TY - THES A1 - Riedinger, Verena T1 - Landscape-scale spillover of pollinators from oil-seed rape to crop and semi-natural habitats on different temporal scales T1 - Landschafts-Spillover von Bestäubern aus Raps auf ackerbaulich genutzte und naturnahe Habitate auf verschiedenen zeitlichen Ebenen N2 - Organisms use different resources in different habitat types during their life cycle. Thereby, they connect habitats and provide ecosystem services or disservices in several habitat types. In agricultural landscapes, the spillover of organisms, i.e. movement of an organism and its function from one habitat to another, especially from semi-natural to managed habitats, is one of the most important processes that influence population dynamics and community composition. Importantly, spillover connects habitats not only spatially, but also on different temporal scales, because availability of resources changes over time in agricultural landscapes, e.g. by mass-flowering events of crops, harvesting or crop rotation. Most often, semi-natural habitats are seen as beneficial source of organisms, but also managed habitats can provide valuable resources, and thereby initiate spillover to other habitats. Mass-flowering crops, like oil-seed rape, are such valuable feeding resources for pollinators, and pollinators might spillover from oil-seed rape to other habitats which provide alternative foraging resources. The focus of this dissertation was to evaluate the influence of oil-seed rape on pollinators in agricultural landscapes by studying effects (1) on different temporal scales (from effects during the flowering period of oil-seed rape, Chapter II & IV, to intermediate effects on a second mass-flowering crop, Chapter III, to spillover effects to the flowering period in the next year, Chapter IV), (2) semi-natural (Chapter II) and crop (Chapter III, IV) habitats, and (3) on various pollinator groups which differ in their life cycle (Chapter II, III, IV). In this dissertation effects from oil-seed rape on all temporal scales – in the short term during mass-flowering and in the long term on a late-flowering crop and even in the next year on oil-seed rape fields ─ were found. These effects might be important for crop and wild plant pollination, and pollinator conservation. Importantly, the effects on different temporal scales depend on the considered habitat (managed or different semi-natural habitats) and on the investigated pollinator group. The more pollinators match the flowering period of oil-seed rape in their activity period and the more dependent they are on flowering resources in their life cycle, the more pronounced are their responses. Effects were found for wild bees, but not for hoverflies and honey bees. Moreover, the availability of semi-natural habitats in the landscape is important and may modulate effects from oil-seed rape. The longevity of effects of oil-seed rape shows the importance of including several temporal scales into ecosystem-service studies, not only for pollinators, but also for other ecosystem-service providing species groups. N2 - Organismen nutzen während ihres Lebens verschiedene Ressourcen in unterschiedlichen Habitaten. Dabei verbinden sie Habitate miteinander und erbringen positive oder negative Ökosystemdienstleistungen in verschiedenen Habitattypen. In Agrarlandschaften ist der „Spillover“ von Organismen, d.h. die Bewegung von Organismen und die gleichzeitige Verschiebung ihrer Funktion von einem Habitat in ein anderes, insbesondere von naturnahen Habitaten hin zu landwirtschaftlich genutzten Habitaten, einer der wichtigsten Prozesse, die die Populationsdynamik und Zusammensetzung von Gemeinschaften beeinflussen. Zu betonen ist, dass Spillover Habitate nicht nur räumlich, sondern auch auf unterschiedlichen zeitlichen Skalen verbindet, da sich die Verfügbarkeit von Ressourcen in Agrarlandschaften über die Zeit, z.B. durch die Massenblüte von Feldfrüchten, die Ernte oder die Fruchtfolge, verändert. Meist werden naturnahe Habitate als wertvolle Quelle von Organismen betrachtet, aber auch landwirtschaftlich genutzte Habitate können wertvolle Ressourcen zur Verfügung stellen und damit den Spillover von Organismen in andere Habitate initiieren. Massentrachten, wie Raps, sind solche wertvollen Ressourcen für Bestäuber. Bestäuber können von Rapsfeldern auf andere Habitate überschwappen, die ihnen alternative Futterquellen bieten. Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt auf der Beurteilung des Einflusses von Raps auf Bestäuber in Agrarlandschaften anhand der Betrachtung von Effekten (1) auf unterschiedlichen zeitlichen Ebenen (von Effekten während der Blühperiode des Rapses, Kapitel II & IV, über mittelfristige Effekte auf eine zweite blühende Feldfrucht, Kapitel III, bis hin zu Spillover-Effekten in die Blühperiode des nächsten Jahres, Kapitel IV), (2) in naturnahen (Kapitel II) und landwirtschaftlich genutzten (Kapitel III, IV) Habitaten und (3) für unterschiedliche Bestäubergruppen, die sich in ihrem Lebenszyklus unterscheiden (Kapitel II, III, IV). In dieser Dissertation wurden Effekte von Raps auf allen untersuchten zeitlichen Ebenen gefunden – sowohl kurzfristig während der Rapsblüte als auch langfristig in einer spätblühenden Massentracht und sogar im nächsten Jahr während der Rapsblüte. Diese Effekte können Folgen für die Bestäubung von Kultur- und Wildpflanzen und auch für den Schutz von Bestäubern haben. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass die Effekte auf unterschiedlichen zeitlichen Ebenen abhängig von dem untersuchten Habitat (landwirtschaftlich genutzte, verschiedene naturnahe Habitate), sowie der untersuchten Bestäubergruppe sind. Je mehr die Bestäuber in ihrer Aktivitätsperiode mit der Blütezeit von Raps übereinstimmen und je mehr sie auf Blütenressourcen in ihrem Lebenszyklus angewiesen sind, umso größer scheint ihre Reaktion. Effekte wurden für Wildbienen, nicht aber für Schwebfliegen und Honigbienen gefunden. Darüber hinaus ist auch die Verfügbarkeit von naturnahen Habitaten in der Landschaft wichtig und kann die Effekte des Rapses beeinflussen. Die Langlebigkeit der Effekte von Raps zeigt die Bedeutung der Integration von unterschiedlichen zeitlichen Ebenen in die Untersuchung von Ökosystem-Dienstleistungen, nicht nur für Bestäuber, sondern auch für andere Artengruppen, die Ökosystem-Dienstleistungen erbringen. KW - Raps KW - Bestäuber KW - Bienen <Überfamilie> KW - Ackerrandstreifen KW - Schwebfliegen KW - mass-flowering crops KW - semi-natural habitats KW - temporal spillover KW - Massentrachten KW - naturnahe Habitate KW - zeitlicher Spillover KW - sunflowers KW - Sonnenblumen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96844 N1 - Kapitel IV. ist mittlerweile in einer überarbeiteten Version veröffentlicht als: V. Riedinger, O. Mitesser, T. Hovestadt, I. Steffan-Dewenter, A. Holzschuh (2015). Annual dynamics of wild bee densities: attractiveness and productivity effects of oilseed rape. Ecology 96:1351-1360. ER - TY - THES A1 - Wende, Beate T1 - Diversity of saproxylic beetles and host tree specialisation in differently managed forests across Germany T1 - Artenvielfalt und Wirtsbaumartenspezialiserung totholzbewohnender Käfer in verschiedenen Wäldern Deutschlands N2 - Chapter I The gradual turnover of dead organic material into mineral nutrients is a key ecological function, linking decomposition and primary production, the essential parts of the nutrient-energy cycle. However, disturbances in terms of species or resource losses might impair the equilibrium between production and decomposition. Humanity has converted large proportions of natural landscapes and intensified land-use activity for food production. Globally, only very few areas are totally unaffected by human activity today. To ensure the maintenance of both essential ecosystem services, knowledge about the interplay of biodiversity and ecosystem functioning as well as effects of intensified management on both is crucial. The vast majority of terrestrial biomass production as well as decomposition take place in forest ecosystems. Though forestry has a long sustainable history in Europe, its intensification during the last century has caused severe impacts on forest features and, consequently, on the associated biota, especially deadwood dependent organisms. Among these, saproxylic beetles are the most diverse group in terms of species numbers and functional diversity, but also most endangered due to habitat loss. These features classify them as ideal research organisms to study effects of intensified forestry on ecosystem services. The BELONGDEAD project located in Germany aimed to investigate deadwood decay and functional consequences of diversity changes in the associated fauna on the decomposition process from the initialisation of deadwood decay to complete degradation. As part of the BeLongDead project, this dissertation focussed on saproxylic beetle species, thereby evaluating (1) regionally effects of tree species identity of fresh deadwood and (2) forest management of varying intensities on the diversity, abundance and community composition of saproxylic beetles (chapter II); (3) the specialisation degree of different trophic guilds of saproxylic beetles, and thus the stability and robustness of their interaction networks against disturbances (chapter III); (4) the impact of environmental features of local to regional spatial scales on species richness of saproxylic beetles differing in their habitat niche in terms of deadwood decay stages (chapter IV). Chapter II The vast majority of European forest ecosystems have been anthropogenically affected, leaving less than 1% of the about 1 milliard hectare as natural forests. A long history of forestry and especially the technological progress during the last century have caused massive habitat fragmentation as well as substantial loss of essential resources in European forest ecosystems. Due to this, the substrate-dependent group of saproxylic beetles has experienced severe species losses. Thus, investigations concerning saproxylic diversity and deadwood volume were badly needed. However, the importance of different deadwood in terms of tree species identity for the colonization by saproxylic beetles under different local and regional management regimes is poorly understood. Therefore, we studied possible regional differences in colonization patterns of saproxylic beetle species in a total of 688 fresh deadwood logs of 13 tree species in 9 sites of managed conifer and beech forests, and unmanaged beech forests, respectively. We found that tree species identity was an important driver in determining saproxylic species composition and abundance within fresh deadwood. However, saproxylic species showed different colonization patterns of deadwood items of the same tree species among the study regions. Regionally consistent, conifer forests were most diverse. We attribute the latter result to the historically adaption of saproxylic beetle species to semi-open forests, which conditions are actually best reflected by conifer forests. To preserve a diverse local species pool of early successional saproxylic beetles, we suggest an equal high degree of deadwood diversity in a tree species context in due consideration of regional differences. Chapter III The extinction risk of a particular species corresponds with its species-specific requirements on resources and habitat conditions, in other words with the width of the species` ecological niche. Species with a narrow ecological niche are defined as specialists. Members of this group experience higher extinction risk by resource limitation than generalists, which are able to utilize a variety of resources. For the classification of species as specialists or generalists, thus evaluating possible extinction risks, ecologists use the concept of interaction networks. This method has often been applied for mutualistic or antagonistic plant-animal interactions, but information for networks of detritivores is scarce. Therefore, saproxylic beetle species sampled as described in chapter II were categorised according to their larval diet; additionally their interaction networks (N=108) with 13 dead host tree species were analysed. Specialisation degree was highest for wood-digesting beetles and decreased with increasing trophic level. Also the network indices evaluating robustness and generality indicated a higher susceptibility to species extinctions for xylophagous than for mycetophagous and predatory beetles. The specialisation of xylophagous species on specific tree species might be an adaption to tree species specific ingredients stored for defence against pathogens and pests. However, we conclude that the high specialisation degree of xylophages and thus their higher extinction risk by resource loss harbours certain dangers for ecosystem function and stability as species diversity is positively linked to both. Chapter IV Populations depend on individual emigration and immigration events to ensure genetic exchange. For successful migration it is of utmost importance that spatially separated populations are obtainable by specimen. Migratory success depends on the one hand on the species dispersal abilities and on the other on the availability of suitable habitats in the surrounding landscape in which the distinct host populations exist. However, consequences of intensive forest management correspond not only to severe reduction of local deadwood amount, but, among others, also a change in tree species composition and high levels of fragmentation in the surrounding forest area. Saproxylic beetle species differ in their dispersal behaviour according to the temporal availability of their preferred habitat. Generally, early successional saproxylic beetles are able to disperse over large distances, whereas beetles inhabiting advanced decayed wood often remain close to their larval habitat. Due to this, environmental factors might affect saproxylic beetle guilds differently. We classified the saproxylic beetles sampled as described in chapter II according to their calculated habitat niche as early, intermediate or late successional saproxylic beetles. For the different guilds the effects of 14 environmental factors on different spatial scales (stand factors at 0.1 km radius, landscape composition at 2 km radius, and regionally differing abiotic factors in 400 km to 700 km distance) were investigated. Consistently for all guilds, species richness decreased with fragmentation at local and landscape scale, and increased in warmer climate. However, we found contradictory results between the guilds to some extent. We relate this to guild specific habitat requirements of the saproxylic beetles. Therefore, for the development of appropriate conservation practices guild-specific requirements saproxylic beetles have to be considered not only locally but on larger spatial scales. Chapter V In conclusion, this dissertation identified main drivers of early successional saproxylic beetle species richness on various spatial scales. Our results emphasize the importance to develop management schemes meeting species-specific and guild-specific habitat requirements of the saproxylic beetle fauna at relevant spatial and temporal scales. Therefore, short-term actions suggested for sustainable forest management should be the focus on a diverse tree species composition consisting of indigenous tree species with respect to regional differences. Moreover, senescent trees, fallen and standing deadwood should remain in the forests, and some tree individuals should be allowed to grow old. Long-term actions should involve the reduction of forest fragmentation and the connection of spatial widely separated forest fragments. Furthermore, to fully understand the effects of forest management long-term research should be conducted to compare habitat requirements of intermediate and late successional beetles with the results presented in this dissertation. N2 - Kapitel I Die Mineralisierung von toter organischer Materie nimmt eine Schlüsselfunktion innerhalb eines Ökosystems ein, da sie die beiden essentiellen Komponenten des Energie-Nährstoff-Zyklus - Zersetzung und Primärproduktion - miteinander verbindet. Anthropogen bedingte Störungen wie z.B. Arten-, oder Ressourcenverluste können jedoch das Gleichgewicht zwischen den beiden wichtigen Ökosystemdienstleistungen Produktion und Abbau aus der Balance bringen. Um die Nahrungsversorgung der Menschheit zu gewährleisten, wurde bereits ein großer Teil der Natur in Agrarflächen umgewandelt und die Produktion durch intensive Bewirtschaftungsformen gesteigert. Weltweit gibt es nur noch wenige Gebiete ohne menschliche Beeinflussung. Um dauerhaft essentielle Ökosystemdienstleistungen zu gewährleisten, sind Kenntnisse über die Auswirkungen von intensiver Bewirtschaftung auf das Zusammenspiel zwischen Artenvielfalt und Ökosystemfunktionen unabdingbar. Der größte Teil der terrestrischen Biomasseproduktion wird von Wäldern geleistet. Obwohl die Waldbewirtschaftung in Europa lange Zeit nachhaltig war, wirkte sich deren Intensivierung während des letzten Jahrhunderts massiv auf die Waldstruktur und die damit assoziierte Fauna aus. Besonders betroffen sind die obligatorisch an Totholz gebundenen Organismen. Innerhalb der Totholzfauna sind xylobionte Käfer eine artenreiche und funktional hoch diverse Gruppe, doch aufgrund von Lebensraumverlusten sind viele Arten stark bedroht. All diese Eigenschaften klassifizieren Totholzkäfer zu idealen Forschungsobjekten, um die Auswirkungen von intensiver Waldbewirtschaftung auf Ökosystemfunktionen zu untersuchen. Das BELONGDEAD-Projekt hat als Ziel, die funktionalen Auswirkungen von Veränderungen in der Artengemeinschaft auf die Abbauraten von Totholz zu analysieren. Der Untersuchungszeitraum des in Deutschland beheimateten Projekts umfasst die Initialisierung des Zersetzungsprozesses bis zum vollständigen Abbau von experimentell ausgelegten Totholzstämmen unterschiedlicher Baumarten. Als Teil des BELONGDEAD-Projekts lag der Fokus der vorliegenden Dissertation auf der Totholzkäferfauna. Wir untersuchten (1) regionale Effekte der Baumartenzugehörigkeit von frischem Totholz und (2) die Auswirkungen von Waldbewirtschaftung unterschiedlicher Intensität auf die Artenvielfalt, Abundanz und Struktur der Artengemeinschaften von totholzbewohnenden Käfern (Kapitel II); (3) den Spezialisierungsgrad verschiedener trophischer Gilden von Totholzkäfern, sowie die Stabilität und Robustheit ihrer jeweiligen Netzwerke gegen Störungen (Kapitel III); (4) den Einfluss von Umweltfaktoren auf die Artenvielfalt xylobionter Käfergilden auf mehreren räumlichen Skalen. Kapitel II Der Großteil der europäischen Wälder ist anthropogen beeinflusst. In Europa bilden Naturwälder weniger als 1% der gesamten Waldfläche von ca. 1 Mrd. Hektar. Traditionelle Waldbewirtschaftung und vor allem der technologische Fortschritt des letzten Jahrhunderts fragmentierten die Waldfläche in hohem Maß, und verursachten beträchtliche Verluste an lebensnotwendigen Ressourcen. Besonders innerhalb der obligatorisch an Totholz gebundenen Gruppe der xylobionten Käfer verzeichnete man einen rasanten Artenrückgang. Daher gab es einen großen Bedarf an Studien, die Untersuchungen zur Mindestmenge an lokal vorhandenem Totholz zur Sicherung der xylobionten Artenvielfalt durchführten. Wenig beachtet wurde bisher jedoch die Bedeutung der Baumartenzugehörigkeit von Totholz für die Besiedlung durch xylobionter Käfer in verschiedenen Waldbewirtschaftungssystemen auf lokaler und regionaler Ebene. Wir untersuchten daher mögliche Unterschiede zwischen 3 Regionen im Besiedlungsmuster xylobionter Käfer bei insgesamt 651 experimentell ausgelegten Baumstämmen in einem frühen Sukzessionsstadium von 13 Baumarten auf jeweils 9 Untersuchungsflächen in bewirtschafteten Buchen- und Nadelwäldern, sowie in unbewirtschafteten Buchenwäldern. Bei den ausgelegten Totholzstämmen war die Baumartenzugehörigkeit ausschlaggebend für die Struktur der Artengemeinschaften und Abundanzen xylobionter Käfer. Aufgrund der unterschiedlichen regionalen Artenpools divergierten die Besiedlungsmuster xylobionter Käferarten von Totholz der gleichen Baumart in den verschiedenen Regionen stark voneinander. In allen Regionen zeigten die Totholzkäfer in Nadelwäldern die höchste Artenvielfalt. Dieses Ergebnis lässt sich auf die - historisch bedingte - Anpassung der Totholzkäferfauna an eine halboffene Waldstruktur zurückführen, die derzeit am besten durch Nadelwälder widergespiegelt wird. Um eine diverse lokale Artengemeinschaft xylobionter Käfer zu gewährleisten ist eine große Variabilität vom baumartspezifischen Totholz unabdingbar, wobei regionale Unterschiede in Betracht gezogen werden müssen. Kapitel III Das Aussterberisiko einer Art ist abhängig von den artspezifischen Ansprüchen an ihre Umwelt und den dort vorkommenden Ressourcen –auch definiert als die ökologische Nische der betrachteten Art. Arten mit geringer Nischenbreite sind per definitionem Spezialisten. Mitglieder dieser Gruppe stehen durch Verarmung ihres Ressourcenangebots unter einem höheren Aussterberisiko als Generalisten, die eine größere Variabilität in ihrem Ressourcenspektrum aufweisen. Interaktionsnetzwerke dienen in der Ökologie als wichtiges Werkzeug um das Aussterberisiko spezifischer Arten zu bewerten und eine Einteilung hinsichtlich Spezialist oder Generalist vorzunehmen. Bei mutualistischen oder antagonistischen Tier-Pflanzen-Interaktionen ist diese Methode etabliert, doch für die Gruppe der Zersetzer ist das Netzwerk-Konzept bisher nur sporadisch angewandt worden. Daher teilten wir die xylobionten Käferarten, die im Rahmen des in Kapitel II beschriebenen Experiments gesammelt wurden, anhand ihres larvalen Ernährungstyps in drei trophische Gilden (Xylophage, Mycetophage und Räuber) ein; anschließend wurden ihre Interaktionsnetzwerke (N= 108) mit den 13 Wirtsbaumarten analysiert. Rein xylophage Arten wiesen den höchsten Spezialisierungsgrad auf, der mit zunehmendem trophischem Grad geringer wurde. Die Netzwerkparameter Robustheit und Generalität ließen ebenfalls auf eine höhere Anfälligkeit für Artenverluste bei xylophagen als bei mycetophagen oder räuberischen Arten schließen. Die Spezialisierung xylophager Arten auf spezifische Baumarten ist möglicherweise eine Adaption an artenspezifische sekundäre Inhaltsstoffe, die als Schutz vor Schädlingen und Krankheitserregern in Holz und Rinde gespeichert werden. Der hohe Spezialisierungsgrad xylophager Käfer bedingt ein höheres Aussterberisiko bei Ressourcenverlust. Dies würde die Stabilität des Ökosystems und dessen Ökosystemfunktionen nachhaltig schwächen da eine hohe Artenvielfalt Garant für ein funktionierendes Ökosystem ist. Kapitel IV Individuelle Immigrations- und Emigrationsereignisse sind für die Sicherstellung des genetischen Austauschs zwischen Populationen essentiell. Daher ist von größter Wichtigkeit, dass die räumliche Distanz zwischen Populationen von den zu- oder abwandernden Individuen überwunden werden kann. Der Migrationserfolg ist dabei zum einen von der artspezifischen Ausbreitungsfähigkeit, und zum anderen von der Verfügbarkeit an geeigneten Habitaten in der Umgebung der Populationen abhängig. Die Folgen intensiver Waldbewirtschaftung sind jedoch nicht nur ein drastische Verminderung des lokalen Totholzvolumens, sondern unter anderem auch die Veränderung der Baumartengesellschaften, sowie hochgradige Fragmentierung der Waldflächen und der umgebenden Landschaft. Xylobionte Käferarten unterscheiden sich in ihrem Ausbreitungsverhalten hinsichtlich der zeitlichen Verfügbarkeit ihres bevorzugten Habitats. Im Allgemeinen können Besiedler früher Sukzessionsstadien weite Strecken überwinden, wohingegen Bewohner von Alttotholzstrukturen meist nahe ihrem Ursprungshabitat verbleiben. Dies legt die Vermutung nahe, dass Umweltparameter verschieden auf unterschiedliche Habitatgilden einwirken. Um diese Vermutung zu überprüfen, wurde für die gesammelten xylobionten Käferarten ihre jeweilige Habitatnische berechnet. Wir klassifizierten die Arten als Besiedler von entweder frühen, mittleren oder alten Totholzstrukturen. Für jede Gilde wurde der Einfluss von 14 Umweltparametern auf verschiedenen räumlichen Skalen - Standortfaktoren der Untersuchungsfläche (Radius: 100 m), Landschaftsparameter im Umkreis von 2 km der Untersuchungsfläche, sowie regionenspezifische abiotische Faktoren (Distanz zwischen den Regionen: 400 – 700 km) - untersucht. Bei starker lokaler und landschaftlicher Fragmentierung nahmen die Artenzahlen in den xylobionten Gilden ab, während sich höhere Jahresdurchschnittstemperatur positiv auf die Artenvielfalt auswirkte. Jedoch gab es hatten nicht alle Umweltfaktoren den gleichen Effekt auf die Gilden. Wir führen dies auf die unterschiedlichen Habitatansprüche der xylobionten Gilden zurück. Um adäquate Schutzmaßnahmen für Totholzkäfer zu entwickeln, müssen die spezifischen Habitatansprüche der verschiedenen xylobionten Gilden, nicht nur auf lokaler, sondern auch auf größeren räumlichen Ebenen in die Planungen miteinbezogen werden. Kapitel V In der vorliegenden Dissertation konnte ich wichtige Triebfedern der Artenvielfalt xylobionter Käfer identifizieren. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit der Entwicklung von nachhaltigen Waldbewirtschaftungskonzepten, die den art- und gildenspezifischen Anforderungen xylobionter Käfer an den Lebensraum auf den relevanten räumlichen und zeitlichen Skalen gerecht werden. Kurzfristige Maßnahmepläne für eine nachhaltige Forstwirtschaft sollte die Förderung von Mischwäldern mit einer vielfältigen Baumartengemeinschaft mit standortgemäßen einheimischen Hölzern unter Berücksichtigung regionaler Besonderheiten beinhalten. Alte Bäume, sowie liegendes und stehendes Totholz sollten im Wald verbleiben und einzelne Bäume aus der Nutzung genommen werden um die Strukturen altgewachsener Bäume langfristig zu gewährleisten. Langfristige Ziele sind die Verringerung der Waldfragmentierung und das Anlegen von Biotopverbundsystemen, um weit auseinanderliegende Waldflächen wieder miteinander zu verbinden. Um die Auswirkungen kommerzieller Forstwirtschaft im vollen Umfang zu erfassen, sind Langzeitstudien notwendig die die Habitatansprüche xylobionter Käfer aus mittleren und alten Totholzsukzessionsstadien mit den Ergebnissen der vorliegenden Dissertation vergleichen. KW - Saproxylophage KW - Käfer KW - Ökosystem KW - Saproxylic beetles KW - temperate forests KW - Deutschland KW - Wald KW - saproxylic Coleoptera KW - Forest management KW - Diversity Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107049 ER - TY - THES A1 - Kirscher, Lorenz T1 - Melanogene rekombinante Vaccinia-Viren als diagnostisches und therapeutisches Agenz zur Tumorbehandlung T1 - Melanogenic recombinant Vaccina Viruses as diagnostic and therapeutic agent for tumor treatment N2 - Die gängigen therapeutischen Behandlungsmethoden für die verschiedensten Krebserkrankungen zeigen nach wie vor Mängel bezüglich der Effizienz sowie zahlreiche Nebenwirkungen während und nach der Behandlung. Maßgeblich für diese Defizite ist die teilweise geringe Sensitivität der meisten konventionellen diagnostischen Systeme und damit einhergehend die oftmals zu späte Identifikation entarteter Gewebsbereiche. Zur Lösung dieser Problematik bieten onkolytische Vaccinia-Viren einen Ansatz, sowohl die Effizienz der Therapie wie auch die Diagnostik zu verbessern. In beiden Fällen sind die Tumorzell-spezifische Vermehrung der Viren und die Möglichkeit entscheidend, die Viren als Vektorsystem zur Expression therapeutischer oder diagnostischer Fremdgenkassetten zu nutzen. Um ein auf Vaccinia-Virus-basierendes Reportersystem zum diagnostischen Nachweis von Krebszellen mittels Tiefengewebs-Tomographie bereit zu stellen, wurden die für die murine Tyrosinase (mTyr) und das Tyrosinase-Helferprotein 1 (Tyrp1) kodierenden Gene in das Genom eines onkolytischen Vaccinia-Virus inseriert. Die Tyrosinase ist das Schlüsselenzym der Melaninsynthese. Bereits die solitäre Expression der Tyrosinase führt in der transformierten Zelle zur Melaninproduktion. Das Tyrosinase-Helferprotein 1 ist an der Prozessierung und Stabilisierung der Tyrosinase beteiligt. Bereits in verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass Melanin als Reportermolekül für die Magnetresonanz sowie für die multispektrale optoakustische Tomographie einsetzbar ist. Es wurde deswegen angestrebt, die Kombination aus dem therapeutischen Potential des onkolytischen Vaccinia-Virus und der diagnostischen Anwendung des Melanins als Reporter auszunutzen. Sämtliche in dieser Arbeit aufgeführten rekombinanten Vaccinia-Viren (rVACV) wurden von der Firma Genelux Corporation zur Verfügung gestellt und in dieser Arbeit hinsichtlich der therapeutischen Effizienz und des diagnostischen Potentials untersucht. In ersten Zellkultur-Versuchen wurde anhand verschiedener konstitutiv melanogener rVACV-Konstrukte festgestellt, dass die Kombination aus dem Vaccinia-Virus-spezifischen synthetic early/late Promotor und dem Enzym Tyrosinase (GLV-1h327) bzw. den Enzymen Tyrosinase und Tyrosinase-Helferprotein 1 (GLV-1h324) die höchste Melaninsynthese-Rate zeigte. Anschließend wurde mittels der Bestimmung der spektralen Absorption und der Enzymaktivität der viral kodierten Melanin synthetisierenden Enzyme sowie mikroskopischer Analysen gezeigt, dass es mit diesen auf 8 Vaccinia-Virus-basierenden melanogenen Reportersystemen möglich ist, die Melaninsynthese in nicht-melanogenen Zellen zu induzieren. Anhand elektronenmikroskopischer Untersuchungen in Zellkultur und ex vivo konnte gezeigt werden, dass die nach rVACV-Infektion stattfindende Melaninsynthese in den Lysosomen der Wirtszelle abläuft. Eine Analyse der atomaren Zusammensetzung des viral vermittelten Melanins ergab, dass es sich um eine Mischform aus Eu- und Phäomelanin handelt. Dieser Melanin-Mix ähnelte dem Melanin aus Haut und Augen, jedoch lagen an Melanin-gebundene Metallionen in erhöhtem Maß vor... N2 - The common therapeutic approaches available to treat various cancers still have deficiencies concerning their efficiency and side effects. Decisive for these deficiencies is the poor sensitivity of most of the conventional diagnostic systems and associated with that the late, sometimes too late, identification of tumorous tissue. The oncolytic vaccinia virus is an opportunity to enhance the efficiency of both the therapy and the diagnosis of tumor tissue. In both cases, the specificity for tumor cells and the simplicity of inserting foreign gene cassettes into the viral genome are key factors. The genes encoding murine tyrosinase (mTyr) and tyrosinase related protein 1 (Tyrp1) were inserted into the genome of an oncolytic vaccinia virus. Tyrosinase is the key enzyme during melanogenesis and expression of this enzyme alone can lead to melanin production. Tyrp1 is involved in processing and stabilizing tyrosinase. Various studies have demonstrated melanin to be an excellent reporter molecule for MRI (magnetic resonance imaging) and MSOT (multispectral optoacoustic tomography). Therefore, melanogenic oncolytic vaccinia viruses were constructed to combine the therapeutic potential of this virus with diagnostic abilities of melanin. All recombinant vaccinia viruses (rVACV) mentioned were kindly provided by Genelux Corporation. In this thesis, we tested for their therapeutic efficiency and diagnostic potential. Initial cell culture experiments have shown that the combination of vaccinia virus-specific synthetic early/late promoter and the melanogenic enzyme tyrosinase (GLV-1h327) or the enzymes mTyr and Tyrp1 (GLV-1h324) have the highest melanin synthesis rate. It was observed that the infection of non-melanin producing cells with an rVACV-based melanogenic reporter system resulted in melanogenesis. Electron microscopy showed that the viral associated melanogenesis is localized in the lysosomes of the infected host cell. The atomic composition analysis of the virus-mediated melanin molecules revealed a mixture of eu- and pheomelanin. The virus-associated melanin is comparable to that in the skin and eye but showed higher amounts of melanin-bound metal ions. ... KW - Melanin KW - Vaccinia Virus KW - Onkolyse KW - MSOT KW - MRT KW - Tyrosinase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112074 ER - TY - THES A1 - Luibl [née Hermann], Christiane T1 - The role of the neuropeptides NPF, sNPF, ITP and PDF in the circadian clock of Drosophila melanogaster T1 - Die Rolle der Neuropeptide NPF, sNPF, ITP und PDF in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster N2 - Organisms have evolved endogenous clocks which allow them to organize their behavior, metabolism and physiology according to the periodically changing environmental conditions on earth. Biological rhythms that are synchronized to daily changes in environment are governed by the so-called circadian clock. Since decades, chronobiologists have been investigating circadian clocks in various model organisms including the fruitfly Drosophila melanogaster, which was used in the present thesis. Anatomically, the circadian clock of the fruitfly consists of about 150 neurons in the lateral and dorsal protocerebrum, which are characterized by their position, morphology and neurochemistry. Some of these neurons had been previously shown to contain either one or several neuropeptides, which are thought to be the main signaling molecules used by the clock. The best investigated of these neuropeptides is the Pigment Dispersing Factor (PDF), which had been shown to constitute a synchronizing signal between clock neurons as well as an output factor of the clock. In collaboration with various coworkers, I investigated the roles of three other clock expressed neuropeptides for the generation of behavioral rhythms and the partly published, partly unpublished data are presented in this thesis. Thereby, I focused on the Neuropeptide F (NPF), short Neuropeptide F (sNPF) and the Ion Transport Peptide (ITP). We show that part of the neuropeptide composition within the clock network seems to be conserved among different Drosophila species. However, the PDF expression pattern in certain neurons varied in species deriving from lower latitudes compared to higher latitudes. Together with findings on the behavioral level provided by other people, these data suggest that different species may have altered certain properties of their clocks - like the neuropeptide expression in certain neurons - in order to adapt their behavior to different habitats. We then investigated locomotor rhythms in Drosophila melanogaster flies, in which neuropeptide circuits were genetically manipulated either by cell ablation or RNA interference (RNAi). We found that none of the investigated neuropeptides seems to be of equal importance for circadian locomotor rhythms as PDF. PDF had been previously shown to be necessary for rhythm maintenance in constant darkness (DD) as well as for the generation of morning (M) activity and for the right phasing of the evening (E) activity in entrained conditions. We now demonstrate that NPF and ITP seem to promote E activity in entrained conditions, but are clearly not the only factors doing so. In addition, ITP seems to reduce nighttime activity. Further, ITP and possibly also sNPF constitute weak period shortening components in DD, thereby opposing the effect of PDF. However, neither NPF or ITP, nor sNPF seem to be necessary in the clock neurons for maintaining rhythmicity in DD. It had been previously suggested that PDF is released rhythmically from the dorsal projection terminals. Now we discovered a rhythm in ITP immunostaining in the dorsal projection terminals of the ITP+ clock neurons in LD, suggesting a rhythm in peptide release also in the case of ITP. Rhythmic release of both ITP and PDF seems to be important to maintain rhythmic behavior in DD, since constantly high levels of PDF and ITP in the dorsal protocerebrum lead to behavioral arrhythmicity. Applying live-imaging techniques we further demonstrate that sNPF acts in an inhibitory way on few clock neurons, including some that are also activated by PDF, suggesting that it acts as signaling molecule within the clock network and has opposing effects to PDF. NPF did only evoke very little inhibitory responses in very few clock neurons, suggesting that it might rather be used as a clock output factor. We were not able to apply the same live-imaging approach for the investigation of the clock neuron responsiveness to ITP, but overexpression of ITP with various driver lines showed that the peptide most likely acts mainly in clock output pathways rather than inter-clock neuron communication. Taking together, I conclude that all investigated peptides contribute to the control of locomotor rhythms in the fruitfly Drosophila melanogaster. However, this control is in most aspects dominated by the actions of PDF and rather only fine-tuned or complemented by the other peptides. I assume that there is a high complexity in spatial and temporal action of the different neuropeptides in order to ensure correct signal processing within the clock network as well as clock output. N2 - Die meisten Organismen haben endogene Uhren entwickelt, mit deren Hilfe sie ihre Verhaltensweisen, ihren Metabolismus und auch ihre Physiologie an die periodisch wechselnden Umweltbedingungen auf unserer Erde anpassen können. Die sogenannten circadianen Uhren steuern dabei biologische Rhythmen, die an täglich wiederkehrende Umweltfaktoren angepasst sind. Schon seit Jahrzehnten wurden diese circadianen Uhren von Chronobiologen in verschiedensten Modellorganismen untersucht. Zu diesen gehört auch die Taufliege Drosophila melanogaster, welche im Rahmen dieser Doktorarbeit Verwendung fand. Anatomisch besteht die circadiane Uhr der Taufliege aus etwa 150 sogenannten Uhrneuronen, die sich im dorsalen und lateralen Protocerebrum der Fliege befinden. Diese können anhand ihrer Position im Gehirn, ihrer Morphologie als auch ihrer neurochemischen Eigenschaften charakterisiert werden. Es wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass einige dieser Uhrneuronen jeweils ein oder mehrere Neuropeptide exprimieren, welche mit großer Wahrscheinlichkeit die wichtigsten Signalmoleküle der Uhr darstellen. Dabei ist der „Pigment Dispersing Factor“ (PDF) wohl das Neuropeptid, welches bisher in Bezug auf seine Funktion in der Uhr die größte Aufmerksamkeit fand. Es ist daher auch das Neuropeptid, das bei Weitem am besten untersucht ist. So wurde bereits gezeigt, dass PDF die Oszillationen der Uhrneuronen untereinander synchronisiert und auch in Ausgangssignalwegen der Uhr zu nachgeschalteten Gehirnregionen eine Rolle spielt. In Zusammenarbeit mit verschiedenen Kollegen, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit untersucht, welche Rolle drei andere Neuropeptide, welche in den Uhrneuronen exprimiert werden, in der Generierung von Verhaltensrhythmen spielen. Der Fokus lag dabei auf der Untersuchung des Neuropeptids F (NPF) des short Neuropeptids F (sNPF) und des Ion Transport Peptids (ITP). Wir konnten für manche dieser Peptide zeigen, dass ihre Verwendung im Uhrnetzwerk unterschiedlicher Drosophila-Arten konserviert zu sein scheint. Im Falle von PDF zeigten sich jedoch Unterschiede in der zellspezifischen Expression in Arten aus südlichen Breitengraden im Vergleich zu Arten aus nördlichen Breitengraden. Zusammen mit ergänzenden Verhaltensdaten anderer Arbeitsgruppen, gehen wir davon aus, dass unterschiedliche Arten bestimmte Eigenschaften ihrer Uhr – wie etwa die Neuropeptid-Expression in bestimmten Zellen – verändert haben, um ihr Verhalten bestmöglich an ihr jeweiliges Habitat anzupassen. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Aktivitätsrhythmik in Fliegen untersucht, in welchen gezielt bestimmte Neuropeptid-Systeme auf genetischem Wege - entweder durch Zellablation oder RNA-Interferenz (RNAi) - manipuliert wurden. Wir konnten zeigen, dass wohl keines der untersuchten Peptide eine ähnlich große Rolle für die Aktivitätsrhythmik spielt wie PDF. Aus früheren Arbeiten geht hervor, dass PDF sowohl für die Aufrechterhaltung eines Rhythmus in konstanter Dunkelheit (DD), als auch für die Generierung der Morgenaktivität und für die richtige Phasenlage der Abendaktivität in Licht-Dunkel Zyklen (LD) essentiell ist. Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen nun, dass NPF und ITP die Abendaktivität in LD fördern, dass sie jedoch nicht die einzigen Faktoren sind, die dies bewerkstelligen. ITP scheint außerdem Aktivität während der Nacht zu hemmen. Des Weiteren stellen ITP und möglicherweise auch sNPF eine schwache Perioden verkürzende Komponente in DD dar, ganz im Gegensatz zu PDF, welches eine Perioden verlängernde Wirkung besitzt. Jedoch scheinen weder ITP, NPF noch sNPF für die generelle Aufrechterhaltung eines Rhythmus in DD nötig zu sein. Vorhergehende Arbeiten wiesen bereits darauf hin, dass PDF wahrscheinlich rhythmisch an den dorsalen Nervenendigungen ausgeschüttet wird. Unsere jetzigen Ergebnisse zeigen desweiteren eine Oszillation in der ITP-Immunfärbung in den dorsalen Projektionen der ITP+ Uhrneuronen in LD, was auch auf eine rhythmische Ausschüttung dieses Peptids schließen lässt. Die rhythmische Freisetzung beider Peptide scheint für die Aufrechterhaltung eines Verhaltensrhythmus in DD wichtig zu sein, da eine konstant hohe Menge an ITP und PDF im dorsalen Gehirn den Freilauf-Rhythmus störten. Die live-Imaging Experimente dieser Arbeit zeigten, dass sNPF auf manche Uhrneuronen inhibitorisch wirkt – auch auf einige, die durch PDF aktiviert werden können. sNPF könnte also als Signalmolekül innerhalb des Uhrnetzwerkes fungieren. Auch NPF führte zu inhibitorischen Zellantworten, jedoch waren diese äußerst schwach und betrafen nur wenige Uhrneuronen, was darauf schließen lässt, dass dieses Peptid wahrscheinlich am Signalausgang der Uhr beteiligt ist. Es war uns bisher nicht möglich dieselben live-Imaging Untersuchungen auch für ITP durchzuführen, jedoch zeigten Überexpressionsstudien mit verschiedenen Treiberlinien, dass auch ITP mit großer Wahrscheinlichkeit im Signalausgang der Uhr fungiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle hier untersuchten Neuropeptide an der Kontrolle der rhythmischen Lokomotoraktivität von Drosophila melanogaster mitwirken. Dabei ist PDF eindeutig der dominierende Faktor, während die anderen Neuropeptide die Wirkung von PDF eher feinregulieren oder komplementieren. Aus den Daten kann geschlossen werden, dass die örtliche und zeitliche Funktionsweise dieser verschiedenen Peptide sehr komplex ist, um sowohl die Prozessierung von Signalen innerhalb des Uhrnetzwerkes als auch in den weitgehend noch unbekannten Ausgangswegen der Uhr zu gewährleisten. KW - Taufliege KW - Biologische Uhr KW - Neuropeptide KW - Innere Uhr KW - Drosophila KW - Circadian Rhythms Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93796 ER - TY - THES A1 - Bettaga, Noomen T1 - Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus T1 - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in angiogenesis and arteriogenesis in mice N2 - Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gefäßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gefäßsystem wird hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gewährleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkräfte und Zytokine wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird während dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor für NO produziert die NO-GC den sekundären Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und führt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar. Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einer vollständigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zusätzlich zellspezifische Knockout-Mäuse für glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt. Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur äußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine stärkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt. Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-Mäuse eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erhöhte Tuft-Bildung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-Mäuse zeigten eine gegenüber den Kontroll-Tieren unveränderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gefäßkapillaren der Mausretina. Daher könnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich für die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Ischämie-Modells durchgeführt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterläufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell für den Arteriogenese-Prozess ist. Zusammengefasst führt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese. N2 - Nitric oxide (NO) plays an important role in vascular remodelling processes such as angiogenesis and arteriogenesis. The synthesis of NO in the vascular system is ensured mainly by endothelial NO synthase (eNOS). It can be regulated by a number of factors, such as shear stress and cytokines like the vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is an important stimulator of angiogenesis and is upregulated during this process. Most of the physiological effects of NO are mediated by the NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC). As the main receptor for NO, NO-GC produces the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and thereby leads to a variety of physiological effects. However, whether the effects of NO in angiogenesis and arteriogenesis are also mediated by NO-GC is still unclear. NO-GC consists of two subunits (α and ß). The deletion of the ß1 subunit in mice results in a global knockout mouse (GCKO). Using the Cre-LoxP system we also generated smooth muscle cell-specific (SMC GCKO) and endothelial cell-specific knockout mice (EC GCKO). To investigate the role of NO-GC in angiogenesis and arteriogenesis, three well-established methods have been used. In the first part of the project, the expression of the NO-GC in endothelial cells should be investigated. By using the reverse transcription polymerase chain reaction method (RT-PCR), the results show a very weak expression of the NO-GC in endothelial cells of the lung. A role for NO-GC in the VEGF-mediated angiogenesis was ascertained by the aortic ring assay. The results show an increased angiogenesis in the global absence of NO-GC. However, the EC-GCKO shows no difference compared to control mice. This indicates that NO-GC in endothelial cells is unlikely to play a major role in VEGF-mediated angiogenesis. In the second part of the project, the role of NO-GC in angiogenesis was investigated in an in vivo model. In the oxygen induced-retinopathy model (OIR), GCKO mice showed reduced vaso-obliteration, slowed angiogenesis and increased tuft formation. Similar results were observed in the SMC-GCKO animals. In contrast, EC-GCKO mice showed vaso-obliteration as well as angiogenesis rate and tuft formation similar to those seen in control animals. The results of this experiment suggest that NO-GC in endothelial cells is not involved in vaso-obliteration, physiological angiogenesis and tuft formation. Immunhistochemical analyses showed the expression of NO-GC in pericytes of the vascular capillaries of the mouse retina. Therefore, NO-GC in this cell type could be responsible for the effects in GCKO- and SMC-GCKO animals. In the last part of this thesis, hindlimb-ischemia experiments were performed. For this purpose, the paws of all GCKO- and some SMC-GCKO animals showed necrosis after ligation of the femoral artery. The regeneration of legs from EC-GCKO animals after the operation was normal. These results exclude a major role of NO-GC in endothelial cells, but show that NO-GC in smooth muscle cells is essential in the arteriogenesis process. In summary, the deletion of NO-GC in smooth muscle cells and probably also in pericytes leads to a slowed angiogenesis and inhibits arteriogenesis. KW - Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Angiogenese KW - Arteriogenese KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111284 ER - TY - THES A1 - Siegl, Christine T1 - Degradation of Tumour Suppressor p53 during Chlamydia trachomatis Infections T1 - Abbau des Tumorsuppressors p53 während Chlamydia trachomatis Infektionen N2 - The intracellular pathogen Chlamydia is the causative agent of millions of new infections per year transmitting diseases like trachoma, pelvic inflammatory disease or lymphogranuloma venereum. Undetected or recurrent infections caused by chlamydial persistence are especially likely to provoke severe pathologies. To ensure host cell survival and to facilitate long term infections Chlamydia induces anti-apoptotic pathways, mainly at the level of mitochondria, and restrains activity of pro-apoptotic proteins. Additionally, the pathogen seizes host energy, carbohydrates, amino acids, lipids and nucleotides to facilitate propagation of bacterial progeny and growth of the chlamydial inclusion. At the beginning of this study, Chlamydia-mediated apoptosis resistance to DNA damage induced by the topoisomerase inhibitor etoposide was investigated. In the course of this, a central cellular protein crucial for etoposide-mediated apoptosis, the tumour suppressor p53, was found to be downregulated during Chlamydia infections. Subsequently, different chlamydial strains and serovars were examined and p53 downregulation was ascertained to be a general feature during Chlamydia infections of human cells. Reduction of p53 protein level was established to be mediated by the PI3K-Akt signalling pathway, activation of the E3-ubiquitin ligase HDM2 and final degradation by the proteasome. Additionally, an intriguing discrepancy between infections of human and mouse cells was detected. Both activation of the PI3K-Akt pathway as well as degradation of p53 could not be observed in Chlamydia-infected mouse cells. Recently, production of reactive oxygen species (ROS) and damage to host cell DNA was reported to occur during Chlamydia infection. Thus, degradation of p53 strongly contributes to the anti-apoptotic environment crucial for chlamydial infection. To verify the importance of p53 degradation for chlamydial growth and development, p53 was stabilised and activated by the HDM2-inhibiting drug nutlin-3 and the DNA damage-inducing compound etoposide. Unexpectedly, chlamydial development was severely impaired and inclusion formation was defective. Completion of the chlamydial developmental cycle was prevented resulting in loss of infectivity. Intriguingly, removal of the p53 activating stimulus allowed formation of the bacterial inclusion and recovery of infectivity. A similar observation of growth recovery was made in infected cell lines deficient for p53. As bacterial growth and inclusion formation was strongly delayed in the presence of activated p53, p53-mediated inhibitory regulation of cellular metabolism was suspected to contribute to chlamydial growth defects. To verify this, glycolytic and pentose phosphate pathways were analysed revealing the importance of a functioning PPP for chlamydial growth. In addition, increased expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase rescued chlamydial growth inhibition induced by activated p53. The rescuing effect was even more pronounced in p53-deficient cells treated with etoposide or nutlin-3 revealing additional p53-independent aspects of Chlamydia inhibition. Removal of ROS by anti-oxidant compounds was not sufficient to rescue chlamydial infectivity. Apparently, not only the anti-oxidant capacities of the PPP but also provision of precursors for nucleotide synthesis as well as contribution to DNA repair are important for successful chlamydial growth. Modulation of host cell signalling was previously reported for a number of pathogens. As formation of ROS and DNA damage are likely to occur during infections of intracellular bacteria, several strategies to manipulate the host and to inhibit induction of apoptosis were invented. Downregulation of the tumour suppressor p53 is a crucial point during development of Chlamydia, ensuring both host cell survival and metabolic support conducive to chlamydial growth. N2 - Intrazellulär lebende Chlamydien führen jährlich zu Millionen an Neuinfektionen und lösen Krankheiten wie das Trachom, eine Entzündung des Auges, sowie entzündliche Beckenerkrankungen oder Lymphogranuloma venereum, eine venerische Lymphknotenentzündung, aus. Unentdeckte oder wiederkehrende Infektionen, ausgelöst durch chronisch persistierende Chlamydien, führen häufig zu schwerwiegenden Komplikationen. Um das Überleben der Wirtszelle und dauerhafte Infektionen zu ermöglichen, induzieren Chlamydien antiapoptotische Signalwege, hauptsächlich auf Höhe der Mitochondrien, und beeinträchtigen darüber hinaus die Aktivität proapoptotischer Proteine. Energie, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Lipide und Nukleotide bezieht der Krankheitserreger vollständig aus der Wirtszelle. Erst dadurch wird sowohl die Vermehrung der Bakterien, als auch das Wachstum der chlamydialen Inklusion ermöglicht. Zu Beginn dieser Arbeit wurde die Chlamydien-vermittelte Resistenz gegenüber induziertem Zelltod nach Schädigung der DNA durch den Topoisomerase-Inhibitor Etoposid untersucht. Im Zuge dessen wurde entdeckt, dass der Tumorsuppressor p53, ein zentrales zelluläres Protein entscheidend für die Etoposid-induzierte Apoptose, während Chlamydien-Infektionen herunterreguliert wird. Nachdem verschiedene chlamydiale Stämme und Serovare untersucht wurden, konnte festgestellt werden, dass es sich bei der Herunterregulierung von p53 um ein allgemeines Merkmal chlamydialer Infektionen von humanen Zellen handelt. Die Reduzierung der Proteinmenge von p53 wird dabei durch den PI3K-Akt Signalweg, Aktivierung der E3-Ubiquitin-Ligase HDM2 und abschließendem Abbau durch das Proteasom vermittelt. Zusätzlich wurde ein interessanter Unterschied zwischen Infektionen humaner und muriner Zellen entdeckt. Sowohl Aktivierung des PI3K-Akt Weges, als auch der Abbau von p53 konnten in Chlamydien-infizierten Mauszellen nicht beobachtet werden. Kürzlich wurde darüber berichtet, dass während chlamydialer Infektionen reaktive Sauerstoffspezies produziert werden und die DNA der Wirtszelle geschädigt wird. Demnach trägt der Abbau von p53 entscheidend dazu bei, ein für chlamydiale Infektionen maßgebliches, anti-apoptotisch geprägtes Umfeld zu generieren. Um die Bedeutung des Abbaus von p53 für Wachstum und Entwicklung von Chlamydien zu ermessen, wurde p53 durch den HDM2-inhibierenden Wirkstoff Nutlin-3, sowie die DNA-Schäden induzierende Verbindung Etoposid stabilisiert bzw. aktiviert. Die Entwicklung der Chlamydien, sowie die Ausbildung der Inklusion wurden dadurch überraschenderweise stark beeinträchtigt bzw. waren fehlerhaft. Die Vollendung des chlamydialen Entwicklungszyklus wurde verhindert, was den Verlust der Infektivität nach sich zog. Interessanterweise erlaubte das Entfernen des p53-aktivierenden Stimulus die Ausbildung der bakteriellen Inklusion und die Wiedererlangung der Infektivität. Eine ähnliche Beobachtung konnte in Zelllinien mit einer p53-Defizienz gemacht werden. Da bakterielles Wachstum und Ausbildung der Inklusion durch aktiviertes p53 stark eingeschränkt war, wurde vermutet, dass p53-vermittelte Inhibierung des zellulären Metabolismus am fehlerhaften Wachstum der Chlamydien beteiligt ist. Analyse von Glykolyse und Pentosephosphatweg (PP-Weg) zeigten den Stellenwert eines funktionierenden PP-Wegs für das Wachstum der Chlamydien auf. Zusätzlich konnte durch Überexpression der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase das durch aktiviertes p53 gehemmte Wachstum der Chlamydien wiederhergestellt werden. Dieser Effekt war noch deutlicher in p53-defizienten Zellen, die mit Etoposid bzw. Nutlin-3 behandelt wurden. Demnach tragen auch p53-unabhängige Aspekte zur Einschränkung des chlamydialen Wachstums bei. Das Entfernen von reaktiven Sauerstoffspezies durch Antioxidationsmittel war jedoch nicht ausreichend zur Wiedererlangung der chlamydialen Infektivität. Demnach sind nicht nur die anti-oxidativen Eigenschaften des PP-Wegs sondern auch das Bereitstellen von Vorläufermolekülen für die Nukleotidsynthese, sowie dessen Beitrag zur DNA-Reparatur entscheidend für erfolgreiches Wachstum von Chlamydien. Veränderung der Signaltransduktion der Wirtszelle wurde bereits bei einigen Krankheitserregern nachgewiesen. Da reaktive Sauerstoffspezies und DNA Schäden häufig bei Infektionen intrazellulärer Bakterien auftreten, entstanden unterschiedliche Strategien, den Wirt zu manipulieren und das Einleiten des Zelltodes zu verhindern. Das Herunterregulieren des Tumorsuppressors p53 ist entscheidend während der Entwicklung von Chlamydien. Sowohl das Überleben der Wirtszelle, als auch die für chlamydiales Wachstum förderliche Unterstützung durch den Stoffwechsel werden dadurch gewährleistet. KW - Chlamydia-trachomatis-Infektion KW - Protein p53 KW - metabolism KW - cancer KW - Chlamydia KW - Chlamydia-trachomatis-Infektion Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108679 ER - TY - THES A1 - Proppert, Sven Martin T1 - Design, implementation and characterization of a microscope capable of three-dimensional two color super-resolution fluorescence imaging T1 - Design, Implementierung und Charakterisierung eines Mikroskops für dreidimensionale zwei Farben superhochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung N2 - This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging. N2 - In dieser Arbeit werden die Grundlagen der dreidimensionalen hochauflösenden Lokalisationsmikroskopie erarbeitet und daraus Spezifikationen für ein geeignetes Mikroskop abgeleitet. Zur Gewinnung der axialen Koordinate der Emission einzelner Farbstoffe wird die Punktspreizfunktion in der Detektion astigmatisch mithilfe einer zylindrischen Linse verändert. Nach einer kurzen Einleitung in die Grundzüge der Optik und der Lokalisationsmikroskopie werden die Ursachen für typische Aberrationen besprochen, wie sie in der 3D-Lokalisationsmikroskopie häufig auftreten. Weiterhin wird der Einfluss dieser Aberrationen auf die erreichbare Präzision und Exaktheit des Lokalisationsprozesses behandelt. Mit dem Wissen aus diesen Überlegungen wurden Experimente entworfen und durchgeführt um die getroffenen Schlussfolgerungen zu validieren und zu demonstrieren, dass das vorgeschlagene Mikroskop dazu in der Lage ist, biologische Strukturen in den drei räumlichen Dimensionen aufzulösen. Weiterhin wird gezeigt, dass beinahe aberrationsfreie Mikroskopie großer Volumina prinzipiell möglich ist. Während der Arbeit an dieser Promotion wurde eine neue Methode zur Gewinnung der axialen Koordinaten eingeführt. Diese auf kubischen B-splines basierende Interpolationsmethode stellte sich als anderen Routinen überlegen in der Kalibration eines Mikroskops und der anschließenden Auswertung von Messungen heraus. Deshalb wird dieses Verfahren in der vorliegenden Arbeit verwendet und erklärt. Da diese Doktorarbeit auch den Anspruch hat, zukünftigen Studenten den Einstieg in die hochauflösende 3D Mikroskopie zu erleichtern, werden abschließend detaillierte Protokolle für spezifische Aspekte der zwei Farben 3D Lokalisationsmikroskopie zur Verfügung gestellt. KW - Dimension 3 KW - aberration KW - Einzelmolekülmikroskopie KW - single molecule microscopy KW - 3D KW - super-resolution KW - Mikroskopie KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Aberration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107905 ER - TY - THES A1 - Proft, Florian Lukas Patrick T1 - Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch T1 - Molecular mechanisms of effectivness of the antidepressant venlafaxine - genetic investigations in mice and men N2 - Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt. Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird. Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen. Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern. Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war. Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen. Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet. Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren. In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert. Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben. Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren. N2 - Depressive disorders not only lead to the suffering of the affected individuals but also to economic losses by incapacitating them to fulfill social demands and by utilization of health care systems. Therapeutic intervention via pharmacotherapy is successful in variabel degrees. Etiological research revealed a diversity of somatic factors to be associated with the illness. Primary pharmacological treatment is using substances that inhibit the reuptake of monoaminergic neurotransmitters (serotonin, norepinephrine, in part also dopamine) into the presynaptic terminals. Continued application, sometimes for weeks, leads to a reduction of depressive symptoms (lag of onset). On the other hand for a number of patients various pharmacotherapeutic drugs do not result in symptomatic relief or remission. A reason for these discrepancies to date has not been determined but it is to assume, that pharmacokinetic and pharmacodynamic variations between patients bear the responsibility. In the thesis at hand venlafaxine, an inhibitor of serotonin- respectively serotonin- and norepinephrine-reuptake, was used. Venlafaxine's pharmacodynamic activity is dependent on its concentration in the target compartment as the affinity for the serotonin-transporter is 30 times that for the norepinephrine-transporter. Two goals were targeted here. Comparative gene expression analysis was performed to identify potential effectors of antidepressive effectiveness. On this basis a more specific pharmacological intervention than increasing monoaminergic transmission might be facilitated. The second part of the thesis was dedicated to pharmacogenetic research. In it the predictiveness of the expression activity of the genes coding for venlafaxine's primary targets (SLC6A2, norepinephrine-transporter; SLC6A4, serotonin-transporter) in combination with serum concentrations of active moiety (venlafaxine and its equally active metabolite o desmethylvenlafaxine) towards the therapeutic effect was investigated. Knowledge on such an association might improve efficacy of future pharmacological intervention with venlafaxine, as serum concentrations necessary for patients' desired improvement in the light of a respective genotype could be individually targeted. For gene expression analysis, first, mice (DBA/2 strain) were given venlafaxine in different dosages via the oral route for one month and their hippocampi were analyzed by hypothesis-free genome wide microarray analysis for genes differentially expressed between treatment groups. For candidate genes identified that way, differential expression was validated via qRT-PCR. In the second step validated genes were investigated via qRT-PCR for differential expression in leucocytes of patients who had received antidepressive venlafaxine treatment for one month. Expression was compared between leucocytes after one week and during the fifth week of treatment, that is, before and after potential onset of antidepressive effect. Post mortem comparison between human central and peripheral tissue had to a certain degree shown congruence of expression patterns and thus leucocyte analysis can give hints towards events in the central nervous system. Candidate genes identified in the animal study code for transcription factors respectively proteins mediating in second messenger cascades. In human leucocytes statistical significance was reached for the reduced mRNA abundance of Fos after one month of treatment. Fos is a transcription factor subunit that after heterodimerization with Jun influences expression of effector genes. Association of Fos with depressive disorder and its role in an antidepressive effect had been shown in animal studies. Hippocampal knock-out (ko) of Fos in mice had been associated with reduced fear behaviour and higher excitability of the neurons in this region. Also an association with synaptic plasticity and thus with learning behaviour had been shown. On the other hand, in rats depression-like behaviour had been associated with low hippocampal Fos expression and following successful pharmacological "therapy" expression had been found to be induced. Thus already between non-human species pronounced differences in the role of Fos respectively Fos can be seen. Regarding the different species and tissues investigated as well as the heterogeneous reports on the role of Fos, it can thus only be concluded that the gene respectively its protein product is part of the development and the venlafaxine-induced relief of depressive symptoms. New antidepressant drugs based on an interaction with Fos, e.g. by decreasing its abundance, might in theory be considered. However, due to its far-reaching activity in a number of various processes throughout the organism and especially its role as a proto-oncogene, systemic inhibition of Fos does not seem a proper basis for innovative therapeutic intervention. Future studies should therefore focus on other differentially expressed genes found in the microarray analysis. For evaluating the predictive power of the expression activity of the genes SLC6A2 respectively SLC6A4 which code for venlafaxine's primary targets (serotonin- respectively norepinephrine-transporter) and the serum concentration of active moiety with regard to the achieved antidepressive effect in a naturalistic clinical design patients from the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy (University Hospital of Würzburg) were analyzed. SLC6A2 was genotyped for rs28386840 and SLC6A4 for 5-HTTLPR. To investigate phenotypical conditions, patients were dichotomized into carriers of "low-expressing" and "high-expressing" genotypes. Results of the pharmacological intervention were evaluated using the CGI-I-scale and symptom changes after one month of venlafaxine application were dichotomized into "good response" and "bad response". rs28386840 was found not to be associated with therapeutic outcome. The high-expressing genotype of SLC6A4 was found to be significantly associated with insufficient response. After stratifying the collective for serum concentrations this especially held true in the subcollective with high concentration (200 - 400 ng / ml). Below and above this range 5-HTTLPR was not significantly associated with the response. It can be concluded that genotyping rs28386840 will not be useful for instruction of therapeutic intervention with venlafaxine. However, information on patients' 5-HTTLPR might instruct psychiatrists, if venlafaxine is considered for treatment, to use serum concentrations which exceed the range recommended by the AGNP (> 400 ng / ml) in patients with the high-expressing genotype of SLC6A4. The study at hand analyzed only 56 patients and inclusion of a variety of cofactors as well as regression analysis incorporating both polymorphisms to evaluate their potential and probable synergistic effect was not possible. Thus, before application of the present findings into clinical practice, validation and confirmation of the potentially causal relationship in larger samples using a prospective controlled design is necessary. KW - Wirkmechanismus KW - Venlafaxin KW - Pharmakogenetik KW - Genexpression KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201 ER - TY - THES A1 - Xian, Yibo T1 - Identification of essential genes and novel virulence factors of Neisseria gonorrhoeae by transposon mutagenesis T1 - Identifizierung von essentiellen Genen und neuen Virulenzfaktoren von Neisseria gonorrhoeae durch Transposonmutagenese N2 - Neisseria gonorrhoeae is a human-specific pathogen that causes gonorrhea. It is defined as a super bacterium by the WHO due to the emergence of gonococci that are resistant to a variety of antibiotics and a rapidly increasing infection incidence. Genome-wide investigation of neisserial gene essentiality and novel virulence factors is urgently required in order to identify new targets for anti-neisserial therapeutics. To identify essential genes and new virulence factors, a high-density mutant library in N. gonorrhoeae MS11 was generated by in vitro transposon mutagenesis. The transposon library harbors more than 100,000 individual mutants, a density that is unprecedented in gonococcal research. Essential genes in N. gonorrhoeae were determined by enumerating frequencies of transposon insertion sites (TIS) with Illumina deep sequencing (Tn-seq). Tn-seq indicated an average distance between adjacent TIS of 25 bp. Statistical analysis unequivocally demonstrated 781 genes that were significantly depleted in TIS and thus are essential for Neisseria survival. A subset of the genes was experimentally verified to comprise essential genes and thus support the outcome of the study. The hereby identified candidate essential genes thus may constitute excellent targets for the development of new antibiotics or vaccines. In a second study, the transposon mutant library was applied in a genome-scale “negative-selection strategy” to identify genes that are involved in low phosphate-dependent invasion (LPDI). LPDI is dependent on the Neisseria porin subtype PorBIA which acts as an epithelial cell invasin in absence of phosphate and is associated with severe pathogenicity in disseminated gonococcal infections (DGI). Tn-seq demonstrated 98 genes, which were involved in adherence to host cells and 43 genes involved in host cell invasion. E.g. the hypothetical protein NGFG_00506, an ABC transporter ATP-binding protein NGFG_01643, as well as NGFG_04218 encoding a homolog of mafI in N. gonorrhoeae FA1090 were experimentally verified as new invasive factors in LPDI. NGFG_01605, a predicted protease, was identified to be a common factor involved in PorBIA, Opa50 and Opa57-mediated neisserial engulfment by the epithelial cells. Thus, this first systematic Tn-seq application in N. gonorrhoeae identified a set of previously unknown N. gonorrhoeae invasive factors which demonstrate molecular mechanisms of DGI. N2 - Neisseria gonorrhoeae ist ein human-spezifisches Pathogen, das die Krankheit Gonorrhoe verursacht. Aufgrund der steigenden Anzahl antibiotikaresistenter Gonokokken und der damit verbundenen, rapide zunehmenden Anzahl von Infektionen erklärte die WHO Gonokokken 2012 zum Superbakterium. Daher ist eine genomweite Untersuchung der neisseriellen Genessentiatialität und neuer Virulenzfaktoren dringend erforderlich, um neue Ziele für die antineisserielle Therapie zu identifizieren. Hierzu wurde eine high-density Mutantenbibliothek in N. gonorrhoeae MS11 durch in vitro Transposonmutagenese generiert. Die Transposonbibliothek enthält mehr als 100.000 individuelle Mutanten - eine Dichte, die in der Gonokokken-Forschung beispiellos ist. Essentielle Gene von N. gonorrhoeae wurden durch die Ermittlung der Häufigkeit von Transposon insertion sites (TIS) mit Hilfe von Illumina deep sequencing (Tn-seq) bestimmt. Tn-seq ergab eine durchschnittliche Distanz von 25 Basenpaaren zwischen benachbarten TIS. Die statistische Analyse zeigte eindeutig 781 Gene, die signifikant weniger TIS aufwiesen und deshalb als essentiell für das Überleben der Neisserien verstanden werden können. Für ausgewählte Gene wurde experimentell bestätigt, dass sie essentielle Gene beinhalten, wodurch das Ergebnis der Tn-seq unterstützt wird. Die hierbei identifizierten essentiellen Gene könnten exzellente Targets für die Entwicklung neuer Antibiotika oder Impfstoffe darstellen. In einer zweiten Studie wurde die Transposon Mutanten Bibliothek für eine genomweite „negative Selektionsstrategie“ bereitgestellt. Es sollten Gene identifiziert werden, die an der phosphatfreien Invasion (low phosphate-dependent invasion = LPDI) beteiligt sind. Die LPDI ist vom neisseriellen Porin Subtyp PorBIA abhängig, welches bei Epithelzellen in Abwesenheit von Phosphat als Invasin fungiert und mit einer schweren Pathogenität in disseminierenden Gonokokkeninfektionen (DGI) assoziiert ist. Tn-seq ergab 98 Gene, die an der Adhärenz an die Wirtszelle, und 43 Gene, die an der Wirtszellinvasion beteiligt waren. Zum Beispiel wurden das hypothetische Protein NGFG_00506, ein ABC Transporter, das ATP-bindende Protein NGFG_01643, wie auch NGFG_04218, das für ein Homolog von mafI in N. gonorrhoeae FA1090 kodiert, experimentell als neue Invasionsfaktoren in der LPDI verifiziert. NGFG_01605, bei dem angenommen wird, dass es sich um eine Protease handelt, wurde als ein allgemeiner Faktor identifiziert, der an der PorBIA-, Opa50- and Opa57-vermittelten Einstülpung der Membran von Epithelzellen beteiligt ist. Die erste systematische Anwendung von Tn-seq in N. gonorrhoeae identifizierte eine Reihe bisher unbekannter Invasionsfaktoren von N. gonorrhoeae, die molekulare Mechanismen der DGI zeigen. KW - Neisseria gonorrhoeae KW - transposon mutagenesis KW - essential genes KW - virulence factors KW - Virulenzfaktor KW - Transposon KW - Mutagenese Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102659 ER - TY - THES A1 - Weber, David T1 - Hey target gene regulation in embryonic stem cells and cardiomyocytes T1 - Regulation von Hey Zielgenen in embryonalen Stammzellen und Kardiomyozyten N2 - The Notch signaling pathway is crucial for mammalian heart development. It controls cell-fate decisions, coordinates patterning processes and regulates proliferation and differentiation. Critical Notch effectors are Hey bHLH transcription factors (TF) that are expressed in atrial (Hey1) and ventricular (Hey2) cardiomyocytes (CM) and in the developing endocardium (Hey1/2/L). The importance of Hey proteins for cardiac development is demonstrated by knockout (KO) mice, which suffer from lethal cardiac defects, such as ventricular septum defects (VSD), valve defects and cardiomyopathy. Despite this clear functional relevance, little is known about Hey downstream targets in the heart and the molecular mechanism by which they are regulated. Here, I use a cell culture system with inducible Hey1, Hey2 or HeyL expression to study Hey target gene regulation in HEK293 cells, in murine embryonic stem cells (ESC) and in ESC derived CM. In HEK293 cells, I could show that genome wide binding sites largely overlap between all three Hey proteins, but HeyL has many additional binding sites that are not bound by Hey1 or Hey2. Shared binding sites are located close to transcription start sites (TSS) where Hey proteins preferentially bind to canonical E boxes, although more loosely defined modes of binding exist. Additional sites only bound by HeyL are more scattered across the genome. The ability of HeyL to bind these sites depends on the C-terminal part of the protein. Although there are genes which are differently regulated by HeyL, it is unclear whether this regulation results from binding of additional sites by HeyL. Additionally, Hey target gene regulation was studied in ESC and differentiated CM, which are more relevant for the observed cardiac phenotypes. ESC derived CM contract in culture and are positive for typical cardiac markers by qRT PCR and staining. According to these markers differentiation is unaffected by prolonged Hey1 or Hey2 overexpression. Regulated genes are largely redundant between Hey1 and Hey2. These are mainly other TF involved in e.g. developmental processes, apoptosis, cell migration and cell cycle. Many target genes are cell type specifically regulated causing a shift in Hey repression of genes involved in cell migration in ESC to repression of genes involved in cell cycle in CM. The number of Hey binding sites is reduced in CM and HEK293 cells compared to ESC, most likely due to more regions of dense chromatin in differentiated cells. Binding sites are enriched at the proximal promoters of down-regulated genes, compared to up-or non-regulated genes. This indicates that up-regulation primarily results from indirect effects, while down-regulation is the direct results of Hey binding to target promoters. The extent of repression generally correlates with the amount of Hey binding and subsequent recruitment of histone deacetylases (Hdac) to target promoters resulting in histone H3 deacetylation. However, in CM the repressive effect of Hey binding on a subset of genes can be annulled, likely due to binding of cardiac specific activators like Srf, Nkx2-5 and Gata4. These factors seem not to interfere with Hey binding in CM, but they recruit histone acetylases such as p300 that may counteract Hey mediated histone H3 deacetylation. Such a scenario explains differential regulation of Hey target genes between ESC and CM resulting in gene and cell-type specific regulation. N2 - Der Notch Signalweg ist essenziell für die Herzentwicklung in Säugetieren. Er kontrolliert Zell-differenzierung, koordiniert Musterbildungsprozesse und reguliert Proliferation und Differenzierung. Kritische Notch Effektoren sind Hey bHLH Transkriptionsfaktoren, welche im Herzen in atrialen (Hey1) und ventrikulären (Hey2) Kardiomyozyten und dem sich entwickelnden Endokardium (Hey1/2/L) exprimiert werden. Die Bedeutung von Hey Proteinen während der Herzentwicklung wird an Hand von verschiedenen KO Mäusen ersichtlich, welche letale Herzdefekte, wie ventrikuläre Septumdefekte, Herzklappendefekte und Kardiomyopathien, entwickeln. Trotz dieser klaren funktionalen Relevanz ist wenig über Hey Zielgene im Herzen und den molekularen Mechanismus bekannt, über den diese reguliert werden. Hier wurde ein Zellkultursystem mit induzierbarer Expression von Hey1, Hey2 oder HeyL verwendet, um Hey Zielgene in HEK293, murinen embryonalen Stammzellen und in differenzierten Kardiomyozyten zu studieren. In HEK293 Zellen konnte ich zeigen, dass die Bindestellen im Genom weitestgehend zwischen allen drei Hey Proteinen überlappen, HeyL jedoch viele zusätzliche Bindestellen aufweist, welche weder von Hey1 noch Hey2 gebunden werden. Gemeinsame Bindestellen befinden sich nahe Transkriptionsstartstellen, präferentiell an kanonische E boxen. Die nur von HeyL gebunden Bindestellen sind mehr über das Genom verteilt. Dabei ist die Fähigkeit von HeyL diese Stellen zu binden vom C-terminalen Teil abhängig. Obwohl es Gene gibt, die unterschiedlich von HeyL reguliert werden, ist es auf Grund der sehr viel größeren Anzahl an HeyL Bindestellen unklar, ob diese Regulation das Resultat von zusätzlicher HeyL Bindung ist. Zusätzlich wurde die Regulation von Hey Zielgenen in embryonalen Stammzellen und differenzierten Kardiomyozyten untersucht, da diese Zellen für die beobachteten kardialen Phänotypen relevanter sind. Differenzierte Kardiomyozyten kontrahieren in Kultur und sind positiv für typische kardiale Marker an Hand von qRT-PCR und Färbungen. Nach diesen Markern ist die Differenzierung durch kontinuierliche Überexpression von Hey1 oder Hey2 unverändert. Die Hey1 und Hey2 regulierten Gene sind weitestgehend redundant. Viele Zielgene sind andere Transkriptionsfaktoren, die zum Beispiel an Entwicklungsprozessen, Apoptose, Zellmigration und dem Zellzyklus beteiligt sind. Diese werden oft Zelltyp spezifisch reguliert, was zur Folge hat, dass in embryonalen Stammzellen auch an der Zellmigration beteiligte Gene reprimiert werden, während es in Kardiomyozyten vor allem Gene sind, die den Zellzyklus betreffen. Die Zahl der Hey Bindestellen ist in Kardiomyozyten und HEK293 Zellen verglichen mit embryonalen Stammzellen reduziert, höchstwahrscheinlich da differenzierte Zellen weniger offenes Chromatin besitzen. Die Bindestellen sind in reprimierten Genen verglichen mit induzierten oder nicht regulierten Genen angereichert. Dies deutet an, dass eine Induktion meist durch indirekte Effekte zu Stande kommt, während eine Repression das direkte Ergebnis der Hey Bindung an Zielpromotoren ist. Die Stärke der Repression korreliert dabei generell mit der Menge an Promoter gebundenem Hey Protein, welches Histon-Deacetylasen rekrutiert und zu einer Reduktion der Histon H3 Acetylierung führt. In Kardiomoyzyten wird der repressive Effekt von Hey für bestimmte Gene unterbunden, wahrscheinlich durch Bindung herzspezifischer Aktivatoren, wie Srf, Nkx2 5 und Gata4. Diese Faktoren scheinen nicht die Bindung von Hey zu beeinflussen, aber sie rekrutieren Acetylasen wie p300, welche Hey vermittelter Histon H3 Deacetylierung entgegenwirken. Dieses Model erklärt die unterschiedliche Regulation von Hey Zielgenen zwischen embryonalen Stammzellen und Kardiomyozyten. KW - Transkriptionsfaktor KW - Gen notch KW - Gene regulation KW - Notch signalling KW - Hey proteins KW - Genregulation KW - Notch Signalweg KW - Hey Proteine Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101663 ER -