absence of CpG methylation, which is consistent with a parthenogenetic (PG) origin. Upon differentiation parent-of-origin-specific gene expression was maintained in hpESCs and hpNSCs as demonstrated by imprinted gene expression analyses. Together this shows that despite the lack of a paternal genome, hpNSCs are proficient in differentiating into glial- and neuron-type cells, which exhibit electrical activity similar to newly formed neurons. Moreover, maternal-specific gene expression and imprinting-specific DNA-methylation are largely maintained upon neural differentiation. hpESCs are a means to generate histocompatible and disease allele-free ESCs. Additionally, hpESCs are a unique model to study the influence of imprinting on neurogenesis. N2 - Imprinted Gene spielen eine wichtige Rolle bei der Gehirnentwicklung. Da das neurale Entwicklungspotenzial von hpESCs bisher noch nicht ausführlich untersucht wurde, war das Ziel dieser Arbeit das Differenzierungspotenzial von hpESCs zu verschiedenen neuralen Subtypen zu untersuchen. Außerdem wurden die DNA-Methylierung und Expression imprinted Gene in hpESCs während der neuralen Differenzierung analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass von hpESCs abgeleitete neurale Stammzellen (hpNSCs) die NSC-Marker Sox1, Nestin, Pax6 und Musashi1 (MS1) exprimierten, Pluripotenzmarker-Gene (Oct4, Nanog) abschalteten und keine Aktivierung von Markern der Neuralleistenzellen (Snai2, FoxD3) sowie dem mesodermalen Marker Acta1 stattfand. Immunfärbungen zeigten weiterhin, dass aus hpESCs abgeleitete Stammzellen die NSC-Marker Nestin, Sox1, Sox2 und Vimentin auf Proteinebene exprimierten. Durch gerichtete neurale Differenzierung für 28 Tage konnten aus hpESCs neurale Subtypen abgeleitet werden, die eine neurale Zelltyp-spezifische Morphologie aufweisen und positiv für neuronale und gliale Marker wie Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 und GABA sind. Um aus hpNSCs dopaminerge und Motoneuronen abzuleiten, wurden während der Differenzierung Morphogene und trophische Faktoren zugegeben. Elektrophysiologische Analysen konnten zeigen, dass die in vitro differenzierten Neuronen, die von hpESCs abgeleitet wurden, für Neurone typische Na+/K+ Ströme sowie Aktionspotentiale (30 Hz) vorweisen ausbilden und auf ausgewählte pharmakologische Natrium- (Tetrodotoxin) und Kalium- (Tetraethylammonium) Kanal-Blocker reagierten. Desweiteren war der Großteil der CpGs von differentiell methylierten Regionen (DMRs) KvDMR1 in hpESCs und hpNSCs methyliert, während DMR1 (H19/Igf2 Locus) eine partiell oder komplett abwesende CpG-Methylierung zeigte, was dem parthenogenetischen Ursprung entspricht. Während der Differenzierung wurde die elternabhängige (parent-of-origin) spezifische Genexpression in hpESCs und hpNSCs aufrechterhalten, wie mit Genexpressionsanalysen imprinted Gene gezeigt werden konnte. In der Summe zeigen die hier dargestellten Ergebnisse, dass hpESCs, die kein paternales Genom besitzen, keine Beeinträchtigung im neuralen Differenzierungspotential zeigten und zu Gliazellen und Neurone differenziert werden konnten. Elektrophysiologische Analysen zeigten ferner, dass von hpESCs abgeleitete Neurone funktionell sind. Zudem wird die Expression maternal-spezifischer Gene und die Imprinting-spezifische DNA-Methylierung während der Differenzierung größtenteils aufrechterhalten. In der Summe stellen hpESCs ein einzigartiges Modell dar, um den Einfluss des Imprintings auf die Neurogenese zu untersuchen. KW - Embryonale Stammzelle KW - Neurogenese KW - Zelldifferenzierung KW - Stammzelle KW - human parthenogenetic stem cells KW - in vitro neural differentiation KW - human parthenogenetic neural stem cells KW - PG neurons KW - imprinting. Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75935 ER - TY - THES A1 - Wolski, Stefanie Carola T1 - Structural and functional characterization of nucleotide excision repair proteins T1 - Strukturelle und funktionelle Charakterisierung von Nucleotid-Exzisions-Reparatur Proteinen N2 - XPD is a 5‘-3‘ helicase of the superfamily 2. As part of the transcription factor IIH it functions in transcription initiation and nucleotide excision repair. This work focus on the role of XPD in nucleotide excision repair. NER is a DNA repair pathway unique for its broad substrate range. In placental mammals NER is the only repair mechanism able to remove lesions induced by UV-light. NER can be divided into four different steps that are conserved between pro- and eukaryotes. Step 1 consists of the initial damage recognition, during step 2 the putative damage is verified, in step 3 the verified damage is excised and in the 4th and final step the resulting gap in the DNA is refilled. XPD was shown to be involved in the damage verification step. It was possible to solve the first apo XPD structure by a MAD approach using only the endogenous iron from the iron sulfur cluster. Based on the apo XPD structure several questions arise: where is DNA bound? Where is DNA separated? How is damage verification achieved? What is the role of the FeS cluster? These questions were addressed in this work. Hypothesis driven structure based functional mutagenesis was employed and combined with detailed biochemical characterization of the variants. The variants were analyzed by thermal unfolding studies to exclude the possibility that the overall stability could be affected by the point mutation. DNA binding assays, ATPase assays and helicase assays were performed to delineate amino acid residues important for DNA binding, helicase activity and damage recognition. A structure of XPD containing a four base pair DNA fragment was solved by molecular replacement. This structure displays the polarity of the translocated strand with respect to the helicase framework. Moreover the properties of the FeS cluster were studied by electron paramagnetic resonance to get insights into the role of the FeS cluster. Furthermore XPD from Ferroplasma acidarmanus was investigated since it was shown that it is stalled at CPD containing lesions. The data provide the first detailed insight into the translocation mechanism of a SF2B helicase and reveal how polarity is achieved. This provides a basis for further anlayses understanding the combined action of the helicase and the 4Fe4S cluster to accomplish damage verification within the NER cascade. N2 - XPD ist eine 5‘-3‘ Helicase der Superfamilie 2. Als Untereinheit des Transkriptionsfaktors IIH ist XPD in Transkriptionsinitiation und Nucleotid-Exzisions-Reparatur involviert. Diese Arbeit fokusiert auf die Rolle von XPD in der NER. NER ist ein DNA Reparatur Weg der bekannt ist für seine breite Substratspezifität. In Säugetieren ist NER der einzige Reparaturmechanismus, der fähig ist Läsionen zu reparieren, die durch UV Strahlung induziert werden. NER kann man in vier unterschiedliche Schritte aufteilen die zwischen Pro- und Eukaryoten konserviert sind. Schritt 1 besteht aus der initialen Schadenserkennung, während des zweiten Schrittes wird der mögliche Schaden verifiziert, im dritten Schritt wird der verifizierte Schaden ausgeschnitten und im vierten und letzten Schritt wird die resultierende Lücke in der DNA geschlossen. Es wurde gezeigt, dass XPD in die Schadensverifizierung involviert ist. Ein MAD Versuch, bei dem nur das endogene Eisen des Eisen-Schwefel-Clusters verwendet wurde ermöglichte die Strukturlösung der ersten apo XPD Struktur. Basierend auf der Struktur ergeben sich verschiedene Fragen: wo wird DNA gebunden? Wo wird DNA aufgetrennt? Wie wird Schadenserkennung ermöglicht? Was ist die Rolle des Eisen-Schwefel-Clusters? Diese Fragen werden in dieser Arbeit angesprochen. Strukturbasierte funktionelle Mutagenesestudien, die auf Hypothesen basiert sind, wurden angewendet und mit einer detailierten biochemischen Charakterizierung der Varianten kombiniert. Die Varianten wurden mittels thermischen Entfaltungsstudien analysiert, um die Möglichkeit auszuschliessen, dass die Stabilität durch die Punktmutation betroffen ist. DNA-Bindungs- Assays, ATPase Assays und Helikase Assays wurden durchgeführt um Aminosäurereste zu identifizieren, die für DNA Bindung, Helikase Aktivität und Schadenserkennung wichtig sind. Eine Struktur von XPD, die ein DNA Fragment mit vier Basen enthält, wurde mittels Molekularem Ersatz gelöst. Diese Struktur zeigt die Polarität des translozierenden DNA- Stranges im Verhältnis zu der Helikasestruktur auf. Desweiteren wurden die Eigenschaften des FeS Clusters mittels paramagnetischen Elektronenresonanz Studien untersucht, um Einblicke in die Rolle des FeS Clusters zu bekommen. Ausserdem wurde XPD aus Ferroplasma acidarmanus erforscht, da gezeigt wurde, dass es an CPD enthaltenden Läsionen hängen bleibt. Diese Daten stellen die ersten detailierten Einblicke in den Translokationsmechanismus einer SF2B Helikase dar und zeigen wie Polarität erzielt wird. Das ist eine Basis für weitere Analysen, um die kombinierte Aktion von Helikase und dem 4Fe4S Cluster zu verstehen, die zur Schadenserkennung in der NER Kaskade führt. KW - DNS-Reparatur KW - Helicasen KW - Kristallographie KW - XPD KW - Xeroderma pigmentosum KW - TFIIH KW - Nukleotid-Exzisions-Reparatur KW - X-ray Crystallography KW - XPD KW - TFIIH KW - Nucleotide-Excision-Repair KW - FeS cluster Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67183 ER - TY - THES A1 - Masic, Anita T1 - Signaling via Interleukin-4 Receptor alpha chain during dendritic cell–mediated vaccination is required to induce protective immunity against Leishmania major in susceptible BALB/c mice T1 - Die auf dendritischen Zellen basierende Immunisierungsstrategie gegen Leishmania major in BALB/c Mäusen ist abhängig von der Stimulation der Interleukin-4 Rezeptor alpha Kette N2 - Cutaneous leishmaniasis is endemic in tropical and subtropical regions of the world. Effective vaccination strategies are urgently needed because of the emergence of drug-resistant parasites and severe side effects of chemotherapy. The research group of Heidrun Moll previously established a DC-based vaccination strategy to induce complete and long-lasting immunity to experimental leishmaniasis using LmAg-loaded and CpG ODN-activated DC as a vaccine carrier. Prevention of tissue damages at the site of L. major inoculation can be achieved if the BALB/c mice were systemically given LmAg-loaded BMDC that had been exposed to CpG ODN. The interest in further exploring the role of IL-4 aroused as previous studies allowed establishing that IL-4 was involved in the redirection of the immune response towards a type 1 profile. Thus, wt BALB/c mice or DC-specific CD11ccreIL-4Rα-/lox BALB/c mice were given either wt or IL-4Rα-deficient LmAg-loaded BMDC exposed or not to CpG ODN prior to inoculation of 2 x 105 stationary phase L. major promastigotes into the BALB/c footpad. The results provide evidence that IL4/IL-4Rα-mediated signaling in the vaccinating DC is required to prevent tissue damages at the site of L. major inoculation, as properly conditioned wt DC but not IL-4Rα-deficient DC were able to confer resistance. Furthermore, uncontrolled L. major population size expansion was observed in the footpad and the footpad draining LN in CD11ccreIL-4Rα-/lox mice immunized with CpG ODN-exposed LmAg-loaded IL-4Rα-deficient DC, indicating the influence of IL-4R-mediated signaling in host DC to control parasite replication. In addition, no footpad damage was observed in BALB/c mice that were systemically immunized with LmAg-loaded wt DC doubly exposed to CpG ODN and recombinant IL-4. Discussing these findings allow the assumption that triggering the IL4/IL4Rα signaling pathway could be a precondition when designing vaccines aimed to prevent damaging processes in tissues hosting intracellular microorganisms. N2 - Die kutane Leishmaniose ist vor allem in den tropischen und subtropischen Regionen endemisch. Die Notwendigkeit der Erforschung und Etablierung einer Impfstoffstrategie basiert auf dem Auftreten von starken Nebenwirkungen während einer medikamentösen Behandlung, als auch auf die Entwicklung von Resistenzen des Parasiten gegenüber herkömmlichen Behandlungsmethoden. Die Arbeitsgruppe um Heidrun Moll etablierte eine auf dendritischen Zellen (DZ) basierende Immunisierungsstrategie, welche langlebige Immunität gegen experimentelle Leishmaniose vermittelt. Dabei dienen CpG ODN-stimulierte DZ als Adjuvans für L.-major–Antigene (LmAg). Die durch Infektion mit Leishmania-Parasiten hervorgerufene Gewebeschädigung kann in BALB/c-Mäusen verhindert werden, vorausgesetzt eine systemische Verabreichung von LmAg-beladenen und CpG ODN-aktivierten DZ erfolgte eine Woche vor der Infektion. Es konnte gezeigt werden, dass der Schutz durch die Induktion einer von Interleukin (IL)-12 und Interferon (IFN)-gamma dominierten T-Helfer (Th)1-Immunantwort herbeigeführt wurde und kranke Kontrollmäuse eine IL-4-dominierte Th2 Immunantwort aufwiesen. Mittlerweile zeigen zahlreiche Studien, dass IL-4 nicht ausschließlich eine krankheitsfördernde Funktion innehat, sondern auch die Fähigkeit zur Einleitung eine Typ-1-Immunantwort besitzt. Auf Grund dieser Studien wurde das Augenmerk auf die Rolle von IL-4 in der DZ-basierten Immunisierung gegen Leishmaniose in BALB/c Mäusen gelegt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Notwendigkeit der Stimulation der IL-4 Rezeptor alpha (IL-4Rα) Kette auf DZ, während einer DZ-basierten Immunisierung gegen Leishmaniose in BALB/c Mäusen gezeigt. Um dies zu erreichen, wurden Wildtyp (wt)-BALB/c-Mäuse oder DZ-spezifische CD11ccreIL-4Rα-/lox BALB/c Mäuse entweder mit wt oder IL-4Rα-defizienten LmAg-beladenen DZ mit oder ohne Aktivierung durch CpG ODN, eine Woche vor der Infektion mit 2x105 L. major Promastigoten in den Hinterfuß, immunisiert. Die in dieser Doktorarbeit gezeigten Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Stimulation der IL-4Rα-Kette auf den als Adjuvans eingesetzten DZ erforderlich ist, um eine Gewebsschädigung an der Infektionsstelle zu verhindern, da konditionierte wt DZ, nicht aber IL-4Rα-defiziente DZ in der Lage sind, Schutz gegen Leishmaniose zu vermitteln. Des Weiteren konnte eine unkontrollierte Ausdehnung von Leishmania-Parasiten im infizierten Fuß und in den angrenzenden Lymphknoten von CD11ccreIL-4Rα-/lox Mäusen beobachtet werden, welche mit CpG ODN-aktivierten und LmAg-beladenen IL-4Rα-defizienten DZ immunisiert wurden. Dieser Befund zeigt den Einfluss der Stimulation der IL-4Rα-Kette auf wirtsansässigen DZ im Hinblick auf die Eindämmung der Parasitenreplikation und Parasitenverbreitung. Zusätzliche Analysen in BALB/c-Mäusen, welche mit LmAg-beladenen, CpG ODN- und rekombinanten IL-4-stimulierten DZ immunisiert wurden, zeigten einen resistenten klinischen Verlauf der Infektion. Die hier gezeigten Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass die durch die IL-4/IL-4Rα-Kette ausgelösten Signale in den DZ eine Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche Immunisierung sind und sollten deswegen unbedingt bei der Entwicklung eines Impfstoffes gegen die gewebsschädigenden Folgen einer Leishmaniose oder anderer durch intrazelluläre Mikroorganismen verursachten Infektionen berücksichtigt werden. KW - Leishmania major KW - Dendritische Zelle KW - Immunisierung KW - murine leishmaniasis KW - IL-4 Rezeptor alpha KW - Leishmania major KW - murine leishmaniasis KW - dendritic cells KW - IL-4 KW - IL-4 receptor alpha chain KW - vaccine Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75508 ER - TY - THES A1 - Schnitzer, Johannes K. T1 - Mechanism of dendritic cell-based vaccination against Leishmania major T1 - Mechanismus der auf dendritischen Zellen beruhenden Impfung gegen Leishmania major N2 - Die Impfung mittels Antigen-beladener dendritischer Zellen [DZ] ist mittlerweile eine gut etablierte Technik, die dann zum Einsatz kommt, wenn Standard-Impftechniken versagen, vor Krankheiten zu schützen beziehungsweise diese zu heilen. Die Effizienz dieser Technik konnte bereits für diverse Infektionskrankheiten und Krebserkrankungen in experimentellen Tiermodellen sowie am Menschen gezeigt werden. Hierbei ist die Möglichkeit zur wohldefinierten Manipulation und Antigenbeladung der DZ ein großer Vorteil gegenüber den konventionellen Ansätzen. Jedoch ist vor allem bei der Anwendung im klinischen Bereich die Präparation, Herstellung und Manipulation dieser autologen DZ mit einem erheblichen technischen, zeitlichen sowie finanziellen Aufwand verbunden. Hinsichtlich einer Präventivimpfung gegen eine pandemische Infektionskrankheit, die in hauptsächlich unterentwickelten Ländern vorkommt, wird dieser Aufwand sicherlich ein Hindernis darstellen. Daher muss für solche Fälle ein maßgeschneiderter Impfstoff entwickelt werden, der sich am Vorbild des effektiven DZ-basierten Impfstoffs orientiert. Für die Impfung gegen die Leishmania Parasiten besteht so ein DZ-basierter Impfstoff bereits. Dessen Wirkung, eine T-Zell Antwort vom Typ Th1 zu induzieren, wurde bereits in mehreren Veröffentlichungen demonstriert. Zusätzlich hat aber eine unserer Studien gezeigt, dass das typische Th1-bezogene Zytokin IL-12 zur Differenzierung naiver T-Zellen nicht von den injizierten DZ bereitgestellt werden muss, sondern von der geimpften Maus. Dies gab erste Hinweise auf eine stärkere Beteiligung des Wirts-Immunsystems als zuvor angenommen. Daher sollte hier vertieft der Mechanismus dieser DZ-basierten Impfung untersucht werden, wobei modifizierte Impfstoff-Ansätze zum Einsatz kommen sollten. Dabei wurden die Fragen nach der vom Impfstoff transportierten Information und dem Empfänger dieser Information berücksichtigt. Das aktuelle Paradigma zur DZ-basierten Impfung besagt, dass transferierte DZ im direkten Kontakt mittels dreier Signale T-Zellen stimulieren und aktivieren. Dafür müssen diese DZ mit dem entsprechenden Antigen beladen und aktiviert worden sein um das Antigen-Peptide mittels MHC Molekül im Kontext der Co-Stimulation präsentieren zu können. Jedoch zeigt diese Studie hier, dass weder eine Aktivierung der DZ noch die Präsentation des Antigens mittels passender MHC Moleküle notwendig ist für die Induktion einer protektiven Immunantwort gegen Leishmania Parasiten. Aufgeschlossene, mit Antigen beladene DZ müssen nicht vor dem Transfer mit CpG ODN aktiviert worden sein, um entsprechende Immunität zu verleihen. Ebenso hat der MHC Typ in diesem Falle auch keinen Einfluss auf die Effektivität des Impfstoffs. Da im Weiteren aufgeschlossene mit Leishmania-Antigen beladene Makrophagen nach Impfung die gleiche Wirkung erzielen, wie vorangegangene DZ-basierte Impfstoffe, können keine DZ spezifischen Mechanismen Schlüsselkomponenten der Induktion einer protektiven Immunität sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die DZ der geimpften Mäuse, eine maßgebliche Rolle bei der Verarbeitung transferierter Signale spielen. Suspensionen aufgeschlossener DZ stellen eine Kombination aus freigesetzten löslichen Molekülen sowie Membranvesikeln dar, die sich nach dem Aufschluss gebildet haben. Nach Auftrennung dieser beiden Fraktionen konnte gezeigt werden, dass ausschließlich die Membran-Fraktion nach Verimpfung eine geeignete Immunantwort zum Schutz vor Leishmania Parasiten induzieren kann. Als Vorteil dieser Aufreinigung erweist sich zudem die stabile Lagermöglichkeit bei -80°C. Somit ist klar gezeigt, dass die Immunität-verleihende Einheit dieser Impfstoffvarianten in der Membran-Fraktion liegt. Verfolgt man die Induktion Th1-zugehöriger Zytokine in in vivo Experimenten so ergibt sich im Falle der Gesamtsuspension aufgeschlossener, mit Leishmania-Antigen beladener DZ ein klares Bild. Diese Suspension erzeugt das volle Spektrum der DZ-basierten Impfung gegen Leishmania Parasiten. Es kann sowohl Produktion von IL-12 und IL-2 als auch eine antigenspezifische T-Zell Proliferation nach Stimulation von Splenozyten mit der entsprechenden Suspension verzeichnet werden. Außerdem produzieren Splenozyten von entsprechend geimpften Mäusen nach Stimulation mit Leishmania-Antigen erhebliche Mengen des entscheidenden Zytokins IFNγ. Obwohl jedoch die Verimpfung aufgereinigter Membranvesikel dieses Ansatzes im Tierversuch zu biologisch sowie statistisch signifikanten Ergebnissen führt, lassen sich die entsprechend Th1-bezogenen Zytokine im in vivo Ansatz nur in geringen Maße nachweisen. Ob dies jedoch für einen in vivo unbemerkten Aktivitätsverlust des Vakzins oder für andere lymphatische Organe als Ort der T-Zell Instruktion spricht, ist noch unbekannt und muss noch geklärt werden. N2 - Dendritic cell-based vaccination is a well established technique for preventive and therapeutic instruction of the immune system where conservative vaccine formulations fail to cure or prevent diseases, respectively. Efficiency of this technique already was demonstrated in infectious diseases as well as for cancer in animal or human studies. Well controlled manipulation and antigen-loading of immature DC is most beneficial to this technique. But, time-consuming and cost-extensive procedures for preparation of DC precursors, expansion and stimulation of DC and inpatient administration are big disadvantages regarding vaccine development for pandemic infectious diseases that occur mainly in underdeveloped countries. Therefore vaccines are needed that are pathogen-tailored and able to induce equal immune responses as their DC-based vaccine models. For vaccination against Leishmania parasites such a DC-based vaccine is feasible and its efficacy to induce protective Th1-based immune responses was already demonstrated in several animal studies. But, one of our own studies indicated supportive activity of host cells exceeding the allocation of T cells to become activated by transferred DC. IL-12, an important cytokine for the induction of Th1-related immune responses, has to be produced by host cells. Therefore, the aim of this study was to investigate the mechanism of BMDC-based vaccination with regard to simplification of the vaccine formulation. Key questions that have been addressed are: Which cells process the information that is transferred by the injected DC and what are the key components of this information? Further more, it was looked at whether altered vaccine formulations are able to induce protective immunity and whether they share equal molecular mechanisms. The current paradigm of BMDC-based vaccination proposes direct interaction of transferred BMDC with host T cells. These BMDC have to be antigen-loaded for stimulation via antigen-peptide-MHC molecule-complexes and they have to be activated for proper co-stimulation of T cells. Here, this study demonstrates that neither activation for co-stimulation nor direct interaction with adequate MHC molecules is needed for the induction of protective immunity against infection with Leishmania-parasites. Disrupted antigen-loaded BMDC are able to induce protective immunity in BALB/c mice without pre-stimulation via CpG ODN. Beyond, if BMDC were used with a different MHC-background than recipient mice then the vaccine still would be efficient in terms of reduction of footpad swelling and parasite load in draining lymph nodes. Even more, DC-specific features are no key component that leads to protective immunity as vaccination with disrupted antigen-loaded MΦ shows equal properties than before mentioned vaccine formulations. Further more, it was found that host DC play a major role in transforming the incoming signal, received from transferred antigen-loaded DC, into Th1-related stimuli and Leishmania-antigen-specific T cell activation. Suspensions of disrupted antigen-loaded DC resemble a combination of laid off soluble molecules together with exosome-like vesicles that formed after disruption of membranes. Here it was shown that separation of the membranous and soluble fractions and subsequent transfer into BALB/c mice will lead to protection of these mice against infection with L. major promastigotes only if the membranous fraction is used as vaccine. More, this vaccine formulation takes advantage of easy storage at -80°C with no need of fresh production. This clearly demonstrates that the immunity-inducing principle of disrupted DC-based vaccination lies within the membrane enclosed fraction. On a molecular level, disrupted antigen-loaded DC induce Th1-related cytokines during vaccination and as response on pathogen encounter. In vivo assays revealed IL-12 production and antigen-specific T cell proliferation among splenocytes that were stimulated with disrupted antigen-loaded DC. Splenocytes of accordingly vaccinated mice produce tremendous amounts of IFNγ after stimulation with Leishmania parasites. In summary, disrupted antigen-loaded BMDC fulfil all characteristics of DC-based vaccination against Leishmania major. But, while purification of membranes of antigen-loaded DC and subsequent transfer to BALB/c mice leads to control of the disease in the animal model, only slight levels of Th1-related cytokines are seen in the in vivo assays. Whether this points towards a loss of vaccine activity on unseen levels or unknown sites where Th1-related immunity is induced by both, complete solution and purified membranes, still has to be determined. KW - Leishmania major KW - Immunsystem KW - Impfung KW - Dendritische Zelle KW - Makrophage KW - Interferon KW - Interleukin 12 KW - Leishmania KW - Immunologie KW - Dendritic cell Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74865 ER - TY - THES A1 - Gerold, Kay T1 - CTLA4 and CLEC16A in Type 1 Diabetes - Looking behind the association T1 - CTLA4 und CLEC16A in Typ 1 Diabetes - Ein Blick hinter die Assoziation N2 - Type 1 diabetes is an autoimmune disease that leads to the destruction of insulin-producing pancreatic beta cells and consequently to hyperglycemia. In the last 60 years, the prevalence of type 1 diabetes has been increasing constantly and is predicted to continue rising. About 80% of the disease risk is attributable to the genetic variation. Thanks to genome wide association studies the number of known disease-associated polymorphisms climbed from five to 53 in the last 10 years. As these studies reveal possible candidate genes but not underlying mechanisms we strove to take the next step and explore the association of two genes suggested by these studies with type 1 diabetes. As a method of choice we decided to use lentiviral RNAi in non obese diabetic (NOD) mice, a widely-used model for type 1 diabetes, introducing a shRNA directed against the target message into the genome of this mouse strain via a lentivirus. This allowed us to study the partial loss-of-function of the target gene within the context of diabetes, directly seeing its effect on autoimmune mechanisms. In this thesis we examined two different genes in this manner, Ctla4 and Clec16a. A type 1 diabetes associated polymorphism in the CTLA4 gene had been found to alter the splicing ratio of its variants soluble CTLA-4 (sCTLA-4) and full length CTLA-4, the associated allele producing less sCTLA-4 than the protective allele. We mimicked this effect by specifically targeting the sCtla4 mRNA via lentiviral RNAi in the NOD model. As a result we could confirm the reduction of sCTLA-4 to accelerate type 1 diabetes development. Furthermore we could show a function of sCTLA-4 in regulatory T cells, more specifically at least partly in their ability to modulate costimulation by antigen presenting cells. The second candidate gene, Clec16a was targeted with the shRNA in a way that was designed to knock down most splice variants. As the gene function and the effect of the associated SUMMARY 10 polymorphism was unknown, we reasoned this method to be feasible to investigate its role in type 1 diabetes. The knockdown of Clec16a in NOD mice resulted in an almost complete protection from diabetes development that could be attributed to T cells dysfunction. However, as expression patterns and a study of the Drospophila orthologue suggested a possible role of CLEC16A in antigen presentation we also examined antigen presenting cells in the thymus and periphery. Although we did not detect any effect of the knockdown on peripheral antigen presenting cells, thymic epithelial cells were clearly affected by the loss of CLEC16A, rendering them more activated and shifting the ratio of cortical to medullary epithelial cells in favor of cortical cells. We therefore suggest a role of CLEC16A in the selection of T cells, that needs, however, to be further investigated. In this thesis we provided a feasible and fast method to study function of genes and even of single splice variants within the NOD mouse model. We demonstrate its usefulness on two candidate genes associated with type 1 diabetes by confirming and unraveling the cause of their connection to the disease. N2 - Typ 1 Diabetes ist eine Autoimmunerkrankung, bei der es zur Zerstörung von pankreatischen beta-Zellen und daraus folgend zu einer Hyperglykämie kommt. In den letzten 60 Jahren stieg die Diabetes Prävalenz stetig an und Studien sagen voraus, dass sich dieser Trend in Zukunft noch stärker fortsetzen wird. Man geht davon aus, dass ca. 80% des Erkrankungsrisikos für autoimmunen Diabetes genetischer Natur sind. Dank Genom-weiter Assoziationsstudien wurde dieser Beitrag gerade in den letzten zehn Jahren immer weiter aufgeklärt und bis heute wurden 53 mit Typ 1 Diabetes assozierte Polymorphismen identifiziert. Da diese Studien es nur leisten können, mögliche Kandidatengene aufzuzeigen, allerdings keine Aussagen über die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen machen können, haben wir es uns zum Ziel gesetzt diesen nächsten Schritt zu gehen und zwei der durch diese Studien vorgeschlagenen Gene auf ihre Rolle in der Typ 1 Diabetes Ätiologie zu untersuchen. Unsere Methode der Wahl war die lentivirale RNA Interferenz im Mausmodell der nonobese diabetic mouse (NOD). Via lentiviralen Vektoren wird die Information für eine shRNA, die an die mRNA des Zielgenes bindet, in das Empfängergenom integriert. Die daraus folgende Herabregulierung der Ziel-mRNA erlaubt es uns den Effekt dieser fehlenden Geninformation auf die Immunregulation zu analysieren. Auf diese Weise wurden in dieser Thesis zwei Kandidatengene untersucht, Ctla4 und Clec16a. Der mit Typ 1 Diabetes assoziierte Polymorphismus im CTLA4 Gen verursacht eine Verschiebung im Splice Verhältnis der beiden Isoformen im Menschen, soluble CTLA-4 (sCTLA-4) und full length CTLA-4, zu Gunsten der full length Variante. Im NOD Mausmodell konnte diese Verschiebung durch eine Einführung einer gegen sCtla4 gerichteten shRNA nachgeahmt werden. In Folge dessen konnten wir bestätigen, dass eine eduzierung der sCTLA-4 Variante die Typ 1 Diabetes Entwicklung beschleunigt. Zudem ZUSAMMENFASSUNG 12 konnten wir eine Rolle von sCTLA-4 in der Funktion von regulatorischen T Zellen, genauer in deren Fähigkeit die Kostimulation durch Antigen präsentierenden Zellen zu modulieren, zeigen. Bei dem zweiten Gen, das in dieser Thesis untersucht wurde handelte sich um Clec16a. Es wurde von einer shRNA herunterreguliert, die den Großteil der Varianten abdeckt, da die Funktion des Genes, sowie die Auswirkungen des assoziierten Polymorphismus unbekannt waren. Der Knockdown von Clec16a in der NOD Maus verursachte einen fast vollständigen Schutz vor Diabetes, der im weiteren Verlauf den T Zellen zugerechnet werden konnte. Allerdings hatten das Expressionsmuster, sowie eine Studie am Drosophila Ortholog ema eine Rolle von CLEC16A in Antigen präsentierenden Zellen impliziert. Folglich untersuchten wir die Möglichkeit, dass diese Zellgruppe in der Peripherie oder im Thymus durch den CLEC16A Mangel beeinträchtigt sein könnten. Tatsächlich wies die Zellgruppe, die im Thymus für die Selektion von T Zellen zuständig ist einen erhöhten Aktivierungsstatus auf, was auf eine modifizierte T Zell Selektion hindeuten könnte. Mit dieser Arbeit konnten wir eine praktikable und schnelle Methode, für die funktionelle Analyse von Genen und sogar einzelnen Splice Varianten, aufzeigen. Wir konnten ihren Nutzen weiterhin an zwei mit Typ 1 Diabetes assoziierten Kandidatengenen unter Beweis stellen, indem wir so die Assoziation bestätigen und Licht auf die zugrunde liegenden Mechanismen werfen konnten. KW - Diabetes mellitus KW - Typ 1 KW - Molekulargenetik KW - Type 1 Diabetes Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66617 ER -