TY - JOUR A1 - Senecal, Jean-Luc A1 - Isabelle, Catherine A1 - Fritzler, Marvin J. A1 - Targoff, Ira N. A1 - Goldstein, Rose A1 - Gagne, Michel A1 - Raynauld, Jean-Pierre A1 - Joyal, France A1 - Troyanov, Yves A1 - Dabauvalle, Marie-Christine T1 - An Autoimmune Myositis-Overlap Syndrome Associated With Autoantibodies to Nuclear Pore Complexes Description and Long-Term Follow-up of the Anti-Nup Syndrome JF - Medicine N2 - Autoimmune myositis encompasses various myositis-overlap syndromes, each being identified by the presence of serum marker autoantibodies. We describe a novel myositis-overlap syndrome in 4 patients characterized by the presence of a unique immunologic marker, autoantibodies to nuclear pore complexes. The clinical phenotype was characterized by prominent myositis in association with erosive, anti-CCP, and rheumatoid factor-positive arthritis, trigeminal neuralgia, mild interstitial lung disease, Raynaud phenomenon, and weight loss. The myositis was typically chronic, relapsing, and refractory to corticosteroids alone, but remitted with the addition of a second immuno-modulating drug. There was no clinical or laboratory evidence for liver disease. The prognosis was good with 100% long-term survival (mean follow-up 19.5 yr). By indirect immunofluorescence on HEp-2 cells, sera from all 4 patients displayed a high titer of antinuclear autoantibodies (ANA) with a distinct punctate peripheral (rim) fluorescent pattern of the nuclear envelope characteristic of nuclear pore complexes. Reactivity with nuclear pore complexes was confirmed by immunoelectron microscopy. In a cohort of 100 French Canadian patients with autoimmune myositis, the nuclear pore complex fluorescent ANA pattern was restricted to these 4 patients (4%). It was not observed in sera from 393 adult patients with systemic sclerosis (n = 112), mixed connective tissue disease (n = 35), systemic lupus (n = 94), rheumatoid arthritis (n = 45), or other rheumatic diseases (n = 107), nor was it observed in 62 normal adults. Autoantibodies to nuclear pore complexes were predominantly of IgG isotype. No other IgG autoantibody markers for defined connective tissue diseases or overlap syndromes were present, indicating a selective and highly focused immune response. In 3 patients, anti-nuclear pore complex autoantibody titers varied in parallel with myositis activity, suggesting a pathogenic link to pathophysiology. The nuclear pore complex proteins, that is, nucleoporins (nup), recognized by these sera were heterogeneous and included Nup358/RanBP2 (n = 2 patients), Nup90 (n = 1), Nup62 (n = 1), and gp210 (n = 1). Taken together the data suggest that nup autoantigens themselves drive the anti-nup autoimmune response. Immunogenetically, the 4 patients shared the DQA1*0501 allele associated with an increased risk for autoimmune myositis. In conclusion, we report an apparent novel subset of autoimmune myositis in our population of French Canadian patients with connective tissue diseases. This syndrome is recognized by the presence of a unique immunologic marker, autoantibodies to nuclear pore complexes that react with nups, consistent with an "anti-nupsyndrome.'' KW - idiopathic inflammatory myopathies KW - primary biliary-cirrhosis KW - transfer RNA-synthetases KW - major histocompatibility complex KW - systemic sclerosis KW - French-Canadian patients KW - protein KW - predictive factors KW - envelope KW - antibodies Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114829 SN - 0025-7974 VL - 93 IS - 24 ER - TY - THES A1 - Klein, Teresa T1 - Lokalisationsmikroskopie für die Visualisierung zellulärer Strukturen T1 - Localization Microscopy for the visualization of cellular structures N2 - Die Einführung der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Strukturen in Zellen spezifisch und mit hohem Kontrast zu markieren und zu untersuchen. Da die Lichtmikroskopie jedoch in ihrer Auflösung begrenzt ist, bleiben Strukturinformationen auf molekularer Ebene verborgen. Diese als Beugungsgrenze bekannte Limitierung, kann mit modernen Verfahren umgangen werden. Die Lokalisationsmikroskopie nutzt hierfür photoschaltbare Fluorophore, deren Fluoreszenz räumlich und zeitlich separiert wird, um so einzelne Fluorophore mit Nanometer-Genauigkeit lokalisieren zu können. Aus tausenden Einzelmolekül-Lokalisationen wird ein künstliches, hochaufgelöstes Bild rekonstruiert. Die hochauflösende Mikroskopie ist grade für die Lebendzell-Beobachtung ein wertvolles Werkzeug, um subzelluläre Strukturen und Proteindynamiken jenseits der Beugungsgrenze unter physiologischen Bedingungen untersuchen zu können. Als Marker können sowohl photoaktivierbare fluoreszierende Proteine als auch photoschaltbare organische Fluorophore eingesetzt werden. Während die Markierung mit fluoreszierenden Proteinen einfach zu verwirklichen ist, haben organische Farbstoffe hingegen den Vorteil, dass sie auf Grund der höheren Photonenausbeute eine präzisere Lokalisation erlauben. In lebenden Zellen wird die Markierung von Strukturen mit synthetischen Fluorophoren über sogenannte chemische Tags ermöglicht. Diese sind olypeptidsequenzen, die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden und anschließend mit Farbstoff-gekoppelten Substraten gefärbt werden. An der Modellstruktur des Histonproteins H2B werden in dieser Arbeit Farbstoffe in Kombination mit chemischen Tags identifiziert, die erfolgreich für die Hochauflösung mit direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in lebenden Zellen eingesetzt werden können. Für besonders geeignet erweisen sich die Farbstoffe Tetramethylrhodamin, 505 und Atto 655, womit der gesamte spektrale Bereich vertreten ist. Allerdings können unspezifische Bindung und Farbstoffaggregation ein Problem bei der effizienten Markierung in lebenden Zellen darstellen. Es wird gezeigt, dass die Beschichtung der Glasoberfläche mit Glycin die unspezifische Adsorption der Fluorophore erfolgreich minimieren kann. Weiterhin wird der Einfluss des Anregungslichtes auf die lebende Zelle diskutiert. Es werden Wege beschrieben, um die Photoschädigung möglichst gering zu halten, beispielsweise durch die Wahl eines Farbstoffs im rotem Anregungsbereich. Die Möglichkeit lebende Zellen mit photoschaltbaren organischen Fluorophoren spezifisch markieren zu können, stellt einen großen Gewinn für die Lokalisationsmikroskopie dar, bei der ursprünglich farbstoffgekoppelte Antikörper zum Einsatz kamen. Diese Markierungsmethode wird in dieser Arbeit eingesetzt, um das Aggregationsverhalten von Alzheimer verursachenden � -Amyloid Peptiden im Rahmen einer Kooperation zu untersuchen. Es werden anhand von HeLa Zellen verschiedene beugungsbegrenzte Morphologien der Aggregate aufgeklärt. Dabei wird gezeigt, dass intrazellulär vorhandene Peptide größere Aggregate formen als die im extrazellulären Bereich. In einer zweiten Kollaboration wird mit Hilfe des photoaktivierbaren Proteins mEos2 und photoactivated localization microscopy (PALM) die strukturelle Organisation zweier Flotillinproteine in der Membran von Bakterien untersucht. Diese Proteine bilden zwei Cluster mit unterschiedlichen Durchmessern, die mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass beide Proteine in unterschiedlichen Anzahlen im Bakterium vorliegen. N2 - The implementation of fluorescence microscopy enables specific labeling and studying of cellular structures with high contrast. Since light microscopy is limited in its resolution, structural information at the molecular level remains hidden. This barrier, known as diffraction limit, can be circumvented by modern imaging techniques. For this purpose localization microscopy employs photoswitchable fluorophores. The fluorescence of these fluorophores is spatially and temporally separated in order to localize single fluorophores with nanometer precision. From thousands of single-molecule localizations an artificial highresolution image is reconstructed. Super-resolution microscopy is a valuable tool for live-cell observations in order to investigate sub-cellular structures and protein dynamics beyond the diffraction limit under physiological conditions. Both photoactivatable fluorescent proteins and photoswitchable organic fluorophores can be used as labels. Whereas labeling with fluorescent proteins is straightforward to implement, organic fluorophores, however, have the Advantage of a more precise localization due to a higher photon yield. In living cells, labeling of structures with synthetic fluorophores is facilitated by so-called chemical tags. Those are polypeptide sequences that are genetically fused to the target protein and subsequently labeled with dye coupled substrates. In this work, on the basis of the model structure H2B—a histone protein—dyes are identified in combination with chemical tags, that can be successfully used for super-resolution imaging with direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in living cells. The dyes tetramethylrhodamine, 505 and Atto 655 proved to be particularly suitable, whereby the whole spectral range is represented. However, unspecific binding and dye aggregation can pose a problem for the efficient labeling of living cells. It is shown, that coating the glass surface with glycine successfully minimizes unspecific adsorption of fluorophores. Furthermore the impact of the excitation light on living cells is discussed. Methods are presented to keep photodamage at a minimum, e. g., by choosing a dye within the red excitation range. The feasibility to label living cells with photoswitchable organic fluorophores represents a big asset for localization microscopy, which originally employed dye labeled antibodies. This alternative labeling technique is used in a collaboration to study the aggregation behavior of � -Amyloid peptides, which cause Alzheimer’s disease. By means of HeLa cells, different diffraction limited morphologies of aggregates are revealed. It is thereby shown, that intracellular peptides generate larger aggregates than the ones in the extracellular region. In another collaboration the structural organization of two flotillin proteins in the membrane of bacteria is examined by means of the photoactivatable Protein mEos2 and photoactivated localization microscopy (PALM). These proteins form two clusters with different diameters, which could be determined with nanometer precision. It was also asserted that both proteins exist in unequal numbers within the bacterium. KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Zellmarker KW - dSTORM KW - PALM KW - live-cell KW - Hochauflösung KW - Zellmarkierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99260 ER - TY - JOUR A1 - Hudson, Lawrence N. A1 - Newbold, Tim A1 - Contu, Sara A1 - Hill, Samantha L. L. A1 - Lysenko, Igor A1 - De Palma, Adriana A1 - Phillips, Helen R. P. A1 - Senior, Rebecca A. A1 - Bennett, Dominic J. A1 - Booth, Hollie A1 - Choimes, Argyrios A1 - Correia, David L. P. A1 - Day, Julie A1 - Echeverria-Londono, Susy A1 - Garon, Morgan A1 - Harrison, Michelle L. K. A1 - Ingram, Daniel J. A1 - Jung, Martin A1 - Kemp, Victoria A1 - Kirkpatrick, Lucinda A1 - Martin, Callum D. A1 - Pan, Yuan A1 - White, Hannah J. A1 - Aben, Job A1 - Abrahamczyk, Stefan A1 - Adum, Gilbert B. A1 - Aguilar-Barquero, Virginia A1 - Aizen, Marcelo A1 - Ancrenaz, Marc A1 - Arbelaez-Cortes, Enrique A1 - Armbrecht, Inge A1 - Azhar, Badrul A1 - Azpiroz, Adrian B. A1 - Baeten, Lander A1 - Báldi, András A1 - Banks, John E. A1 - Barlow, Jos A1 - Batáry, Péter A1 - Bates, Adam J. A1 - Bayne, Erin M. A1 - Beja, Pedro A1 - Berg, Ake A1 - Berry, Nicholas J. A1 - Bicknell, Jake E. A1 - Bihn, Jochen H. A1 - Böhning-Gaese, Katrin A1 - Boekhout, Teun A1 - Boutin, Celine A1 - Bouyer, Jeremy A1 - Brearley, Francis Q. A1 - Brito, Isabel A1 - Brunet, Jörg A1 - Buczkowski, Grzegorz A1 - Buscardo, Erika A1 - Cabra-Garcia, Jimmy A1 - Calvino-Cancela, Maria A1 - Cameron, Sydney A. A1 - Cancello, Eliana M. A1 - Carrijo, Tiago F. A1 - Carvalho, Anelena L. A1 - Castro, Helena A1 - Castro-Luna, Alejandro A. A1 - Cerda, Rolando A1 - Cerezo, Alexis A1 - Chauvat, Matthieu A1 - Clarke, Frank M. A1 - Cleary, Daniel F. R. A1 - Connop, Stuart P. A1 - D'Aniello, Biagio A1 - da Silva, Pedro Giovani A1 - Darvill, Ben A1 - Dauber, Jens A1 - Dejean, Alain A1 - Diekötter, Tim A1 - Dominguez-Haydar, Yamileth A1 - Dormann, Carsten F. A1 - Dumont, Bertrand A1 - Dures, Simon G. A1 - Dynesius, Mats A1 - Edenius, Lars A1 - Elek, Zoltán A1 - Entling, Martin H. A1 - Farwig, Nina A1 - Fayle, Tom M. A1 - Felicioli, Antonio A1 - Felton, Annika M. A1 - Ficetola, Gentile F. A1 - Filgueiras, Bruno K. C. A1 - Fonte, Steve J. A1 - Fraser, Lauchlan H. A1 - Fukuda, Daisuke A1 - Furlani, Dario A1 - Ganzhorn, Jörg U. A1 - Garden, Jenni G. A1 - Gheler-Costa, Carla A1 - Giordani, Paolo A1 - Giordano, Simonetta A1 - Gottschalk, Marco S. A1 - Goulson, Dave A1 - Gove, Aaron D. A1 - Grogan, James A1 - Hanley, Mick E. A1 - Hanson, Thor A1 - Hashim, Nor R. A1 - Hawes, Joseph E. A1 - Hébert, Christian A1 - Helden, Alvin J. A1 - Henden, John-André A1 - Hernández, Lionel A1 - Herzog, Felix A1 - Higuera-Diaz, Diego A1 - Hilje, Branko A1 - Horgan, Finbarr G. A1 - Horváth, Roland A1 - Hylander, Kristoffer A1 - Horváth, Roland A1 - Isaacs-Cubides, Paola A1 - Ishitani, Mashiro A1 - Jacobs, Carmen T. A1 - Jaramillo, Victor J. A1 - Jauker, Birgit A1 - Jonsell, Matts A1 - Jung, Thomas S. A1 - Kapoor, Vena A1 - Kati, Vassiliki A1 - Katovai, Eric A1 - Kessler, Michael A1 - Knop, Eva A1 - Kolb, Annette A1 - Körösi, Àdám A1 - Lachat, Thibault A1 - Lantschner, Victoria A1 - Le Féon, Violette A1 - LeBuhn, Gretchen A1 - Légaré, Jean-Philippe A1 - Letcher, Susan G. A1 - Littlewood, Nick A. A1 - López-Quintero, Carlos A. A1 - Louhaichi, Mounir A1 - Lövei, Gabor L. A1 - Lucas-Borja, Manuel Esteban A1 - Luja, Victor H. A1 - Maeto, Kaoru A1 - Magura, Tibor A1 - Mallari, Neil Aldrin A1 - Marin-Spiotta, Erika A1 - Marhall, E. J. P. A1 - Martínez, Eliana A1 - Mayfield, Margaret M. A1 - Mikusinski, Gregorz A1 - Milder, Jeffery C. A1 - Miller, James R. A1 - Morales, Carolina L. A1 - Muchane, Mary N. A1 - Muchane, Muchai A1 - Naidoo, Robin A1 - Nakamura, Akihiro A1 - Naoe, Shoji A1 - Nates-Parra, Guiomar A1 - Navarerete Gutierrez, Dario A. A1 - Neuschulz, Eike L. A1 - Noreika, Norbertas A1 - Norfolk, Olivia A1 - Noriega, Jorge Ari A1 - Nöske, Nicole M. A1 - O'Dea, Niall A1 - Oduro, William A1 - Ofori-Boateng, Caleb A1 - Oke, Chris O. A1 - Osgathorpe, Lynne M. A1 - Paritsis, Juan A1 - Parrah, Alejandro A1 - Pelegrin, Nicolás A1 - Peres, Carlos A. A1 - Persson, Anna S. A1 - Petanidou, Theodora A1 - Phalan, Ben A1 - Philips, T. Keith A1 - Poveda, Katja A1 - Power, Eileen F. A1 - Presley, Steven J. A1 - Proença, Vânia A1 - Quaranta, Marino A1 - Quintero, Carolina A1 - Redpath-Downing, Nicola A. A1 - Reid, J. Leighton A1 - Reis, Yana T. A1 - Ribeiro, Danilo B. A1 - Richardson, Barbara A. A1 - Richardson, Michael J. A1 - Robles, Carolina A. A1 - Römbke, Jörg A1 - Romero-Duque, Luz Piedad A1 - Rosselli, Loreta A1 - Rossiter, Stephen J. A1 - Roulston, T'ai H. A1 - Rousseau, Laurent A1 - Sadler, Jonathan P. A1 - Sáfián, Szbolcs A1 - Saldaña-Vásquez, Romeo A. A1 - Samnegård, Ulrika A1 - Schüepp, Christof A1 - Schweiger, Oliver A1 - Sedlock, Jodi L. A1 - Shahabuddin, Ghazala A1 - Sheil, Douglas A1 - Silva, Fernando A. B. A1 - Slade, Eleanor A1 - Smith-Pardo, Allan H. A1 - Sodhi, Navjot S. A1 - Somarriba, Eduardo J. A1 - Sosa, Ramón A. A1 - Stout, Jane C. A1 - Struebig, Matthew J. A1 - Sung, Yik-Hei A1 - Threlfall, Caragh G. A1 - Tonietto, Rebecca A1 - Tóthmérész, Béla A1 - Tscharntke, Teja A1 - Turner, Edgar C. A1 - Tylianakis, Jason M. A1 - Vanbergen, Adam J. A1 - Vassilev, Kiril A1 - Verboven, Hans A. F. A1 - Vergara, Carlos H. A1 - Vergara, Pablo M. A1 - Verhulst, Jort A1 - Walker, Tony R. A1 - Wang, Yanping A1 - Watling, James I. A1 - Wells, Konstans A1 - Williams, Christopher D. A1 - Willig, Michael R. A1 - Woinarski, John C. Z. A1 - Wolf, Jan H. D. A1 - Woodcock, Ben A. A1 - Yu, Douglas W. A1 - Zailsev, Andreys A1 - Collen, Ben A1 - Ewers, Rob M. A1 - Mace, Georgina M. A1 - Purves, Drew W. A1 - Scharlemann, Jörn P. W. A1 - Pervis, Andy T1 - The PREDICTS database: a global database of how local terrestrial biodiversity responds to human impacts JF - Ecology and Evolution N2 - Biodiversity continues to decline in the face of increasing anthropogenic pressures such as habitat destruction, exploitation, pollution and introduction of alien species. Existing global databases of species' threat status or population time series are dominated by charismatic species. The collation of datasets with broad taxonomic and biogeographic extents, and that support computation of a range of biodiversity indicators, is necessary to enable better understanding of historical declines and to project - and avert - future declines. We describe and assess a new database of more than 1.6 million samples from 78 countries representing over 28,000 species, collated from existing spatial comparisons of local-scale biodiversity exposed to different intensities and types of anthropogenic pressures, from terrestrial sites around the world. The database contains measurements taken in 208 (of 814) ecoregions, 13 (of 14) biomes, 25 (of 35) biodiversity hotspots and 16 (of 17) megadiverse countries. The database contains more than 1% of the total number of all species described, and more than 1% of the described species within many taxonomic groups - including flowering plants, gymnosperms, birds, mammals, reptiles, amphibians, beetles, lepidopterans and hymenopterans. The dataset, which is still being added to, is therefore already considerably larger and more representative than those used by previous quantitative models of biodiversity trends and responses. The database is being assembled as part of the PREDICTS project (Projecting Responses of Ecological Diversity In Changing Terrestrial Systems - ). We make site-level summary data available alongside this article. The full database will be publicly available in 2015. KW - urban-rural gradient KW - instensively managed farmland KW - Mexican coffee plantations KW - Bombus Spp. Hymenoptera KW - bumblebee nest density KW - data sharing KW - land use KW - habitat destruction KW - global change KW - land-use change KW - plant community composition KW - Northeastern Costa Rica KW - dung beetle coleoptera KW - bird species richness Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114425 VL - 4 IS - 24 ER - TY - JOUR A1 - Rozycka, Miroslawa A1 - Wojtas, Magdalena A1 - Jakob, Michal A1 - Stigloher, Christian A1 - Grzeszkowiak, Mikolaj A1 - Mazur, Maciej A1 - Ozyhar, Andrzej T1 - Intrinsically Disordered and Pliable Starmaker-Like Protein from Medaka (Oryzias latipes) Controls the Formation of Calcium Carbonate Crystals JF - PLOS ONE N2 - Fish otoliths, biominerals composed of calcium carbonate with a small amount of organic matrix, are involved in the functioning of the inner ear. Starmaker (Stm) from zebrafish (Danio rerio) was the first protein found to be capable of controlling the formation of otoliths. Recently, a gene was identified encoding the Starmaker-like (Stm-l) protein from medaka (Oryzias latipes), a putative homologue of Stm and human dentine sialophosphoprotein. Although there is no sequence similarity between Stm-l and Stm, Stm-l was suggested to be involved in the biomineralization of otoliths, as had been observed for Stm even before. The molecular properties and functioning of Stm-l as a putative regulatory protein in otolith formation have not been characterized yet. A comprehensive biochemical and biophysical analysis of recombinant Stm-l, along with in silico examinations, indicated that Stm-l exhibits properties of a coil-like intrinsically disordered protein. Stm-l possesses an elongated and pliable structure that is able to adopt a more ordered and rigid conformation under the influence of different factors. An in vitro assay of the biomineralization activity of Stm-l indicated that Stm-l affected the size, shape and number of calcium carbonate crystals. The functional significance of intrinsically disordered properties of Stm-l and the possible role of this protein in controlling the formation of calcium carbonate crystals is discussed. KW - circular-dichroism KW - unstructured proteins KW - olyelectrolyte domains KW - modulating KW - biominarlization proteins KW - nacreous layer formation KW - alpha-helical structure KW - dye stains-all KW - polyelectrolyte domains KW - phosphorylation sites KW - procambarus-clarkii KW - secondary structure Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114251 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Sibilski, Claudia T1 - Identification and characterization of the novel mKSR1 phosphorylation site Tyr728 and its role in MAPK signaling T1 - Identifizierung und Charakterisierung der neuartigen mKSR1-Phosphorylierungsstelle Tyr728 und deren Rolle in der MAPK-Signalkaskade N2 - In mammals, KSR1 functions as an essential scaffold that coordinates the assembly of RAF/MEK/ERK complexes and regulates intracellular signal transduction upon extracellular stimulation. Aberrant activation of the equivalent MAPK signaling pathway has been implicated in multiple human cancers and some developmental disorders. The mechanism of KSR1 regulation is highly complex and involves several phosphorylation/dephosphorylation steps. In the present study, a number of novel in vivo phosphorylation sites were detected in mKSR1 by use of mass spectrometry analysis. Among others, Tyr728 was identified as a unique regulatory residue phosphorylated by LCK, a Src kinase family member. To understand how phosphorylation of Tyr728 may regulate the function of KSR1 in signal transduction and cellular processes, structural modeling and biochemical studies were integrated in this work. Computational modeling of the mKSR1(KD) protein structure revealed strong hydrogen bonding between phospho-Tyr728 and the residues surrounding Arg649. Remarkably, this pattern was altered when Tyr728 was non-phosphorylated or substituted. As confirmed by biochemical analysis, Arg649 may serve as a major anchor point for phospho-Tyr728 in order to stabilize internal structures of KSR1. In line with the protein modeling results, mutational studies revealed that substitution of Tyr728 by phenylalanine leads to a less compact interaction between KSR1 and MEK, a facilitated KSR1/B-RAF binding and an increased phosphorylation of MEK in complex with KSR1. From these findings it can be concluded that phospho-Tyr728 is involved in tightening the KSR1/MEK interaction interface and in regulating the phosphorylation of KSR1-bound MEK by either RAF or KSR1 kinases. Beside the Tyr728, Ser722 was identified as a novel regulatory phosphorylation site. Amino acid exchanges at the relevant position demonstrated that Ser722 regulates KSR1-bound MEK phosphorylation without affecting KSR1/MEK binding per se. Due to its localization, Ser722 might consequently control the catalytic activity of KSR1 by interfering with the access of substrate (possibly MEK) to the active site of KSR1 kinase. Together with Ser722, phosphorylated Tyr728 may further positively affect the kinase activity of KSR1 as a consequence of its vicinity to the activation and catalytic loop in the KSR1(KD). As revealed by structural modeling, phospho-Tyr728 builds a hydrogen bond with the highly conserved Lys685. Consequently, phospho-Tyr728 has a stabilizing effect on internal structures involved in the catalytic reaction and possibly enhances the phosphate transfer within the catalytic cleft in KSR1. Considering these facts, it seems very likely that the LCK-dependent phosphorylation of Tyr728 plays a crucial role in the regulation of KSR1 catalytic activity. Results of fractionation and morphology analyses revealed that KSR1 recruits LCK to cytoskeleton for its phosphorylation at Tyr728 suggesting that this residue may regulate cytoskeleton dynamics and, consequently, cell motility. Beside that, phosphorylation of Tyr728 is involved in the regulation of cell proliferation, as shown by a significantly reduced population doubling time of KSR1-Y728F cells compared to cells expressing wild type KSR1. Taken together, tyrosine phosphorylation in KSR1 uncovers a new link between Src family kinases and MAPK signaling. Tyr728, the novel regulatory phosphorylation site in murine KSR1, may coordinate the transition between the scaffolding and the catalytic function of KSR1 serving as a control point used to fine-tune cellular responses. N2 - KSR1 fungiert bei Säugetieren als zentrales Gerüstprotein, welches die Anordnung von RAF/MEK/ERK-Komplexen koordiniert und die intrazelluläre Signalweiterleitung nach extrazellulärer Stimulation reguliert. Eine abweichende Aktivierung des entsprechenden MAPK-Signalwegs wurde mit vielen humanen Krebsformen und einigen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht. Der Mechanismus der KSR1-Regulierung ist hochgradig komplex und involviert mehrfach Schritte der Phosphorylierung/Dephosphorylierung. In der vorliegenden Studie wurden etliche neue in-vivo-Phosphorylierungsstellen in mKSR1 mittels massenspektrometrischer Analyse entdeckt. Neben anderen wurde Tyr728 als besonderer regulatorischer Rest identifiziert, welcher durch LCK, einem Mitglied der Src-Kinase-Familie, phosphoryliert wird. Um zu verstehen wie die Phosphorylierung von Tyr728 die Funktion von KSR1 innerhalb der Signalweiterleitung und zellulärer Prozesse regulieren könnte, wurden strukturelle Modellierungen und biochemische Untersuchungen in diese Arbeit integriert. Die Computermodellierung der mKSR1(KD)-Proteinstruktur zeigte starke Wasserstoff- brückenbindungen zwischen Phospho-Tyr728 und den Resten in der Umgebung von Arg649 auf. Dieses Muster war auffällig verändert, wenn Tyr728 nicht phosphoryliert oder substituiert war. Wie anhand biochemischer Analyse untermauert wurde, könnte Arg649 für phospho-Tyr728 als Hauptankerpunkt dienen, um interne Strukturen in KSR1 zu stabilisieren. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Proteinmodellierung enthüllten die Mutationsstudien, dass die Substitution von Tyr728 mit Phenylalanin zu einer weniger kompakten Interaktion zwischen KSR1 und MEK, einer erleichterten KSR1/B-RAF-Bindung und einer ansteigenden Phosphorylierung von MEK im Komplex mit KSR1 führt. Anhand dieser Erkenntnisse kann man rückschließen, dass Phospho-Tyr728 in die Verstärkung der Interaktionen innerhalb der KSR1/MEK-Grenzfläche und in die Regulierung der Phosphorylierung von KSR1-gebundenem MEK durch entweder RAF- oder KSR1-Kinasen involviert ist. Neben Tyr728 wurde Ser722 als eine neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle identifiziert. Aminosäureaustausche an der betreffenden Position demonstrierten, dass Ser722 die Phosphorylierung von KSR1-gebundenem MEK reguliert ohne die KSR1/MEK-Bindung selbst zu beeinträchtigen. Bedingt durch seine Lokalisierung könnte Ser722 folglich die katalytische Aktivität von KSR1 kontrollieren, indem es den Zugang des Substrates (möglicherweise MEK) zur aktiven Seite der KSR1-Kinase behindert. Zusammen mit Ser722 könnte phosphoryliertes Tyr728 ferner die Kinaseaktivität von KSR1 positiv beeinflussen, infolge von dessen Nähe zur Aktivierungs- und katalytischen Schleife in der KSR1(KD). Wie mittels Strukturmodellierung offengelegt wurde, bildet Phospho-Tyr728 eine Wasserstoffbrücke mit dem hochgradig konservierten Lys685 aus. Folglich hat Phospho-Tyr728 einen stabilisierenden Effekt auf interne Strukturen, welche in die katalytische Reaktion involviert sind, und erleichtert möglicherweise den Phosphattransfer innerhalb der katalytischen Spalte in KSR1. In Anbetracht dieser Fakten scheint es sehr wahrscheinlich, dass die LCK-abhängige Phosphorylierung von Tyr728 eine äußerst wichtige Rolle in der Regulierung der katalytischen Aktivität von KSR1 spielt. Die Ergebnisse der Fraktionierungs- und Morphologieanalysen enthüllten, dass KSR1 für die Phosphorylierung an Tyr728 LCK zum Zytoskelett rekrutiert, was darauf hindeutet, dass dieser Rest die Dynamik des Zytoskeletts und folglich Zellmotilität regulieren könnte. Darüber hinaus ist die Phosphorylierung von Tyr728 in die Regulierung der Zellproliferation involviert, wie anhand einer bedeutend reduzierten Populationsverdopplungszeit von KSR1-Y728F-Zellen im Vergleich zu Zellen, welche wildtypisches KSR1 exprimieren, gezeigt wurde. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Tyrosin-Phosphorylierung in KSR1 eine neue Verknüpfung zwischen Kinasen der Src-Familie und der MAPK-Signalwirkung enthüllt. Tyr728, die neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle in Maus-KSR1, könnte den Übergang zwischen der Gerüst- und der katalytischen Funktion von KSR1 koordinieren und damit als Kontrollpunkt dienen, um zelluläre Reaktionen fein abzustimmen. KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Regulation KW - tyrosine phosphorylation KW - KSR1 KW - LCK KW - MAPK KW - phosphorylation KW - signaling Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114672 ER - TY - THES A1 - Wenzel, Jens T1 - Regulation of TLR-induced macrophage responses by cytoskeleton-associated phosphoproteins T1 - Regulation der Antwort von Makrophagen auf TLR-Stimulation durch Zytoskelett-assoziierte Phosphoproteine N2 - Toll-like receptors (TLR) are pattern recognition receptors (PRR) by which macrophages (MØ) sense pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The recognition of lipopolysaccharide (LPS), the PAMP of gram negative bacteria, by TLR4 triggers signaling cascades and leads to the pro-inflammatory activation of the cells. A recent quantitative and kinetic analysis of the phosphoproteome of LPS-activated primary macrophages highlighted the cytoskeleton as a cell compartment with an enriched protein phosphorylation. In total 44 cytoskeleton-associated proteins were regulated by this post-translational modification and thus might be involved in the control and regulation of key macrophage functions like spreading, motility and phagocytosis. To investigate the control of cytoskeleton-associated cell functions by TLR4 activation, we first developed a method to quantitatively measure the spreading response of bone marrow MØ after stimulation with LPS. Fluorescence microscopy was used for cell imaging and visualisation of the MØ contact area. In collaboration with the Fraunhofer Institute Erlangen, we developed and validated a software tool for the semi-automated segmentation and quantitation of MØ fluorescence microscopy data, which allowed fast, robust and objective image analysis. Using this method, we observed that LPS caused time-dependent spreading, which was detectable after 1-2 h and maximal after 24 h. Next, the impact of genetic or pharmacological inhibition of known TLR signaling components was investigated. Deficiency in the adapter protein MYD88 strongly reduced spreading activity at the late time points, but had no impact early after LPS-stimulation. A similar effect was observed upon pharmacological inhibition of ERK1/2 signaling, indicating that ERK1/2 mediates MYD88-dependent MØ spreading. In contrast, MØ lacking the MAPK p38 were impaired in the initial spreading response but responded normally 8-24 h after stimulation. The genetic deletion of the MAPK phosphatases DUSP1 and DUSP16 resulted in impaired late spreading, corroborating the essential role for functional MAPK signaling in TLR4-driven MØ spreading. To identify the contribution of other cytoskeletal phosphoproteins to MØ spreading, siRNA knockdown of selected candidate genes in primary murine MØ was employed and combined with automated quantitative image analysis. These experiments revealed a functional role for the Myosins MYO1e and MYO1f in MØ spreading. These motor proteins are strongly phosphorylated in LPS-activated MØ. Because of their ability to simultaneously bind to actin filaments and cell membrane or other proteins, we investigated their role in phagocytosis, cytokine production and antigen presentation. Phagocytosis and killing of bacteria were not affected in Myo1e-/- macrophages. However, MYO1e plays a role in chemokine secretion and antigen presentation processes. MCP1 (CCL2) release was selectively increased in Myo1e-deficient MØ and dendritic cells (DC), while cytokine secretion was unaffected. Furthermore, macrophages and DCs lacking MYO1e showed lower levels of MHC-II on the cell surface. However, mRNA levels of CCL2 and of MHC-II were unaltered. These data suggest a role for MYO1e in the transport of selected chemokines and of MHC-II molecules to the cell surface. MHC-II-restricted antigen presentation assays revealed an impaired capacity of macrophages and DC lacking MYO1e to stimulate antigen-specific T cells, suggesting that the reduced MHC-II expression is functionally relevant. Taken together, in this study first a quantitative image analysis method was developed which allows the unbiased, robust and efficient investigation of the macrophage spreading response. Combination of this method with siRNA knockdown of selected cytoskeleton-associated phosphoproteins led to the identification of MYO1e and MYO1f as regulators of macrophage spreading. Furthermore, we identified MYO1e in MØ and DC to be essential for the intracellular transport of CCL2 and MHC-II to the cell surface and for optimal stimulation of antigen-specific CD4 T cells. N2 - Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Mustererkennungsrezeptoren (PRR) durch die Makrophagen (MØ) pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) erkennen. Die Erkennung von Lipopolysacchariden (LPS), dem PAMP gramnegativer Bakterien, durch TLR4 löst Signalkaskaden aus, die zu einer pro-inflammatorischen Aktivierung der Zellen führen. Eine quantitative und kinetische Analyse des Phosphoproteoms LPS-aktivierter primärer Makrophagen identifizierte das Zytoskelett als ein Zellkompartiment mit gesteigerter Proteinphosphorylierung. Insgesamt wurden 44 Zytoskelett-assoziierte Proteine identifiziert, die durch diese post-translationale Modifikation reguliert wurden und demzufolge an der Regulation wichtiger Zellfunktionen von Makrophagen wie Spreading, Motilität und Phagozytose beteiligt sein könnten. Um die Kontrolle Zytoskelett-vermittelter Zellfunktionen nach TLR4 Aktivierung zu untersuchen, entwickelten wir zunächst eine Methode zur quantitativen Messung der Spreadingantwort von Knochenmarksmakrophagen nach LPS Stimulation. Die Visualisierung der Zellen sowie ihrer Kontaktfläche erfolgte hierbei mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für eine schnelle, robuste und objektive Analyse der Fluoreszenzaufnahmen entwickelten und validierten wir in Kollaboration mit dem Fraunhofer Institut in Erlangen eine Software zur halbautomatischen Segmentierung und Quantifizierung der Kontaktfläche. Unter Verwendung dieser Methode konnte eine zeitabhängige LPS-induzierte Zunahme der Zellkontaktfläche beobachtet werden, die nach 1-2 Stunden detektierbar war und ein Maximum nach 24 Stunden erreichte. Durch den Einsatz pharmakologischer Inhibitoren sowie genetisch veränderter Zellen wurde anschließend der Einfluss bekannter TLR4-Signalwegkomponenten untersucht. Die genetische Defizienz des Adapterproteins MYD88 führte hierbei zu einer stark reduzierten Spreadingaktivität der Zellen während der späten LPS Stimulationsphase, wohingegen das initiale Spreading nicht beeinflusst wurde. Ein vergleichbarer Effekt konnte unter Verwendung eines pharmakologischen Inhibitors zur Hemmung des ERK1/2 Signalweges identifiziert werden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass ERK1/2 für die Weiterleitung des MYD88 vermittelten Spreading notwendig ist. Im Gegensatz dazu wurde in p38-defizienten Makrophagen ein beeinträchtigtes initiales Spreading beobachtet, wohingegen das späte Spreading nach 8 – 24 Stunden nicht beeinflusst war. Die genetische Deletion der MAPK Phosphatasen DUSP1 und DUSP16 resultierte ebenfalls in einer Minderung des späten Spreadings, ebenfalls ein Hinweis auf die essentielle Rolle funktioneller MAPK Signalwege. Um die Beteiligung weiter Zytoskelett-Phosphoproteine am Zellspreading zu identifizieren, wurde die Expression ausgewählter Kandidatengene in primären Makrophagen mittels spezifischer siRNA unterdrückt und das Zellspreading mit Hilfe der entwickelten Software quantifiziert. Diese Versuche zeigten eine funktionelle Rolle der Myosine MYO1e und MYO1f. Diese Motorproteine weisen ebenfalls eine starke Phosphorylierung nach LPS Stimulation auf. Aufgrund ihrer Eigenschaft simultan mit Aktinfilamenten und Zellmembranen sowie anderen Proteinen zu interagieren, untersuchten wir ihre Rolle während der Phagozytose, Zytokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Obwohl Myo1e defiziente Makrophagen keine Beeinträchtigung der Phagozytose oder Abtötung von Bakterien aufwiesen, spielte das Motorprotein eine wichtige Rolle in der Chemokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Interessanterweise war die Sekretion des Chemokins MCP1 (CCL2) in Myo1e-defizienten Makrophagen und dendritischen Zellen (DC) selektiv erhöht, während die Zytokinfreisetzung unbeeinträchtigt war. Des Weiteren wiesen Myo1e KO Makrophagen und DC eine reduzierte MHC-II Oberflächen-Expression auf, obwohl die MHC-II als auch die CCL2 Transkription auf mRNA Ebene nicht beeinflusst war. Diese Daten legen nahe, dass MYO1e während des Transports bestimmter Chemokine, sowie von MHC-II zur Zelloberfläche eine wichtige Rolle spielt. Zudem zeigten Myo1e KO Makrophagen und DC in einem MHC-II-abhängigen Antigenpräsentationsassay eine abgeschwächte Fähigkeit zur Antigen-spezifischen T-Zell Aktivierung, was die funktionelle Relevanz der reduzierten Expression von MHC-II nahelegt. Zusammenfassend wurde in dieser Studie zunächst eine Methode zur quantitativen Bildanalyse entwickelt, welche eine unvoreingenommene, robuste und effiziente Untersuchung des Spreadings von Makrophagen erlaubte. Die Kombination dieser Methode mit dem spezifischen siRNA Knockdown ausgewählter Zytoskelett-assoziierter Phosphoproteine führte zur Identifizierung von MYO1e und MYO1f als wichtige Regulatoren dieser Zellfunktion. Darüber hinaus konnte in Makrophagen und DC eine essentielle Rolle für MYO1e im intrazellulären Transport von CCL2 und MHC-II an die Zelloberfläche identifiziert werden, sowie dessen Notwendigkeit für eine vollständige Aktivierung antigen-spezifischer CD4 T Zellen. KW - Toll-like-Rezeptoren KW - Makrophage KW - Phosphoproteine KW - Zellskelett KW - macrophage KW - cytoskeleton KW - phosphorylation KW - TLR4 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98843 ER - TY - JOUR A1 - Remmele, Christian W. A1 - Xian, Yibo A1 - Albrecht, Marco A1 - Faulstich, Michaela A1 - Fraunholz, Martin A1 - Heinrichs, Elisabeth A1 - Dittrich, Marcus T. A1 - Müller, Tobias A1 - Reinhardt, Richard A1 - Rudel, Thomas T1 - Transcriptional landscape and essential genes of Neisseria gonorrhoeae N2 - The WHO has recently classified Neisseria gonorrhoeae as a super-bacterium due to the rapid spread of antibiotic resistant derivatives and an overall dramatic increase in infection incidences. Genome sequencing has identified potential genes, however, little is known about the transcriptional organization and the presence of non-coding RNAs in gonococci. We performed RNA sequencing to define the transcriptome and the transcriptional start sites of all gonococcal genes and operons. Numerous new transcripts including 253 potentially non-coding RNAs transcribed from intergenic regions or antisense to coding genes were identified. Strikingly, strong antisense transcription was detected for the phase-variable opa genes coding for a family of adhesins and invasins in pathogenic Neisseria, that may have regulatory functions. Based on the defined transcriptional start sites, promoter motifs were identified. We further generated and sequenced a high density Tn5 transposon library to predict a core of 827 gonococcal essential genes, 133 of which have no known function. Our combined RNA-Seq and Tn-Seq approach establishes a detailed map of gonococcal genes and defines the first core set of essential gonococcal genes. KW - Neisseria gonorrhoeae Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113676 ER - TY - JOUR A1 - Linder, Bastian A1 - Hirmer, Anja A1 - Gal, Andreas A1 - Rüther, Klaus A1 - Bolz, Hanno Jörn A1 - Winkler, Christoph A1 - Laggerbauer, Bernhard A1 - Fischer, Utz T1 - Identification of a PRPF4 Loss-of-Function Variant That Abrogates U4/U6.U5 Tri-snRNP Integration and Is Associated with Retinitis Pigmentosa N2 - Pre-mRNA splicing by the spliceosome is an essential step in the maturation of nearly all human mRNAs. Mutations in six spliceosomal proteins, PRPF3, PRPF4, PRPF6, PRPF8, PRPF31 and SNRNP200, cause retinitis pigmentosa (RP), a disease characterized by progressive photoreceptor degeneration. All splicing factors linked to RP are constituents of the U4/U6.U5 tri-snRNP subunit of the spliceosome, suggesting that the compromised function of this particle may lead to RP. Here, we report the identification of the p.R192H variant of the tri-snRNP factor PRPF4 in a patient with RP. The mutation affects a highly conserved arginine residue that is crucial for PRPF4 function. Introduction of a corresponding mutation into the zebrafish homolog of PRPF4 resulted in a complete loss of function in vivo. A series of biochemical experiments suggested that p.R192H disrupts the binding interface between PRPF4 and its interactor PRPF3. This interferes with the ability of PRPF4 to integrate into the tri-snRNP, as shown in a human cell line and in zebrafish embryos. These data suggest that the p.R192H variant of PRPF4 represents a functional null allele. The resulting haploinsufficiency of PRPF4 compromises the function of the tri-snRNP, reinforcing the notion that this spliceosomal particle is of crucial importance in the physiology of the retina. KW - zebrafish KW - embryos KW - immunoprecipitation KW - arginine KW - messenger RNA KW - spliceosomes KW - mutation KW - RNA splicing Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113663 ER - TY - JOUR A1 - Vergho, Daniel Claudius A1 - Kneitz, Susanne A1 - Kalogirou, Charis A1 - Burger, Maximilian A1 - Krebs, Markus A1 - Rosenwald, Andreas A1 - Spahn, Martin A1 - Löser, Andreas A1 - Kocot, Arkadius A1 - Riedmiller, Hubertus A1 - Kneitz, Burkhard T1 - Impact of miR-21, miR-126 and miR-221 as Prognostic Factors of Clear Cell Renal Cell Carcinoma with Tumor Thrombus of the Inferior Vena Cava N2 - Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) characterized by a tumor thrombus (TT) extending into the inferior vena cava (IVC) generally indicates poor prognosis. Nevertheless, the risk for tumor recurrence after nephrectomy and thrombectomy varies. An applicable and accurate prediction system to select ccRCC patients with TT of the IVC (ccRCC/TT) at high risk after nephrectomy is urgently needed, but has not been established up to now. To our knowledge, a possible role of microRNAs (miRs) for the development of ccRCC/TT or their impact as prognostic markers in ccRCC/TT has not been explored yet. Therefore, we analyzed the expression of the previously described onco-miRs miR-200c, miR-210, miR-126, miR-221, let-7b, miR-21, miR-143 and miR-141 in a study collective of 74 ccRCC patients. Using the expression profiles of these eight miRs we developed classification systems that accurately differentiate ccRCC from non-cancerous renal tissue and ccRCC/TT from tumors without TT. In the subgroup of 37 ccRCC/TT cases we found that miR-21, miR-126, and miR-221 predicted cancer related death (CRD) accurately and independently from other clinico-pathological features. Furthermore, a combined risk score based on the expression of miR-21, miR-126 and miR-221 was developed and showed high sensitivity and specificity to predict cancer specific survival (CSS) in ccRCC/TT. Using the combined risk score we were able to classify ccRCC/TT patients correctly into high and low risk cases. The risk stratification by the combined risk score (CRS) will benefit from further cohort validation and might have potential for clinical application as a molecular prediction system to identify high- risk ccRCC/TT patients. KW - forecasting KW - metastasis KW - renal cancer KW - renal cell carcinoma KW - kidneys KW - surgical oncology KW - surgical and invasive medical procedures KW - regression analysis Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113633 ER - TY - THES A1 - Gjorgjevikj, Maja T1 - IL-4 analogues with site-specific chemical modification as screening tools for foldamers T1 - IL-4-Muteine mit ortsspezifische chemische Modifikation als Screening-Tools für Foldamere N2 - The cytokine Interleukin-4 (IL-4) plays a crucial role in the pathophysiology and progression of asthma and other atopic diseases. Its activities are signaled into the cells upon binding to and signaling through a shared receptor complex composed of the subunits IL-4Rα and common γc. Another cytokine, Interleukin-13 shares many functions with IL-4. This can be explained by the fact that both, IL-4 and IL-13, can signal via a shared receptor complex comprising the IL-4R and the IL-13R1 subunit. Therefore, the IL-4Rα receptor subunit has become a highly promising drug target, since it mediates IL-4 and IL-13 responses and blocking IL-4Rα will abrogate IL-4 as well as IL-13 effector functions. Currently, an IL-4 based mutein (Pitrakinra), acting as a dual IL-4/IL-13 receptor antagonist is in clinical development. This work describes the generation and production of biologically active IL-4 muteins, which contain a single additional engineered cysteine. The introduction of a free thiol group allows site-specific chemical modification. The muteins were expressed in E. coli in insoluble form, refolded and purified. The thiol group of the mutein was protected as mixed disulfide with the tripeptide glutathione. A first attempt to chemically reduce the engineered cysteine residue failed, because the three native disulfide bonds of IL-4 exhibit a similar reactivity and chemical reduction of the native disulfide resulted in full deactivation and precipitation of the IL-4 protein. Therefore, an enzymatic approach was developed which specifically reduces the mixed disulfide bonds with an attached glutathion moiety and thus leaves the native structurally essential disulfide bonds unaltered. For optimization, four different IL-4 cysteine muteins with four cysteine residues introduced at positions close to the IL-4Rα binding site were tested and their reduction rates by glutaredoxin was determined. The enzymatic reduction occured at different rates for all four muteins indicating that accessibility is an important influence and must be determined individually for each mutant protein. After optimization of the pH value and particularly the reaction time, all muteins could be prepared with the engineered thiol group being released in reasonable yield. The proteins exhibiting the free thiol group were then modified by N-ethylmaleimide (NEM) or maleimido-PEG. The effects of these modifications at different positions on binding to IL-4R were measured employing SPR biosensor technology. In the second project of this study, foldamers, which represent a new class of stable, compactly folded biomolecules and can specifically interact with proteins and nucleic acids, were examined to identify their potential as new drugs to interfere with IL-4 activities. Fragment-based drug discovery offers great promise for providing new starting points for drug discovery and facilitates the lead optimization. As foldamers equipped with a thiol-group for tethering could not to be produced; only the effect of foldamers present in a synthesized foldamer library on the binding to IL-4R could be tested. Two libraries containing different foldamers based on aromatic amide were synthesized by Michael Grotz and Dr. Michael Deligny and tested in our lab for their capability to disrupt the ligand-receptor interaction of IL-4 and its receptor IL-4Rα [ECD] using surface plasmon resonance technology. None of the studied foldamers could specifically inhibit the IL-4/IL-4Rα interaction. Some foldamers showed non-specific binding. The study presented here shows the design and production of a potentially new type of IL-4 antagonists, which employ site-specific chemical modification to exert their antagonistic function. N2 - Das Zytokin Interleukin-4 (IL-4) spielt eine entscheidende Rolle in der Entstehung und Pathophysiologie von Asthma und anderen atopischen Krankheiten. Seine Aktivitäten können in die Zelle durch die Bindung an einen Rezeptorkomplex übertragen werden, welcher aus den Untereinheiten IL-4Rα und γc besteht. Interleukin-13 (IL-13), ein verwandtes Zytokin, und IL-4 besitzen viele gemeinsame Funktionen. Das kann dadurch erklärt werden, dass IL-4 wie auch IL-13 ihre Signale über einen gemeinsamen Rezeptorkomplex übertragen können, der aus der IL-4R und der IL-13R1 Untereinheit besteht. Die IL-4R Untereinheit ist ein vielversprechendes Zielmolekül für die Entwicklung von Pharmaka, da sie IL-4 und IL-13 Reaktionen vermittelt. Durch Blockieren von IL-4R werden die Aktivitäten von IL-4 sowie IL-13 unterdrückt. Ein IL-4 basiertes Doppelmutein (Pitrakinra), welches als Gegenspieler zu IL-4 und IL-13 Rezeptoren fungiert, befindet sich derzeit in der klinischen Entwicklung. In dieser Arbeit wird die Bildung und Produktion von biologisch aktiven IL-4 Muteinen mit einem einzelnen zusätzlich eingefügten Cysteinrest beschrieben. Die Einführung einer freien Thiol-Gruppe ermöglicht ortsspezifische chemische Modifizierungen. Ein „Tethering“ Ansatz sollte dann auch eine sehr schwach Bindung von thiol-reaktiven Verbindungen an IL-4 messbar machen. Die Muteine wurden in unlöslicher Form in E. coli exprimiert, zurückgefaltet und auf gereinigt. Dabei wurde die Thiolgruppe des Muteins als Disulfid mit dem Tripeptid Glutathion geschützt. Erste Versuche gezielt den eingeführten Cysteinrest selektiv chemisch zu reduzieren schlugen fehl, da die drei proteineigenen Disulfidbrücken von IL-4 eine ähnliche Reaktivität zeigten, und die Reduktion zur vollständigen Desaktivierung und Fällung des IL-4 Proteins führte. Daher wurde ein enzymatischer Ansatz entwickelt, der gezielt die Disulfidbrücke zum Glutathionrest reduziert und die proteineigenen strukturell essentiellen Disulfidbrücken unverändert lässt. Zur Optimierung wurden vier verschiedene IL-4 Cystein-Muteine mit Cysteinresten an verschiedenen Positionen nahe der IL-4Rα Bindungsstelle getestet und die Reduktionsgeschwindigkeit in Gegenwart von Glutaredoxin bestimmt. Die enzymatische Reduktion verlief für alle vier Muteine mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Dies deutet darauf hin, dass die Zugänglichkeit der Disulfidgruppe einen wichtigen Einfluss besitzt. Die Reduktionsbedingungen mussten daher für jedes Mutein neu bestimmt werden. Nach Optimierung des pH Wertes und insbesondere der Reaktionszeit konnten alle Muteine mit einer freien Thiolgruppe in angemessener Ausbeute erhalten werden. Die Proteine mit jeweils einer freien Thiolgruppe wurden daraufhin mit N-Ethylmaleinimid (NEM) oder Maleimido-PEG modifiziert. Die Effekte der Modifizierung an verschiedenen Positionen des IL-4 auf die Bindung an IL-4R wurden mit Hilfe der SPR-Spektroskopie (Oberflächen Plasmon Resonanz Spektroskopie) gemessen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion von Foldameren mit der IL-4Ra Rezeptorkette untersucht. Foldamere stellen eine neue Klasse von stabilen, kompakt gefalteten Biomolekülen dar, die möglicherweise spezifisch mit Proteinen und Nukleinsäuren wechselwirken können. Es sollten Vorversuche durchgeführt werden um zu sondieren, ob aus Foldameren Hemmstoffe für IL-4 und IL-13 entwickelt werden können. Da Foldamere mit einer Thiolgruppe zur Anbindung (Tethering) an IL-4 nicht hergestellt werden konnten, wurden zunächst nur nichtreaktive Foldamare aus einer synthetisierten Foldamer-Bibliothek getestet. Zwei Bibliotheken mit verschiedenen auf aromatischen Amiden basierenden Foldameren wurden von Michael Grotz und Dr. Michael Deligny synthetisiert und von mir mit Hilfe der SPR Spektroskopie auf ihre Fähigkeit getestet, die Ligand-Rezeptor Wechselwirkung von IL-4 und derIL-4Rα Rezeptoruntereinheit zu unterbinden. Keines der untersuchten Foldamere konnte die IL-4/IL-4Rα Wechselwirkung spezifisch hemmen. Einige Foldamere zeigten eine unspezifische Bindung. Die hier dargestellten Studien zeigen das Design und die Herstellung eines potentiell neuen Typs von Gegenspieler zu IL-4, welcher ortsspezifische chemische Modifikationen ausnutzt um seine antagonistische Funktion zu erfüllen. KW - Il 4 KW - Foldamere KW - Modifizierung KW - Foldamers KW - PEG chemical modification KW - Zutokin KW - chemische Modifizierung KW - SPR-Spektroskopie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113531 ER -