TY - THES A1 - Weigl, Franziska T1 - Correlation of FluidFM® Technology and Fluorescence Microscopy for the Visualization of Cellular Detachment Steps T1 - Korrelation der FluidFM® Technologie und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von zellulären Ablöseschritten N2 - This thesis aimed the development of a correlated device which combines FluidFM® with Fluorescence Microscopy (FL) (FL-FluidFM®) and enables the simultaneous quantification of adhesion forces and fluorescent visualization of mature cells. The implementation of a PIFOC was crucial to achieve a high-resolution as well as a stable but dynamic focus level. The functionality of SCFS after hardware modification was verified by comparing two force-curves, both showing the typical force progression and measured with the optimized and conventional hardware, respectively. Then, the integration of FL was examined by detaching fluorescently labeled REF52 cells. The fluorescence illumination of the cytoskeleton showed the expected characteristic force profile and no evidence of interference effects. Afterwards a corresponding correlative data analysis was addressed including manual force step fitting, the identification of visualized cellular unbinding, and a time-dependent correlation. This procedure revealed a link between the area of cytoskeletal unbinding and force-jumps. This was followed by a comparison of the detachment characteristics of intercellular connected HUVECs and individual REF52 cells. HUVECs showed maximum detachment forces in the same order of magnitude as the ones of single REF52 cells. This contrasted with the expected strong cohesiveness of endothelial cells and indicated a lack of cell-cell contact formation. The latter was confirmed by a comparison of HUVECs, primary HBMVECs, and immortalized EA.hy926 cells fluorescently labeled for two marker proteins of intercellular junctions. This unveiled that both the previous cultivation duration and the cell type have a major impact on the development of intercellular junctions. In summary, the correlative FL FluidFM® represents a powerful novel approach, which enables a truly contemporaneous performance and, thus, has the potential to reveal new insights into the mechanobiological properties of cell adhesion. N2 - Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines korrelierten Gerätes, das FluidFM® mit Fluoreszenzmikroskopie (FL) kombiniert (FL-FluidFM®) und die gleichzeitige Quantifizierung von Adhäsionskräften und Fluoreszenzvisualisierung ausgereifter Zellen ermöglicht. Die Implementierung eines PIFOC war entscheidend, um eine hohe Auflösung sowie ein stabiles, aber dynamisches Fokusniveau zu erreichen. Die Funktionalität der SCFS nach der Hardwaremodifikation wurde durch den Vergleich zweier Kraftkurven verifiziert, die beide den typischen Kraftverlauf zeigten und jeweils mit der optimierten bzw. konventionellen Hardware gemessen wurden. Anschließend wurde die Integration von FL durch das Ablösen fluoreszenzmarkierter REF52-Zellen untersucht. Unter Fluoreszenzbeleuchtung des Zytoskeletts zeigte sich das erwartete charakteristische Kraftprofil und kein Hinweis auf Störeffekte. Anschließend wurde eine entsprechende korrelative Datenanalyse durchgeführt, die eine manuelle Kraftstufenanpassung, die Identifizierung der visualisierten zellulären Ablösung und eine zeitabhängige Korrelation umfasste. Dieses Verfahren ergab einen Zusammenhang zwischen dem Bereich der Zytoskelett-Ablösung und den Kraftsprüngen. Es folgte ein Vergleich der Ablösungseigenschaften von interzellulär verbundenen HUVECs und einzelnen REF52-Zellen. HUVECs zeigten maximale Ablösekräfte in der gleichen Größenordnung wie die von einzelnen REF52-Zellen. Dies stand im Gegensatz zu der erwarteten starken Kohäsion von Endothelzellen und deutete auf eine fehlende Zell-Zell-Kontaktbildung hin. Letzteres wurde durch einen Vergleich von HUVECs, primären HBMVECs und immortalisierten EA.hy926-Zellen bestätigt, die für zwei Markerproteine für interzelluläre Verbindungen fluoreszierend markiert wurden. Dabei zeigte sich, dass sowohl die vorherige Kultivierungsdauer als auch der Zelltyp einen großen Einfluss auf die Entwicklung von interzellulären Verbindungen haben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das korrelative FL-FluidFM® einen leistungsstarken neuen Ansatz darstellt, der eine korrelative Durchführung ermöglicht und somit das Potenzial hat, neue Erkenntnisse über die mechanobiologischen Eigenschaften der Zelladhäsion zu liefern KW - Correlative microscopy KW - FluidFM KW - Fluorescence Microscopy KW - Cell adhesion KW - Korrelative Mikroskopie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298763 ER - TY - THES A1 - Klitsch, Alexander T1 - Corneal and cutaneous factors contributing to small fiber pathology in fibromyalgia syndrome T1 - Untersuchung cornealer und kutaner Faktoren im Rahmen der Kleinfaserpathologie beim Fibromyalgie-Syndrom N2 - We examined 143 patients suffering from FMS, a syndrome characterized by chronic widespread pain, sleep disturbances, and fatigue. Etiology and pathophysiology of FMS are scarcely understood. In recent years abnormalities of small Aδ- and C-nerve fibers have been found in subgroups of FMS patients. It is yet unclear how such SFP is caused in FMS patients and how it contributes to FMS symptoms. We used CCM to analyze corneal small nerve fibers and associated LC, comparing FMS patients’ results to those from 65 healthy controls and 41 disease controls suffering from SFN. We, further, assessed expression levels of mRNA and miRNA in keratinocytes taken from skin punch biopsies of FMS patients and healthy controls kept as monocellular cell cultures. A screening was performed using NGS in a small cohort of 12 FMS patients and 5 healthy controls. Results were validated in larger cohorts by qRT-PCR. As in previous studies IENFD and CNFD were reduced in a subgroup of FMS patients. We found identical LC densities in FMS patients, healthy controls, and SFN patients. The subpopulation of dLCfiber contact in FMS and SFN patients was lower than in healthy controls. Our RNA expression analysis revealed one mRNA that was expressed higher in FMS patients than in controls: PRSS21. We conclude that reduced neurotrophic signaling of LC may contribute to SFP in the cornea. Epidermal PRSS21 expression and dLCfiber contact density are promising biomarker candidates for FMS diagnosis. N2 - Wir untersuchten 143 PatientInnen mit FMS, einem chronischen Schmerzsyndrom mit bislang kaum verstandener Ätiologie und Pathophysiologie. In den letzten Jahren wurden bei Subgruppen von FMS-PatientInnen Pathologien der sogenannten small fibers nachgewiesen. Wie diese entstehen oder zu den Symptomen des FMS beitragen ist noch unklar. Wir untersuchten corneale Nerven und assoziierte LC mittels CCM und verglichen die Ergebnisse der FMS PatientInnen mit denen von 65 gesunden Kontrollen und 41 SFN Patientinnen. Weiterhin untersuchten wir die mRNA und miRNA Expression in Keratinozyten aus Hautstanzbiopsien von FMS PatientInnen und gesunden Kontrollen, die isoliert in Zellkultur genommen wurden. Mittels NGS wurde ein mRNA/miRNA-Screening in einer kleinen Kohorte von 12 PatientInnen und 5 Kontrollen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mittels qRT-PCR in einer größeren Gruppe validiert. Wie in vorausgegangenen Studien waren IENFD und CNFD bei FMS PatientInnen-Subgruppen reduziert. Die Dichte an LC war bei FMS und SFN PatientInnen sowie gesunden Kontrollen identisch. Die Subpopulation der dLCfiber contact war bei FMS und SFN PatientInnen niedriger als bei gesunden Kontrollen. Eine mRNA, PRSS21, wurde bei FMS PatientInnen stärker als bei Kontrollen exprimiert. Wir schlussfolgern, dass eine Reduktion neurotropher Signale durch LC zur Kleinfaserpathologie bei FMS beitragen könnte. Epidermale PRSS21-Expression und dLCfiber contact Dichte stellen vielversprechende Kandidaten für Biomarker zur FMS-Diagnose dar. KW - Fibromyalgie KW - Hornhaut KW - small fiber pathology KW - fibromyalgia sydrome KW - corneal confocal microscopy KW - Langerhans cells Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-224398 ER - TY - THES A1 - Dabas, Neelam T1 - Control of Nitrogen Regulated Virulence Traits of the Human Fungal Pathogen Candida albicans T1 - Steuerung von stickstoffregulierten Virulenzeigenschaften des human-pathogenen Pilzes Candida albicans N2 - Der Hefepilz Candida albicans ist ein harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten des Gastrointestinal- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Bei einer Störung der natürlichen Mikroflora oder des Wirtsimmunsystems kann der Pilz jedoch auch oberflächliche und sogar systemische Infektionen verursachen. C. albicans weist eine Reihe von Eigenschaften auf, die zur Virulenz des Erregers beitragen. Dazu gehören die Adhärenz an unterschiedliche Wirtsoberflächen, die morphologische Variabilität des Pilzes und die Sekretion von Aspartatproteasen. Die Expression vieler dieser Virulenzfaktoren wird unter anderem durch die Verfügbarkeit von Stickstoff reguliert. Unter Stickstoffmangelbedingungen wechselt C. albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum filamentösen Wachstum, und dieser Wechsel wird durch die Ammoniumpermease Mep2p reguliert. Wie die Induktion des filamentösen Wachstums durch Mep2p kontrolliert wird, ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsanalyse von Mep2p durchgeführt, um Aminosäuren zu identifizieren, die an der Signalfunktion dieser Permease beteiligt sind. Die C-terminale cytoplasmatische Domäne von Mep2p wird für den Ammoniumtransport nicht benötigt, ist jedoch essentiell für die Signaltransduktion. Progressive C-terminale Verkürzungen von Mep2p zeigten, dass ein MEP2DC433-Allel immer noch in der Lage war, das filamentöse Wachstum zu induzieren, wohingegen die Deletion einer weiteren Aminosäure die Morphogenese blockierte. Das Tyrosin an Position 433 (Y433) ist deshalb die letzte Aminosäure, die für die Signalfunktion von Mep2p essentiell ist. Um besser zu verstehen, wie die Signalaktivität von Mep2p durch die Verfügbarkeit und den Transport von Ammonium reguliert wird, wurden verschiedene hochkonservierte Aminosäuren mutiert, die vermutlich an der Bindung oder dem Transport von Ammonium in die Zelle beteiligt sind. Die Mutation von D180, von dem postuliert wurde, dass es den initialen Kontakt mit extrazellulärem Ammonium ermöglicht, oder der im Transportkanal lokalisierten Histidine H188 und H342 hatte zur Folge, dass Mep2p nicht mehr exprimiert wurde, so dass diese Aminosäuren vermutlich für die Proteinstabilität wichtig sind. Die Mutation von F239, das zusammen mit F126 eine extracytosolische Pforte zur Transportpore bildet, verhinderte trotz korrekter Membranlokalisation sowohl den Ammoniumtransport als auch das filamentöse Wachstum. Allerdings führte auch die Mutation von W167, das vermutlich zusammen mit Y122, F126 und S243 an der Rekrutierung des Ammoniumions an der extrazellulären Seite der Membran beteiligt ist, zur Blockierung des filamentösen Wachstums, obwohl der Ammoniumtransport kaum beeinflusst war. Dies zeigte, dass die intrazelluäre Signaltransduktion durch extrazelluläre Veränderungen in Mep2p beeinflusst werden kann. Die Mutation von Y122 reduzierte die Ammoniumaufnahme weitaus starker als die Mutation von W167, erlaubte jedoch immer noch ein effizientes filamentöses Wachstum. Die Signalaktivität von Mep2p ist deshalb offensichtlich nicht direkt mit der Transportaktivität des Proteins korreliert. Ein wichtiger Aspekt in der Fähigkeit von Mep2p, die Morphogenese zu stimulieren, ist die vergleichsweise starke Expression des Proteins. Um die Regulation der MEP2-Expression aufzuklären, wurden die cis-regulatorischen Sequenzen und die trans-aktivierenden Faktoren, die die MEP2-Induktion unter Stickstoffmangel vermitteln, identifiziert. Eine Promotoranalyse zeigte, dass zwei mutmaßliche Bindungsstellen für GATA-Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle in der MEP2-Expression haben, da die Deletion oder Mutation dieser GATAA-Sequenzen die Expression von MEP2 stark reduzierte. Um die Rolle der GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p bei der Regulation der MEP2-Expression zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die entsprechenden Gene deletiert waren. Die Expression von Mep2p war in gln3D und gat1D Einzelmutanten stark verringert und in gln3D gat1D Doppelmutanten nicht mehr nachweisbar. Die Deletion von GLN3 hatte auch eine starke Reduktion des filamentösen Wachstums zur Folge, die durch die konstitutive Expression von MEP2 unter Kontrolle des ADH1-Promotors aufgehoben wurde. Dagegen hatte die Deletion von GAT1 keinen Einfluss auf das filamentöse Wachstum. Überraschenderweise war das filamentöse Wachstum in den gat1D Mutanten teilweise unabhängig von Mep2p, was darauf hinwies, dass in Abwesenheit von GAT1 andere Signalwege aktiviert werden, die die Morphogenese stimulieren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p die Expression der Ammoniumpermease MEP2 kontrollieren und dass Gln3p auch ein wichtiger Regulator des durch Stickstoffmangel induzierten filamentösen Wachstums von C. albicans ist. Mutanten, in denen die beiden GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p fehlten, waren nicht mehr in der Lage, in einem Medium zu wachsen, das bovines Serumalbumin (BSA) als einzige Stickstoffquelle enthält. Die Fähigkeit von C. albicans, Proteine als einzige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden, wird durch die sekretierte Aspartatprotease Sap2p, die die Proteine zu Peptiden abbaut, und durch Oligopeptidtransporter, die diese Peptide in die Zelle aufnehmen, vermittelt. Der Wachstumsdefekt der gln3D gat1D Doppelmutanten war hauptsächlich durch einen Defekt in der SAP2-Expression verursacht, da die Expression von SAP2 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors die Fähigkeit zum Wachstum auf BSA wieder herstellte. Es zeigte sich, dass Gln3p und Gat1p die Expression des Transkriptionsfaktors STP1, der für die Induktion von SAP2 in Gegenwart von Proteinen notwendig ist, regulieren. Bei einer Expression von STP1 unter Kontrolle des induzierbaren Tet-Promotors waren Gln3p und Gat1p nicht mehr notwendig für das Wachstum auf Proteinen. Wenn bevorzugte Stickstoffquellen verfügbar sind, wird SAP2 auch in Gegenwart von Proteinen reprimiert, und diese Stickstoff-Katabolitrepression korrelierte mit einer reduzierten STP1-Expression. Die Expression von STP1 unter Kontrolle des Tet-Promotors hob diese Repression auf, was zeigte, dass die Regulation der STP1-Expression durch die GATA-Transkriptionsfaktoren eine Schlüsselrolle sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Kontrolle der SAP2-Expression spielt. Eine regulatorische Kaskade, in der die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors Stp1p durch die allgemeinen Regulatoren Gln3p und Gat1p kontrolliert wird, stellt die Expression von SAP2 in C. albicans deshalb unter Stickstoffkontrolle und gewährleistet eine angepasste Expression dieses Virulenzfaktors. Die Ergebnisse dieser Arbeit illustrieren, dass die GATA-Faktoren Gln3p und Gat1p zum Teil überlappende aber auch spezifische Funktionen in der Anpassung von C. albicans an die Verfügbarkeit verschiedener Stickstoffquellen haben. Diese Anpassungsmechanismen spielen auch eine Rolle in der Pathogenität des Pilzes, wobei die relative Bedeutung von Gln3p und Gat1p vom Zielgen und der Stickstoffquelle abhängt. Diese Erkenntnisse geben einen vertieften Eiblick in die molekularen Grundlagen der Anpassung von C. albicans an unterschiedliche Umweltbedingungen. N2 - The yeast Candida albicans is a member of the normal microflora on the mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in healthy persons. However, it is an opportunistic pathogen that can cause a range of infections from superficial to disseminated, in response to perturbation of the normal microflora or alterations in the host immunity. C. albicans exhibits a variety of characteristics such as adhesion, morphogenetic switching and secreted aspartic protease production that contribute to its virulence. Expression of many of these virulence factors is controlled by the availability of essential element, nitrogen. C. albicans undergoes morphogenetic transition to form filaments under nitrogen starvation conditions and this switch is controlled by the ammonium permease Mep2p. However, little is known about how this signaling function of Mep2p is regulated. Mutational analysis of Mep2p was carried out to identify the residues that confer signaling activity to this permease. The C-terminal cytoplasmic tail of Mep2p contains a signaling domain that is dispensable for ammonium transport but essential for the signaling activity of Mep2p. In this work, progressive C-terminal truncations analysis demonstrated that a MEP2DC433 allele was still able to induce filamentation while nitrogen starvation-induced filamentous growth was abolished in cells expressing a MEP2DC432 allele. Therefore, tyrosine at position 433 (Y433) is the last amino acid in Mep2p that is essential for signaling. To gain insights into how the signaling activity of Mep2p is regulated by ammonium availability and transport, conserved residues that have been implicated in ammonium binding or uptake were mutated. Mutation of D180, which has been proposed to mediate initial contact with extracellular ammonium, or the pore-lining residues H188 and H342 abolished Mep2p expression, indicating that these residues are important for protein stability. Mutation of F239, which together with F126 is predicted to form an extracytosolic gate to the conductance channel, abolished both ammonium uptake and Mep2p-dependent filamentation, despite proper localization of the protein. On the other hand, mutation of W167, which is assumed to participate along with Y122, F126, and S243 in the recruitment and coordination of the ammonium ion at the extracytosolic side of the cell membrane, also abolished filamentation without having a strong impact on ammonium transport, demonstrating that extracellular alterations in Mep2p can affect intracellular signaling. Mutation of Y122 reduced ammonium uptake much more strongly than mutation of W167 but still allowed efficient filamentation, indicating that the signaling activity of Mep2p is not directly correlated with its transport activity. An important aspect in the ability of Mep2p to stimulate filamentation in response to nitrogen limitation is its high expression levels. The cis-acting sequences and trans-acting regulators that mediate MEP2 induction in response to nitrogen limitation were identified. Promoter analysis revealed that two putative binding sites for GATA transcription factors have a central role in MEP2 expression, as deletion of the region containing these sites or mutation of the GATAA sequences in the full-length MEP2 promoter strongly reduced MEP2 expression. To elucidate the roles of the GATA transcription factors GLN3 and GAT1 in regulating MEP2 expression, mutants lacking one or both of these transcription factors were constructed. Mep2p expression was strongly reduced in gln3D and gat1D single mutants and virtually abolished in gln3D gat1D double mutants. Deletion of GLN3 strongly inhibited filamentous growth under limiting nitrogen conditions, which could be rescued by constitutive expression of MEP2 from the ADH1 promoter. In contrast, inactivation of GAT1 had no effect on filamentation. Surprisingly, filamentation became partially independent of the presence of a functional MEP2 gene in the gat1D mutants, indicating that the loss of GAT1 function results in the activation of other pathways that induce filamentous growth. These findings demonstrated that the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p control expression of the MEP2 ammonium permease and that GLN3 is also an important regulator of nitrogen starvation-induced filamentous growth in C. albicans. C. albicans mutants lacking both the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p were unable to grow in a medium containing an alternative nitrogen source, bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source. The ability to utilize proteins as sole source of nitrogen for growth of C. albicans is conferred by the secreted aspartic protease Sap2p, which degrades the proteins, and oligopeptide transporters that mediate uptake of the proteolytic products into cell. The growth defect of gln3D gat1D mutants was mainly caused by their inability to express the SAP2 gene, as SAP2 expression from the constitutive ADH1 promoter restored the ability of the mutants to grow on BSA. Expression of STP1, which encodes a transcription factor that is required for SAP2 induction in the presence of proteins, was regulated by Gln3p and Gat1p. Forced expression of STP1 from a tetracycline-inducible promoter bypassed the requirement of the GATA transcription factors for growth of C. albicans on proteins. When preferred nitrogen sources are available, SAP2 is repressed and this nitrogen catabolite repression of SAP2 was correlated with downregulation of STP1 under these conditions. Tetracycline-induced STP1 expression abolished nitrogen catabolite repression of SAP2, demonstrating that regulation of STP1 expression levels by the GATA transcription factors is a key aspect of both positive and negative regulation of SAP2 expression. Therefore, by using a regulatory cascade in which expression of the specific transcription factor Stp1p is controlled by the general regulators Gln3p and Gat1p, C. albicans places SAP2 expression under nitrogen control and ensures proper expression of this virulence determinant. In summary, the present study illustrated how GATA factors, Gln3p and Gat1p, play partially overlapping, but distinct roles, in mediating the appropriate responses of C. albicans to the availability of different nitrogen sources. These responses are also determinants of pathogenicity of the fungus. The relative contributions of Gln3p and Gat1p vary with their target genes and the availability of nitrogen source. Overall, these findings provide us with a better understanding of the molecular basis of some of the important processes that help in adaptation of C. albicans to various environmental conditions. The yeast Candida albicans is a member of the normal microflora on the mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in healthy persons. However, it is an opportunistic pathogen that can cause a range of infections from superficial to disseminated, in response to perturbation of the normal microflora or alterations in the host immunity. C. albicans exhibits a variety of characteristics such as adhesion, morphogenetic switching and secreted aspartic protease production that contribute to its virulence. Expression of many of these virulence factors is controlled by the availability of essential element, nitrogen. C. albicans undergoes morphogenetic transition to form filaments under nitrogen starvation conditions and this switch is controlled by the ammonium permease Mep2p. However, little is known about how this signaling function of Mep2p is regulated. Mutational analysis of Mep2p was carried out to identify the residues that confer signaling activity to this permease. The C-terminal cytoplasmic tail of Mep2p contains a signaling domain that is dispensable for ammonium transport but essential for the signaling activity of Mep2p. In this work, progressive C-terminal truncations analysis demonstrated that a MEP2DC433 allele was still able to induce filamentation while nitrogen starvation-induced filamentous growth was abolished in cells expressing a MEP2DC432 allele. Therefore, tyrosine at position 433 (Y433) is the last amino acid in Mep2p that is essential for signaling. To gain insights into how the signaling activity of Mep2p is regulated by ammonium availability and transport, conserved residues that have been implicated in ammonium binding or uptake were mutated. Mutation of D180, which has been proposed to mediate initial contact with extracellular ammonium, or the pore-lining residues H188 and H342 abolished Mep2p expression, indicating that these residues are important for protein stability. Mutation of F239, which together with F126 is predicted to form an extracytosolic gate to the conductance channel, abolished both ammonium uptake and Mep2p-dependent filamentation, despite proper localization of the protein. On the other hand, mutation of W167, which is assumed to participate along with Y122, F126, and S243 in the recruitment and coordination of the ammonium ion at the extracytosolic side of the cell membrane, also abolished filamentation without having a strong impact on ammonium transport, demonstrating that extracellular alterations in Mep2p can affect intracellular signaling. Mutation of Y122 reduced ammonium uptake much more strongly than mutation of W167 but still allowed efficient filamentation, indicating that the signaling activity of Mep2p is not directly correlated with its transport activity. An important aspect in the ability of Mep2p to stimulate filamentation in response to nitrogen limitation is its high expression levels. The cis-acting sequences and trans-acting regulators that mediate MEP2 induction in response to nitrogen limitation were identified. Promoter analysis revealed that two putative binding sites for GATA transcription factors have a central role in MEP2 expression, as deletion of the region containing these sites or mutation of the GATAA sequences in the full-length MEP2 promoter strongly reduced MEP2 expression. To elucidate the roles of the GATA transcription factors GLN3 and GAT1 in regulating MEP2 expression, mutants lacking one or both of these transcription factors were constructed. Mep2p expression was strongly reduced in gln3D and gat1D single mutants and virtually abolished in gln3D gat1D double mutants. Deletion of GLN3 strongly inhibited filamentous growth under limiting nitrogen conditions, which could be rescued by constitutive expression of MEP2 from the ADH1 promoter. In contrast, inactivation of GAT1 had no effect on filamentation. Surprisingly, filamentation became partially independent of the presence of a functional MEP2 gene in the gat1D mutants, indicating that the loss of GAT1 function results in the activation of other pathways that induce filamentous growth. These findings demonstrated that the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p control expression of the MEP2 ammonium permease and that GLN3 is also an important regulator of nitrogen starvation-induced filamentous growth in C. albicans. C. albicans mutants lacking both the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p were unable to grow in a medium containing an alternative nitrogen source, bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source. The ability to utilize proteins as sole source of nitrogen for growth of C. albicans is conferred by the secreted aspartic protease Sap2p, which degrades the proteins, and oligopeptide transporters that mediate uptake of the proteolytic products into cell. The growth defect of gln3D gat1D mutants was mainly caused by their inability to express the SAP2 gene, as SAP2 expression from the constitutive ADH1 promoter restored the ability of the mutants to grow on BSA. Expression of STP1, which encodes a transcription factor that is required for SAP2 induction in the presence of proteins, was regulated by Gln3p and Gat1p. Forced expression of STP1 from a tetracycline-inducible promoter bypassed the requirement of the GATA transcription factors for growth of C. albicans on proteins. When preferred nitrogen sources are available, SAP2 is repressed and this nitrogen catabolite repression of SAP2 was correlated with downregulation of STP1 under these conditions. Tetracycline-induced STP1 expression abolished nitrogen catabolite repression of SAP2, demonstrating that regulation of STP1 expression levels by the GATA transcription factors is a key aspect of both positive and negative regulation of SAP2 expression. Therefore, by using a regulatory cascade in which expression of the specific transcription factor Stp1p is controlled by the general regulators Gln3p and Gat1p, C. albicans places SAP2 expression under nitrogen control and ensures proper expression of this virulence determinant. In summary, the present study illustrated how GATA factors, Gln3p and Gat1p, play partially overlapping, but distinct roles, in mediating the appropriate responses of C. albicans to the availability of different nitrogen sources. These responses are also determinants of pathogenicity of the fungus. The relative contributions of Gln3p and Gat1p vary with their target genes and the availability of nitrogen source. Overall, these findings provide us with a better understanding of the molecular basis of some of the important processes that help in adaptation of C. albicans to various environmental conditions. KW - Transkriptionsfaktor KW - Candida albicans KW - Stickstoff KW - Stickstoffkontrolle KW - Ammoniumpermease KW - Sekretion von Aspartatproteasen KW - Candida albicans KW - ammonium permease KW - secreted aspartic protease KW - nitrogen regulation KW - transcription factor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29769 ER - TY - THES A1 - Upcin, Berin T1 - Contribution of vascular adventitia-resident progenitor cells to new vessel formation in \(ex\) \(vivo\) 3D models T1 - Der Beitrag der Gefäßwandadventitia-residenten Vorläuferzellen zur Neovaskularisation in \(ex\) \(vivo\) 3D Modellen N2 - Ongoing research to fight cancer, one of the dominant diseases of the 21st century has led to big progress especially when it comes to understanding the tumor growth and metastasis. This includes the discovery of the molecular mechanisms of tumor vascularization, which is critically required for establishment of tumor metastasis. Formation of new blood vessels is the first step in tumor vascularization. Therefore, understanding the molecular and cellular basis of tumor vascularization attracted a significant effort studying in biomedical research. The blood vessels for supplying tumor can be formed by sprouting from pre-existing vessels, a process called angiogenesis, or by vasculogenesis, that is de novo formation of blood vessels from not fully differentiated progenitor cell populations. Vasculogenic endothelial progenitor cells (EPCs) can either be activated from populations in the bone marrow reaching the pathological region via the circulation or they can be recruited from local reservoirs. Neovessel formation influences tumor progression, hence therapeutic response model systems of angiogenesis/vasculogenesis are necessary to study the underlying mechanisms. Although, initially the research in this area focused more on angiogenesis, it is now well understood that both angiogenesis and postnatal vasculogenesis contribute to neovessel formation in adult under both most pathological as well as physiological conditions. Studies in the last two decades demonstrate that in addition to the intimal layer of fully differentiated mature endothelial cells (ECs) and various smaller supplying vessels (vasa vasorum) that can serve as a source for new vessels by angiogenesis, especially the adventitia of large and medium size blood vessels harbors various vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SPCs) populations that serve as a source for new vessels by postnatal vasculogenesis. However, little is known about the potential role of VW-SPCs in tumor vascularization. To this end, the present work started first to establish a modified aortic ring assay (ARA) using mouse aorta in order to study the contribution of vascular adventitia-resident VW-SPCs to neovascularization in general and in presence of tumor cells. ARA is already established an ex vivo model for neovascularization allows to study the morphogenetic events of complex new vessel formation that includes all layers of mature blood vessels, a significant advantage over the assays that employ monolayer endothelial cell cultures. Moreover, in contrast to assays employing endothelial cells monocultures, both angiogenic and vasculogenic events take place during new vessel formation in ARA although the exact contribution of these two processes to new vessel formation cannot be easily distinguished in conventional ARA. Thus, in this study, a modified protocol for the ARA (mdARA) was established by either removing or keeping the aortic adventitia in place. The mdARA allows to distinguish the role of VW-SPCs from those of other aortic layers. The present data show that angiogenic sprouting from mature aortic endothelium was markedly delayed when the adventitial layer was removed. Furthermore, the network between the capillary-like sprouts was significantly reduced in absence of aortic adventitia. Moreover, the stabilization of new sprouts by assembling the NG2+ pericyte-like cells that enwrapped the endothelial sprouts from the outside was improved when the adventitial layer remained in place. Next, mimicking the tumor-vessel adventitia-interaction, multicellular tumor spheroids (MCTS) and aortic rings (ARs) with or without adventitia of C57BL/6-Tg (UBC-GFP) mice were confronted within the collagen gel and cultured ex vivo. This 3D model enabled analysis of the mobilization, migration and capillary-like sprouts formation by VW-SPCs within tumor-vessel wall-interface in comparison to tumor-free side of the ARs. Interestingly, while MCTS preferred the uptake of single vascular adventitia-derived cells, neural spheroids were directly penetrated by capillary-like structures that were sprouted from the aortic adventitia. In summary, the model established in this work allows to study new vessel formation by both postnatal vasculogenesis and angiogenesis under same conditions. It can be applied in various mouse models including reporter mouse models, e.g. Cxcr1 CreER+/mTmG+/- mice, in which GFP-marked macrophages of the vessel wall were directly observed as they mobilized from their niche and migrated into collagen gel. Another benefit of the model is that it can be used for testing different factors such as small molecules, growth factors, cytokines, and drugs with both pro- and anti-angiogenic/vasculogenic effects. N2 - Die Forschungsarbeiten der letzten Jahrzehnte zur Bekämpfung der Krebserkrankung, einer der dominierenden Krankheiten des 21. Jahrhunderts, haben zu großen Fortschritten, insbesondere im Verständnis bezüglich der Tumormetastasierung geführt. Dies schließt die Prozesse der Tumorvaskularisierung als einen der initialen Schritte der Metastasierung mit ein, die nach wie vor nicht ausreichend geklärt sind. Die Blutgefäßbildung zur Versorgung des Tumorgewebes kann durch die Anagiogenese, die als Einsprießen neuer Gefäße aus den bereits vorhandenen Blutgefäßen definiert wird, oder durch die Vaskulogenese, die als Gefäßneubildung aus Stamm- und Vorläuferzellen beschrieben wird, sichergestellt werden. Noch nicht vollständig ausdifferenzierte endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) werden dabei nach dem bisherigen Kenntnistand aus dem Knochenmark rekrutiert und erreichen die Regionen der Gefäßneubildung über die Blutzirkulation und können dort zur de novo Formierung neuer Blutgefäße auch beim Erwachsenen beitragen. Untersuchungen der letzten zwei Dekaden haben gezeigt, dass solche Vorläuferzellen auch aus lokalen Reservoiren, wie z.B. aus der Gefäßwandadventitia der bereits existierenden Blutgefäße mobilisiert werden. Da die Bildung neuer Gefäße einen direkten Einfluss auf die Tumorprogression hat, sind entsprechende Modellsysteme notwendig, um die zugrundeliegenden Mechanismen möglichst präzise zu untersuchen. Obwohl sich die Forschung der Tumorvaskularisierung zunächst auf Prozesse der Angiogenese konzentrierte, ist es mittlerweile ausreichend belegt, dass auch die Vaskulogenese zur Tumorvaskularisierung beiträgt und somit die Tumorprogression beeinflusst. Anhand einer Vielzahl an Studien der letzten zwei Jahrzehnte konnte demonstriert werden, dass sich, neben der Intimaschicht, die vollständig differenzierte Endothelzellen (ECs) enthält und kleineren Gefäßwand-versorgenden Blutgefäßen, der sogenannten Vasa vasorum in der Adventitia der großen Gefäße, auch Populationen gefäßwandresidenter Stamm- und Vorläuferzellen (VW-SPCs) in der äußeren Gefäßwandschicht, nämlich der Adventitia fast aller Gefäßabschnitte nachweisen lassen. Obwohl diese als Quelle neuer Gefäße in der postnatalen Vaskulogenese beschrieben sind, ist nach wie vor wenig über die potenzielle Rolle von VW-SPCs in der Tumorvaskularisation bekannt. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit zuerst ein modifiziertes Aortic Ringassay (ARA) unter Verwendung der Mausaorta etabliert, um den Beitrag der VW-SPCs zur Neovaskularisierung im Allgemeinen und zur Tumorvaskularisierung im Speziellen ex vivo untersuchen zu können. ARA ist ein bereits seit einigen Jahrzehnten etabliertes ex vivo Modell zur Untersuchung der Gefäßneubildung durch Angiogenese. Mittels ARA kann die Bildung komplexer vaskulärer Strukturen in Präsenz aller Wandschichten reifer Blutgefäße untersucht werden, was einen wesentlichen Vorteil gegenüber der Verwendung von Endothelzellkulturen in Monolayer bedeutet. Hierbei ist jedoch anzumerken, dass in ARA sowohl angiogene als auch vaskulogene Prozesse zur Gefäßbildung beitragen, aber der genaue Beitrag beider Prozesse schwer oder kaum voneinander unterscheidbar ist. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit ein modifiziertes ARA-Protokoll etabliert (mdARA), in welchem die aortale Adventitia vor dem Beginn des ARA entweder entfernt oder belassen wurde und somit die Rolle der VW-SPCs bei der Gefäßsprossung von den Zellen anderer Aortenwandschichten differenziert studiert werden konnte. Die dabei generierten Daten zeigen, dass sich die angiogene Aussprossung aus dem reifen Aortenendothel nach Entfernung der adventitialen Schicht deutlich verzögerte. Darüber hinaus war das Netzwerk zwischen den kapillarartigen Sprossen in Abwesenheit der Aortenadventitia signifikant reduziert. Mehr noch, das Belassen der adventitialen Wandstruktur führte zu einer verbesserten Stabilisierung neuer Gefäßsprossen. Als sichtbares Korrelat hierfür zeigte sich eine stärkere und bessere Anlagerung der NG2+ Perizyten-ähnlichen Zellen zu den endothelialen Kapillar-ähnlichen Aussprossungen von außen, wie Perizyten an der Kapillarwand in situ. Als nächstes wurden die Aortenringe (ARs) von C57BL/6-Tg (UBC-GFP)-Mäusen mit multizellulären Tumor-Sphäroiden (MCTS) in Kollagengel ko-kultiviert, um die Interaktion zwischen Tumor und Gefäßwand-Adventitia ex vivo nachzuahmen. Dieses 3D Modell ermöglichte die Analyse der Mobilisierung und Migration der VW-SPCs von der aortalen Adventitia sowohl zu der Tumorseite in den Tumor-Gefäßwand-Interfaces als auch zu der tumorfreien Seite der Aortenringe. Interessanterweise wurde die Kapillarsprossung im Tumor-Gefäßwand-Interface an der Grenze zum MCTS gestoppt und die VW-SPCs als Einzelzellen in die MCTS aufgenommen. Demgegenüber wurde auf der tumor-freien Seite der Aortenringe eine deutlich längere Kapillaraussprossung beobachtet. Im Gegensatz zu MCTS resultierte die Ko-Kultivierung der ARs mit neuronalen Spheroiden darin, dass die aus der aortalen Adventitia aussprossenden Kapillar-ähnlichen Strukturen direkt in die neuronalen Spheroide penetrierten. Zusammenfassend berücksichtigt dieses neuartige in vitro 3D-Modell sowohl Angiogenese als auch Vaskulogenese und bietet vielfältige Vorteile, wie zum Beispiel die Kompatibilität zu verschiedenen Mausmodellen einschließlich der Reporter-Mausmodelle, wie z.B. die in dieser Arbeit gezeigte Verwendung der Aorta von Cxcr1 CreER+/mTmG+/- um die GFP-markierten Makrophagen aus der Gefäßwand bei der Gefäßaussprossung studieren zu können. Des Weiteren ist dieses Model auch für Testung unterschiedlicher Faktoren und Therapeutika einschließlich der anti-angiogenen und -vasculogenen Substanzen unter ex vivo Bedingungen geeignet.   KW - Progenitor KW - Adventitia Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-255070 ER - TY - THES A1 - Glotzbach-Schoon, Evelyn T1 - Contextual fear conditioning in humans: The return of contextual anxiety and the influence of genetic polymorphisms T1 - Kontextuelle Furchtkonditionierung beim Menschen: die Wiederkehr von Kontextangst und der Einfluss von genetischen Polymorphismen N2 - Als Angst bezeichnet man einen nicht auf spezifische Objekte gerichteten länger anhaltenden zukunfts-orientierten Zustand der Besorgnis. Diese ist kennzeichnend für Angststörungen wie Panikstörung, generalisierte Angststörung und Posttraumatische Belastungsstörung (PTBS). Experimentell kann Angst durch kontextuelle Furchtkonditionierung ausgelöst werden. Bei dieser Art der Konditionierung werden aversive Ereignisse als unvorhersehbar erlebt, wodurch der gesamte Kontext mit der Gefahr assoziiert wird. Diese Arbeit hat zum Ziel, Mechanismen der Entstehung und Aufrechterhaltung von Kontextangst zu untersuchen. Dies sind zum einem erleichterte Akquisition von Kontextkonditionierungen und deren fehlerhafte Extinktion. Hier ist vor allem die Fragestellung relevant, wie dies durch genetische Varianten moduliert wird (Studie 1). Zum anderen soll die Wiederkehr der Angst nach der Extinktion mit einem neuen Reinstatement-Paradigma untersucht werden (Studie 2). Zur Untersuchung dieser Forschungsfragen wurden zwei kontextuelle Furchtkonditionierungsstudien in virtueller Realität (VR) durchgeführt. Während der Akquisition wurden leicht schmerzhafte elektrische Reize (unkonditionierter Stimulus, US) unvorhersehbar präsentiert, während die Probanden in einem virtuellen Büroraum waren. Dadurch wurde dieser Raum zum Angstkontext (CXT+). Ein zweiter Büroraum wurde nie mit dem US gepaart, deshalb wurde dieser Raum zum Sicherheitskontext (CXT-). Die Extinktion, in der die Kontexte ohne US präsentiert wurden, fand 24 h später statt, und ein Test zum Abruf der Extinktion bzw. zur Wiederkehr der Angst nochmals 24 h später. In beiden Studien wurde die Angst auf drei verschiedenen Ebenen gemessen: Verhalten (angstpotenzierter Schreckreflex), Physiologie (tonische Hautleitfähigkeit), und verbale Ebene (explizite Ratings). Die Probanden für Studie 1 wurden anhand der 5-HTTLPR (S+ Risikoallel vs. LL nicht-Risikoallel) und NPSR1 rs324981 (T+ Risikoallel vs. AA nicht-Risikoallel) Polymorphismen stratifiziert, sodass vier kombinierte Genotyp Gruppen (S+/T+, S+/LL, LL/T+ und LL/AA) mit je 20 Probanden vorlagen. Es zeigte sich, dass der angstpotenzierte Schreckreflex durch die Interaktion zwischen beiden genetischen Polymorphismen moduliert wurde. Nur Träger beider Risikoallele (S+ Träger des 5-HTTLPR und T+ Träger des NPSR1 Polymorphismus) zeigten einen höheren Schreckreflex im CXT+ als im CXT- während der Akquisition. Der Abruf der Extinktion an Tag 3, gemessen anhand des Schreckreflexes, wurde allerdings nicht durch die Genotypen moduliert. Interessanterweise zeigte sich auf dem expliziten Angstlevel (Valenz- und Angstratings) nur ein Einfluss des NPSR1 Polymorphismus, und zwar bewerteten die nicht-Risikoallel Träger (AA) den CXT+ mit negativerer Valenz und höherer Angst im Vergleich zum CXT-; die Risikoallel Träger (T+) taten dies nicht. In der zweiten Studie wurde fast das gleiche Paradigma benutzt wie in der ersten Studie mit der Ausnahme, dass eine Versuchsgruppe (Reinstatementgruppe) den US noch einmal am Anfang des dritten Untersuchungstages vor der Präsentation von CXT+ und CXT- appliziert bekam. Die zweite Versuchsgruppe (Kontrollgruppe) erhielt keinen US, sondern wurde direkt durch CXT+ und CXT- geführt. Es zeigte sich, dass nur in der Reinstatementgruppe die Angst auf impliziter und expliziter Ebene wiederkehrte, d.h. die Probanden zeigten einen höheren Schreckreflex und höhere Angstratings auf den CXT+ im Vergleich zum CXT-. Wichtig war vor allem, dass die Wiederkehr der Angst in der Reinstatementgruppe mit der Veränderung der Zustandsangst und der Stimmung (von der Extinktion zum Test) korrelierte. D.h. je größer die Angst und je negativer die Stimmung wurden, desto höher war die Wiederkehr der Angst. Zusammengefasst belegt Studie 1, dass erleichterte kontextuelle Furchtkonditionierung auf impliziter Ebene (Schreckreflex) ein Endophänotyp für Angststörungen sein könnte, was zu unserem Verständnis der Ätiologie von Angststörungen beitragen könnte. Die Ergebnisse der zweiten Studie legen nahe, dass eine ängstliche und negative Stimmung nach der Extinktion die Rückkehr von Angst begünstigen könnte. Darüber hinaus scheint das VR-basierte kontextuelle Furchtkonditionierungsparadigma ein geeignetes Mittel zu sein, um Mechanismen der Angstentstehung und Angstwiederkehr experimentell zu erforschen. Weiterführende Studien könnten nun auch Angstpatienten untersuchen und das Paradigma auf evolutionär-relevante Kontexte (z.B. Höhe, Dunkelheit, weite Plätze) ausweiten. N2 - Sustained anxiety is considered as a chronic and future-oriented state of apprehension that does not belong to a specific object. It is discussed as an important characteristic of anxiety disorders including panic disorder, generalized anxiety disorder (GAD) and posttraumatic stress disorder (PTSD). Experimentally, sustained anxiety can be induced by contextual fear conditioning in which aversive events are unpredictably presented and therefore the whole context becomes associated with the threat. This thesis aimed at investigating important mechanisms in the development and maintenance of sustained anxiety: (1) facilitated acquisition and resistant extinction of contextual anxiety due to genetic risk factors (Study 1), and (2) the return of contextual anxiety after successful extinction using a new reinstatement paradigm (Study 2). To this end, two contextual fear conditioning studies were conducted in virtual reality (VR). During acquisition one virtual office was paired with unpredictable mildly painful electric stimuli (unconditioned stimulus, US), thus becoming the anxiety context (CXT+). Another virtual office was never paired with any US, thus becoming the safety context (CXT-). Extinction was conducted 24 h later, i.e. no US was presented, and extinction recall was tested another 24 h later on Day 3. In both studies context-evoked anxiety was measured on three different response levels: behavioral (anxiety-potentiated startle reflex), physiological (skin conductance level), and verbal (explicit ratings). In Study 1, participants were stratified for 5-HTTLPR (S+ risk allele vs. LL no risk allele) and NPSR1 rs324981 (T+ risk allele vs. AA no risk allele) polymorphisms, resulting in four combined genotype groups with 20 participants each: S+/T+, S+/LL, LL/T+, and LL/AA. Results showed that acquisition of anxiety-potentiated startle was influenced by a gene × gene interaction: only carriers of both risk alleles (S+ carriers of the 5-HTTLPR and T+ carriers of the NPSR1 polymorphism) exhibited significantly higher startle magnitudes in CXT+ compared to CXT-. However, extinction recall as measured with anxiety-potentiated startle was not affected by any genotype. Interestingly, the explicit anxiety level, i.e. valence and anxiety ratings, was only influenced by the NPSR1 genotype, in a way that no risk allele carriers (AA) reported higher anxiety and more negative valence in response to CXT+ compared to CXT-, whereas risk allele carriers (T+) did not. Study 2 adopted nearly the same paradigm with the modification that one group (reinstatement group) received one unsignaled US at the beginning of the experimental session on Day 3 before seeing CXT+ and CXT-. The second group served as a control group and received no US, but was immediately exposed to CXT+ and CXT-. Results showed a return of anxiety on the implicit and explicit level (higher startle responses and anxiety ratings in response to CXT+ compared to CXT-) in the reinstatement group only. Most important, the return of contextual anxiety in the reinstatement group was associated with a change of state anxiety and mood from extinction to test, that is the more anxiety and negative mood participants experienced before the reinstatement procedure, the higher their return of anxiety was. In sum, results of Study 1 showed that facilitated contextual fear conditioning on an implicit behavioral level (startle response) could be regarded as an endophenotype for anxiety disorders, which can contribute to our understanding of the etiology of anxiety disorders. Results of Study 2 imply that anxiety and negative mood after extinction could be an important facilitator for the return of anxiety. Furthermore, the present VR-based contextual fear conditioning paradigm seems to be an ideal tool to experimentally study mechanisms underlying the acquisition and the return of anxiety. Future studies could investigate clinical samples and extend the VR paradigm to evolutionary-relevant contexts (e.g., heights, darkness, open spaces). KW - Angst KW - Genetik KW - Kontextkonditionierung KW - context conditioning KW - anxiety KW - genetics KW - virtual reality KW - Virtuelle Realität Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87955 ER - TY - THES A1 - Seo, Ean Jeong T1 - Construction of recombinant E. coli Nissle 1917 (EcN) strains for the expression and secretion of defensins T1 - Konstruktion von rekombinanten E. coli Nissle 1917 (EcN) Stämmen, die Defensine exprimieren bzw. sekretieren N2 - Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) ist eines der wenigen Probiotika, die als aktive Komponente eines Medikaments in mehreren Ländern zugelassen sind. Am besten ist die Wirksamkeit des EcN für die Remissionserhaltung von an Colitis Ulcerosa leidenden Patienten dokumentiert. Diese Fähigkeit ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass EcN in der Lage ist die Produktion des humanen beta-Defensins 2 (HBD2) mittels seiner Flagelle zu Induzieren. In dieser Studie wurden rekombinante EcN Stämme konstruiert, die ein Defensin zu produzieren vermögen. Zu diesem Zweck wurden Kodon-optimierte Defensingene in Expressionsplasmidvektoren kloniert, die entweder die Proform mit der Signalsequenz oder die reife Defensinform des humanen -Defensins 5 (HD5) oder des humanen -Defensins 2 (HBD2) unter der Kontrolle des T7-Promotors kodieren. Die Synthese dieser Defensine wurde mittels Western-Blot nach der Induktion der Expression und der Lyse der rekombinanten EcN Stämme demonstriert. Das rekombinante reife HBD2 mit einem N-terminalen His-Tag konnte mittels Ni-Säulen-Chromatographie aufgereinigt werden. Das so gewonnene HBD2 zeigte antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes. In einem zweiten Ansatz wurde der Teil des HBD2-Gens mit dem yebF-Gen fusioniert, der das reife HBD2 kodiert. Das resultierende Fusionsprotein YebFMHBD2 wurde von dem entsprechenden EcN Stamm nach Induktion der Expression sekretiert. Die Präsenz von YebFMHBD2 im Medium war nicht das Ergebnis von Zellyse wie Western-Blots spezifisch für die -Galaktosidase und das Maltose-Bindeprotein mit dem Kulturüberstand zeigten. Dieser Kulturüberstand inhibierte das Wachstum von E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes nach Dialyse und Aufkonzentration sowohl in Agardiffusionsassays als auch in Flüssigcokultur. Damit konnte gezeigt werden, dass EcN ein für die Produktion von bestimmten humanen Defensinen geeignetes Probiotikum darstellt. EcN ist bei der Behandlung von Morbus Crohn Patienten nicht aktiv. Dies ist vermutlich in der genetisch bedingten Unfähigkeit zur ausreichenden Defensinproduktion solcher Individuen begründet. Als ein erster Schritt in der Entwicklung von alternativen Ansätzen zur Behandlung Morbus Crohn Patienten wurden in dieser Arbeit EcN Stämme konstruiert, die in der Lage sind HD5 oder HBD2 zu produzieren. N2 - The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) is one of the few probiotics licensed as a medication in several countries. Best documented is its effectiveness in keeping patients suffering from ulcerative colitis (UC) in remission. This might be due to its ability to induce the production of human beta defensin 2 (HBD2) in a flagellin-dependent way in intestinal epithelial cells. In contrast to ulcerative colitis, for Crohn´s disease (CD) convincing evidence is lacking that EcN might be clinically effective, most likely due to the genetically based inability of sufficient defensin production in CD patients. As a first step in the development of an alternative approach for the treatment of CD patients, EcN strains were constructed which were able to produce human alpha-defensin 5 (HD5) or beta-defensin 2 (HBD2). For that purpose codon-optimized defensin genes encoding either the proform with the signal sequence or the mature form of human alpha defensin 5 (HD5) or the gene encoding HBD2 with or without the signal sequence were cloned in an expression vector plasmid under the control of the T7 promoter. Synthesis of the encoded defensins was shown by Western blots after induction of expression and lysis of the recombinant EcN strains. Recombinant mature HBD2 with an N-terminal His-tag could be purified by Ni-column chromatography and showed antimicrobial activity against E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes. In a second approach, that part of the HBD2-gene which encodes mature HBD2 was fused with yebF gene. The resulting fusion protein YebFMHBD2 was secreted from the encoding EcN mutant strain after induction of expression. Presence of YebFMHBD2 in the medium was not the result of leakage from the bacterial cells, as demonstrated in the spent culture supernatant by Western blots specific for ß-galactosidase and maltose-binding protein. The dialyzed and concentrated culture supernatant inhibited the growth of E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes in radial diffusion assays as well as in liquid coculture. This demonstrates EcN to be a suitable probiotic E. coli strain for the production of certain defensins. KW - Escherichia coli KW - Probiotikum KW - Rekombinante DNS KW - Genexpression KW - Defensine KW - Probiotic KW - Recombinant defensins KW - E. coli Nissle 1917 KW - HBD2 KW - HD5 KW - Antimicrobial activity KW - Secretion Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72005 ER - TY - THES A1 - Weigand, Isabel T1 - Consequences of Protein Kinase A mutations in adrenocortical cells and tumours T1 - Auswirkungen von Proteinkinase A Mutationen in Zellen und Tumoren der Nebenniere N2 - Adrenal Cushing’s Syndrome (CS) is a rare but life-threatening disease and therefore it is of great importance to understand the pathogenesis leading to adrenal CS. It is well accepted that Protein Kinase A (PKA) signalling mediates steroid secretion in adrenocortical cells. PKA is an inactive heterotetramer, consisting of two catalytic and two regulatory subunits. Upon cAMP binding to the regulatory subunits, the catalytic subunits are released and are able to phosphorylate their target proteins. Recently, activating somatic mutations affecting the catalytic subunit a of PKA have been identified in a sub-population of cortisol-producing adenomas (CPAs) associated with overt CS. Interestingly, the PKA regulatory subunit IIb has long been known to have significantly lower protein levels in a sub-group of CPAs compared to other adrenocortical tumours. Yet, it is unknown, why these CPAs lack the regulatory subunit IIb, neither are any functional consequences nor are the underlying regulation mechanisms leading to reduced RIIb levels known. The results obtained in this thesis show a clear connection between Ca mutations and reduced RIIb protein levels in CPAs but not in other adrenocortical tumours. Furthermore, a specific pattern of PKA subunit expression in the different zones of the normal adrenal gland is demonstrated. In addition, a Ca L206R mutation-mediated degradation of RIIb was observed in adrenocortical cells in vitro. RIIb degradation was found to be mediated by caspases and by performing mutagenesis experiments of the regulatory subunits IIb and Ia, S114 phosphorylation of RIIb was identified to make RIIb susceptible for degradation. LC-MS/MS revealed RIIb interaction partners to differ in the presence of either Ca WT and Ca L206R. These newly identified interaction partners are possibly involved in targeting RIIb to subcellular compartments or bringing it into spatial proximity of degrading enzymes. Furthermore, reducing RIIb protein levels in an in vitro system were shown to correlate with increased cortisol secretion also in the absence of PRKACA mutations. The inhibiting role of RIIb in cortisol secretion demonstrates a new function of this regulatory PKA subunit, improving the understanding of the complex regulation of PKA as key regulator in many cells. N2 - Das adrenale Cushing Syndrom, ausgelöst durch ein Kortisol-sekretierendes Nebennierenadenom (CPA), ist eine potentiell letale Erkrankung mit einer geringen Inzidenz. Schon lange ist bekannt, dass der Proteinkinase A (PKA)-Signalweg maßgeblich die Sekretion von Steroidhormonen in der Nebenniere reguliert. In ihrer inaktiven Form ist die PKA ein Heterotetramer aus zwei katalytischen und zwei regulatorischen Untereinheiten, welches über die Bindung des second messengers cAMP und die daraus resultierende Konformationsänderung aktiviert wird. Kürzlich wurden in etwa 40 % der CPAs, somatische Mutationen in der katalytischen Untereinheit a (Ca) der PKA identifiziert. Diese Mutation verhindert die Bindung der regulatorischen Untereinheiten, was zu einer konstitutiven Aktivierung des PKA-Signalwegs führt. Unabhängig davon war bereits einige Jahre zuvor erkannt worden, dass in einem Teil der CPAs die regulatorische Untereinheit IIb (RIIb) der PKA in geringerem Maße exprimiert wird. Ein Zusammenhang zwischen dieser verringerten Proteinmenge an RIIb und den Mutationen in Ca war bisher nicht bekannt. In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass zwischen den Mutationen in Ca und der verringerten Proteinmenge von RIIb in CPAs, jedoch nicht in anderen Tumorentitäten der Nebenniere, ein klarer Zusammenhang besteht. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass auch die Zonen der normalen Nebenniere ein spezifisches Muster der Proteinkinase A Untereinheiten exprimieren. Zusätzlich konnten in in vitro Versuchen Caspasen identifiziert werden, die maßgeblich am Abbau von RIIb beteiligt sind. Durch Mutagenese-Experimente und den Austausch der Inhibitory-Sequenzen der regulatorischen Untereinheiten RIa und RIIb, konnte die Phosphorylierung von Ser114 an RIIb als essentiell für den Abbau identifiziert werden. Darüber hinaus wurden mittels LC-MS/MS neue RIIb Interaktionspartner in Zellen der Nebennierenrinde identifiziert, die sich in der An-oder Abwesenheit der Ca L206R Mutante unterscheiden. Ferner konnte für RIIb eine inhibierende Rolle, speziell in der Kortisol-Sekretion von Nebennierenrindenzellen, gezeigt werden. Dies stellt eine bislang unbekannte Funktion von RIIb dar, die das Verständnis der komplexen Regulierung von PKA als Schlüsselregulator in vielen Zellen verbessert. KW - Cushing-Syndrom KW - protein kinase a KW - cushing's syndrome KW - tumour KW - signalling KW - adrenal gland Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160646 ER - TY - THES A1 - Kouhestani, Dina T1 - Complementation of a bimolecular Antibody-Derivative within the context of the Immunological Synapse T1 - Komplementierung eines bimolekularen Antikörper-Derivates im Kontext der Immunologischen Synapse N2 - Cancer is a disease of uncontrolled cell proliferation and migration. Downregulation of antigen-presenting major histocompatibility complex (MHC) and co-stimulatory molecules are two of the most commonly used pathways by cancer cells to escape from immune surveillance. Therefore, many approaches have been developed for restoring the immune surveillance in cancer patients. One approach is to redirect the patient’s own T cells for tumor cell destruction. For T cell function it is important to induce a durable and robust cytotoxic response against target cells and to generate memory T cells, after MHC-mediated recognition of foreign intracellular antigens presented on the surface of antigen presenting cells (APC). Because of these cytotoxic properties, T cell mediated immunotherapy has been established as an effective and durable anti-neoplastic treatment. Different T cell mediated therapies for cancer treatment exist. One of them is using bispecific antibody fragments, so called bi-sepcific T cell engagers (BiTEs), for retargeting of T cells against single antigen positive tumor cells. The BiTE antibodies have two antigen binding domains, one against a target on the target cell, the second against CD3 on the T cells, facilitating cell-to-cell interactions. However, suitable single tumor antigens are limited, which restricts this approach to very few tumor types. To overcome this limitation, we have developed T cell-engaging antibody derivatives, termed hemibodies. Hemibodies exist as two complementary polypeptide chains. Each consists of two specific domains. On one end there is a single-chain variable fragment (scFv) against a target protein and on the other end there is either the heavy chain variable domain (VH) or light chain variable domain (VL) of an anti-CD3 binding antibody. Only when both hemibodies bind their respective antigens on the same tumor cell, the complementary anti CD3 VH and VL domains become aligned and reconstitute the functional CD3 binding-domain to engage T cells. For targeting malignant cells of hematopoietic origin, we used hemibodies against CD45 and HLA-A2. They were expressed in CHO cells, then purified via Strep-tag. To get more insight into the hemibody mechanism of T cell mediated target cell killing, we analyzed the biochemical and functional properties of hemibodies in more detail. Our main finding indicates that VLαCD3-scFvαHLA-A2 and VHαCD3-scFvαCD45 hemibodies induce an atypical immunological synapse characterized by a co-localization of HLA-A2 and CD45 out of the target cell -T cell interface. Nevertheless, hemibodies induce a high caspase activity in target cells in a concentration-dependent manner at nanomolar concentrations in vitro. Looking at ZAP70, which is usually recruited from the cytoplasm to the CD3 receptor in the middle of the cell-cell interface, we were able to detect activated ZAP70 outside of the cell-cell interface in the presence of hemibodies. In contrast cells treated with BiTEs show a central recruitment in the cell-cell interface as expected. We looked also at the interaction of hemibodies with soluble recombinant CD3 epsilon/gamma protein in the absence of target cells. The binding could be measured only at very high concentration out of the therapeutic window. This work contributes to the mechanistic understanding, which underlies the hemibody technology as a new dual antigen restricted T cell-mediated immunotherapy of cancer. N2 - Krebs ist eine Krankheit mit unkontrollierter Zellproliferation und -migration. Die Herunterregulierung des antigen-präsentierenden Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) und der co-stimulierenden Moleküle sind zwei der am häufigsten verwendeten Wege von Krebszellen, um der Immunüberwachung zu entkommen. Daher wurden viele Ansätze zur Wiederherstellung der Immunüberwachung bei Krebspatienten entwickelt. Ein Ansatz besteht darin, die eigenen T-Zellen des Patienten zur Zerstörung von Tumorzellen anzuleiten. T-Zellen zeichnen sich durch ihre schnelle Expansion nach MHC-vermittelter Erkennung von fremden intrazellulären Antigenen auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) aus. Darüber hinaus sind eine dauerhafte und robuste zytotoxische Immunantwort und die Erzeugung von Gedächtnis-T-Zellen wichtige Merkmale von T-Zellen. Aufgrund dieser Eigenschaften hat sich die T-Zell-vermittelte Immuntherapie als wirksame antineoplastische Behandlung in den letzten Jahren etabliert. Es gibt verschiedene Ansätze T-Zellen zur Krebsbehandlung zu nutzen. Ein Ansatz verwendet bispezifische Antikörperfragmente, sogenannte bi-sepezifische T-Zell-Engager (BiTEs), zum Retargeting von T-Zellen gegen Antigen-positive Tumorzellen. Die BiTE-Antikörper besitzen zwei Antigen-Bindungsdomänen. Eine ist gegen ein Antigen auf der Zielzelle gerichtet und die zweite ist gegen CD3 auf T-Zellen gerichtet, was zu einer direkten Rekrutierung der T-Zelle an die Zielzelle führt. Geeignete einzelne Tumorantigene, die nur auf Tumorzellen zu finden sind und nicht auf gesundem Gewebe sind jedoch begrenzt, was diesen Ansatz auf sehr wenige Tumortypen einschränkt. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir bispezifische T-Zell-rekrutierende Antikörper-Derivate entwickelt, sogenannte Hemibodies. Hemibodies sind „single chain“ Polypeptidketten. Jeder Hemibody besitzt zwei spezifische Antigen bindende Domänen. Eine Domäne besteht aus einem „single chain variable Fragment“ (scFv) und ist gegen ein Zielantigen gerichtet und zweite Effektor-Domäne besteht entweder aus der variablen Domäne der schweren Kette (VH), oder die variable Domäne der leichten Kette (VL) eines Anti-CD3-Antikörpers. Nur wenn zwei komplementierende Hemibodies ihr jeweiliges Antigen auf der Oberfläche derselben Zielzelle binden, können die beiden anti-CD3-VH- und anti-CD3-VL-Domänen komplementieren und erst jetzt die funktionelle anti-CD3-Bindungsdomäne ausbilden um T-Zellen zu binden und zu aktivieren. Zur Therapie von bösartigen Zellen hämatopoetischen Ursprungs haben wir Hemibodies gegen CD45 und HLA-A2 hergestellt. Sie wurden in CHO-Zellen exprimiert und dann über Strep-Tag gereinigt. Um mehr über den Hemibody-Mechanismus der T-Zell-vermittelten Abtötung von Zielzellen zu erfahren, haben wir die biochemischen und funktionellen Eigenschaften von Hemibodies genauer analysiert. Unser Arbeit zeigt, dass VLαCD3-scFvαHLA-A2- und VHαCD3-scFvαCD45-Hemibodies eine atypische immunologische Synapse ausbilden. Diese ist gekennzeichnet durch die gemeinsame Verdrängung von HLA-A2 und CD45 aus dem „interface“ zwischen Zielzelle und T-Zelle. Dennoch können Hemibodies selbst bei Konzentrationen im nanomolaren Bereich in vitro eine Caspase-Aktivität in den Zielzellen induzieren. Betrachtet man ZAP70, dass bei T- Zell Aktivierung normalerweise vom Zytoplasma zum CD3-Rezeptor in der Mitte des Zell-Zell „interface“ rekrutiert wird, zeigt sich bei der Hemibody vermittelten T-Zell Aktivierung aktiviertes ZAP70 außerhalb des Zell-Zell „interface“. Im Gegensatz zu Hemibodies zeigen mit BiTEs aktivierte T-Zellen erwartungsgemäß eine zentrale Rekrutierung von ZAP70 im Zell-Zell „interface“. Wir untersuchten auch die Wechselwirkung von Hemibodies mit löslichem rekombinantem CD3-Epsilon / Gamma-Protein in Abwesenheit von Zielzellen. Eine Bindung konnte nur bei sehr hoher Konzentration außerhalb des therapeutischen Fensters gemessen werden. Diese Arbeit untersucht im Detail den T-Zell vermittelten Mechanismus der Hemibody Technologie. Die Ergebnisse ermöglichen uns den Wirkmechanismus der Hemibodies besser zu verstehen. Dies ist wichtig für die sichere Weiterentwicklung dieser neuen zielgerichteten T-Zell vermittelten Immuntherapie. KW - T cell engaging Antibody KW - Immunological synapse KW - Antibody Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204669 ER - TY - THES A1 - Dugar, Gaurav T1 - Comparative transcriptomics and post-transcriptional regulation in \(Campylobacter\) \(jejuni\) T1 - Vergleichende Transkriptomanalysen und posttranskriptionelle Regulierung in \(Campylobacter\) \(jejuni\) N2 - The transcriptome is defined as the set of all RNA molecules transcribed in a cell. These include protein-coding messenger RNAs (mRNAs) as well as non-coding RNAs, such as ribosomal RNAs (rRNAs), transfer RNAs (tRNAs), and small non-coding RNAs (sRNAs). sRNAs are known to play an important role in regulating gene expression and virulence in pathogens. In this thesis, the transcriptome of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni was characterized at single nucleotide resolution by use of next-generation sequencing approaches. The first genome of a C. jejuni strain was published in the year 2000. However, its transcriptome remained uncharacterized at large. C. jejuni can survive in a variety of ecological niches and hosts. However, how strain-specific transcriptional changes contribute to such adaptation is not known. In this study, the global transcriptome maps of four closely related C. jejuni strains were defined using a differential RNA-seq (dRNA-seq) approach. This analysis also included a novel automated method to annotate the transcriptional start sites (TSS) at a genome-wide scale. Next, the transcriptomes of four strains were simultaneously mapped and compared by the use of a common coordinate system derived from whole-genome alignment, termed as SuperGenome. This approach helped to refine the promoter maps by comparison of TSS within strains. Most of the TSS were found to be conserved among all four strains, but some single-nucleotide-polymorphisms (SNPs) around promoter regions led to strain-specific transcriptional output. Most of these SNPs altered transcription only slightly, but some others led to a complete abrogation of transcription leading to differential molecular phenotypes. These in turn might help the strains to adapt to their specific host or microniche. The transcriptome also unveiled a plethora of sRNAs, some of which were conserved among the four strains while others were strain specific. Furthermore, a Cas9-dependent minimal type-II CRISPR-Cas system with only three Cas genes and multiple promoters to drive the transcription of the CRISPR locus was also characterized in C. jejuni using the dRNA-seq dataset. Apart from sRNAs, the role of global RNA binding proteins (RBPs) is also unclear in C. jejuni. Aided by the global transcriptome data, the role of RBPs in post-transcriptional regulation of C. jejuni was studied at a global scale. Two of the most widely studied RNA binding proteins in bacteria are Hfq and CsrA. The RNA interactome of the translational regulator CsrA was defined using another global deep-sequencing technique that combines co-immunoprecipitation (coIP) with RNA sequencing (RIP-seq). Using this interactome dataset, the direct targets of this widespread global post-transcriptional regulator were defined, revealing a significant enrichment for mRNAs encoding genes involved in flagella biosynthesis. Unlike Gammaproteobacteria, where sRNAs such as CsrB/C, antagonize CsrA activity, no sRNAs were enriched in the CsrA-coIP in C. jejuni, indicating absence of any sRNA antagonists and novel modes of CsrA activity regulation. Instead, the CsrA regulatory pathway revealed flaA mRNA, encoding the major flagellin, as a dual-function mRNA. flaA mRNA was the main target of CsrA but it also served to antagonize CsrA activity along with the protein antagonist FliW previously identified in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Furthermore, this regulatory mRNA was also shown in this thesis to localize to the poles of elongating C. jejuni cells in a translation-dependent manner. It was also shown that this localization is dependent on the CsrA-FliW regulon, which controls the translation of flaA mRNA. The role and mechanism of flaA mRNA localization or mRNA localization in general is not yet clear in bacteria when compared to their eukaryotic counterparts. Overall, this study provides first insights into riboregulation of the bacterial pathogen C. jejuni. The work presented in this thesis unveils several novel modes of riboregulation in C. jejuni, which could be applicable more generally. Moreover, this study also lays out several unsolved intriguing questions, which may pave the way for interesting studies to come. N2 - Das Transkriptom ist definiert als die Summe aller RNA-Moleküle, die in einer Zelle transkribiert werden. Hierzu gehören sowohl protein-kodierende Boten-RNAs (mRNAs für „messenger RNAs“), als auch nicht-kodierende RNAs, wie ribosomale RNAs (rRNAs), transfer RNAs (tRNAs) und kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs für „small RNAs“). Diese sRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Regulierung von Genexpression und Virulenz von Pathogenen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Transkriptom des Lebensmittelkeims Campylobacter jejuni mit Hilfe von Next-Generation-Sequencing-Methoden charakterisiert, welche eine Auflösung des Transkriptoms auf Einzelnukleotid-Ebene ermöglichen. Obwohl eine erste Genomsequenz für C. jejuni bereits im Jahr 2000 veröffentlicht wurde, war das Transkriptom bisher größtenteils uncharakterisiert. C. jejuni besitzt die Fähigkeit in vielen ökologischen Nischen und Wirten überleben zu können. Es ist jedoch bislang unbekannt, wie stammspezifische Veränderungen des Transkriptoms zu dieser Adaption beitragen. Mittels eines differenziellen RNA-Sequenzierungsansatzes wurden in dieser Arbeit globale Transkriptomkarten von vier nahverwandten C. jejuni Stämmen erstellt. Diese Analyse beinhaltet auch eine neue automatisierte Methode zur genomweiten Identifizierung von Transkriptionsstartstellen (TSS). Anschließend wurde aus den Genomsequenzen der vier Campylobacter Stämme ein SuperGenom erstellt. Dieses wiederum diente als Referenz, anhand dessen die Transkriptome kartiert und miteinander verglichen werden konnten. Dieser Ansatz ermöglichte eine verfeinerte Kartierung der Promotoren mittels des Vergleichs verschiedener Stämme. Die meisten TSS waren innerhalb der vier Stämme konserviert. Allerdings kam es durch SNPs („single-nucleotide polymorphisms“) in den Promoterregionen zu stammspezifischem Transkriptoutput. Die meisten dieser SNPs hatten nur geringe Veränderungen der Transkription zur Folge. Manche jedoch führten zu einem kompletten Verlust der Transkription und damit zu verschiedenen molekularen Phänotypen. Diese wiederum könnten es den verschiedenen Stämmen ermöglichen, sich an ihre spezifische Wirts- oder Mikronische anzupassen. Das Transkriptom wies auch eine Fülle von sRNAs auf, von denen manche in allen vier Stämmen konserviert, andere jedoch stammspezifisch waren. Zudem wurde mittels des C. jejuni-dRNA-seq-Datensatzes ein minimales Cas9-abhängiges CRISPR-Cas-System des Typs II entdeckt. Dieses beinhaltet lediglich drei Cas-Gene, jedoch mehrere Promotoren, die die Expression des CRISPR-Lokus antreiben. Neben der Funktion von sRNAs ist auch die Rolle globaler RNA-Bindeproteine (RBPs) in C. jejuni weitestgehend unklar. Mithilfe der Transkriptomdaten wurde die Rolle von RBPs in der posttranskriptionellen Regulierung in C. jejuni untersucht. Zwei der am besten untersuchten RNA-Bindeproteine in Bakterien sind Hfq und CsrA. Das RNA-Interaktom des Translationsregulators CsrA wurde mittels eines weiteren globalen Deep-Squencing-Ansatzes definiert. Bei dieser Methode werden Coimmunopräzipitation (coIP) und RNA-Sequenzierung zum so genannten RIP-seq kombiniert. Mithilfe dieses Interaktionsdatensatzes wurden die Zielgene dieses weitverbreiteten, globalen posttranskriptionellen Regulators definiert. Hierbei wurde eine signifikante Anreicherung von mRNAs, die in die Biosynthese von Flagellen involviert sind, erkennbar. Anders als in Gammaproteobakterien, in denen sRNAs wie CsrB und CsrC die CsrA-Aktivität antagonisieren, wurden in C. jejuni keine sRNAs in der CsrA-CoIP angereichert. Dies deutet auf das Fehlen jeglicher sRNA-Antagonisten, und damit auf eine neue Art der CsrA-Aktivitätskontrolle hin. Anstelle der sRNAs wurde die flaA mRNA, welche für das Hauptflagellin kodiert, als mRNA mit dualer Funktion identifiziert. Sie ist zum einen das Hauptzielgen von CsrA, fungiert aber gleichzeitig, zusammen mit dem Protein FliW, als Antagonist von CsrA. FliW wurde bereits zuvor in dem Grampositiven Bakterium Bacillus subtilis identifiziert. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass die regulatorische flaA mRNA translationsabhängig an den Polen der wachsenden C. jejuni-Zellen lokalisiert ist. Außerdem war zu erkennen, dass diese Lokalisierung abhängig von dem CsrA-FliW-Regulon stattfindet, welches die Translation der flaA-mRNA kontrolliert. Im Gegensatz zu Eukaryoten ist die Rolle, die die Lokalisation der flaA-mRNA, oder bakterieller mRNA im Allgemeinen, spielt, sowie der Mechanismus, der zu dieser Lokalisierung führt, bisher noch unklar. Zusammenfassend ermöglicht diese Arbeit einen ersten Einblick in die Riboregulierung des bakteriellen Pathogens C. jejuni. Es konnten einige neue Mechanismen dieser Art der Regulierung aufgedeckt werden, welche auch allgemeine Gültigkeit finden könnten. Zudem werden in dieser Arbeit neue, faszinierende Fragen aufgeworfen, die den Weg für weitere interessante Studien bereiten. KW - Post-transcriptional regulation KW - Transcriptome KW - SNPs KW - CsrA KW - Campylobacter jejuni KW - Transkriptom KW - Posttranskriptionelle Regulation Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146180 ER - TY - THES A1 - Huang, Hua T1 - Comparative investigation of the chemical composition and the water permeability of fruit and leaf cuticles T1 - Vergleichende Untersuchung zur chemischen Zusammensetzung und zur Wasserpermeabilität der Kutikula von Früchten und Blättern N2 - The plant cuticle is a continuous extracellular protective layer covering the outermost surfaces of higher plants that are in contact with the surrounding atmosphere. The primary function of the cuticular lipid membrane, which is mainly composed of biopolymer cutin and cuticular waxes, is to protect the plant organs against uncontrolled water loss. The chemical composition and the biophysical properties of cuticular waxes affect the rate of water diffusion across the cuticle. Fruit transpiration plays an important role in the development and the maintenance of fruit quality. The fruit has been suggested to present better dehydration stress tolerance than the leaf. However, the differences in transpiration and the chemical composition of cuticular waxes between fruit and leaf have yet to be comprehensively investigated. The present study aims to investigate the water permeability and cuticular wax composition of fruit and leaf cuticles of a wide range of plant species and to elucidate the different roles of the cuticular wax components in the transpiration barrier. To address these objectives, fruit and leaf samples from 17 species were investigated. The cuticular transpiration of intact fruits and astomatous adaxial leaf surfaces and the minimum leaf conductance obtained by leaf drying curves for intact leaves were gravimetrically determined for a variety of plant species. The chemical composition of cuticular waxes of fruits and leaves was thoroughly analysed by gas chromatography with flame ionization and mass spectrometry. The water permeability of fruits ranged from 3.7 x 10-5 m s-1 (Prunus domestica subsp. syriaca) to 37.4 x 10-5 m s-1 (Coffea arabica), whereas permeability for leaves varied between 1.6 x 10-5 m s-1 (Cornus officinalis) and 4.5 x 10-5 m s-1 (Prunus domestica subsp. syriaca (L.)). The interspecies range of water permeability of fruits was significantly higher than that of leaves. Chemical analyses of the cuticular waxes demonstrated that fatty acids, primary alcohols, n-alkanes, aldehydes and alkyl esters were the predominant very-long-chain aliphatic compound classes of fruit and leaf surfaces. Sterols, such as β-sitosterol and campesterol, and triterpenoids, such as oleanolic acid, ursolic acid, α-amyrin and ß-amyrin, were the major cyclic compound classes in the cuticular wax membrane. The amount and composition of cuticular waxes of both fruits and leaves varied at an intraspecific level. There were no significant correlations between the total cuticular wax load or the individual cuticular wax composition and the water permeability of fruits or leaves independently or together. After combining the fruit and leaf data set, a significant correlation between the average chain length of very-long-chain aliphatic compounds and permeabilities was detected, i.e. the longer the average chain length, the lower the water permeability. Interestingly, n-Nonacosane (C29) was abundantly detected in fruit waxes of Rosaceae species. These fruits exhibited a relatively low transpiration level, which was very close to their leaf cuticular permeability. The present study suggests that the lower cuticular permeability of leaves, in comparison to that of fruits, may be attributed to the longer average chain length of aliphatic compounds. The accumulation of total wax, triterpenoids and aliphatic compounds may not contribute to the transpiration barrier directly. The present results are highly consistent with the previous model assumptions for the cuticular structure and transport barrier. Furthermore, this comparative study on leaf and fruit cuticles provides further insights linking the cuticular wax chemistry to the physiological properties of the plant cuticle. N2 - Die pflanzliche Kutikula ist eine kontinuierliche extrazelluläre Schutzschicht, welche die oberirdischen primären Abschlussgewebe höherer Pflanzen bedeckt, die in Kontakt mit der umgebenden Atmosphäre stehen. Die primäre Funktion der lipophilen Kutikularmembran, die hauptsächlich aus dem Biopolymer Kutin und kutikulären Wachsen aufgebaut ist, besteht darin, die Pflanzenorgane vor unkontrolliertem Wasserverlust zu schützen. Die chemische Zusammensetzung und die biophysikalischen Eigenschaften von kutikulären Wachsen beeinflussen weitgehend die Geschwindigkeit der Wasserdiffusion über die Kutikula. Die Transpiration von Früchten spielt eine wichtige Rolle in der Ausbildung und Beständigkeit von Fruchtqualitätsmerkmalen. Unterschiede in der Transpiration und der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse zwischen Frucht und Blatt sollten untersucht werden. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, die Wasserpermeabilität und die kutikuläre Wachszusammensetzung von Früchten und Blättern aus einem breiten Spektrum von Pflanzenarten zu untersuchen und die verschiedenen Rollen der kutikulären Wachskomponenten in den Transpirationsbarriereeigenschaften aufzuklären. Um diesen Zielen näherzukommen, wurden Frucht- und Blattproben von 17 Arten untersucht. Die kutikuläre Transpiration von intakten Früchten und astomatären adaxialen Blattoberflächen ausgewählter Arten sowie der minimale Leitwert von deren Blättern, ermittelt durch Austrocknungskurven mit intakten Blättern, wurden gravimetrisch bestimmt. Die chemische Zusammensetzung der kutikulären Wachse von Früchten und Blättern wurde durch Gaschromatographie mit Flammenionisation und Massenspektrometrie nachgewiesen. Die Wasserdurchlässigkeit von Früchten reichte von 3,7 x 10-5 m s-1 (Prunus domestica subsp. syriaca) bis 37,4 x 10-5 m s-1 (Coffea arabica), während die Werte für Blätter zwischen 1,6 x 10-5 m s-1 (Cornus officinalis) und 4,5 x 10-5 m s-1 variierten (Prunus domestica subsp. syriaca). Der interspezifische Vergleich der Wasserdurchlässigkeit von Früchten war deutlich höher als die der Blätter. Chemische Analysen der kutikulären Wachse zeigten, dass Fettsäuren, primäre Alkohole, n-Alkane, Aldehyde und Alkylester die häufigsten sehr langkettigen aliphatischen Verbindungsklassen für Früchte und Blätter waren. Sterole wie β-Sitosterol und Campesterol und Triterpenoide zum Beispiel Oleanolsäure, Ursolsäure, α-Amyrin und ß-Amyrin, waren die wichtigsten zyklischen Verbindungsklassen in den kutikulären Wachsmischungen. Die Menge und Zusammensetzung der kutikulären Wachse, sowohl von Früchten als auch von Blättern, variierte auf intraspezifischer Ebene. Es waren keine signifikanten Korrelationen zwischen der Menge der kutikulären Wachsablagerung oder der kutikulären Wachszusammensetzung und der Wasserdurchlässigkeit von Frucht- und/oder Blattoberflächen zu erkennen. Wurden die Frucht- und Blattdatensätze zusammen untersucht, so war eine signifikante Korrelation zwischen der durchschnittlichen Kettenlänge von sehr langkettigen aliphatischen Verbindungen und der Permeabilität festzustellen, ging eine längere durchschnittliche Kettenlänge mit geringerer Wasserdurchlässigkeit einher. Interessanterweise wurden große Mengen an n-Nonacosan in Fruchtwachsen der untersuchten Rosaceae-Arten nachgewiesen. Diese Früchte zeigten ein relativ niedriges Transpirationsniveau, das sehr nahe an der Permeabilität ihrer Blattkutikeln lag. Die vorliegende Studie liefert weitere Belege dafür, dass der im Allgemeinen niedrigere minimale Leitwert von Blättern auf die – im Vergleich zur Kutikula von Früchten – längere durchschnittliche Kettenlänge der aliphatischen Verbindungen zurückzuführen ist. Die Anhäufung von Gesamtwachs, Triterpenoiden oder aliphatischen Verbindungen trägt nicht direkt zur Transpirationsbarriere bei. Die vorliegenden Ergebnisse decken sich in hohem Maße mit den bisherigen Modellannahmen zur Struktur der Kutikula und der von ihr vermittelten Funktion als Transpirationsbarriere. Darüber hinaus gibt diese Vergleichsstudie über die Kutikula von Früchten und Blättern zahlreiche Einblicke, die dabei helfen können, die kutikuläre Wachschemie mit den physiologischen Eigenschaften der pflanzlichen Kutikula zu verknüpfen. KW - Cuticle KW - Transpiration barrier KW - Fruit KW - Leaf KW - Permeability KW - ACL KW - Cuticular water permeabilities KW - Cuticular waxes KW - Aliphatics KW - Cyclics KW - Chain-length distribution Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152948 ER - TY - THES A1 - Bertolini, Enrico T1 - Comparative analysis of insect circadian clocks: a behavioural, anatomical, and molecular study T1 - Vergleichende Analyse der zirkadianen Uhr von Insekten: eine verhaltensbezogene, anatomische und molekulare Studie N2 - Biological clocks are endogenous oscillators that give organisms the sense of time. Insects, as the largest taxonomic group, offer fascinating models to study the evolution of clocks and their adaptation to various environments. Although the laboratory fruit fly, Drosophila melanogaster, led the role in the field of circadian biology as it provides a powerful genetic experimental tool, new model insect species need to be established to understand photoperiodic responses and to enable comparative studies. This work reports the behavioural, anatomical, and molecular characterization of the circadian clock of five insect species. The malt fly Chymomyza costata carries a D. melanogaster-like clock network, which supports circadian rhythms under rhythmic environment but cannot self-sustain when isolated from external time cues. The olive fly Bactrocera oleae is the major pest of olive plantations and the characterization of its circadian clock will improve future pest management strategies. The linden bug Pyrrhocoris apterus, a well suited model for investigating circadian and photoperiodic timing interactions, shows high degree of homology of the clock network with D. melanogaster. The scuttle flies Megaselia scalaris and Megaselia abdita represent new fascinating models to study how the clock network controls circadian behaviour. Overall, this work highlights high degree of homology between different circadian clock systems, but at the same time also dramatic differences in terms of circadian behaviour and neuro-anatomical expression of clock components. These have been mainly discussed in regards to the evolution of clocks in Diptera, and the adaptation of clocks to high latitudes. N2 - Biologische Uhren sind endogene Oszillatoren, mit welchen Organismen die Zeit messen können. Als größte taxonomische Gruppe stellen Insekten eine Vielzahl faszinierender Modelle, um die Evolution und Anpassung von biologischen Uhren an verschiedene Umweltbedingungen zu untersuchen. Obwohl Drosophila melanogaster eines der führenden Modelltiere im Feld der Chronobiologie ist, was sich leicht auf die herausragende genetische Manipulierbarkeit der Fliege zurück führen lässt, müssen weitere Insektenarten als Modellorganismen etabliert werden, um anhand verglei- chender Studien die Anpassungen an photoperiodische Veränderungen verstehen zu können. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Charakterisierung der zirkadianen Uhr von fünf Insektenarten auf molekularer-, anatomischer- und Verhaltens-Ebene. Die Taufliegenart Chymomyza costata besitzt eine Drosophila-ähnliche Uhr, die zirkadiane Rhythmen unterstützt solange sich das Tier in einer rhythmischen Umwelt befindet. Allerdings kann die Uhr den Rhythmus nicht selbstständig aufrecht erhalten, wenn die Fliege von externen Zeitgebern isoliert ist. Die Olivenfruchtfliege Bactrocera oleae ist der bedeutendste Schädling auf Olivenplantagen und die Charakterisierung der zirkadianen Uhr dieser Art wird zuku¨nftige Schädlingsbekämpfungsstrategien verbessern. Die Gemeine Feuerwanze Pyrrhocoris apterus, ein gut geeignetes Modell um die Interaktion des zirkadianen und photoperiodischen Timings zu untersuchen, zeigt hohe Homologie zum Uhrennetzwerk von D. melanogaster. Die Buckelfliegen Megaselia scalaris und Megaselia abdita repräsentieren neue faszinierende Modelle für die Erforschung wie das Uhrennetzwerk zirkadianes Verhalten steuert. Zusammengenommen hebt diese Arbeit die hohe Ähnlichkeit zwischen verschiedenen zirkadianen Systemen hervor, zeigt jedoch gleichermaßen gravierende Unterschiede in Bezug auf zirkadianes Verhalten und der neuroanatomischen Expression von Uhrenkomponenten. Die Homologien und Unterschiede werden hauptsächlich in Bezug auf die Evolution biologischer Uhren in Dipteren, sowie der Anpassung der Uhren an höhere geografische Breiten, erörtert. KW - neurobiology KW - circadian clock KW - insects Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164651 ER - TY - THES A1 - Lichtenstein, Leonie T1 - Color vision and retinal development of the compound eye in bees T1 - Farbensehen und retinale Entwicklung des Komplexauges bei Bienen N2 - The superfamiliy of bees, Apiformes, comprises more than 20,000 species. Within the group, the eusocial species like honeybees and bumblebees are receiving increased attention due to their outstanding importance for pollination of many crop and wild plants, their exceptional eusocial lifestyle and complex behavioral repertoire, which makes them an interesting invertebrate model to study mechanisms of sensory perception, learning and memory. In bees and most animals, vision is one of the major senses since almost every living organism and many biological processes depend on light energy. Bees show various forms of vision, e.g. color vision, achromatic vision or polarized vision in order to orientate in space, recognize mating partners, detect suitable nest sites and search for rewarding food sources. To catch photons and convert light energy into electric signals, bees possess compound eyes which consists of thousands of single ommatidia comprising a fixed number of photoreceptors; they are characterized by a specific opsin protein with distinct spectral sensitivity. Different visual demands, e.g. the detection of a single virgin queen by a drone, or the identification and discrimination of flowers during foraging bouts by workers, gave rise to the exceptional sex-specific morphology and physiology of male and female compound eyes in honeybees. Since Karl von Frisch first demonstrated color vision in honeybees more than 100 years ago, much effort has been devoted to gain insight into the molecular, morphological and physiological characteristics of (sex-specific) bee compound eyes and the corresponding photoreceptors. However, to date, almost nothing is known about the underlying mechanisms during pupal development which pattern the retina and give rise to the distinct photoreceptor distribution. Hence, in Chapter 2 and 3 I aimed to better understand the retinal development and photoreceptor determination in the honeybee eye. In a first step, the intrinsic temporal expression pattern of opsins within the retina was evaluated by quantifying opsin mRNA expression levels during the pupal phase of honeybee workers and drones. First results revealed that honeybee workers and drones express three different opsin genes, UVop, BLop and Lop1 during pupal development which give rise to an ultraviolet, blue, and green-light sensitive photoreceptor. Moreover, opsin expression patterns differed between both sexes and the onset of a particular opsin occurred at different time points during retinal development. Immunostainings of the developing honeybee retina in Chapter 2 showed that at the beginning of pupation the retina consist only of a thin hypodermis. However, at this stage all retinal structures are already present. From about mid of pupation, opsin expression levels increase and goes hand in hand with the differentiation of the rhabdoms, suggesting a two-step process in photoreceptor development and differentiation in the honeybee compound eye. In a first step the photoreceptor cells meet its fate during late pupation; in a second step, the quantity of opsin expression in each photoreceptor strongly increase up to the 25-fold shortly after eclosion. To date, the underlying mechanisms leading to different photoreceptor types have been intensively studied in the fruit fly, Drosophila melanogaster, and to some extend in butterflies. Interestingly, the molecular mechanisms seemed to be conserved within insects and e.g. the two transcription factors, spalt and spineless, which have been shown to be essential for photoreceptor determination in flies and butterflies, have been also identified in the honeybee. In chapter 3, I investigated the expression patterns of both transcription factors during pupal development of honeybee workers and showed that spalt is mainly expressed during the first few pupal stages which might correlate with the onset of BLop expression. Further, spineless showed a prominent peak at mid of pupation which might initiates the expression of Lop1. However, whether spalt and spineless are also essential for photoreceptor determination in the honeybee has still to be investigated, e.g. by a knockdown/out of the respective transcription factor during retinal development which leads to a spectral phenotype, e.g. a dichromatic eye. Such spectral phenotypes can then be tested in behavioral experiments in order to test the function of specific photoreceptors for color perception and the entrainment of the circadian clock. In order to evaluate the color discrimination capabilities of bees and the quality of color perception, a reliable behavioral experiment under controlled conditions is a prerequisite. Hence, in chapter 4, I aimed to establish the visual PER paradigm as a suitable method for behaviorally testing color vision in bees. Since PER color vision has considered to be difficult in bees and was not successful in Western honeybees without ablating the bee’s antennae or presenting color stimuli in combination with other cues for several decades, the experimental setup was first established in bumblebees which have been shown to be robust and reliable, e.g. during electrophysiological recordings. Workers and drones of the bufftailed bumblebee, Bombus terrestris were able to associate different monochromatic light stimuli with a sugar reward and succeeded in discriminating a rewarded color stimulus from an unrewarded color stimulus. They were also able to retrieve the learned stimulus after two hours, and workers successfully transferred the learned information to a new behavioral context. In the next step, the experimental setup was adapted to honeybees. In chapter 5, I tested the setup in two medium-sized honeybees, the Eastern honeybee, Apis cerana and the Western honeybee, Apis mellifera. Both honeybee species were able to associate and discriminate between two monochromatic light stimuli, blue and green light, with peak sensitivities of 435 nm and 528 nm. Eastern and Western honeybees also successfully retrieve the learned stimulus after two hours, similar to the bumblebees. Visual conditioning setups and training protocols in my study significantly differed from previous studies using PER conditioning. A crucial feature found to be important for a successful visual PER conditioning is the duration of the conditioned stimulus presentation. In chapter 6, I systematically tested different length of stimuli presentations, since visual PER conditioning in earlier studies tended to be only successful when the conditioned stimulus is presented for more than 10 seconds. In this thesis, intact honeybee workers could successfully discriminate two monochromatic lights when the stimulus was presented 10 s before reward was offered, but failed, when the duration of stimulus presentation was shorter than 4 s. In order to allow a more comparable conditioning, I developed a new setup which includes a shutter, driven by a PC based software program. The revised setup allows a more precise and automatized visual PER conditioning, facilitating performance levels comparable to olfactory conditioning and providing now an excellent method to evaluate visual perception and cognition of bees under constant and controlled conditions in future studies. N2 - Die Bienen umfassen weltweit mehr als 20000 Arten, aber besonders eusoziale Honigbienen und Hummeln gewinnen durch ihre essenzielle Rolle bei der Bestäubung vieler Wild- und Kulturpflanzen zunehmend an Bedeutung. Ihr einzigartiger eusozialer Lebensstil, aber auch ihr komplexes Verhaltensrepertoire macht sie zu einem interessanten Insektenmodel, um Mechanismen sensorischer Wahrnehmung, sowie Fähigkeiten des Lernens und Gedächtnisses näher zu untersuchen. Da beinahe jeder lebende Organismus und viele biologische Prozessen durch Sonnenenergie beeinflusst werden, ist die Fähigkeit des Sehens im Tierreich weit verbreitet und zählt auch bei Bienen zu den wichtigsten sensorischen Sinnen. Um geeignete Nistplätze, Futterquellen oder auch Paarungsspartner zu finden, sowie zur Orientierung, nutzen Bienen verschiedenste Formen des Sehens, z. B. Farbensehen, achromatisches Sehen, oder auch das Polarisationssehen. Um Photonen einfangen und diese in ein elektrisches Signal für die weitere Verarbeitung umzuwandeln zu können, besitzen Bienen Komplexaugen, die sich aus mehreren tausend Einzelaugen, den sogeannten Ommatiden zusammensetzen. Jedes Ommatidium enthält eine festgelegte Anzahl an Photorezeptoren, welche durch ein spezifisches Opsin- Protein mit einer bestimmten spektralen Empfindlichkeit charakterisiert sind. Unterschiedliche visuelle Ansprüche wie zum Beispiel die Wahrnehmung einer einzelnen Königin während ihres Paarungsfluges durch einen Drohn oder die Identifizierung und Unterscheidung von Blüten während des Sammelflugs einer Arbeiterin, führten zu einer geschlechtsspezifischen Morphologie und Physiologie männlicher und weiblicher Komplexaugen. Seit Karl von Frisch vor mehr als 100 Jahren zeigen konnte, dass Honigbienen Farben wahrnehmen können, wurden viele Anstrengungen unternommen, ein besseres Verständnis für die molekularen und physiologischen Eigenschaften des (geschlechtsspezifischen) Bienenkomplexauges zu entwickeln. Dennoch ist bis heute wenig über die zugrundeliegenden Mechanismen bekannt, die während der Puppenentwicklung der Biene zur Bildung der Retina und der spezifischen Verteilung der Photorezeptoren innerhalb der Retina führen. Daher wurde in Kapitel 2 dieser Thesis das Ziel verfolgt, die retinale Entwicklung sowie die Determinierung der Photorezeptoren im Honigbienenauge weiter aufzuschlüsseln. In einem ersten Schritt wurde das zeitliche Opsinexpressionsmuster während der Puppenentwicklung von Drohnen und Arbeiterinnen der Honigbiene durch Quantifizierung der Opsin-mRNA Expression, untersucht. Erste Ergebnisse zeigten, dass Drohnen und Arbeiterinnen während ihrer Puppenentwicklung drei verschiedene Opsin-Gene, UVop, BLop und Lop1 exprimieren, welche letztendlich drei verschiedene Photorezeptortypen hervorbringen, einen ultraviolett- , blau- und grün-sensitiven Photorezeptor. Die Opsin-Expressionsmuster unterschieden sich nicht nur zwischen den Geschlechtern, sondern auch im Expressionsbeginn der jeweiligen Opsine während der Retinaentwicklung. Immunfärbungen der sich entwickelnden Retina zeigten außerdem, dass die Retina von Honigbienen zu Beginn ihrer Entwicklung zunächst nur aus einer sehr dünnen Hypodermis besteht, jedoch bereits alle retinale Strukturen enthält. Die Photorezeptordeterminierung bei Honigbienen lässt auf einen zweistufigen Prozess schließen, da ab etwa der Mitte der Verpuppung die Opsinexpression signifikant zunimmt und Hand in Hand mit der Differenzierung der Rhabdome verläuft. Im ersten Schritt, während der späten Puppenphase, erfolgt die Festlegung des Photorezeptortyps in den jeweiligen Photorezeptorzellen. Im zweiten Schritt, kurz nach dem Schlupf der Biene, nimmt dann die Quantität der Opsinexpression stark zu, nämlich bis um das 25-fache. Bisher wurden die zugrundliegenden Mechanismen, die die verschiedenen Photorezeptortypen determinieren, zum Teil in Schmetterlingen, aber besonders intensiv in der Taufliege, Drosophila melanogaster, untersucht. Interessanterweise scheinen die molekularen Mechanismen innerhalb der Insekten konserviert zu sein und beispielsweise die zwei Transkriptionsfaktoren, spalt und spineless, welche während der Photorezeptordeterminierung in Fliegen und Schmetterlingen eine essenzielle Rolle spielen, auch in der Honigbiene identifiziert. In Kapitel 3 habe ich die Expressionsmuster dieser beiden Transkriptionsfaktoren während der Puppenentwicklung von Honigbienenarbeiterinnen untersucht und konnte zeigen, dass spalt hauptsächlich in den ersten Puppenstadien exprimiert wird was vermutlich mit dem Beginn der BLop -Expression korreliert. Spineless zeigte hingegen in der Mitte der Puppenentwicklung einen markantes Maximum in seiner mRNA Expression, was mit der Expression von Lop1 zusammenhängen könnte. Ob spalt und spineless jedoch auch in der Honigbiene eine Rolle in der Photorezeptordeterminierung spielen, bleibt noch zu untersuchen. Zum Beispiel durch einen Knockdown/out des jeweiligen Transkriptionsfaktors während der Retinaentwicklung, der zu einem spektralen Phänotyp, beispielsweise einem dichromatischen Auge, führt. Solche spektralen Phänotypen könnten dann in Verhaltensexperimenten getestet werden, um Aufschluss über die Funktion einzelner Photorezeptoren für das Farbensehen und die Synchronisierung der inneren Uhr gewinnen zu können. Um jedoch die Farbunterscheidungsfähigkeiten von Bienen und die Qualität in der Farbwahrnehmung evaluieren zu können ist ein zuverlässiger Verhaltensversuch vonnöten. Daher war es in Kapitel 4 mein Ziel, das visuelle PER Paradigma als passende Verhaltensmethode für das Testen von Farbensehen in Bienen zu etablieren. Seit mehreren Jahrzehnten gilt die visuelle Konditionierung der PER bei Bienen als schwierig und war bei der europäischen Honigbiene bisher ohne ein Abschneiden der Antennen oder ohne Präsentation weiterer Cues, wie Duft oder Bewegenung, nicht erfolgreich. Daher wurde das experimentelle Setup zunächst bei Hummeln etabliert, welche sich schon in anderen Studien als zuverlässige und robuste Versuchstiere herausgestellt hatten, beispielsweise während elektrophysiologischer Untersuchungen. Arbeiterinnen und Drohnen der schwarzen Erdhummel, Bombus terrestris, waren fähig verschiedene monochromatische Lichtstimuli mit einer Zuckerbelohnung zu assoziieren und schafften es auch, einen unbelohnten von einem belohnten Farbstimulus zu unterscheiden. Auch konnten sie den gelernten Stimulus nach zwei Stunden erneut abrufen und Arbeiterinnen zeigten die Fähigkeit, die gelernte Information erfolgreich in einen neuen Verhaltenskontext zu übertragen. Im nächsten Schritt wurde der Versuchsaufbau für Honigbienen adaptiert, sodass ich diesen in Kapitel 5 bei zwei mittelgroßen Honigbienenarten, der asiatischen Honigbiene, Apis cerana, und in der europäischen Honigbiene, Apis mellifera, verwenden konnte. Beide Honigbienenarten waren fähig, zwei monochromatische Lichtstimuli, Blau und Grün, mit Absorptionsmaxima von 435 nm und 528 nm, mit einer Belohnung zu assoziieren und zwischen beiden Stimuli zu unterscheiden. Ähnlich den Hummeln, konnten auch die asiatischen und europäischen Honigbienen den gelernten Stimulus erfolgreich nach zwei Stunden erneut abrufen. Die visuellen Konditionierungssetups und -Protokolle in meinen Untersuchungen unterschieden sich von denen vorangegangener Studien um einen entscheidenden Faktor, der von besonderer Bedeutung für eine erfolgreiche visuelle Konditionierung der PER von Bienen zu sein scheint, nämlich die Präsentationsdauer des konditionierten Stimulus. Da in vorangegangenen Studien eine visuelle Konditionierung der PER dazu tendierte nur dann erfolgsversprechend zu sein, wenn der konditionierte Stimulus für mehr als 10 s präsentiert wurde, habe ich in Kapitel 6 verschiedene Längen der Stimuluspräsentation systematisch getestet. Unmanipulierte Honigbienenarbeiterinnen konnten erfolgreich zwischen zwei monochromatischen Stimuli unterscheiden, wenn der Stimulus für 10 s präsentiert wurde, aber scheiterten, wenn die Stimuluspräsentation kürzer als 4 s war. Um ein vergleichbareres Konditionieren der Bienen zu ermöglichen, entwickelte ich ein neues Setup, welches einen Shutter beinhaltete, der durch ein PC basiertes Softwareprogramm gesteuert wurde. Das überarbeitete Setup ermöglicht eine präzisiere und automatisierte visuelle PER Konditionierung und bietet nun für zukünftige Studien eine exzellente Methode, visuelle Wahrnehmung und Kognition von Bienen unter konstanten und kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. KW - Biene KW - Komplexauge KW - Farbensehen KW - bees KW - compound eyes KW - retinal development KW - color vision KW - Netzhaut KW - Entwicklung Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150997 ER - TY - THES A1 - Alexander, Stephanie T1 - Collective cancer cell invasion \(in\) \(vivo\): function of β1 and β3 integrins in perivascular invasion and resistance to therapy T1 - Kollektive Tumorzellinvasion \(in\) \(vivo\): Funktion von β1 und β3 Integrinen in perivaskulärer Invasion und Therapieresistenz N2 - Pro-migratory signals mediated by the tumor microenvironment contribute to the cancer progression cascade, including invasion, metastasis and resistance to therapy. Derived from in vitro studies, isolated molecular steps of cancer invasion programs have been identified but their integration into the tumor microenvironment and suitability as molecular targets remain elusive. The purpose of the study was to visualize central aspects of tumor progression, including proliferation, survival and invasion by real-time intravital microscopy. The specific aims were to monitor the kinetics, mode, adhesion and chemoattraction mechanisms of tumor cell invasion, the involved guidance structures, and the response of invasion zones to anti-cancer therapy. To reach deeper tumor regions by optical imaging with subcellular resolution, near-infrared and infrared excited multiphoton microscopy was combined with a modified dorsal skinfold chamber model. Implanted HT-1080 fibrosarcoma and B16/F10 and MV3 melanoma tumors developed zones of invasive growth consisting of collective invasion strands that retained cell-cell contacts and high mitotic activity while invading at velocities of up to 200 μm per day. Collective invasion occurred predominantly along preexisting tissue structures, including blood and lymph vessels, collagen fibers and muscle strands of the deep dermis, and was thereby insensitive to RNAi based knockdown and/or antibody-based treatment against β1 and β3 integrins, chemokine (SDF-1/CXCL12) and growth factor (EGF) signaling. Therapeutic hypofractionated irradiation induced partial to complete regression of the tumor main mass, yet failed to eradicate the collective invasion strands, suggesting a microenvironmentally privileged niche. Whereas no radiosensitization was achieved by interference with EGFR or doxorubicin, the simultaneous inhibition of β1 and β3 integrins impaired cell proliferation and survival in spontaneously growing tumors and strongly enhanced the radiation response up to complete eradication of both main tumor and invasion strands. In conclusion, collective invasion in vivo is a robust process which follows preexisting tissue structures and is mainly independent of established adhesion and chemoattractant signaling. Due to its altered biological response to irradiation, collective invasion strands represent a microenvironmentally controlled and clinically relevant resistance niche to therapy. Therefore supportive regimens, such as anoikisinduction by anti-integrin therapy, may serve to enhance radio- and chemoefficacy and complement classical treatment regimens. N2 - Die Progression von Tumorerkrankungen, einschließlich Tumorinvasion, Metastasierung und Therapieresistenz wird unter anderem durch migrationsfördernde Signale aus der Tumorumgebung vermittelt. Zur bisherigen Aufklärung einzelner Schritte des Tumorinvasions- und Progressionsprogramms trugen dabei wesentlich In-vitro-Studien bei, jedoch erfordert die Darstellung der Relevanz molekularer Zielstrukturen und deren Funktion im Tumormikromilieu die Validierung in geeigneten In-vivo-Tumormodellen. Ziel dieser Studie war, zelluläre und molekulare Mechanismen der Tumorprogression inklusive Proliferation, Überleben und Invasion mittels Echtzeit-Intravitalmikroskopie darzustellen. Untersucht wurden insbesondere die Kinetik und Arten der Tumorzellinvasion, die zugrunde liegenden Adhäsionswege und pro-migratorischen Signale (EGF, SDF-1), beteiligte Leitstrukturen des Tumorstromas, und Strategien, therapeutisch gegen Invasionszonen vorzugehen. Um tiefe Tumorareale mittels subzellulär aufgelöster optischer Bildgebung zu erreichen, wurde nah-infrarote und infrarote Multiphotonenmikroskopie mit einem modifizierten Rückenkammermodell kombiniert. Orthotope Xeno- und Allotransplantate von HT-1080-Fibrosarkom- und B16/F10- oder MV3-Melanomzellen entwickelten dabei ausgeprägte invasive Wachstumszonen bestehend aus kollektiven Invasionssträngen mit intakten Zell-Zell-Kontakten und zeitgleicher Mitoseaktivität, die Geschwindigkeiten von bis zu 200 μm pro Tag erreichten. Diese kollektive Invasion orientierte sich bevorzugt entlang von Funktionsstrukturen der tiefen Dermis wie Blut- und Lymphgefäßen, Kollagenfasern und Muskelsträngen. RNAibasierende Herrunterregulation und/oder Injektion blockierender Antikörper gegen β1 und β3 Integrine, wie auch Inhibition von EGF führten nur zu minimaler Änderung der Invasionseffizienz. Therapeutische hypofraktionierte Bestrahlung induzierte partielle bis komplette Regression der Tumorhauptmasse, nicht jedoch der kollektiven Invasionsstränge, was auf eine kombinierte Invasions- und Resistenznische hinweist. Weder Doxorubicin noch gegen EGFR gerichtete Antikörper steigerten die Radiosensitivität, jedoch führte die simultane Inhibition von β1 und β3 Integrinen zu einer starken Hemmung von Proliferation und Überleben spontan wachsender Tumoren (Anoikis) und verstärkte die Strahlungssensitivität bis hin zum kompletten Verschwinden von sowohl Tumorhauptmasse wie auch Invasionsträngen. Kollektive Invasion ist somit ein wichtiger Invasionsmodus, der sich an vorbestehenden Gewebsstrukturen orientiert und unabhängig von Integrinen und EGF- und SDF-1-Signalen erfolgt. Die kollektiven Stränge entwickeln dabei eine vom Haupttumor verschiedene biologische Reaktion auf Bestrahlung und entsprechen damit einer durch die Mikroumgebung kontrollierten und von Integrinsignalen abhängenden Resistenznische. Somit könnte eine zusätzliche anti- Integrin-Therapie die Effizienz von Bestrahlung und Chemotherapie erhöhen und klassische Behandlungsschemen/-programme ergänzen. KW - Tumorzelle KW - Kollektive Invasion KW - Multiphotonenmikroskopie KW - Integrine KW - collective invasion KW - multiphoton microscopy KW - integrins KW - Invasion KW - Integrine Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85435 ER - TY - THES A1 - Jonas, Franziska T1 - CNS1-dependency of \(in\) \(vivo\) peptide-induced CD4\(^+\)Foxp3\(^+\) regulatory T cells T1 - CNS1-Abhängigkeit von \(in\) \(vivo\) Peptid-induzierten CD4\(^+\)Foxp3\(^+\) regulatorischen T-Zellen N2 - CD4+Foxp3+ Tregs can be induced in vitro by TGF-b stimulation. Here, CNS1 deficient CD4+ T cells were found to show compromised Foxp3 upregulation in vitro compared to CNS1 WT CD4+ T cells. Moreover, we could demonstrate that antigen-specific CD4+Foxp3+ Tregs can be induced in vivo by tolerogenic antigen stimulation. Parenteral application of agonist BDC2.5 mimetope induced Foxp3 expression in CD4+ BDC2.5 tg cells. We could show that induction of Foxp3 expression by tolerogenic peptide stimulation is impaired in CNS1 deficient CD4+ BDC2.5 tg cells compared to CNS1 WT CD4+ BDC2.5 tg controls. These results indeed indicate that in vivo induced Tregs share mechanistic characteristics with naturally occurring pTregs. Additional in vivo experiments with blocking monoclonal anti-TGF-b demonstrated that high dosage TGF-b blockade abrogated peptide-induced Foxp3 expression in CNS1 WT BDC2.5 tg CD4+ cells, akin to what is seen for impaired Foxp3 upregulation in peptide-stimulated CNS1 KO BDC2.5 tg CD4+ cells without anti-TGF-b-treatment. Adoptive transfer of CD4+CD25- T cells in T cell deficient recipients dramatically increased CD4+Foxp3+ Treg frequencies in both CNS1 WT CD4+ and CNS1 KO CD4+ donor cells. Despite an initially lower increase in Foxp3 expression in CNS1 KO donor cells compared to CNS1 WT donor cells early after transfer, in this setting impaired Treg induction in CNS1 deficient cells was not preserved over time. Consequently, diabetes onset and progression were indistinguishable between mice that received CNS1 WT or CNS1 KO donor cells. Additional Foxp3 induction by peptide stimulation of immunodeficient recipients after transfer of CNS1 WT BDC2.5. tg or CNS1 KO BDC2.5 tg donor cells was not detectable. N2 - CD4+Foxp3+ Tregs können in vitro mittels TGF-b-Stimulation induziert werden. Im Rahmen dieses Projekts konnte bestätigt werden, dass CNS1-defiziente CD4+ T-Zellen im Vergleich zu CD4+ CNS1 WT-Zellen in vitro eine eingeschränkte Foxp3-Hochregulation zeigen. Des Weiteren konnten wir Antigen-spezifische CD4+Foxp3+ Tregs mittels tolerogener Antigenstimulation in vivo induzieren. Parenteral appliziertes BDC2.5-Mimetop induzierte die Foxp3 Expression in CD4+ BDC2.5 transgenen T-Zellen. Hierbei zeigten CNS1 KO BDC2.5 transgene CD4+ T-Zellen im Vergleich zu CNS1 WT BDC2.5 transgenen CD4+ T-Zell-Kontrollen eine eingeschränkte Hochregulation der Foxp3 Expression nach Mimetop-Stimulation. Peptid-induzierte CD4+Foxp3+ Tregs verhalten sich somit ähnlich wie natürlich vorkommende pTregs. Unter Verwendung höherer Dosen von anti-TGF-b zeigte sich bei Mimetop-Stimulation im in vivo Experiment eine eingeschränkte Foxp3-Hochregulation der CNS1 WT CD4+ BDC2.5 transgenen T-Zellen, ähnlich wie es bei CNS1 KO CD4+ BDC2.5 transgenen T-Zellen ohne anti-TGF-b-Behandlung zu beobachten war. ... KW - Treg KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Diabetes mellitus Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243887 ER - TY - THES A1 - Eschbach, Claire T1 - Classical and operant learning in the larvae of Drosophila melanogaster T1 - Klassiches und operantes Lernen bei Larven der Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit studiere ich einige psychologische Aspekte im Verhalten der Drosophila, insbesondere von Drosophila Larven. Nach einer Einleitung, in der ich den wissenschaftlichen Kontext darstelle und die Mechanismen der olfaktorischen Wahrnehmung sowie des klassichen und operanten Lernens beschreibe, stelle ich die verschiedenen Experimente meiner Doktorarbeit vor. Wahrnehmung Das zweite Kapitel behandelt die Art, in der adulte Drosophila zwischen Einzeldüften und Duftgemischen generaliseren. Ich habe gefunden, daß die Fliegen eine Mischung aus zwei Düften als gleich verschieden von ihren beiden Elementen wahrnehmen; und daß die Intensität sowie die chemisch-physikalische Natur der Elemente das Ausmass der Generalisierung zwischen der Mischung und ihren beiden Elementen beeinflusst. Diese Entdeckungen sollten für die weitere Forschung anregend sein, wie zum Beispiel zum functional imaging. Gedächtnis Das dritte Kapitel stellt die Etablierung eines neuen Protokolls zur klassischen Konditionierung bei Drosophila Larven dar. Es handelt sich um Experimente, bei denen ein Duft mit einer mechanischen Störung als Strafreiz verknüpft wird. Das Protokoll wird einen Vergleich zwischen zwei Arten vom aversiven Gedächtnissen (Geschmack vs. mechanische Störung als Strafreize) ermöglichen, einschliesslich eines Vergleiches ihrer neurogenetischen Grundlagen; zudem kann nun geforscht werden, ob die jeweiligen Gedächtnisse spezifisch für die Art des verwendeten Strafreizes sind. Selbstgestaltung Das vierte Kapitel umfasst unsere Versuche, operantes Gedächtnis bei Drosophila Larven zu beobachten. Zumindest für die unmittelbar ersten Momente des Tests konnte ich zeigen, dass die Larven ihr Verhalten entsprechend dem Training ausrichten. Dieses Gedächtnis scheint jedoch im Laufe des Tests schnell zu verschwinden. Es ist daher geraten, diese Ergebnisse über operantes Lernen zu wiederholen, eventuell das experimentelle Protokoll zu verbessern, um so eine systematische Analyse der Bedingungen und Mechanismen für das operante Lernen bei der Drosophila Larve zu erlauben. Im fünften Kapitel verwende ich die im Rahmen des vierten Kapitels entwickelten Methoden für eine Analyse der Fortbewegung der Larven. Ich habe insbesondere die Wirkung des pflanzlichen ‚cognitive enhancers’ Rhodiola rosea untersucht, sowie die Auswirkungen von Mutationen in den Genen, welche für Synapsin und SAP47 kodieren; schliesslich habe ich getestet, ob die Geschmacksqualität der Testsituation lokomotorische Parameter verändert. Diese Dissertation erbringt also eine Reihe neuer Aspekte zur Psychologie der Drosophila und wird hoffentlich in diesem Bereich der Forschung neue Wege öffnen. N2 - In this thesis I studied psychological aspects in the behaviour of Drosophila, and especially Drosophila larvae. After an introduction where I present the general scientific context and describe the mechanisms of olfactory perception as well as of classical and operant conditioning, I present the different experiments that I realised during my PhD. Perception The second chapter deals with the way adult Drosophila generalise between single odours and binary mixtures of odours. I found that flies perceive a mixture of two odours as equally similar to the two elements composing it; and that the intensity as well as the physico-chemical nature of the elements composing a mixture affect the degree of generalisation between this mixture and one of its elements. These findings now call for further investigation on the physiological level, using functional imaging. Memory The third chapter presents a series of experiments in Drosophila larvae in order to define some characteristics of a new protocol for classical aversive learning which involves associating odours with mechanical disturbance as a punishment. The protocol and the first results should open new doors for the study of classical conditioning in Drosophila larvae, by allowing the comparison between two types of aversive memory (gustatory vs. mechanical reinforcement), including a comparison of their neurogenetic bases. It will also allow enquiries into the question whether these respective memories are specific for the kind of reinforcer used. Agency The fourth chapter documents our attempts to establish operant memory in Drosophila larvae. By analysing the first moments of the test, I could reveal that the larvae modified their behaviour according to their previous operant training. However, this memory seems to be quickly extinguished during the course of the test. We now aim at repeating these results and improving the protocol, in order to be able to systematically study the mechanisms allowing and underlying operant learning in Drosophila larvae. In the fifth chapter, I use the methods developed in chapter four for an analysis of larval locomotion. I determine whether larval locomotion in terms of speed or angular speed is affected by a treatment with the “cognitive enhancer” Rhodiola rosea, or by mutations in the Synapsin or SAP47 genes which are involved in the formation of olfactory memory. I also characterize the modifications induced by the presence of gustatory stimuli in the substrate on which the larvae are crawling. This thesis thus brings new elements to the current knowledge of Drosophila KW - Lernen KW - Taufliege KW - Neurobiologie KW - Drosophila KW - learning KW - Drosophila KW - neurobiology KW - behaviour Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70583 ER - TY - THES A1 - Amatobi, Kelechi Michael T1 - Circadian clocks determine transport and membrane lipid oscillation in \(Drosophila\) hemolymph in complex interactions between nutrient-type, photic conditions and feeding behaviour T1 - Die innere Uhr bestimmt den Transport und die Membranlipid-Oszillation in der \(Drosophila\) Hämolymphe in komplexen Interaktionen zwischen Nährstofftyp, photischen Bedingungen und Fressverhalten N2 - The interaction between circadian clocks and metabolism is of increasing interest, since clock dysfunction often correlates with metabolic pathologies. Many research articles have been published analysing the impact of factors such as circadian clock, light, feeding time and diet-type on energy homeostasis in various tissues/organs of organisms with most of the findings done in mammals. Little is known about the impact of circadian clock and the above-mentioned factors on circulating lipids, especially the transport form of lipids - diacylglycerol (DG) and membrane lipids such as phosphatidylethanolamine (PE) and phosphatidylcholine (PC) in the Drosophila hemolymph. The fruit fly Drosophila is a prime model organism in circadian, behaviour and metabolism research. To study the role of circadian clock and behaviour in metabolism, we performed an extensive comparative hemolymph lipid (diacylglycerol: DG, phosphatidylethanolamine: PE, phosphatidylcholine: PC) analysis using ultra performance liquid chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry (UPLC-MS) between wild-type flies (WTCS) and clock disrupted mutants (per01). In addition, clock controlled food intake– feeding behaviour was investigated. Time-dependent variation of transport (DG) and membrane lipids (PE and PC) were not rhythmic in WTCS under constant darkness and in per01 under LD, suggesting an impact of light and clock genes on daily lipid oscillations. Day-time and night-time restriction of food led to comparable lipid profiles, suggesting that lipid oscillations are not exclusively entrained by feeding but rather are endogenously regulated. Ultradian oscillations in lipid levels in WTCS under LD were masked by digested fatty acids since lipid levels peaked more robustly at the beginning and end of light phase when flies were fed a lipid- and protein-free diet. These results suggest that metabolite (DG, PE and PC) oscillation is influenced by complex interactions between nutrient-type, photic conditions, circadian clock and feeding time. In conclusion, the results of this thesis suggest that circadian clocks determine transport and membrane lipid oscillation in Drosophila hemolymph in complex interactions between nutrient-type, photic conditions and feeding behaviour. N2 - Die Interaktion zwischen Innerer Uhr und Metabolismus ist von zunehmendem Interesse, weil Störungen der Inneren Uhr oft mit metabolischen Störungen assoziiert sind. Zahlreiche Untersuchungen zum Einfluss verschiedener Faktoren, u.a. der Inneren Uhr, Lichtregime, Zeitpunkt der Nahrungsaufnahme und Art der Diät, auf die Energiehomöostase in verschiedenen Geweben und Organen wurden vor allem in Säugetieren durchgeführt. Der Einfluss der Inneren Uhr und der oben genannten weiteren Faktoren auf zirkulierende Lipide in der Hämolymphe von Drosophila, insbesondere auf die Transportform Diacylglycerol (DG) und Membranlipide (wie z.B. Phosphatidylethanolamin (PE) und Phospathidylcholine (PC)), ist jedoch kaum untersucht. Die Taufliege Drosophila dient dabei als hervorragendes Modell in der circadianen Verhaltens- und Metabolismusforschung. Um die Rolle der Inneren Uhr und circadianen Verhaltens auf den Metabolismus zu untersuchen, haben wir eine extensive und vergleichende Lipidanalyse (DG, PE, PC) in der Hämolymphe von Wildtyp-Fliegen (WTCS) und Uhrmutanten (per01) mittels Ultrahochleistungs-Flüssigkeits-chromatographie gekoppelt mit Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgeführt. Gleichzeitig wurde auch die circadian gesteuerte Nahrungsaufnahme untersucht. Die zeitabhängigen Schwankungen der Transport-(DG) und Membranlipide (PE, PC) unterlagen keiner tageszeitlichen Rhythmik in konstanter Dunkelheit in Wildtypfliegen, und unter Licht-Dunkelwechsel (LD) in per01 Mutanten. Dies weist auf einen Einfluss der Inneren Uhr und des Lichts auf tägliche Lipidschwankungen hin. Restriktion der Futtergabe auf entweder Tag oder Nacht ergab ähnliche Lipidprofile, was darauf hinweist, daß Schwankungen in den Lipidkonzentrationen nicht ausschliesslich durch die Nahrungsaufnahme, sondern auch endogen geregelt werden. Ultradiane Oszillationen in der Lipidkonzentration in WTCS unter LD-Bedingungen wurden durch mit der Nahrung aufgenommene Fettsäuren maskiert, zeigten sich aber deutlicher zu Beginn und Ende der Lichtphase wenn die Fliegen auf einer Lipid- und Protein-freien Diät gehalten wurden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß Oszillationen in Lipiden (DG, PE und PC) in der Hämolymphe durch eine komplexe Interaktion zwischen Diättyp, Lichtregime, Innerer Uhr und Zeitpunkt der Nahrungsaufnahme bestimmt wird. Zusammengenommen zeigen die Resultate dieser Arbeit, dass die Innere Uhr in komplexer Interaktion mit Diättyp, Lichtregime und Freßverhalten das zeitliche Profil von Transport- und Membranlipiden in der Drosophila-Hämolymphe bestimmt. KW - Pharmaceutische Biologie KW - DG diacyglycerol KW - PE Phosphoethanolamine Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244462 ER - TY - THES A1 - Wagner, Martin T1 - Chronic Kidney Disease as an Important Co-morbid Condition in Coronary Heart Disease Patients T1 - Chronische Nierenerkrankung als bedeutender Risikofaktor bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit N2 - In patients with coronary heart disease (CHD) the control of the modifiable “traditional” cardiovascular risk factors such as hypertension, dyslipidemia, diabetes, achieving/maintaining normal body weight and smoking cessation is of major importance to improve prognosis. Guideline recommendations for secondary CHD prevention include specific treatment targets for blood pressure, lipid levels, and markers of glucose metabolism for both younger and older patients. Chronic kidney disease (CKD) has been identified as a “non-traditional” risk factor for worse outcome in CHD patients, as it is associated with a markedly increased risk for subsequent CV events and mortality. The specific objectives of the current thesis-project are to investigate (a) the quality of care in a recent sample of German CHD patients and to investigate variation of risk factor control between younger and elder patients (≤70 versus >70 years), (b) to analyze the prevalence of CKD across Europe in stable CHD patients in the outpatient setting and during a hospital stay for CHD, (c) to investigate the level of awareness of CKD in German CHD patients and their treating physicians. Data from the European-wide EUROASPIRE IV study were used that include data on 7998 CHD patients in the ambulatory setting (study visit) and during a hospital stay for CHD (index). The German EUROASPIRE IV study center in Würzburg recruited 536 patients in 2012-2013. Risk factor control was compared against the current recommendations of the European Society of Cardiology. CKD was described by stages of glomerular filtration rate (eGFR) and albuminuria. German patients were asked in an additional kidney specific module whether they have ever been told by a physician about renal impairment. The fact that CKD or acute kidney injury (AKI) was mentioned in prominent parts of the hospital discharge letter as well as correct ICD-coding of CKD or AKI served as a proxy for physician’s awareness of CKD. The majority of German CHD patients was treated with the recommended drug therapies including e.g. β-blockers, anti-platelets and statins. However, treatment targets for blood pressure and LDL-cholesterol levels were not achieved in many patients (45% and 53%, respectively) and glycemic control in diabetic CHD patients with HbA1-levels <7% was insufficient (61%). A minority of patients reported on current smoking (10%), but unhealthy life-styles e.g. overweight/obesity (85%/37%) were frequent. Patterns of care differed between younger and older CHD patients while older patients were less likely to receive the recommended medical CHD-therapy, were more likely to have uncontrolled blood pressure and also to be diabetic. However, a greater proportion of diabetic patients >70 years was achieving the HbA1c target, and less elder patients were current smokers or were obese. About 17% of patients on average had CKD (eGFR< 60 ml/min/1.73m²) in the entire European sample at the study visit, and an additional 10% had albuminuria despite preserved eGFR, with considerable variation among countries. Impaired kidney function was observed in every fifth patient admitted for CHD in the entire European dataset of the EUROASPIRE IV study. Of the German CHD patients with CKD at the study visit, only a third were aware of their renal impairment. A minority of these patients was being seen by nephrologists, however, with a higher likelihood of CKD awareness and specialist care in more advanced stages of CKD. About a third of patients admitted for CHD showed either CKD or AKI during the hospital stay, but the discharge letter mentioned chronic or acute kidney disease only in every fifth of these patients. In contrast, correct ICD coding of CKD or AKI was more complete, but still suboptimal. In summary, quality of secondary prevention in German CHD patients indicates considerably room for improvement, with life-style modifications may become an even greater factor in prevention campaigns than medical treatment into certain target ranges. Preventive therapies should also consider different needs in older individuals acknowledging physical and mental potential, other comorbidities and drug-interactions with co-medication. CKD is common in CHD patients, not only in the elderly. Since CHD and CKD affect each other and impact on worse prognosis of each other, raising the awareness of CKD among patients and physicians and considering CKD in medical therapy may improve prognosis and slow disease progression of CHD as well as CKD. N2 - Bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit (KHK) ist die Behandlung der „klassischen“ kardiovaskulären Risikofaktoren wie Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, Diabetes, ein normales Körpergewicht sowie der Nikotinverzicht von Bedeutung, um die Prognose zu verbessern. Leitlinien empfehlen in der Sekundärprävention spezifische Behandlungsziele für Bluthochdruck, Hypercholesterinämie und Diabetes. Die chronische Niereninsuffizienz (NI) stellt einen „nicht-klassischen“ Risikofaktor für eine schlechtere Prognose bei KHK-Patienten dar und ist assoziiert mit einem erhöhten Risiko für eine Progression der KHK und kardiovaskuläre Mortalität. Die Studienziele der vorgelegten Arbeit beinhalten (a) die Umsetzung der KHK-Leitlinien in einem deutschen Kollektiv von Patienten inklusive der Unterschiede in der Versorgung zwischen Jüngeren und älteren Patienten (≤70 / >70 Jahre). Zudem (b) wird die Prävalenz der NI in stabilen ambulanten Verhältnissen und ebenso während eines Krankenhausaufenthaltes aufgrund eines KHK-Ereignisses in 24 Europäischen Ländern inklusive Deutschland untersucht. Schließlich (c) wird am deutschen Studienzentrum das Bewusstsein („Awareness“) für Nierenerkrankungen sowohl bei den Patienten als auch den behandelnden Ärzten analysiert. Es wurden die Daten der europaweiten EUROASPIRE IV Studie verwendet, für die zwischen 2012 und 2013 insgesamt 7998 KHK Patienten rekrutiert wurden. Sie enthält Informationen aus einem ambulanten Studienbesuch und aus einem Krankenhausaufenthalt aufgrund eines KHK-Ereignisses (Index). Am deutschen Studienzentrum in Würzburg wurden 536 Patienten eingeschlossen und die Qualität der Risikofaktorkontrolle nach den Empfehlungen der Europäischen Gesellschaft für Kardiologie untersucht. Chronische NI wurde in Stadien eingeteilt anhand von glomerulärer Filtrationsrate (eGFR) und Albuminurie. Zudem Am deutschen EUROASPIRE IV Studienzentrum wurden die Patienten zudem in einem zusätzlichen „Nieren-spezifischen Modul“ befragt, ob sie jemals von einem Arzt hinsichtlich einer Nierenerkrankung aufgeklärt wurden. Um das Bewusstsein für Nierenerkrankungen bei Ärzten einzuschätzen, wurde untersucht, ob akute oder chronische Nierenfunktionseinschränkungen im Arztbrief des Index-Aufenthaltes erwähnt wurden, und ob Nierenerkrankungen adäquat ICD-codiert waren. Die Mehrheit der deutschen KHK-Patienten wurde mit den empfohlenen Präparaten β-Blocker, Aspirin und Statinen behandelt, allerdings wurden die Ziel-/Grenzwerte für Blutdruck und Cholesterin oftmals nicht erreicht (45% bzw. 53%), ebenso wie die Blutzuckerkontrolle bei diabetischen Patienten (39%). Nur wenige Patienten waren aktive Raucher (10%), aber viele waren übergewichtig (85%) oder adipös (37%). Ältere Patienten erhielten seltener die empfohlenen Präparate und waren häufiger hypertensiv oder Diabetiker. Allerdings zeigten sich diabetische Patienten >70 Jahre besser kontrolliert und ältere Patienten waren seltener Raucher oder übergewichtig. Im Durchschnitt hatten 17% der KHK Patienten – mit großer Variation innerhalb der teilnehmenden Staaten – im EUROASPIRE IV Gesamtkollektiv eine chronische NI (eGFR <60 ml/min/1.73m²) und zusätzliche 10% hatten Albuminurie bei erhaltener eGFR. Eine eingeschränkte Nierenfunktion zeigte sich auch in jedem fünften Patienten bei Krankenhausaufnahme für das Index Ereignis im EUROASPIRE IV Gesamtkollektiv. Von den deutschen Patienten mit chronischer NI gab nur ein Drittel an, von ihrer Nierenfunktionseinschränkung zu wissen. Nur wenige dieser Patienten wurden von einem Nephrologen behandelt, wobei Patienten mit fortgeschrittener NI sich sowohl häufiger ihrer NI bewusst waren als auch von Spezialisten behandelt wurden. Im Index-Krankenhausaufenthalt hatte ein Drittel der Patienten wenigstens einen Hinweis auf eine entweder chronisch oder akut eingeschränkte Nierenfunktion. Lediglich in einem Fünftel war diese Diagnose im Entlassungsbrief erwähnt, während die Codierung nach Entlassung zwar vollständiger, aber immer noch lückenhaft war. Die Qualität der Sekundärprävention in deutschen KHK-Patienten lässt weiterhin beträchtlichen Raum für Verbesserung. Hierbei erscheinen die Veränderung im Lebensstil weitaus zielführender zu sein als die medikamentöse Therapie in definierte Zielbereiche. Die medizinische Therapie und die Herangehensweise an Verhaltensänderungen muss insbesondere bei älteren Patienten an die besondere Bedürfnisse dieser Patientengruppe angepasst werden. Chronische NI ist häufig bei KHK Patienten anzutreffen, nicht nur bei älteren Studienteilnehmern. KHK und chronische NI beeinflussen sich und die Prognose des jeweils anderen gegenseitig, sodass eine Steigerung des Bewusstseins für Nierenerkrankungen sowohl bei Patienten als auch bei Ärzten, und die Anpassung der Behandlungsstrategie womöglich zu einer Verbesserung der Prognose und zur Verlangsamung des Fortschreitens beider Erkrankungen, KHK und NI führen. KW - koronare Herzerkrankung KW - Sekundärprävention KW - Chronische Nierenerkrankung KW - coronary heart disease KW - secondary prevention KW - chronic kidney disease Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175498 ER - TY - THES A1 - Jetani, Hardikkumar T1 - Chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells targeting FLT3 in acute myeloid leukemia (AML) T1 - Chimäre Antigen Rezeptor (CAR)-modifizierte T-Zellen gegen FLT3 bei Akuter Myeloischer Leukämie (AML) N2 - Adoptive immunotherapy using chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells targeting CD19 has shown remarkable therapeutic efficacy against B cell leukemia and lymphoma, and provided proof of concept for therapeutic potential in other hematologic malignancies. Acute myeloid leukemia (AML) is an entity with an unmet medical need for effective and curative treatments. Therefore, there is a strong desire for development of potentially curative CAR-T cell immunotherapy for AML treatment. FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) is a homodimeric transmembrane protein expressed uniformly by AML blasts. FLT3 plays a vital role in the survival of AML blasts and is a key driver of leukemia-genesis in AML cases with internal tandem duplication (FLT3ITD) and tyrosine kinase domain (TKD) mutations. These attributes suggest that FLT3 could be an excellent target for CAR-T cell immunotherapy. Here, we engineered human CD4+ and CD8+ T cells to express FLT3-specific CARs and demonstrate that they confer potent reactivity against AML cell lines and primary AML blasts that express either wild-type FLT3 or FLT3-ITD. Further, we show that FLT3 CAR-T cells exert potent antileukemia activity in xenograft models of AML and induce complete remissions. We also demonstrate that FLT3-expression on FLT3-ITD+ AML cells can be augmented by FLT3 inhibitors, which lead to increased recognition by CARs and improved efficacy of FLT3 CAR-T cells. We confirmed this principle with three different FLT3 inhibitors which are at distinct stages of clinical development i.e. Phase II/III clinical trial (crenolanib, quizartinib) and clinically approved (midostaurin). Further, we observed the strongest anti-leukemia activity of FLT3 CAR-T cells in combination with crenolanib in vivo. FLT3 is known to be expressed by normal hematopoietic stem and progenitor cells. We evaluated FLT3-expression on normal hematopoietic stem cells (HSCs) using flow cytometry and confirmed lower level of FLT3-expression on HSCs and progenitors compared to AML cells. As anticipated, we found that FLT3 CAR-T cells recognize normal HSCs in vitro and in vivo, and compromise normal hematopoiesis, suggesting that adoptive therapy with FLT3 CAR-T cells will require successive CAR-T cell depletion and allogeneic HSC transplantation (HSCT) to reconstitute the hematopoietic system. Moreover, an FLT3 inhibitor treatment does not increase FLT3-expression on HSCs. Accordingly, we demonstrate that the depletion of FLT3 CAR-T cells is possible with inducible Caspase 9 (iCasp9) safety switch. Collectively, our data establish FLT3 as a novel CAR target in AML with particular relevance in high-risk FLT3-ITD+ AML. Our data demonstrate that FLT3 CAR-T cells act synergistically with FLT3 inhibitors in FLT3-ITD+ AML. i.e. FLT3 inhibitors-induced upregulation of FLT3 in FLT3-ITD+ AML cells enhances their recognition and elimination by FLT3 CAR-T cells. Due to recognition of normal HSCs, the clinical use of FLT3 CART cells is likely restricted to a defined therapeutic window and must be followed by CART cell depletion and allogeneic HSCT for hematopoietic reconstitution. The data provide rational to use FLT3 CAR-T cells in combination with FLT3 inhibitors to augment the anti-leukemia efficacy of FLT3 CAR-T cells in high-risk FLT3-ITD+ AML patients, and to mitigate the risk of relapse with FLT3-negative AML variants, which could otherwise develop under therapeutic pressure. The data provide proof of concept for synergistic use of CAR-T cell immunotherapy and small molecule targeted therapy and encourage the clinical evaluation of this combination treatment in high-risk patients with FLT3-ITD+ AML. N2 - Adoptive Immuntherapie, die Chimäre- Antigenrezeptor (CAR) –modifizierte, gegen CD19 gerichtet T-Zellen verwendet, hat eine bemerkenswerte therapeutische Wirksamkeit gegen B-Zell-Leukämien und -Lymphome und großes therapeutisches Potenzial für die Behandlung anderer hämatologischer Erkrankungen gezeigt. Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist hierbei eine Entität, für die es bisher an wirksamen und kurativen Therapien fehlt und für die die Entwicklung einer potentiell kurativen CAR-T-Zellimmuntherapie von großer Bedeutung ist. FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) ist ein homodimeres Transmembranprotein, das von AML-Blasten uniform exprimiert wird. FLT3 spielt eine wichtige Rolle beim Überleben von AML-Blasten und ist ein Schlüsselfaktor in der Leukämie-Genese bei AML-Fällen mit interner Tandem-Duplikation (FLT3-ITD) und Tyrosinkinase-Domänen (TKD)-Mutationen. Diese Eigenschaften legen die Vermutung nahe, dass FLT3 ein ausgezeichnetes Target für die CAR-T-Zell-Immuntherapie darstellen könnte. Daher setzten wir dort an und modifizierten humane CD4+ und CD8+ T-Zellen, um FLT3-spezifische CARs zu exprimieren, und konnten nachweisen, dass diese eine starke Reaktivität gegen AML-Zelllinien und primäre AML-Blasten besitzen, die entweder den FLT3-Wildtyp oder FLT3-ITD exprimieren. Weiterhin konnten wir zeigen, dass FLT3 CAR-T-Zellen in AML-Xenograft-Modellen eine starke anti-Leukämie-Aktivität besitzen und vollständige Remissionen hervorrufen können. Zudem gelang der Nachweis, dass die FLT3-Expression auf FLT3-ITD+ AML-Zellen durch FLT3-Inhibitoren verstärkt werden kann, was zu einer erhöhten Erkennung durch die CARs und einer verbesserten Wirksamkeit von FLT3-CAR-T-Zellen führt. Wir konnten dieses Prinzip mit drei verschiedenen FLT3-Inhibitoren belegen, die sich in unterschiedlichen Stadien der klinischen Entwicklung befinden, d. h. aus einer Klinischen Phase II / III-Studie (Crenolanib, Quizartinib) und einem klinisch zugelassenen Inhibitor (Midostaurin). Darüber hinaus beobachteten wir die stärkste anti-Leukämie-Aktivität von FLT3 CAR-T-Zellen in einer Kombination mit Crenolanib in vivo. Es ist bekannt, dass FLT3 von normalen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen exprimiert wird. Wir untersuchten die FLT3-Expression in normalen hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) mittels Durchflusszytometrie und bestätigten im Vergleich zu AML-Zellen eine niedrigere FLT3-Expression auf HSCs und Vorläuferzellen. Wie erwartet, zeigte sich, dass FLT3 CAR-T-Zellen normale HSCs in vitro und in vivo erkennen und die normale Hämatopoese beeinträchtigen, was darauf hindeutet, dass eine adoptive Therapie mit FLT3 CAR-T-Zellen eine sukzessive CAR-T-Zell-Depletion und allogene HSC-Transplantation erfordert, um das hämatopoetische System wiederaufzubauen. Darüber hinaus erhöht die Behandlung mit einem FLT3-Inhibitor nicht die FLT3-Expression auf den HSCs. Dementsprechend konnten wir aufzeigen, dass die Depletion von FLT3 CAR-T Zellen mit einer induzierbaren Caspase 9 (iCasp9) als „Sicherheitsschalter“ möglich ist. Zusammenfassend etablieren unsere Daten FLT3 als ein neuartiges CAR-Target in der Behandlung von AML mit besonderer Relevanz für die Hochrisiko-FLT3-ITD+ AML. Unsere Daten zeigen, dass FLT3 CAR-T-Zellen synergistisch mit FLT3-Inhibitoren in FLT3-ITD+ AML wirken, d.h. eine FLT3-Inhibitoren-induzierte Hochregulation von FLT3 in FLT3-ITD+ AML-Zellen bewirkt und dies die Erkennung und Eliminierung durch FLT3-CAR-T-Zellen verstärkt. Durch ihre Eigenschaft der Erkennung von normalen HSCs ist die klinische Verwendung von FLT3 CAR-T-Zellen wahrscheinlich auf ein definiertes therapeutisches Fenster beschränkt und muss durch eine anschließende CAR-T-Zell-Depletion und eine allogene HSCT zur Rekonstitution des hämatopoetischen Systems ergänzt werden. In Anbetracht der Daten scheint es sinnvoll, FLT3-CAR-T-Zellen in Kombination mit FLT3-Inhibitoren zu verwenden, um die anti-leukämische Wirksamkeit von FLT3-CAR-T-Zellen bei Hochrisiko-FLT3-ITD+ AML-Patienten zu erhöhen und das Risiko eines Rückfalls mit FLT3-negativen AML-Varianten zu verringern, die sich sonst therapiebedingt entwickeln könnten. Die Daten stellen ein Proof-of-Concept für den synergistischen Einsatz von CAR-T-Zell-Immuntherapie und niedermolekularen Inhibitoren dar, der eine klinische Evaluation dieser Kombinationsbehandlung bei Hochrisikopatienten mit FLT3-ITD+ AML erstrebenswert macht. KW - Chimeric antigen receptor (CAR) KW - FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) KW - FLT3 inhibitor KW - Acute myeloid leukemia (AML) Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179096 ER - TY - THES A1 - Seufert, Pascal T1 - Chemical and physical structure of the barrier against water transpiration of leaves: Contribution of different wax compounds T1 - Chemischer und physikalischer Aufbau der Wassertranspirationsbarriere von Blättern: Beitrag verschiedener Wachskomponenten N2 - The cuticle is constituted of the biopolymer cutin and intra- and epicuticular waxes. In some cases, it has epicuticular wax crystals, protruding from the epicuticular wax film. One of the most important tasks is protection against desiccation. Many investigations were conducted to find the transport limiting component of the cuticle. It is evidentially confirmed that the waxes form this barrier. These waxes are multifactorial blends made of very-long-chain aliphatic (VLCA) compounds and triterpenoids (TRP). The VLCAs were proposed to constitute the transpiration barrier to water. However, experimental confirmation was lacking so far. The present study focuses on the development of a method to selectively extract TRPs from the cuticle and the impact of the removal on the transpiration barrier. The plants deployed in this study exhibited several features. They had no epicuticular crystals on their surfaces, were astomatous, had a rather durable and possibly isolatable cuticle. A broad range of wax compositions was covered from plants with no TRP content and low wax load like Hedera helix and Zamioculcas zamiifolia to plants with high TRP content and high wax load like Nerium oleander. The selective extraction was conducted using a sequence of solvents. TRPs were extracted almost exhaustively from CMs with the first MeOH extract. Only a minor amount of shorter chained VLCAs was obtained. The remaining waxes, consisting mostly of VLCAs and some remnant TRPs, were removed with the following TCM extract. After the extractions, the water permeance of native cuticular membranes (CM), MeOH extracted (M) and dewaxed cuticular discs (MX) was investigated gravimetrically. Compared to the water permeance of CMs, Ms showed no or only a small increase in water conductance. MXs, however, always showed strongly increased values. The knowledge about the wax compounds constituting the transport-limiting properties is vital for different projects. For various issues, it would be favourable to have a standardized wax mixture as an initial point of research. It could be used to develop screening procedures to investigate the impact of adjuvants on cuticular waxes or the influence of wax constituents on the properties of cuticular waxes. This work concentrated on the development of an artificial wax mixture, which mimics the physical properties of a plant leaf wax sufficiently. As target wax, the leaf wax of Schefflera elegantissima was chosen. The wax of this plant species consisted almost exclusively of VLCAs, had a rather simple composition regarding compound classes and chain length distribution and CMs could be isolated. Artificial binary, ternary and quaternary waxes corresponding to the conditions within the plant wax were investigated using differential scanning calorimetry (DSC), X-ray diffraction (XRD) techniques and Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy. Phase diagrams were mapped out for a series of binary, ternary and quaternary wax mixtures. FTIR experiments were conducted using, ternary and a quaternary artificial wax blends. The blends were chosen to represent the conditions within the wax of the adaxial CM plant wax. The FTIR experiments exhibited an increasing resemblance of the artificial wax to the plant wax (adaxial CM wax) with an increasing number of compounds in the artificial wax. The same trend was found for DSC thermograms. Thermograms of ternary and quaternary blends exhibited more overlapping peaks and occurred in a temperature range more similar to the range of the whole leaf plant wax. The XRD spectrum at room temperature showed good conformity with the quaternary blend. The current work illustrates a method for selective extraction of TRPs from isolated CMs. It gives direct experimental proof of the association of the water permeance barrier with the VLCA rather than to the TRPs. Furthermore, the possibility to mimic cuticular waxes using commercially available wax compounds is investigated. The results show promising feasibility for its viability, enabling it to perform as a standardized initial point for further research (e.g. to examine the influence of different constituents on waxes), revealing valuable knowledge about the structure and the chemistry-function relationship of cuticular waxes. N2 - Die Kutikula ist eine der vielen Anpassungen, die Pflanzen entwickelten um nach der Besiedelung des Landes mit den Herausforderungen ihrer neuen Umgebung fertig zu werden. Sie überzieht überirdische Pflanzenorgane, wie Blüten oder Blätter und erfüllt verschiedene Aufgaben. Hierzu besteht sie aus dem biopolymer Kutin und intra- sowie epikutikulären Wachs. Studien, die sich mit der Lokalisierung der transporteinschänkenden Barriere beschäftigten, zeigten, dass die Wachse sie bilden. Diese sind vielschichtige Mischungen aus langkettigen aliphatischen Verbindungen (VLCA) und pentazyklischen Verbindung wie Triterpenen (TRP). Es wird davon ausgegangen, dass VLCAs die Barriere aufbauen, ein direkter experimenteller Nachweis dafür wurde jedoch noch nicht erbracht. In dieser Arbeit wurde daher ein Verfahren zur selektiven Extraktion von TRPs aus isolierten kutikulären Membranen (CM) entwickelt und deren Auswirkung auf die Transpirationsbarriere untersucht. Die untersuchten Pflanzen wiesen keine epikutikuläre Kristalle auf, hatten keine Stomata auf der Kutikula der Blattoberseite und es war möglich ihre Kutikula zu isolieren. Die Zusammensetzung der Wachse variierte von wenig Wachs ohne TRPs (z. B. Hedera helix, Zamioculcas zamiifolia) hin zu pflanzen mit großer Wachsmenge und hohem TRP- Anteil (Nerium oleander). Die selektive Extraktion wurde durch die sequenzielle Nutzung zweier Lösemittel erreicht. TRPs wurden fast vollständig mit Methanol (MeOH) entfernt, während VLCAs überwiegend nur mit Chloroform (TCM) extrahiert werden konnten. Die gravimetrische Bestimmung der Wassertranspiration von unbehandelten, mit Methanol extrahierten (M) und entwachsten Membranen (MX) in Transpirationskammern zeigte bei allen untersuchten Pflanzenarten einen einheitlichen Trend auf. Im Vergleich zu CMs erhöhte sich die Transpirationsrate bei Ms nicht oder nur geringfügig, während bei MXs ein starker Anstieg festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse stellen den ersten direkten experimentellen Nachweis der Verbindung von VLCAs zur Transpirationsbarriere kutikulärer Wachse dar. Mit dem Wissen, sich bei der Untersuchung der Permeation durch die Kutikula sich nur auf die VLCA Fraktion beschränken zu müssen können weitere Projekte effizient angegangen werden. Ein leicht erhältliches Standartwachsgemisch könnte Ausgangspunkt für die Untersuchung des Einflusses verschiedener Pflanzenwachskomponenten auf deren physikalische Eigenschaften dienen. Als Zielwachs diente das Blattwachs von Schefflera elegantissima. Es bestand fast ausschließlich aus VLCAs, hatte eine recht einfache Zusammensetzung bezüglich der Stoffklassen und Kettenlängenverteilung und die Kutikula war isolierbar. Mit Hilfe von dynamische Differentialkalorimetrie (DSC), Röntgenbeugung (XRD) und Fouriertransformierter Infrarot (FTIR) Spektroskopie wurden binäre, ternäre und quaternäre Gemische, die Verhältnisse im Pflanzenwachs wiederspiegelten, untersucht und Phasendiagramme erstellt. Phasendiagramme wurden von einer Reihe der binären Gemische, bestehend aus Alkanen oder Alkoholen, ternären Gemischen aus zwei Alkanen und einem Alkohol und quaternären Gemischen aus zwei Alkanen und zwei Alkoholen erstellt. FTIR-spektroskopische Versuche zeigten mit zunehmender Komponentenzahl eine erhöhte Ähnlichkeit der artifiziellen Wachse zum Pflanzenwachs (adaxiale isolierte Kutikula). Ein ähnlicher Trend wurde für die Ähnlichkeit der Thermogramme der artifiziellen Gemische zum Pflanzenwachs (aus dem Extrakt ganzer Blätter) ersichtlich. Das Diffraktogramm des quaternären Waches stimmte auf Raumtemperatur gut mit dem des Pflanzenwachses (adaxiale isolierte Kutikula) ein. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur selektiven Extraktion von TRPs aus isolierten kutikulären Membranen. Sie zeigt einen direkten experimentellen Nachweis für die Assoziation der Transpirationsbarriere zu den VLCAs und nicht zu den TRPs. Zusätzlich wird die Möglichkeit kutikulare Wachse mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Wachskomponenten nachzustellen untersucht, was vielversprechende Ergebnisse liefert. Dieses Wachs könnte daher als standardisierter Ausgangspunkt für weitere Experimente (z. B. zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Wachskomponenten auf dessen physikalische Eigenschaften) dienen. Dies könnte wertvolle Informationen über die Struktur und die Beziehung zwischen chemischer Zusammensetzung und der Funktion kutikulärer Wachse liefern. KW - Kutikula KW - Transpiration KW - Kutikularwachs KW - FT-IR-Spektroskopie KW - Differential scanning calorimetry KW - Very-long-chain aliphatic KW - X-ray diffraction KW - Selective extraction Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208963 ER - TY - THES A1 - Staiger, Simona T1 - Chemical and physical nature of the barrier against active ingredient penetration into leaves: effects of adjuvants on the cuticular diffusion barrier T1 - Chemische und physikalische Beschaffenheit der Barriere gegenüber Wirkstoffen: Adjuvantieneffekte auf die kutikuläre Diffusionsbarriere N2 - Agrochemicals like systemic active ingredients (AI) need to penetrate the outermost barrier of the plant, known as the plant cuticle, to reach its right target site. Therefore, adjuvants are added to provide precise and efficient biodelivery by i.a. modifying the cuticular barrier and increasing the AI diffusion. This modification process is depicted as plasticization of the cuticular wax which mainly consists of very long-chain aliphatic (VLCA) and cyclic compounds. Plasticization of cuticular waxes is pictured as an increase of amorphous domains and/or a decrease of crystalline fractions, but comprehensive, experimental proof is lacking to date. Hence, the objective of this thesis was to i) elucidate the permeation barrier of the plant cuticle to AIs in terms of the different wax fractions and ii) holistically investigate the modification of this barrier using selected oil and surface active adjuvants, an aliphatic leaf wax and an artificial model wax. Therefore, the oil adjuvant methyl oleate (MeO) and other oil derivatives like methyl linolenate (MeLin), methyl stearate (MeSt) and oleic acid (OA) were selected. Three monodisperse, non-ionic alcohol ethoxylates with increasing ethylene oxide monomer (EO) number (C10E2, C10E5, C10E8) were chosen as representatives of the group of surface active agents (surfactants). Both adjuvant classes are commonly used as formulation aids for agrochemicals which are known for its penetration enhancing effect. The aliphatic leaf wax of Schefflera elegantissima was selected, as well as a model wax comprising the four most abundant cuticular wax compounds of this species. Permeation, transpiration and penetration studies were conducted using enzymatically isolated cuticles of Prunus laurocerasus and Garcinia xanthochymus. Cuticular permeability to the three organic solutes theobromine, caffeine and azoxystrobin differing in lipophilicity was measured using a steady-state two-chamber system separated by the isolated leaf cuticles of the evergreen species P. laurocerasus and G. xanthochymus. Treating the isolated cuticles with methanol selectively removed the cyclic fraction, and membrane permeability to the organic compounds was not altered. In contrast, fully dewaxing the membranes using chloroform resulted in a statistically significant increase in permeance for all compounds and species, except caffeine with cuticles of G. xanthochymus due to a matrix-specific influence on the semi-hydrophilic compound. Crystalline regions may reduce the accessibility to the lipophilic pathway across the waxes and also block hydrophilic domains in the cuticle. Knowing that the aliphatic wax fraction builds the cuticular diffusion barrier, the influence of the adjuvants on the phase behaviour of an aliphatic cuticular wax as well as the influence on the cuticular penetration of AIs were investigated. Differential scanning calorimetry (DSC) and Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) were selected to investigate the phase behaviour and thus possible plasticization of pure Schefflera elegantissima leaf wax, its artificial model wax comprising the four most abundant compounds (n-nonacosane, n-hentriacontane, 1-triacontanol and 1-dotriacontanol) and wax adjuvant mixtures. DSC thermograms showed a shift of the melting ranges to lower temperatures and decreased absolute values of the total enthalpy of transition (EOT) for all adjuvant leaf wax blends at 50 % (w/w) adjuvant proportion. The highest decrease was found for C10E2 followed by MeO > OA and C10E8 > MeLin > MeSt. The aliphatic crystallinity determined by FTIR yielded declined values for the leaf and the artificial wax with 50 % MeO. All other adjuvant leaf wax blends did not show a significant decrease of crystallinity. As it is assumed that the cuticular wax is formed by crystalline domains which consist of aliphatic hydrocarbon chains and an amorphous fraction comprising aliphatic chain ends and functional groups, the plasticizers are depicted as wax disruptors influencing amorphization and/or crystallization. The adjuvants can increase crystalline domains using the aliphatic tail whereas their more hydrophilic head is embedded in the amorphous wax fraction. DSC and FTIR showed similar trends using the leaf wax and the model wax in combination with the adjuvants. In general, cuticular transpiration increased after adding the pure adjuvants to the surface of isolated cuticles or leaf envelopes. As waxes build the cuticular permeation barrier not only to AIs but also to water, the adjuvant wax interaction might affect the cuticular barrier properties leading to increased transpiration. Direct evidence for increased AI penetration with the adjuvants was given using isolated cuticles of P. laurocerasus in combination with the non-steady-state setup simulation of foliar penetration (SOFP) and caffeine at relative humidity levels (RH) of 30, 50 and 80 %. The increase in caffeine penetration was much more pronounced using C10E5 and C10E8 than MeO but always independent of RH. Only C10E2 exhibited an increased penetration enhancing effect positively related to RH. The role of the molecular structure of adjuvants in terms of humectant and plasticizer properties are discussed. Hence, the current work shows for the first time that the cuticular permeation barrier is associated with the VLCAs rather than the cyclic fraction and that adjuvants structurally influence this barrier resulting in penetration enhancing effects. Additionally, this work demonstrates that an artificial model wax is feasible to mimic the wax adjuvant interaction in conformity with a leaf wax, making it feasible for in-vitro experiments on a larger scale (e.g. screenings). This provides valuable knowledge about the cuticular barrier modification to enhance AI penetration which is a crucial factor concerning the optimization of AI formulations in agrochemistry. N2 - Um ihren optimalen Wirkort in der Pflanze zu erreichen, müssen Agrochemikalien wie systemische Wirkstoffe zunächst die Kutikula überwinden, die die äußerste Barriere der Pflanze darstellt. Es werden sogenannte Adjuvantien verwendet, die unter anderem die kutikuläre Barriere modifizieren, um eine präzise und effiziente Bereitstellung des Wirkstoffs wie auch eine erhöhte Wirkstoffdiffusion zu ermöglichen. Diese Modifikation wird als Weichmachereffekt der Adjuvantien im kutikulären Wachs verstanden. Die Wachse umfassen hauptsächlich langkettige Aliphaten (VLCA) und zyklische, organische Komponenten. Da die Wachse aus kristallinen, für Wirkstoffe unzugänglichen und amorphen, zugänglichen Bereichen bestehen, wird angenommen, dass der Weichmacherprozess eine Zunahme der amorphen Phase und/oder eine Abnahme der kristallinen Phase hervorruft. Allerdings sind umfassende, experimentelle Beweise bisher nicht verfügbar. Daher lag der Schwerpunkt dieser Arbeit auf i) der Aufklärung, wie die verschiedenen Wachsfraktionen zur kutikulären Permeationsbarriere gegenüber Wirkstoffen beitragen und ii) der ganzheitlichen Untersuchung der kutikulären Penetrationsbarriere hinsichtlich eines aliphatischen Pflanzen- und Modelwachses und des Einflusses ausgewählter Öl- und Tensid-Adjuvantien. Hierfür wurden die Öle Methyloleat (MeO), Methyllinolenat (MeLin), Methylstearat (MeSt) und Ölsäure (OA) und drei monodisperse, nicht-ionische Alkoholethoxylate (C10E2, C10E5, C10E8) mit zunehmender Ethylenoxidmonomerzahl (EO) verwendet. Beide Gruppen sind gängige Hilfsstoffe der Formulierung von Agrochemikalien, die für die Aufnahmebeschleunigung des Wirkstoffs bekannt sind. Das aliphatische Blattwachs von Schefflera elegantissima wurde verwendet wie auch ein Modelwachs, dass die vier Hauptkomponenten dieses kutikulären Blattwachses enthielt. Permeabilitäts-, Transpirations- und Penetrationsstudien wurden unter Verwendung enzymatisch isolierter Kutikeln von Prunus laurocerasus und Garcinia xanthochymus durchgeführt. Die kutikuläre Permeabilität gegenüber drei organischen Stoffen unterschiedlicher Lipophilie (Theobromin, Coffein und Azoxystrobin) wurde an isolierten Blattkutikeln der immergrünen Spezies Prunus laurocerasus und Garcinia xanthochymus mittels des Zweikammersystems im steady-state Zustand gemessen. Die zyklische Wachsfraktion konnte mit Hilfe von Methanol aus den isolierten Membranen extrahiert werden und die Membranen wiesen keine Veränderung in der Permeabilität gegenüber den drei Wirkstoffen auf. Im Gegensatz dazu konnte ein signifikanter Anstieg der Permeabilität für alle Substanzen und Spezies beobachtet werden, nachdem die Membranen vollkommen mittels Chloroform entwachst wurden. Einzig und allein für Coffein und Membranen von G. xanthochymus konnte keine Veränderung des Leitwerts festgestellt werden, was auf einen Matrix-spezifischen Einfluss auf semi-hydrophile Substanzen zurückzuführen ist. Hydrophile Bereiche in der Kutikula können durch kristalline, aliphatische Wachse blockiert werden und sind somit unzugänglich für hydrophile Substanzen. Auf Basis dieses neu gewonnenen Wissens der kutikulären Diffusionsbarriere wurde der Einfluss der Adjuvantien auf das Phasenverhalten eines aliphatischen Wachses wie auch ihr Einfluss auf die kutikuläre Wirkstoffpenetration untersucht. Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) und Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) wurden verwendet, um das Phasenverhalten des Blattwachses von Schefflera elegantissima, ihres artifiziellen Modelwachses, das die vier Hauptkomponenten n-Nonacosan, n-Hentriacontan, 1-Triacontanol und 1-Dotriacontanol enthielt, und mögliche Weichmachereffekte durch Adjuvantien zu untersuchen. Mittels DSC konnten Schmelzbereiche, die zu niedrigeren Temperaturen verschobenen waren, und verringerte Beträge der Übergangsenthalpien (EOT) für alle Blattwachs-Adjuvantien-Mischungen bei 50 % Adjuvans-Zugabe (w/w) festgestellt werden. Die stärkste Abnahme wurde für C10E2 gefunden, gefolgt von MeO > OA und C10E8 > MeLin > MeSt. Die mittels FTIR bestimmte aliphatische Kristallinität war bei einem MeO-Anteil von 50 % signifikant gegenüber dem puren Blattwachs vermindert. Alle anderen Adjuvantien zeigten keine signifikanten Veränderungen der Kristallinität im Vergleich zum nativen Blattwachs. Es wird angenommen, dass das kutikuläre Wachs aus kristallinen und amorphen Bereichen aufgebaut ist: erstere umfassen aliphatische Kohlenwasserstoffketten, letztere ihre Kettenenden und funktionellen Gruppen. Die Weichmacheradjuvantien können auf diese Bereiche mit einer Erhöhung der amorphen und/oder Erniedrigung der kristallinen Fraktion einwirken. Sie können mit ihrer aliphatischen Kette in die kristallinen Bereiche eindringen und diese erhöhen, wohingegen sich ihr hydrophilerer Kopf in der amorphen Phase verteilen kann. DSC und FTIR zeigten ähnliche Trends für das Pflanzen- und das Modelwachs in Kombination mit den Adjuvantien. Im Allgemeinen wiesen die isolierten Kutikeln und Blattumschläge von P. laurocerasus und G. xanthochymus erhöhte Leitwerte in Verbindung mit den Adjuvantien auf. Da die Wachse nicht nur die Permeationsbarriere für Wirkstoffe, sondern auch für Wasser darstellen, wird angenommen, dass die Wachs-Adjuvans-Interaktion verantwortlich für die erhöhte Transpiration ist. Erhöhte Wirkstoffpenetration durch Adjuvantien wurde mittels des non-steady-state Versuchs der Simulation der Blattpenetration (SOFP) an isolierten, kutikulären Membranen von P. laurocerasus unter Verwendung von Koffein bei relativen Luftfeuchten (RH) von 30, 50 und 80 % nachgewiesen. Die Zunahme der Flussrate unter Verwendung von C10E5 und C10E8 war deutlich höher als für C10E2, jedoch unabhängig von der RH. Nur für C10E2 konnte eine Abhängigkeit des Effekts von der Luftfeuchte festgestellt werden. Die Rolle der molekularen Struktur der Adjuvantien in Bezug auf „Humectant“- und Weichmachereigenschaften wird diskutiert. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass die kutikuläre Permeationsbarriere mit den VLCAs und nicht mit der zyklischen Fraktion assoziiert ist und dass Adjuvantien wie Öle und Tenside diese Barriere strukturell beeinflussen können, was zu einer erhöhten Penetration führt. Außerdem veranschaulicht diese Arbeit, dass ein artifizielles Modelwachs die Wachs-Adjuvans-Interaktion eines Blattwachses imitieren kann und es gut geeignet für in-vitro Experimente ist, die in größerem Maßstab durchgeführt werden (z.B. Screenings). Das liefert bedeutsames Wissen über die kutikuläre Barriere und ihre Modifikation zur Erhöhung der Wirkstoffpenetration, die wichtige Faktoren in Bezug auf die optimierte Wirkstoffformulierung in der Agrarchemie darstellen. KW - Adjuvans KW - Pflanzenschutzmittel KW - Kutikula KW - Adjuvant KW - Plant Protection KW - Plant cuticle KW - Diffusion Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199375 ER - TY - THES A1 - Schuster, Ann-Christin T1 - Chemical and functional analyses of the plant cuticle as leaf transpiration barrier T1 - Chemie-Funktionsanalysen der pflanzlichen Kutikula als Transpirationsbarriere N2 - Cuticles cover all above-ground primary plant organs and are lipoid in nature consisting of a cutin matrix with cuticular waxes embedded within or deposited on its surface. The foremost function of the plant cuticle is the limitation of transpirational water loss into the surrounding atmosphere. Transpiration of water vapour from plants differs between stomatal and cuticular transpiration. Stomatal closure minimises the stomatal water loss and the remaining, much lower water transpiration occurs through the plant cuticle. Temperature influence on the transpiration barrier properties of intact leaves is not yet known, despite the importance of the cuticular transpiration especially under drought and heat conditions. The present study focuses on the temperature-dependent minimum water permeability of whole leaves, in comparison to the temperature effect on the cuticular permeance of isolated, astomatous cuticles (Chapter I - III). The minimum water permeability was determined gravimetrically from leaf drying curves and represents the cuticular water permeability of intact, stomatous leaves under conditions of complete stomatal closure. The temperature effect on the transpiration barrier of the desert plant Rhazya stricta and the Mediterranean sclerophyll Nerium oleander exposed a continuous increase of minimum water permeabilities with an increase in temperature. In contrast to other published studies, no abrupt and steep increase of the water permeability at high temperatures was detected. This steep increase indicates structural changes of the barrier properties of isolated cuticular membranes with a drastic decrease of efficiency. A stabilising impact of the cell wall on the plant cuticle of intact leaves was proposed. This steadying effect was confirmed with different experimental approaches measuring the cuticular water permeability of Prunus laurocerasus intact leaves. Physiological analysis of water transport on isolated, astomatous leaf cuticles indicated a drastic decline of the barrier properties at elevated temperatures for Prunus laurocerasus but not for Nerium oleander. Cuticular components were quantitatively and qualitatively analysed by gas chromatography with a flame ionisation detector and a mass spectrometric detector, respectively. A high accumulation of pentacyclic triterpenoids as cuticular wax components in relation to the cutin monomer coverage was detected for Nerium oleander and for Rhazya stricta leaves, too. Accordingly, reinforcing of the cutin matrix by triterpenoids was proposed to improve the mechanical strength and to reduce the extensibility of plant cuticles. Thus, structural changes of the cuticular barrier properties were potentially suppressed at elevated temperatures. The function of the cuticular wax amount and/or wax composition and its relation with the cuticular water permeability remains to be elucidated. In the second part of this work the cuticular wax quantity and quality as well as its impact on the transpiration barrier properties was analysed in order to deduce a potential relation between chemistry and function of plant cuticles (Chapter IV - V). Chemical analyses of the cuticular wax components of a wide range of plant species, including one tropical (Vanilla planifolia), temperate (Juglans regia, Plantago lanceolata), Mediterranean (Nerium oleander, Olea europaea) and one desert (Rhazya stricta) plant species, were conducted. The cuticular wax compositions of nine characteristic plant species from xeric limestone sites naturally located in Franconia (Southern Germany) were determined for the first time. The corresponding minimum or cuticular water permeabilities of both stomatous and astomatous leaf surfaces were measured to detect a potential relationship between the cuticular wax amount, wax composition and the cuticular barrier properties. It was demonstrated that abundant cuticular wax amounts did not constitute more efficient transpiration barriers. However, 55% of the cuticular barrier function can be attributed to the very-long-chain aliphatic wax coverages. These new findings provide evidence that the acyclic wax constituents play a pivotal role establishing efficient transpiration barriers. Additionally, these findings strengthen the hypothesis that cyclic components, such as pentacyclic triterpenoids, do not hinder the water diffusion through plant cuticles as effectively as acyclic constituents. For the first time a relationship between the cuticular wax composition and the transpiration barrier properties of a wide range of plant species proved insights into the potential relation between chemistry and function of plant cuticles. N2 - Die Kutikula bedeckt die Epidermis aller primären oberirdischen Pflanzenorgane. Diese lipophile Membran besteht aus dem Polymer Kutin und ein- bzw. aufgelagerten kutikulären Wachsen. Die wichtigste Aufgabe der Kutikula ist der Schutz der Pflanze vor Austrocknung, indem der unkontrollierte Wasserverlust in die Atmosphäre reduziert wird. Spaltöffnungen unterbrechen die kontinuierliche Schutzschicht, wobei die stomatäre Transpiration durch Spaltenschluss minimiert wird und die verbleibende, stark reduzierte Transpiration ausschließlich durch die pflanzliche Kutikula erfolgt. Der Temperatureinfluss auf die Transportbarriere intakter Blätter ist bislang unerforscht, obwohl die kutikuläre Transpiration vor allem an trockenen und heißen Standorten eine wichtige Rolle spielt. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die temperaturabhängige kutikuläre Wasserpermeabilität ganzer Blätter und isolierter Kutikularmembranen verglichen (Kapitel I - III). Die minimale Wasserpermeabilität wurde gravimetrisch mittels Blattaustrocknungskurven bestimmt. Sie ist ein Maß für die kutikuläre Wasserdurchlässigkeit intakter, stomatärer Blätter bei geschlossenen Spaltöffnungen. Die minimale Wasserpermeabilität intakter Blätter von Rhazya stricta und Nerium oleander zeigte einen kontinuierlichen Anstieg mit zunehmender Temperatur. Im Gegensatz zu anderen Veröffentlichungen wurde kein abrupter, steiler Anstieg der Wasserpermeabilität bei erhöhten Temperaturen detektiert, welcher auf strukturelle Veränderungen der Transpirationsbarriere isolierter Kutikularmembranen und auf eine damit einhergehende, stark verminderte Effizienz hindeutet. Dies kann auf einen stabilisierenden Einfluss der Zellwand auf die pflanzliche Kutikula zurückgeführt werden. Verschiedene experimentelle Ansätze zur Bestimmung der temperaturabhängigen kutikulären Wasserpermeabilität von Prunus laurocerasus Blättern konnten dies bestätigen. Bei erhöhten Temperaturen wiesen die isolierten, astomatären Kutikularmembranen von Prunus laurocerasus Blättern eine starke Abnahme der Barrierefunktion auf, die isolierten Kutikularmembranen von Nerium oleander Blättern jedoch nicht. Die kutikulären Wachs- und Kutinkomponenten wurden quantitativ mittels Gaschromtograph mit Flammenionisationsdetektor und qualitativ mittels Gaschromatograph gekoppelt mit Massenspektrometer analysiert. Ein sehr hoher Gehalt an pentazyklischen Triterpenoiden im kutikulären Wachs in Bezug auf den Kutingehalt wurde sowohl für die Blätter von Nerium oleander als auch für Rhazya stricta bestimmt. Triterpenoide erhöhen möglicherweise die mechanische Festigkeit und reduzieren die Dehnbarkeit der Kutikula, indem sie die Kutinmatrix verstärken. Hierdurch könnten strukturelle Veränderungen der Transpirationsbarriere bei erhöhten Temperaturen herabgesetzt werden. Die weit verbreitete Ansicht, dass die Wasserpermeabilität von der kutikulären Wachsmenge und/oder der Wachszusammensetzung bestimmt wird, konnte bislang nicht bestätigt werden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden chemisch-analytische Methoden angewandt, um den Einfluss der Wachskomponenten auf die Transpirationsbarriere zu ermitteln, und somit einen potentiellen Zusammenhang zwischen der Chemie und der Funktion der pflanzlichen Kutikula abzuleiten (Kapitel IV - V). Um Hinweise auf die Auswirkung der chemischen Zusammensetzung der Kutikula auf die Transpirationsbarriere zu erhalten, wurden die kutikulären Wachse eines breiten Artenspektrums analysiert, darunter eine tropische Pflanzenart (Vanilla planifolia), mediterrane Arten (Nerium oleander, Olea europaea), Pflanzenarten der gemäßigten Zone (Juglans regia, Plantago lanceolata) und eine Wüstenpflanze (Rhazya stricta). Zusätzlich wurde die kutikuläre Wachszusammensetzung von neun charakteristischen Pflanzenarten des Mainfränkischen Trockenrasens erstmals untersucht. Die entsprechende minimale oder kutikuläre Wasserpermeabilität von stomatären und astomatären Blattoberflächen dieser Pflanzenarten wurde bestimmt, um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Wachschemie mit der Barrierefunktion aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Wachsmengen keine effizienteren Transpirationsbarrieren bilden. Jedoch konnten rund 55% der Barrierefunktion dem Anteil an langkettigen aliphatischen Komponenten zugeordnet werden. Diese neuen Erkenntnisse erbringen den Nachweis, dass die kutikuläre Transpirationsbarriere entscheidend von azyklischen Wachskomponenten beeinflusst wird. Zudem konnte bestätigt werden, dass zyklische Wachskomponenten die Wasserpermeabilität weniger stark beeinflussen als azyklische Bestandteile. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal einen Zusammenhang zwischen der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse und der kutikulären Transportbarriere anhand eines breiten Artenspektrums. KW - Kutikula KW - Transpiration KW - Kutikularwachs KW - Temperaturabhängigkeit KW - Permeabilität KW - transpiration barrier KW - cuticular water permeability KW - cuticular leaf wax KW - Transportbarriere KW - kutikuläre Wasserpermeabilität KW - kutikuläres Blattwachs KW - desert plant KW - Wüstenpflanze Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133475 ER - TY - THES A1 - Zude, Ingmar T1 - Characterization of virulence-associated traits of Escherichia coli bovine mastitis isolates T1 - Charakterisierung Virulenz-assozierter Eigenschaften von Escherichia coli Isolaten boviner Mastitis N2 - Bacterial mastitis is caused by invasion of the udder, bacterial multiplication and induction of inflammatory responses in the bovine mammary gland. Disease severity and the cause of disease are influenced by environmental factors, the cow’s immune response as well as bacterial traits. Escherichia coli (E. coli) is one of the main causes of acute bovine mastitis, but although pathogenic E. coli strains can be classified into different pathotypes, E. coli causing mastitis cannot unambiguously be distinguished from commensal E. coli nor has a common set of virulence factors been described for mastitis isolates. This project focussed on the characterization of virulence- associated traits of E. coli mastitis isolates in comprehensive analyses under conditions either mimicking initial pathogenesis or conditions that E. coli mastitis isolates should encounter while entering the udder. Virulence-associated traits as well as fitness traits of selected bovine mastitis or faecal E. coli strains were identified and analyzed in comparative phenotypic assays. Raw milk whey was introduced to test bacterial fitness in native mammary secretion known to confer antimicrobial effects. Accordingly, E. coli isolates from bovine faeces represented a heterogeneous group of which some isolates showed reduced ability to survive in milk whey whereas others phenotypically resembled mastitis isolates that represented a homogeneous group in that they showed similar survival and growth characteristics in milk whey. In contrast, mastitis isolates did not exhibit such a uniform phenotype when challenged with iron shortage, lactose as sole carbon source and lingual antimicrobial peptide (LAP) as a main defensin of milk. Reduced bacterial fitness could be related to LAP suggesting that bacterial adaptation to an intramammary lifestyle requires resistance to host defensins present in mammary secretions, at least LAP. E. coli strain 1303 and ECC-1470 lack particular virulence genes associated to mastitis isolates. To find out whether differences in gene expression may contribute to the ability of E. coli variants to cause mastitis, the transcriptome of E. coli model mastitis isolates 1303 and ECC-1470 were analyzed to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction, fitness or even pathogenicity during bovine mastitis. DNA microarray analysis was employed to assess the transcriptional response of E. coli 1303 and ECC-1470 upon cocultivation with MAC-T immortalized bovine mammary gland epithelial cells to identify candidate genes involved in bacterium-host interaction. Additionally, the cell adhesion and invasion ability of E. coli strain 1303 and ECC-1470 was investigated. The transcriptonal response to the presence of host cells rather suggested competition for nutrients and oxygen between E. coli and MAC-T cells than marked signs of adhesion and invasion. Accordingly, mostly fitness traits that may also contribute to efficient colonization of the E. coli primary habitat, the gut, have been utilized by the mastitis isolates under these conditions. In this study, RNA-Seq was employed to assess the bacterial transcriptional response to milk whey. According to our transcriptome data, the lack of positively deregulated and also of true virulence-associated determinants in both of the mastitis isolates indicated that E. coli might have adapted by other means to the udder (or at least mammary secretion) as an inflammatory site. We identified traits that promote bacterial growth and survival in milk whey. The ability to utilize citrate promotes fitness and survival of E. coli that are thriving in mammary secretions. According to our results, lactoferrin has only weak impact on E. coli in mammary secretions. At the same time bacterial determinants involved in iron assimilation were negatively regulated, suggesting that, at least during the first hours, iron assimilation is not a challenge to E. coli colonizing the mammary gland. It has been hypothesized that cellular iron stores cause temporary independency to extracellular accessible iron. According to our transcriptome data, this hypothesis was supported and places iron uptake systems beyond the speculative importance that has been suggested before, at least during early phases of infection. It has also been shown that the ability to resist extracytoplasmic stress, by oxidative conditions as well as host defensins, is of substantial importance for bacterial survival in mammary secretions. In summary, the presented thesis addresses important aspects of host-pathogen interaction and bacterial conversion to hostile conditions during colonization of the mastitis inflammatory site, the mammary gland. N2 - Bei der bakteriellen Mastitis handelt es sich um eine Infektion der bovinen Milchdrüse, ausgelöst durch Eintritt und Wachstum der Bakterien im Euter der Kuh. Krankheitsverlauf und Ursache werden beeinflusst durch Umweltfaktoren, das Immunsystem des Wirtes und die Eigenschaften des bakteriellen Erregers. Die Spezies Escherichia coli (E. coli) ist einer der häufigsten Erreger der akuten bovinen Mastitis. Generell können pathogene E. coli -Stämme entsprechend ihres Infektionsortes in verschiedene Pathotypen klassifiziert werden, die durch eine individuelle Kombination verschiedener Virulenzfaktoren gekennzeichnet sind. Eine eindeutige Unterscheidung von E. coli –Mastitiserregern und kommensalen E. coli -Stämmen ist bisher nicht beschrieben. Diese Studie befasst sich mit der Charakterisierung virulenz-assozierter Eigenschaften von E. coli –Isolaten der bovinen Mastitis. Dazu wurden Untersuchungen unter Bedingungen durchgeführt, die denen während der Anfangsphase der Mastitis entsprechen. Die Virulenz und Fitness-assoziierten Eigenschaften ausgewählter E. coli Mastitis- und Fäkalisolate wurden in vergleichenden phenotypischen Assays identifiziert und analysiert. Zur Untersuchung der bakteriellen Fitness in Milchdrüsensekreten wurde native Molke mit antimikrobiellen Eigenschaften von Rohmilch genutzt. Dabei stellte sich heraus dass E. coli Fäkalisolate eine heterogene Gruppe bilden. Innerhalb dieser Gruppe wiesen einige Isolate eine verminderte Überlebensrate auf. Andere Fäkalisolate zeigten eine höhere Überlebensrate, ähnlich der Überlebensrate von Mastitiserregern. Im Gegensatz zum ihrem grundsätzlich guten Überleben in Molke zeigten Mastitisisolate keine einheitlichen phänotypischen Merkmale bei Wachstum mit 1) Lactose als einziger Kohlenstoffquelle, 2) Eisenlimitierung, oder 3) unter Einfluss von lingualem antimikrobiellem Peptid (LAP), einem bedeutenden Defensin der Wirtsantwort im Euter. Die verminderte Fähigkeit in Milchdrüsensekreten zu überleben korrelierte mit der konzentrationsabhängigen Überlebensfähigkeit in Gegenwart von LAP. Dies lässt vermuten dass eine Anpassung der Bakterien an die Lebensbedingungen in der bovinen Milchdrüse der Resistenz gegenüber Defensinen (u.a. LAP) bedarf. Den Mastitis-isolaten E. coli 1303 und ECC 1470 fehlen diverse Virulenzgene die bereits mit Mastitis assoziiert werden konnten. Um zu bestimmen ob Unterschiede in der Genexpression beider E. coli Isolate dazu beitragen Mastitis auszulösen, wurden Transkriptomanalysen durchgeführt. Dabei sollten vor allem Kandidatengene bestimmt werden, die an der Wirt-Pathogen-Interaktion beteiligt sind oder zur bakteriellen Fitness oder Virulenz der Erreger beitragen. Auf der Basis von DNA Microarrays wurde die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Gegenwart von immortalisierten Zellen des bovinen Milchdrüsenepithels (MAC-T) bestimmt. Zusätzlich wurde die Fähigkeit zur Zelladhäsion und Internalisierung beider Isolate untersucht. Die bakterielle Transkriptionsantwort in Gegenwart der Wirtszellen ergab, dass Erreger und Wirtszellen eher um den Bedarf an Nährstoffen und Sauerstoff konkurrierten, anstatt deutliche Anzeichen der Zelladhäsion oder Invasion zu zeigen. Beide Isolate nutzten vornehmlich Fitnesseigenschaften, die auch bei der Besiedlung des Darms als dem primären Habitat von E. coli verwendet werden. In dieser Studie wurde außerdem die Genexpression von E. coli 1303 und ECC 1470 in Reaktion auf Molke aus Rohmilch mittels Gesamt-Transkriptom-Sequenzierung (RNA Seq) untersucht. Die Transkriptomanalyse ergab keine wirklich deregulierten virulenz-assozierten Gene in einer der beiden E. coli Mastitis Isolate. Ferner konnten Eigenschaften identifiziert werden, die zum Wachstum und Überleben in nativer Molke beitragen. Die Fähigkeit, Citrat zu verwerten, begünstigt das erfolgreiche Überleben in Milchdrüsensekten und stellt einen wichtigen Fitnessfaktor dar. Unsere Transkriptomdaten bestätigen dass Lactoferrin nur geringen Einfluss auf das Wachstum, von E. coli in Milchdrüsensekreten, hat. Die Expression bakterieller Determinanten, die an der Aufnahme von Eisen beteiligt sind, wurde herunterreguliert. Dies lässt darauf schließen dass Eisenaufnahme in den ersten Stunden der Kolonisierung durch die Erreger keine essentielle Fitnesseigenschaft darstellt. Vermutlich reicht die intrazelluläre Menge an Eisen aus, um eine zeitweise Unabhängigkeit von extrazellular verfügbarem Eisen zu ermöglichen. Diese These konnte durch unsere Transkriptomdaten gestützt werden und stellt eine wichtige Entdeckung in Bezug auf die Verfügbarkeit von Eisen während der Kolonisierung der Milchdrüse dar. Unsere Daten zeigen, dass die Resistenz gegenüber extrazellulärem Stress durch oxidative Bedingungen und Defensine des Wirtes von großer Bedeutung für das bakterielle Überleben in Milchdrüsensekreten ist. Die vorliegende Thesis befasst sich mit wichtigen Aspekten der Wirt-Pathogen-Interaktion und der Anpassung an die antimikrobiellen Bedingungen während der Kolonisierung der Milchdrüse als Ort der Infektion. KW - Escherichia coli KW - mastitis KW - infection KW - virulence KW - transcriptome analysis KW - Kuh KW - Brustdrüsenentzündung KW - Virulenz Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100934 ER - TY - THES A1 - Matuschek, Anja T1 - Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells T1 - Charakterisierung tolerogener dendritischer Knochenmarkszellen und regulatorischer T-Lymphozyten aus der Ratte N2 - Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verfügen über die Fähigkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft für therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunität und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht für die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gewünschte Immunhemmung in vivo auszulösen und wie der möglichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist für die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso überraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorläuferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an natürlich vorkommenden Treg mit einem Phänotyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC-Klasse II Molekül, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression änderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verfügen somit über einen robusten und gegenüber Reifungssignalen überaus resistenten Phänotyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unfähig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verzögern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinausschüttung (IL-2 um 49% und IFN-γ um 92%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Moleküle zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC lässt ebenfalls eine Bedeutung dieser Moleküle bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung löslicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90%. Für diese Immunhemmung scheint das in diesen Überständen nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen Überstände reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50%, doch führte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Veränderungen auf molekularer Ebene festzustellen wären. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem können diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung naïver TLymphozyten hemmen. Naïve und aktivierte T-Lymphozyten können dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen lässt, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verstärkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus natürlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabhängig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der natürlich vorkommenden Treg zu erhöhen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Phänotyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten lässt, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empfängers zu untersuchen. N2 - Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Allogene Zelle KW - Transforming Growth Factor beta KW - tolerogen KW - Dendritische Zelle KW - regulatorische T-Zellen KW - allogen KW - TGF-ß KW - tolerogenic KW - dendritic cell KW - regulatory T cells KW - allogenic KW - TGF-ß Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51708 ER - TY - THES A1 - Heidenreich, Julius Frederik T1 - Characterization of the widely used Rac1-inhibitors NSC23766 and EHT1864 in mouse platelets T1 - Untersuchung der Rac1-Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 in murinen Thrombozyten N2 - Platelet activation and aggregation at sites of vascular injury is critical to prevent excessive blood loss, but may also lead to life-threatening ischemic diseases, such as myocardial infarction and stroke. Extracellular agonists induce platelet activation by stimulation of platelet membrane receptors. Signal transduction results in reorganization of the cytoskeleton, shape change, platelet adhesion and aggregation, cumulating in thrombus formation. Several Rho GTPases, including Rac1, Cdc42 and RhoA, are essential mediators of subsequent intracellular transduction of ITAM- and GPCR-signaling. Therefore, inhibition or knockout can result in severely defective platelet signaling. Mice with platelet specific Rac1-deficiency are protected from arterial thrombosis. This benefit highlights further investigation of Rac1-specific functions and its potential as a new pharmacological target for prevention of cardiovascular diseases. Two newly developed synthetic compounds, NSC23766 and EHT1864, were proposed to provide highly specific inhibition of Rac1 activity, but both drugs have never been tested in Rac1-deficient cell systems to rule out potential Rac1-independent effects. This study revealed significant off-target effects of NSC23766 and EHT1864 that occurred in a dose-dependent fashion in both wild-type and Rac1-deficient platelets. Both inhibitors individually affected resting platelets after treatment, either by altering membrane protein expression (NSC23766) or by a marked decrease of platelet viability (EHT1864). Platelet apoptosis could be confirmed by enhanced levels of phosphatidylserine exposure and decreased mitochondrial membrane potential. Phosphorylation studies of the major effector proteins of Rac1 revealed that NSC23766 and EHT1864 abolish PAK1/PAK2 activation independently of Rac1 in wild-type and knockout platelets, which may contribute to the observed off-target effects. Additionally, this study demonstrated the involvement of Rac1 in G protein-coupled receptor-mediated platelet activation and GPIb-induced signaling. Furthermore, the data revealed that Rac1 is dispensable in the process of integrin IIb 3-mediated clot retraction. This study unveiled that new pharmacological approaches in antithrombotic therapy with Rac1 as molecular target have to be designed carefully in order to obtain high specificity and minimize potential off-target effects. N2 - Die Aktivierung und Aggregation von Thrombozyten nach Gefäßverletzungen ist entscheidend um starken Blutverlust zu vermeiden. Allerdings können diese Prozesse auch zu lebensbedrohlichen ischämischen Erkrankungen führen, wie beispielsweise Myokardinfarkt und Schlaganfall. Die Stimulation der Membranrezeptoren durch Triggersubstanzen leitet die Thrombozytenaktivierung und somit die Reorganisation des Zytoskeletts ein. Dies ermöglicht die Adhäsion und Aggregation der Thrombozyten und führt letztendlich zur Thrombusbildung. Die Rho GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA sind als wichtige Mediatoren an der intrazellulären Signaltransduktion beteiligt. Eine medikamentöse Hemmung oder ein genetischer Knockout kann daher die intrazellulären Signalkaskaden so stark beeinträchtigen, dass eine effiziente Aktivierung der Thrombozyten nicht mehr möglich ist. In Mäusen mit thrombozytenspezifischem Knockout von Rac1 wurde festgestellt, dass der Funktionsverlust von Rac1 gleichzeitig auch Schutz vor der Entwicklung von arterieller Thrombose bedeutet. Könnte man sich diese Tatsache pharmakologisch zunutze machen, würde die Hemmung von Rac1 möglicherweise einen neuen, erfolgsversprechenden Ansatz in der Prävention von kardiovaskulären Erkrankungen darstellen. Für den Forschungseinsatz wurden die zwei synthetischen Inhibitoren NSC23766 und EHT1864 entwickelt um Rac1-vermittelte Funktionen zu studieren. Beide Substanzen versprechen eine hochspezifische Hemmung der Rac(1)-Aktivität, wurden bisher jedoch nicht in Zellsystemen mit Rac1-Defizienz verwendet um die Substanzen kritisch auf mögliche, unerwünschte Nebenwirkungen zu untersuchen. In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass NSC23766 und EHT1864 zwar effektive Hemmstoffe für Rac1 sind, allerdings genauso Rac1-unabhängige Nebenwirkungen verursachen. Beide Hemmstoffe führten zu Veränderungen der Thrombozyten: Während unter NSC23766 eine verminderte Expression von Membranrezeptoren beobachtet wurde, führte EHT1864 zu einer stark beeinträchtigten Vitalität der Thrombozyten. Anhand von erhöhten Phosphatidylserin-Werten und einer Veränderung des mitochondrialen Membranpotenzials in den behandelten Thrombozyten konnte die EHT1864-vermittelte Apoptose nachgewiesen werden. Letztendlich wurde anhand der verminderten Phosphorylierung von PAK1/PAK2 gezeigt, dass die Aktivierung dieser Rac1-Effektorproteine durch NSC23766 und EHT1864 direkt unterdrückt wird. Zusätzlich zu den Inhibitor-vermittelten Effekten wurde anhand von Rac1-defizienten Thrombozyten nachgewiesen, dass Rac1 auch an GPCR- und GPIb-vermittelten Signalkaskaden beteiligt ist. Außerdem wurde beobachtet, dass Rac1 für die Integrin IIb 3-vermittelte clot retraction entbehrlich ist. Die Ergebnisse dieser Studie legen dar, dass neue pharmakologische Substanzen für die antithrombotische Therapie mit Rac1 als Zielmolekül gründlich erforscht und hinterfragt werden müssen um die Spezifität zu maximieren und vor allem das Nebenwirkungsprofil zu minimieren. KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Signaltransduktion KW - Enzyminhibitor KW - Rho-Proteine KW - mouse platelets KW - rac1 inhibitors Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165453 ER - TY - THES A1 - Wolter, Patrick T1 - Characterization of the mitotic localization and function of the novel DREAM target GAS2L3 and Mitotic kinesins are regulated by the DREAM complex, often up-regulated in cancer cells, and are potential targets for anti-cancer therapy T1 - Charakterisierung der mitotischen Lokalisation und Funktion von GAS2L3, eines kürzlich gefundenen Zielgens des DREAM Komplexes und Mitotische Kinesine werden vom DREAM Komplex reguliert, sind in Krebszellen häufig hochreguliert und sind potentielle Zielle für die Krebstherapie N2 - The recently discovered human DREAM complex (for DP, RB-like, E2F and MuvB complex) is a chromatin-associated pocket protein complex involved in cell cycle- dependent gene expression. DREAM consists of five core subunits and forms a complex either with the pocket protein p130 and the transcription factor E2F4 to repress gene expression or with the transcription factors B-MYB and FOXM1 to promote gene expression. Gas2l3 was recently identified by our group as a novel DREAM target gene. Subsequent characterization in human cell lines revealed that GAS2L3 is a microtubule and F-actin cross-linking protein, expressed in G2/M, plays a role in cytokinesis, and is important for chromosomal stability. The aim of the first part of the study was to analyze how expression of GAS2L3 is regulated by DREAM and to provide a better understanding of the function of GAS2L3 in mitosis and cytokinesis. ChIP assays revealed that the repressive and the activating form of DREAM bind to the GAS2L3 promoter. RNA interference (RNAi) mediated GAS2L3 depletion demonstrated the requirement of GAS2L3 for proper cleavage furrow ingression in cytokinesis. Immunofluorescence-based localization studies showed a localization of GAS2L3 at the mitotic spindle in mitosis and at the midbody in cytokinesis. Additional experiments demonstrated that the GAS2L3 GAR domain, a putative microtubule- binding domain, is responsible for GAS2L3 localization to the constriction zones in cytokinesis suggesting a function for GAS2L3 in the abscission process. DREAM is known to promote G2/M gene expression. DREAM target genes include several mitotic kinesins and mitotic microtubule-associated proteins (mitotic MAPs). However, it is not clear to what extent DREAM regulates mitotic kinesins and MAPs, so far. Furthermore, a comprehensive study of mitotic kinesin expression in cancer cell lines is still missing. Therefore, the second major aim of the thesis was to characterize the regulation of mitotic kinesins and MAPs by DREAM, to investigate the expression of mitotic kinesins in cancer cell line panels and to evaluate them as possible anti-cancer targets. ChIP assays together with RNAi mediated DREAM subunit depletion experiments demonstrated that DREAM is a master regulator of mitotic kinesins. Furthermore, expression analyses in a panel of breast and lung cancer cell lines revealed that mitotic kinesins are up-regulated in the majority of cancer cell lines in contrast to non-transformed controls. Finally, an inducible lentiviral-based shRNA system was developed to effectively deplete mitotic kinesins. Depletion of selected mitotic kinesins resulted in cytokinesis failures and strong anti-proliferative effects in several human cancer cell lines. Thus, this system will provide a robust tool for future investigation of mitotic kinesin function in cancer cells. N2 - Der vor kurzem entdeckte humane DREAM Komplex (für DP,RB ähnlich, E2F und MuvB Komplex) ist ein Chromatin bindender Pocket-Protein-Komplex involviert in Zellzyklusphase abhängiger Genregulation. DREAM besteht aus fünf Kernproteinen, die entweder zusammen mit dem Pocket-Protein p130 und dem Transkriptionsfaktor E2F4 die Genexpression reprimieren oder zusammen mit den Transkriptionsfaktoren B-MYB und FOXM1 die Genexpression fördern. GAS2L3 wurde vor kurzem als neues Zielgen des DREAM Komplexes identifiziert. Eine anschließende Charakterisierung in humanen Zelllinien offenbarte, dass GAS2L3 in der Lage ist, das F-Aktin und das Mikrotubuli Cytoskelett zu binden und zu vernetzen. Außerdem ist GAS2L3 speziell während der G2/M Phase exprimiert, spielt eine Rolle in der Cytokinese und ist wichtig für die genomische Integrität. Der erste Teil der Arbeit hatte zum Ziel zu ergründen in welcher Art und Weise DREAM GAS2L3 reguliert. Außerdem sollte das Verständnis der Rolle von GAS2L3 in der Cytokinese erweitert werden. Hierzu durchgeführte ChIP Analysen zeigten, dass sowohl der reprimierende als auch der aktivierende DREAM Komplex an den Promoter von GAS2L3 bindet. Experimente, in denen GAS2L3 durch RNA-Interferenz (RNAi) depletiert wurde, demonstrierten, dass GAS2L3 in der Cytokinese am Prozess der Einschnürung der Teilungsfurche beteiligt ist. Anschließende auf Immunfluoreszenzmikroskopie basierende Lokalisationsstudien zeigten, dass GAS2L3 an der mitotischen Spindel in der Mitose und am Midbody in der Cytokinese lokalisiert ist. Weiterführende Studien zeigten, dass die GAR Domäne von GAS2L3, eine mutmaßliche Mikrotubuli- Bindedomäne, für die Lokalisierung von GAS2L3 in der für die Abszission wichtigen Konstriktionszone verantwortlich ist. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass GAS2L3 eine Rolle in diesem Prozess spielt. Der DREAM Komplex ist bekannt dafür G2/M Genexpression zu fördern. G2/M Zielgene des Komplexes sind unter anderem mehrere mitotische Kinesine und mitotische Mikrotubuli-Bindeproteine. Bisher ist die Art und Weise und das Ausmaß der Regulierung dieser Proteingruppen durch DREAM aber nur ungenügend untersucht worden. Des Weiteren fehlt bisher eine umfassende Charakterisierung der Expression von mitotischen Kinesinen in Krebszellen. Deswegen befasste sich der zweite Teil der Arbeit mit der Charakterisierung der Regulation von mitotischen Kinesinen und Mikrotubuli-Bindeproteinen durch DREAM, untersuchte die Expression dieser beiden Proteingruppen in Krebszelllinien und evaluierte diese anschließend als potentielle Ziele für die Krebstherapie. Eine Kombination aus ChIP Analysen und RNAi Experimenten zeigte, dass DREAM eine zentrale Rolle in der Regulierung von mitotischen Kinesinen spielt. Expressions- analysen deckten auf, dass mitotische Kinesine in der Mehrheit der Krebszelllinien hochreguliert sind im Gegensatz zu den nicht entarteten Kontrollzelllinien. Schließlich wurde ein auf Lentiviren basierendes induzierbares shRNA System etabliert, welches mitotische Kinesine effektiv herunterregulieren konnte. Depletion ausgewählter mitotischer Kinesine führte zu Fehlern in der Cytokinese und hatte starke Auswirkungen auf das Wachstumsverhalten von mehreren Krebszelllinien. Aufgrund dieser Erkenntnisse wird das lentivirale System eine solide Ausgangsbasis für zukünftige Untersuchungen von mitotischen Kinesinen in Krebszellen bilden. KW - Zellzyklus KW - GAS2L3 KW - B-MYB KW - DREAM KW - cytokinesis KW - mitosis KW - kinesin KW - cancer KW - FOXM1 KW - regulation KW - Zellteilung KW - Regulation KW - Krebs KW - Biologie / Zellbiologie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122531 ER - TY - THES A1 - Riedel, Simone Stefanie T1 - Characterization of the fluorescence protein FP635 for in vivo imaging and establishment of a murine multiple myeloma model for non-invasive imaging of disease progression and response to therapy T1 - Charakterisierung des Fluoreszenzproteins FP635 für die in vivo Bildgebung und Etablierung eines Maus Modells für die nicht invasive Bildgebung des Krankheitsverlaufes und Ansprechen auf Therapien imMultiplen Myelom N2 - Optical in vivo imaging methods have advanced the fields of stem cell transplantation, graft-versus–host disease and graft-versus-tumor responses. Two well known optical methods, based on the transmission of light through the test animal are bioluminescence imaging (BLI) and fluorescence imaging (FLI). Both methods allow whole body in vivo imaging of the same animal over an extended time span where the cell distribution and proliferation can be visualized. BLI has the advantages of producing almost no unspecific background signals and no necessity for external excitation light. Hence, BLI is a highly sensitive and reliable detection method. Yet, the BLI reporter luciferase is not applicable with common microscopy techniques, therefore abolishing this method for cellular resolution imaging. FLI in turn, presents the appealing possibility to use one fluorescent reporter for whole body imaging as well as cellular resolution applying microscopy techniques. The absorption of light occurs mainly due to melanin and hemoglobin in wavelengths up to 650 nm. Therefore, the wavelength range beyond 650 nm may allow sensitive optical imaging even in deep tissues. For this reason, significant efforts are undertaken to isolate or develop genetically enhanced fluorescent proteins (FP) in this spectral range. “Katushka” also called FP635 has an emission close to this favorable spectrum and is reported as one of the brightest far-red FPs. Our experiments also clearly showed the superiority of BLI for whole body imaging over FLI. Based on these results we applied the superior BLI technique for the establishment of a pre-clinical multiple myeloma (MM) mouse model. MM is a B-cell disease, where malignant plasma cells clonally expand in the bone marrow (BM) of older people, causing significant morbidity and mortality. Chromosomal abnormalities, considered a hallmark of MM, are present in nearly all patients and may accumulate or change during disease progression. The diagnosis of MM is based on clinical symptoms, including the CRAB criteria: increased serum calcium levels, renal insufficiency, anemia, and bone lesions (osteolytic lesions or osteoporosis with compression fractures). Other clinical symptoms include hyperviscosity, amyloidosis, and recurrent bacterial infections. Additionally, patients commonly exhibit more than 30% clonal BM plasma cells and the presence of monoclonal protein is detected in serum and/or urine. With current standard therapies, MM remains incurable and patients diagnosed with MM between 2001 and 2007 had a 5-year relative survival rate of only 41%. Therefore, the development of new drugs or immune cell-based therapies is desirable and necessary. To this end we developed the MOPC-315 cell line based syngeneic MM mouse model. MOPC-315 cells were labeled with luciferase for in vivo detection by BLI. We validated the non-invasively obtained BLI data with histopathology, measurement of idiotype IgA serum levels and flow cytometry. All methods affirmed the reliability of the in vivo BLI data for this model. We found that this orthotopic MM model reflects several key features of the human disease. MOPC-315 cells homed efficiently to the BM compartment including subsequent proliferation. Additionally, cells disseminated to distant skeletal parts, leading to the typical multifocal MM growth. Osteolytic lesions and bone remodeling was also detected. We found evidence that the cell line had retained plasticity seen by dynamic receptor expression regulation in different compartments such as the BM and the spleen. N2 - Optische in vivo bildgebende Verfahren haben die Felder der Stammzelltransplantation, Graft-versus-Host Krankheit und Graft-versus-Tumor Reaktion vorangebracht. Zwei gut bekannte optische Methoden, die auf der transmission von Licht durch das Versuchtier basieren, sind die Biolumineszenz Bildgebung (BLI) und die Fluoreszenz Bildgebung (FLI). Beide Methoden erlauben die in vivo Ganzkörperbildgebung desselben Tieres über lange Zeit wärenddessen die Zellverteilung und Proliferation sichtbar gemacht werden kann. Vorteil der BLI ist, dass beinahe keine unspezifischen Hintergrundsignale erzeugt werden und keine Notwendigkeit für Anregungslicht besteht. Daher ist BLI eine hochsensitive und verlässliche Detektionsmethode. Jedoch erlaubt der BLI Reporter, die Luziferase, keine Anwendung mit gängigen Mikroskopieanwendungen und verhindert daher, dass diese Methode für die Bildgebung auf zellulärer Ebene genutzt werden kann. FLI wiederum bietet die attraktive Möglichkeit einen fluoreszenten Reporter sowohl für die Bildgebung des gesamten Körpers, als auch auf zellulärer Ebene durch die Anwendung von Mikroskopietechniken zu nutzen. Derzeit bestehen noch größere Einschränkungen bei der Arbeit mit fluoreszent markierten Zellen innerhalb eines Tieres. Die allgemeine Autofluoreszenz des umliegenden Gewebes führt zu hohen Hintergrundsignalen. Zusätzlich werden sowohl das Anregungslicht als auch die emittierte Fluoreszenz durch das umliegende Gewebe abgeschwächt. Die Absorption des Lichtes geschieht hauptsächlich durch Melanin und Hämoglobin in Wellenlängen bis zu 650 nm. Daher könnte der Wellenlängenbereich über 650 nm sensitive optische Bildgebung auch in tief liegendem Gewebe ermöglichen. Aus diesem Grund werden erhebliche Anstrenungen unternommen um Fluoreszenzproteine (FP) in diesem spektralen Bereich zu isolieren oder genetisch verbesserte zu entwickeln. „Katushka“ auch FP635 genannt hat eine Emission, die nahe an diesem günstigen Spektrum liegt und wurde als eines der hellsten dunkelroten FPs beschrieben. Wir untersuchten FP635 für die Anwendung als sensitiver Einzelreporter für die Detektion immunologischer Prozesse von der Ganzkörper- bis zur Einzelzellbildgebung. Unsere Experimente zeigten auch deutlich die Überlegenheit der BLI über die FLI für die Ganzkörperbildgebung. Basierend auf diesen Ergebnissen setzten wir die überlegene BLI für die Etablierung eines präklinischen Mausmodells des Multiplen Myeloms (MM) ein. MM ist eine B-Zell Erkrankung wobei maligne Plasmazellen klonal im Knochenmark (BM) älterer Menschen expandieren und erhebliche Morbidität und Sterblichkeit verursacht. Chromosomale Abnormitäten gelten als Kennzeichen des MM, sind bei beinahe allen Patienten vorhanden und können sich während des Krankheitsverlaufes anhäufen oder verändern. Die Diagnose des MM basiert auf klinischen Syptomen inklusive der folgenden Kriterien: erhöhte Serum Kalzium Konzentration, Niereninsuffizienz, Anämie und Knochenläsionen (osteolytische Läsionen oder Osteoporose mit Kompressionsfrakturen). Weitere klinische Symptome beinhalten Hyperviskosität, Amyloidose und wiederkehrende bakterielle Infektionen. Zusätzlich zeigen Patienten verbreitet mehr als 30% klonale BM Plasmazellen und monoklonales Protein ist in Serum und/oder Urin detektierbar. Mit derzeitigen Standardtherapien bleibt MM unheilbar und Patienten, die zwischen 2001 und 2007 mit MM diagnostiziert wurden hatten eine relative 5-jahres Überlebensrate von nur 41%. Daher ist die Entwicklung neuer Medikamente und immunzellbasierten Therapien wünschenswert und notwendig. Zu diesem Zweck entwickelten wir das auf der Zelllinie MOPC-315 basierende syngene MM Mausmodell. Die MOPC-315 Zellen wurden für die in vivo Detektion mittels BLI mit Luziferase markiert. Wir validierten die nichtinvasiv gewonnenen BLI Daten mit Histopathologie, der Messung des idiotypen IgA Spiegels im Serum und Durchflusszytometrie. Alle Methoden bekräftigten die Zuverlässigkeit in vivo BLI Daten für dieses Modell. Wir stellten fest, dass dieses orthotope MM Modell einige Hauptmerkmale der menschlichen Erkrankung widerspiegelt. Die MOPC-315 Zellen wanderten effizient in das BM Kompartiment inklusive darauffolgender Proliferation. Ausserdem, streuten die Zellen in entfernte Teile des Skeletts aus was zum typischen multifokalen MM Wachstum führte. Wir stellten auch osteolytische Läsionen und Knochenumbau fest. Wir fanden Hinweise darauf, dass sich die Zelllinie Plastizität bewahrte was durch die dynamische Regulation der Rezeptorexpression in verschiedenen Kompartimenten, wie dem BM und der Milz, sichtbar wurde. KW - Fluoreszenzproteine KW - Plasmozytom KW - Biolumineszenzmessung KW - Maus KW - Multiple myeloma KW - bioluminescence imaging KW - fluorescence imaging KW - FP635 KW - mouse model KW - nichtinvasive Bildgebung KW - Multiples Myelom Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77894 ER - TY - THES A1 - Weisert, Nadine T1 - Characterization of telomere-associated proteins in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Charakterisierung Telomer-assoziierter Proteine in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The unicellular pathogen Trypanosoma brucei is the causative agent of African trypanosomiasis, an endemic disease prevalent in sub-Saharan Africa. Trypanosoma brucei alternates between a mammalian host and the tsetse fly vector. The extracellular parasite survives in the mammalian bloodstream by periodically exchanging their ˈvariant surface glycoproteinˈ (VSG) coat to evade the host immune response. This antigenic variation is achieved through monoallelic expression of one VSG variant from subtelomeric ˈbloodstream form expression sitesˈ (BES) at a given timepoint. During the differentiation from the bloodstream form (BSF) to the procyclic form (PCF) in the tsetse fly midgut, the stage specific surface protein is transcriptionally silenced and replaced by procyclins. Due to their subtelomeric localization on the chromosomes, VSG transcription and silencing is partly regulated by homologues of the mammalian telomere complex such as TbTRF, TbTIF2 and TbRAP1 as well as by ˈtelomere-associated proteinsˈ (TelAPs) like TelAP1. To gain more insights into transcription regulation of VSG genes, the identification and characterization of other TelAPs is critical and has not yet been achieved. In a previous study, two biochemical approaches were used to identify other novel TelAPs. By using ˈco-immunoprecipitationˈ (co-IP) to enrich possible interaction partners of TbTRF and by affinity chromatography using telomeric repeat oligonucleotides, a listing of TelAP candidates has been conducted. With this approach TelAP1 was identified as a novel component of the telomere complex, involved in the kinetics of transcriptional BES silencing during BSF to PCF differentiation. To gain further insights into the telomere complex composition, other previously enriched proteins were characterized through a screening process using RNA interference to deplete potential candidates. VSG expression profile changes and overall proteomic changes after depletion were analyzed by mass spectrometry. With this method, one can gain insights into the functions of the proteins and their involvement in VSG expression site regulation. To validate the interaction of proteins enriched by co-IP with TbTRF and TelAP1 and to identify novel interaction proteins, I performed reciprocal affinity purifications of the four most promising candidates (TelAP2, TelAP3, PPL2 and PolIE) and additionally confirmed colocalization of two candidates with TbTRF via immunofluorescence (TelAP2, TelAP3). TelAP3 colocalizes with TbTRF and potentially interacts with TbTRF, TbTIF2, TelAP1 and TelAP2, as well as with two translesion polymerases PPL2 and PolIE in BSF. PPL2 and PolIE seem to be in close contact to each other at the telomeric ends and fulfill different roles as only PolIE is involved in VSG regulation while PPL2 is not. TelAP2 was previously characterized to be associated with telomeres by partially colocalizing with TbTRF and cells show a VSG derepression phenotype when the protein was depleted. Here I show that TelAP2 interacts with the telomere-binding proteins TbTRF and TbTIF2 as well as with the telomere-associated protein TelAP1 in BSF and that TelAP2 depletion results in a loss of TelAP1 colocalization with TbTRF in BSF. In conclusion, this study demonstrates that characterizing potential TelAPs is effective in gaining insights into the telomeric complex's composition and its role in VSG regulation in Trypanosoma brucei. Understanding these interactions could potentially lead to new therapeutic targets for combatting African trypanosomiasis. N2 - Der einzellige Pathogen Trypanosoma brucei ist der Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis, eine endemische Krankheit vertreten in der Sub-Sahara Zone Afrikas. Trypanosoma brucei wechselt zwischen einem Säugerwirt und dem Insektenvektor, der Tsetse-Fliege. Der im Blutstrom des Säugers vorkommende, extrazelluläre Parasit ändert seinen Oberflächenmantel bestehend aus dem ˈvariablen Oberflächenproteinˈ (VSG) in periodischen Abständen, um der Immunantwort des Wirtes auszuweichen. Diese antigenetische Variation wird durch die monoallelische Expression einer einzelnen VSG-Variante, lokalisiert auf den ˈBlutstromform Expressionsseitenˈ (BES), zu einem bestimmten Zeitpunkt erreicht. Diese stadienspezifischen Oberflächenproteine werden während der Differenzierung der ˈBlutstromformˈ (BSF) zur ˈprozyklischen Formˈ (PCF) im Mitteldarm der Tsetse-Fliege stillgelegt und durch Prozykline ersetzt. Wegen der subtelomeren Lokalisation wird die VSG Transkription und Stilllegung teilweise durch Homologe des Säuger Telomerkomplexes TbTRF, TbTIF2 und TbRAP1 als auch durch Telomer-assoziierte Proteine (TelAPs) wie TelAP1 reguliert. Um Einblicke in die Transkriptionsregulation der VSG Gene zu erhalten, ist die Identifikation und Charakterisierung anderer Telomer-assoziierter Proteine von großem Interesse. In einer vorherigen Studie wurden zwei komplementäre biochemische Versuchsansätze verwendet, um weitere neue TelAPs zu identifizieren. Es wurde eine ko-Immunpräzipitation (co-IP) durchgeführt, um mögliche Interaktionspartner von TbTRF zu identifizieren, sowie eine Affinitätschromatographie unter Verwendung telomerischen Wiederholungseinheiten. Hierdurch wurde eine Liste von potenziellen Kandidaten generiert. Mit diesem Ansatz wurde TelAP1 als neue Komponente des Telomerkomplexes identifiziert, welches an der Kinetik der transkriptionellen BES-Stilllegung während der Differenzierung von BSF zu PCF beteiligt ist. Um weitere Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes zu erhalten, wurden zuvor angereicherte Proteine durch einen Screening-Prozess unter Verwendung von RNA-Interferenz charakterisiert. Nach der Depletion von 21 Proteinen wurden massenspektrometrische Analysen der VSG Expressionsprofiländerungen sowie allgemeine Veränderungen des Proteomenprofils analysiert. Mit dieser Methode können Erkenntnisse über die Funktion der jeweiligen Proteine und ihrer Beteiligung an der Regulierung der antigenetischen Variation von T. brucei gewonnen werden. Um die Interaktionen von Proteinen zu validieren, welche bei den Co-Immunpräzipitationen mit TbTRF und TelAP1 angereichert wurden, habe ich eine reziproke Affinitätschromatographie mit vier der vielversprechendsten Kandidaten durchgeführt (TelAP2, TelAP3, PPL2 und PolIE). Zusätzlich bestätigte ich die Co-lokalisation von zwei Kandidaten mit TbTRF via Immunfluoreszenzaufnahmen (TelAP2, TelAP3). TelAP3 ko-lokalisiert mit TbTRF und TelAP1 und interagiert potenziell mit TbTRF, TbTIF2, TelAP1 und TelAP2 als auch mit den zwei Transläsionspolymerasen PPL2 und PolIE in BSF. PPL2 und PolIE stehen in engem Kontakt zueinander und nehmen an den Telomerenden unterschiedliche Funktionen ein, da nur PolIE an der VSG Regulation beteiligt ist. TelAP2 wurde in einer vorherigen Publikation als Telomer-assoziiertes Protein durch partielle Co-Lokalisation mit TbTRF identifiziert und Zellen zeigen nach der Depletion von TelAP2 eine Derepression von zuvor stillgelegten VSGs. In dieser Studie zeige ich, dass TelAP2 mit den Telomer-bindenden Proteinen TbTRF und TbTIF2 sowie mit dem telomerassoziierten Protein TelAP1 in BSF interagiert und dass die Depletion von TelAP2 zu dem Verlust der Co-Lokalisation von TelAP1 mit TbTRF in BSF führt. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Charakterisierung potenzieller TelAPs dazu beiträgt, Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes und dessen Rolle bei der VSG-Regulation in Trypanosoma brucei zu gewinnen. Das Verständnis dieser Interaktionen könnte möglicherweise zu neuen therapeutischen Ansatzpunkten zur Bekämpfung der afrikanischen Trypanosomiasis führen. KW - Telomer KW - Trypanosoma brucei KW - telomere-associated protein Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352732 ER - TY - THES A1 - Aster, Hans-Christoph T1 - Characterization of subgroups in fibromyalgia syndrome T1 - Charakterisierung von Subgruppen des Fibromyalgie-Syndroms N2 - The present cumulative dissertation summarizes three clinical studies, which examine subgroups of patients within the fibromyalgia syndrome (FMS). FMS entails chronic pain and associated symptoms, and its pathophysiology is incompletely understood (1). Previous studies show that there is a subgroup of patients with FMS with objective histological pathology of the small nerve fibers of the peripheral nervous system (PNS). Another subgroup of FMS patients does not show any signs of pathological changes of the small nerve fibers. The aim of this dissertation was to compare FMS patients with healthy controls, and these two FMS subgroups for differences in the central nervous system (CNS) in order to explore possible interactions between PNS and the CNS. Regarding the CNS, differences of FMS patients with healthy controls have already been found in studies with small sample sizes, but no subgroups have yet been identified. Another aim of this thesis was to test whether the subgroups show a different response to different classes of pain medication. The methods used in this thesis are structural and functional magnetic resonance imaging (MRI), magnetic resonance diffusion imaging and magnetic resonance spectroscopy. For the evaluation of clinical symptoms, we used standardized questionnaires. The subgroups with and without pathologies of the PNS were determined by skin biopsies of the right thigh and lower leg based on the intraepidermal nerve fiber density (IENFD) of the small nerve fibers. 1) In the first MRI study, 43 female patients with the diagnosis of FMS and 40 healthy control subjects, matched in age and body mass index, were examined with different MRI sequences. Cortical thickness was investigated by structural T1 imaging, white matter integrity by diffusion tensor imaging and functional connectivity within neuronal networks by functional resting state MRI. Compared to the controls, FMS patients had a lower cortical volume in bilateral frontotemporoparietal regions and the left insula, but a higher cortical volume in the left pericalcarine cortex. Compared to the subgroup without PNS pathology, the subgroup with PNS pathology had lower cortical volume in both pericalcarine cortices. Diffusion tensor imaging revealed an increased fractional anisotropy (FA) of FMS patients in corticospinal pathways such as the corona radiata, but also in regions of the limbic systems such as the fornix and cingulum. Subgroup comparison again revealed lower mean FA values of the posterior thalamic radiation and the posterior limb of the left internal capsule in the subgroup with PNS pathology. In the functional connectivity analysis FMS patients, compared to controls, showed a hypoconnectivity between the right median frontal gyrus and the posterior cerebellum and the right crus cerebellum, respectively. In the subgroup comparisons, the subgroup with PNS pathology showed a hyperconnectivity between both inferior frontal gyri, the right posterior parietal cortex and the right angular gyrus. In summary, these results show that differences in brain morphology and functional connectivity exist between FMS patients with and without PNS pathology. These differences were not associated with symptom duration or severity and, in some cases, have not yet been described in the context of FMS. The differences in brain morphology and connectivity between subgroups could also lead to a differential response to treatment with centrally acting drugs. Further imaging studies with FMS patients should take into account this heterogeneity of FMS patient cohorts. 2) Following the results from the first MRI study, drug therapies of FMS patients and their treatment response were compared between PNS subgroups. As there is no licensed drug for FMS in Europe, the German S3 guideline recommends amitriptyline, duloxetine and pregabalin for temporary use. In order to examine the current drug use in FMS patients in Germany on a cross-sectional basis, 156 patients with FMS were systematically interviewed. The drugs most frequently used to treat pain in FMS were non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) (28.9%), metamizole (15.4%) and amitriptyline (8.8%). Pain relief assessed by patients on a numerical rating scale from 0-10 averaged 2.2 points for NSAIDs, 2.0 for metamizole and 1.5 for amitriptyline. Drugs that were discontinued for lack of efficacy and not for side effects were acetaminophen (100%), flupirtine (91.7%), selective serotonin reuptake inhibitors (81.8%), NSAIDs (83.7%) and weak opioids (74.1%). Patients were divided into subgroups with and without PNS pathology as determined by skin biopsies. We found no differences in drug use and effect between the subgroups. Taken together, these results show that many FMS patients take medication that is not in accordance with the guidelines. The reduction of symptoms was best achieved with metamizole and NSAIDs. Further longitudinal studies on medication in FMS are necessary to obtain clearer treatment recommendations. 3) Derived from previous pharmacological and imaging studies (with smaller case numbers), there is a hypothesis in the FMS literature that hyperreactivity of the insular cortex may have an impact on FMS. The hyperreactivity seems to be due to an increased concentration of the excitatory neurotransmitter glutamate in the insular cortex of FMS patients. The hypothesis is supported by magnetic resonance spectroscopy studies with small number of cases, as well as results from pharmacological studies with glutamate-inhibiting medication. Studies from animal models have also shown that an artificially induced increase in glutamate in the insular cortex can lead to reduced skin innervation. Therefore, the aim of this study was to compare glutamate and GABA concentrations in the insular cortex of FMS patients with those of healthy controls using magnetic resonance imaging. There was no significant difference of both neurotransmitters between the groups. In addition, there was no correlation between the neurotransmitter concentrations and the severity of clinical symptoms. There were also no differences in neurotransmitter concentrations between the subgroups with and without PNS pathology. In conclusion, our study could not show any evidence of a correlation of glutamate and GABA concentrations with the symptoms of FMS or the pathogenesis of subgroups with PNS pathologies. N2 - Die vorliegende kumulative Dissertation fasst drei klinische Studien zusammen, welche Unterschiede zwischen Patientinnen mit Fibromyalgiesyndrom (FMS) und gesunden Kontrollen, sowie Subgruppen des FMS untersuchen. Das FMS wird als chronisches Schmerzsyndrom mit Begleitsymptomen wie Depressionen, gastrointestinalen Symptomen oder Erschöpfung definiert. Die Pathophysiologie ist noch nicht vollständig geklärt (1). Frühere Studien zeigen, dass es eine Subgruppe von PatientInnen mit FMS gibt, welche objektive, histologische Pathologien der kleinen Nervenfasern des peripheren Nervensystems (PNS) aufweisen. Eine andere Subgruppe von FMS-Patienten zeigt keinerlei Anzeichen für pathologische Veränderungen dieser kleinen Nervenfasern. Ziel dieser Dissertation ist es, diese beiden Subgruppen auf Unterschiede im zentralen Nervensystem (ZNS) hin zu vergleichen, um mögliche Wechselwirkungen zwischen dem PNS und ZNS zu untersuchen. Hinsichtlich des ZNS wurden bereits Unterschiede zwischen FMS-Patienten und gesunden Kontrollpersonen in Studien mit kleineren Fallzahlen festgestellt, jedoch wurden noch keine Subgruppen identifiziert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, zu prüfen, ob die Subgruppen von FMS PatientInnen unterschiedlich auf verschiedene Arten von Schmerzmedikamenten ansprechen. Die in dieser Arbeit verwendeten Methoden sind die strukturelle und funktionelle Magnetresonanztomographie (MRT), die Magnetresonanz-Diffusionsbildgebung und die Magnetresonanzspektroskopie. Für die Bewertung der klinischen Symptome wurden standardisierte Fragebögen verwendet. Die Subgruppen mit und ohne Pathologien des peripheren Nervensystems (PNS) wurden durch Hautbiopsien des rechten Ober- und Unterschenkels anhand der intraepidermalen Nervenfaserdichte der kleinen Nervenfasern bestimmt. 1) In der ersten MRT-Studie wurden 43 Patientinnen mit der Diagnose eines FMS und 40 gesunde Kontrollpersonen, die hinsichtlich Alter und Body-Mass-Index gematcht waren, mit verschiedenen Sequenzen der Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht. Das Volumen des Kortex wurde mittels struktureller T1-Bildgebung, die Integrität der weißen Substanz mittels Diffusionstensor-Bildgebung und die funktionelle Konnektivität innerhalb neuronaler Netzwerke mittels einer funktionellen Ruhezustands-MRT untersucht. Im Vergleich zu den Kontrollpersonen hatten FMS-Patientinnen ein geringeres Kortexvolumen der bilateralen frontotemporoparietalen Regionen und der linken Inselrinde, aber ein höheres Kortexvolumen im linken pericalcarinen Kortex. Im Vergleich zu der Untergruppe ohne PNS-Pathologien wies die Untergruppe mit PNS-Pathologien ein geringeres Kortexvolumen in beiden pericalcarinen Kortizes auf. Die Diffusions-Tensor-Bildgebung zeigte eine erhöhte fraktionelle Anisotropie (FA) der FMS PatientInnen in kortikospinalen Bahnen wie der Corona radiata, aber auch in Regionen des limbischen Systems wie dem Fornix und dem Cingulum. Ein Subgruppenvergleich ergab wiederum niedrigere mittlere FA-Werte in der Subgruppe mit PNS-Pathologien bezüglich der hinteren Thalamusausstrahlung und des hinteren Schenkels der linken Capsula interna. In der Analyse der funktionellen Konnektivität zeigten FMS-Patienten im Vergleich zu den Kontrollen eine Hypokonnektivität zwischen dem rechten medianen frontalen Gyrus und dem hinteren Kleinhirn bzw. dem rechten Kleinhirn. In den Subgruppenvergleichen zeigte die Subgruppe mit PNS-Pathologien eine Hyperkonnektivität zwischen beiden inferioren frontalen Gyri, dem rechten posterioren parietalen Kortex und dem rechten Gyrus angularis. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass zwischen FMS Patienten mit und ohne PNS-Pathologie Unterschiede in der Hirnmorphologie und funktionellen Konnektivität bestehen. Diese Unterschiede waren nicht mit der Dauer oder Ausprägung der Symptome assoziiert und sind teilweise noch nicht im Zusammenhang mit dem FMS beschrieben worden. Die Unterschiede in der Hirnmorphologie und Konnektivität zwischen den Subgruppen könnte auch zu einem unterschiedlichen Ansprechen auf die Behandlung mit zentral wirksamen Medikamenten führen. Weitere bildgebende Studien mit FMS-PatientInnen sollten diese Heterogenität von FMS-Patientenkohorten berücksichtigen. 2) Den Ergebnissen der ersten MRT-Studie folgend wurden die medikamentösen Therapien von FMS-PatientInnen und ihr Ansprechen auf die Behandlung zwischen den PNS-Subgruppen verglichen. Da es in Europa kein zugelassenes Medikament für das FMS gibt, empfiehlt die deutsche S3-Leitlinie Amitriptylin, Duloxetin und Pregabalin zur vorübergehenden Anwendung. Um den aktuellen Medikamenteneinsatz bei FMS-Patienten in Deutschland im Querschnitt zu untersuchen, wurden 156 PatientInnen mit FMS systematisch befragt. Die am häufigsten verwendeten Medikamente zur Schmerzbehandlung bei FMS waren nicht-steroidale Antirheumatika (NSAIDs) (28,9 %), Metamizol (15,4 %) und Amitriptylin (8,8 %). Die von den Patienten auf einer numerischen Bewertungsskala von 0-10 bewertete Schmerzlinderung betrug im Durchschnitt 2,2 Punkte für NSAIDs, 2,0 für Metamizol und 1,5 für Amitriptylin. Medikamente, die wegen mangelnder Wirksamkeit und nicht wegen Nebenwirkungen abgesetzt wurden, waren Paracetamol (100 %), Flupirtin (91,7 %), selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (81,8 %), NSAIDs (83,7 %) und schwache Opioide (74,1 %). Die Patienten wurden in Subgruppen mit und ohne PNS-Pathologien eingeteilt, welche, wie schon beschrieben, anhand von Hautbiopsien bestimmt wurden. Wir fanden keine Unterschiede zwischen den Subgruppen in Bezug auf die Medikamenteneinnahme und deren Wirkung. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass viele FMS-PatientInnen Medikamente einnehmen, die nicht mit den Leitlinien übereinstimmen. Die Reduzierung der Symptome wurde am besten mit Metamizol und NSAIDs erreicht. Weitere Längsschnittstudien zur Medikation bei FMS wären hilfreich, um breitere Behandlungsempfehlungen zu erhalten. 3) Abgeleitet aus den bisherigen pharmakologischen und bildgebenden Studien (mit kleineren Fallzahlen) besteht in der FMS Literatur die Hypothese, dass eine Hypersensitivität der Inselrinde einen Einfluss auf die FMS-Symptomatik haben könnte. Diese Hypersensitivität könnte durch eine erhöhte Konzentration des erregenden Neurotransmitters Glutamat in der Inselrinde von FMS Patienten bedingt sein. Diese Hypothese wird durch Magnetresonanzspektroskopie-Studien mit kleinen Fallzahlen, sowie Ergebnissen aus pharmakologischen Studien mit Glutamat-hemmender Medikation gestützt. Studien aus dem Tiermodell konnten außerdem zeigen, dass ein künstlich herbeigeführter Anstieg von Glutamat in der Inselrinde zu einer Reduktion der kleinen Nervenfasern im PNS führen kann. Ziel dieser Studie war es deshalb, mittels Magnetresonanztomographie die Glutamat- und GABA Konzentrationen der Inselrinde von FMS Patienten mit denen von gesunden Kontrollen zu vergleichen. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied beider Neurotransmitter zwischen den Gruppen. Es konnte ebenfalls kein Zusammenhang zwischen den Konzentrationen und der Ausprägung der klinischen Symptomatik bewiesen werden. Auch zwischen den Subgruppen mit und ohne PNS Pathologie zeigten sich keine Unterschiede in der Neurotransmitterkonzentration. Zusammenfassend konnte unsere Studie keinen Hinweis auf einen Zusammenhang der Glutamat- und GABA- Konzentrationen in der Inselrinde mit der Symptomatik des FMS oder der Entstehung von Subgruppen mit PNS Pathologien zeigen. KW - Fibromyalgie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313049 ER - TY - THES A1 - Tian, Yuehui T1 - Characterization of novel rhodopsins with light-regulated cGMP production or cGMP degradation T1 - Charakterisierung neuartiger Rhodopsine mit Licht-regulierter cGMP-Produktion oder cGMP-Degradation N2 - Photoreceptors are widely occurring in almost all kingdoms of life. They mediate the first step in sensing electromagnetic radiation of different wavelength. Absorption spectra are found within the strongest radiation from the sun and absorption usually triggers downstream signaling pathways. Until now, mainly 6 classes of representative photoreceptors are known: five water-soluble proteins, of these three classes of blue light-sensitive proteins including LOV (light-oxygen-voltage), BLUF (blue-light using FAD), and cryptochrome modules with flavin (vitamin B-related) nucleotides as chromophore; while two classes of yellow and red light-sensitive proteins consist of xanthopsin and phytochrome, respectively. Lastly, as uniquely integral membrane proteins, the class of rhodopsins can usually sense over a wide absorption spectrum, ranging from ultra-violet to green and even red light. Rhodopsins can be further divided into two types, i.e., microbial (type I) and animal (type II) rhodopsins. Rhodopsins consist of the protein opsin and the covalently bound chromophore retinal (vitamin A aldehyde). In this thesis, I focus on identification and characterization of novel type I opsins with guanylyl cyclase activity from green algae and a phosphodiesterase opsin from the protist Salpingoeca rosetta. Until 2014, all known type I and II rhodopsins showed a typical structure with seven transmembrane helices (7TM), an extracellular N-terminus and a cytosolic C-terminus. The proven function of the experimentally characterized type I rhodopsins was membrane transport of ions or the coupling to a transducer which enables phototaxis via a signaling chain. A completely new class of type I rhodopsins with enzymatic activity was identified in 2014. A light-activated guanylyl cyclase opsin was discovered in the fungus Blastocladiella emersonii which was named Cyclop (Cyclase opsin) by Gao et al. (2015), after heterologous expression and rigorous in-vitro characterization. BeCyclop is the first opsin for which an 8 transmembrane helices (8TM) structure was demonstrated by Gao et al. (2015). Earlier (2004), a novel class of enzymatic rhodopsins was predicted to exist in C. reinhardtii by expressed sequence tag (EST) and genome data, however, no functional data were provided up to now. The hypothetical rhodopsin included an N-terminal opsin domain, a fused two-component system with histidinekinase and response regulator domain, and a C-terminal guanylyl cyclase (GC) domain. This suggested that there could be a biochemical signaling cascade, integrating light-induction and ATP-dependent phosphate transfer, and as output the light-sensitive cGMP production. One of my projects focused on characterizing two such opsins from the green algae Chlamydomonas reinhardtii and Volvox carteri which we then named 2c-Cyclop (two-component Cyclase opsin), Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop, respectively. My results show that both 2c-Cyclops are light-inhibited GCs. Interestingly, Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop are very sensitive to light and ATP-dependent, whereby the action spectra of Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop peak at ~540 nm and ~560 nm, respectively. More importantly, guanylyl cyclase activity is dependent on continuous phosphate transfer between histidine kinase and response regulator. However, green light can dramatically block phosphoryl group transfer and inhibit cyclase activity. Accordingly, mutation of the retinal-binding lysine in the opsin domain resulted in GC activity and lacking light-inhibition. A novel rhodopsin phosphodiesterase from the protist Salpingoeca rosetta (SrRhoPDE) was discovered in 2017. However, the previous two studies of 2017 claimed a very weak or absent light-regulation. Here I give strong evidence for light-regulation by studying the activity of SrRhoPDE, expressed in Xenopus laevis oocytes, in-vitro at different cGMP concentrations. Surprisingly, hydrolysis of cGMP shows a ~100-fold higher turnover than that of cAMP. Light can enhance substrate affinity by decreasing the Km value for cGMP from 80 μM to 13 μM, but increases the maximum turnover only by ~30%. In addition, two key single mutants, SrRhoPDE K296A or K296M, can abolish the light-activation effect by interrupting a covalent bond of Schiff base type to the chromophore retinal. I also demonstrate that SrRhoPDE shows cytosolic N- and C- termini, most likely via an 8-TM structure. In the future, SrRhoPDE can be a potentially useful optogenetic tool for light-regulation of cGMP concentration, possibly after further improvements by genetic engineering. N2 - Photorezeptoren sind in fast allen Lebewesen vorzufinden. Sie vermitteln den ersten Schritt bei der Detektion von elektromagnetischer Strahlung unterschiedlicher Wellenlänge. Ihre Absorptionsspektren finden sich innerhalb des Bereichs der stärksten Sonnenstrahlung (UV bis nahes IR) und die Absorption löst normalerweise nachgelagerte Signalwege aus. Bis jetzt sind hauptsächlich 6 Klassen von Photorezeptoren bekannt: als wasserlösliche Proteine zunächst drei Klassen von Blaulicht-empfindlichen Modulen, die LOV-Domäne (Light/Oxygen/Voltage), die BLUF-Domäne (Blue Light sensing, Using FAD) und Cryptochrom mit Flavinen (Vitamin B-Komplex) als Chromophor, sowie Xanthopsine, die hauptsächlich für gelbes Licht und Phytochrome, die für Rotlicht empfindlich sind. Als integrale Membranproteine kann die Klasse der Rhodopsine jedoch ein breiteres Absorptionsspektrum aufweisen, je nach Rhodopsin empfindlich für UV/blaues, grünes oder sogar rotes Licht. Rhodopsine bestehen aus dem Protein Opsin und dem kovalent gebundenen Chromophor Retinal (Vitamin A-Aldehyd). Sie können weiter in zwei Typen unterteilt werden, mikrobielle (Typ I) und tierische (Typ II) Rhodopsine. In dieser Dissertation konzentriere ich mich auf die Identifizierung und Charakterisierung von neuen Typ I Opsinen mit Guanylylcyclase-Aktivität aus Grünalgen und einem Phosphodiesterase-Opsin aus dem Protisten Salpingoeca rosetta. Bis 2014 wiesen alle bekannten Rhodopsine eine typische Struktur mit sieben Transmembranhelices (7TM), einem extrazellulären N-Terminus und einem zytosolischen C- Terminus auf. Die nachgewiesene Funktion der experimentell charakterisierten Rhodopsine vom Typ I ist der Membrantransport von Ionen oder die Kopplung an einen Transducer, der die Phototaxis über eine Signalkette ermöglicht. Eine völlig neue Klasse von Typ-I Rhodopsinen mit enzymatischer Aktivität wurde 2014 gefunden. Ein lichtaktiviertes Guanylyl-Cyclase- Opsin wurde im Pilz Blastocladiella emersonii (Be) entdeckt, das von Gao et al. (2015) nach heterologer Expression und gründlicher in-vitro-Charakterisierung Cyclop (Cyclase opsin) genannt wurde. BeCyclop ist das erste Opsin, für das eine Struktur mit 8 Transmembranhelices (8TM) demonstriert wurde (Gao et al., 2015). Bereits früher (2004) wurde durch expressed sequence tag (EST) und Genom-Daten vorhergesagt, dass eine neue Klasse von enzymatischen Rhodopsinen in Chlamydomonas reinhardtii existiert, jedoch gelang bisher keine funktionelle Expression. Eines dieser hypothetischen Rhodopsine umfasste eine N-terminale Opsin- Domäne, ein fusioniertes Zweikomponentensystem mit Histidinkinase- und Regulator-Domäne und eine C-terminale Guanylylcyclase (GC). Dies legte nahe, dass das Protein eine biochemische Signalkaskade inkorporieren könnte, die Licht-Absorption und ATP-abhängigen Phosphattransfer integriert und eine lichtempfindliche cGMP-Produktion bewirkt. Eines meiner Projekte konzentrierte sich auf die Charakterisierung von zwei solchen Opsinen aus den Grünalgen C. reinhardtii und Volvox carteri, die wir nun 2c-Cyclop (Zweikomponenten-Cyclase-Opsin), d.h. Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop, nennen. Meine Ergebnisse zeigen, dass beide 2c-Cyclops durch Licht gehemmte GCs sind. Interessanterweise sind Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop sehr empfindlich gegenüber Licht und die cGMP- Produktion ist ATP-abhängig, wobei die Wirkungsspektren von Cr2c-Cyclop und Vc2c-Cyclop bei ~540 nm bzw. ~560 nm ihren Höhepunkt erreichen. Ich konnte zeigen, dass die Guanylyl- Cyclase-Aktivität von einem kontinuierlichen Phosphat-Transfer zwischen Histidinkinase und Response-Regulator abhängt. Grünes Licht kann jedoch den Phosphoryl-Gruppen-Transfer dramatisch blockieren und die Cyclase-Aktivität inhibieren. Dementsprechend führte die Mutation des Retinal-bindenden Lysins in der Opsindomäne zu einer cGMP Produktion ohne jegliche Lichtinhibierung. Eine neuartige Rhodopsin-Phosphodiesterase aus dem Protisten Salpingoeca rosetta (SrRhoPDE) wurde im Jahr 2017 entdeckt. Die vorangegangenen zwei Studien von 2017 zeigten jedoch eine sehr schwache oder fehlende Lichtregulation der PDE-Aktivität. Hier konnte ich eine starke Lichtregulation beweisen, indem ich die Aktivität von SrRhoPDE, exprimiert in Xenopus laevis Oozyten, in-vitro bei verschiedenen cGMP-Konzentrationen untersuchte. Überraschenderweise zeigt die Hydrolyse von cGMP einen etwa 100-fach höheren Umsatz als der von cAMP. Licht kann die Substrataffinität durch Verringern des Km-Werts für cGMP von 80 µM auf 13 µM erhöhen, erhöht jedoch den maximalen Umsatz nur um ~30%. Darüber hinaus können zwei Einzelmutanten, SrRhoPDE K296A oder K296M, den Lichtaktivierungseffekt aufheben, indem sie eine kovalente Bindung vom Schiff-Base-Typ an das Chromophor Retinal unterbrechen. Ich zeige auch, dass SrRhoPDE zytosolische N- und C-Termini aufweist, höchstwahrscheinlich über eine 8-TM-Struktur. In Zukunft könnte SrRhoPDE ein potentiell nützliches optogenetisches Werkzeug für die Lichtregulation der cGMP-Konzentration sein, möglicherweise nach weiteren Verbesserungen durch Gentechnik. KW - Photoreceptor KW - Rhodopsin KW - guanylyl cyclase (GC) KW - two-component Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168143 ER - TY - THES A1 - Altmann, Stephan T1 - Characterization of Metabolic Glycoengineering in Mesenchymal Stromal Cells for its Application in thermoresponsive Bioinks T1 - Charakterisierung von Metabolic Glycoengineering in mesenchymalen Stromazellen für die Anwendung in thermoresponsiven Biotinten N2 - This work developed during the first funding period of the subproject B05 in the framework of the interdisciplinary research consortium TRR 225 ‘From the Fundamentals of Biofabrication toward functional Tissue Models’ and was part of a cooperation between the Orthopedic Department represented by Prof. Dr. Regina Ebert and the Institute of Organic Chemistry represented by Prof. Dr. Jürgen Seibel. This project dealed with cellular behavior during the bioprinting process and how to influence it by modifying the cell glycocalyx with functional target molecules. The focus was on the impact of potential shear stress, that cells experience when they get processed in thermoresponsive bioinks, and a way to increase the cell stiffness via metabolic glycoengineering to attenuate shear forces. For the characterization of the metabolic glycoengineering, four different peracetylated and four non-acetylated modified monosaccharides (two mannose and two sialic acid sugars) were tested in primary human mesenchymal stromal cells (hMSC) and telomerase-immortalized hMSC (hMSC-TERT). Viability results demonstrated a dose-dependent correlation for all sugars, at which hMSC-TERT seemed to be more susceptible leading to lower viability rates. The assessment of the incorporation efficiencies was performed by click chemistry using fluorescent dyes and revealed also a dose-dependent correlation for all mannose and sialic acid sugars, while glucose and galactose variants were not detected in the glycocalyx. However, incorporation efficiencies were highest when using mannose sugars in the primary hMSC. A subsequent analysis of the temporal retention of the incorporated monosaccharides showed a constant declining fluorescence signal up to 6 d for azido mannose in hMSC-TERT, whereas no signal could be detected for alkyne mannose after 2 d. Investigation of the differentiation potential and expression of different target genes revealed no impairment after incubation with mannose sugars, indicating a normal phenotype for hMSC-TERT. Following the successful establishment of the method, either a coumarin derivative or an artificial galectin 1 ligand were incorporated into the cell glycocalyx of hMSC-TERT as functional target molecule. The biophysical analysis via shear flow deformation cytometry revealed a slightly increased cell stiffness and lowered fluidity for both molecules. A further part of this project aimed to control lectin-mediated cell adhesion by artificial galectin 1 ligands. As that hypothesis was settled in the work group of Prof. Dr. Jürgen Seibel, this work supported with an initial characterization of galectin 1 as part of the hMSC biology. A stable galectin 1 expression at gene and protein level in both hMSC and hMSC-TERT could be confirmed, at which immunocytochemical stainings could detect the protein only in the glycocalyx. The treatment of hMSC-TERT with a galectin 1 ligand in different concentrations did not show an altered gene expression of galectin 1. However, these first data in addition to the investigation of stiffness confirmed the applicability of specific and artificial IV galectin 1 ligands in biofabrication approaches to alter cell properties of hMSC. To conclude, metabolic glycoengineering has been successfully implemented in hMSC and hMSC-TERT to introduce glycocalyx modifications which reside there for several days. A proof of concept was carried out by the increase of cell stiffness and fluidity by the incorporation of a coumarin derivative or an artificial galectin 1 ligand. For the characterization of shear stress impact on cells after printing in thermoresponsive bioinks, the processing of hMSC-TERT (mixing or additionally printing) with Pluronic F127 or Polyoxazoline-Polyoxazine (POx-POzi) polymer solution was investigated. While there were no changes in viability when using POx-POzi bioink, processing with Pluronic F127 indicated slightly lower viability and increased apoptosis activity. Assessment of cellular responses to potential shear stress showed no reorganization of the cytoskeleton independent of the bioink, but highly increased expression of the mechanoresponsive proto-oncogene c Fos which was more pronounced when using Pluronic F127 and just mixed with the bioinks. Interestingly, processing of the mechanoresponsive reporter cell line hMSC-TERT-AP1 revealed slightly elevated mechanotransduction activity when using POx-POzi polymer and just mixed with the bioinks as well. In conclusion, hMSC-TERT embedded in thermoresponsive bioinks might shortly experience shear stress during the printing process, but that did not lead to remarkable cell damage likely due to the rheological properties of the bioinks. Furthermore, the printing experiments also suggested that cells do not sense more shear stress when additionally printed. N2 - Diese Arbeit entstand aus dem Projekt B05 während der ersten Förderperiode im Rahmen des interdisziplinären Sonderforschungsbereiches TRR 225 „Von den Grundlagen der Biofabrikation zu funktionalen Gewebemodellen“ und beinhaltete eine Kooperation zwischen dem Lehrstuhl für Orthopädie repräsentiert durch Prof. Dr. Regina Ebert und dem Institut für Organische Chemie repräsentiert durch Prof. Dr. Jürgen Seibel. Das Projekt beschäftigte sich mit den Auswirkungen des 3D Drucks auf Zellen während und nach dem Druck mit thermoresponsiven Biotinten. Hierbei lag der Fokus auf Scherkräften, die Zellen während des Drucks erfahren, und der Möglichkeit, deren nachteilige Auswirkungen durch gezielte Erhöhung der Zellsteifigkeit via Metabolic Glycoengineering zu minimieren. Zur Etablierung dieser Methode wurden vier azetylierte sowie vier nicht-azetylierte modifizierte Einfachzucker (zwei Mannosen und zwei Sialinsäuren) hinsichtlich ihrer Zellkompatibilität und Einbaurate in primären humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSC) und Telomerase-immortalisierten hMSC (hMSC-TERT) charakterisiert. Bei der Viabilität zeigte sich für alle untersuchten Zucker ein konzentrationsabhängiges Verhalten, wobei die hMSC-TERT generell empfindlicher reagierten. Eine Untersuchung von verschiedenen Zielgenen nach Zuckerinkubation gab keine Hinweise auf biologisch veränderte Expressionsmuster und auch das phänotypische Differenzierungspotenzial (adipogen und osteogen) blieb erhalten. Der Einbau der modifizierten Zucker in Proteoglykane sowie Glykoproteine der Glykokalyx wurde mikroskopisch mittels Fluoreszenzfarbstoffen charakterisiert. Dabei zeigte sich ebenfalls ein konzentrationsabhängiges Verhalten für alle Mannosen und Sialinsäuren, wohingegen die Glukose- und Galaktosevarianten nicht nachgewiesen werden konnten. Die Mannosezucker zeigten die höchsten Einbauraten, welche in primären hMSC noch stärker ausfielen als in hMSC-TERT. Ein Langzeitversuch zur Beurteilung der zeitlichen Stabilität der Glykokalyxmodifikation konnte für die azetylierte Azidomannose ein abnehmendes Fluoreszenzsignal bis zum sechsten Tag nach der Klickreaktion ermitteln. Im Gegensatz dazu konnte die azetylierte Alkinmannose bereits ab dem zweiten Tag nicht mehr nachgewiesen werden. Nach der erfolgreichen Optimierung der Methodik wurde der Effekt eines Kumarinderivates oder eines künstlichen Galektin 1 Liganden auf die Zellsteifigkeit sowie die -fluidität mit Hilfe der Deformationszytometrie untersucht. Die Modifikation der Glykokalyx mit beiden untersuchten Molekülen führte zu einer leichten Erhöhung der Steifigkeit in Kombination mit einer leicht erniedrigten Fluidität. In einem weiteren Teil des Projekts sollte die Lektin-vermittelte Adhäsion von Zellen an Polymerstränge initiiert werden, indem sie mit künstlichen Galektin 1 Liganden modifiziert werden. Da diese Hypothese in der Forschungsgruppe von Prof. Dr. Jürgen Seibel bearbeitet wurde, unterstützte diese Arbeit mit einer anfänglichen Charakterisierung von Galektin 1 als Teil der hMSC Zellbiologie. In hMSC und hMSC-TERT konnte eine VI stabile Expression auf Gen- und Proteinebene nachwiesen werden, wobei das Lektin in der Glykokalyx lokalisiert war. Ein Inkubationsversuch mit einem spezifischen Liganden zeigte in hMSC-TERT unabhängig von der Konzentration keine veränderte Galektin 1 Genexpression. In Verbindung mit den Steifigkeitsuntersuchungen bestätigt diese anfängliche Charakterisierung die Anwendbarkeit von künstlichen Galektin 1 Liganden in der Biofabrikation um hMSC zu modifizieren. Somit konnte gezeigt werden, dass Metabolic Glycoengineering sich für die gezielte Einbringung von Molekülen in die Zellglykokalyx von primären hMSC sowie der entsprechenden TERT-Zelllinie zur mittelfristigen Modifikation eignet. Dies wurde durch einen funktionellen Ansatz bestätigt, indem die Zellsteifigkeit und -fluidität durch den Einsatz zwei verschiedener Moleküle erwartungsgemäß beeinflusst wurden. Für die Charakterisierung der Scherstressauswirkungen auf Zellen nach 3D Druck in thermoresponsiven Biotinten wurden hMSC und hMSC-TERT in Pluronic F127 oder Polyoxazolin-Polyoxazin (POx-POzi) Polymerlösung prozessiert (gemischt oder zusätzlich verdruckt) und direkt danach analysiert. Während letztere die Viabilität nicht verschlechterte, zeigten hMSC-TERT nach Verarbeitung in Pluronic F127 eine leicht erniedrigte Viabilität sowie leicht erhöhte Apoptoseraten. Im Zuge von Analysen der Mechanotransduktion und deren Auswirkungen konnte unabhängig von der Biotinte sowie der Behandlung kein Umbau des Zytoskeletts immunzytochemisch nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu zeigten Genexpressionsanalysen eine starke Hochregulierung des mechanoresponsiven Proto-Onkogens c Fos unter allen Bedingungen, wobei diese stärker ausfiel bei Verwendung der Pluronic F127 Biotinte und nur nach Mischen (gilt für beide Biotinten). Um den Scherstress quantitativ zu beurteilen, wurde die Reporterzelllinie hMSC-TERT-AP1 verwendet, welche das Auslesen der Mechanotransduktion durch eine gekoppelte Luziferase-Proteinexpression ermöglicht. Interessanterweise zeigte sich eine leicht erhöhte Luziferaseaktivität nur nach Verarbeitung mit der POx-POzi Polymerlösung, welche stärker ausfiel wenn die Zellen mit der Biotinte lediglich gemischt wurden. Zusammengenommen bestätigten die Ergebnisse die zelluläre Wahrnehmung von Scherstress in thermoresponsiven Biotinten, allerdings scheint dieser nur schwache Auswirkungen auf die Zellen zu haben, was auf die rheologischen Eigenschaften beider untersuchten Biotinten zurückgeführt werden kann. Die Druckergebnisse legten außerdem nahe, dass die Zellen nicht mehr Scherstress erfahren, wenn sie zusätzlich verdruckt wurden. KW - Glykobiologie KW - Glykokalyx KW - Tissue Engineering KW - Galectine KW - Metabolic Glycoengineering KW - Biofabrication KW - Galectin 1 KW - Glycocalyx KW - Shear Stress KW - Scherstress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-291003 ER - TY - THES A1 - Lux, Thomas Joachim T1 - Characterization of Junctional Proteins in the Dorsal Root Ganglion of Rats with Traumatic Nerve Injury T1 - Charakterisierung von Junktionsproteinen im Spinalganglion von Ratten mit traumatischer Nervenverletzung N2 - In my thesis, I characterized aGPCRs Adgrl1 and Adgrl3, tight junction proteins and the blood-DRG-barrier in rats’ lumbar dorsal root ganglions after traumatic neuropathy. In contrast to the otherwise tightly sealed barriers shielding neural tissues, the dorsal root ganglion’s neuron rich region is highly permeable in its healthy state. Furthermore, the DRG is a source of ectopic signal generation during neuropathy; the exact origin of which is still unclear. I documented expression of Adgrl1 and Adgrl3 in NF200 + , CGRP + and IB4 + neurons. One week after CCI, I observed transient downregulation of Adgrl1 in non-peptidergic nociceptors (IB4+). In the context of previous data, dCirl deletion causing an allodynia-like state in Drosophila, our research hints to a possible role of Adgrl1 nociceptive signal processing and pain resolution in neuropathy. Furthermore, I demonstrated similar claudin-1, claudin-12, claudin-19, and ZO-1 expression of the dorsal root ganglion’s neuron rich and fibre rich region. Claudin-5 expression in vessels of the neuron rich region was lower compared to the fibre rich region. Claudin-5 expression was decreased one week after nerve injury in vessels of the neuron rich region while permeability for small and large injected molecules remained unchanged. Nevertheless, we detected more CD68+ cells in the neuron rich region one week after CCI. As clinically relevant conclusion, we verified the high permeability of the neuron rich regions barrier as well as a vessel specific claudin-5 downregulation after CCI. We observed increased macrophage invasion into the neuron rich region after CCI. Furthermore, we identified aGPCR as potential target for further research and possible treatments for neuropathy, which should be easily accessible due to the blood-DRG-barriers leaky nature. Its precise function in peripheral tissues, its mechanisms of activation, and its role in pain resolution should be evaluated further. N2 - Die vorliegende Arbeit charakterisiert die aGPCR Adgrl1 und Adgrl3, repräsentative Tight Junction Proteine, sowie die Blut-Spinalganglion-Schranke in lumbalen Spinalganglien von Ratten mit und ohne traumatische Neuropathie. Die hohe Permeabilität der zellulären, neuronenreichen Region von Spinalganglien in naiven Tieren ist eine der wenigen Ausnahmen der sonst sehr dichten Barrieren des Nervensystems. Ich konnte die Expression von Adgrl1 und Adgrl3 in NF200+ , CGRP+ und IB4+ Neuronen nachweisen. Eine Woche nach CCI war die Adgrl1 Expression in nicht-peptidergen Nozizeptoren (IB4+ ) vorübergehend herabreguliert. Zusätzlich konnten wir eine ähnliche Expression von Claudin-1, Claudin-12, Claudin-19 und ZO-1 in der neuronenreichen sowie der faserreichen Region zeigen. Claudin-5 ist in Gefäßen der neuronenreichen Region niedriger exprimiert als in Gefäßen der faserreichen Region. Nach Nervenläsion war die Claudin-5 Immunoreaktivität in Gefäßen der neuronenreichen Region reduziert, die Permeabilität für große und kleine Moleküle jedoch unverändert. Allerdings konnten wir nach traumatischer Nervenverletzung vermehrt Makrophagen in der neuronenreichen Region nachweisen. Weiterhin haben wir einen neuen endogenen antinozizeptiven Rezeptor, Adrlg1, ähnlich den Opioidrezeptoren, als potenzielles, und aufgrund der permeablen Blut-Spinalganglion-Schranke therapeutisch gut erreichbares, Target für die antineuropathische Therapie identifiziert. KW - Neuropathy KW - Neuropathic Pain KW - Claudin KW - Latrophilin KW - Tight Junction Proteins KW - Dorsal Root Ganglion Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251926 ER - TY - THES A1 - Herter, Eva Kristine T1 - Characterization of direct Myc target genes in Drosophila melanogaster and Investigating the interaction of Chinmo and Myc T1 - Charakterisierung direkter Myc Zielgene in Drosophila melanogaster und Interaktionsanalyse der Proteine Chinmo und Myc N2 - The correct regulation of cell growth and proliferation is essential during normal animal development. Myc proteins function as transcription factors, being involved in the con-trol of many growth- and proliferation-associated genes and deregulation of Myc is one of the main driving factors of human malignancies. The first part of this thesis focuses on the identification of directly regulated Myc target genes in Drosophila melanogaster, by combining ChIPseq and RNAseq approaches. The analysis results in a core set of Myc target genes of less than 300 genes which are mainly involved in ribosome biogenesis. Among these genes we identify a novel class of Myc targets, the non-coding small nucleolar RNAs (snoRNAs). In vivo studies show that loss of snoRNAs not only impairs growth during normal development, but that overexpression of several snoRNAs can also enhance tumor development in a neu-ronal tumor model. Together the data show that Myc acts as a master regulator of ribo-some biogenesis and that Myc’s transforming effects in tumor development are at least partially mediated by the snoRNAs. In the second part of the thesis, the interaction of Myc and the Zf-protein Chinmo is described. Co-immunoprecipitations of the two proteins performed under endogenous and exogenous conditions show that they interact physically and that neither the two Zf-domains nor the BTB/POZ-domain of Chinmo are important for this interaction. Fur-thermore ChIP experiments and Myc dependent luciferase assays show that Chinmo and Myc share common target genes, and that Chinmo is presumably also involved in their regulation. While the exact way of how Myc and Chinmo genetically interact with each other still has to be investigated, we show that their interaction is important in a tumor model. Overexpression of the tumor-suppressors Ras and Chinmo leads to tu-mor formation in Drosophila larvae, which is drastically impaired upon loss of Myc. N2 - Die korrekte Regulation von Zellwachstum und Proliferation ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Tieren. Myc-Proteine fungieren als Transkriptions-faktoren, die in die Funktionskontrolle vieler Gene eingebunden sind die eine Rolle bei Zellwachstum und Proliferation spielen. Fehlregulierung von Myc ist ein Hauptfaktor menschlicher Tumorbildung. Der erste Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit der Identifizierung direkt regulierter Myc Zielgene in Drosophila melanogaster durch Kombination von ChIPseq und RNAseq Analysen. Insgesamt wurde eine Hauptgruppe von weniger als 300 Myc Ziel-genen identifiziert, von denen der Großteil eine Funktion in der Ribosomen Biogenese hat. Unter diesen Genen haben wir eine neue Klasse an Myc Zielgenen identifiziert, die nicht-codierenden „small nucleolar RNAs“ (snoRNAs). In vivo Experimente zeigen, dass der Verlust der snoRNAs nicht nur das Wachstum während der natürlichen Ent-wicklung beeinträchtigt, sondern auch, dass Überexpression verschiedener snoRNAs die Tumorbildung in einem neuronalen Tumormodel begünstigt. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass Myc maßgeblich Ribosomen Biogenese steuert und dass der transformierende Effekt, den Myc in der Tumorentwicklung inne hat, zumindest teilwei-se durch die snoRNAs gesteuert wird. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Interaktion von Myc und dem Zink-Finger Protein Chinmo beschrieben. Co-Immunoprezipitationen der zwei Proteine die unter endogenen und exogenen Bedingungen durchgeführt wurden zeigen, dass sie physisch miteinander interagieren und dass weder Chinmos Zf-Domänen noch seine BTB/POZ-Domäne für diese Interaktion verantwortlich sind. ChIP-Versuche und Myc abhängige Luciferase-Assays zeigen weiterhin, dass Chinmo und Myc gemeinsame Zielgene besitzen und dass Chinmo darüber hinaus wahrscheinlich auch an ihrer Regulation beteiligt ist. Während der genaue Zusammenhang der genetischen Interaktionen von Myc und Chinmo noch ungewiss ist und weiterer Untersuchungen bedarf, kann gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden Proteine in einem Tumormodel eine Rolle spielt. Die Tumorbildung die durch Überexpression des Tumorsuppressors Ras zusammen mit Chinmo hervorgerufen wird, wird durch den Verlust von Myc stark reduziert. KW - Myc KW - Drosophila melanogaster KW - Transcription KW - snoRNA KW - Ribosome KW - Growth KW - Taufliege KW - Transkription Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122272 ER - TY - THES A1 - Segerer, Gabriela T1 - Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM T1 - Charakterisierung zellbiologischer und physiologischer Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase AUM N2 - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer. Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized. This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos. To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation. The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells. These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling. Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase. To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions. Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under hypoxic (~1% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3’-phosphate (GADP). Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism. Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism. N2 - Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugetieren gehören zu einer großen ubiquitären Proteinfamilie, zu der auch mindestens 40 Phosphatasen, die im menschlichen Organismus vertreten sind, zählen. Eine Vielzahl dieser Phosphatasen hat wichtige physiologische Funktionen beispielsweise als regulatorische Enzyme im Metabolismus. Gleichzeitig werden sie in Verbindung mit Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Stoffwechselstörungen und Krebs gebracht. Dennoch sind die Funktionen vieler Mitglieder dieser Phosphatasen Familie bis heute weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die zellbiologischen und physiologischen Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase PGP, auch AUM genannt, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde mit gereinigtem Enzym nach potenziellen Protein-Substraten von PGP gesucht. Weiterhin wurden zellbiologische Studien mit der spermatogonialen GC1 Zelllinie sowie mit primären Endothelzellen und Lymphozyten durchgeführt. Mit biochemischen Methoden wurden zudem PGP-defiziente Mausembryonen charakterisiert. Es wurde zunächst die Rolle von PGP für RTK- und integrin- induzierte Zellmigration untersucht. Dabei zeigte sich, dass PGP Inaktivierung die Zelladhäsion und Zellmigration steigerte. Gleichzeitig wurde eine vermehrte Bildung von RTK- und integrinvermittelten ringförmigen Plasmamembranausstülpungen, sogenannten Circular Dorsal Ruffles (CDR) auf der dorsalen Zelloberfläche beobachtet. PGP wurde zudem als negativer Regulator integrinund GPCR-induzierter gerichteter Lymphozytenmigration identifiziert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus wurde näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PGP die Bildung von CDRs und die gerichtetete Zellmigration in Abhängigkeit der Phospholipase C- (PLC-), Proteinkinase C- (PKC-) sowie Src Kinase-Aktivität steuert. Nach Integrin- und RTKAktivierung waren die Tyrosinreste 1068 und 1173 des EGF-Rezeptors in PGP-depletierten Zellen vermehrt phosphoryliert und PLCγ1 in diesen Zellen hyperaktiviert. Interessanterweise wurde zudem eine beschleunigte PKC-vermittelte Reorganisation des Zytoskeletts beobachtet. In stimulierten Lymphozyten führte PGP-Inaktivierung zu einer erhöhten PKCAktivität. Durch massenspektrometrische Analysen konnten erhöhte Spiegel des Membranlipids Phosphatidylserin (PS) in PGP-defizienten Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Hypothese, dass die Anreicherung von PS in der Plasmamembran PGP-defizienter Zellen zu einer Vor-Rekrutierung von Signalproteinen führt, die die Aktivierung von Integrinen, EGF-Rezeptoren und GPCRs mit einer beschleunigten Zytoskelett-Reorganisation verbindet. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass PGP durch die Dephosphorylierung von Phosphoglykolat die Zelladhäsion und Zellmigration reguliert. Um die physiologischen Funktionen von PGP zu verstehen, wurden konditional PGPinaktivierte Mäuse untersucht. Die Inaktivierung von PGP im gesamten Organismus führte zu einem Wachstumsdefekt ab Tag E8.5 und dem Tod der Embryonen im Uterus zwischen Tag E9.5 und E11.5. Die beobachtete embryonale Letalität war nicht durch einen Defekt des (kardio-)vaskulären Systems zu erklären. PGP-inaktivierte Embryonen starben zu einem Zeitpunkt, an dem der intrauterine Übergang von einem hypoxischen zu einem normoxischen Millieu stattfindet. Der Einfluss von Sauerstoff wurde deshalb weiter untersucht. Zellwachstumsanalysen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit GC1 Zellen und embryonalen Maus-Fibroblasten, die aus E8.5 Embryonen gewonnen wurden zeigten, dass normoxische Bedingungen (~20% O2) einen Wachstumsdefekt PGP-inaktivierter Zellen verursacht, wohingegen dies unter hypoxischen Bedingungen (~1% O2) nicht der Fall war. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI), ein durch PG in vitro gehemmtes Enzym, in PGP inaktivierten Zellen und Embryonen vermindert war. TPI stellt einen entscheidenden Verzweigungspunkt des Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. TPI katalysiert die Isomerisierung der aus der Glykolyse stammenden Intermediate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP, eine Vorstufe des für die Triglycerid-Biosynthese benötigten Glycerol-Grundgerüsts) und Glyceraldehyd-3’-phosphat (GADP). Eine Verringerung der TPI-Aktivität in PGPinaktivierten Zellen resultierte in erhöhten Glycerol-3-phosphat Spiegeln und einer gesteigerten Triglycerid-Biosynthese. Die Analyse des zellulären ATP Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs bei der mitochondrialen Atmung zeigte, dass sowohl die ATP Produktion als auch die mitochondriale Atmung in Abhängikeit der Lipolyse in PGP-defizienten Zellen erhöht waren. Unter hypoxischen Bedingungen, die zu einer Normalisierung der Zellproliferation führten, wiesen PGP-profiziente und -defiziente Zellen keinen Unterschied bezüglich ATP Produktion und mitochondrialer Atmung auf. Wir vermuten deswegen, dass die Inhibierung der TPI-Aktivität durch PG-Anreicherung aufgrund ausbleibender Hydrolyse durch PGP zu einer Verschiebung des zellulären Energiehaushaltes von Seiten eines pro-proliferativ glykolytischen auf die Seite eines lipogenetisch/lipolytischen Metabolismus führt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PGP als eine metabolische Phosphatase Zellmigration, Zellproliferation wie auch den zellulären Energiehaushalt reguliert. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen an der Schnittschnelle dieser zellulären Prozesse dar und lässt auf eine wichtige Rolle von PGP im Glukose- und Lipidstoffwechsel im adulten Organismus schließen. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Phosphoglykolat-Phosphatase KW - Maus KW - Cytologie KW - Physiologie KW - Phosphatasen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847 ER - TY - THES A1 - Anton, Selma T1 - Characterization of cAMP nanodomains surrounding the human Glucagon-like peptide 1 receptor using FRET-based reporters T1 - Charakterisierung der Rezeptor-assoziierten cAMP Nanodomänen des humanen Glucagon-like peptide 1 Rezeptors mittels FRET-basierter Sensoren N2 - Cyclic adenosine monophosphate (cAMP), the ubiquitous second messenger produced upon stimulation of GPCRs which couple to the stimulatory GS protein, orchestrates an array of physiological processes including cardiac function, neuronal plasticity, immune responses, cellular proliferation and apoptosis. By interacting with various effector proteins, among others protein kinase A (PKA) and exchange proteins directly activated by cAMP (Epac), it triggers signaling cascades for the cellular response. Although the functional outcomes of GSPCR-activation are very diverse depending on the extracellular stimulus, they are all mediated exclusively by this single second messenger. Thus, the question arises how specificity in such responses may be attained. A hypothesis to explain signaling specificity is that cellular signaling architecture, and thus precise operation of cAMP in space and time would appear to be essential to achieve signaling specificity. Compartments with elevated cAMP levels would allow specific signal relay from receptors to effectors within a micro- or nanometer range, setting the molecular basis for signaling specificity. Although the paradigm of signaling compartmentation gains continuous recognition and is thoroughly being investigated, the molecular composition of such compartments and how they are maintained remains to be elucidated. In addition, such compartments would require very restricted diffusion of cAMP, but all direct measurements have indicated that it can diffuse in cells almost freely. In this work, we present the identification and characterize of a cAMP signaling compartment at a GSPCR. We created a Förster resonance energy transfer (FRET)-based receptor-sensor conjugate, allowing us to study cAMP dynamics in direct vicinity of the human glucagone-like peptide 1 receptor (hGLP1R). Additional targeting of analogous sensors to the plasma membrane and the cytosol enables assessment of cAMP dynamics in different subcellular regions. We compare both basal and stimulated cAMP levels and study cAMP crosstalk of different receptors. With the design of novel receptor nanorulers up to 60nm in length, which allow mapping cAMP levels in nanometer distance from the hGLP1R, we identify a cAMP nanodomain surrounding it. Further, we show that phosphodiesterases (PDEs), the only enzymes known to degrade cAMP, are decisive in constraining cAMP diffusion into the cytosol thereby maintaining a cAMP gradient. Following the discovery of this nanodomain, we sought to investigate whether downstream effectors such as PKA are present and active within the domain, additionally studying the role of A-kinase anchoring proteins (AKAPs) in targeting PKA to the receptor compartment. We demonstrate that GLP1-produced cAMP signals translate into local nanodomain-restricted PKA phosphorylation and determine that AKAP-tethering is essential for nanodomain PKA. Taken together, our results provide evidence for the existence of a dynamic, receptor associated cAMP nanodomain and give prospect for which key proteins are likely to be involved in its formation. These conditions would allow cAMP to exert its function in a spatially and temporally restricted manner, setting the basis for a cell to achieve signaling specificity. Understanding the molecular mechanism of cAMP signaling would allow modulation and thus regulation of GPCR signaling, taking advantage of it for pharmacological treatment. N2 - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine große und sehr vielfältige Familie an Membranproteinen dar, deren primäre Funktion die Signalübertragung von extrazellulären Stimuli in intrazelluläre Signale ist. Dank ihrer breiten Expression im gesamten menschlichen Körper regulieren sie unterschiedliche zelluläre Prozesse und damit deren physiologische Funktion, unter anderem die Sinnesempfindung, zelluläre Kommunikation und Neurotransmission. GPCRs stehen im Zusammenhang mit unterschiedlichen Erkrankungen wie Herzinsuffizienz, Krebs, neurologischen Funktionsstörungen und diverser metabolischer Krankheiten, weswegen sie als Ziele („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt werden. Aufgrund ihrer Expression auf der Zelloberfläche sind sie leicht zugänglich, und die Diversität ihrer Liganden begünstigt zusätzlich ihre Nutzung als pharmakologische Targets. Heutzutage vermitteln bereits 30% aller weltweit zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung an GPCRs. GPCRs üben ihre Funktion aus, indem sie hauptsächlich an G Proteine binden, welche wiederum die Produktion sogenannter second messenger in Gang setzen. cAMP ist das Hauptsignalmolekül der Rezeptoren, welche an das stimulatorische GS Protein koppeln. cAMP überträgt hunderte ankommende Signale in einer hochspezifischen Weise, indem es an unterschiedliche Effektorproteine bindet, welche sich in bestimmten zellulären Regionen befinden. Dadurch koordiniert dieses Signalmolekül eine Vielzahl zellulärer Prozesse, angefangen bei der Regulierung von Ionenkanalaktivität über die Kontraktilität glatter- und quergestreifter Muskulatur bis hin zur Genexpression, Zellproliferation und Apoptose. Durch die pleiotropen Effekte, welche durch cAMP reguliert werden, stellt sich die Frage, wie GS-gekoppelte Rezeptoren Signalspezifität erreichen, obwohl sie ihre Funktion durch dieses eine Signalmolekül ausführen. Ursprünglich ging man von einer uneingeschränkten Diffusion und dadurch homogenen Verteilung von cAMP in der Zelle aus. Diese Vorstellung ist jedoch nicht mit der Signalisierungsspezifität von GPCRs vereinbar, da unter diesen Umständen cAMP unselektiv all seine Effektorproteine in der gesamten Zelle aktivieren könnte. Daher entstand die Hypothese der cAMP-Kompartimentierung, wobei die Zelle lokal begrenzte Bereiche mit hohen oder niedrigen cAMP Konzentrationen umfassen würde. Jedoch gab es bisher keinerlei Beweise für die Existenz und die molekulare Zusammensetzung mutmaßlicher Domänen. Folglich setzten wir uns als Ziel, hochkonzentrierte cAMP-Kompartimente in der Zelle zu lokalisieren, ihre räumliche Dimension aufzuklären und ihre Rolle zur Realisierung zellulärer Signalisierungsspezifität zu ermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Studie setzten wir einen Förster resonance energy transfer (FRET)-basierten cAMP Sensor ein, fusionierten ihn mit dem humanen glucagone-like peptide 1 Rezeptor (hGLP1R) als Prototyp eines GS-koppelnden Rezeptors, um cAMP am Ursprung des Signals zu messen. Mittels dieser Sensoren weisen wir eine Rezeptor-umgebende begrenzte cAMP Domäne nach, welche eine erhöhte cAMP Konzenztration aufweist (Figure ‎3.10). Bei Stimulation des Rezeptors mit GLP1 Konzenztrationen beginnend bei 10 fM entsteht eine Rezeptordomäne mit lokal erhöhten cAMP Konzentrationen, welche getrennt von Plasmamembran und Cytosol ist. Wir zeigen, dass das hGLP1R-Kompartiment geschützt ist vor cAMP Signalen, welche an weiteren, unabhängigen GS-gekoppelten Rezeptoren ihren Ursprung haben (Figure ‎3.11). Um die räumliche Dimension dieser Domäne zu untersuchen, verwendeten wir Nanolinker der Länge 30- und 60 nm als Abstandhalter zwischen Rezeptor und Sensor (Figure ‎3.12) und zeigen dabei, dass sich die Domäne über eine Länge von 60 Nanometern erstreckt, wobei ein abnehmender cAMP-Gradient erkennbar ist. Weiterhin beweisen wir, dass Phosphodiesterasen (PDEs) Schlüsselfaktoren für die Bildung des cAMP-Gradienten um den Rezeptor herum sind, indem sie die Diffusion ins Cytosol beschränken (Figure ‎3.13). Darüber hinaus zeigen wir (Figure ‎3.15), dass Rezeptor-spezifische cAMP Signale PKA-Phosphorylierung in der Rezeptordomäne auslösen und, dass AKAPs elementar für nanodomänen PKA-Aktivität sind, wohingegen die cytosolische PKA-Phosphorylierung unabhängig von AKAP-Targeting der PKA ist (Figure ‎3.16). Zusammenfassend beweisen unsere Ergebnisse die Existenz einer Rezeptor-umgebenden Nanodomäne mit erhöhten cAMP Spiegeln eines GS-gekoppelten Rezeptors. Zeitgleiche Studien in unserer Gruppe zeigen, dass cAMP in der Zelle weitgehend gebunden vorliegt und diffusionslimitiert ist. Dies stellt den Nachweis für eine eingeschränkte Diffusion als molekulare Voraussetzung für die Bildung von Signalkompartimenten dar. Wir gehen davon aus, dass unsere Ergebnisse ein Ausgangspunkt für die Aufklärung von Rezeptoren als Quelle für Signalkompartimente darstellen, jedoch bedarf es weiterer Studien, um die präzise molekulare Zusammensetzung und die beteiligten Proteine dieser Signaldomäne zu untersuchen. Das Grundverständnis der Signalisierungskaskaden auf molekularer Ebene könnte es uns ermöglichen, die zellulären Reaktionen zu manipulieren, um eine Fehlfunktion der Signalisierung in erkrankten Zellen wiederherzustellen. Da der hGLP1R entscheidend für Aufrechterhaltung ausgeglichener Blutglucosespiegel ist, würde die Erfassung der molekularen Details der kompartimentalisierten Signalübertragung die Feinabstimmung der Rezeptorsignale ermöglichen, um ihn als spezifisches Target zur Behandlung von Diabetes Mellitus einzusetzen. KW - FRET KW - cAMP KW - compartments KW - GPCR Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190695 ER - TY - THES A1 - Salvador, Ellaine Riciel P. T1 - Characterization of Asymptomatic Bacteriuria (ABU) Escherichia coli Isolates: virulence traits and host-pathogen interactions T1 - Charakterisierung der Virulenzeigenschaften und Wirt-Pathogen-Interaktionen von asymptomatischer Bakteriurie (ABU) Escherichia coli Isolaten N2 - Urinary tract infection (UTI) is one of the most serious health problems worldwide. It accounts for a million hospital visits annually in the United States. Among the many uropathogenic bacteria, uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the most common causative agent of UTI. However, not all E. coli that inhabit the urinary tract can cause UTI. Some of them thrive for long periods of time in the urinary bladder without causing overt symptoms of infection. This carrier state is called asymptomatic bacteriuria (ABU). E. coli ABU isolates can live in the host without inducing host response due to deletions, insertions and point mutations in the genome leading to the attenuation of virulence genes. They therefore behave in the same way as commensals. Since bacteria that inhabit the urinary tract are said to originate from the lower intestinal tract and ABU behave in a similar way as commensals, this study compared various phenotypic and genotypic characteristics of ABU and commensal E. coli fecal isolates. The two groups did not show a strict clustering with regards to phylogenetic lineage since there appears to be overlaps in their distribution in some clonal complexes. In addition, it was observed that the UPEC virulence genes were more frequently inactivated in ABU than in fecal isolates. Hence, ABU tend to have less functional virulence traits compared to the fecal isolates. The ABU model organism E. coli 83972 which is known not only for its commensal behavior in the urinary bladder but its ability to outcompete other bacteria in the urinary tract is currently being used as prophylactic treatment in patients who have recurrent episodes of UTI at the University Hospital in Lund, Sweden. The pilot studies showed that upon deliberate long-term colonization of the patients with E. coli 83972, they become protected from symptomatic UTI. In this study, the phenotypic and genotypic characteristics of eight re-isolates taken from initially asymptomatically colonized patients enrolled in the deliberate colonization study who reported an episode of symptoms during the colonization period were investigated. Two out of the eight re-isolates were proven to be a result of super infection by another uropathogen. Six re-isolates, on the other hand, were E. coli 83972. The urine re-isolates confirmed to be E. coli 83972 were phenotypically heterogeneous in that they varied in colony size as well as in swarming motility. Four of these re-isolates were morphologically homogenous and similar to the parent isolate E. coli 83972 whereas one of them appeared phenotypically heterogenous as a mixture of smaller and normal-sized colonies. Still another re-isolate phenotypically resembled small colony variants. Meanwhile, three of the six re-isolates did not differ from the parent isolate with regards to motility. On the other hand, three exhibited a markedly increased motility compared to the parent isolate. Transcriptome analysis demonstrated the upregulation of a cascade of genes involved in flagellar expression and biosynthesis in one of the three motile re-isolates. However, upon further investigation, it was found out that the expression of flagella had no effect on bacterial adhesion to host cells in vitro as well as to the induction of host inflammatory markers. Thus, this implies that the increased motility in the re-isolates is used by the bacteria as a fitness factor for its benefit and not as a virulence factor. In addition, among the various deregulated genes, it was observed that gene regulation tends to be host-specific in that there is no common pattern as to which genes are deregulated in the re-isolates. Taken together, results of this study therefore suggest that the use of E. coli 83972 for prophylactic treatment of symptomatic UTI remains to be very promising. N2 - Harnwegsinfektionen (HWI) sind weltweit ein ernstes Gesundheitsproblem, auf welches allein in den USA jährlich ca. eine Million Krankenhausbesuche entfallen. Innerhalb der Gruppe uropathogener Bakterien stellen die uropathogenen Escherichia coli (UPEC) die wichtigsten Verursacher akuter Harnwegserkrankungen dar. Interessanterweise führen nicht alle E. coli Varianten, die den Harnweg besiedeln, zwangsläufig zu HWI. Einige von ihnen sind in der Lage, die Harnblase über einen langen Zeitraum zu kolonisieren ohne Symptome einer HWI auszulösen. Dieses Phänomen wird als asymptomatische Bakteriurie (ABU) bezeichnet. Die Eigenschaft von E. coli ABU-Isolaten innerhalb des Wirtsorganismus leben zu können, ohne eine deutliche Wirtsabwehrreaktion hervorzurufen, ist unter anderem bedingt durch Deletionen, Insertionen und Punktmutationen im bakteriellen Genom und der daraus resultierenden Inaktivierung einiger Virulenzgene. Ihre Lebensweise ist daher mit der kommensaler Organismen vergleichbar. Da die den Harnweg besiedelnden Bakterien mit hoher Wahrscheinlichkeit ihren Ursprung im unteren Darmtrakt haben und sich die ABU-Isolate ähnlich der Kommensalen verhalten, wurden in dieser Arbeit zahlreiche phäno- und genotypische Charakteristika von ABU-Isolaten mit denen kommensaler E. coli-Fäkalisolate verglichen. Für diese beiden Gruppen konnte hinsichtlich ihrer phylogenetischen Abstammung keine strikte Clusterbildung festgestellt werden, da ihre Verteilung in einigen klonalen Komplexen Überlappungen aufwies. Es zeigte sich jedoch, dass die UPEC-Virulenzgene in den ABU-Isolaten häufiger inaktiviert vorlagen als in den Fäkalisolaten. Demzufolge scheinen die ABU-Isolate weniger funktionale Virulenzeigenschaften zu besitzen als die Fäkalisolate. Der Modell-ABU Stamm E. coli 83972 ist sowohl für sein kommensales Verhalten in der menschlichen Blase bekannt, als auch für seine Fähigkeit, andere Bakterien aus dem Harntrakt zu verdrängen. Er wird gegenwärtig am Universitätsklinikum in Lund (Schweden) als prophylaktisches Therapeutikum bei der Behandlung von Patienten mit rezidivierenden HWI eingesetzt. In Pilotstudien konnte gezeigt werden, dass eine vorsätzliche Langzeit-Kolonisierung von Patienten mit E. coli 83972 zum Schutz vor symptomatischen HWI führt. In der vorliegenden Arbeit wurden die phäno- und genotypischen Charakteristika von acht Patienten-Reisolaten dieser Langzeitstudie untersucht. Die Reisolate wurden aus zunächst asymptomatisch kolonisierten Patienten isoliert, die allerdings im Verlauf der Langzeit-Kolonisierung über eine Reihe von Symptomen klagten. Zwei dieser acht Reisolate waren nachweislich das Resultat einer Superinfektion mit einem anderen uropathogenen Bakterium. Die restlichen sechs Reisolate konnten jedoch als E. coli 83972 identifiziert werden. Für diese sechs Reisolate war eine phänotypische Heterogenität zu beobachten, die sich zum einen in variierender Koloniegröße, zum anderen in unterschiedlichem Schwärmverhalten zeigte: Vier der Reisolate entsprachen morphologisch dem Ausgangsstamm E. coli 83972, wohingegen ein Reisolat phänotypisch abweichend als Mischung von kleineren und normal-großen Kolonien in Erscheinung trat. Ein weiteres Reisolat ähnelte phänotypisch sogenannten „Small Colony Variants“. Das Schwärmverhalten betreffend unterschieden sich indessen drei der sechs Reisolate vom Ausgangsstamm. Sie zeigten im Vergleich eine erhöhte Motilität. In einem dieser drei motilen Reisolate konnte mittels Transkriptomanalyse die hochregulierte Expression einer Reihe von Genen, welche für die Flagellenexpression und -biosynthese verantwortlich sind, aufgezeigt werden. Weiterführende in vitro-Untersuchungen ergaben jedoch, dass diese erhöhte Flagellenexpression weder einen verstärkenden Effekt auf die bakterielle Adhäsion an die Wirtszellen hat, noch in der Wirtszelle die Bildung von Entzündungsmarkern induziert. Dieses Ergebnis impliziert, dass die erhöhte Motilität der Reisolate als Fitnessfaktor und nicht als Virulenzfaktor zu betrachten ist. Ferner führte die genauere Analyse der deregulierten Gene zu der Annahme, dass die Genregulation in den Reisolaten wirtsspezifisch ist, da sich kein übereinstimmendes Muster bezüglich der Deregulation abzeichnete. Unter Berücksichtigung aller Ergebnisse dieser Studie lässt sich abschließend sagen, dass die Verwendung des E. coli Stammes 83972 als prophylaktisches Therapeutikum bei der Behandlung von symptomatischen HWI weiterhin als sehr vielversprechend angesehen werden kann. KW - Escherichia coli KW - Harnwegsinfektion KW - Virulenz KW - Escherichia coli KW - Urinary tract infection KW - asymptomatic bacteriuria Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71283 ER - TY - THES A1 - Andelovic, Kristina T1 - Characterization of arterial hemodynamics using mouse models of atherosclerosis and tissue-engineered artery models T1 - Charakterisierung arterieller Hämodynamiken in atherosklerotischen Mausmodellen und tissue-engineerten Arterienmodellen N2 - Within this thesis, three main approaches for the assessment and investigation of altered hemodynamics like wall shear stress, oscillatory shear index and the arterial pulse wave velocity in atherosclerosis development and progression were conducted: 1. The establishment of a fast method for the simultaneous assessment of 3D WSS and PWV in the complete murine aortic arch via high-resolution 4D-flow MRI 2. The utilization of serial in vivo measurements in atherosclerotic mouse models using high-resolution 4D-flow MRI, which were divided into studies describing altered hemodynamics in late and early atherosclerosis 3. The development of tissue-engineered artery models for the controllable application and variation of hemodynamic and biologic parameters, divided in native artery models and biofabricated artery models, aiming for the investigation of the relationship between atherogenesis and hemodynamics Chapter 2 describes the establishment of a method for the simultaneous measurement of 3D WSS and PWV in the murine aortic arch at, using ultra high-field MRI at 17.6T [16], based on the previously published method for fast, self-navigated wall shear stress measurements in the murine aortic arch using radial 4D-phase contrast MRI at 17.6 T [4]. This work is based on the collective work of Dr. Patrick Winter, who developed the method and the author of this thesis, Kristina Andelovic, who performed the experiments and statistical analyses. As the method described in this chapter is basis for the following in vivo studies and undividable into the sub-parts of the contributors without losing important information, this chapter was not split into the single parts to provide fundamental information about the measurement and analysis methods and therefore better understandability for the following studies. The main challenge in this chapter was to overcome the issue of the need for a high spatial resolution to determine the velocity gradients at the vascular wall for the WSS quantification and a high temporal resolution for the assessment of the PWV without prolonging the acquisition time due to the need for two separate measurements. Moreover, for a full coverage of the hemodynamics in the murine aortic arch, a 3D measurement is needed, which was achieved by utilization of retrospective navigation and radial trajectories, enabling a highly flexible reconstruction framework to either reconstruct images at lower spatial resolution and higher frame rates for the acquisition of the PWV or higher spatial resolution and lower frame rates for the acquisition of the 3D WSS in a reasonable measurement time of only 35 minutes. This enabled the in vivo assessment of all relevant hemodynamic parameters related to atherosclerosis development and progression in one experimental session. This method was validated in healthy wild type and atherosclerotic Apoe-/- mice, indicating no differences in robustness between pathological and healthy mice. The heterogeneous distribution of plaque development and arterial stiffening in atherosclerosis [10, 12], however, points out the importance of local PWV measurements. Therefore, future studies should focus on the 3D acquisition of the local PWV in the murine aortic arch based on the presented method, in order to enable spatially resolved correlations of local arterial stiffness with other hemodynamic parameters and plaque composition. In Chapter 3, the previously established methods were used for the investigation of changing aortic hemodynamics during ageing and atherosclerosis in healthy wild type and atherosclerotic Apoe-/- mice using the previously established methods [4, 16] based on high-resolution 4D-flow MRI. In this work, serial measurements of healthy and atherosclerotic mice were conducted to track all changes in hemodynamics in the complete aortic arch over time. Moreover, spatially resolved 2D projection maps of WSS and OSI of the complete aortic arch were generated. This important feature allowed for the pixel-wise statistical analysis of inter- and intragroup hemodynamic changes over time and most importantly – at a glance. The study revealed converse differences of local hemodynamic profiles in healthy WT and atherosclerotic Apoe−/− mice, with decreasing longWSS and increasing OSI, while showing constant PWV in healthy mice and increasing longWSS and decreasing OSI, while showing increased PWV in diseased mice. Moreover, spatially resolved correlations between WSS, PWV, plaque and vessel wall characteristics were enabled, giving detailed insights into coherences between hemodynamics and plaque composition. Here, the circWSS was identified as a potential marker of plaque size and composition in advanced atherosclerosis. Moreover, correlations with PWV values identified the maximum radStrain could serve as a potential marker for vascular elasticity. This study demonstrated the feasibility and utility of high-resolution 4D flow MRI to spatially resolve, visualize and analyze statistical differences in all relevant hemodynamic parameters over time and between healthy and diseased mice, which could significantly improve our understanding of plaque progression towards vulnerability. In future studies the relation of vascular elasticity and radial strain should be further investigated and validated with local PWV measurements and CFD. Moreover, the 2D histological datasets were not reflecting the 3D properties and regional characteristics of the atherosclerotic plaques. Therefore, future studies will include 3D plaque volume and composition analysis like morphological measurements with MRI or light-sheet microscopy to further improve the analysis of the relationship between hemodynamics and atherosclerosis. Chapter 4 aimed at the description and investigation of hemodynamics in early stages of atherosclerosis. Moreover, this study included measurements of hemodynamics at baseline levels in healthy WT and atherosclerotic mouse models. Due to the lack of hemodynamic-related studies in Ldlr-/- mice, which are the most used mouse models in atherosclerosis research together with the Apoe-/- mouse model, this model was included in this study to describe changing hemodynamics in the aortic arch at baseline levels and during early atherosclerosis development and progression for the first time. In this study, distinct differences in aortic geometries of these mouse models at baseline levels were described for the first time, which result in significantly different flow- and WSS profiles in the Ldlr-/- mouse model. Further basal characterization of different parameters revealed only characteristic differences in lipid profiles, proving that the geometry is highly influencing the local WSS in these models. Most interestingly, calculation of the atherogenic index of plasma revealed a significantly higher risk in Ldlr-/- mice with ongoing atherosclerosis development, but significantly greater plaque areas in the aortic arch of Apoe-/- mice. Due to the given basal WSS and OSI profile in these two mouse models – two parameters highly influencing plaque development and progression – there is evidence that the regional plaque development differs between these mouse models during very early atherogenesis. Therefore, future studies should focus on the spatiotemporal evaluation of plaque development and composition in the three defined aortic regions using morphological measurements with MRI or 3D histological analyses like LSFM. Moreover, this study offers an excellent basis for future studies incorporating CFD simulations, analyzing the different measured parameter combinations (e.g., aortic geometry of the Ldlr-/- mouse with the lipid profile of the Apoe-/- mouse), simulating the resulting plaque development and composition. This could help to understand the complex interplay between altered hemodynamics, serum lipids and atherosclerosis and significantly improve our basic understanding of key factors initiating atherosclerosis development. Chapter 5 describes the establishment of a tissue-engineered artery model, which is based on native, decellularized porcine carotid artery scaffolds, cultured in a MRI-suitable bioreactor-system [23] for the investigation of hemodynamic-related atherosclerosis development in a controllable manner, using the previously established methods for WSS and PWV assessment [4, 16]. This in vitro artery model aimed for the reduction of animal experiments, while simultaneously offering a simplified, but completely controllable physical and biological environment. For this, a very fast and gentle decellularization protocol was established in a first step, which resulted in porcine carotid artery scaffolds showing complete acellularity while maintaining the extracellular matrix composition, overall ultrastructure and mechanical strength of native arteries. Moreover, a good cellular adhesion and proliferation was achieved, which was evaluated with isolated human blood outgrowth endothelial cells. Most importantly, an MRI-suitable artery chamber was designed for the simultaneous cultivation and assessment of high-resolution 4D hemodynamics in the described artery models. Using high-resolution 4D-flow MRI, the bioreactor system was proven to be suitable to quantify the volume flow, the two components of the WSS and the radStrain as well as the PWV in artery models, with obtained values being comparable to values found in literature for in vivo measurements. Moreover, the identification of first atherosclerotic processes like intimal thickening is achievable by three-dimensional assessment of the vessel wall morphology in the in vitro models. However, one limitation is the lack of a medial smooth muscle cell layer due to the dense ECM. Here, the utilization of the laser-cutting technology for the generation of holes and / or pits on a microscale, eventually enabling seeding of the media with SMCs showed promising results in a first try and should be further investigated in future studies. Therefore, the proposed artery model possesses all relevant components for the extension to an atherosclerosis model which may pave the way towards a significant improvement of our understanding of the key mechanisms in atherogenesis. Chapter 6 describes the development of an easy-to-prepare, low cost and fully customizable artery model based on biomaterials. Here, thermoresponsive sacrificial scaffolds, processed with the technique of MEW were used for the creation of variable, biomimetic shapes to mimic the geometric properties of the aortic arch, consisting of both, bifurcations and curvatures. After embedding the sacrificial scaffold into a gelatin-hydrogel containing SMCs, it was crosslinked with bacterial transglutaminase before dissolution and flushing of the sacrificial scaffold. The hereby generated channel was subsequently seeded with ECs, resulting in an easy-to-prepare, fast and low-cost artery model. In contrast to the native artery model, this model is therefore more variable in size and shape and offers the possibility to include smooth muscle cells from the beginning. Moreover, a custom-built and highly adaptable perfusion chamber was designed specifically for the scaffold structure, which enabled a one-step creation and simultaneously offering the possibility for dynamic cultivation of the artery models, making it an excellent basis for the development of in vitro disease test systems for e.g., flow-related atherosclerosis research. Due to time constraints, the extension to an atherosclerosis model could not be achieved within the scope of this thesis. Therefore, future studies will focus on the development and validation of an in vitro atherosclerosis model based on the proposed bi- and three-layered artery models. In conclusion, this thesis paved the way for a fast acquisition and detailed analyses of changing hemodynamics during atherosclerosis development and progression, including spatially resolved analyses of all relevant hemodynamic parameters over time and in between different groups. Moreover, to reduce animal experiments, while gaining control over various parameters influencing atherosclerosis development, promising artery models were established, which have the potential to serve as a new platform for basic atherosclerosis research. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Hauptansätze zur Bewertung und Untersuchung der veränderten Hämodynamik wie Wandschubspannung, des oszillatorischen Scherindex und der arteriellen Pulswellengeschwindigkeit bei der Entwicklung und Progression der Atherosklerose durchgeführt: 1. Die Etablierung einer schnellen Methode zur gleichzeitigen Bestimmung der 3D-Wandschubspannung und der Pulswellengeschwindigkeit im gesamten Aortenbogen der Maus mittels hochauflösender 4D-Fluss-MRT 2. Die Verwendung von seriellen in vivo Messungen in atherosklerotischen Mausmodellen mittels hochauflösender 4D-Fluss-MRT, die in Studien zur Beschreibung der veränderten Hämodynamik bei später und früher Atherosklerose aufgeteilt wurden 3. Die Entwicklung von tissue-engineerten Arterienmodellen für die kontrollierte Anwendung und Variation von hämodynamischen und biologischen Parametern, unterteilt in native Arterienmodelle und biofabrizierte Arterienmodelle, mit dem Ziel, die Beziehung zwischen Atherogenese und veränderter Hämodynamik zu untersuchen Kapitel 2 beschreibt die Etablierung einer Methode zur gleichzeitigen Messung von 3D-Wandschubspannung und Pulswellengeschwindigkeit im Aortenbogen der Maus unter Verwendung der Ultrahochfeld-MRT bei 17,6T [16], die auf der zuvor veröffentlichten Methode zur schnellen, selbstnavigierten Messung der Wandschubspannung im Aortenbogen der Maus unter Verwendung der radialen 4D-Phasenkontrast-MRT bei 17,6T [4] basiert. Dieses Projekt basiert auf der gemeinsamen Arbeit von Dr. Patrick Winter, der diese Methode entwickelt hat, und der Autorin dieser Thesis, Kristina Andelovic, die die Experimente und statistischen Analysen durchgeführt hat. Da die in diesem Kapitel beschriebene Methode die Grundlage für die folgenden in vivo Studien darstellt und sich nicht in die einzelnen Beiträge der Autoren aufteilen lässt, ohne dass wichtige Informationen verloren gehen, wurde dieses Kapitel nicht in die einzelnen Teile aufgeteilt, um grundlegende Informationen über die Mess- und Analysemethoden zu liefern und somit eine bessere Verständlichkeit für die folgenden Studien zu gewährleisten. Die größte Herausforderung in diesem Kapitel bestand darin, die Anforderung an eine hohe räumliche Auflösung zur Bestimmung der Geschwindigkeitsgradienten an der Gefäßwand für die WSS-Quantifizierung und an eine hohe zeitliche Auflösung für die Bestimmung der Pulswellengeschwindigkeit zu erfüllen, ohne die Messzeit aufgrund der Notwendigkeit von zwei separaten Messungen zu verlängern. Darüber hinaus ist für eine vollständige Erfassung der Hämodynamik im murinen Aortenbogen eine vollständige 3D-Messung des Aortenbogens erforderlich, die durch die Nutzung der retrospektiven Navigation und radialen Trajektorien erreicht wurde. Dies wurde durch ein hoch flexibles Rekonstruktionssystem ermöglicht, das entweder Bilder mit geringerer räumlicher Auflösung und höheren Bildraten für die Erfassung der Pulswellengeschwindigkeit oder mit höherer räumlicher Auflösung und niedrigeren Bildraten für die Erfassung der 3D-WSS in einer angemessenen Messzeit von nur 35 Minuten rekonstruieren konnte. Die in vivo-Bestimmung aller relevanter hämodynamischen Parameter, die mit der Entwicklung und dem Fortschreiten der Atherosklerose zusammenhängen, wurde somit in einer einzigen experimentellen Sitzung ermöglicht. Die Methode wurde an gesunden Wildtyp- und atherosklerotischen Apoe-/- Mäusen validiert, wobei keine Unterschiede in der Robustheit der Messungen zwischen pathologischen und gesunden Mäusen festgestellt werden konnten. Die heterogene Verteilung der Plaqueentwicklung und Arterienversteifung in der Atherosklerose [10, 12] weist jedoch auf die Wichtigkeit lokaler PWV-Messungen hin. Zukünftige Studien sollten sich daher auf die 3D-Erfassung der lokalen PWV im murinen Aortenbogen auf Grundlage der vorgestellten Methode konzentrieren, um räumlich aufgelöste Korrelationen der lokalen arteriellen Steifigkeit mit anderen hämodynamischen Parametern und der Plaquezusammensetzung zu ermöglichen. In Kapitel 3 wurden die zuvor etablierten Methoden zur Untersuchung der sich verändernden Hämodynamik in der Aorta während des Alterns und der Atherosklerose bei gesunden Wildtyp- und atherosklerotischen Apoe-/- Mäusen verwendet [4, 16], die auf hochauflösender 4D-Fluss MRT basieren. In dieser Arbeit wurden serielle Messungen an gesunden und atherosklerotischen Mäusen durchgeführt, um alle Veränderungen der Hämodynamik im gesamten Aortenbogen über die Zeit zu verfolgen. Zudem wurden in dieser Arbeit räumlich aufgelöste 2D-Projektionskarten der WSS und des OSI des gesamten Aortenbogens generiert. Diese Methode ermöglichte die pixelweise statistische Analyse der Unterschiede und hämodynamischen Veränderungen zwischen und innerhalb von Gruppen im Zeitverlauf und die Visualisierung auf einen Blick. Die Studie ergab sich gegensätzlich entwickelnde lokale hämodynamische Profile bei gesunden WT- und atherosklerotischen Apoe-/- Mäusen, wobei die longWSS über die Zeit abnahm und der OSI zunahm, während die PWV bei gesunden Mäusen konstant blieb. Im Gegensatz nahm die longWSS zu und der OSI bei kranken Mäusen ab, während die PWV über die Zeit zunahm. Darüber hinaus wurden räumlich aufgelöste Korrelationen zwischen WSS, PWV, Plaque und Gefäßwandeigenschaften ermöglicht, die detaillierte Einblicke in die Zusammenhänge zwischen Hämodynamik und Plaquezusammensetzung in der Atherosklerose bieten. Dabei wurde die zirkumferentielle WSS als potenzieller Marker für die Plaquegröße und -zusammensetzung bei fortgeschrittener Atherosklerose identifiziert. Darüber hinaus ergaben Korrelationen mit der PWV, dass der maximale radiale Druck als potenzieller Marker für die vaskuläre Elastizität dienen könnte. Zusammengefasst demonstriert diese Studie die Nützlichkeit der hochauflösenden 4D-Fluss MRT zur räumlichen Auflösung, Visualisierung und Analyse statistischer Unterschiede in allen relevanten hämodynamischen Parametern im Zeitverlauf und zwischen gesunden und erkrankten Mäusen, was unser Verständnis der Plaqueprogression in Richtung Vulnerabilität erheblich verbessern könnte. In zukünftigen Studien sollte jedoch der Zusammenhang zwischen Gefäßelastizität und radialem Druck weiter untersucht und mit lokalen PWV-Messungen und CFD validiert werden. Darüber hinaus spiegelten die histologischen 2D-Datensätze nicht die 3D-Eigenschaften und regionalen Charakteristika der atherosklerotischen Plaques wider. Daher sollten künftige Studien eine Analyse des 3D-Plaquevolumens und der 3D-Plaquenzusammensetzung sowie morphologische Messungen mittels MRT oder der Lichtblattmikroskopie mit einbeziehen, um das fundamentale Verständnis der Beziehung zwischen veränderter Hämodynamik und der Atherosklerose weiter zu verbessern. In Kapitel 4 ging es um die Beschreibung und Untersuchung der Hämodynamik in frühen Stadien der Atherosklerose. Darüber hinaus umfasste diese Studie zum ersten Mal Messungen der basalen Hämodynamik in gesunden WT- und atherosklerotischen Mausmodellen. Aufgrund des Mangels an Studien, die die Hämodynamik in Ldlr-/- Mäusen beschreiben, die zusammen mit dem Apoe-/- Mausmodell die am häufigsten verwendeten Mausmodelle in der Atheroskleroseforschung sind, wurde dieses Modell in diese Studie integriert, um erstmals die sich verändernde Hämodynamik im Aortenbogen zu Beginn und während der Entwicklung und Progression der frühen Atherosklerose zu beschreiben. In dieser Studie wurden erstmals deutliche Unterschiede in den basalen Aortengeometrien dieser Mausmodelle identifiziert, die zu signifikant unterschiedlichen Fluss- und WSS-Profilen im Ldlr-/- Mausmodell führen. Eine weitere basale Charakterisierung verschiedener Parameter ergab nur modell-charakteristische Unterschiede in den Lipidprofilen, was beweist, dass die Geometrie die lokale WSS in diesen Modellen stark beeinflusst. Interessanterweise ergab die Berechnung des atherogenen Plasma-Indexes ein signifikant höheres Risiko bei Ldlr-/- Mäusen mit fortschreitender Atheroskleroseentwicklung, aber signifikant größere Plaqueflächen im Aortenbogen der Apoe-/- Mäuse. Aufgrund des gegebenen basalen WSS- und OSI-Profils in diesen beiden Mausmodellen - zwei Parameter, die die Plaque-Entwicklung und -Progression stark beeinflussen - gibt es Hinweise darauf, dass sich die regionale Plaque-Entwicklung zwischen diesen Mausmodellen während der Atherogenese stark unterscheidet. Daher sollten sich künftige Studien auf die räumlich-zeitliche Bewertung der Plaqueentwicklung und -Zusammensetzung in den drei definierten Aortenregionen konzentrieren, wobei morphologische Messungen mittels MRT oder histologische 3D-Analysen wie LSFM zum Einsatz kommen. Darüber hinaus bietet diese Studie eine hervorragende Grundlage für künftige Studien mit CFD-Simulationen, in denen die verschiedenen gemessenen Parameterkombinationen (z. B. die Aortengeometrie der Ldlr-/-Maus mit dem Lipidprofil der Apoe-/- Maus) analysiert und die daraus resultierende Plaqueentwicklung und -Zusammensetzung simuliert werden. Dies könnte zum Verständnis des komplexen Zusammenspiels zwischen veränderter Hämodynamik, Serumlipiden und Atherosklerose beitragen und unser grundlegendes Verständnis der Schlüsselfaktoren für die Entstehung von Atherosklerose deutlich verbessern. In Kapitel 5 wird die Etablierung eines tissue-engineerten Arterienmodells beschrieben, das auf nativen, von Schweinehalsschlagadern hergestellten, dezellularisierten Gerüststrukturen basiert. Diese wurden zudem in einem MRT-geeigneten Bioreaktorsystem [23] kultiviert, um die hämodynamisch bedingte Atheroskleroseentwicklung auf kontrollierbare Weise zu untersuchen, wobei hierfür die zuvor etablierten Methoden zur WSS- und PWV-Bewertung [4, 16] verwendet wurden. Dieses in vitro Arterienmodell zielte auf die Reduzierung von Tierversuchen ab und bot gleichzeitig eine vereinfachte, aber vollständig kontrollierbare physikalische und biologische Umgebung. Zu diesem Zweck wurde in einem ersten Schritt ein sehr schnelles und schonendes Dezellularisierungsverfahren etabliert, das zu Gerüststrukturen basierend auf Schweinehalsschlagadern führte, die eine vollständige Azellularität aufwiesen, wobei gleichzeitig die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix, die allgemeine Ultrastruktur und die mechanischen Eigenschaften der nativen Arterien erhalten blieben. Darüber hinaus wurde eine gute Zelladhäsion und -proliferation erreicht, die mit isolierten menschlichen Endothelzellen aus humanem Vollblut untersucht wurde. Darüber hinaus wurde zum ersten Mal eine MRT-geeignete Arterienkammer für die gleichzeitige Kultivierung der generierten Modelle und der Untersuchung der hochauflösenden 4D-Hämodynamik in diesen Arterienmodellen entwickelt. Unter Verwendung der hochauflösenden 4D-Fluss-MRT erwies sich das Bioreaktorsystem als sehr geeignet, den Volumenstrom, die beiden Komponenten der WSS inklusive dem radialen Druck und die PWV in den Arterienmodellen zu quantifizieren, wobei die erhaltenen Werte sehr gut mit den in der Literatur gefundenen Werten für in vivo-Messungen vergleichbar sind. Darüber hinaus lassen sich durch die dreidimensionale Untersuchung der Gefäßwandmorphologie in den in vitro-Modellen erste atherosklerotische Prozesse wie die Verdickung der Intima erkennen. Eine Einschränkung ist jedoch das Fehlen einer medialen glatten Muskelzellschicht aufgrund der dichten ECM des Gewebegerüsts. Die Verwendung der Laserschneidetechnik zur Erzeugung von Löchern und / oder Gruben im Mikrometerbereich, die eine Besiedlung des Mediums mit SMCs ermöglichen, zeigte in einem ersten Versuch vielversprechende Ergebnisse und sollte in zukünftigen Studien daher dringend weiter untersucht werden. Das präsentierte Arterienmodell verfügt somit über alle relevanten Komponenten für die Erweiterung zu einem Atherosklerosemodell und ebnet den Weg für ein deutlich besseres Verständnis der Schlüsselmechanismen in der Atherogenese. Kapitel 6 beschreibt die Entwicklung eines einfach herzustellenden, kostengünstigen und vollständig an gegebene Bedürfnisse anpassbaren Arterienmodells auf Grundlage von Biomaterialien. Hier wurden thermoresponsive Opfergerüststrukturen, die mit der MEW-Technik hergestellt wurden, zur Herstellung variabler, biomimetischer Formen verwendet, um die geometrischen Eigenschaften des Aortenbogens, bestehend aus Verzweigungen und Krümmungen, zu imitieren. Nach der Einbettung der Opfergerüststruktur in ein Gelatin-Hydrogel, das zudem SMCs enthält, wurde es mit bakterieller Transglutaminase vernetzt, bevor es aufgelöst und gespült wurde. Der so entstandene Hydrogelkanal wurde anschließend mit Endothelzellen besiedelt, wodurch ein einfach zu erstellendes, schnelles und kostengünstiges Arterienmodell entstand. Im Gegensatz zum nativen Arterienmodell ist dieses Modell daher deutlich variabler in Größe und Form und bietet die wichtige Möglichkeit, von Anfang an glatte Muskelzellen mit einzubringen. Darüber hinaus wurde speziell für die gegebene Gerüststruktur eine maßgeschneiderte und hochgradig anpassungsfähige Perfusionskammer entwickelt, die eine sehr schnelle und einstufige Herstellung des Arterienmodells ermöglicht und gleichzeitig die Möglichkeit zur dynamischen Kultivierung der Modelle bietet, was eine hervorragende Grundlage für die Entwicklung von in vitro Krankheits-Testsystemen für z.B. die Atheroskleroseforschung im Zusammenhang mit der Hämodynamik darstellt. Aus Zeitgründen konnte die Ausweitung auf ein Atherosklerosemodell jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht realisiert werden. Daher werden sich zukünftige Studien auf die Entwicklung und Validierung eines in vitro-Atherosklerosemodells konzentrieren, das auf den hier entwickelten zwei- und dreischichtigen Arterienmodellen basiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit den Weg für eine schnelle Erfassung und detaillierte Analyse der sich verändernden Hämodynamik während der Entwicklung und der Progression der Atherosklerose geebnet hat, einschließlich räumlich aufgelöster Analysen aller relevanten hämodynamischen Parameter im Zeitverlauf innerhalb einer Gruppe und zwischen verschiedenen Gruppen. Darüber hinaus wurden vielversprechende Arterienmodelle etabliert, die das Potenzial haben, als neue Plattform für die Atherosklerose-Grundlagenforschung zu dienen, um Tierversuche zu minimieren und gleichzeitig die Kontrolle über verschiedene Parameter zu erlangen, die die Atheroskleroseentwicklung beeinflussen. KW - Hämodynamik KW - Arteriosklerose KW - Tissue Engineering KW - Atherosclerosis KW - MRI KW - Hemodynamics KW - Tissue Engineering KW - Biofabrication KW - Artery Models Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-303601 ER - TY - THES A1 - Schlipp [verh.: Wölfel], Angela T1 - Characterization of anti-beta1-adrenoceptor antibodies with Förster resonance energy transfer microscopy T1 - Charakterisierung von anti-beta1-Adrenozeptor Antikörpern mittels Förster Resonanz Energie Transfer Mikroskopie N2 - Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data. N2 - Dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine wichtige Subgruppe von Patienten mit Herzinsuffizienz dar und ist vermutlich in etwa einem Drittel der Fälle mit einem Autoimmunmechanismus assoziiert. In diesen Patienten konnten funktionell aktive konformationelle Autoantikörper gegen die zweite extrazelluläre Schleife des β1-adrenergen Rezeptors (Anti-β1ECII-AAK) nachgewiesen werden. Diese AK stimulieren chronisch den β1-AR und induzieren dadurch die adrenerge Signaltransduktionskaskade in Kardiomyozyten, was, auf lange Sicht, zur Verschlimmerung der Herzinsuffizienz beiträgt. Mittels eines Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays analysierten wir die Bildung von cAMP nach aab-vermittelter β1-AR Aktivierung in vitro. Dieser Assay verwendet HEK293 Zellen, die den humanen β1-AR sowie den cAMP-Sensor Epac1-camps stabil exprimieren. Der Assay zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg von cAMP bei Stimulation mit dem vollen Agonisten (-) Isoproterenol. Diese Antwort war mit den Ergebnissen an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten vergleichbar und konnte durch einen selektiven β1-AR Antagonist blockiert werden. In verschiedenen Tieren induzierte poly- und monoklonale Anti-β1¬ECII-abs konnten die adrenerge Signalkaskade in dem gleichen FRET Assay aktivieren, wogegen isotypische Kontroll-AK keine intrazellulären cAMP Änderungen herbeiführten. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir funktionell aktivierende AAK im Serum von Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer und hypertensiver Herzerkrankung sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie nachweisen, jedoch nicht im Serum von gesunden Kontrollpersonen. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen dem stimulierenden Potential der Anti-β1-AAKs und der linksventrikulären Pumpfunktion. Um diesen Assay zur Detektion funktionell aktivierender Anti-β1ECII-aabs in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen, versuchten wir ein automatisiertes Hochdurchsatzverfahren zu etablieren. Weder die Durchflusszytometrie noch die FRET Detektion mittels eines Fluoreszenz Plattenlesegeräts wiesen einen akzeptabelen Signal-zu-Rausch-Quotienten auf. Es gelang mit zwei verschiedenen FRET-Multiwell-Mikroskopsystemen die Aktivierung durch (-) isoproterenol konzentrationsabhängig zu detektieren, allerdings war es aufgrund von Fokusproblemen nicht möglich aktivierende Anti- β1¬ECII-AAKs im Hochdurchsatzverfahren zu detektieren. Einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung der Anti-β1-AAK-assoziierten autoimmunen DCM stellt die Neutralisierung der AAKs mittels korrespondierender Epitop-imitierender Peptide dar. Wir konnten im FRET Assay eine Reduktion des aktivierenden Effekts von Anti-β1¬ECII-AAKs nach in vitro Inkubation mit β1¬ECII-imitierenden Peptiden nachweisen. Hierbei erwiesen sich zyklische (in geringerem Maß als lineare) Peptide in 40-fachem molarem Überschuss als effektive Antikörper-„Fänger“ in vitro. Eine intravenöse Gabe der Zyklopeptide in einem Rattenmodell der DCM neutralisierte funktionell aktivierende Anti-β1¬ECII-abs ebenfalls effizient in vivo. Zur genaueren Analyse des von Anti-β1¬ECII-AAK gebundenen Rezeptor-Epitops setzten wir sequentiell Alanin-mutierte β1ECII-imitierende Zyklopeptide ein. Unsere Daten zeigten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten C209 und C215 des humanen β1¬AR essentiell für die Ausbildung des AAK-Epitops zu sein scheinen. Ein Austausch weiterer AK-bindungsrelevanter Aminosäuren im zyklischen Fängerpeptid durch Alanin verminderte dessen Avidität zum AK und inhibierte dessen Rezeptor-aktivierendes Potential weniger effizient. Im Gegensatz dazu verhinderte das nicht-mutierte Zyklopeptid nahezu vollständig die AK-vermittelte Rezeptoraktivierung. Durch diesen Ala-Scan Ansatz konnten wir ein „NDPK“-Epitop identifizieren, das für die AK-Bindung an β1¬ECII essentiell zu sein scheint. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Neutralisation von konformationellen aktivierenden Anti-β1¬ECII-(A)AKs durch Zyklopeptide ein viel versprechendes Therapiekonzept bei Herzinsuffizienz darstellt, das im Hinblick auf die hier vorgestellten Daten weiter ausgebaut werden sollte. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Beta-1-Rezeptor KW - Antikörper KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - Adrenergic receptor KW - Beta-1-receptor KW - Antibodies KW - Fluorescence-resonance-energy-transfer KW - Dilated cardiomyopathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67162 ER - TY - THES A1 - Maier-Peuschel, Monika T1 - Characterization of allosteric mechanisms on the M2 and M4 mACh receptor using the FRET-technique T1 - Charakterisierung allosterischer Mechanismen am M2 und M4 mACh Rezeptor unter Anwenduntg der FRET-Technik N2 - Allosteric modulators have been proposed as promising new compounds to modify protein function. Allosteric binding sites have been discovered for several G-protein-coupled receptors, including M1-5 muscarinic receptors. Since these receptors play a pivotal role in the regulation of a plethora of organ functions, it is particularly important to investigate the mechanisms of allosteric modulation. To study molecular mechanisms of allosteric modulation in the M2 muscarinic receptor, a new FRET-based sensor was designed. CFP fused to the C-terminus of the receptor and a small fluorescent compound FlAsH, which labels a specific binding sequence in the third intracellular loop, were used as donor and acceptor fluorophores, respectively. The first part of the study was to design a functional FRET receptor sensor. After several optimization steps the constructs FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP and HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP were generated which showed good cell-surface expression, robust changes in FRET and the ability to deliver reproducible data. The second part of this thesis sought to elucidate the mechanisms of the allosteric ligand binding and their effects on the receptor conformation. The described modifications, which were introduced in the wild type M2 mAChR to create the FRET sensor can alter receptor functionality and influence receptor expression. Radioligand binding studies revealed that the used transfection method provided sufficient receptor expression but, unfortunately, about 60 % of the FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP receptor remains in the cytosol. However, this was sufficient to perform FRET experiments. Patch clamp GIRK-measurements with acetylcholine evinced that the new M2-sensor was able to activate Gi-proteins. Also, radioligand-binding assays with the second construct HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP showed ligand affinity comparable to the wildtype receptor. Furthermore inhibition of forskolin-stimulated cAMP production was indistinguishable from the behaviour of the wildtype receptor. According to that, the full functionality of both receptor constructs could be confirmed. FRET measurements with the full muscarinic receptor agonists carbachol and acetylcholine confirmed that the FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP receptor construct showed rapid changes in FRET upon addition of both ligands, which were concentration-dependent. Concentration response curves and the resulting EC50 values of both agonists were similar to those already published in literature. In addition, the orthosteric antagonists atropine and methoctramine inhibited the FRET changes induced by the agonists. This inhibition was significantly faster than the washout kinetics, pointing to an active displacement of the agonists by the antagonists. Allosteric ligands gallamine, tacrine and dimethyl-W84 did not alter receptor conformation when added without an orthosteric ligand. However, when applied in addition to muscarinic agonists, all three substances inhibited the FRET-signal. The extent of this inhibition was dependent on the used concentration of the allosteric ligands. These results reveal that conformational changes brought about by allosteric ligands can be measured with the FRET technique. Furthermore real-time FRET-based kinetic measurements could be performed in living cells and showed that the allosteric ligands gallamine and dimethyl-W84 alter receptor conformation significantly faster than the antagonists atropine and methoctramine. This data indicate that allosteric ligands actively induce the conformational changes in the receptor. N2 - Allosterische Modulatoren, welche es ermöglichen die Funktionen einiger Proteine zu verändern, scheinen eine vielversprechende neue Substanzgruppe zu sein. Bereits bei mehreren GPCR konnten allosterische Bindungsstellen identifiziert werden, so auch in der Gruppe der muscarinischen Acetylcholin-Rezeptoren. Da gerade diese Rezeptorgruppe eine große Rolle im Organismus spielt und dort viele verschiedene Organfunktionen beeinflusst, stellt das Aufdecken der Mechanismen allosterischer Liganden gerade hier ein wichtiges Ziel dar. Um die Mechanismen allosterischer Bindung am M2-muscarinergen Rezeptor auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde ein FRET-Rezeptor Sensor hergestellt. Die GFP-Mutante CFP wurde dazu mit dem C-terminalen Ende des Rezeptors verbunden, und die Bindungssequenz für das FlAsH-Molekül, ein sogenannter Hairpin-binder, wurde in die Aminosäuresequenz der dritten intrazellulären Schleife eingebracht. Diese beiden Fluorophore fungieren als Donor und Akzeptorpaar im FRET-Sensor-Konstrukt. Da es bis jetzt keine Daten zu einem solchen muscarinischen FRET-Rezeptor-Sensor gibt, musste zunächst ein funktionelles Konstrukt erstellt werden. Nach Optimierung von Expression und FRET-Signalstärke gelang es mit den Konstrukten FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP und HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP zwei Sensoren herzustellen, welche den nötigen Anforderungen entsprechen. Im zweiten Teil der Doktorarbeit sollten dann die Mechanismen der allosterischen Rezeptormodifikatoren genauer beleuchtet werden. Durch die extensive Modifikation am M2 mAChR Konstrukt musste zunächst, die Funktionalität des Rezeptors sichergestellt werden. Durch Radioliganden-Bindungs-Experimente stellte sich heraus, dass nach Transfektion der Rezeptor sehr gut in der Zelle exprimiert wird, doch zu 60% im Zellinneren verbleibt. Dies reichte jedoch aus, um FRET-Experimente durchzuführen. Messungen mit der Patch-Clamp Methode zeigten, dass der M2-Rezeptor Sensor in der Lage ist, Gi-Proteine zu aktivieren. Außerdem zeigten Radioliganden Bindungs Assays, dass die Liganden Affinität des zweiten Konstruktes HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP vergleichbar mit der des Wildtyp-Rezeptors ist. Desweiteren ist das Konstrukt weiterhin in der Lage das FRET-Signal von Forskolin-stimulierten cAMP zu inhibieren. Somit scheint die Funktionalität beider Rezeptorkonstrukte, trotz Modifikationen, erhalten geblieben zu sein. FRET-Experimente unter Zugabe der Agonisten Acetylcholin und Carbachol zeigten auf, dass das FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP Rezeptor-Konstrukt konzentrationsabhängige und schnelle Änderungen des FRET-Signals aufweist. Auch die dabei ermittelten Werte der Konzentrations-Wirkungs-Kurven stimmten mit bereits veröffentlichten Werten überein. Die Antagonisten Atropin und Methoctramin führten zu einer Blockade des durch den Agonisten induzierten Signals, welches gleichzeitig schneller als das Auswaschen des Agonisten war. Alleinige Zugabe der gewählten allosterischen Liganden, Gallamin, Tacrin und Dimethyl-W84 änderte das FRET-Signal nicht. Erst durch vorherige Stimulation mit einem orthosterischen Agonisten waren sie in der Lage, das FRET-Signal des Agonisten zu blockieren. Die Stärke dieser Inhibition hing von der Konzentration des jeweiligen allosterischen Liganden ab. Diese Ergebnisse offenbaren, dass die Konformationsänderungen des Rezeptors nach Zugabe eines allosteren Liganden mit der FRET-Methode gemessen werden kann. Darüber hinaus konnte durch kinetische Messungen aufgedeckt werden, dass die allosteren Liganden Gallamin und W84 die Konformation des Rezeptors schneller ändern, als die Antagonisten Atropin und Methoctramin. Dieses Ergebnis bekräftigt die Annahme, dass allosterische Liganden aktiv eine bestimmte Konformationsänderung des Rezeptors herbeiführen. KW - Allosterie KW - Acetylcholinrezeptor KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - muskarinische Rezeptoren KW - muscarinic m ACh receptors Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49237 ER - TY - THES A1 - Kessie, David Komla T1 - Characterisation of Bordetella pertussis virulence mechanisms using engineered human airway tissue models T1 - Charakterisierung der Virulenzmechanismen von Bordetella pertussis mit humanen Gewebemodellen der Atemwege N2 - Pertussis is a highly contagious acute respiratory disease of humans which is mainly caused by the gram-negative obligate human pathogen Bordetella pertussis. Despite the availability and extensive use of vaccines, the disease persists and has shown periodic re-emergence resulting in an estimated 640,000 deaths worldwide in 2014. The pathogen expresses various virulence factors that enable it to modulate the host immune response, allowing it to colonise the ciliated airway mucosa. Many of these factors also directly interfere with host signal transduction systems, causing damage to the ciliated airway mucosa and increase mucous production. Of the many virulence factors of B. pertussis, only the tracheal cytotoxin (TCT) is able to recapitulate the pathophysiology of ciliated cell extrusion and blebbing in animal models and in human nasal biopsies. Furthermore, due to the lack of appropriate human models and donor materials, the role of bacterial virulence factors has been extrapolated from studies using animal models infected with either B. pertussis or with the closely related species B. bronchiseptica which naturally causes respiratory infections in these animals and produces many similar virulence factors. Thus, in the present work, in vitro airway mucosa models developed by co-culturing human airway epithelia cells and fibroblasts from the conduction zone of the respiratory tract on a decellularized porcine small intestine submucosa scaffold (SISser®) were used, since these models have a high correlation to native human conducting zone respiratory epithelia. The major aim was to use the engineered airway mucosa models to elucidate the contribution of B. pertussis TCT in the pathophysiology of the disease as well as the virulence mechanism of B. pertussis in general. TCT and lipopolysaccharide (LPS) either alone or in combination were observed to induce epithelial cell blebbing and necrosis in the in vitro airway mucosa model. Additionally, the toxins induced viscous hyper-mucous secretion and significantly disrupted barrier properties of the in vitro airway mucosa models. This work also sought to assess the invasion and intracellular survival of B. pertussis in the polarised epithelia, which has been critically discussed for many years in the literature. Infection of the models with B. pertussis showed that the bacteria can adhere to the models and invade the epithelial cells as early as 6 hours post inoculation. Invasion and intracellular survival assays indicated the bacteria could invade and persist intracellularly in the epithelial cells for up to 3 days. Due to the novelty of the in vitro airway mucosa models, this work also intended to establish a method for isolating individual cells for scRNA-seq after infection with B. pertussis. Cold dissociation with Bacillus licheniformis subtilisin A was found to be capable of dissociating the cells without inducing a strong fragmentation, a problem which occurs when collagenase and trypsin/EDTA are used. In summary, the present work showed that TCT acts possibly in conjunction with LPS to disrupt the human airway mucosa much like previously shown in the hamster tracheal ring models and thus appears to play an important role during the natural B. pertussis infection. Furthermore, we established a method for infecting and isolating infected cells from the airway mucosa models in order to further investigate the effect of B. pertussis infection on the different cell populations in the airway by single cell analytics in the future. N2 - Pertussis ist eine hoch ansteckende akute Atemwegserkrankung des Menschen, die durch das gramnegative obligat humanpathogene Bakterium Bordetella pertussis verursacht wird. Obwohl seit langer Zeit effektive Impfstoffe verfügbar sind und weltweit eingesetzt werden, stellt die Krankheit nach wie vor ein großes Problem dar und tritt seit einiger Zeit auch in Ländern mit guten Impfraten wieder vermehrt auf. Allein in den letzten 10 Jahren wurden weltweit etwa 24 Millionen Neuinfektionen mit 640,000 Todesfällen pro Jahr gezählt. Die Bakterien exprimieren verschiedene Virulenzfaktoren, die es ihnen ermöglichen, die Immunantwort des Wirts zu modulieren, wodurch sie die Schleimhaut der oberen Atemwege besiedeln können. Viele dieser Faktoren stören auch direkt die Signaltransduktionssysteme des Zellen der oberen Atemwege, was zu einer Schädigung des Flimmerepithels der Atemwege und zu einer starken Erhöhung der Schleimproduktion führt. Von den vielen bekannten Virulenzfaktoren von B. pertussis kann soweit bekannt nur das Tracheale Cytotoxin (TCT) die typische Pathophysiologie des Flimmerepithels verursachen, die durch massive Gewebszerstörung gekennzeichnet ist und z.B. das Herauslösen von Epithelzellen aus der Epithelschicht oder die Ausbildung von bläschenförmigen Epithelzellen beinhaltet. Aufgrund des Mangels an geeigneten menschlichen Modellsystemen bzw. an Spendermaterialien wurden die Virulenzeigenschaften des Erregers entweder mit Hilfe von einfachen Zellkultursystemen oder in Tiermodellen untersucht, die keine natürlichen Wirte für B. pertussis darstellen. Alternativ hierzu wurden auch Daten, die mit dem eng verwandten tierpathogenen Bakterium B. bronchiseptica, das viele aus B. pertussis bekannte Virulenzfaktoren produziert, in entsprechenden Tiermodellen erhoben wurden, genutzt, um auf die Virulenzeigenschaften von B. pertussis zu schließen. Die vorliegende Arbeit verwendet In-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle, die durch Co-Kultivierung von menschlichen Atemwegsepithelzellen und Fibroblasten auf einem dezellularisierten Schweine-Dünndarm-Submukosa-Gerüst (SISser®) entwickelt wurden. Die in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle weisen eine hohe Korrelation mit nativen menschlichen Epithelien der oberen Atemwege auf. Mithilfe dieser neuartigen Atemwegsschleimhautmodelle sollte der Beitrag von B. pertussis TCT zur Pathophysiologie der Krankheit und die Bedeutung von TCT als relevanter Virulenzfaktor aufgeklärt werden. Es wurde beobachtet, dass TCT und das bakterielle Lipopolysaccharid (LPS) entweder alleine oder in Kombination die Bildung von Epithelzellbläschen und Nekrose in diesen in-vitro-Atemwegsschleimhautmodellen induzieren. Zusätzlich induzierten diese Toxine eine viskose Hyperschleimsekretion und störten die Barriereeigenschaften der in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle signifikant. Zudem wurde in dieser Arbeit versucht, die Invasion und das intrazelluläre Überleben von B. pertussis in den polarisierten Epithelien zu bewerten, das in der einschlägigen Fachliteratur kritisch diskutiert wird. Die Infektion der Modelle mit B. pertussis zeigte, dass die Bakterien bereits 6 Stunden nach der Inokulation an den Modellen adhärieren und in diese eindringen können. Invasions- und intrazelluläre Überlebenstests zeigten, dass die Bakterien bis zu 3 Tage intrazellulär in die Epithelzellen überleben können. Aufgrund der Neuheit der in dieser Arbeit entwickelten in-vitro-Atemwegsschleimhautmodelle sollte auch eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen für scRNA-seq Analysen nach Infektion mit B. pertussis etabliert werden. Dabei wurde festgestellt, dass die Inkubation der Modelle mit Subtilisin A von Bacillus licheniformis in der Kälte eine sehr gute Methode darstellt, um die Zellen zu dissoziieren, ohne eine starke Fragmentierung zu induzieren, wie sie unter Verwendung von Kollagenase und Trypsin / EDTA auftritt. Zusammenfassend wird in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass TCT gemeinsam mit LPS eine extrem destruktive Wirkung auf die menschliche Atemwegsschleimhaut besitzt, die der früher gezeigten Wirkung in Tiermodellen stark ähnelt. TCT sollte deshalb tatsächlich als ein wichtiger Virulenzfaktor von B. pertussis eingeschätzt werden. Darüber hinaus wurden Methoden zur Infektion und Isolierung von infizierten Zellen aus den Atemwegsschleimhautmodellen entwickelt, um künftig die Auswirkung einer B. pertussis Infektion auf die verschiedenen Zellpopulationen in den Atemwegen durch Einzelzellanalytik noch besser erforschen zu können. KW - Tissue engineering KW - Pertussis KW - Airway epithelia KW - Bordetella KW - tracheal cytotoxin KW - 3D models Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235717 ER - TY - THES A1 - Lerch, Maike Franziska T1 - Characterisation of a novel non-coding RNA and its involvement in polysaccharide intercellular adhesin (PIA)-mediated biofilm formation of \(Staphylococcus\) \(epidermidis\) T1 - Charakterisierung einer neuen nicht-kodierenden RNA und deren Beteiligung an der PIA-vermittelten Biofilmbildung von \(Staphylococcus\) \(epidermidis\) N2 - Coagulase-negative staphylococci, particularly Staphylococcus epidermidis, have been recognised as an important cause of health care-associated infections due to catheterisation, and livestock-associated infections. The colonisation of indwelling medical devices is achieved by the formation of biofilms, which are large cell-clusters surrounded by an extracellular matrix. This extracellular matrix consists mainly of PIA (polysaccharide intercellular adhesin), which is encoded by the icaADBC-operon. The importance of icaADBC in clinical strains provoking severe infections initiated numerous investigations of this operon and its regulation within the last two decades. The discovery of a long transcript being located next to icaADBC, downstream of the regulator gene icaR, led to the hypothesis of a possible involvement of this transcript in the regulation of biofilm formation (Eckart, 2006). Goal of this work was to characterise this transcript, named ncRNA IcaZ, in molecular detail and to uncover its functional role in S. epidermidis. The ~400 nt long IcaZ is specific for ica-positive S. epidermidis and is transcribed in early- and mid-exponential growth phase as primary transcript. The promotor sequence and the first nucleotides of icaZ overlap with the 3' UTR of the preceding icaR gene, whereas the terminator sequence is shared by tRNAThr-4, being located convergently to icaZ. Deletion of icaZ resulted in a macroscopic biofilm-negative phenotype with highly diminished PIA-biofilm. Biofilm composition was analysed in vitro by classical crystal violet assays and in vivo by confocal laser scanning microscopy under flow conditions to display biofilm formation in real-time. The mutant showed clear defects in initial adherence and decreased cell-cell adherence, and was therefore not able to form a proper biofilm under flow in contrast to the wildtype. Restoration of PIA upon providing icaZ complementation from plasmids revealed inconsistent results in the various mutant backgrounds. To uncover the functional role of IcaZ, transcriptomic and proteomic analysis was carried out, providing some hints on candidate targets, but the varying biofilm phenotypes of wildtype and icaZ mutants made it difficult to identify direct IcaZ mRNA targets. Pulse expression of icaZ was then used as direct fishing method and computational target predictions were executed with candidate mRNAs from aforesaid approaches. The combined data of these analyses suggested an involvement of icaR in IcaZ-mediated biofilm control. Therefore, RNA binding assays were established for IcaZ and icaR mRNA. A positive gel shift was maintained with icaR 3' UTR and with 5'/3' icaR mRNA fusion product, whereas no gel shift was obtained with icaA mRNA. From these assays, it was assumed that IcaZ regulates icaR mRNA expression in S. epidermidis. S. aureus instead lacks ncRNA IcaZ and its icaR mRNA was shown to undergo autoregulation under so far unknown circumstances by intra- or intermolecular binding of 5' UTR and 3' UTR (Ruiz de los Mozos et al., 2013). Here, the Shine-Dalgarno sequence is blocked through 5'/3' UTR base pairing and RNase III, an endoribonuclease, degrades icaR mRNA, leading to translational blockade. In this work, icaR mRNA autoregulation was therefore analysed experimentally in S. epidermidis and results showed that this specific autoregulation does not take place in this organism. An involvement of RNase III in the degradation process could not be verified here. GFP-reporter plasmids were generated to visualise the interaction, but have to be improved for further investigations. In conclusion, IcaZ was found to interact with icaR mRNA, thereby conceivably interfering with translation initiation of repressor IcaR, and thus to promote PIA synthesis and biofilm formation. In addition, the environmental factor ethanol was found to induce icaZ expression, while only weak or no effects were obtained with NaCl and glucose. Ethanol, actually is an ingredient of disinfectants in hospital settings and known as efficient effector for biofilm induction. As biofilm formation on medical devices is a critical factor hampering treatment of S. epidermidis infections in clinical care, the results of this thesis do not only contribute to better understanding of the complex network of biofilm regulation in staphylococci, but may also have practical relevance in the future. N2 - Koagulase-negative Staphylokokken besiedeln die menschliche und tierische Haut, sowie die Schleimhäute. Durch Läsionen oder das Einbringen von medizinischen Instrumenten wie Kathetern gelangen sie in tiefere Hautschichten oder die Blutbahn und können dort schwerwiegende Infektionen auslösen, vor Allem bei Risikopersonen. Besonders Staphylococcus epidermidis hat sich als Verursacher von nosokomialen Infektionen, aber auch als Pathogen in der Tierhaltung etabliert. Die Bakterien bilden bei der Besiedlung sogenannte Biofilme aus (d.h. eine Akkumulation der Keime, die von einer extrazellulären Matrix umgeben sind). Diese Matrix besteht neben Proteinen und eDNA hauptsächlich aus einem Polysaccharid, dem interzellulären Adhäsin PIA (engl.: polysaccharide intercellular adhesin). Dieses wird durch die Ica-Proteine synthetisiert, die im icaADBC-Operon (engl.: intercellular adhesin operon) kodiert sind. Das Operon hat große Bedeutung in klinischen Stämmen und wurde daher innerhalb der letzten beiden Jahrzehnte eingehend untersucht, auch im Hinblick auf seine Regulation. In der unmittelbaren Umgebung des icaADBC-Operons, stromabwärts des icaR Gens, das für den Repressor des ica-Operons (IcaR) kodiert, wurde ein großes Transkript identifiziert, von dem vermutet wird, dass es möglicherweise an der Regulation der Biofilmbildung beteiligt ist (Eckart, 2006). Ziel dieser Arbeit war es, dieses Transkript zu charakterisieren und seine Funktion in S. epidermidis aufzudecken. Die nicht-kodierende RNA, genannt IcaZ, hat eine Länge von ~400 nt und ist spezifisch für ica-positive S. epidermidis. Sie wird in der frühen bis mittleren exponentiellen Phase temperaturabhängig exprimiert. Stromaufwärts überlappt das icaZ-Gen und dessen Promotor mit der 3' UTR vom icaR-Gen. Stromabwärts wird das icaZ-Gen vom einem Transkriptionsterminator begrenzt, der auch für das tRNAThr-4-Gen benutzt wird, das auf dem gegenüberliegenden Strang in Richtung des icaZ-Gens lokalisiert ist. Die Deletion der RNA führte zu einem makroskopisch sichtbaren Biofilm-negativen Phänotyp mit deutlich verminderter PIA Bildung. Die Biofilmzusammensetzung wurde in vitro mittels eines klassischen Kristallviolett-Assays gemessen und die Biofilmbildung in vivo in Echtzeit mittels konfokaler Mikroskopie (CLSM) betrachtet. Dabei wurde mit einer peristaltischen Pumpe ein Mediumfluss appliziert. Die Mutante zeigte klare Defekte in der initialen Adhärenz und in der Zell-Zell Adhäsion. Sie bildete im Gegensatz zum Wildtyp keinen strukturierten Biofilm aus. Zur Komplementierung des Biofilms wurde die IcaZ von einem Plasmid exprimiert und die Biofilmzusammensetzung nach 18-20 Stunden Wachstum gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen in den verschiedenen Mutanten waren nicht eindeutig. Um die Funktion von IcaZ aufzudecken, wurden Transkriptom- und Proteomvergleiche zwischen Wildtyp und Mutante gemacht. Diese lieferten einige Hinweise, aber da der metabolische Unterschied eines Biofilmbildners zu einem Nicht-Biofilmbildner zu groß war, wurde eine direktere Methode angewandt, die induzierte Expression (Pulsexpression). Zudem wurden potentielle Interaktionspartner der IcaZ mittels computer-basierter Bindungsvorhersagen analysiert. Die icaR mRNA kristallisierte sich dabei als Target heraus und die Interaktion zwischen IcaZ und icaR mRNA wurde mit Gelshift-Assays (EMSA) untersucht. Eine Bandenverschiebung wurde mit icaR 3' UTR und mit dem icaR-5'-3' UTR-Fusionsprodukt detektiert, wohingegen keine Interaktion zwischen IcaZ und icaA mRNA stattfand. Aufgrund dieser Assays wurde vermutet, dass IcaZ die Translation von icaR in S. epidermidis reguliert. In S. aureus fehlt die nicht-kodierende RNA IcaZ und für icaR mRNA wurde eine Autoregulation gezeigt, bei der die icaR 5' UTR mit der icaR 3' UTR intramolekular oder intermolekular durch Basenpaarung interagiert, wodurch die Shine-Dalgarno Sequenz blockiert wird und es aufgrund dessen zu einer Hemmung der Translation kommt. Die Umweltfaktoren, die dazu führen sind bisher unbekannt. Der Komplex wird durch eine Endoribonuklease, RNase III, abgebaut (Ruiz de los Mozos et al., 2013). In S. epidermidis wurde eine solche Interaktion theoretisch ausgeschlossen. Experimentelle Analysen dieser Arbeit haben gezeigt, dass diese Autoregulation in S. epidermidis nicht stattfinden kann und es wird angenommen, dass IcaZ diese Regulation übernimmt. Um die Interaktion zu visualisieren wurden GFP-Reporter Plasmide generiert, die aber für weitere Experimente noch zu verbessern sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass IcaZ mit der icaR mRNA interagiert, was höchstwahrscheinlich zu einer Hemmung der Translation des Repressors IcaR führt und damit letztlich PIA-Synthese und Biofilmbildung positiv reguliert. Zusätzlich wurde gefunden, dass Ethanol die Expression der IcaZ-RNA induziert, während NaCl nur schwache Effekte zeigte und Glucose keinen Einfluss auf die Expression von icaZ hatte. Ethanol ist ein Bestandteil von Desinfektionsmitteln, die in Krankenhäusern verwendet werden und ist bekannt dafür Biofilmbildung auszulösen. Da die Bildung von Biofilmen auf medizinischen Geräten kritisch ist und diese die Behandlung von S. epidermidis Infektionen erschweren, tragen die Ergebnisse dieser Arbeit nicht nur zu einem besseren Verständnis des komplexen Netzwerks der Biofilmregulation bei, sondern haben möglicherweise auch praktischen Nutzen in der Zukunft. KW - Biofilm KW - Staphylococcus epidermidis KW - Non-coding RNA KW - Hospitalismus KW - icaADBC KW - Nosocomial Infections KW - Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) KW - Biofilm formation KW - non-coding RNA KW - ncRNA KW - Nosokomiale Infektionen Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155777 ER - TY - THES A1 - Fetiva Mora, Maria Camila T1 - Changes in chromatin accessibility by oncogenic YAP and its relevance for regulation of cell cycle gene expression and cell migration T1 - Änderungen der Chromatinzugänglichkeit durch onkogene YAP und seine Relevanz für die Genexpression während des Zellzyklus und für die Zellmigration N2 - Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes. The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration. Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration. N2 - Ein Kennzeichen vieler Tumoren ist die fehlerhafte Aktivierung von zellzyklusregulierenden Signalwegen. Ein für das Tumorwachstum wichtiger Signalwege ist der Hippo-Signalweg und das durch ihn regulierte Onkogen YAP, ein transkriptioneller Koaktivator. Durch die Regulierung von Zellzyklusgenen ist YAP verantwortlich für onkogene Prozesse wie Zellproliferation und Metastasierung. Der MMB-Multiproteinkomplex wiederum – er entsteht, wenn B-MYB an das MuvB-Kernmodul bindet – ist ein wichtiger Regulator der mitotischen Genexpression, welche ebenso mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wurde. Unser Labor hat zuvor einen neuen Mechanismus der Regulation mitotischer Gene durch den MMB-Komplex und YAP identifiziert: Durch die Bindung an Enhancer der MMB-Zielgene und die Förderung der B-MYB-Bindung an Promotoren reguliert YAP eine Reihe von mitotischen und zytokinetischen Zielgenen, welche die Zellproliferation fördern. Diese Doktorarbeit befasst sich mit den Mechanismen der YAP- und MMB-vermittelten Transkription und charakterisiert die Rolle der YAP regulierten Enhancer während der Transkription von Zellzyklusgenen. Die in dieser Dissertation dargelegten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von konstitutiv aktivem, onkogenem YAP5SA zu weitreichenden Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit nicht-transformierter humaner MCF10A Zellen führt. ATAC-seq zeigte, dass ein grosse Anzahl YAP-gebundene Enhancer zugänglich und aktiviert werden. Gleichzeitig konnte festgestellt werden, dass die MMB-gebundenen Promotoren bereits vor der Expression von YAP zugänglich sind und während der YAP-Induktion offen bleiben. Mittels CRISP-Interferenz (CRISPRi) und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) konnten wir zeigen, dass YAP-gebundene Enhancer die Rekrutierung von CDK7 an MMB-regulierten Promotoren sowie die Initiation und Elongation der Transkription von G2/M Genen fördert. Durch die experimentelle Blockade der YAP-B-MYB Proteininteraktion konnten wir darüber hinaus belegen, dass auch die Bindung von YAP an B-MYB für die Initiation der Transkription an MMB-regulierten Genen entscheidend ist. Unerwarteterweise führte die Überexpression von YAP5SA auch dazu, dass bestimmte Regionen im Genom weniger zugänglich werden. Motivanalysen ergaben, dass diese neu geschlossenen Regionen Bindungsmotive für die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren enthalten. Die Chromatinschließung durch YAP ist an eine reduzierte Expression und an den Verlust der Chromatinbindung des p53-Familienmitglieds Np63 gekoppelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von Np63 durch YAP ein wichtiger Schritt in der YAP-abhängigen Förderung der Zellmigration ist. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Dissertation Einblicke in die Rolle von YAP bei Chromatinveränderungen welche zu den onkogenen Aktivitäten von YAP beitragen. Die Überexpression von YAP führt dabei einerseits zur Öffnung des Chromatins an YAP-gebundenen Enhancern, die zusammen mit dem MMB-Komplex die Expression von G2/M Genen stimulieren. Andererseits fördert YAP auch das Schließen von Chromatin an Np63-gebundenen Regionen, was wiederum Zellmigration nach sich zieht. KW - YAP KW - B-MYB KW - MMB KW - enhancers KW - transcription KW - chromatin accessibility KW - opening of chromatin KW - closing of chromatin KW - cell migration KW - G2/M genes KW - Chromatin KW - Genexpression KW - Zellzyklus KW - Zellmigration Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302910 ER - TY - THES A1 - Lorenz, Viola T1 - Cellular regulation of the hemITAM-coupled platelet receptor C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2): In vitro and in vivo studies in mice T1 - Zelluläre Regulation des hemITAM-gekoppelten Thrombozytenrezeptors C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2): In vitro und in vivo Studien in Mäusen N2 - Platelet aggregation at sites of vascular injury is essential to limit posttraumatic blood loss, but may also cause acute ischemic disease states such as myocardial infarction or stroke. Stable thrombus formation requires a series of molecular events involving platelet receptors and intracellular signal transduction, which contribute to adhesion, activation and aggregation of platelets. In this thesis, the cellular regulation of platelet surface receptors and their involvement in thrombus formation was investigated using genetically modified mice. In the first part of the study, the functional relevance of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-coupled collagen receptor GPVI and of the recently identified hemITAM-bearing C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) for in vivo thrombus formation was analyzed. Megakaryocyte/ platelet-specific CLEC-2 knock out mice displayed a defective lymphatic development and were protected from occlusive arterial thrombus formation. These phenotypes were more pronounced in mice with a GPVI/CLEC-2 double deficiency. Hemostasis was not compromised in CLEC-2 or GPVI single-deficient animals, as they showed only mildly prolonged tail bleeding times. Combined depletion of both receptors resulted in markedly prolonged bleeding times revealing an unexpected redundant function of the two receptors in hemostasis as well as thrombosis. These findings might have important implications for the development of anti-CLEC-2/ anti-GPVI agents as therapeutics. In the second part, mechanisms underlying the cellular regulation of CLEC-2 were studied. Previous studies have shown that injection of the anti-CLEC-2 antibody INU1 results in complete immunodepletion of platelet CLEC-2 in mice, which is preceded by a severe transient thrombocytopenia thereby limiting its potential therapeutic use. It is demonstrated that INU1-induced CLEC-2 immunodepletion occurs through Src family kinase (SFK)-dependent receptor internalization in vitro and in vivo, presumably followed by intracellular degradation. In mice with spleen tyrosine kinase (Syk) deficiency, INU1-induced CLEC-2 internalization/ degradation was fully preserved, whereas the associated thrombocytopenia was largely prevented. These results show that CLEC-2 can be downregulated from the platelet surface through internalization in vitro and in vivo and that this can be mechanistically uncoupled from the associated antibody-induced thrombocytopenia. Since INU1 IgG induced a pronounced thrombocytopenia, the in vivo effects of monovalent INU1 F(ab) fragments were analyzed. Very unexpectedly, injection of the F(ab) fragments resulted in widespread thrombus formation leading to persistent neurological deficits of the animals. This intravascular thrombus formation is the result of CLEC-2-dependent platelet activation and aggregation. The mechanism underlying the thrombus formation is still unknown and depends potentially on binding of a yet unidentified ligand to F(ab)-opsonized CLEC-2 on platelets. N2 - Die Aggregation von Thrombozyten ist ein essentielle Prozess, um Blutungen nach einer Gefäßverletzung zu stoppen. Sie kann aber auch zu akuten thrombotischen Erkrankungen, wie Herzinfarkt und Schlafanfall, führen. Die Bildung eines stabilen Thrombus ist ein dynamischer Prozess, der ein definiertes Zusammenspiel von thrombozytären Rezeptoren und intrazellulären Signalen benötigt, die zur Adhäsion, Aktivierung und Aggregation der Thrombozyten beitragen. In der hier vorliegenden Dissertation wurde zellulär Regulation von thrombozytären Oberflächenrezeptoren und ihre Beteiligung an der Thromben-Bildung mittels genetisch veränderter Mäuse untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde die funktionelle Relevanz des immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-gekoppelten Kollagenrezeptors GPVI und des vor kurzem entdeckten hemITAM-gekoppelten C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) für die in vivo Thromben-Bildung charakterisiert. Mäuse mit einer Megakaryozyten/ Thrombozyten-spezifischen CLEC-2-Defizienz weisen Defekte in der Entwicklung ihrer lymphatischen Gefäße auf und sind vor arteriellen Gefäßverschlüssen geschützt. Dieser Phänotyp war in Mäusen mit einer Defizient GPVI und CLEC-2 verstärkt. GPVI oder CLEC-2-defiziente Mäuse zeigen eine normale Hämostase, da ihre Schwanzblutungszeiten nur minimal verlängert waren. Die gleichzeitige Defizienz beider Rezeptoren verlängerte die Blutungszeiten der Tiere allerdings erheblich. Das spricht dafür, dass beiden Rezeptoren eine unerwartete redundante Funktion sowohl in der Hämostase als auch während der pathologischen Thromben-Bildung haben. Diese Ergebnisse könnten für die Entwicklung neuer therapeutischen Wirkstoffen, die gegen GPVI und/ oder CLEC-2 gerichtet sind, bedeutsam sein. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die zelluläre Regulation von CLEC-2 untersucht. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Behandlung von Mäusen mit dem gegen CLEC-2 gerichteten Antikörper INU1 zu einem spezifischen Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten führt. Dieser Prozess, der „Immunodepletion“ genannt wird, ist von einer Thrombozytopenie begleitet, die das therapeutische Potential eines solchen Ansatzes reduziert. Im Verlauf der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die INU1-abhängige Immunodepletion in vitro und in vivo mittels src family kinase (SFK)-abängiger Internalisierung geschieht. Der Internalisierung ist vermutlich ein intrazellulärer Abbau nachgeschaltet. In Mäusen mit einer spleen tyrosine kinase (Syk) Defizienz war die INU1-abhängige Thrombozytopenie zum größten Teil verhindert, aber die Herabregulation durch Internalisierung von CLEC-2 blieb erhalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass CLEC-2 in vitro und in vivo durch Internalisierung von der Thrombozyten-Oberfläche herabreguliert werden kann. Darüber hinaus kann dies von der Antikörper-vermittelten Thrombozytopenie mechanistisch entkoppelt werden. Da die Injektion von INU1 IgG eine starke Thrombozytopenie in der Tieren verursacht, sollen die in vivo Effekte von monovalenten INU1 F(ab) Fragmenten getestet werden. Unerwarteter weise führte die Injektion dieser F(ab) Fragmente zu einer systemischen Thromben-Bildung, die unter anderem neurologische Defizite in den Tieren auslösten. Diese intravaskuläre Thromben-Bildung ist ein Ergebnis von CLEC-2-abhängier Thrombozyten Aktivierung und Aggregation. Der Mechanismus, der dieser Thromben-Bildung zugrunde liegt, ist bisher noch nicht aufgeklärt. Möglicherweise wird er durch die Bindung eines unbekannten Liganden an das F(ab)-gebunde CLEC-2 auf Thrombozyten ausgelöst. KW - Thrombozytenaggregation KW - CLEC-2 Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116724 ER - TY - THES A1 - Mainz, Laura T1 - Cellular metabolism as target for cancer therapy T1 - Zellulärer Metabolismus als Krebstherapie-Target N2 - Due to a usually late diagnosis, drug resistance and early metastases, pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the seventh leading cause of global cancer deaths. Thus, there is an urgent need to develop new therapeutic concepts. Two different approaches have in recent years become the focus of intense research: (1) targeting cancer-associated metabolic rearrangements, and (2) targeting genetic vulnerabilities with combination therapy. Both concepts potentially have advantages such as increased efficacy, which decreases the likelihood of therapy-resistance, and reduced side effects, that are often associated with high concentrations of chemotherapeutic drugs. Autophagy is an evolutionary conserved signalling pathway that regulates cellular homeostasis. Regarding cancer, autophagy can either promote or suppress tumor growth. However, mouse models that allow genetic regulation of autophagy in established tumor tissue are not yet established. Therefore, we analysed new inducible shRNA mouse models targeting Atg5 or Atg7 with regard to functionality and toxicity. Both, shRNA Atg5- and shRNA Atg7-mediated knockdown anteceded functional autophagy impairment, and revealed unexpected profound phenotypic differences. Knockdown of Atg5 neither impaired the animal nor caused any grossly or microscopically detectable organ damage, whereas knockdown of Atg7 caused pancreatic destruction and eventually death. It is currently unclear whether mice died as a result of exocrine or endocrine collapse or due to a combination of both. The presented mouse models are highly potent RNAi mice that allow widespread and regulable inhibition of autophagy upon administration of doxycycline and provide a valuable and versatile toolbox for future autophagy and cancer research. In PDAC, argininosuccinate synthase 1 (ASS1) deficiency has been associated with higher recurrence rates, shorter disease-free survival, and shorter overall survival. During cancer development, rate-limiting enzymes of de novo arginine synthesis, like ASS1 or OTC, are downregulated via epigenetic silencing of their respective promotor. Known as ‘arginine auxotrophy‘, loss of these essential enzymes results in dependence on extracellular arginine. Based on this assumption, sensitivity of various cell lines to arginine deprivation was reported. However, the underlying mechanism is still unclear and the anti-tumor effects of the monotherapy are not sufficient to completely abrogate cancer cells. Therefore, the effects of arginine deprivation via rhArgI-PEG5000 were investigated in murine and human PDAC cells. In this study, we highlighted that arginine deprivation induced profound alterations such as autophagosome accumulation, induction of senescence and the ISR in pancreatic cancer cells. These alterations are potential genetic vulnerabilities that can be targeted by additional means to induce tumor cell death. N2 - Infolge einer späten Diagnose, Therapie-Resistenz und unentdeckten Mikrometastasen wurde das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) zur siebthäufigsten krebsbedingten Todesursache weltweit. Dies verdeutlicht, dass dringend neue therapeutische Ansätze entwickelt werden müssen. In den vergangenen Jahren wurde unter anderem auf zwei Ansätze fokussiert: (1) Behandlung Tumor-assoziierter metabolischer Veränderungen und (2) Behandlung genetischer Schwachstellen mit Kombinationstherapie. Zum einen erhofft man sich eine erhöhte Wirksamkeit, die die Wahrscheinlichkeit von Therapie-Resistenzen reduziert, zum anderen verringerte Nebenwirkungen, die meist mit hohen Chemotherapeutika-Konzentrationen verbunden sind. Autophagie ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der für die Regulation der zellulären Homöostase verantwortlich ist. Es ist bekannt, dass dieser das Tumorwachstum sowohl fördern, als auch unterdrücken kann. Jedoch sind Mausmodelle, die eine genetische Regulierung von Autophagie im etablierten Tumorgewebe ermöglichen, noch nicht etabliert. Aus diesem Grund wurden neue induzierbare shRNA-Mausmodelle gegen Atg5 oder Atg7 hinsichtlich Funktionalität und Toxizität analysiert. Nach Induktion führten beide shRNAs zum systemweiten Knockdown, der im weiteren Verlauf eine funktionelle Beeinträchtigung des Signalwegs zur Folge hatte. Jedoch traten unerwartete phänotypische Unterschiede auf. Der Atg5-Knockdown beeinträchtigte weder den Allgemeinzustand des Tieres noch verursachte es makroskopisch oder mikroskopisch nachweisbare Organschäden. Im Gegenteil dazu hatte der Atg7- Knockdown die Zerstörung des Pankreas und schließlich den Tod des Tieres zur Folge. Es bleibt unklar, ob die Tiere infolge eines exokrinen oder endokrinen Kollapses oder aufgrund einer Kombination aus beidem starben. Dennoch ermöglichen die vorgestellten Mausmodelle eine systemweite Regulation von Autophagie. Daher stellen sie eine wertvolle und vielseitige Methode für die zukünftige Autophagie- und Krebs-Forschung dar. Ein Argininosuccinate Synthase 1 (ASS1)-Mangel in PDAC-Patienten wird mit einem höheren Rezidiv, einem kürzeren krankheitsfreien Überleben und einem kürzeren Gesamtüberleben in Verbin-dung gebracht. Im Laufe der Entwicklung eines Tumors kommt es häufig zum Verlust essentieller Enzyme, wie ASS1 oder OTC, innerhalb der Arginine de novo Synthese. Bekannt als ‘Arginin-Auxotrophie‘, hat dies die Abhängig von extrazellulärem Arginine zur Folge. Basierend auf dieser Annahme, wurde die Sensibilität verschiedener Tumorzelllinien auf Argininentzug nachgewiesen. Jedoch ist der zugrunde liegende Mechanismus noch unklar und die Wirksamkeit nicht ausreichend, um alle Tumorzellen zu zerstören. Aus diesem Grund wurde der Effekt von Argininentzug mittels rhArgI-PEG5000-Behandlung auf murine und humane PDAC-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Argininentzug Akkumulation von Autophagosomen, die Induktion von Seneszenz und die ISR zur Folge hatte. Diese Veränderungen stellen potentielle genetische Schwachstellen dar, die in Kombination mit anderen Medikamenten behandelt werden könnten, um Tumorzelltod zu induzieren. KW - Arginine KW - Autophagy KW - tumor metabolism KW - targeted therapy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211480 ER - TY - THES A1 - Scholl, Christina T1 - Cellular and molecular mechanisms contributing to behavioral transitions and learning in the honeybee T1 - Zelluläre und molekulare Mechanismen, die zu Verhaltensänderungen und Lernen in der Honigbiene beitragen N2 - The honeybee Apis mellifera is a social insect well known for its complex behavior and the ability to learn tasks associated with central place foraging, such as visual navigation or to learn and remember odor-reward associations. Although its brain is smaller than 1mm² with only 8.2 x 105 neurons compared to ~ 20 x 109 in humans, bees still show amazing social, cognitive and learning skills. They express an age – related division of labor with nurse bees staying inside the hive and performing tasks like caring for the brood or cleaning, and foragers who collect food and water outside the hive. This challenges foragers with new responsibilities like sophisticated navigation skills to find and remember food sources, drastic changes in the sensory environment and to communicate new information to other bees. Associated with this plasticity of the behavior, the brain and especially the mushroom bodies (MBs) - sensory integration and association centers involved in learning and memory formation – undergo massive structural and functional neuronal alterations. Related to this background my thesis on one hand focuses on neuronal plasticity and underlying molecular mechanisms in the MBs that accompany the nurse – forager transition. In the first part I investigated an endogenous and an internal factor that may contribute to the nurse - forager phenotype plasticity and the correlating changes in neuronal network in the MBs: sensory exposure (light) and juvenile hormone (JH). Young bees were precociously exposed to light and subsequently synaptic complexes (microglomeruli, MG) in the MBs or respectively hemolymph juvenile hormone (JH) levels were quantified. The results show that light input indeed triggered a significant decrease in MG density, and mass spectrometry JH detection revealed an increase in JH titer. Interestingly light stimulation in young bees (presumably nurse bees) triggered changes in MG density and JH levels comparable to natural foragers. This indicates that both sensory stimuli as well as the endocrine system may play a part in preparing bees for the behavioral transition to foraging. Considering a connection between the JH levels and synaptic remodeling I used gene knockdown to disturb JH pathways and artificially increase the JH level. Even though the knockdown was successful, the results show that MG densities remained unchanged, showing no direct effect of JH on synaptic restructuring. To find a potential mediator of structural synaptic plasticity I focused on the calcium-calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in the second part of my thesis. CaMKII is a protein known to be involved in neuronal and behavioral plasticity and also plays an important part in structural plasticity reorganizing synapses. Therefore it is an interesting candidate for molecular mechanisms underlying MG reorganization in the MBs in the honeybee. Corresponding to the high abundance of CaMKII in the learning center in vertebrates (hippocampus), CaMKII was shown to be enriched in the MBs of the honeybee. Here I first investigated the function of CaMKII in learning and memory formation as from vertebrate work CaMKII is known to be associated with the strengthening of synaptic connections inducing long term potentiation and memory formation. The experimental approach included manipulating CaMKII function using 2 different inhibitors and a specific siRNA to create a CaMKII knockdown phenotype. Afterwards bees were subjected to classical olfactory conditioning which is known to induce stable long-term memory. All bees showed normal learning curves and an intact memory acquisition, short-term and mid-term memory (1 hour retention). However, in all cases long-term memory formation was significantly disrupted (24 and 72 hour retention). These results suggests the necessity of functional CaMKII in the MBs for the induction of both early and late phases of long-term memory in honeybees. The neuronal and molecular bases underlying long-term memory and the resulting plasticity in behavior is key to understanding higher brain function and phenotype plasticity. In this context CaMKII may be an important mediator inducing structural synaptic and neuronal changes in the MB synaptic network. N2 - Die Honigbiene Apis mellifera ist ein soziales Insekt, das bekannt ist für sein komplexes Verhalten und seine Fähigkeiten, Aufgaben in Bezug auf zentrales Sammelverhalten, zum Beispiel visuelle Navigation oder die Assoziation Duft – Belohnung, zu lernen, ist. Obwohl das Bienengehirn kleiner als 1mm² ist und im Vergleich zum dem des Menschen mit ~ 20 x 109 Neuronen nur 8.2 x 105 Neurone besitzt, verfügen Bienen trotzdem über beeindruckende soziale, kognitive und Lernfähigkeiten. Sie praktizieren eine altersabhängige Arbeitsteilung mit Ammen, die im Stock bleiben und Aufgaben wie das Versorgen der Brut übernehmen, und Sammlerinnen, die außerhalb des Stockes Futter und Wasser suchen. Dies fordert die Sammlerinnen zu neuen Aufgaben heraus, zum Beispiel hochentwickelte Navigation, drastischen Änderungen der sensorischen Umwelt, Lernen neuer Assoziationen und die Vermittlung der neuen Informationen an andere Bienen. Diese phänotypische Plastizität geht mit stark strukturellen und funktionell neuronalen Veränderungen im Gehirn und vor allem in den Pilzkörpern – sensorische Integrierungszentren, die an Lernen und Gedächtnisbildung beteiligt sind – einher. Passend dazu liegt ein Schwerpunkt meiner Arbeit darauf, die neuronale Plastizität und die molekularen Mechanismen im Pilzkörper, die mit der Wandlung der Amme hin zur Sammlerin zusammen hängen, zu untersuchen. Im ersten Teil werden ein endogener und ein interner Faktor, die zum Ammen - Sammlerinnen Übergang und den damit einhergehenden Änderungen im neuronalen Netzwerk beitragen könnten, untersucht: sensorische Input (Licht) und Juvenilhormon (JH). Junge Bienen wurden frühzeitig dem Licht ausgesetzt und anschließend synaptische Komplexe (Mikroglomeruli, MG) in den Pilzkörpern beziehungsweise JH aus der Hämolymphe quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Einfluss des Lichts tatsächlich eine plastische Verringerung der MG-Dichte auslöst und massenspektrometrische Messungen eine Zunahme an der JH-Menge in der Hämolymphe zeigen. Interessanterweise führt die Stimulation der jungen Ammen mit Licht zu Änderungen in der MG-Dichte und zu JH-Mengen, die vergleichbar sind mit den Werten bei natürlichen Sammlerinnen sind. Dies weist darauf hin, dass sowohl sensorische Stimuli als auch das Hormonsystem einen Beitrag zu der Vorbereitung der Bienen auf die bevorstehende Verhaltensänderung leisten. Um eine Verbindung zwischen der JH-Menge und synaptischen Umstrukturierungen in Betracht zu ziehen, habe ich einen Gen-Knockdown eingesetzt, um JH-Signalwege zu manipulieren und dadurch die JH-Menge künstlich zu erhöhen. Obwohl der Knockdown erfolgreich war, zeigen die Ergebnisse keinen direkten Zusammenhang zwischen der JH-Menge und einer synaptischer Umgestaltung. Um einen möglichen Vermittler von struktureller Plastizität zu finden, habe ich den Fokus im zweiten Teil meiner Arbeit auf die Calcium-Calmodulin-abhängige Protein-Kinase II (CaMKII) gerichtet. CaMKII ist ein Protein, das für seine Rolle sowohl in neuronaler und Verhaltensplastizität als auch in struktureller Plastizität bekannt ist. Daher ist es ein interessanter Kandidat, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die bei der MG-Umstrukturierung in den Pilzkörpern beteiligt sind. In Übereinstimmung mit dem hohen Vorkommen der CaMKII in Lernzentren in Vertebraten (Hippocampus) kommt CaMKII auch in hohem Maß in den Pilzkörpern der Biene vor. In dieser Arbeit habe ich zuerst die Funktion der CaMKII in Lernvorgängen und bei der Gedächtnisbildung untersucht, da bekannt ist, dass CaMKIII mit verstärkten synaptischen Verbindungen, die Langzeitpotenzierung und Gedächtnisbildung auslösen, in Zusammenhang gebracht wird. Der experimentelle Ansatz beinhaltet die Manipulation der CaMKII mit zwei verschiedenen Inhibitoren und einer spezifische siRNA, um einen CaMKII-Knockdown-Phänotyp zu erzeugen. Alle Substanzen wurden über den medialen Ocellartrakt injiziert, um zu gewährleisten, dass sie den Pilzkörper erreichen. Anschließend wurde eine klassische olfaktorische Konditionierung durchgeführt, die ein stabiles Langzeitgedächtnis induziert. Alle Bienen zeigten ein normales Lernverhalten, Kurzzeitgedächtnis und Mittelzeitgedächtnis (eine Stunde Speicherung) waren intakt. Jedoch war in allen Fällen das Langzeitgedächtnis beschädigt (24 und 72 Stunden Speicherung). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CaMKII in den Pilzkörpern essentiell für das Auslösen von frühen und späten Formen des Langzeitgedächtnisses der Biene ist. Die neuronalen und molekularen Grundlagen des Langzeitgedächtnis sind der Schlüssel, um höhere Gehirnfunktionen und phänotypische Plastizität zu verstehen. CaMKII könnte ein wichtiger Vermittler sein, um strukturelle und neuronale synaptische Änderungen im Netzwerk des Pilzkörpers auszulösen. KW - Biene KW - honeybee KW - learning and memory KW - division of labor KW - Lernen KW - Molekularbiologie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115527 ER - TY - THES A1 - Gotru, Sanjeev Kiran T1 - Cation Homeostasis in Platelets T1 - Kationen-Homöostase in Thrombozyten N2 - Divalent cations are important second messengers triggering various signal transduction events in platelets. Whereas calcium channel blockers have an established antithrombotic effect and the regulation of Ca2+ homeostasis has been elucidated in platelets, the molecular regulation of Mg2+ and Zn2+ homeostasis has not been investigated so far. In the first part of the thesis, the role of -type serine-threonine kinase linked to transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 7 (TRPM7) in platelets was investigated. Using Trpm7R/R mice with a point mutation deleting the kinase activity, we showed that the TRPM7 kinase regulates platelet activation via immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM), hem(ITAM) and protease-activated receptor (PAR) signaling routes. Furthermore, Trpm7R/R mice were protected from in vivo thrombosis and stroke, thus establishing TRPM7 kinase as a promising anti-thrombotic target. In the second part of the thesis, the role of TRPM7 channel in a megakaryocyte (MK) and platelet-specific knockout mouse, Trpm7fl/fl-Pf4Cre, was investigated. Here, we observed that depending on the type of stimulation, Trpm7fl/fl-Pf4Cre platelets showed either enhanced or inhibited responses. Although Trpm7fl/fl-Pf4Cre mice were thrombocytopenic, no differences to wildtype mice were observed in models of in vivo thrombosis and stroke. The above two studies highlight that inhibition of TRPM7 kinase but not the channel itself (in MKs and platelets) may be a promising anti-thrombotic strategy. Besides TRPM7, we investigated the role of magnesium transporter 1 (MAGT1) in platelet Mg2+ homeostasis and found that MAGT1 primarily regulates receptor-operated calcium entry (ROCE) in platelets specifically upon GPVI activation. This physiological crosstalk is triggered by protein kinase C (PKC) isoforms. Platelets from Magt1-/y mice hyper-reacted to GPVI and thromboxane A2 (TXA2) receptor stimulation in vitro. Consequently, Magt1-/y platelets were found to be pro-thrombotic in disease models of thrombosis and stroke. To compare platelet ITAM-signaling to the immune system, we further investigated the role of MAGT1 in T and B cells. We described the primary role of MAGT1 in mice under pathogen-free conditions. Magt1-/y B cells showed dysregulated Mg2+ and Ca2+ homeostasis upon B-cell receptor activation, thereby altering Syk, LAT, phospholipase C (PLC)2 and PKC phosphorylation. In contrast to human MAGT1-deficient T cells, development and effector functions of mouse Magt1-/y T cells showed no alterations. Finally, in the last part of the thesis, we described methods to measure intracellular free zinc [Zn2+]i in human and mouse platelets with storage pool disease (SPD). We propose to measure the [Zn2+]i status in SPD platelets as a relatively easy diagnostic to screen platelet granule abnormalities. N2 - Zweiwertige Kationen sind wichtige sekundäre Botenstoffe, welche verschiedene Signaltransduktionsereignisse in Thrombozyten initiieren. Zwar wurde die Regulation der Ca2+Homöostase in Blutplättchen bereits aufgeklärt und der Einsatz von Calciumkanalblockern zur antithrombotischen Therapie ausführlich diskutiert, die molekulareRegulation der Mg2+und Zn2+Homöostase in Thrombozyten und Megakaryozyten (MK) wurdebisher jedoch nicht untersucht.Im ersten Teil dieser Thesis wurde die Rolle der -Typ Serin-Threonin Kinase des transienten Rezeptortyp Kation Kanals, Unterfamilie M, 7 (TRPM7) in Thrombozyten untersucht. Unter Verwendung von Trpm7R/RMäusen mit einer Punktmutation in der Kinasedomäne, welche die Aktivität der Kinase blockiert, konnten wir zeigen, dass die TRPM7-Kinase die Thrombozytenaktivierung über Immunorezeptor-Tyrosin-basierte Aktivierungsmotive (ITAM), Hem(ITAM) und Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR) reguliert. Trpm7R/RMäuse waren vor in vivoThrombose und Schlaganfall geschützt, was die TRPM7 Kinase als vielversprechendes antithrombotisches Zielprotein etabliert.Im zweiten Teil wurde die Rolle des TRPM7 Kanals in einer Megakaryozyten (MK)-und Plättchen-spezifischen Knockout Maus(Trpm7fl/fl-Pf4Cre) untersucht. Wir konnten zeigen, dass Trpm7fl/fl-Pf4CrePlättchen je nach Art der Stimulation entweder erhöhte oder verminderte Reaktionen zeigten. Obwohl Trpm7fl/fl-Pf4Cre-Mäuse thrombozytopen waren, wurden keine Unterschiede in in vivoThrombosemodellen und Schlaganfall beobachtet. Diese Studien heben hervor, dass die Hemmung der TRPM7 Kinase, aber nicht die des Kanal selbst (inMKs und Plättchen), eine vielversprechende anti-thrombotische Therapie sein könnte. Neben TRPM7 untersuchten wir die Rolle von Magnesium Transporter 1 (MAGT1)in der Mg2+-Homöostase in Thrombozyten und konnten zeigen, dass MAGT1 primär den Rezeptor-gesteuerten Calciuminflux (ROCE) spezifisch nach GPVI Aktivierung reguliert. Dieser physiologische Crosstalk wird durch Proteinkinase C (PKC) Isoformen vermittelt. Thrombozyten von Magt1-/yMäusen reagierten in vitrohyperreaktiv auf GPVI und ThromboxanA2(TXA2) Rezeptor Stimulation. Dementsprechend konnte auch gezeigt werden, dass Magt1-/yPlättchen in Modellen von Thrombose und Schlaganfall pro-thrombotisch wirkten.Um die ITAM-Signalübertragung in Thrombozyten mit der in T und B Zellen zu vergleichen, untersuchten wir die Rolle von MAGT1 in Immunzellen. Wir überprüften die Rolle von MAGT1 in Mäusen unter pathogen-freien Bedingungen. Magt1-/yB Zellen zeigten eine dysregulierte Mg2+und Ca2+Homöostase nach Aktivierung des B Zell Rezeptors, wodurch Syk, LAT, PLCγ2 und PKC Phosphorylierung beeinflusst wurde. Im Gegensatz zu menschlichen MAGT1-defizienten T Zellen, zeigten Magt1-/yT Zellen keine Veränderungen in Entwicklung und Effektorfunktion. Schließlich beschrieben wir im letzten Teil der Arbeit Methoden zur Messung des intrazellulären freien Zinks [Zn2+]iin humanen und murinen Thrombozyten mit Storage-Pool-Defekt (SPD). Wir unterbreiten in dieser Thesis, den [Zn2+]iStatus in SPD Thrombozyten zu messenum nachAnomalien in den Thrombozyten-Granula zu suchen. KW - Thrombozyt KW - Kationen-Homöostase KW - Homöostase KW - Cation Homeostasis KW - Platelets Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176616 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Stefanie T1 - Cartilage Tissue Engineering – Comparison of Articular Cartilage Progenitor Cells and Mesenchymal Stromal Cells in Agarose and Hyaluronic Acid-Based Hydrogels T1 - Tissue Engineering von Knorpel – Vergleich von Gelenkknorpel-Vorläuferzellen und mesenchymalen Stromazellen in Agarose- und Hyaluronsäure-basierten Hydrogelen N2 - Articular cartilage damage caused by sports accidents, trauma or gradual wear and tear can lead to degeneration and the development of osteoarthritis because cartilage tissue has only limited capacity for intrinsic healing. Osteoarthritis causes reduction of mobility and chronic pain and is one of the leading causes of disability in the elderly population. Current clinical treatment options can reduce pain and restore mobility for some time, but the formed repair tissue has mostly inferior functionality compared to healthy articular cartilage and does not last long-term. Articular cartilage tissue engineering is a promising approach for the improvement of the quality of cartilage repair tissue and regeneration. In this thesis, a promising new cell type for articular cartilage tissue engineering, the so-called articular cartilage progenitor cell (ACPC), was investigated for the first time in the two different hydrogels agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) in comparison to mesenchymal stromal cells (MSCs). In agarose, ACPCs´ and MSCs´ chondrogenic capacity was investigated under normoxic (21 % oxygen) and hypoxic (2 % oxygen) conditions in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer. In the newly developed hyaluronic acid (HA)-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G), chondrogenesis of ACPCs and MSCs was also evaluated in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs like in agarose hydrogel. Additionally, the contribution of the bioactive molecule hyaluronic acid to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated in 2D monolayer, 3D pellet and HA-SH hydrogel culture. It was shown that both ACPCs and MSCs could chondrogenically differentiate in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels. In agarose hydrogel, ACPCs produced a more articular cartilage-like tissue than MSCs that contained more glycosaminoglycan (GAG), less type I collagen and only little alkaline phosphatase (ALP) activity. Hypoxic conditions did not increase extracellular matrix (ECM) production of ACPCs and MSCs significantly but improved the quality of the neo-cartilage tissue produced by MSCs. The creation of zonal agarose constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer led to an ECM production in zonal hydrogels that lay in general in between the ECM production of non-zonal ACPC and MSC hydrogels. Even though zonal co-culture of ACPCs and MSCs did not increase ECM production, the two cell types influenced each other and, for example, modulated the staining intensities of type II and type I collagen in comparison to non-zonal constructs under normoxic and hypoxic conditions. In HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogel, MSCs produced more ECM than ACPCs, but the ECM was limited to the pericellular region for both cell types. Zonal HASH/P(AGE-co-G) hydrogels resulted in a native-like zonal distribution of ECM as MSCs in the lower zone produced more ECM than ACPCs in the upper zone. It appeared that chondrogenesis of ACPCs was supported by hydrogels without biological attachment sites such as agarose, and that chondrogenesis of MSCs benefited from hydrogels with biological cues like HA. As HA is an attractive material for cartilage tissue engineering, and the HA-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) appeared to be beneficial for MSC chondrogenic differentiation, the contribution of HA to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated. An upregulation of chondrogenic gene expression was found in 2D monolayer and 3D pellet culture of MSCs in response to HA supplementation, while gene expression of osteogenic and adipogenic transcription factors was not upregulated. MSCs, encapsulated in a HA-based hydrogel, showed upregulation of gene expression for chondrogenic, osteogenic and adipogenic differentiation markers as well as for stemness markers. In a 3D bioprinting process, using the HA-based hydrogel, gene expression levels of MSCs mostly did not change. Nevertheless, expression of three tested genes (COL2A1, SOX2, CD168) was downregulated in printed in comparison to cast constructs, underscoring the importance of closely monitoring cellular behaviour during and after the printing process. In summary, it was confirmed that ACPCs are a promising cell source for articular cartilage engineering with advantages over MSCs when they were cultured in a suitable hydrogel like agarose. The performance of the cells was strongly dependent on the hydrogel environment they were cultured in. The different chondrogenic performance of ACPCs and MSCs in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels highlighted the importance of choosing suitable hydrogels for the different cell types used in articular cartilage tissue engineering. Hydrogels with high polymer content, such as the investigated HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels, can limit ECM distribution to the pericellular area and should be developed further towards less polymer content, leading to more homogenous ECM distribution of the cultured cells. The influence of HA on chondrogenic gene expression and on the balance between differentiation and maintenance of stemness in MSCs was demonstrated. More studies should be performed in the future to further elucidate the signalling functions of HA and the effects of 3D bioprinting in HA-based hydrogels. Taken together, the results of this thesis expand the knowledge in the area of articular cartilage engineering with regard to the rational combination of cell types and hydrogel materials and open up new possible approaches to the regeneration of articular cartilage tissue. N2 - Gelenkknorpeldefekte, die durch Sportverletzungen, Unfälle oder graduelle Abnutzung ent-stehen, können zu Degeneration des Gewebes und zur Entstehung von Arthrose führen, da Knorpelgewebe nur über eine eingeschränkte Fähigkeit zur Selbstheilung verfügt. Arthrose reduziert die Beweglichkeit und verursacht chronische Schmerzen. Sie ist vor allem bei älte-ren Menschen einer der häufigsten Gründe für körperliche Behinderung. Die zurzeit verfüg-baren operativen Behandlungsmöglichkeiten können die Symptome meist für einige Zeit lindern, aber das dabei gebildete Ersatzgewebe zeigt meistens nur eingeschränkte Funktiona-lität im Vergleich zu natürlichem gesunden Knorpelgewebe und bleibt nur für eine begrenzte Zeit stabil. Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Qualität des Ersatzgewebes und der Knorpelregeneration zu verbessern. Diese Arbeit untersuchte einen neuen vielversprechenden Zelltyp für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe, sogenannte Gelenkknorpel-Vorläuferzellen (ACPCs). Diese Zellen wurden erstmals in zwei verschiedenen Hydrogelen, Agarose und HA-SH/P(AGE-co-G), mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) verglichen. Die chondrogene Kapazität von ACPCs und MSCs in Agarose wurde unter normoxischen (21 % Sauerstoff) und hypoxischen (2 % Sauerstoff) Bedingungen in Monokultur und zonal geschichteter Kokultur untersucht. In den zonalen Kokulturen befanden sich ACPCs in einer oberen Schicht und MSCs in einer unte-ren Schicht. In dem neu entwickelten Hyaluronsäure (HA)-basierten Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) wurde die chondrogene Differenzierung von ACPCs und MSCs ebenfalls in Monokultur und in zonal geschichteter Kokultur, wie im Agarose-Hydrogel, analysiert. Außerdem wurde der Beitrag des biologisch aktiven Moleküls Hyaluronsäure zur chondro-genen Genexpression von MSCs in 2D-, 3D-Pellet- und HA-SH-Hydrogel-Kulturen unter-sucht. Diese Arbeit zeigte, dass sowohl ACPCs als auch MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen chondrogen differenzieren konnten. ACPCs produzierten im Agarose-Hydrogel ein Gewebe, das dem Gelenkknorpel ähnlicher war als das von MSCs produzierte Gewebe, da es mehr Glykosaminoglykane (GAG), weniger Typ I Kollagen und nur geringe Aktivität der Alkalinen Phosphatase (ALP) aufwies. Hypoxische Bedingungen konnten die Produktion von extrazellulärer Matrix (ECM) durch ACPCs und MSCs nicht erhöhen, aber sie verbesserten die Qualität des von MSCs produzierten Gewebes. Die Herstellung von zon-alen Agarose-Konstrukten mit ACPCs in der oberen Schicht und MSCs in der unteren Schicht führte zu einer ECM-Produktion in zonalen Hydrogelen, die im Allgemeinen zwi-schen der ECM-Produktion der ACPC-Monokultur und der MSC-Monokultur lag. Zonale Kokultur von ACPCs und MSCs führte zwar nicht zu einer erhöhten ECM-Produktion, al-lerdings beeinflussten die beiden Zelltypen sich gegenseitig und modulierten zum Beispiel die Intensitäten der Typ II und Typ I Kollagen Färbungen im Vergleich zu Monokulturen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Im HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel produzierten die MSCs mehr ECM als die ACPCs, allerdings war die Verteilung der gebilde-ten ECM bei beiden Zelltypen auf den perizellulären Bereich beschränkt. Zonale HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogele führten zu einer zonalen Verteilung von ECM, die der natürli-chen Struktur von Gelenkknorpel ähnlich war, da die MSCs in der unteren Schicht mehr ECM produzierten als die ACPCs in der oberen Schicht. Anscheinend wurde die chondroge-ne Differenzierung von ACPCs von Hydrogelen unterstützt, die, so wie Agarose, keine bio-logischen Bindestellen aufwiesen, und die Chondrogenese von MSCs profitierte von Hydro-gelen mit biologischen Signalen wie HA. Da HA ein attraktives Material für Tissue Engineering von Knorpel darstellt und das HA-basierte Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) anscheinend die chondrogene Differenzierung von MSCs begünstigte, wurde der Beitrag von HA zur chondrogenen Genexpression in MSCs untersucht. Eine Hochregulation der chondrogenen Genexpression ließ sich in 2D- und 3D-Pellet-Kulturen von MSCs als Reaktion auf HA beobachten, während die Genexpression von osteogenen oder adipogenen Transkriptionsfaktoren nicht hochreguliert wurde. Der Ein-schluss von MSCs in einem HA-basierten Hydrogel führte zu einer Erhöhung der Genex-pression von chondrogenen, osteogenen, adipogenen und Stemness-Markern. Ein 3D-Druck-Prozess mit dem HA-basierten Hydrogel veränderte die Genexpression von MSCs in den meisten Fällen nicht. Dennoch wurde die Expression von drei getesteten Genen (COL2A1, SOX2, CD168) in gedruckten im Vergleich zu gegossenen Konstrukten herunterreguliert. Dies unterstrich die Wichtigkeit einer genauen Kontrolle des Verhaltens der Zellen während und nach dem Druck-Prozess. Zusammenfassend ließen sich ACPCs als vielversprechender neuer Zelltyp für das Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe bestätigen. ACPCs haben Vorteile gegenüber MSCs, vor allem, wenn sie in einem passenden Hydrogel wie Agarose kultiviert werden. Die Leis-tung der Zellen war stark von den verschiedenen Hydrogelen und der Umgebung beeinflusst, die diese den Zellen darboten. Die unterschiedliche chondrogene Leistung von ACPCs und MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen zeigte deutlich die übergeordnete Relevanz der Auswahl von passenden Hydrogelen für die verschiedenen Zelltypen, die im Tissue Engineering von Gelenkknorpel Verwendung finden. Hydrogele mit einem hohen Polymergehalt, wie das eingesetzte HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel, können die Verteilung der gebildeten ECM auf den perizellulären Bereich beschränken und sollten weiterentwickelt werden, um einen niedrigeren Polymergehalt und damit eine homogenere ECM-Verteilung durch die kultivierten Zellen zu erreichen. Der Einfluss von HA auf die chondrogene Gen-expression und auf die Balance zwischen Differenzierung und Erhaltung der Stemness in MSCs ließ sich aufzeigen. In Zukunft sollten weitere Studien die Signalfunktionen von HA und den Einfluss des 3D-Drucks in HA-basierten Hydrogelen genauer zu untersuchen. Zusammengenommen erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit das Wissen im Bereich des Tissue Engineerings von Gelenkknorpelgewebe, vor allem in Bezug auf eine rationale Kom-bination von Zelltypen und Hydrogel-Materialien, und eröffnen neue Ansätze zur Knorpel-regeneration. KW - Hyaliner Knorpel KW - Tissue Engineering KW - Hydrogel KW - Hypoxie KW - Mesenchymzelle KW - articular cartilage progenitor cells KW - Cartilage KW - Mesenchymal stem cell KW - Hyaluronsäure KW - Agarose KW - zonal Hydrogels KW - Bioprinting KW - Cartilage Tissue Engineering KW - Oxygen partial pressure KW - chondrogene Differenzierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251719 ER - TY - THES A1 - Hapke, Nils T1 - Cardiac antigen derived T cell epitopes in the frame of myocardial infarction T1 - T-Zell-Epitope von kardialen Antigenen im Kontext des Myokardinfarktes N2 - Cardiovascular disease and the acute consequence of myocardial infarc- tion remain one of the most important causes of morbidity and mortality in all western societies. While much progress has been made in mitigating the acute, life-threatening ischemia caused by infarction, heart failure of the damaged my- ocardium remains prevalent. There is mounting evidence for the role of T cells in the healing process after myocardial infarction, but relevant autoantigens, which might trigger and regulate adaptive immune involvement have not been discov- ered in patients. In this work, we discovered an autoantigenic epitope in the adrenergic receptor beta 1, which is highly expressed in the heart. This autoantigenic epitope causes a pro-inflammatory immune reaction in T cells isolated from pa- tients after myocardial infarction (MI) but not in control patients. This immune reaction was only observed in a subset of MI patients, which carry at least one allele of the HLA-DRB1*13 family. Interestingly, HLA-DRB1*13 was more com- monly expressed in patients in the MI group than in the control group. Taken together, our data suggests antigen-specific priming of T cells in MI patients, which leads to a pro-inflammatory phenotype. The primed T cells react to a cardiac derived autoantigen ex vivo and are likely to exhibit a similar phenotype in vivo. This immune phenotype was only observed in a certain sub- set of patients sharing a common HLA-allele, which was more commonly ex- pressed in MI patients, suggesting a possible role as a risk factor for cardiovas- cular disease. While our results are observational and do not have enough power to show strong clinical associations, our discoveries provide an essential tool to further our understanding of involvement of the immune system in cardiovascu- lar disease. We describe the first cardiac autoantigen in the clinical context of MI and provide an important basis for further translational and clinical research in cardiac autoimmunity. N2 - Die koronare Herzerkrankung und die akute Konsequenz des Myokardin- farktes (MI) sind eine der häufigsten Ursachen von Morbidität und Mortalität in unserer westlichen Gesellschaft. Obwohl es große Fortschritte in der Behand- lung von akut lebensbedrohlichen ischämischen Ereignissen gab, bleibt die re- sultierende Herzinsuffizienz nach Infarkt ein häufiges klinisches Problem. Immer mehr Evidenz weist auf eine wichtige Rolle von T-Zellen im Heilungsprozess nach MI hin, aber relevante Autoantigene, die adaptive Immunantworten auslö- sen und regulieren könnten, wurden in Patienten mit MI noch nicht entdeckt. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Epitop des Adrenergen Rezeptors Beta 1, der im Herz hoch exprimiert ist und als Autoantigen fungiert. Dieses Au- toantigen verursacht eine pro-inflammatorische Immunreaktion in T-Zellen, die von MI-Patienten isoliert wurden, aber nicht in Kontrollpatienten. Diese Immun- reaktion beobchten wir jedoch nur in einem Teil der Patienten, der ein Allel der Familie HLA-DRB1*13 trägt. Interessanterweise sind MI-Patienten häufiger Trä- ger eines solchen Allels als Kontroll-Patienten. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass T-Zellen in MI- Patienten antigen-spezifisch aktiviert werden und einen pro-inflammatorischen Phänotyp ausbilden. Die aktivierten T-Zellen reagieren ex vivo auf ein kardiales Autoantigen und entwickeln vermutlich in vivo einen ähnlichen Phänotyp. Dieser ist abhängig von einem HLA-Allel, welches in Infarkt-Patienten häufiger war als in der Kontrollgruppe, was eine mögliche Rolle als Risikofaktor für kardiovasku- läre Erkrankungen suggeriert. Unsere Ergebnisse stellen eine wichtige Grundlage dar, um unser Ver- ständnis des Immunsystems in kardiovaskulären Erkrankungen zu vertiefen. Wir beschreiben in dieser Arbeit das erste kardiale Autoantigen, das im klinischen Kontext des Myokardinfarktes entdeckt wurde und bieten somit eine wichtige Grundlage für weitere translationale und klinische Forschung in der Immunkar- diologie. KW - Immunologie KW - Kardiologie KW - Immunkardiologie KW - Immunocardiology Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-301963 ER - TY - THES A1 - Janßen, Jan Paul T1 - Capabilities of a multi-pinhole SPECT system with two stationary detectors for in vivo imaging in rodents T1 - Leistungsfähigkeit eines Multi-Pinhole SPECT-Systems mit zwei stationären Detektoren zur In-vivo-Bildgebung in Nagetiermodellen N2 - Molecular imaging of rats is of great importance for basic and translational research. As a powerful tool in nuclear medicine, SPECT can be used to visualize specific functional processes in the body, such as myocardial perfusion or bone metabolism. Typical applications in laboratory animals are imaging diagnostics or the development of new tracers for clinical use. Innovations have enabled resolutions of up to a quarter of a millimeter with acceptable sensitivity. These advances have recently led to significantly more interest in SPECT both clinically and preclinically. The objective of this thesis was to evaluate the performance of the new U-SPECT5/CT E-Class by MILabs with a dedicated ultra-high resolution multi-pinhole collimator for rats and its potential for in vivo imaging of rats. The unique features of the U-SPECT are the large stationary detectors and the new iterative reconstruction algorithm. In addition, compared to the conventional system, the "E-Class" uses only two detectors instead of three. First, the sensitivity, maximum resolution, and uniformity were determined as performance parameters. Thereafter, CNRs for different activity levels comparable to those of typical in vivo activities were examined. Finally, two example protocols were carried out for imaging with 99mTc-MIBI and 99mTc-HMDP in healthy rats to evaluate the in vivo capabilities. For this purpose, CNR calculations and an image quality assessment were performed. The focus was on image quality as a function of scan time and post-reconstruction filter across a wide range of realistically achievable in vivo conditions. Performance was reasonable compared to other systems in the literature, with a sensitivity of 567 cps/MBq, a maximum resolution of 1.20 mm, and a uniformity of 55.5%. At the lower activities, resolution in phantom studies decreased to ≥1.80 mm while maintaining good image quality. High-quality bone and myocardial perfusion SPECTs were obtained in rats with a resolution of ≥1.80 mm and ≥2.20 mm, respectively. Although limited sensitivity remains a weakness of SPECT, the U-SPECT5/CT E-Class with the UHR-RM collimator can achieve in vivo results of the highest standard despite the missing third detector. Currently, it is one of the best options for high-resolution radionuclide imaging in rats. N2 - Die molekulare Bildgebung bei Ratten hat einen hohen Stellenwert in der Grundlagenforschung und der translationale Forschung. Dabei ist SPECT ein leistungsfähiges Instrument zur Visualisierung spezifischer funktioneller Prozesse im Körper, wie z. B. der Herzmuskeldurchblutung oder des Knochenstoffwechsels. Typische Anwendungsbereiche an Labortieren sind die bildgebende Diagnostik im Rahmen von Studien oder die Entwicklung neuer Tracer für den klinischen Einsatz. Durch Innovationen wurden Auflösungen von bis zu einem Viertelmillimeter bei akzeptabler Empfindlichkeit erreichbar. Diese Fortschritte haben in letzter Zeit zu einem deutlich gestiegenen Interesse an SPECT sowohl im klinischen als auch im präklinischen Bereich geführt. Ziel dieser Arbeit war es, die Leistung des neuen U-SPECT5/CT E-Class von MILabs mit einem speziellen ultra-hochauflösenden Multi-Pinhole-Kollimator für Ratten und das Potenzial für die In-vivo-Bildgebung bei Ratten zu untersuchen. Dabei sind die Besonderheiten des U-SPECTs die großen stationären Detektoren und der neue iterative Rekonstruktionsalgorithmus. Außerdem verfügt die von uns verwendete „E-Klasse“ im Vergleich zum konventionellen System nur über zwei statt drei Detektoren. Zunächst wurden die Sensitivität, die maximale Ortsauflösung und die Homogenität als Leistungsparameter bestimmt. Anschließend wurde das Kontrast-Rausch-Verhältnis für verschiedene Aktivitätsniveaus, die mit denen typischer In-vivo-Studien vergleichbar sind, untersucht. Schließlich wurden zwei Beispielprotokolle für die Bildgebung mit 99mTc-MIBI und 99mTc-HMDP bei gesunden Ratten durchgeführt, um die In-vivo-Kapazitäten zu erfassen. Zur Bewertung wurden eine Kontrast-Rausch-Analyse und eine Bildqualitätsumfrage genutzt. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Bildqualität in Abhängigkeit von der Scanzeit sowie dem Postrekonstruktionsfilters für ein breites Spektrum realistisch erreichbarer In-vivo-Bedingungen. Die Leistung war mit einer Sensitivität von 567 cps/MBq, einer maximalen Ortsauflösung von 1,20 mm und einer Homogenität von 55,5% mit anderen in der Literatur beschriebenen Systemen vergleichbar. Bei niedrigeren Aktivitäten verringerte sich die Auflösung in Phantomstudien auf ≥1,80 mm bei gleichbleibend guter Bildqualität. Es wurden hochqualitative Knochen- und Myokardperfusions-SPECTs mit einer Auflösung von ≥1,80 mm bzw. ≥2,20 mm bei Ratten erzielt. Obwohl die begrenzte Empfindlichkeit nach wie vor eine Schwäche der SPECT ist, kann das U-SPECT5/CT E-Class mit dem UHR-RM-Kollimator, trotz des fehlenden dritten Detektors, In-vivo-Ergebnisse auf höchstem Niveau erzielen. Es ist derzeit eine der besten Optionen für die hochauflösende Radionuklid-Bildgebung bei Ratten. KW - SPECT KW - Molekulare Bildgebung KW - Rodents KW - Image Quality KW - SPECT/CT Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328608 ER - TY - THES A1 - Ku, Hsing-Ping T1 - Cadherin-13 Deficiency Impacts Murine Serotonergic Circuitries and Cognitive Functions T1 - Cadherin-13 Defizienz beeinflusst serotonerge Netzwerke und kognitive Funktionen der Maus N2 - Cadherin-13 (CDH13) is a member of the cadherin superfamily that lacks the typical transmembrane domain for classical cadherins and is instead attached to the cell membrane with a GPI-anchor. Over the years, numerous genome-wide association (GWA) studies have identified CDH13 as a risk factor for neurodevelopmental disorders, including attention- deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and autism spectrum disorder. Further evidence using cultured cells and animal models has shown that CDH13 plays important roles in cell migration, neurite outgrowth and synaptic function of the central nervous system. Research in our laboratory demonstrated that the CDH13 deficiency resulted in increased cell density of serotonergic neurons of the dorsal raphe (DR) in developing and mature mouse brains as well as serotonergic hyperinnervation in the developing prefrontal cortex, one of the target areas of DR serotonergic neurons. In this study, the role of CDH13 was further explored using constitutive and serotonergic system-specific CDH13-deficient mouse models. Within the adult DR structure, the increased density of DR serotonergic neurons was found to be topographically restricted to the ventral and lateral-wing, but not dorsal, clusters of DR. Furthermore, serotonergic hyperinnervation was observed in the target region of DR serotonergic projection neurons in the lateral wings. Unexpectedly, these alterations were not observed in postnatal day 14 brains of CDH13-deficient mice. Additionally, behavioral assessments revealed cognitive deficits in terms of compromised learning and memory ability as well as impulsive-like behaviors in CDH13-deficient mice, indicating that the absence of CDH13 in the serotonergic system alone was sufficient to impact cognitive functions and behavioral competency. Lastly, in order to examine the organization of serotonergic circuitries systematically and to tackle limitations of conventional immunofluorescence, a pipeline of the whole-mount immunostaining in combination with the iDISCO+ based rapid tissue clearing techniques was established. This will facilitate future research of brain neurotransmitter systems at circuitry and/or whole-brain levels and provide an excellent alternative for visualizing detailed and comprehensive information about a biological system in its original space. In summary, this study provided new evidence of CDH13’s contribution to proper brain development and cognitive function in mice, thereby offering insights into further advancement of therapeutic approaches for neurodevelopmental disorders. N2 - Cadherin-13 (CDH13) ist ein Mitglied der Cadherin-Superfamilie, dem die für klassische Cadherine typische Transmembran-Domäne fehlt und das stattdessen mit einem GPI-Anker an der Zellmembran befestigt ist. Im Laufe der Jahre wurde CDH13 in mehreren genom-weiten Assoziationsstudien (GWAS) als Risikofaktor für neurologische Entwicklungsstörungen, einschließlich Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und Autismus- Spektrum-Störung, identifiziert. Weitere Nachweise in Zellkulturen und Tiermodellen zeigten, dass CDH13 eine wichtige Rolle bei der Zellmigration, dem Wachstum von Neuriten und der synaptischen Funktion des zentralen Nervensystems spielt. Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass CDH13-Defizienz zu einer erhöhten Zelldichte serotonerger Neuronen der dorsalen Raphe (DR) in sich entwickelnden und reifen Mäusegehirnen sowie zu einer serotonergen Hyperinnervation im sich entwickelnden präfrontalen Kortex, einem der Zielgebiete der serotonergen Neuronen der DR, führt. In dieser Studie wurde die Rolle von CDH13 weiter untersucht, indem konstitutive und für das serotonerge System spezifische CDH13-defiziente Mausmodelle verwendet wurden. Innerhalb der adulten DR-Struktur zeigte sich, dass die erhöhte Dichte serotonerger DR-Neurone topographisch auf die ventralen und lateralen, nicht aber dorsalen Cluster der DR beschränkt ist. Außerdem wurde eine serotonerge Hyperinnervation in der Zielregion der serotonergen Projektionsneuronen der DR in den Seitenflügeln beobachtet. Unerwarteterweise wurden diese Veränderungen nicht in den Gehirnen von CDH13-defizienten Mäusen nach dem 14. postnatalem Tag. Darüber hinaus zeigten Verhaltensuntersuchungen bei CDH13-defizienten Mäusen kognitive Defizite in Form von beeinträchtigter Lern- und Gedächtnisfähigkeit sowie impulsivem Verhalten, was darauf hindeutet, dass das Fehlen von CDH13 im serotonergen System allein ausreicht, um kognitive Funktionen und V erhaltenskompetenz zu beeinträchtigen. Um die Organisation der serotonergen Netzwerke systematisch zu untersuchen und die Grenzen der konventionellen Immunfluoreszenz zu überwinden, wurde eine Pipeline für die Ganzkörper-Immunfärbung in Kombination mit der auf iDISCO+ basierenden raschen und effizienten Gewebereinigungstechnik eingerichtet. Dies wird die künftige Erforschung der Neurotransmitter-Systeme des Gehirns auf Netzwerk- und/oder Ganzhirnebene erleichtern und eine hervorragende Alternative für die Visualisierung detaillierter und umfassender Informationen über ein biologisches System in seinem ursprünglichen Raum bieten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie neue Hinweise für den Beitrag von CDH13 zur korrekten Entwicklung des Gehirns und der kognitiven Funktionen bei Mäusen lieferte und damit Einblicke in die weitere Entwicklung von therapeutischen Ansätzen für Entwicklungsstörungen des Nervensystems bietet. KW - CDH13 KW - neurodevelopmental disorders KW - serotonergic system Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251446 ER - TY - THES A1 - Halboth, Florian T1 - Building behavior and nest climate control in leaf-cutting ants: How environmental cues affect the building responses of workers of \(Atta\) \(vollenweideri\) T1 - Bauverhalten und Kontrolle des Nestklimas bei Blattschneiderameisen: Wie Umweltreize die Bauaktivität von Arbeiterinnen der Art \(Atta\) \(vollenweideri\) beeinflussen N2 - The present work investigates the influence of environmental stimuli on the building behavior of workers of the leaf-cutting ant Atta vollenweideri. It focuses on cues related to the airflow-driven ventilation of their giant underground nests, i.e., air movements and their direction, carbon dioxide concentrations and humidity levels of the nest air. First, it is shown that workers are able to use airflow and its direction as learned orientation cue by performing learning experiments with individual foragers using a classical conditioning paradigm. This ability is expected to allow workers to also navigate inside the nest tunnels using the prevailing airflow directions for orientation, for example during tasks related to nest construction and climate control. Furthermore, the influence of carbon dioxide on the digging behavior of workers is investigated. While elevated CO2 levels hardly affect the digging rate of the ants, workers prefer to excavate at locations with lower concentrations and avoid higher CO2 levels when given a choice. Under natural conditions, shifting their digging activity to soil layers containing lower carbon dioxide levels might help colonies to excavate new or to broaden existing nest openings, if the CO2 concentration in the underground rises. It is also shown that workers preferably transport excavated soil along tunnels containing high CO2 concentrations, when carbon dioxide levels in the underground are elevated as well. In addition, workers prefer to carry soil pellets along outflow tunnels instead of inflow tunnels, at least for high humidity levels of the air. The material transported along tunnels providing outflow of CO2-rich air might be used by workers for the construction of ventilation turrets on top of the nest mound, which is expected to promote the wind-induced ventilation and the removal of carbon dioxide from the underground. The climatic conditions inside the nest tunnels also influence the structural features of the turrets constructed by workers on top the nest. While airflow and humidity have no effect on turret structure, outflow of CO2-rich air from the nest causes workers to construct turrets with additional openings and increased aperture, potentially enhancing the airflow-driven gas exchanges within the nest. Finally, the effect of airflow and ventilation turrets on the gas exchanges in Atta vollenweideri nests is tested experimentally on a physical model of a small nest consisting of a single chamber and two nest tunnels. The carbon dioxide clearance rate from the underground was measured depending on both the presence of airflow in the nest and the structural features of the built turrets. Carbon dioxide is removed faster from the physical nest model when air moves through the nest, confirming the contribution of wind-induced flow inside the nest tunnels to the ventilation of Atta vollenweideri nests. In addition, turrets placed on top of one of the tunnel openings of the nest further enhance the CO2 clearance rate and the effect is positively correlated with turret aperture. Taken together, climatic variables like airflow, carbon dioxide and humidity levels strongly affect the building responses of Atta vollenweideri leaf-cutting ants. Workers use these environmental stimuli as orientation cue in the nest during tasks related to excavation, soil transport and turret construction. Although the effects of these building responses on the microclimatic conditions inside the nest remain elusive so far, the described behaviors are expected to allow ant colonies to restore and maintain a proper nest climate in the underground. N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss von Umweltreizen auf das Bauverhalten von Blattschneiderameisen der Art Atta vollenweideri. Dabei wird der Fokus auf Luftströmungen und deren Richtung, sowie CO2-Konzentration und Feuchtigkeitsgehalt der Luft gelegt, welche alle im Zusammenhang mit dem wind-induzierten Ventilationssystem der riesigen, unterirdischen Nester stehen. Zunächst wird experimentell mit Hilfe von klassischer Konditionierung gezeigt, dass Arbeiterinnen während des Furagierens lernen können, Luftströmungen sowie deren Richtung zur Orientierung zu nutzen. Diese Fähigkeit sollte Arbeiterinnen auch die Navigation im Nest anhand der auftretenden Strömungsrichtung der Luft, zum Beispiel während Tätigkeiten im Kontext des Nestbaus und der Klimakontrolle, ermöglichen. Weiterhin wird der Einfluss von Kohlenstoffdioxid auf das Grabeverhalten von Arbeiterinnen untersucht. Obwohl CO2 kaum die Grabe-Rate der Ameisen beeinflusst, graben Arbeiterinnen bevorzugt an Orten mit niedrigerer Konzentration und vermeiden höhere Konzentrationen, wenn möglich. Unter natürlichen Bedingungen könnte das Verlagern der Grabeaktivität in Bodenschichten mit niedrigerer CO2-Konzentration Kolonien dabei helfen, neue Nestöffnungen zu graben oder bestehende zu erweitern, wenn die CO2-Konzentration unter der Erde zunimmt. Zusätzlich wird gezeigt, dass Arbeiterinnen ausgegrabene Erde vornehmlich entlang Tunnel transportieren, die eine hohe CO2-Konzentration aufweisen, wenn die CO2-Konzentration im Untergrund ebenfalls erhöht ist. Zudem bevorzugen Arbeiterinnen den Transport von Erdmaterial entlang Ausstrom- anstatt Einstrom-Tunnel, zumindest für hohe Luftfeuchtigkeiten. Material, welches entlang Nesttunnel transportiert wird, aus denen CO2-haltige Luft ausströmt, könnte Arbeiterinnen zum Bau der Ventilationstürme an der Nestoberfläche dienen, was die wind-induzierte Belüftung der Nester verstärken und die Abfuhr von CO2 aus dem Nest fördern sollte. Die klimatischen Bedingungen in den Nesttunneln beeinflussen auch die strukturellen Eigenschaften der Ventilationstürme, die von Arbeiterinnen oberhalb des Nests errichtet werden. Während Luftströmungen und Luftfeuchtigkeit keinen Einfluss auf die Struktur der Türme haben, veranlasst das Ausströmen von CO2-haltiger Luft aus dem Nest Arbeiterinnen dazu, Türme zu bauen, die mehrere Öffnungen und eine vergrößerte Öffnungsfläche besitzen, was den strömungsinduzierten Gasaustausch im Nest begünstigen könnte. Abschließend werden die Auswirkungen von Luftströmungen und Ventilationstürmen auf den Gasaustausch in den Nestern der Blattschneiderameise Atta vollenweideri mit Hilfe eines physikalischen Modells eines kleinen Nests, bestehend aus einer einzelnen Nestkammer und zwei Nesttunneln, untersucht. Die Abfuhr-Rate von CO2 aus dem Untergrund wurde abhängig vom Vorhandensein von Luftströmungen und den strukturellen Eigenschaften der errichteten Ventilationstürme gemessen. CO2 wird schneller aus dem physikalischen Modell entfernt, wenn Luft durch das Nest strömt, was den Beitrag von Luftbewegungen in den Tunneln zur Ventilation der Nester von Atta vollenweideri bestätigt. Ventilationstürme an einer der Nestöffnungen platziert, verstärken zusätzlich die Abfuhr-Rate von CO2 aus dem Nest und dieser Effekt nimmt mit zunehmender Öffnungsfläche der Türme zu. Zusammengefasst beeinflussen Klimavariablen wie Luftströmungen, Kohlenstoffdioxid und Luftfeuchtigkeit stark das Bauverhalten von Blattschneiderameisen der Art Atta vollenweideri. Arbeiterinnen nutzen diese Umweltreize zur Orientierung im Nest während Tätigkeiten, die im Zusammenhang mit Grabeverhalten, dem Transport von Erdmaterial und dem Bau von Ventilationstürmen stehen. Obwohl die Auswirkungen dieser Bauantworten auf die mikroklimatischen Bedingungen im Nest zunächst noch unklar sind, wird angenommen, dass die beschriebenen Verhaltensweisen es Kolonien erlauben, ein geeignetes Nestklima wiederherzustellen und aufrechtzuerhalten. KW - Verhalten KW - Ameisen KW - Nestbau KW - Klima KW - Kohlendioxid KW - building behavior KW - leaf-cutting ants KW - nest climate KW - climate control KW - carbon dioxide KW - airflow KW - Atta vollenweideri Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161701 ER -