TY - THES A1 - Riaño, Rubén Felipe T1 - BTN3A1 in the immune response of Vγ9Vδ2 T cells T1 - BTN3A1 in der Immunantwort der Vγ9Vδ2 T Zellen N2 - Human Vγ9Vδ2 T cells are the main γδ T cell subset in the circulation, accounting for up to 5% of the total peripheral blood lymphocyte population. They have been suggested to be important in response to tumors and infections. Their immune mechanisms encompass cell killing via cytotoxicity and secretion of pro-inflammatory cytokines such as IFNγ and tumor necrosis factor (TNF). The main stimulators of Vγ9Vδ2 T cells are isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), denominated phosphoantigens (PAg). A major advance in the understanding of PAg detection and Vγ9Vδ2 T cell activation has been the identification of the butyrophlin 3A (BTN3A) proteins as key mediators in these processes. In humans, three isoforms constitute the BTN3A family: BTN3A1, BTN3A2, and BTN3A3; and their genes are localized on the short arm of chromosome 6. The role of BTN3A1 has been highlighted by BTN3A-specific monoclonal antibody 20.1 (mAb 20.1), which has an agonist effect and causes proliferation, expansion, and activation of primary human Vγ9Vδ2 T cells. On the other hand, BTN3A-specific monoclonal antibody 103.2 (mAb 103.2) is antagonistic, inhibiting the Vγ9Vδ2 T cell response. The actual mechanism underlying both PAg- and mAb 20.1-mediated activation is not completely elucidated, but the importance of BTN3A1 is clear. The main objective of this dissertation was to characterize the role of BTN3A1 in the PAg-dependent and PAg-independent Vγ9Vδ2 T cell activation and to evaluate its contribution in the response to influeza A virus infected cells. This research work demonstrated, by using Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine cells (reporter cells), that human chromosome 6 (Chr6) is mandatory for PAg-induced stimulation, but not for stimulation with mAb 20.1. The reporter cells responded to mAb 20.1 in cultures with BTN3A1-transduced Chinese hamster ovary cells (CHO BTN3A1) as antigen presenting cells. Nevertheless, for PAg-dependent activation the presence of Chr6 in CHO BTN3A1 was mandatory. Although reporter cells expressing clonotypically different Vγ9Vδ2 TCRs showed similar PAg response, they clearly differed in the mAb 20.1 response. The reporter cell line transduced with Vγ9Vδ2 TCR D1C55 demonstrated essentially no response to mAb 20.1 compared to Vγ9Vδ2 TCR MOP cells. These findings were further supported by experiments performed with human PBMCs-derived Vγ9Vδ2 T cell clones. The results indicate heterogeneity in the PAg- and 20.1-dependent responses, in terms of CD25 and CD69 expression, among three different Vγ9Vδ2 T cells clones. Co-cultures of reporter cells with Raji RT1BI and PAg plus mAb 20.1 or single chain antibody 20.1 (sc 20.1) revealed no additive or synergistic activating effects. In contrast, mAb 20.1 or sc 20.1 inhibited the PAg-mediated activation of the reporter cells. The comparison of the relative contribution of the isoforms BTN3A2 and BTN3A3, in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, was undertaken by overexpression of these isoforms in CHO cells. The results showed that BTN3A2 contributes to both PAg- and mAb-induced Vγ9Vδ2 T cell activation. On the contrary, BTN3A3 does not support PAg-mediated γδ T cell response. Additionally, mutations in the proposed PAg- and mAb 20.1-binding sites of the extracellular BTN3A1 domain were generated by means of site-directed mutagenesis. These mutations revoked the mAb 20.1-induced Vγ9Vδ2 T cell activation, but not that induced by PAg. Finally, co-cultures of Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine reporter cells with influenza A/PR/8/34-infected cells, or infection of PBMCs with this virus strain indicated that BTN3A1 might be dispensable for the Vγ9Vδ2 T cell response against influenza A. The data of this research work points out that: i) in addition to BTN3A1, other Chr6-encoded genes are necessary for Vγ9Vδ2 T cell activation with PAg; ii) clonotypical (CDR3) differences influence the PAg- and mAb 20.1-mediated Vγ9Vδ2 T cell activation; iii) the PAg- and mAb 20.1-induced responses are not synergistic and interfere with each other; iv) BTN3A2 and BTN3A3 isoforms differ in the ability to support PAg- or mAb 20.1-dependent Vγ9Vδ2 T cell activation; v) the importance of the intracellular B30.2 domain of BTN3A1, in the Vγ9Vδ2 T cell activation, might be higher than that of the extracellular domain; and vi) in spite of the importance of BTN3A1 in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, it is possible that many molecules with redundant functions are involved in the elimination of influenza virus infection by these cells. In summary, it is possible to hypothesize a model in which BTN3A1 detects prenyl pyrophosphates in the cytoplasm via its B30.2 domain and in association with another protein(s). The binding of PAg to this domain induces a multimerization of BTN3A1 or a conformational change of its extracellular domain (mimicked by mAb 20.1). These modifications might be recognized by the Vγ9Vδ2 TCR or by an associated T cell protein. In the case that the TCR directly recognizes BTN3A1, the intensity of the response will depend on the Vγ9Vδ2 TCR clonotype. Future research will allow to gain a better understanding of BTN3A1, its interaction with other proteins, its actual role in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, and its importance in specific models of cancer or infection. This knowledge will be necessary to transform these cells into effective tools in the clinic. N2 - Im Menschen stellen Vγ9Vδ2 T Zellen die größte Subpopulation an γδ T Zellen im Blut dar und machen bis zu 5% der Gesamtpopulation peripherer Blutlymphozyten aus. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von Tumoren und Infektionen. Ihre Immunantwort umfasst cytotoxische Aktivität sowie Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IFNγ und dem Tumor Necrosis Faktor (TNF). Vγ9Vδ2 T Zellen werden am stärksten durch Isopentenylpyrophosphat (IPP) und (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphat (HMBPP) stimuliert, welche als Phosphoantigene (PAg) bezeichnet werden. Ein großer Schritt für das Verständnis der Phosphoantigenerkennung und Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung war die Identifzierung der Schlüsselrolle, die Butyrophilin 3A (BTN3A) Proteinen in diesen Prozessen zukommt. Im Menschen existieren drei Isoformen von BTN3A (BTN3A1, BTN3A2 und BTN3A3), deren Gene auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 lokalisiert sind. Die Rolle von BTN3A1 wurde durch den BTN3A spezifischen monoklonalen Antikörper 20.1 (mAk 20.1) besonders hervorgehoben, der eine agonistische Wirkung besitzt und Proliferation, Expansion, sowie Aktivierung primärer humaner Vγ9Vδ2 T Zellen hervorruft. Zudem existiert ein antagonistischer BTN3A spezifischer monoklonale Antikörper 103.2 (mAk 103.2), welcher Vγ9Vδ2 T Zellantworten inhibiert. Die der PAg- und mAk 20.1 vermittelten Aktivierung zugrunde liegenden Mechanismen wurden noch nicht vollständig aufgeklärt, die bedeutende Rolle von BTN3A1 in diesem Prozess ist jedoch eindeutig. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von BTN3A1 in der PAg abhängigen sowie unabhängigen Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung zu charakterisieren und ihren Beitrag zu der Immunantwort gegen mit Influenza A Virus infizierte Zellen zu ermitteln. Durch die Nutzung Vγ9Vδ2 TCR MOP transduzierter muriner Zellen als Reporterzellen konnte gezeigt werden, dass das humane Chromosom 6 (Chr6) zwar für die PAg abhängige Stimulation, nicht jedoch für die Aktivierung durch mAk 20.1 zwingend notwendig ist. In Kultur mit BTN3A1 transduzierten “chinese hamster ovary” (CHO) Zellen antworteten die Reporterzellen auf mAk 20.1. Für eine PAg abhängige Aktivierung war jedoch zusätzlich die Anwesenheit des humanen Chr6 in CHO BTN3A1 Zellen Voraussetzung. Obwohl Reporterzellen, die Vγ9Vδ2 TCRs verschiedener Klonotypen exprimierten, ähnliche PAg Antworten zeigten, unterschieden sie sich in der mAk 20.1 Antwort klar. Die mit Vγ9Vδ2 TCR D1C55 transduzierten Reporterzellen zeigten im Vergleich zu Vγ9Vδ2 TCR MOP Zellen nahezu keine mAk 20.1 abhängige Antwort. Diese Befunde wurden auch durch Experimente gestützt, die mit humanen, aus PBMCs gewonnenen Vγ9Vδ2 T Zellklonen durchgeführt wurden. Deren Resultate weisen, bezüglich der CD25 und CD69 Expression, auf eine heterogene PAg- und 20.1 abhängige Antwort der drei unterschiedlichen Vγ9Vδ2 T Zellklone hin. Kokulturen von Reporterzellen mit Raji RT1BI und PAg plus mAk 20.1 oder dem Einzelkettenantikörper 20.1 (sc 20.1) zeigten keine additive oder synergistische aktivierende Wirkung, vielmehr wurde die PAg vermittelte Aktivierung der Reporterzellen durch mAk 20.1 oder sc 20.1 inhibiert. Mittels Überexpression der beiden Isoformen BTN3A2 und BTN3A3 in CHO Zellen, wurde deren jeweiliger Beitrag zur Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass BTN3A2 sowohl zu PAg als auch mAk induzierten Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung beiträgt. BTN3A3 hingegen unterstützt die PAg vermittelte γδ T Zellaktivierung nicht. Weiterhin wurden, mittels gerichteter Mutagenese, in den vorgeschlagenen PAg- und mAk 20.1 Bindungsstellen der extrazellulären BTN3A1 Domäne Mutationen generiert. Diese verhinderten die mAk 20.1-, jedoch nicht die PAg vermittelte Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung. Zuletzt zeigten Kokulturen von Vγ9Vδ2 TCR MOP transduzierten murinen Reporterzellen und Influenza A/PR/8/34 infizierten Zellen, sowie eine Infektion von PBMCs mit diesem Virusstamm, dass BTN3A1 für die Vγ9Vδ2 T Zellantwort gegen Influenza A entbehrlich sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass i) zusätzlich zu BTN3A1, andere auf Chr6 befindliche Gene für die PAg abhängige Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen nötig sind; ii) klonotypische (CDR3) Unterschiede die PAg und mAk 20.1 vermittelte Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung beeinflussen; iii) die PAg- and mAk 20.1 induzierten Antworten sich nicht verstärken, sondern beeinträchtigen; iv) sich die Isoformen BTN3A2 und BTN3A3 in der Fähigkeit, die PAg- oder mAk 20.1 abhängige Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung zu unterstützen, unterscheiden; v) die intrazelluläre B30.2 Domäne von BTN3A1 eine größere Bedeutung für die Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung haben könnte als die extrazelluläre; und dass vi) trotz der Bedeutung von BTN3A1 für die Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen, die Möglichkeit besteht, dass viele Moleküle mit redundanter Funktion bei der Eliminierung von Influenza Viren durch diese Zellen eine Rolle spielen. Zusammenfassend lässt sich als Hypothese ein mögliches Modell aufstellen, in dem BTN3A1 in Assoziation mit einem oder mehreren zusätzlichen Proteinen zytoplasmatische Prenylpyrophosphate mittels der B30.2 Domäne detektiert. Die Bindung der PAg an diese Domäne würde dann eine Multimerisierung von BTN3A1 oder eine Konformationsänderung der extrazellulären Domäne (wie auch durch mAk 20.1 herbeigeführt) induzieren. Diese Modifizierungen könnten vom Vγ9Vδ2 TCR oder von einem assoziierten T Zellprotein erkannt werden. Für den Fall einer direkten Erkennung von BTN3A1 durch den TCR würde der Grad der T Zellantwort vom Vγ9Vδ2 TCR Klonotyp abhängen. Zukünftige Forschung wird ein besseres Verständnis von BTN3A1, dessen Proteininteraktionen, dessen Rolle in der Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung, und dessen Bedeutung in spezifischen Krebs- oder Infektionsmodellen ermöglichen. Wissen, das benötigt wird, um diese Zellen effizient in klinischen Therapien einzusetzen. KW - gamma delta T cells KW - Vgamma9Vdelta2 T cells KW - phosphoantigen KW - HMBPP KW - IPP KW - butyrophilin 3A KW - human chromosome 6 KW - monoclonal antibody 20.1 KW - monoclonal antibody 103.2 KW - influenza A virus KW - T cell activation KW - T-Lymphozyt KW - Immunmodulation KW - In vitro Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142084 ER - TY - THES A1 - Holzmeister, Ib T1 - Branched silica precursors as additives for mineral bone cements T1 - Verzweigte Silica-Vorläufer als Additive für mineralische Knochenzemente N2 - Mineral biocements are brittle materials, which usually results in catastrophic failure during mechanical loading. Here, previous works demonstrated the feasibility of reducing brittleness by a dual-setting approach, in which a silica sol was simultaneously gelled during the setting of a brushite forming cement. The current thesis aimed at further improving this concept by both using a novel silicate based cement matrix for an enhanced bonding between cement and silica matrix as well as multifunctional silica precursors to increase the network density of the gel. Due to its well-known biocompatibility and osteogenic regeneration capacity, baghdadite was chosen as mineral component of such composites. This required in a first approach the conversion of baghdadite ceramics into self-setting cement formulations. This was investigated initially by using baghdadite as reactive filler in a brushite forming cement (Chapter 4). Here, the ß-TCP component in a equimolar mixture of ß-TCP and acidic monocalcium phosphate anhydrous was subsequently replaced by baghdadite at various concentrations (0, 5, 10, 20, 30, 50, and 100 wt%) to study the influence on physicochemical cement properties such as mechanical performance, radiopacity, phase composition and microstructure. X-ray diffraction profiles demonstrated the dissolution of baghdadite during the cement reaction without affecting the crystal structure of the precipitated brushite phase. In addition, EDX analysis showed that calcium is homogeneously distributed in the cement matrix, while zirconium and silicon form cluster-like aggregates ranging in size from a few micrometers to more than 50 µm. X-ray images and µ-CT analyses indicate improved X-ray visibility with increased incorporation of baghdadite in brushite cement, with an aluminum equivalent thickness nearly doubling at a baghdadite content of 50 wt%. At the same time, the compressive strength of brushite cement increased from 12.9 ± 3.1 MPa to 21.1 ± 4.1 MPa at a baghdadite content of 10 wt%. Cell culture medium conditioned with powdered brushite cement approached physiological pH values when increasing amounts of baghdadite were added to the cement (pH = 6.47 for pure brushite, pH = 7.02 for brushite with 20 wt% baghdadite substitution). Baghdadite substitution also affected the ion content in the culture medium and thus the proliferation activity of primary human osteoblasts in vitro. The results demonstrated for the first time the suitability of baghdadite as a reactive cement additive for improving the radiopacity, mechanical performance, and cytocompatibility of brushite cements. A second approach (Chapter 5) aimed to produce single component baghdadite cements by an increase of baghdadite solubility to initiate a self-setting cement reaction. For this, the material was mechanically activated by longer grinding times of up to 24h leading to both a decrease in particle and crystallite size as well as a partial amorphization of baghdadite. Baghdadite cements were formed by adding water at a powder to liquid ratio of 2.0 g/ml. Maximum compressive strengths were determined to be ~2 MPa after 3 days of setting for a 24-hour ground material. Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) measurements showed an incongruent dissolution profile of the set cements, with preferential dissolution of calcium and only minor release of zirconium ions. Cement formation occurs under alkaline conditions, with the unground raw powder resulting in a pH of 11.9 during setting, while prolonged grinding increases the pH to about 12.3. Finally, mechanically activated baghdadite cements were combined with inorganic silica networks (Chapter 6) to create dual-setting cements with a further improvement of mechanical performance. While a modification of the cement pastes with a TEOS derived sol was already thought to improve strength, it was hypothesized that using multi-arm silica precursors can further enhance their mechanical performance due to a higher network density. In addition, this should also reduce pore size of both gels and cement and hence will be able to adjust the release kinetics of incorporated drugs. For this, multi-armed silica precursors were synthesized by the reaction of various multivalent alcohols (ethylene glycol, glycerine, pentaerythrit) with an isocyanate modified silica precursor. After hydrolysis under acidic conditions, the sols were mixed with baghdadite cement powders in order to allow a simultaneous gel formation and cement setting. Since the silica monomers have a high degree of linkage sites, this resulted in a branched network that interpenetrated with the growing cement crystals. In addition to minor changes in the crystalline phase composition as determined by X-ray diffraction, the novel composites exhibited improved mechanical properties with up to 20 times higher compressive strength and further benefit from an about 50% lower overall porosity than the reference pure baghdadite cement. In addition, the initial burst release of the model drug vancomycin was completely inhibited by the added silica matrix. This observation was verified by testing for the antimicrobial activity with Staphylococcus aureus by measuring the inhibition zones of selected samples after 24 h and 48 h, whereas the antimicrobial effectiveness of a constant vancomycin release could be demonstrated. The current thesis clearly demonstrated the high potential of baghdadite as a cement formulation for medical application. The initially poor mechanical properties of such cements can be overcome by special processing techniques or by combination with silica networks. The achieved mechanical performance is > 10 MPa and hence suitable for bone replacement under non-load bearing conditions. The high intrinsic radiopacity as well as the alkaline pH during setting may open the way ahead to further dental applications, e.g. as root canal sealers or filler in dental composites. Here, the high pH is thought to lead to antimicrobial properties of such materials similar to commonly applied calcium hydroxide or calcium silicates, however combined with an intrinsic radiopacity for X-ray imaging. This would simplify such formulations to single component materials which are less susceptible to demixing processes during transport, storage or processing. N2 - Mineralische Biozemente sind spröde Materialien, die bei mechanischer Belastung in der Regel ein katastrophales Versagen zeigen. In früheren Arbeiten konnte die Sprödigkeit durch einen dual-härtenden Materialansatz verringert werden, bei dem ein dem Zement zugesetztes Kieselsol während des Aushärtens eines Bruschit-bildenden Zements simultan geliert und so die Matrix verstärkt. Die vorliegende Arbeit zielte darauf ab, dieses Konzept weiter zu verbessern, indem sowohl eine neuartige Zementmatrix auf Silikatbasis für eine verbesserte Bindung zwischen Zement und Kieselsäurematrix als auch multifunktionale Kieselsäure Precursoren zur Erhöhung der Netzwerkdichte des Gels verwendet wurden. Aufgrund der nachgewiesenen Biokompatibilität und osteogenen Regenerationsfähigkeit wurde Baghdadit als mineralischer Bestandteil solcher Komposite gewählt. Dies erforderte in einem ersten Ansatz die Umwandlung von Baghdadit-Keramik in selbsthärtende Zementformulierungen. Dies wurde zunächst durch die Verwendung von Baghdadit als reaktiver Füllstoff in einem Bruschit-bildenden Zement untersucht (Kapitel 4). Dabei wurde die β-TCP-Komponente in einem äquimolaren Gemisch aus β-TCP und saurem Monocalciumphosphat sukzessive durch Baghdadit in verschiedenen Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 30, 50 und 100 Gew.-%) ersetzt, um den Einfluss auf die physikalisch-chemischen Zementeigenschaften, wie mechanische Festigkeit, Röntgenopazität, Phasenzusammensetzung und Mikrostruktur zu untersuchen. Röntgenbeugungsprofile zeigten die Auflösung von Baghdadit während der Zementreaktion, ohne die Kristallstruktur der ausgefällten Bruschitphase zu beeinträchtigen. Darüber hinaus zeigte die EDX-Analyse, dass Calcium homogen in der Zementmatrix verteilt ist, während Zirkon und Silizium clusterartige Aggregate mit einer Größe von einigen Mikrometern bis zu mehr als 50 µm bilden. Röntgenbilder und µ-CT-Analysen zeigen eine verbesserte Röntgensichtbarkeit bei erhöhtem Baghdadit-Anteil im Bruschit-Zement, wobei sich die Aluminium-Äquivalentdicke bei einem Baghdadit-Gehalt von 50 Gew.-% nahezu verdoppelt. Gleichzeitig stieg die Druckfestigkeit von Bruschitzement von 12,9 ± 3,1 MPa auf 21,1 ± 4,1 MPa bei einem Baghdaditgehalt von 10 Gew.-%. Zellkulturmedium, das mit pulverförmigem Bruschitzement konditioniert wurde, näherte sich physiologischen pH-Werten an, wenn dem Zement steigende Mengen an Baghdadit zugesetzt wurden (pH = 6,47 für reinen Bruschitzement, pH = 7,02 für Bruschitzement mit 20 Gew.-% Baghdadit-Substitution). Die Baghdadit-Substitution wirkte sich auch auf den Ionengehalt im Kulturmedium und damit auf die Proliferationsaktivität von primären menschlichen Osteoblasten in vitro aus. Die Ergebnisse zeigten zum ersten Mal die Eignung von Baghdadit als reaktives Zementadditiv zur Verbesserung der Röntgenopazität, der mechanischen Eigenschaften und der Zytokompatibilität von Bruschitzementen. Ein zweiter Ansatz (Kapitel 5) zielte auf die Herstellung einkomponentiger Baghdadit-Zemente durch eine Erhöhung der Baghdadit-Löslichkeit ab, um eine Zementreaktion zu initiieren. Dazu wurde das Material durch längere Mahlung von bis zu 24 Stunden mechanisch aktiviert, was sowohl zu einer Abnahme der Partikel- und Kristallitgröße, als auch zu einer teilweisen Amorphisierung von Baghdadit führte. Baghdadit-Zemente wurden durch Zugabe von Wasser bei einem Verhältnis von Pulver zu Flüssigkeit von 2,0 g/ml erhalten. Die maximalen Druckfestigkeiten wurden mit ~2 MPa nach 3 Tagen Aushärtung für ein 24 Stunden gemahlenes Material ermittelt. Massenspektrometrische Messungen mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) ergaben ein inkongruentes Auflösungsprofil der abgebundenen Zemente mit einer bevorzugten Auflösung von Calcium und einer nur geringen Freisetzung von Zirkonium-Ionen. Die Zementbildung erfolgt unter alkalischen Bedingungen, wobei das ungemahlene Rohpulver während des Abbindens einen pH-Wert von 11.9 aufweist, während ein längeres Mahlen den pH-Wert auf etwa 12.3 erhöht. Abschließend wurden mechanisch aktivierte Baghdadit-Zemente mit anorganischen Silica-Netzwerken kombiniert (Kapitel 6), um dual härtende Zemente mit einer weiteren Verbesserung der mechanischen Eigenschaften zu erhalten. Während eine Modifikation der Zementpasten mit einem TEOS-abgeleiteten Sol bereits die Festigkeit verbessern sollte, wurde angenommen, dass die Verwendung von mehrarmigen Kieselsäure-Precursoren die mechanische Festigkeit aufgrund einer höheren Netzwerkdichte weiter verbessern kann. Darüber hinaus sollte sich auch die Porengröße von Gelen und Zement verringern, so dass die Freisetzungskinetik von inkorporierten Wirkstoffen angepasst werden kann. Zu diesem Zweck wurden mehrarmige Kieselsäure-Precursoren durch die Reaktion verschiedener mehrwertiger Alkohole (Ethylenglykol, Glycerin, Pentaerythrit) mit einem isocyanatmodifizierten Kieselsäure-Precursor synthetisiert. Nach der Hydrolyse unter sauren Bedingungen wurden die Sole mit Baghdadit-Zementpulvern gemischt, um eine gleichzeitige Gelbildung und Zementabbindung zu ermöglichen. Da die Kieselsäuremonomere einen hohen Grad an Verknüpfungsstellen aufweisen, führte dies zu einem verzweigten Netzwerk, das die ausfallenden Zementkristalle durchdrang. Neben geringfügigen Veränderungen in der Zusammensetzung der durch Röntgenbeugung bestimmten kristallinen Phasen, wiesen die neuartigen Komposite verbesserte mechanische Eigenschaften mit einer bis zu 20-fach höheren Druckfestigkeit auf und profitierten außerdem von einer um etwa 50 % geringeren Gesamtporosität als der reine Baghdadit-Referenzzement. Darüber hinaus wurde die anfängliche starke Freisetzung („burst release“) des Modellwirkstoffs Vancomycin durch die zugesetzte Silica-Matrix vollständig gehemmt. Diese Beobachtung wurde durch Prüfung der antimikrobiellen Aktivität mit Staphylococcus aureus durch Messung des Hemmhofs im Agar-Diffusionstest ausgewählter Proben nach 24 h und 48 h verifiziert, wobei die antimikrobielle Wirksamkeit einer konstanten Vancomycin-Freisetzung nachgewiesen werden konnte. Die vorliegende Arbeit zeigte deutlich das hohe Potenzial von Baghdadit Zementformulierungen für medizinische Anwendungen. Die anfänglich schlechten mechanischen Eigenschaften solcher Zemente können durch spezielle Verarbeitungstechniken oder durch die Kombination mit Silicanetzwerken überwunden werden. Die erzielten mechanischen Eigenschaften liegen bei > 10 MPa und die Materialien eignen sich daher für den Knochenersatz unter nicht-lasttragenden Bedingungen. Die hohe intrinsische Röntgenopazität sowie der alkalische pH-Wert während der Aushärtung könnten den Weg für weitere dentale Anwendungen öffnen, z. B. als Wurzelkanal-Zemente oder Füllstoff in Dentalkompositen. Hier ist davon auszugehen, dass der hohe pH-Wert zu antimikrobiellen Eigenschaften solcher Materialien führt, ähnlich wie bei den üblicherweise verwendeten Calciumhydroxiden oder Calciumsilikaten, jedoch in Kombination mit einer intrinsischen Röntgenopazität. Dies würde solche Formulierungen zu einkomponentigen Systemen vereinfachen, die weniger anfällig für Entmischungsprozesse während Transport, Lagerung oder Verarbeitung sind. KW - Zement KW - Sol-gel KW - Baghdadite KW - Cement KW - Silica precursor KW - Dual-setting Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-275044 ER - TY - THES A1 - Kaufmann, Tobias T1 - Brain-computer interfaces based on event-related potentials: toward fast, reliable and easy-to-use communication systems for people with neurodegenerative disease T1 - Gehirn-Computer Schnittstellen basierend auf ereigniskorrelierten Potentialen: Entwicklung von schnellen, zuverlässigen und leicht zu bedienenden Kommunikationssystemen für Menschen mit neurodegenerativer Erkrankung N2 - Objective: Brain Computer Interfaces (BCI) provide a muscle independent interaction channel making them particularly valuable for individuals with severe motor impairment. Thus, different BCI systems and applications have been proposed as assistive technology (AT) solutions for such patients. The most prominent system for communication utilizes event-related potentials (ERP) obtained from the electroencephalogram (EEG) to allow for communication on a character-by-character basis. Yet in their current state of technology, daily life use cases of such systems are rare. In addition to the high EEG preparation effort, one of the main reasons is the low information throughput compared to other existing AT solutions. Furthermore, when testing BCI systems in patients, a performance drop is usually observed compared to healthy users. Patients often display a low signal-to-noise ratio of the recorded EEG and detection of brain responses may be aggravated due to internally (e.g. spasm) or externally induced artifacts (e.g. from ventilation devices). Consequently, practical BCI systems need to cope with mani-fold inter-individual differences. Whilst these high demands lead to increasing complexity of the technology, daily life use of BCI systems requires straightforward setup including an easy-to-use graphical user interface that nonprofessionals can handle without expert support. Research questions of this thesis: This dissertation project aimed at bringing forward BCI technology toward a possible integration into end-users' daily life. Four basic research questions were addressed: (1) Can we identify performance predictors so that we can provide users with individual BCI solutions without the need of multiple, demanding testing sessions? (2) Can we provide complex BCI technology in an automated, user-friendly and easy-to-use manner, so that BCIs can be used without expert support at end-users' homes? (3) How can we account for and improve the low information transfer rates as compared to other existing assistive technology solutions? (4) How can we prevent the performance drop often seen when bringing BCI technology that was tested in healthy users to those with severe motor impairment? Results and discussion: (1) Heart rate variability (HRV) as an index of inhibitory control (i.e. the ability to allocate attention resources and inhibit distracting stimuli) was significantly related to ERP-BCI performance and accounted for almost 26% of variance. HRV is easy to assess from short heartbeat recordings and may thus serve as a performance predictor for ERP-BCIs. Due to missing software solutions for appropriate processing of artifacts in heartbeat data (electrocardiogram and inter-beat interval data), our own tool was developed that is available free of charge. To date, more than 100 researchers worldwide have requested the tool. Recently, a new version was developed and released together with a website (www.artiifact.de). (2) Furthermore, a study of this thesis demonstrated that BCI technology can be incorporated into easy-to-use software, including auto-calibration and predictive text entry. Naïve, healthy nonprofessionals were able to control the software without expert support and successfully spelled words using the auto-calibrated BCI. They reported that software handling was straightforward and that they would be able to explain the system to others. However, future research is required to study transfer of the results to patient samples. (3) The commonly used ERP-BCI paradigm was significantly improved. Instead of simply highlighting visually displayed characters as is usually done, pictures of famous faces were used as stimulus material. As a result, specific brain potentials involved in face recognition and face processing were elicited. The event-related EEG thus displayed an increased signal-to-noise ratio, which facilitated the detection of ERPs extremely well. Consequently, BCI performance was significantly increased. (4) The good results of this new face-flashing paradigm achieved with healthy participants transferred well to users with neurodegenerative disease. Using a face paradigm boosted information throughput. Importantly, two users who were highly inefficient with the commonly used paradigm displayed high accuracy when exposed to the face paradigm. The increased signal-to-noise ratio of the recorded EEG thus helped them to overcome their BCI inefficiency. Significance: The presented work at hand (1) successfully identified a physiological predictor of ERP-BCI performance, (2) proved the technology ready to be operated by naïve nonprofessionals without expert support, (3) significantly improved the commonly used spelling paradigm and (4) thereby displayed a way to effectively prevent BCI inefficiency in patients with neurodegenerative disease. Additionally, missing software solutions for appropriate handling of artifacts in heartbeat data encouraged development of our own software tool that is available to the research community free of charge. In sum, this thesis significantly improved current BCI technology and enhanced our understanding of physiological correlates of BCI performance. N2 - Zielsetzung: Gehirn-Computer Schnittstellen (engl. Brain-Computer Interface, BCI) bilden einen muskel-unabhängigen Interaktionskanal, was sie besonders für Menschen mit starken, motorischen Einschränkungen wertvoll macht. Daher wurden verschiedene BCI-Systeme und -Anwendungen als unterstützende Technologien (UT) für diese Patienten vorgeschlagen. Das am häufigsten verwendete System zu Kommunikationszwecken basiert auf ereigniskorrelierten Potentialen (EKP) des Elektroenzephalogramms (EEG) und ermöglicht es Buchstabe für Buchstabe zu kommunizieren. Zum derzeitigen Stand der Technik sind Berichte über alltägliche Verwendung von BCI-Systemen jedoch selten. Zusätzlich zu dem hohen Präparationsaufwand, der mit dem Messen eines EEGs verbunden ist, ist eine der Hauptursachen der verhältnismäßig geringe Informationstransfer im Vergleich zu anderen existierenden UT-Lösungen. Zudem wird häufig beobachtet, dass das BCI-Kontrollvermögen bei Patienten deutlich niedriger ist als bei gesunden Nutzern. Das EEG von Patienten weißt häufig ein niedrigeres Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf und die Erkennung von Hirnantworten kann durch interne (z. B. Spasmus) oder externe Artefakte (z. B. von einem Beatmungsgerät herrührend) zusätzlich erschwert werden. Somit müssen praxisrelevante BCI-Systeme mit einer Vielfalt von interindividuellen Unterschieden klar kommen. Obschon diese hohen Anforderungen zu einer zunehmend komplexeren Technologie führen, erfordert der Alltagsgebrauch von BCI-Systemen einen einfachen Aufbau inklusive leicht zu bedienender, grafischer Benutzeroberfläche, die von Laien, ohne Unterstützung von Experten, bedient werden kann. Forschungsfragestellungen dieser Dissertationsschrift: Das Dissertationsprojekt bezweckte die Weiterentwicklung von BCI-Systemen, um den Weg für eine Integration in das tägliche Leben von Benutzern zu bahnen. Vier grundlegende Forschungsfragestellungen wurden adressiert: (1) Können Prädiktoren des BCI-Kontrollvermögens gefunden werden, sodass Nutzer mit individuell angepassten BCI-Lösungen versorgt werden können, ohne dass mehrfache, anstrengende Testsitzungen notwendig sind? (2) Kann komplexe BCI-Technologie auf automatisierte, nutzerfreundliche und leicht zu bedienende Weise bereitgestellt werden, sodass BCIs, ohne die Unterstützung von Experten, zuhause verwendet werden können? (3) Wie kann man den im Vergleich zu anderen existierenden UT-Lösungen niedrigen Informationstransferraten begegnen und sie erhöhen? (4) Wie kann ein Abfall des Kontrollvermögens verhindert werden, der häufig in Erscheinung tritt, wenn man BCI-Technologie, die an Gesunden getestet wurde, zu Patienten mit starken motorischen Einschränkungen bringt? Ergebnisse und Diskussion: (1) Herzratenvariabilität als Index des inhibitorischen Kontrollvermögens (die Fähigkeit Aufmerksamkeitsressourcen bereitzustellen und ablenkende Reize zu inhibieren) wurde zu EKP-BCI-Kontrollvermögen in einen signifikanten Bezug gesetzt und klärte beinahe 26% der Varianz auf. HRV ist leicht aus kurzen Aufzeichnungen des Herzschlags zu erheben und könnte daher als Prädiktor des EKP-BCI-Kontrollvermögens dienen. Aufgrund fehlender Softwarelösungen für angemessene Artefaktbehandlung in Aufzeichnungen des Herzschlags (Elektrokardiogramm und Interbeat-Intervall Daten) wurde ein eigenes Programm entwickelt, das frei erhältlich ist. Bis heute wurde es von mehr als 100 Wissenschaftlern weltweit angefordert. Unlängst wurde zudem eine neue Version entwickelt, die zusammen mit einer Website veröffentlicht wurde (www.artiifact.de). (2) Des Weiteren zeigte eine Studie dieser Dissertation, dass BCI-Technologie samt Auto-Kalibration und Wortvervollständigung in eine leicht zu bedienende Software integriert werden kann. Ungeschulte, gesunde Probanden waren in der Lage die Software ohne Unterstützung von Experten zu bedienen und buchstabierten mit dem auto-kalibrierten BCI erfolgreich Wörter. Sie gaben an, dass die Bedienung der Software leicht zu tätigen sei und dass sie in der Lage wären, das System anderen zu erklären. Jedoch muss zukünftige Forschung klären, ob sich die Ergebnisse auf Patienten übertragen lassen. (3) Das häufig verwendete EKP-BCI-Paradigma wurde signifikant verbessert. Statt - wie normalerweise getätigt - visuell präsentierte Buchstaben einfach aufleuchten zu lassen, wurden Bilder berühmter Gesichter als Stimulationsmaterial verwendet. Hierdurch wurden spezifische Gehirnpotentiale der Gesichtserkennung und -verarbeitung ausgelöst. Das ereigniskorrelierte EEG wies daher ein höheres Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf, was die Detektion von EKPs stark vereinfachte. Infolgedessen war das BCI-Kontrollvermögen signifikant erhöht. (4) Die guten Ergebnisse dieses neuen Gesichter-Stimulus-Paradigmas, die mit gesunden Probanden erreicht wurden, ließen sich gut auf Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen übertragen. Die Verwendung eines Gesichter-Paradigmas erhöhte den Informationstransfer erheblich. Zwei Nutzer, die sehr ineffizient im Umgang mit dem herkömmlichen BCI-System waren, erreichten zudem ein hohes Kontrollvermögen mit dem Gesichter-Paradigma. Das erhöhte Signal-zu-Rausch-Verhältnis des aufgezeichneten EEGs half ihnen somit ihre BCI Ineffizienz zu überwinden. Signifikanz: Die hier vorgestellte Arbeit (1) identifizierte einen physiologischen Prädiktor des EKP-BCI-Kontrollvermögens, (2) zeigte, dass die Technologie bereit ist für die Verwendung durch ungeschulte Laien ohne Unterstützung von Experten, (3) verbesserte das herkömmliche Kommunikationsparadigma signifikant, und (4) zeigte hierdurch einen Weg auf, die BCI Ineffizienz von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen effektiv zu verhindern. Die fehlende Softwarelösung zur angemessenen Behandlung von Artefakten in Aufzeichnungen des Herzschlags animierte zudem zur Entwicklung einer eigenen Anwendung, die der Wissenschaftsgemeinschaft kostenfrei zur Verfügung gestellt wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass dieses Dissertationsprojekt somit derzeitige BCI-Technologie signifikant verbesserte und unser Verständnis physiologischer Korrelate des BCI-Kontrollvermögens erweiterte. KW - Gehirn-Computer-Schnittstelle KW - Herzfrequenzvariabilität KW - Nervendegeneration KW - BCI KW - HRV Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83441 ER - TY - THES A1 - Weidner, Magdalena Theodora T1 - Brain serotonin throughout development - for better and for worse T1 - Der Effekt von Serotonin im sich entwickelnden Gehirn - in guten wie in schlechten Tagen N2 - The work presented in this thesis covers the effects of early-life adversity in the context of altered serotonin (5-HT; 5-hydroxytryptamine) system functioning in mice. The main body is focussing on a screening approach identifying molecular processes, potentially involved in distinct behavioural manifestations that emerge from or are concomitant with early adversity and, with regard to some behavioural manifestations, dependent on the functioning of the 5-HT system. N2 - Diese Arbeit berichtet Ergebnisse der umfassenden Erforschung des Einflusses von aversiven Bedingungen während der pränatalen und frühkindlichen Entwicklungsphase, unter dem Einfluss genetischer Variationen des serotonergen (5-HT, 5-Hydroxytryptamin) Systems, im Mausmodel. Der Hauptfokus der Thesis lag bei der hypothesenfreien Untersuchung der Konsequenzen, die durch den kombinierten Effekt aversiver Bedingungen, und genetischer Prädisposition ausgelöst werden, sowie, final, der Ermittlung potentieller Kandidatengene, die an der Manifestierung verhaltensbezogener Konsequenzen beteiligt sein können sowie durch epigenetische Mechanismen reguliert werden. KW - Gehirn KW - Serotonin KW - Entwicklung KW - Stress KW - epigenetics KW - early-life stress KW - rodent model KW - behaviour Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163345 SN - 978-94-6233-940-8 N1 - This document is also published by the University library Maastricht. Maastricht University holds the same rights as University of Würzburg PB - Magdalena T. Weidner CY - Maastricht, the Netherlands ER - TY - THES A1 - Volpato, Daniela T1 - Bitopic Ligands and their molecular fragments for the study of the M1 Muscarinic Receptor T1 - Bitopische Liganden und ihre Molekülfragmente für die Untersuchung des M1 Muskarinischen Rezeptors N2 - The past decades have witnessed the development of new pharmaceutical compounds that modulate receptor function by targeting allosteric sites. Allosteric sites are, by definition, domains topographically distinct from the orthosteric binding pocket where the natural ligand binds. Exploring the possibilities of linking orthosteric and allosteric pharmacophores in one compound to yield ‘bitopic’ compounds is a strategy derived from the “message-address” concept by Schwyzer , first applied to GPCRs by Portoghese et al. This concept explicitly underlines the orthosteric/allosteric combination, in opposite to the more general umbrella term bivalent. The broad possibilities of bitopic ligands in the pharmaceutical field are under continuous study. Bitopic compounds are promising pharmaceutical tools for taking advantage of the allosteric binding to achieve subtype selectivity while preserving high affinity at the receptor. The development of bitopic ligands, based on the idea of combining high affinity (via orthosteric sites) with high selectivity (via allosteric sites), have led to the development of highly selective bivalent ligands for GPCRs , such as for the opioid receptors , muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), serotonin receptors, cannabinoid receptors, and gonadotropin-releasing hormone receptors. This concept has even been extended to other receptors, for examples nicotinic receptors and other proteins, such as acetylcholinesterases and the tyrosine kinase receptors TrkA and TrkC. The reasons to pursue a bitopic ligand approach are various. An improved affinity for the target GPCR and/or an improved selectivity either at the level of receptor subtype, or at the level of signaling pathway. Another advantage of bitopic ligands over purely allosteric ligands is that the former rely on the appropriate presence of endogenous agonist tone to mediate their effects, whereas a bitopic ligand would engage the orthosteric site irrespective of the presence or absence of endogenous tone. By way of introduction to the hybrid approach, a review of the concept of hybrids compounds targeting the cholinergic system is presented in section A of this thesis. Recent updates in hybrid molecule design as a strategy for selectively addressing multiple target proteins involved in Alzheimer's disease (AD) is here reported . This represents the potential and the growing interest in hybrid compound as pharmacological tools to achieve receptor subtype selectivity and/or, to study the overall functional activity of the receptor. Until now, muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) have proved to be a particularly fruitful receptor model for the development and characterization of bitopic ligands. In this thesis, several examples of new muscarinic bitopic approach are reported in the results section. A study of bipharmacophoric ligands composed of the muscarinic positive allosteric modulators (BQCAderived compounds) linked with chain of various lengths to different orthosteric building blocks is reported in the result part 1. Synthesis and examination of the potential pharmacological characteristic of Oxotremorine-BQCAd compounds and Xanomeline-BQCAd hybrid derivatives are described in results parts 2 and 4, respectively. Moreover, the bitopic concept has even been extended to other proteins, such as acetylcholinesterase. In the result part 5 an overview of the new Tacrine-Xanomeline hybrids aiming to improve the inhibitory potency of the acetylcholinesterase and simultaneously to increase the cholinergic tone, via the xanomelinic portion acting on the M1 receptor is given. A new trivalent approach is presented for the first time to deepen the study of the M1 muscarinic receptor in the result part 6. Moreover, the synthesis of a new series of iperoxo-derived alkane, bis(ammonio)alkane-type and rigidified chain ligands is given in the result part 7 together with some prospects for further research. N2 - Mit zunehmendem Alter der Bevölkerung werden altersbedingte Krankheiten, insbesondere neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD), häufiger und stellen darüber hinaus ein soziales und wirtschaftliches Problem für die Gesellschaft dar1,2. AD ist eine schwere altersabhängige neurodegenerative Erkrankung des Gehirns, die mit Gedächtnisverlust und einer Abnahme der kognitiven Funktionen verbunden ist und immer weiter fortschreitet. Die Krankheit ist derzeit unheilbar und aufgrund des demographischen Wandels wird ein starker Anstieg an Betroffenen erwartet. Daher beschäftigt sich eine Vielzahl wissenschaftlicher Studien mit der Prävention und der Behandlung von AD. Derzeit besteht das Hauptziel darin, die Ursachen und Mechanismen dieser Krankheit durch innovative Grundlagenforschung zu verstehen. AD ist ein komplexes Zusammenspiel verschiedener pathologischer Merkmale2,4. Diese besonderen Merkmale der Krankheit, die gleichzeitig auftreten, müssen untersucht und gleichzeitig untersucht werden, um wirksame und selektive Medikamente zu entwickeln. Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit zwei Zielstrukturen der cholinergen Hypothese zur Entstehung von AD: dem muskarinischen M1-Rezeptor5,6 und der AChE7 unter Verwendung des Hybridisierungsansatzes. Zunächst wurden vermeintlich selektive M1 Agonisten entwickelt und synthetisiert. Diese sollten die cholinerge Transmission verstärken um die cholinerge Funktion in Alzheimer Patienten zu verbessern. Hierbei wurde die Hybridisierung durch die kovalente Verbindung einer allosterischen und einer orthosterischen Einheit in einem Molekül durchgeführt. ... KW - Ligand KW - Bitopic Ligands KW - Muscarinrezeptor KW - M1 Muscarinic Receptor KW - Bitopische Liganden Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248815 ER - TY - THES A1 - Peters, Katharina T1 - Biological Substrates of Waiting Impulsivity in Children and Adolescents with and without ADHD T1 - Biologische Substrate der Warte-Impulsivität bei Kindern und Jugendlichen mit und ohne ADHS N2 - Focus of the present work were the questions whether and how the concept of waiting impulsivity (WI), defined as the ability to regulate a response in anticipation of reward and measured by the 4-choice serial reaction time task (4-CSRTT), may contribute to our understanding of Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) and its neurobiological underpinnings. To address this topic, two studies were conducted: in a first study, the relationship be-tween 4-CSRTT behavioral measures, neural correlates and ADHD symptom domains, i.e. inattention (IA) and hyperactivity/impulsivity (H/I) was explored in a pooled sample of 90 children and adolescents with (n=44) and without (n=46) ADHD diagnosis. As ex-pected, IA was associated with dorsolateral prefrontal brain regions linked with executive functions and attentional control, which was evident on the structural and the functional level. Higher levels of both IA and H/I covaried with decreased activity in the right ven-trolateral prefrontal cortex (PFC), a central structure for response inhibition. Moderation analyses revealed that H/I-related decreased activation in this region did not map linearly on difficulties on the behavioral level: brain activation was a significant predictor of task accuracy only, when H/I symptoms were low/absent but not for clinically relevant ADHD symptoms. Further, H/I was implicated in dysfunctional top-down control of reward eval-uation. Both symptom domains correlated positively with hippocampus (HC) activity in anticipation of reward. In addition, for high H/I symptoms, greater activation in the HC was found to correlate with higher motivation on the behavioral level, indicating that rein-forcement-learning and/or contingency awareness may contribute to altered reward pro-cessing in ADHD patients. In a second study, the possible serotonergic modulation of WI and the ADHD-WI relation-ship was addressed in a sub-sample comprising 86 children and adolescents of study I. The effects of a functional variant in the gene coding for the rate-limiting enzyme in the synthesis of brain serotonin on behavior and structure or function of the WI-network was investigated. Moderation analyses revealed that on the behavioral level, a negative corre-lation between accuracy and IA was found only in GG-homozygotes, whereas no signifi-cant relationship emerged for carriers of the T-allele. This is in line with previous reports of differential effects of serotonergic modulation on attentional performance depending on the presence of ADHD symptoms. A trend-wise interaction effect of genotype and IA for regional volume of the right middle frontal gyrus was interpreted as a hint towards an involvement of the PFC in this relationship, although a more complex mechanism includ-ing developmental effects can be assumed. In addition, interaction effects of genotype and IA were found for brain activation in the amygdala (AMY) und HC during perfor-mance of the 4-CSRTT, while another interaction was found for H/I symptoms and geno-type for right AMY volume. These findings indicate a serotonergic modulation of coding of the emotional value of reward during performance of the 4-CSRTT that varies de-pending on the extent of psychopathology-associated traits. Taken together, it was shown that the 4-CSRTT taps distinct domains of impulsivity with relevance to ADHD symptomatology: (proactive) response inhibition difficulties in relation with anticipation of reward. Furthermore, the two symptom domains, IA and H/I, contrib-ute differently to WI, which emphasizes the need to distinguish both in the research of ADHD. The results of study II emphasized the relevance of serotonergic transmission especially for attentional control and emotional processing. Although the present findings need replication and further refinement in more homogenous age groups, the use of the 4-CSRTT with a dimensional approach is a very promising strategy, which will hopefully extend our understanding of impulsivity-related mental disorders in the future. N2 - Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht das Konzept der Warte-Impulsivität (WI), definiert als die Fähigkeit der Antwort-Inhibition, während eine Belohnung erwartet wird, welche mittels des 4-choice serial reaction time task (4-CSRTT) erfasst werden kann. Es sollte untersucht werden ob und auf welche Weise WI und der 4-CSRTT genutzt werden können, um die neurobiologischen Grundlagen der Aufmerksamkeits-Defizit/Hyperaktivitäts-Störung (ADHS) besser zu verstehen. Es wurden zwei Studien durchgeführt: In einer ersten Studie wurde der Zusammenhang zwischen 4-CSRTT Verhaltensmaßen, ihren neuronalen Korrelaten und den ADHS Kern-Symptomen, Unaufmerksamkeit (IA) und Hyperaktivität/Impulsivität (H/I), überprüft. Es wurden 90 Kinder und Jugendliche mit (n=44) und ohne (n=46) ADHS-Diagnose unter-sucht. Erwartungsgemäß war IA, auf funktioneller und struktureller Ebene, mit dorsolate-ralen präfrontalen Hirnregionen assoziiert, die für Exekutivfunktionen und die Aufmerk-samkeitskontrolle zuständig sind. Stärkere Ausprägungen von IA und H/I gingen mit ver-ringerter Aktivität im rechten ventrolateralen präfrontalen Cortex (PFC), einer zentralen Struktur für die Inhibition von Antworten, einher. Moderationsanalysen ergaben, dass diese H/I-assoziierte geringere Aktivität nicht direkt mit Einschränkungen auf Verhaltens-ebene zusammenhing: Die Hirnaktivierung war nur in Abwesenheit von H/I Symptomen ein signifikanter Prädiktor der Sorgfaltsleistung, was bei stärkerer ADHS-Symptomatik nicht der Fall war. Darüber hinaus wiesen die Ergebnisse auf einen Zusammenhang zwi-schen H/I und dysfunktionaler Belohnungsverarbeitung hin. Beide Symptombereiche korrelierten während der Belohnungserwartung positiv mit Aktivität im Hippocampus (HC). Zusätzlich zeigte sich, dass bei stark ausgeprägten H/I-Symptomen eine höhere HC-Aktivierung mit höherer Motivation auf Verhaltensebene einher ging. Dies deutet da-rauf hin, dass Lernprozesse und ein Bewusstsein für Kontingenz bei der Verarbeitung von Belohnungen bei ADHS eine Rolle spielen könnten. In einer zweiten Studie wurde eine mögliche serotonerge Modulation von WI und dem WI-ADHS Zusammenhang betrachtet. Eine Teilstichprobe von 86 Probanden aus Studie I wurde untersucht. Eine funktionelle Genvariante des Enzyms, welches den entschei-denden Schritt in der Serotonin-Synthese im Gehirn katalysiert, wurde bezüglich seiner Effekte auf WI-Verhalten sowie Struktur und Funktion des WI-Netzwerks getestet. Mode-rationsanalysen zeigten, dass auf Verhaltensebene eine negative Korrelation zwischen IA und der Sorgfaltsleistung bei GG-Homozygoten, aber kein signifikanter Zusammenhang für Träger des T-Allels bestand. Unterschiedliche Effekte von serotonerger Modulation auf die Aufmerksamkeitsleistung in Abhängigkeit von ADHS-Symptomatik wurden be-reits in der Literatur berichtet. Ein Trend-Effekt für die Interaktion zwischen Genotyp und IA und dem Volumen des rechten Gyrus frontalis medius wurde als Hinweis auf eine Be-teiligung des PFC in diesem Zusammenhang interpretiert. Auf Grund möglicher Entwick-lungseffekte, ist aber ein komplexeres Zusammenspiel der verschiedenen Faktoren an-zunehmen. Interaktionseffekte von Genotyp und IA für Aktivität der Amygdala (AMY) und dem HC sowie für H/I und Genotyp bezüglich des Volumens der rechten AMY könn-ten auf eine serotonerge Modulation der emotionalen Bewertung von Belohnung hindeu-ten, die je nach ADHS-Symptomatik unterschiedlich ausfällt. Zusammenfassend zeigte sich, dass mittels des 4-CSRTT ADHS-relevante Aspekte von Impulsivität untersucht werden können: Schwierigkeiten der Antwortinhibition im Kontext von Belohnungserwartung. Sowohl IA als auch H/I hatten unterschiedlichen Einfluss auf WI. Sie sollten in der ADHS-Forschung differenziert betrachtet werden. Die Ergebnisse der zweiten Studie verdeutlichen, dass die serotonerge Transmission bei ADHS beson-ders bei Aufmerksamkeitsprozessen und emotionaler Verarbeitung eine Rolle spielt. Die vorliegenden Befunde sollten in homogeneren Alterskohorten überprüft werden. Sie ma-chen jedoch Hoffnung, dass mittels des 4-CSRTT und dimensionaler Forschungsansätze psychiatrische Störungen der Impulskontrolle besser verstanden werden können. KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - Impulsivität KW - ADHD KW - Waiting Impulsivity Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246368 ER - TY - THES A1 - Beudert, Matthias T1 - Bioinspired Modification and Functionalization of Hydrogels for Applications in Biomedicine T1 - Biologisch-inspirierte Modifizierung und Funktionalisierung von Hydrogelen für Anwendungen in der Biomedizin N2 - Over the years, hydrogels have been developed and used for a huge variety of different applications ranging from drug delivery devices to medical products. In this thesis, a poly(2-methyl-2-oxazoline) (POx) / poly(2-n-propyl-2-oxazine) (POzi) bioink was modified and analyzed for the use in biofabrication and targeted drug delivery. In addition, the protein fibrinogen (Fbg) was genetically modified for an increased stability towards plasmin degradation for its use as wound sealant. In Chapter 1, a thermogelling, printable POx/POzi-based hydrogel was modified with furan and maleimide moieties in the hydrophilic polymer backbone facilitating post-printing maturation of the constructs via Diels-Alder chemistry. The modification enabled long-term stability of the hydrogel scaffolds in aqueous solutions which is necessary for applications in biofabrication or tissue engineering. Furthermore, we incorporated RGD-peptides into the hydrogel which led to cell adhesion and elongated morphology of fibroblast cells seeded on top of the scaffolds. Additional printing experiments demonstrate that the presented POx/POzi system is a promising platform for the use as a bioink in biofabrication. Chapter 2 highlights the versatility of the POx/POzi hydrogels by adapting the system to a use in targeted drug delivery. We used a bioinspired approach for a bioorthogonal conjugation of insulin-like growth factor I (IGF-I) to the polymer using an omega-chain-end dibenzocyclooctyne (DBCO) modification and a matrix metalloprotease-sensitive peptide linker. This approach enabled a bioresponsive release of IGF-I from hydrogels as well as spatial control over the protein distribution in 3D printed constructs which makes the system a candidate for the use in personalized medicine. Chapter 3 gives a general overview over the necessity of wound sealants and the current generations of fibrin sealants on the market including advantages and challenges. Furthermore, it highlights trends and potential new strategies to tackle current problems and broadens the toolbox for future generations of fibrin sealants. Chapter 4 applies the concepts of recombinant protein expression and molecular engineering to a novel generation of fibrin sealants. In a proof-of-concept study, we developed a new recombinant fibrinogen (rFbg) expression protocol and a Fbg mutant that is less susceptible to plasmin degradation. Targeted lysine of plasmin cleavage sites in Fbg were exchanged with alanine or histidine in different parts of the molecule. The protein was recombinantly produced and restricted plasmin digest was analyzed using high resolution mass spectrometry. In addition to that, we developed a novel time resolved screening protocol for the detection of new potential plasmin cleavage sites for further amino acid exchanges in the fibrin sealant. N2 - Hydrogele wurden im Laufe der Jahre für eine Vielzahl von Anwendungen, von der Verabreichung von Medikamenten bis hin zu medizinischen Produkten, entwickelt und eingesetzt. In dieser Arbeit wurde eine Poly(2-methyl-2-oxazolin) POx) / Poly(2-n-propyl-2- oxazin) (POzi) Biotinte modifiziert und für den Einsatz in der Biofabrikation und für die gezielte Verabreichung von Medikamenten analysiert. Außerdem wurde das Protein Fibrinogen (Fbg) gentechnisch verändert, um seine Stabilität gegenüber dem Plasminabbau in seiner Funktion als Wundkleber zu erhöhen In Kapitel 1 wurde ein thermogelierendes, druckbares Hydrogel auf POx/POzi-Basis mit Furan- und Maleimid-Funktionen im hydrophilen Polymerrückgrat modifiziert, was die Reifung der Konstrukte nach dem Druck durch Diels-Alder-Chemie bewirkt. Die Modifizierung ermöglichte eine langfristige Stabilität der Hydrogele in wässrigen Lösungen, was für Anwendungen im Bereich der Biofabrikation oder im Tissue Engineering erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir RGD-Peptide in das Hydrogel integriert, was zur Zelladhäsion und einer verlängerten Morphologie von Fibroblasten, die auf den Gelen ausgesät wurden, führte. Weitere Druckexperimente zeigen außerdem, dass das POx/POzi-System eine vielversprechende Plattform für den Einsatz als Biotinte in der Biofabrikation ist. Kapitel 2 unterstreicht die Vielseitigkeit der POx/POzi-Hydrogele, indem das System für die gezielte Abgabe von Medikamenten angepasst wird. Wir verwendeten einen von der Natur inspirierten Ansatz für eine biorthogonale Konjugation vom Insuline-like Growth Factor I (IGF- I) an das Polymer unter Verwendung einer Dibenzocyclooctin-Modifikation des Polymers am Ende der Omega-Kette und eines Matrix-Metalloproteasen-empfindlichen Peptid-Linkers. Dieser Ansatz ermöglichte eine bioresponsive Freisetzung von IGF-I aus Hydrogelen sowie eine räumliche Kontrolle über die Proteinverteilung in 3D-gedruckten Konstrukten, was das System zu einem Kandidaten für den Einsatz in der personalisierten Medizin macht. Kapitel 3 gibt einen allgemeinen Überblick über die Notwendigkeit von Wundversiegelungsmitteln und die derzeit auf dem Markt befindlichen Generationen von Fibrinklebern einschließlich der Vorteile und Herausforderungen. Darüber hinaus werden Trends und potenzielle neue Strategien zur Lösung aktueller Probleme und zur Erweiterung der Toolbox für künftige Generationen von Fibrinklebern aufgezeigt. In Kapitel 4 werden die Konzepte der rekombinanten Proteinexpression und des Molecular Engineering auf eine neue Generation von Fibrin Wundklebern angewandt. In einer Proof-of- Concept-Studie haben wir ein neues rekombinantes Fbg Expressionsprotokoll und eine Fbg Mutante entwickelt, die weniger anfällig für einen Abbau durch Plasmin ist. Gezielte Lysine in Plasmin-Schnittstellen in Fbg wurde entweder durch Alanin oder Histidin in unterschiedlichen Teilen des Moleküls ausgetauscht. Das Protein wurde rekombinant hergestellt und eine verminderte Schnittrate wurde mittels hochauflösender Massenspektrometrie gezeigt. Zusätzlich haben wir ein neues zeitaufgelöstes Screening-Protokoll entwickelt, mit dem sich neue potenzielle Plasmin-Spaltstellen für weitere Aminosäurenaustausche in Fibrin-Klebern auflösen lassen. KW - Hydrogel KW - Targeted drug delivery KW - 3 D bioprinting KW - Hydrogels KW - Modification KW - Bioinks KW - Fibrinogen KW - Drug Delivery Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322887 ER - TY - THES A1 - Gründl, Marco T1 - Biochemical characterization of the MMB-Hippo crosstalk and its physiological relevance for heart development T1 - Biochemische Charakterisierung des MMB-Hippo Signalweges und dessen physiologische Rolle in der Herzentwicklung N2 - The Myb-MuvB (MMB) complex plays an essential role in the time-dependent transcriptional activation of mitotic genes. Recently, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP, the transcriptional coactivator of the Hippo pathway, to coregulate a subset of mitotic genes (Pattschull et al., 2019). Several genetic studies have shown that the Hippo-YAP pathway is essential to drive cardiomyocyte proliferation during cardiac development (von Gise et al., 2012; Heallen et al., 2011; Xin et al., 2011). However, the exact mechanisms of how YAP activates proliferation of cardiomyocytes is not known. This doctoral thesis addresses the physiological role of the MMB-Hippo crosstalk within the heart and characterizes the YAP-B-MYB interaction with the overall aim to identify a potent inhibitor of YAP. The results reported in this thesis indicate that complete loss of the MMB scaffold protein LIN9 in heart progenitor cells results in thinning of ventricular walls, reduced cardiomyocyte proliferation and early embryonic lethality. Moreover, genetic experiments using mice deficient in SAV1, a core component of the Hippo pathway, and LIN9-deficient mice revealed that the correct function of the MMB complex is critical for proliferation of cardiomyocytes due to Hippo-deficiency. Whole genome transcriptome profiling as well as genome wide binding studies identified a subset of Hippo-regulated cell cycle genes as direct targets of MMB. By proximity ligation assay (PLA), YAP and B-MYB were discovered to interact in embryonal cardiomyocytes. Biochemical approaches, such as co-immunoprecipitation assays, GST-pulldown assays, and µSPOT-based peptide arrays were employed to characterize the YAP-B-MYB interaction. Here, a PY motif within the N-terminus of B-MYB was found to directly interact with the YAP WW-domains. Consequently, the YAP WW-domains were important for the ability of YAP to drive proliferation in cardiomyocytes and to activate MMB target genes in differentiated C2C12 cells. The biochemical information obtained from the interaction studies was utilized to develop a novel competitive inhibitor of YAP called MY-COMP (Myb-YAP competition). In MY-COMP, the protein fragment of B-MYB containing the YAP binding domain is fused to a nuclear localization signal. Co-immunoprecipitation studies as well as PLA revealed that the YAP-B-MYB interaction is robustly blocked by expression of MY-COMP. Adenoviral overexpression of MY-COMP in embryonal cardiomyocytes suppressed entry into mitosis and blocked the pro-proliferative function of YAP. Strikingly, characterization of the cellular phenotype showed that ectopic expression of MY-COMP led to growth defects, nuclear abnormalities and polyploidization in HeLa cells. Taken together, the results of this thesis reveal the mechanism of the crosstalk between the Hippo signaling pathway and the MMB complex in the heart and form the basis for interference with the oncogenic activity of the Hippo coactivator YAP. N2 - Der Myb-MuvB Komplex spielt eine essenzielle Rolle in der transkriptionellen Aktivierung von Zellzyklusgenen. Unser Labor hat kürzlich einen bis dahin unbekannten Mechanismus zwischen dem MMB-Komplex und Hippo-YAP Signalweg, der zur Aktivierung von Mitosegenen beiträgt, identifiziert. Der Hippo-YAP Signalweg ist beteiligt an der Gewebehomöostase und am Wachstum von Organen. So reguliert der Hippo-YAP Signalweg zum Beispiel während der Herzentwicklung die Proliferation von Herzmuskelzellen. Der exakte Mechanismus wie YAP die Zellteilung von Kardiomyozyten aktiviert, ist jedoch bisher nicht bekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wird das Zusammenspiel zwischen dem Hippo-Signalweg und dem MMB-Komplex im Herzen untersucht. Außerdem wird die Interaktion zwischen YAP und B-MYB biochemisch charakterisiert, um einen Inhibitor zu entwickeln, der die Aktivität von YAP vermindert. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass der Verlust der zentralen Untereinheit des MMB-Komplexes, LIN9, in Vorläuferzellen der Kardiomyozyten zu einer Reduktion der Herzwand sowie zu einer niedrigeren Proliferationsrate von Herzmuskelzellen und einer erhöhten Embryonalsterblichkeit führt. Außerdem wurde in genetischen Experimenten mit Hippo- und LIN9-defizienten Mäusen gezeigt, dass der MMB-Komplex wichtig für die Aktivierung der Proliferation in Hippo-defizienten Kardiomyozyten ist. Eine globale Analyse der Transkription und Chromatinbindung von YAP und LIN9 im Herzen zeigte, dass eine Untergruppe von Zellzyklusgenen, die nach Inaktivierung des Hippo-Signalwegs vermehrt exprimiert werden, gleichzeitig den MMB-Komplex am Promoter gebunden haben. Durch Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass YAP und B-MYB in embryonalen Kardiomyozyten miteinander interagieren. Die Bindung der beiden Transkriptionsfaktoren wurde durch Co-Immunpräzipitation, GST-Pulldown-Analysen und Peptid-Arrays biochemisch untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass ein PY-Motiv im N-terminus von B-MYB direkt an die WW-Domänen von YAP bindet. Im Umkehrschluss wurde festgestellt, dass die WW-Domänen von YAP essenziell sind, um sowohl die Proliferation in Herzmuskelzellen als auch die Expression von Mitosegenen in differenzierten C2C12 Zellen zu aktivieren. Letztendlich wurden die Ergebnisse der Interaktionsstudie genutzt, um einen neuartigen kompetitiven Inhibitor von YAP zu entwickeln. Für MY-COMP (Myb-YAP Competition) wurde der Proteinabschnitt von B-MYB, der die YAP Bindedomäne enthält, mit einer Kernlokalisierungssequenz fusioniert. Bindestudien zeigten, dass MY-COMP die Interaktion zwischen YAP und B-MYB effektiv blockiert. Eine durch Adenoviren vermittelte Überexpression von MY-COMP in embryonalen Herzmuskelzellen resultierte in einer verminderten Anzahl von mitotischen Zellen. Somit wird durch Expression von MY-COMP, die proliferative Fähigkeit von YAP vermindert. Interessanterweise wurden in HeLa Zellen, die mit MY-COMP behandelt wurden, vermehrt Abnormalitäten der Zellkerne, polyploide Zellen sowie ein Wachstumsdefizit beobachtet. Zusammengefasst verdeutlichen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit die Bedeutung des Zusammenspiels zwischen dem MMB-Komplex und dem Hippo-YAP-Signalweg für die Herzentwicklung und bilden die Grundlage, für die effektive Inhibierung der onkogenen Eigenschaften des Hippo-Coaktivators YAP. KW - Zellzyklus KW - Heart development KW - Hippo pathway KW - Myb-MuvB complex KW - Cardiomyocyte Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213328 ER - TY - THES A1 - Knobloch, Gunnar T1 - Biochemical and structural characterization of chronophin T1 - Die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Chronophin N2 - The haloacid dehalogenase (HAD) family of phosphatases is an ancient, ubiquitous group of enzymes, and their emerging role in human health and disease make them attractive targets for detailed analyses. This thesis comprises the biochemical and structural characterization of chronophin, an HAD-type phosphatase, which has been shown to act on Ser3-phosphorylated cofiln-1, a key regulator of actin dynamics, and on the Ser/Thr-phosphorylated steroid receptor co-activator 3 (SRC-3). Besides being a specific phosphoprotein phosphatase, chronophin also acts on the small molecule pyridoxal 5'-phosphate (PLP, vitamin B6), implying that chronophin serves as a regulator of a variety important physiological pathways. The analysis of chronophin was performed on different levels, ranging from intrinsic regulatory mechanisms, such as the allosteric regulation via dimerization or the characterization of specificity determinants, to modes of extrinsic modulation, including the association with putative interacting proteins or the generation of chronophin-specific inhibitors. The association of the previously identified putative chronophin interactors calcium- and integrinbinding protein 1 (CIB1) and calmodulin was investigated using recombinantly expressed and purified proteins. These studies revealed that the interaction of chronophin with CIB1 or calmodulin is mutually exclusive and regulated by calcium. Neither CIB1 nor calmodulin had an effect on the in vitro chronophin phosphatase activity towards PLP or phospho-cofilin-1, but might regulate other functions of this important phosphatase. The role of chronophin dimerization was studied by generating a constitutively monomeric variant, which showed reduced PLP hydrolyzing activity. X-ray crystallographic studies revealed that dimerization is essential for the positioning of the substrate specificity loop in chronophin, unraveling a previously unknown mechanism of allosteric regulation through a homophilic interaction. This mechanism potentially applies to other enzymes of the C2a subfamily of HAD-type phosphatases, as all structurally characterized members show a conserved mode of dimerization. The general determinants of substrate specificity in the C2a subfamily of HAD phosphatases were investigated by performing domain swapping experiments with chronophin and its paralog AUM and subsequent biochemical analyses of the hybrid proteins. The X-ray crystallographic structure determination of the chronophin catalytic domain equipped with the AUM capping domain revealed the first partial structure of AUM. This structural information was then used in subsequent studies that analyzed the divergent substrate specificities of AUM and chronophin in an evolutionary context. Finally, a set of four chronophin inhibitors were generated based on the structure of PLP and characterized biochemically, showing moderate inhibitory effects with IC50-values in the micromolar range. These compounds nevertheless constitute valuable tools for future in vitro experiments, such as studies concerning the structure-function relationship of chronophin as a PLP phosphatase. In addition, the crystal structure of one inhibitor bound to chronophin could be solved. These results provide the basis for the further development of competitive chronophin inhibitors with increased specificity and potency. N2 - HAD Phosphatasen gehören zu einer phylogenetisch alten Proteinfamilie, die in allen drei Domänen des Lebens vertreten ist. Enzyme dieser vergleichsweise wenig charakterisierten Familie von Phosphatasen erweisen sich zunehmend als biomedizinisch interessante Zielmoleküle, da immer mehr Krankheiten identifiziert werden, bei denen HAD Phosphatasen eine Rolle spielen. In der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde die HAD Phosphatase Chronophin biochemisch und strukturell charakterisiert. Bisher konnte gezeigt werden, dass Chronophin die Proteine Cofilin-1, ein Schlüsselprotein in der Regulation des Aktin-Zytoskeletts, und den Steroidrezeptor Coaktivator 3 (SRC-3) dephosphoryliert. Darüberhinaus ist bekannt, dass Chronophin eine spezifische Pyridoxal 5'-Phosphat (PLP, Vitamin B6) Phosphatase ist, und somit an der Regulation verschiedenster Signalwege beteiligt ist. Die hier beschriebene Analyse von Chronophin beinhaltet die Untersuchung intrinsischer Regulationsmechanismen, wie z.B. Determinanten der Substratspezifität, die allosterische Regulation über Dimerisierung, bis hin zur Kontrolle durch extrinsische Faktoren wie interagierende Proteine oder Inhibitoren. Die Interaktion von Chronophin mit den kürzlich in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Interaktionspartnern CIB1 (Kalzium- und Integrin-bindendes Protein 1) und Calmodulin wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter und gereinigter Proteine untersucht. Dabei kam heraus, dass sich die Assoziation von CIB1 und Calmodulin an Chronophin gegenseitig ausschließt, und dass dieser Prozess durch Kalzium reguliert wird. Dabei beeinflusst weder die Bindung an CIB1 noch an Calmodulin die Phosphataseaktivität von Chronophin gegenüber den Substraten PLP oder phosphoryliertem Cofilin-1. Möglicherweise regulieren die beiden interagierenden Proteine die Funktion von Chronophin auf eine andere, hier nicht weiter untersuchte Art und Weise. Der Einfluss der Chronophin-Dimerisierung wurde untersucht, indem wir eine konstitutiv monomere Variante des üblicherweise dimeren Chronophins geschaffen haben. Diese monomere Variante des Enzyms wies eine deutlich reduzierte Aktivität gegenüber PLP auf. Durch röntgenkristallographische Analysen des wild-typischen Proteins und der monomeren Variante konnten wir zeigen, dass die Dimerisierung von Chronophin notwendig ist, um ein Strukturelement, welches wichtig für die Substratspezifität ist, in einer korrekten Position zu halten. Dieser allosterische Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Substratspezifität war bisher unbekannt, und trifft möglicherweise auf alle Proteine der C2a Unterfamilie von HAD Phosphatasen zu, die strukturell mit Chronophin verwandt sind. Die Faktoren, welche auf die Substratspezifität von Chronophin Einfluss nehmen wurden untersucht, indem einzelne Proteindomänen mit dem paralogen Protein AUM ausgetauscht, und die so geschaffenen Protein-Hybride biochemisch untersucht wurden. Durch das Lösen der röntgenkristallographischen Struktur eines Protein-Hybrids, bestehend aus der katalytischen Domäne von Chronophin und der capping-Domäne von AUM, konnte die die erste partielle Struktur von AUM untersucht werden. Mit Hilfe dieser strukturellen Information und durch bioinformatische Analysen konnten anschließend die unterschiedliche Substratspezifitäten der beiden paralogen Phosphatasen Chronophin und AUM in einem evolutionsbiologischen Kontext untersucht werden. Zusätzlich wurden vier mögliche Chronophin-Inhibitoren auf der Basis der PLP-Struktur synthetisiert. Die biochemische Analyse der Substanzen als Chronophin-Hemmer ergab moderate inhibitorische Eigenschaften mit IC50-Werten im micromolaren Bereich. Jedoch stellen die hier charakterisierten Inhibitoren nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von Chronophin als PLP-Phosphatase dar. Die röntgenkristallographische Struktur von Chronophin mit einem der Inhibitoren liefert außerdem eine wichtge Grundlage für die zukünfitige Verbesserung der Inhibitoren bezüglich Effektivität und Spezifität. KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Dimerisierung KW - Inhibitor KW - Chronophin KW - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase KW - Haloacid dehalogenase KW - HAD phosphatase KW - PLP phosphatase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110088 ER - TY - THES A1 - Viswanathan, Aravindan T1 - Biochemical and structural characterisation of modules within the SMN complex T1 - Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Modulen des SMN-Komplexes N2 - Cellular proteome profiling revealed that most biomolecules do not exist in isolation, but rather are incorporated into modular complexes. These assembled complexes are usually very large, consisting of 10 subunits on an average and include either proteins alone, or proteins and nucleic acids. Consequently, such macromolecular assemblies rather than individual biopolymers perform the vast majority of cellular activities. The faithful assembly of such molecular assemblies is often aided by trans-acting factors in vivo, to preclude aggregation of complex components and/or non-cognate interactions. A paradigm for an assisted assembly of a macromolecular machine is the formation of the common Sm/LSm core of spliceosomal and histone-mRNA processing U snRNPs. The key assembly factors united in the Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) and the Survival Motor Neuron (SMN) complexes orchestrate the assembly of the Sm/LSm core on the U snRNAs. Assembly is initiated by the PRMT5-complex subunit pICln, which pre-arranges the Sm/LSm proteins into spatial positions occupied in the mature U snRNPs. The SMN complex subsequently binds these Sm/LSm units, displaces pICln and catalyses the Sm ring closure on the Sm-site of the U snRNA. The SMN complex consists of the eponoymous SMN protein linked in a modular network of interactions with eight other proteins, termed Gemins 2-8 and Unrip. Despite functional and structural characterisation of individual protein components and/or sub-complexes of this assembly machinery, coherent understanding of the structural framework of the core SMN complex remained elusive. The current work, employing a combined approach of biochemical and structural studies, aimed to contribute to the understanding of how distinct modules within the SMN complex coalecse to form the macromolecular SMN complex. A novel atomic resolution (1.5 Å) structure of the human Gemin8:7:6 sub-complex, illustrates how the peripheral Gemin7:6 module is tethered to the SMN complex via Gemin8’s C-terminus. In this model, Gemin7 engages with both Gemin6 and Gemin8 via the N- and C-termini of its Sm-fold like domain. This highly conserved interaction mode is reflected in the pronounced sequence conservation and identical biochemical behaviour of similar sub-complexes from divergent species, namely S. pombe and C. elegans. Despite lacking significant sequence similarity to the Sm proteins, the dimeric Gemin7:6 complex share structural resemblance to the Sm heteromers. The hypothesis that the dimeric Gemin7:6 functions as a Sm-surrogate during Sm core assembly could not be confirmed in this work. The functional relevance of the structural mimicry of the dimeric Gemin7:6 sub-complex with the Sm heterodimers therefore still remains unclear. Reduced levels of functional SMN protein is the cause of the devastating neurodegenerative disease, Spinal Muscular Atrophy (SMA). The C-terminal YG-zipper motif of SMN is a major hot-spot for most SMA patient mutations. In this work, adding to the existing inventory of the human and fission yeast YG-box models, a novel 2.2 Å crystal structure of the nematode SMN’s YG-box domain adopting the glycine zipper motif has been reported. Furthermore, it could be assessed that SMA patient mutations mapping to this YG-box domain greatly influences SMN’s self-association competency, a property reflected in both the human and nematode YG-box biochemical handles. The shared molecular architecture and biochemical behaviour of the nematode SMN YG-box domain with its human and fission yeast counterparts, reiterates the pronounced conservation of this oligomerisation motif across divergent organisms. Apart from serving as a multimerization domain, SMN’s YG-box also acts as interaction platform for Gemin8. A systematic investigation of SMA causing missense mutations uncovered that Gemin8’s incorporation into the SMN complex is influenced by the presence of certain SMA patient mutations, albeit independent of SMN’s oligomerisation status. Consequently, loss of Gemin8 association in the presence of SMA patient mutations would also affect the incorporation of Gemin7:6 sub-complex. Gemin8, therefore sculpts the heteromeric SMN complex by bridging the Gemin7:6 and SMN:Gemin2 sub-units, a modular feature shared in both the human and nematode SMN complexes. These findings provide an important foundation and a prospective structural framework for elucidating the core architecture of the SMN complex in the ongoing Cryo-EM studies. N2 - Systematische Untersuchungen von zellulären Bestandteilen haben gezeigt, dass viele Proteine nicht isoliert, sondern vielmehr in modularen Komplexen organisiert vorliegen. Mit durchschnittlich zehn Untereinheiten sind diese Komplexe sehr groß, wobei sie entweder ausschließlich aus Proteinen oder aber aus Proteinen und Nukleinsäuren bestehen können. Daher wird der Großteil zellulärer Aktivitäten nicht von einzelnen Biopolymeren, sondern von makromolekularen Komplexen verrichtet. Die Zusammenlagerung dieser Komplexe wird in vivo häufig von Hilfsfaktoren unterstützt, um die Aggregation der Einzelkomponenten und/oder unspezifische Wechselwirkungen zu verhindern. Ein Beispiel für eine derartige Zusammenlagerungshilfe ist die Bildung des Sm/LSm-Cores der mRNA-prozessierenden U snRNPs. Dabei wird die Anlagerung von Sm/LSm Proteinen an die U snRNAs durch eine Anzahl von Hilfsfaktoren orchestriert, die in Protein-Arginin-Methyltransferase 5 (PRMT5)- und dem Survival Motor Neuron (SMN)-Komplexen organisiert sind. Die Zusammenlagerung wird durch die PRMT5-Untereinheit pICln initiiert, die die räumliche Anordnung von Sm/LSm-Proteinen in höher-geordneten Komplexen stabilisiert. Diese werden anschließend auf den SMN-Komplex übertragen, wobei pICln verdrängt und die Verbindung mit der Sm-Seite der U snRNA sichergestellt wird. Der SMN-Komplex besteht aus dem SMN-Protein, das in einem modularen Netzwerk mit acht weiteren Proteinen (Gemins 2-8 und Unrip) interagiert. Auch wenn funktionale und strukturelle Charakterisierungen einzelner Proteinkomponenten und Module dieser Zusammenlagerungs-Maschinerie vorliegen, steht ein tiefergehendes Verständnis des strukturellen Organisation des Gesamt-Komplexes noch aus. In der vorliegenden Arbeit sollte unter Anwendung biochemischer und struktureller Techniken ein Beitrag dazu geleistet werden, die Interaktionen der verschiedenen Komponenten innerhalb des SMN-Komplexes zu verstehen, die so die dreidimensionale Organisation des SMN-Komplexes zu verstehen. Eine neuartige Kristallstruktur des humanen Gemin8:7:6-Subkomplexes bei einer Auflösung von 1.5 Å zeigt, wie der periphere Gemin7:6-Abschnitt durch den C-Terminus von Gemin8 zum SMN-Komplex dirigiert wird. In diesem Modell interagiert Gemin7 sowohl mit Gemin6 als auch Gemin8 über den N- und C-Terminus der Sm-ähnlichen Domäne. Dieser hochkonservierte Interaktionsmodus wird in der erwähnten konservierten Sequenz und dem gleichen biochemischen Verhalten ähnlicher Subkomplexe in divergenten Spezies einschließlich S. pombe und C. elegans widergespiegelt. Obwohl es keine signifikante Übereinstimmung mit der Sequenz von Sm-Proteinen gibt, weist der dimere Gemin7:6-Komplex markante strukturelle Ähnlichkeit mit dem einem Sm-Heterodimer auf. Die Annahme, der dimere Gemin7:6-Subkomplex würde als Hilfsfaktor über die direkte Interaktion mit Sm-Proteinen fungieren konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden. Folglich bleibt die Funktion des dimeren Gemin7:6-Subkomplexes im Kontext der SMN-Zusammenlagerungsmaschinerie unklar. Verringerte Mengen des funktionellen SMN-Proteins sind die Ursache für die neurodegenerative Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA). Das C-terminale YG-Zipper-Motiv von SMN stellt einen Hotspot für die meisten SMA-Mutationen dar. In dieser Arbeit wurde der bereits bekannten YG-Box aus H. sapiens und S. pombe eine neuartige Kristallstruktur der SMN YG-Box aus C. elegans mit einer Auflösung von 2.2 Å hinzugefügt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass SMA-verursachende Missense-Mutationen in der YG-Box einen beträchtlichen Einfluss auf die Selbst-Interaktion von SMN haben, was aus biochemischen Versuchen mit der YG-Box aus H. sapiens und C. elegans ersichtlich wurde. Der molekulare Aufbau und das biochemische Verhalten der SMN YG-Box aus C. elegans, S. pombe und H. sapiens betont die Konservierung dieses Oligomerisierungsmotives über mehrere Organismen hinweg. Neben der Funktion als Multimerisationsdomäne dient die YG-Box von SMN auch als Interaktionsplattform für Gemin8. Eine systematische Untersuchung von SMA-verursachenden Missense-Mutationen ergab, dass die Einbindung von Gemin8 in den SMN-Komplex durch definierte Substitutionen massiv beeinflusst wird. Interessanterweise ist dieser Bindungsdefekt unabhängig vom SMN-Oligomerisierungsstatus. Demzufolge würde diese Klasse von SMA-Mutationen spezifisch die Inkorporation des Gemin7:6-Subkomplexes beeinflussen. Die Resultate dieser Arbeit bilden eine wichtige Grundlage für weitere strukturelle Untersuchungen des SMN-Komplexes über Kryo-Elektronenmikroskopie. KW - SMN complex KW - Macromolecular machine KW - Structural organisation KW - Proteom KW - Motoneuron Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-194749 ER -