TY - THES A1 - Janßen, Jan Paul T1 - Capabilities of a multi-pinhole SPECT system with two stationary detectors for in vivo imaging in rodents T1 - Leistungsfähigkeit eines Multi-Pinhole SPECT-Systems mit zwei stationären Detektoren zur In-vivo-Bildgebung in Nagetiermodellen N2 - Molecular imaging of rats is of great importance for basic and translational research. As a powerful tool in nuclear medicine, SPECT can be used to visualize specific functional processes in the body, such as myocardial perfusion or bone metabolism. Typical applications in laboratory animals are imaging diagnostics or the development of new tracers for clinical use. Innovations have enabled resolutions of up to a quarter of a millimeter with acceptable sensitivity. These advances have recently led to significantly more interest in SPECT both clinically and preclinically. The objective of this thesis was to evaluate the performance of the new U-SPECT5/CT E-Class by MILabs with a dedicated ultra-high resolution multi-pinhole collimator for rats and its potential for in vivo imaging of rats. The unique features of the U-SPECT are the large stationary detectors and the new iterative reconstruction algorithm. In addition, compared to the conventional system, the "E-Class" uses only two detectors instead of three. First, the sensitivity, maximum resolution, and uniformity were determined as performance parameters. Thereafter, CNRs for different activity levels comparable to those of typical in vivo activities were examined. Finally, two example protocols were carried out for imaging with 99mTc-MIBI and 99mTc-HMDP in healthy rats to evaluate the in vivo capabilities. For this purpose, CNR calculations and an image quality assessment were performed. The focus was on image quality as a function of scan time and post-reconstruction filter across a wide range of realistically achievable in vivo conditions. Performance was reasonable compared to other systems in the literature, with a sensitivity of 567 cps/MBq, a maximum resolution of 1.20 mm, and a uniformity of 55.5%. At the lower activities, resolution in phantom studies decreased to ≥1.80 mm while maintaining good image quality. High-quality bone and myocardial perfusion SPECTs were obtained in rats with a resolution of ≥1.80 mm and ≥2.20 mm, respectively. Although limited sensitivity remains a weakness of SPECT, the U-SPECT5/CT E-Class with the UHR-RM collimator can achieve in vivo results of the highest standard despite the missing third detector. Currently, it is one of the best options for high-resolution radionuclide imaging in rats. N2 - Die molekulare Bildgebung bei Ratten hat einen hohen Stellenwert in der Grundlagenforschung und der translationale Forschung. Dabei ist SPECT ein leistungsfähiges Instrument zur Visualisierung spezifischer funktioneller Prozesse im Körper, wie z. B. der Herzmuskeldurchblutung oder des Knochenstoffwechsels. Typische Anwendungsbereiche an Labortieren sind die bildgebende Diagnostik im Rahmen von Studien oder die Entwicklung neuer Tracer für den klinischen Einsatz. Durch Innovationen wurden Auflösungen von bis zu einem Viertelmillimeter bei akzeptabler Empfindlichkeit erreichbar. Diese Fortschritte haben in letzter Zeit zu einem deutlich gestiegenen Interesse an SPECT sowohl im klinischen als auch im präklinischen Bereich geführt. Ziel dieser Arbeit war es, die Leistung des neuen U-SPECT5/CT E-Class von MILabs mit einem speziellen ultra-hochauflösenden Multi-Pinhole-Kollimator für Ratten und das Potenzial für die In-vivo-Bildgebung bei Ratten zu untersuchen. Dabei sind die Besonderheiten des U-SPECTs die großen stationären Detektoren und der neue iterative Rekonstruktionsalgorithmus. Außerdem verfügt die von uns verwendete „E-Klasse“ im Vergleich zum konventionellen System nur über zwei statt drei Detektoren. Zunächst wurden die Sensitivität, die maximale Ortsauflösung und die Homogenität als Leistungsparameter bestimmt. Anschließend wurde das Kontrast-Rausch-Verhältnis für verschiedene Aktivitätsniveaus, die mit denen typischer In-vivo-Studien vergleichbar sind, untersucht. Schließlich wurden zwei Beispielprotokolle für die Bildgebung mit 99mTc-MIBI und 99mTc-HMDP bei gesunden Ratten durchgeführt, um die In-vivo-Kapazitäten zu erfassen. Zur Bewertung wurden eine Kontrast-Rausch-Analyse und eine Bildqualitätsumfrage genutzt. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Bildqualität in Abhängigkeit von der Scanzeit sowie dem Postrekonstruktionsfilters für ein breites Spektrum realistisch erreichbarer In-vivo-Bedingungen. Die Leistung war mit einer Sensitivität von 567 cps/MBq, einer maximalen Ortsauflösung von 1,20 mm und einer Homogenität von 55,5% mit anderen in der Literatur beschriebenen Systemen vergleichbar. Bei niedrigeren Aktivitäten verringerte sich die Auflösung in Phantomstudien auf ≥1,80 mm bei gleichbleibend guter Bildqualität. Es wurden hochqualitative Knochen- und Myokardperfusions-SPECTs mit einer Auflösung von ≥1,80 mm bzw. ≥2,20 mm bei Ratten erzielt. Obwohl die begrenzte Empfindlichkeit nach wie vor eine Schwäche der SPECT ist, kann das U-SPECT5/CT E-Class mit dem UHR-RM-Kollimator, trotz des fehlenden dritten Detektors, In-vivo-Ergebnisse auf höchstem Niveau erzielen. Es ist derzeit eine der besten Optionen für die hochauflösende Radionuklid-Bildgebung bei Ratten. KW - SPECT KW - Molekulare Bildgebung KW - Rodents KW - Image Quality KW - SPECT/CT Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-328608 ER - TY - THES A1 - Ku, Hsing-Ping T1 - Cadherin-13 Deficiency Impacts Murine Serotonergic Circuitries and Cognitive Functions T1 - Cadherin-13 Defizienz beeinflusst serotonerge Netzwerke und kognitive Funktionen der Maus N2 - Cadherin-13 (CDH13) is a member of the cadherin superfamily that lacks the typical transmembrane domain for classical cadherins and is instead attached to the cell membrane with a GPI-anchor. Over the years, numerous genome-wide association (GWA) studies have identified CDH13 as a risk factor for neurodevelopmental disorders, including attention- deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and autism spectrum disorder. Further evidence using cultured cells and animal models has shown that CDH13 plays important roles in cell migration, neurite outgrowth and synaptic function of the central nervous system. Research in our laboratory demonstrated that the CDH13 deficiency resulted in increased cell density of serotonergic neurons of the dorsal raphe (DR) in developing and mature mouse brains as well as serotonergic hyperinnervation in the developing prefrontal cortex, one of the target areas of DR serotonergic neurons. In this study, the role of CDH13 was further explored using constitutive and serotonergic system-specific CDH13-deficient mouse models. Within the adult DR structure, the increased density of DR serotonergic neurons was found to be topographically restricted to the ventral and lateral-wing, but not dorsal, clusters of DR. Furthermore, serotonergic hyperinnervation was observed in the target region of DR serotonergic projection neurons in the lateral wings. Unexpectedly, these alterations were not observed in postnatal day 14 brains of CDH13-deficient mice. Additionally, behavioral assessments revealed cognitive deficits in terms of compromised learning and memory ability as well as impulsive-like behaviors in CDH13-deficient mice, indicating that the absence of CDH13 in the serotonergic system alone was sufficient to impact cognitive functions and behavioral competency. Lastly, in order to examine the organization of serotonergic circuitries systematically and to tackle limitations of conventional immunofluorescence, a pipeline of the whole-mount immunostaining in combination with the iDISCO+ based rapid tissue clearing techniques was established. This will facilitate future research of brain neurotransmitter systems at circuitry and/or whole-brain levels and provide an excellent alternative for visualizing detailed and comprehensive information about a biological system in its original space. In summary, this study provided new evidence of CDH13’s contribution to proper brain development and cognitive function in mice, thereby offering insights into further advancement of therapeutic approaches for neurodevelopmental disorders. N2 - Cadherin-13 (CDH13) ist ein Mitglied der Cadherin-Superfamilie, dem die für klassische Cadherine typische Transmembran-Domäne fehlt und das stattdessen mit einem GPI-Anker an der Zellmembran befestigt ist. Im Laufe der Jahre wurde CDH13 in mehreren genom-weiten Assoziationsstudien (GWAS) als Risikofaktor für neurologische Entwicklungsstörungen, einschließlich Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und Autismus- Spektrum-Störung, identifiziert. Weitere Nachweise in Zellkulturen und Tiermodellen zeigten, dass CDH13 eine wichtige Rolle bei der Zellmigration, dem Wachstum von Neuriten und der synaptischen Funktion des zentralen Nervensystems spielt. Untersuchungen in unserem Labor haben gezeigt, dass CDH13-Defizienz zu einer erhöhten Zelldichte serotonerger Neuronen der dorsalen Raphe (DR) in sich entwickelnden und reifen Mäusegehirnen sowie zu einer serotonergen Hyperinnervation im sich entwickelnden präfrontalen Kortex, einem der Zielgebiete der serotonergen Neuronen der DR, führt. In dieser Studie wurde die Rolle von CDH13 weiter untersucht, indem konstitutive und für das serotonerge System spezifische CDH13-defiziente Mausmodelle verwendet wurden. Innerhalb der adulten DR-Struktur zeigte sich, dass die erhöhte Dichte serotonerger DR-Neurone topographisch auf die ventralen und lateralen, nicht aber dorsalen Cluster der DR beschränkt ist. Außerdem wurde eine serotonerge Hyperinnervation in der Zielregion der serotonergen Projektionsneuronen der DR in den Seitenflügeln beobachtet. Unerwarteterweise wurden diese Veränderungen nicht in den Gehirnen von CDH13-defizienten Mäusen nach dem 14. postnatalem Tag. Darüber hinaus zeigten Verhaltensuntersuchungen bei CDH13-defizienten Mäusen kognitive Defizite in Form von beeinträchtigter Lern- und Gedächtnisfähigkeit sowie impulsivem Verhalten, was darauf hindeutet, dass das Fehlen von CDH13 im serotonergen System allein ausreicht, um kognitive Funktionen und V erhaltenskompetenz zu beeinträchtigen. Um die Organisation der serotonergen Netzwerke systematisch zu untersuchen und die Grenzen der konventionellen Immunfluoreszenz zu überwinden, wurde eine Pipeline für die Ganzkörper-Immunfärbung in Kombination mit der auf iDISCO+ basierenden raschen und effizienten Gewebereinigungstechnik eingerichtet. Dies wird die künftige Erforschung der Neurotransmitter-Systeme des Gehirns auf Netzwerk- und/oder Ganzhirnebene erleichtern und eine hervorragende Alternative für die Visualisierung detaillierter und umfassender Informationen über ein biologisches System in seinem ursprünglichen Raum bieten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie neue Hinweise für den Beitrag von CDH13 zur korrekten Entwicklung des Gehirns und der kognitiven Funktionen bei Mäusen lieferte und damit Einblicke in die weitere Entwicklung von therapeutischen Ansätzen für Entwicklungsstörungen des Nervensystems bietet. KW - CDH13 KW - neurodevelopmental disorders KW - serotonergic system Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251446 ER - TY - THES A1 - Halboth, Florian T1 - Building behavior and nest climate control in leaf-cutting ants: How environmental cues affect the building responses of workers of \(Atta\) \(vollenweideri\) T1 - Bauverhalten und Kontrolle des Nestklimas bei Blattschneiderameisen: Wie Umweltreize die Bauaktivität von Arbeiterinnen der Art \(Atta\) \(vollenweideri\) beeinflussen N2 - The present work investigates the influence of environmental stimuli on the building behavior of workers of the leaf-cutting ant Atta vollenweideri. It focuses on cues related to the airflow-driven ventilation of their giant underground nests, i.e., air movements and their direction, carbon dioxide concentrations and humidity levels of the nest air. First, it is shown that workers are able to use airflow and its direction as learned orientation cue by performing learning experiments with individual foragers using a classical conditioning paradigm. This ability is expected to allow workers to also navigate inside the nest tunnels using the prevailing airflow directions for orientation, for example during tasks related to nest construction and climate control. Furthermore, the influence of carbon dioxide on the digging behavior of workers is investigated. While elevated CO2 levels hardly affect the digging rate of the ants, workers prefer to excavate at locations with lower concentrations and avoid higher CO2 levels when given a choice. Under natural conditions, shifting their digging activity to soil layers containing lower carbon dioxide levels might help colonies to excavate new or to broaden existing nest openings, if the CO2 concentration in the underground rises. It is also shown that workers preferably transport excavated soil along tunnels containing high CO2 concentrations, when carbon dioxide levels in the underground are elevated as well. In addition, workers prefer to carry soil pellets along outflow tunnels instead of inflow tunnels, at least for high humidity levels of the air. The material transported along tunnels providing outflow of CO2-rich air might be used by workers for the construction of ventilation turrets on top of the nest mound, which is expected to promote the wind-induced ventilation and the removal of carbon dioxide from the underground. The climatic conditions inside the nest tunnels also influence the structural features of the turrets constructed by workers on top the nest. While airflow and humidity have no effect on turret structure, outflow of CO2-rich air from the nest causes workers to construct turrets with additional openings and increased aperture, potentially enhancing the airflow-driven gas exchanges within the nest. Finally, the effect of airflow and ventilation turrets on the gas exchanges in Atta vollenweideri nests is tested experimentally on a physical model of a small nest consisting of a single chamber and two nest tunnels. The carbon dioxide clearance rate from the underground was measured depending on both the presence of airflow in the nest and the structural features of the built turrets. Carbon dioxide is removed faster from the physical nest model when air moves through the nest, confirming the contribution of wind-induced flow inside the nest tunnels to the ventilation of Atta vollenweideri nests. In addition, turrets placed on top of one of the tunnel openings of the nest further enhance the CO2 clearance rate and the effect is positively correlated with turret aperture. Taken together, climatic variables like airflow, carbon dioxide and humidity levels strongly affect the building responses of Atta vollenweideri leaf-cutting ants. Workers use these environmental stimuli as orientation cue in the nest during tasks related to excavation, soil transport and turret construction. Although the effects of these building responses on the microclimatic conditions inside the nest remain elusive so far, the described behaviors are expected to allow ant colonies to restore and maintain a proper nest climate in the underground. N2 - Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss von Umweltreizen auf das Bauverhalten von Blattschneiderameisen der Art Atta vollenweideri. Dabei wird der Fokus auf Luftströmungen und deren Richtung, sowie CO2-Konzentration und Feuchtigkeitsgehalt der Luft gelegt, welche alle im Zusammenhang mit dem wind-induzierten Ventilationssystem der riesigen, unterirdischen Nester stehen. Zunächst wird experimentell mit Hilfe von klassischer Konditionierung gezeigt, dass Arbeiterinnen während des Furagierens lernen können, Luftströmungen sowie deren Richtung zur Orientierung zu nutzen. Diese Fähigkeit sollte Arbeiterinnen auch die Navigation im Nest anhand der auftretenden Strömungsrichtung der Luft, zum Beispiel während Tätigkeiten im Kontext des Nestbaus und der Klimakontrolle, ermöglichen. Weiterhin wird der Einfluss von Kohlenstoffdioxid auf das Grabeverhalten von Arbeiterinnen untersucht. Obwohl CO2 kaum die Grabe-Rate der Ameisen beeinflusst, graben Arbeiterinnen bevorzugt an Orten mit niedrigerer Konzentration und vermeiden höhere Konzentrationen, wenn möglich. Unter natürlichen Bedingungen könnte das Verlagern der Grabeaktivität in Bodenschichten mit niedrigerer CO2-Konzentration Kolonien dabei helfen, neue Nestöffnungen zu graben oder bestehende zu erweitern, wenn die CO2-Konzentration unter der Erde zunimmt. Zusätzlich wird gezeigt, dass Arbeiterinnen ausgegrabene Erde vornehmlich entlang Tunnel transportieren, die eine hohe CO2-Konzentration aufweisen, wenn die CO2-Konzentration im Untergrund ebenfalls erhöht ist. Zudem bevorzugen Arbeiterinnen den Transport von Erdmaterial entlang Ausstrom- anstatt Einstrom-Tunnel, zumindest für hohe Luftfeuchtigkeiten. Material, welches entlang Nesttunnel transportiert wird, aus denen CO2-haltige Luft ausströmt, könnte Arbeiterinnen zum Bau der Ventilationstürme an der Nestoberfläche dienen, was die wind-induzierte Belüftung der Nester verstärken und die Abfuhr von CO2 aus dem Nest fördern sollte. Die klimatischen Bedingungen in den Nesttunneln beeinflussen auch die strukturellen Eigenschaften der Ventilationstürme, die von Arbeiterinnen oberhalb des Nests errichtet werden. Während Luftströmungen und Luftfeuchtigkeit keinen Einfluss auf die Struktur der Türme haben, veranlasst das Ausströmen von CO2-haltiger Luft aus dem Nest Arbeiterinnen dazu, Türme zu bauen, die mehrere Öffnungen und eine vergrößerte Öffnungsfläche besitzen, was den strömungsinduzierten Gasaustausch im Nest begünstigen könnte. Abschließend werden die Auswirkungen von Luftströmungen und Ventilationstürmen auf den Gasaustausch in den Nestern der Blattschneiderameise Atta vollenweideri mit Hilfe eines physikalischen Modells eines kleinen Nests, bestehend aus einer einzelnen Nestkammer und zwei Nesttunneln, untersucht. Die Abfuhr-Rate von CO2 aus dem Untergrund wurde abhängig vom Vorhandensein von Luftströmungen und den strukturellen Eigenschaften der errichteten Ventilationstürme gemessen. CO2 wird schneller aus dem physikalischen Modell entfernt, wenn Luft durch das Nest strömt, was den Beitrag von Luftbewegungen in den Tunneln zur Ventilation der Nester von Atta vollenweideri bestätigt. Ventilationstürme an einer der Nestöffnungen platziert, verstärken zusätzlich die Abfuhr-Rate von CO2 aus dem Nest und dieser Effekt nimmt mit zunehmender Öffnungsfläche der Türme zu. Zusammengefasst beeinflussen Klimavariablen wie Luftströmungen, Kohlenstoffdioxid und Luftfeuchtigkeit stark das Bauverhalten von Blattschneiderameisen der Art Atta vollenweideri. Arbeiterinnen nutzen diese Umweltreize zur Orientierung im Nest während Tätigkeiten, die im Zusammenhang mit Grabeverhalten, dem Transport von Erdmaterial und dem Bau von Ventilationstürmen stehen. Obwohl die Auswirkungen dieser Bauantworten auf die mikroklimatischen Bedingungen im Nest zunächst noch unklar sind, wird angenommen, dass die beschriebenen Verhaltensweisen es Kolonien erlauben, ein geeignetes Nestklima wiederherzustellen und aufrechtzuerhalten. KW - Verhalten KW - Ameisen KW - Nestbau KW - Klima KW - Kohlendioxid KW - building behavior KW - leaf-cutting ants KW - nest climate KW - climate control KW - carbon dioxide KW - airflow KW - Atta vollenweideri Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161701 ER - TY - THES A1 - Riaño, Rubén Felipe T1 - BTN3A1 in the immune response of Vγ9Vδ2 T cells T1 - BTN3A1 in der Immunantwort der Vγ9Vδ2 T Zellen N2 - Human Vγ9Vδ2 T cells are the main γδ T cell subset in the circulation, accounting for up to 5% of the total peripheral blood lymphocyte population. They have been suggested to be important in response to tumors and infections. Their immune mechanisms encompass cell killing via cytotoxicity and secretion of pro-inflammatory cytokines such as IFNγ and tumor necrosis factor (TNF). The main stimulators of Vγ9Vδ2 T cells are isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), denominated phosphoantigens (PAg). A major advance in the understanding of PAg detection and Vγ9Vδ2 T cell activation has been the identification of the butyrophlin 3A (BTN3A) proteins as key mediators in these processes. In humans, three isoforms constitute the BTN3A family: BTN3A1, BTN3A2, and BTN3A3; and their genes are localized on the short arm of chromosome 6. The role of BTN3A1 has been highlighted by BTN3A-specific monoclonal antibody 20.1 (mAb 20.1), which has an agonist effect and causes proliferation, expansion, and activation of primary human Vγ9Vδ2 T cells. On the other hand, BTN3A-specific monoclonal antibody 103.2 (mAb 103.2) is antagonistic, inhibiting the Vγ9Vδ2 T cell response. The actual mechanism underlying both PAg- and mAb 20.1-mediated activation is not completely elucidated, but the importance of BTN3A1 is clear. The main objective of this dissertation was to characterize the role of BTN3A1 in the PAg-dependent and PAg-independent Vγ9Vδ2 T cell activation and to evaluate its contribution in the response to influeza A virus infected cells. This research work demonstrated, by using Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine cells (reporter cells), that human chromosome 6 (Chr6) is mandatory for PAg-induced stimulation, but not for stimulation with mAb 20.1. The reporter cells responded to mAb 20.1 in cultures with BTN3A1-transduced Chinese hamster ovary cells (CHO BTN3A1) as antigen presenting cells. Nevertheless, for PAg-dependent activation the presence of Chr6 in CHO BTN3A1 was mandatory. Although reporter cells expressing clonotypically different Vγ9Vδ2 TCRs showed similar PAg response, they clearly differed in the mAb 20.1 response. The reporter cell line transduced with Vγ9Vδ2 TCR D1C55 demonstrated essentially no response to mAb 20.1 compared to Vγ9Vδ2 TCR MOP cells. These findings were further supported by experiments performed with human PBMCs-derived Vγ9Vδ2 T cell clones. The results indicate heterogeneity in the PAg- and 20.1-dependent responses, in terms of CD25 and CD69 expression, among three different Vγ9Vδ2 T cells clones. Co-cultures of reporter cells with Raji RT1BI and PAg plus mAb 20.1 or single chain antibody 20.1 (sc 20.1) revealed no additive or synergistic activating effects. In contrast, mAb 20.1 or sc 20.1 inhibited the PAg-mediated activation of the reporter cells. The comparison of the relative contribution of the isoforms BTN3A2 and BTN3A3, in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, was undertaken by overexpression of these isoforms in CHO cells. The results showed that BTN3A2 contributes to both PAg- and mAb-induced Vγ9Vδ2 T cell activation. On the contrary, BTN3A3 does not support PAg-mediated γδ T cell response. Additionally, mutations in the proposed PAg- and mAb 20.1-binding sites of the extracellular BTN3A1 domain were generated by means of site-directed mutagenesis. These mutations revoked the mAb 20.1-induced Vγ9Vδ2 T cell activation, but not that induced by PAg. Finally, co-cultures of Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine reporter cells with influenza A/PR/8/34-infected cells, or infection of PBMCs with this virus strain indicated that BTN3A1 might be dispensable for the Vγ9Vδ2 T cell response against influenza A. The data of this research work points out that: i) in addition to BTN3A1, other Chr6-encoded genes are necessary for Vγ9Vδ2 T cell activation with PAg; ii) clonotypical (CDR3) differences influence the PAg- and mAb 20.1-mediated Vγ9Vδ2 T cell activation; iii) the PAg- and mAb 20.1-induced responses are not synergistic and interfere with each other; iv) BTN3A2 and BTN3A3 isoforms differ in the ability to support PAg- or mAb 20.1-dependent Vγ9Vδ2 T cell activation; v) the importance of the intracellular B30.2 domain of BTN3A1, in the Vγ9Vδ2 T cell activation, might be higher than that of the extracellular domain; and vi) in spite of the importance of BTN3A1 in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, it is possible that many molecules with redundant functions are involved in the elimination of influenza virus infection by these cells. In summary, it is possible to hypothesize a model in which BTN3A1 detects prenyl pyrophosphates in the cytoplasm via its B30.2 domain and in association with another protein(s). The binding of PAg to this domain induces a multimerization of BTN3A1 or a conformational change of its extracellular domain (mimicked by mAb 20.1). These modifications might be recognized by the Vγ9Vδ2 TCR or by an associated T cell protein. In the case that the TCR directly recognizes BTN3A1, the intensity of the response will depend on the Vγ9Vδ2 TCR clonotype. Future research will allow to gain a better understanding of BTN3A1, its interaction with other proteins, its actual role in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, and its importance in specific models of cancer or infection. This knowledge will be necessary to transform these cells into effective tools in the clinic. N2 - Im Menschen stellen Vγ9Vδ2 T Zellen die größte Subpopulation an γδ T Zellen im Blut dar und machen bis zu 5% der Gesamtpopulation peripherer Blutlymphozyten aus. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von Tumoren und Infektionen. Ihre Immunantwort umfasst cytotoxische Aktivität sowie Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IFNγ und dem Tumor Necrosis Faktor (TNF). Vγ9Vδ2 T Zellen werden am stärksten durch Isopentenylpyrophosphat (IPP) und (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enylpyrophosphat (HMBPP) stimuliert, welche als Phosphoantigene (PAg) bezeichnet werden. Ein großer Schritt für das Verständnis der Phosphoantigenerkennung und Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung war die Identifzierung der Schlüsselrolle, die Butyrophilin 3A (BTN3A) Proteinen in diesen Prozessen zukommt. Im Menschen existieren drei Isoformen von BTN3A (BTN3A1, BTN3A2 und BTN3A3), deren Gene auf dem kurzen Arm von Chromosom 6 lokalisiert sind. Die Rolle von BTN3A1 wurde durch den BTN3A spezifischen monoklonalen Antikörper 20.1 (mAk 20.1) besonders hervorgehoben, der eine agonistische Wirkung besitzt und Proliferation, Expansion, sowie Aktivierung primärer humaner Vγ9Vδ2 T Zellen hervorruft. Zudem existiert ein antagonistischer BTN3A spezifischer monoklonale Antikörper 103.2 (mAk 103.2), welcher Vγ9Vδ2 T Zellantworten inhibiert. Die der PAg- und mAk 20.1 vermittelten Aktivierung zugrunde liegenden Mechanismen wurden noch nicht vollständig aufgeklärt, die bedeutende Rolle von BTN3A1 in diesem Prozess ist jedoch eindeutig. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von BTN3A1 in der PAg abhängigen sowie unabhängigen Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung zu charakterisieren und ihren Beitrag zu der Immunantwort gegen mit Influenza A Virus infizierte Zellen zu ermitteln. Durch die Nutzung Vγ9Vδ2 TCR MOP transduzierter muriner Zellen als Reporterzellen konnte gezeigt werden, dass das humane Chromosom 6 (Chr6) zwar für die PAg abhängige Stimulation, nicht jedoch für die Aktivierung durch mAk 20.1 zwingend notwendig ist. In Kultur mit BTN3A1 transduzierten “chinese hamster ovary” (CHO) Zellen antworteten die Reporterzellen auf mAk 20.1. Für eine PAg abhängige Aktivierung war jedoch zusätzlich die Anwesenheit des humanen Chr6 in CHO BTN3A1 Zellen Voraussetzung. Obwohl Reporterzellen, die Vγ9Vδ2 TCRs verschiedener Klonotypen exprimierten, ähnliche PAg Antworten zeigten, unterschieden sie sich in der mAk 20.1 Antwort klar. Die mit Vγ9Vδ2 TCR D1C55 transduzierten Reporterzellen zeigten im Vergleich zu Vγ9Vδ2 TCR MOP Zellen nahezu keine mAk 20.1 abhängige Antwort. Diese Befunde wurden auch durch Experimente gestützt, die mit humanen, aus PBMCs gewonnenen Vγ9Vδ2 T Zellklonen durchgeführt wurden. Deren Resultate weisen, bezüglich der CD25 und CD69 Expression, auf eine heterogene PAg- und 20.1 abhängige Antwort der drei unterschiedlichen Vγ9Vδ2 T Zellklone hin. Kokulturen von Reporterzellen mit Raji RT1BI und PAg plus mAk 20.1 oder dem Einzelkettenantikörper 20.1 (sc 20.1) zeigten keine additive oder synergistische aktivierende Wirkung, vielmehr wurde die PAg vermittelte Aktivierung der Reporterzellen durch mAk 20.1 oder sc 20.1 inhibiert. Mittels Überexpression der beiden Isoformen BTN3A2 und BTN3A3 in CHO Zellen, wurde deren jeweiliger Beitrag zur Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass BTN3A2 sowohl zu PAg als auch mAk induzierten Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung beiträgt. BTN3A3 hingegen unterstützt die PAg vermittelte γδ T Zellaktivierung nicht. Weiterhin wurden, mittels gerichteter Mutagenese, in den vorgeschlagenen PAg- und mAk 20.1 Bindungsstellen der extrazellulären BTN3A1 Domäne Mutationen generiert. Diese verhinderten die mAk 20.1-, jedoch nicht die PAg vermittelte Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung. Zuletzt zeigten Kokulturen von Vγ9Vδ2 TCR MOP transduzierten murinen Reporterzellen und Influenza A/PR/8/34 infizierten Zellen, sowie eine Infektion von PBMCs mit diesem Virusstamm, dass BTN3A1 für die Vγ9Vδ2 T Zellantwort gegen Influenza A entbehrlich sein könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass i) zusätzlich zu BTN3A1, andere auf Chr6 befindliche Gene für die PAg abhängige Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen nötig sind; ii) klonotypische (CDR3) Unterschiede die PAg und mAk 20.1 vermittelte Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung beeinflussen; iii) die PAg- and mAk 20.1 induzierten Antworten sich nicht verstärken, sondern beeinträchtigen; iv) sich die Isoformen BTN3A2 und BTN3A3 in der Fähigkeit, die PAg- oder mAk 20.1 abhängige Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung zu unterstützen, unterscheiden; v) die intrazelluläre B30.2 Domäne von BTN3A1 eine größere Bedeutung für die Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung haben könnte als die extrazelluläre; und dass vi) trotz der Bedeutung von BTN3A1 für die Aktivierung von Vγ9Vδ2 T Zellen, die Möglichkeit besteht, dass viele Moleküle mit redundanter Funktion bei der Eliminierung von Influenza Viren durch diese Zellen eine Rolle spielen. Zusammenfassend lässt sich als Hypothese ein mögliches Modell aufstellen, in dem BTN3A1 in Assoziation mit einem oder mehreren zusätzlichen Proteinen zytoplasmatische Prenylpyrophosphate mittels der B30.2 Domäne detektiert. Die Bindung der PAg an diese Domäne würde dann eine Multimerisierung von BTN3A1 oder eine Konformationsänderung der extrazellulären Domäne (wie auch durch mAk 20.1 herbeigeführt) induzieren. Diese Modifizierungen könnten vom Vγ9Vδ2 TCR oder von einem assoziierten T Zellprotein erkannt werden. Für den Fall einer direkten Erkennung von BTN3A1 durch den TCR würde der Grad der T Zellantwort vom Vγ9Vδ2 TCR Klonotyp abhängen. Zukünftige Forschung wird ein besseres Verständnis von BTN3A1, dessen Proteininteraktionen, dessen Rolle in der Vγ9Vδ2 T Zellaktivierung, und dessen Bedeutung in spezifischen Krebs- oder Infektionsmodellen ermöglichen. Wissen, das benötigt wird, um diese Zellen effizient in klinischen Therapien einzusetzen. KW - gamma delta T cells KW - Vgamma9Vdelta2 T cells KW - phosphoantigen KW - HMBPP KW - IPP KW - butyrophilin 3A KW - human chromosome 6 KW - monoclonal antibody 20.1 KW - monoclonal antibody 103.2 KW - influenza A virus KW - T cell activation KW - T-Lymphozyt KW - Immunmodulation KW - In vitro Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142084 ER - TY - THES A1 - Holzmeister, Ib T1 - Branched silica precursors as additives for mineral bone cements T1 - Verzweigte Silica-Vorläufer als Additive für mineralische Knochenzemente N2 - Mineral biocements are brittle materials, which usually results in catastrophic failure during mechanical loading. Here, previous works demonstrated the feasibility of reducing brittleness by a dual-setting approach, in which a silica sol was simultaneously gelled during the setting of a brushite forming cement. The current thesis aimed at further improving this concept by both using a novel silicate based cement matrix for an enhanced bonding between cement and silica matrix as well as multifunctional silica precursors to increase the network density of the gel. Due to its well-known biocompatibility and osteogenic regeneration capacity, baghdadite was chosen as mineral component of such composites. This required in a first approach the conversion of baghdadite ceramics into self-setting cement formulations. This was investigated initially by using baghdadite as reactive filler in a brushite forming cement (Chapter 4). Here, the ß-TCP component in a equimolar mixture of ß-TCP and acidic monocalcium phosphate anhydrous was subsequently replaced by baghdadite at various concentrations (0, 5, 10, 20, 30, 50, and 100 wt%) to study the influence on physicochemical cement properties such as mechanical performance, radiopacity, phase composition and microstructure. X-ray diffraction profiles demonstrated the dissolution of baghdadite during the cement reaction without affecting the crystal structure of the precipitated brushite phase. In addition, EDX analysis showed that calcium is homogeneously distributed in the cement matrix, while zirconium and silicon form cluster-like aggregates ranging in size from a few micrometers to more than 50 µm. X-ray images and µ-CT analyses indicate improved X-ray visibility with increased incorporation of baghdadite in brushite cement, with an aluminum equivalent thickness nearly doubling at a baghdadite content of 50 wt%. At the same time, the compressive strength of brushite cement increased from 12.9 ± 3.1 MPa to 21.1 ± 4.1 MPa at a baghdadite content of 10 wt%. Cell culture medium conditioned with powdered brushite cement approached physiological pH values when increasing amounts of baghdadite were added to the cement (pH = 6.47 for pure brushite, pH = 7.02 for brushite with 20 wt% baghdadite substitution). Baghdadite substitution also affected the ion content in the culture medium and thus the proliferation activity of primary human osteoblasts in vitro. The results demonstrated for the first time the suitability of baghdadite as a reactive cement additive for improving the radiopacity, mechanical performance, and cytocompatibility of brushite cements. A second approach (Chapter 5) aimed to produce single component baghdadite cements by an increase of baghdadite solubility to initiate a self-setting cement reaction. For this, the material was mechanically activated by longer grinding times of up to 24h leading to both a decrease in particle and crystallite size as well as a partial amorphization of baghdadite. Baghdadite cements were formed by adding water at a powder to liquid ratio of 2.0 g/ml. Maximum compressive strengths were determined to be ~2 MPa after 3 days of setting for a 24-hour ground material. Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) measurements showed an incongruent dissolution profile of the set cements, with preferential dissolution of calcium and only minor release of zirconium ions. Cement formation occurs under alkaline conditions, with the unground raw powder resulting in a pH of 11.9 during setting, while prolonged grinding increases the pH to about 12.3. Finally, mechanically activated baghdadite cements were combined with inorganic silica networks (Chapter 6) to create dual-setting cements with a further improvement of mechanical performance. While a modification of the cement pastes with a TEOS derived sol was already thought to improve strength, it was hypothesized that using multi-arm silica precursors can further enhance their mechanical performance due to a higher network density. In addition, this should also reduce pore size of both gels and cement and hence will be able to adjust the release kinetics of incorporated drugs. For this, multi-armed silica precursors were synthesized by the reaction of various multivalent alcohols (ethylene glycol, glycerine, pentaerythrit) with an isocyanate modified silica precursor. After hydrolysis under acidic conditions, the sols were mixed with baghdadite cement powders in order to allow a simultaneous gel formation and cement setting. Since the silica monomers have a high degree of linkage sites, this resulted in a branched network that interpenetrated with the growing cement crystals. In addition to minor changes in the crystalline phase composition as determined by X-ray diffraction, the novel composites exhibited improved mechanical properties with up to 20 times higher compressive strength and further benefit from an about 50% lower overall porosity than the reference pure baghdadite cement. In addition, the initial burst release of the model drug vancomycin was completely inhibited by the added silica matrix. This observation was verified by testing for the antimicrobial activity with Staphylococcus aureus by measuring the inhibition zones of selected samples after 24 h and 48 h, whereas the antimicrobial effectiveness of a constant vancomycin release could be demonstrated. The current thesis clearly demonstrated the high potential of baghdadite as a cement formulation for medical application. The initially poor mechanical properties of such cements can be overcome by special processing techniques or by combination with silica networks. The achieved mechanical performance is > 10 MPa and hence suitable for bone replacement under non-load bearing conditions. The high intrinsic radiopacity as well as the alkaline pH during setting may open the way ahead to further dental applications, e.g. as root canal sealers or filler in dental composites. Here, the high pH is thought to lead to antimicrobial properties of such materials similar to commonly applied calcium hydroxide or calcium silicates, however combined with an intrinsic radiopacity for X-ray imaging. This would simplify such formulations to single component materials which are less susceptible to demixing processes during transport, storage or processing. N2 - Mineralische Biozemente sind spröde Materialien, die bei mechanischer Belastung in der Regel ein katastrophales Versagen zeigen. In früheren Arbeiten konnte die Sprödigkeit durch einen dual-härtenden Materialansatz verringert werden, bei dem ein dem Zement zugesetztes Kieselsol während des Aushärtens eines Bruschit-bildenden Zements simultan geliert und so die Matrix verstärkt. Die vorliegende Arbeit zielte darauf ab, dieses Konzept weiter zu verbessern, indem sowohl eine neuartige Zementmatrix auf Silikatbasis für eine verbesserte Bindung zwischen Zement und Kieselsäurematrix als auch multifunktionale Kieselsäure Precursoren zur Erhöhung der Netzwerkdichte des Gels verwendet wurden. Aufgrund der nachgewiesenen Biokompatibilität und osteogenen Regenerationsfähigkeit wurde Baghdadit als mineralischer Bestandteil solcher Komposite gewählt. Dies erforderte in einem ersten Ansatz die Umwandlung von Baghdadit-Keramik in selbsthärtende Zementformulierungen. Dies wurde zunächst durch die Verwendung von Baghdadit als reaktiver Füllstoff in einem Bruschit-bildenden Zement untersucht (Kapitel 4). Dabei wurde die β-TCP-Komponente in einem äquimolaren Gemisch aus β-TCP und saurem Monocalciumphosphat sukzessive durch Baghdadit in verschiedenen Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 30, 50 und 100 Gew.-%) ersetzt, um den Einfluss auf die physikalisch-chemischen Zementeigenschaften, wie mechanische Festigkeit, Röntgenopazität, Phasenzusammensetzung und Mikrostruktur zu untersuchen. Röntgenbeugungsprofile zeigten die Auflösung von Baghdadit während der Zementreaktion, ohne die Kristallstruktur der ausgefällten Bruschitphase zu beeinträchtigen. Darüber hinaus zeigte die EDX-Analyse, dass Calcium homogen in der Zementmatrix verteilt ist, während Zirkon und Silizium clusterartige Aggregate mit einer Größe von einigen Mikrometern bis zu mehr als 50 µm bilden. Röntgenbilder und µ-CT-Analysen zeigen eine verbesserte Röntgensichtbarkeit bei erhöhtem Baghdadit-Anteil im Bruschit-Zement, wobei sich die Aluminium-Äquivalentdicke bei einem Baghdadit-Gehalt von 50 Gew.-% nahezu verdoppelt. Gleichzeitig stieg die Druckfestigkeit von Bruschitzement von 12,9 ± 3,1 MPa auf 21,1 ± 4,1 MPa bei einem Baghdaditgehalt von 10 Gew.-%. Zellkulturmedium, das mit pulverförmigem Bruschitzement konditioniert wurde, näherte sich physiologischen pH-Werten an, wenn dem Zement steigende Mengen an Baghdadit zugesetzt wurden (pH = 6,47 für reinen Bruschitzement, pH = 7,02 für Bruschitzement mit 20 Gew.-% Baghdadit-Substitution). Die Baghdadit-Substitution wirkte sich auch auf den Ionengehalt im Kulturmedium und damit auf die Proliferationsaktivität von primären menschlichen Osteoblasten in vitro aus. Die Ergebnisse zeigten zum ersten Mal die Eignung von Baghdadit als reaktives Zementadditiv zur Verbesserung der Röntgenopazität, der mechanischen Eigenschaften und der Zytokompatibilität von Bruschitzementen. Ein zweiter Ansatz (Kapitel 5) zielte auf die Herstellung einkomponentiger Baghdadit-Zemente durch eine Erhöhung der Baghdadit-Löslichkeit ab, um eine Zementreaktion zu initiieren. Dazu wurde das Material durch längere Mahlung von bis zu 24 Stunden mechanisch aktiviert, was sowohl zu einer Abnahme der Partikel- und Kristallitgröße, als auch zu einer teilweisen Amorphisierung von Baghdadit führte. Baghdadit-Zemente wurden durch Zugabe von Wasser bei einem Verhältnis von Pulver zu Flüssigkeit von 2,0 g/ml erhalten. Die maximalen Druckfestigkeiten wurden mit ~2 MPa nach 3 Tagen Aushärtung für ein 24 Stunden gemahlenes Material ermittelt. Massenspektrometrische Messungen mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) ergaben ein inkongruentes Auflösungsprofil der abgebundenen Zemente mit einer bevorzugten Auflösung von Calcium und einer nur geringen Freisetzung von Zirkonium-Ionen. Die Zementbildung erfolgt unter alkalischen Bedingungen, wobei das ungemahlene Rohpulver während des Abbindens einen pH-Wert von 11.9 aufweist, während ein längeres Mahlen den pH-Wert auf etwa 12.3 erhöht. Abschließend wurden mechanisch aktivierte Baghdadit-Zemente mit anorganischen Silica-Netzwerken kombiniert (Kapitel 6), um dual härtende Zemente mit einer weiteren Verbesserung der mechanischen Eigenschaften zu erhalten. Während eine Modifikation der Zementpasten mit einem TEOS-abgeleiteten Sol bereits die Festigkeit verbessern sollte, wurde angenommen, dass die Verwendung von mehrarmigen Kieselsäure-Precursoren die mechanische Festigkeit aufgrund einer höheren Netzwerkdichte weiter verbessern kann. Darüber hinaus sollte sich auch die Porengröße von Gelen und Zement verringern, so dass die Freisetzungskinetik von inkorporierten Wirkstoffen angepasst werden kann. Zu diesem Zweck wurden mehrarmige Kieselsäure-Precursoren durch die Reaktion verschiedener mehrwertiger Alkohole (Ethylenglykol, Glycerin, Pentaerythrit) mit einem isocyanatmodifizierten Kieselsäure-Precursor synthetisiert. Nach der Hydrolyse unter sauren Bedingungen wurden die Sole mit Baghdadit-Zementpulvern gemischt, um eine gleichzeitige Gelbildung und Zementabbindung zu ermöglichen. Da die Kieselsäuremonomere einen hohen Grad an Verknüpfungsstellen aufweisen, führte dies zu einem verzweigten Netzwerk, das die ausfallenden Zementkristalle durchdrang. Neben geringfügigen Veränderungen in der Zusammensetzung der durch Röntgenbeugung bestimmten kristallinen Phasen, wiesen die neuartigen Komposite verbesserte mechanische Eigenschaften mit einer bis zu 20-fach höheren Druckfestigkeit auf und profitierten außerdem von einer um etwa 50 % geringeren Gesamtporosität als der reine Baghdadit-Referenzzement. Darüber hinaus wurde die anfängliche starke Freisetzung („burst release“) des Modellwirkstoffs Vancomycin durch die zugesetzte Silica-Matrix vollständig gehemmt. Diese Beobachtung wurde durch Prüfung der antimikrobiellen Aktivität mit Staphylococcus aureus durch Messung des Hemmhofs im Agar-Diffusionstest ausgewählter Proben nach 24 h und 48 h verifiziert, wobei die antimikrobielle Wirksamkeit einer konstanten Vancomycin-Freisetzung nachgewiesen werden konnte. Die vorliegende Arbeit zeigte deutlich das hohe Potenzial von Baghdadit Zementformulierungen für medizinische Anwendungen. Die anfänglich schlechten mechanischen Eigenschaften solcher Zemente können durch spezielle Verarbeitungstechniken oder durch die Kombination mit Silicanetzwerken überwunden werden. Die erzielten mechanischen Eigenschaften liegen bei > 10 MPa und die Materialien eignen sich daher für den Knochenersatz unter nicht-lasttragenden Bedingungen. Die hohe intrinsische Röntgenopazität sowie der alkalische pH-Wert während der Aushärtung könnten den Weg für weitere dentale Anwendungen öffnen, z. B. als Wurzelkanal-Zemente oder Füllstoff in Dentalkompositen. Hier ist davon auszugehen, dass der hohe pH-Wert zu antimikrobiellen Eigenschaften solcher Materialien führt, ähnlich wie bei den üblicherweise verwendeten Calciumhydroxiden oder Calciumsilikaten, jedoch in Kombination mit einer intrinsischen Röntgenopazität. Dies würde solche Formulierungen zu einkomponentigen Systemen vereinfachen, die weniger anfällig für Entmischungsprozesse während Transport, Lagerung oder Verarbeitung sind. KW - Zement KW - Sol-gel KW - Baghdadite KW - Cement KW - Silica precursor KW - Dual-setting Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-275044 ER - TY - THES A1 - Kaufmann, Tobias T1 - Brain-computer interfaces based on event-related potentials: toward fast, reliable and easy-to-use communication systems for people with neurodegenerative disease T1 - Gehirn-Computer Schnittstellen basierend auf ereigniskorrelierten Potentialen: Entwicklung von schnellen, zuverlässigen und leicht zu bedienenden Kommunikationssystemen für Menschen mit neurodegenerativer Erkrankung N2 - Objective: Brain Computer Interfaces (BCI) provide a muscle independent interaction channel making them particularly valuable for individuals with severe motor impairment. Thus, different BCI systems and applications have been proposed as assistive technology (AT) solutions for such patients. The most prominent system for communication utilizes event-related potentials (ERP) obtained from the electroencephalogram (EEG) to allow for communication on a character-by-character basis. Yet in their current state of technology, daily life use cases of such systems are rare. In addition to the high EEG preparation effort, one of the main reasons is the low information throughput compared to other existing AT solutions. Furthermore, when testing BCI systems in patients, a performance drop is usually observed compared to healthy users. Patients often display a low signal-to-noise ratio of the recorded EEG and detection of brain responses may be aggravated due to internally (e.g. spasm) or externally induced artifacts (e.g. from ventilation devices). Consequently, practical BCI systems need to cope with mani-fold inter-individual differences. Whilst these high demands lead to increasing complexity of the technology, daily life use of BCI systems requires straightforward setup including an easy-to-use graphical user interface that nonprofessionals can handle without expert support. Research questions of this thesis: This dissertation project aimed at bringing forward BCI technology toward a possible integration into end-users' daily life. Four basic research questions were addressed: (1) Can we identify performance predictors so that we can provide users with individual BCI solutions without the need of multiple, demanding testing sessions? (2) Can we provide complex BCI technology in an automated, user-friendly and easy-to-use manner, so that BCIs can be used without expert support at end-users' homes? (3) How can we account for and improve the low information transfer rates as compared to other existing assistive technology solutions? (4) How can we prevent the performance drop often seen when bringing BCI technology that was tested in healthy users to those with severe motor impairment? Results and discussion: (1) Heart rate variability (HRV) as an index of inhibitory control (i.e. the ability to allocate attention resources and inhibit distracting stimuli) was significantly related to ERP-BCI performance and accounted for almost 26% of variance. HRV is easy to assess from short heartbeat recordings and may thus serve as a performance predictor for ERP-BCIs. Due to missing software solutions for appropriate processing of artifacts in heartbeat data (electrocardiogram and inter-beat interval data), our own tool was developed that is available free of charge. To date, more than 100 researchers worldwide have requested the tool. Recently, a new version was developed and released together with a website (www.artiifact.de). (2) Furthermore, a study of this thesis demonstrated that BCI technology can be incorporated into easy-to-use software, including auto-calibration and predictive text entry. Naïve, healthy nonprofessionals were able to control the software without expert support and successfully spelled words using the auto-calibrated BCI. They reported that software handling was straightforward and that they would be able to explain the system to others. However, future research is required to study transfer of the results to patient samples. (3) The commonly used ERP-BCI paradigm was significantly improved. Instead of simply highlighting visually displayed characters as is usually done, pictures of famous faces were used as stimulus material. As a result, specific brain potentials involved in face recognition and face processing were elicited. The event-related EEG thus displayed an increased signal-to-noise ratio, which facilitated the detection of ERPs extremely well. Consequently, BCI performance was significantly increased. (4) The good results of this new face-flashing paradigm achieved with healthy participants transferred well to users with neurodegenerative disease. Using a face paradigm boosted information throughput. Importantly, two users who were highly inefficient with the commonly used paradigm displayed high accuracy when exposed to the face paradigm. The increased signal-to-noise ratio of the recorded EEG thus helped them to overcome their BCI inefficiency. Significance: The presented work at hand (1) successfully identified a physiological predictor of ERP-BCI performance, (2) proved the technology ready to be operated by naïve nonprofessionals without expert support, (3) significantly improved the commonly used spelling paradigm and (4) thereby displayed a way to effectively prevent BCI inefficiency in patients with neurodegenerative disease. Additionally, missing software solutions for appropriate handling of artifacts in heartbeat data encouraged development of our own software tool that is available to the research community free of charge. In sum, this thesis significantly improved current BCI technology and enhanced our understanding of physiological correlates of BCI performance. N2 - Zielsetzung: Gehirn-Computer Schnittstellen (engl. Brain-Computer Interface, BCI) bilden einen muskel-unabhängigen Interaktionskanal, was sie besonders für Menschen mit starken, motorischen Einschränkungen wertvoll macht. Daher wurden verschiedene BCI-Systeme und -Anwendungen als unterstützende Technologien (UT) für diese Patienten vorgeschlagen. Das am häufigsten verwendete System zu Kommunikationszwecken basiert auf ereigniskorrelierten Potentialen (EKP) des Elektroenzephalogramms (EEG) und ermöglicht es Buchstabe für Buchstabe zu kommunizieren. Zum derzeitigen Stand der Technik sind Berichte über alltägliche Verwendung von BCI-Systemen jedoch selten. Zusätzlich zu dem hohen Präparationsaufwand, der mit dem Messen eines EEGs verbunden ist, ist eine der Hauptursachen der verhältnismäßig geringe Informationstransfer im Vergleich zu anderen existierenden UT-Lösungen. Zudem wird häufig beobachtet, dass das BCI-Kontrollvermögen bei Patienten deutlich niedriger ist als bei gesunden Nutzern. Das EEG von Patienten weißt häufig ein niedrigeres Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf und die Erkennung von Hirnantworten kann durch interne (z. B. Spasmus) oder externe Artefakte (z. B. von einem Beatmungsgerät herrührend) zusätzlich erschwert werden. Somit müssen praxisrelevante BCI-Systeme mit einer Vielfalt von interindividuellen Unterschieden klar kommen. Obschon diese hohen Anforderungen zu einer zunehmend komplexeren Technologie führen, erfordert der Alltagsgebrauch von BCI-Systemen einen einfachen Aufbau inklusive leicht zu bedienender, grafischer Benutzeroberfläche, die von Laien, ohne Unterstützung von Experten, bedient werden kann. Forschungsfragestellungen dieser Dissertationsschrift: Das Dissertationsprojekt bezweckte die Weiterentwicklung von BCI-Systemen, um den Weg für eine Integration in das tägliche Leben von Benutzern zu bahnen. Vier grundlegende Forschungsfragestellungen wurden adressiert: (1) Können Prädiktoren des BCI-Kontrollvermögens gefunden werden, sodass Nutzer mit individuell angepassten BCI-Lösungen versorgt werden können, ohne dass mehrfache, anstrengende Testsitzungen notwendig sind? (2) Kann komplexe BCI-Technologie auf automatisierte, nutzerfreundliche und leicht zu bedienende Weise bereitgestellt werden, sodass BCIs, ohne die Unterstützung von Experten, zuhause verwendet werden können? (3) Wie kann man den im Vergleich zu anderen existierenden UT-Lösungen niedrigen Informationstransferraten begegnen und sie erhöhen? (4) Wie kann ein Abfall des Kontrollvermögens verhindert werden, der häufig in Erscheinung tritt, wenn man BCI-Technologie, die an Gesunden getestet wurde, zu Patienten mit starken motorischen Einschränkungen bringt? Ergebnisse und Diskussion: (1) Herzratenvariabilität als Index des inhibitorischen Kontrollvermögens (die Fähigkeit Aufmerksamkeitsressourcen bereitzustellen und ablenkende Reize zu inhibieren) wurde zu EKP-BCI-Kontrollvermögen in einen signifikanten Bezug gesetzt und klärte beinahe 26% der Varianz auf. HRV ist leicht aus kurzen Aufzeichnungen des Herzschlags zu erheben und könnte daher als Prädiktor des EKP-BCI-Kontrollvermögens dienen. Aufgrund fehlender Softwarelösungen für angemessene Artefaktbehandlung in Aufzeichnungen des Herzschlags (Elektrokardiogramm und Interbeat-Intervall Daten) wurde ein eigenes Programm entwickelt, das frei erhältlich ist. Bis heute wurde es von mehr als 100 Wissenschaftlern weltweit angefordert. Unlängst wurde zudem eine neue Version entwickelt, die zusammen mit einer Website veröffentlicht wurde (www.artiifact.de). (2) Des Weiteren zeigte eine Studie dieser Dissertation, dass BCI-Technologie samt Auto-Kalibration und Wortvervollständigung in eine leicht zu bedienende Software integriert werden kann. Ungeschulte, gesunde Probanden waren in der Lage die Software ohne Unterstützung von Experten zu bedienen und buchstabierten mit dem auto-kalibrierten BCI erfolgreich Wörter. Sie gaben an, dass die Bedienung der Software leicht zu tätigen sei und dass sie in der Lage wären, das System anderen zu erklären. Jedoch muss zukünftige Forschung klären, ob sich die Ergebnisse auf Patienten übertragen lassen. (3) Das häufig verwendete EKP-BCI-Paradigma wurde signifikant verbessert. Statt - wie normalerweise getätigt - visuell präsentierte Buchstaben einfach aufleuchten zu lassen, wurden Bilder berühmter Gesichter als Stimulationsmaterial verwendet. Hierdurch wurden spezifische Gehirnpotentiale der Gesichtserkennung und -verarbeitung ausgelöst. Das ereigniskorrelierte EEG wies daher ein höheres Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf, was die Detektion von EKPs stark vereinfachte. Infolgedessen war das BCI-Kontrollvermögen signifikant erhöht. (4) Die guten Ergebnisse dieses neuen Gesichter-Stimulus-Paradigmas, die mit gesunden Probanden erreicht wurden, ließen sich gut auf Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen übertragen. Die Verwendung eines Gesichter-Paradigmas erhöhte den Informationstransfer erheblich. Zwei Nutzer, die sehr ineffizient im Umgang mit dem herkömmlichen BCI-System waren, erreichten zudem ein hohes Kontrollvermögen mit dem Gesichter-Paradigma. Das erhöhte Signal-zu-Rausch-Verhältnis des aufgezeichneten EEGs half ihnen somit ihre BCI Ineffizienz zu überwinden. Signifikanz: Die hier vorgestellte Arbeit (1) identifizierte einen physiologischen Prädiktor des EKP-BCI-Kontrollvermögens, (2) zeigte, dass die Technologie bereit ist für die Verwendung durch ungeschulte Laien ohne Unterstützung von Experten, (3) verbesserte das herkömmliche Kommunikationsparadigma signifikant, und (4) zeigte hierdurch einen Weg auf, die BCI Ineffizienz von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen effektiv zu verhindern. Die fehlende Softwarelösung zur angemessenen Behandlung von Artefakten in Aufzeichnungen des Herzschlags animierte zudem zur Entwicklung einer eigenen Anwendung, die der Wissenschaftsgemeinschaft kostenfrei zur Verfügung gestellt wird. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass dieses Dissertationsprojekt somit derzeitige BCI-Technologie signifikant verbesserte und unser Verständnis physiologischer Korrelate des BCI-Kontrollvermögens erweiterte. KW - Gehirn-Computer-Schnittstelle KW - Herzfrequenzvariabilität KW - Nervendegeneration KW - BCI KW - HRV Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83441 ER - TY - THES A1 - Weidner, Magdalena Theodora T1 - Brain serotonin throughout development - for better and for worse T1 - Der Effekt von Serotonin im sich entwickelnden Gehirn - in guten wie in schlechten Tagen N2 - The work presented in this thesis covers the effects of early-life adversity in the context of altered serotonin (5-HT; 5-hydroxytryptamine) system functioning in mice. The main body is focussing on a screening approach identifying molecular processes, potentially involved in distinct behavioural manifestations that emerge from or are concomitant with early adversity and, with regard to some behavioural manifestations, dependent on the functioning of the 5-HT system. N2 - Diese Arbeit berichtet Ergebnisse der umfassenden Erforschung des Einflusses von aversiven Bedingungen während der pränatalen und frühkindlichen Entwicklungsphase, unter dem Einfluss genetischer Variationen des serotonergen (5-HT, 5-Hydroxytryptamin) Systems, im Mausmodel. Der Hauptfokus der Thesis lag bei der hypothesenfreien Untersuchung der Konsequenzen, die durch den kombinierten Effekt aversiver Bedingungen, und genetischer Prädisposition ausgelöst werden, sowie, final, der Ermittlung potentieller Kandidatengene, die an der Manifestierung verhaltensbezogener Konsequenzen beteiligt sein können sowie durch epigenetische Mechanismen reguliert werden. KW - Gehirn KW - Serotonin KW - Entwicklung KW - Stress KW - epigenetics KW - early-life stress KW - rodent model KW - behaviour Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163345 SN - 978-94-6233-940-8 N1 - This document is also published by the University library Maastricht. Maastricht University holds the same rights as University of Würzburg PB - Magdalena T. Weidner CY - Maastricht, the Netherlands ER - TY - THES A1 - Volpato, Daniela T1 - Bitopic Ligands and their molecular fragments for the study of the M1 Muscarinic Receptor T1 - Bitopische Liganden und ihre Molekülfragmente für die Untersuchung des M1 Muskarinischen Rezeptors N2 - The past decades have witnessed the development of new pharmaceutical compounds that modulate receptor function by targeting allosteric sites. Allosteric sites are, by definition, domains topographically distinct from the orthosteric binding pocket where the natural ligand binds. Exploring the possibilities of linking orthosteric and allosteric pharmacophores in one compound to yield ‘bitopic’ compounds is a strategy derived from the “message-address” concept by Schwyzer , first applied to GPCRs by Portoghese et al. This concept explicitly underlines the orthosteric/allosteric combination, in opposite to the more general umbrella term bivalent. The broad possibilities of bitopic ligands in the pharmaceutical field are under continuous study. Bitopic compounds are promising pharmaceutical tools for taking advantage of the allosteric binding to achieve subtype selectivity while preserving high affinity at the receptor. The development of bitopic ligands, based on the idea of combining high affinity (via orthosteric sites) with high selectivity (via allosteric sites), have led to the development of highly selective bivalent ligands for GPCRs , such as for the opioid receptors , muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), serotonin receptors, cannabinoid receptors, and gonadotropin-releasing hormone receptors. This concept has even been extended to other receptors, for examples nicotinic receptors and other proteins, such as acetylcholinesterases and the tyrosine kinase receptors TrkA and TrkC. The reasons to pursue a bitopic ligand approach are various. An improved affinity for the target GPCR and/or an improved selectivity either at the level of receptor subtype, or at the level of signaling pathway. Another advantage of bitopic ligands over purely allosteric ligands is that the former rely on the appropriate presence of endogenous agonist tone to mediate their effects, whereas a bitopic ligand would engage the orthosteric site irrespective of the presence or absence of endogenous tone. By way of introduction to the hybrid approach, a review of the concept of hybrids compounds targeting the cholinergic system is presented in section A of this thesis. Recent updates in hybrid molecule design as a strategy for selectively addressing multiple target proteins involved in Alzheimer's disease (AD) is here reported . This represents the potential and the growing interest in hybrid compound as pharmacological tools to achieve receptor subtype selectivity and/or, to study the overall functional activity of the receptor. Until now, muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) have proved to be a particularly fruitful receptor model for the development and characterization of bitopic ligands. In this thesis, several examples of new muscarinic bitopic approach are reported in the results section. A study of bipharmacophoric ligands composed of the muscarinic positive allosteric modulators (BQCAderived compounds) linked with chain of various lengths to different orthosteric building blocks is reported in the result part 1. Synthesis and examination of the potential pharmacological characteristic of Oxotremorine-BQCAd compounds and Xanomeline-BQCAd hybrid derivatives are described in results parts 2 and 4, respectively. Moreover, the bitopic concept has even been extended to other proteins, such as acetylcholinesterase. In the result part 5 an overview of the new Tacrine-Xanomeline hybrids aiming to improve the inhibitory potency of the acetylcholinesterase and simultaneously to increase the cholinergic tone, via the xanomelinic portion acting on the M1 receptor is given. A new trivalent approach is presented for the first time to deepen the study of the M1 muscarinic receptor in the result part 6. Moreover, the synthesis of a new series of iperoxo-derived alkane, bis(ammonio)alkane-type and rigidified chain ligands is given in the result part 7 together with some prospects for further research. N2 - Mit zunehmendem Alter der Bevölkerung werden altersbedingte Krankheiten, insbesondere neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD), häufiger und stellen darüber hinaus ein soziales und wirtschaftliches Problem für die Gesellschaft dar1,2. AD ist eine schwere altersabhängige neurodegenerative Erkrankung des Gehirns, die mit Gedächtnisverlust und einer Abnahme der kognitiven Funktionen verbunden ist und immer weiter fortschreitet. Die Krankheit ist derzeit unheilbar und aufgrund des demographischen Wandels wird ein starker Anstieg an Betroffenen erwartet. Daher beschäftigt sich eine Vielzahl wissenschaftlicher Studien mit der Prävention und der Behandlung von AD. Derzeit besteht das Hauptziel darin, die Ursachen und Mechanismen dieser Krankheit durch innovative Grundlagenforschung zu verstehen. AD ist ein komplexes Zusammenspiel verschiedener pathologischer Merkmale2,4. Diese besonderen Merkmale der Krankheit, die gleichzeitig auftreten, müssen untersucht und gleichzeitig untersucht werden, um wirksame und selektive Medikamente zu entwickeln. Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit zwei Zielstrukturen der cholinergen Hypothese zur Entstehung von AD: dem muskarinischen M1-Rezeptor5,6 und der AChE7 unter Verwendung des Hybridisierungsansatzes. Zunächst wurden vermeintlich selektive M1 Agonisten entwickelt und synthetisiert. Diese sollten die cholinerge Transmission verstärken um die cholinerge Funktion in Alzheimer Patienten zu verbessern. Hierbei wurde die Hybridisierung durch die kovalente Verbindung einer allosterischen und einer orthosterischen Einheit in einem Molekül durchgeführt. ... KW - Ligand KW - Bitopic Ligands KW - Muscarinrezeptor KW - M1 Muscarinic Receptor KW - Bitopische Liganden Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248815 ER - TY - THES A1 - Peters, Katharina T1 - Biological Substrates of Waiting Impulsivity in Children and Adolescents with and without ADHD T1 - Biologische Substrate der Warte-Impulsivität bei Kindern und Jugendlichen mit und ohne ADHS N2 - Focus of the present work were the questions whether and how the concept of waiting impulsivity (WI), defined as the ability to regulate a response in anticipation of reward and measured by the 4-choice serial reaction time task (4-CSRTT), may contribute to our understanding of Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) and its neurobiological underpinnings. To address this topic, two studies were conducted: in a first study, the relationship be-tween 4-CSRTT behavioral measures, neural correlates and ADHD symptom domains, i.e. inattention (IA) and hyperactivity/impulsivity (H/I) was explored in a pooled sample of 90 children and adolescents with (n=44) and without (n=46) ADHD diagnosis. As ex-pected, IA was associated with dorsolateral prefrontal brain regions linked with executive functions and attentional control, which was evident on the structural and the functional level. Higher levels of both IA and H/I covaried with decreased activity in the right ven-trolateral prefrontal cortex (PFC), a central structure for response inhibition. Moderation analyses revealed that H/I-related decreased activation in this region did not map linearly on difficulties on the behavioral level: brain activation was a significant predictor of task accuracy only, when H/I symptoms were low/absent but not for clinically relevant ADHD symptoms. Further, H/I was implicated in dysfunctional top-down control of reward eval-uation. Both symptom domains correlated positively with hippocampus (HC) activity in anticipation of reward. In addition, for high H/I symptoms, greater activation in the HC was found to correlate with higher motivation on the behavioral level, indicating that rein-forcement-learning and/or contingency awareness may contribute to altered reward pro-cessing in ADHD patients. In a second study, the possible serotonergic modulation of WI and the ADHD-WI relation-ship was addressed in a sub-sample comprising 86 children and adolescents of study I. The effects of a functional variant in the gene coding for the rate-limiting enzyme in the synthesis of brain serotonin on behavior and structure or function of the WI-network was investigated. Moderation analyses revealed that on the behavioral level, a negative corre-lation between accuracy and IA was found only in GG-homozygotes, whereas no signifi-cant relationship emerged for carriers of the T-allele. This is in line with previous reports of differential effects of serotonergic modulation on attentional performance depending on the presence of ADHD symptoms. A trend-wise interaction effect of genotype and IA for regional volume of the right middle frontal gyrus was interpreted as a hint towards an involvement of the PFC in this relationship, although a more complex mechanism includ-ing developmental effects can be assumed. In addition, interaction effects of genotype and IA were found for brain activation in the amygdala (AMY) und HC during perfor-mance of the 4-CSRTT, while another interaction was found for H/I symptoms and geno-type for right AMY volume. These findings indicate a serotonergic modulation of coding of the emotional value of reward during performance of the 4-CSRTT that varies de-pending on the extent of psychopathology-associated traits. Taken together, it was shown that the 4-CSRTT taps distinct domains of impulsivity with relevance to ADHD symptomatology: (proactive) response inhibition difficulties in relation with anticipation of reward. Furthermore, the two symptom domains, IA and H/I, contrib-ute differently to WI, which emphasizes the need to distinguish both in the research of ADHD. The results of study II emphasized the relevance of serotonergic transmission especially for attentional control and emotional processing. Although the present findings need replication and further refinement in more homogenous age groups, the use of the 4-CSRTT with a dimensional approach is a very promising strategy, which will hopefully extend our understanding of impulsivity-related mental disorders in the future. N2 - Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht das Konzept der Warte-Impulsivität (WI), definiert als die Fähigkeit der Antwort-Inhibition, während eine Belohnung erwartet wird, welche mittels des 4-choice serial reaction time task (4-CSRTT) erfasst werden kann. Es sollte untersucht werden ob und auf welche Weise WI und der 4-CSRTT genutzt werden können, um die neurobiologischen Grundlagen der Aufmerksamkeits-Defizit/Hyperaktivitäts-Störung (ADHS) besser zu verstehen. Es wurden zwei Studien durchgeführt: In einer ersten Studie wurde der Zusammenhang zwischen 4-CSRTT Verhaltensmaßen, ihren neuronalen Korrelaten und den ADHS Kern-Symptomen, Unaufmerksamkeit (IA) und Hyperaktivität/Impulsivität (H/I), überprüft. Es wurden 90 Kinder und Jugendliche mit (n=44) und ohne (n=46) ADHS-Diagnose unter-sucht. Erwartungsgemäß war IA, auf funktioneller und struktureller Ebene, mit dorsolate-ralen präfrontalen Hirnregionen assoziiert, die für Exekutivfunktionen und die Aufmerk-samkeitskontrolle zuständig sind. Stärkere Ausprägungen von IA und H/I gingen mit ver-ringerter Aktivität im rechten ventrolateralen präfrontalen Cortex (PFC), einer zentralen Struktur für die Inhibition von Antworten, einher. Moderationsanalysen ergaben, dass diese H/I-assoziierte geringere Aktivität nicht direkt mit Einschränkungen auf Verhaltens-ebene zusammenhing: Die Hirnaktivierung war nur in Abwesenheit von H/I Symptomen ein signifikanter Prädiktor der Sorgfaltsleistung, was bei stärkerer ADHS-Symptomatik nicht der Fall war. Darüber hinaus wiesen die Ergebnisse auf einen Zusammenhang zwi-schen H/I und dysfunktionaler Belohnungsverarbeitung hin. Beide Symptombereiche korrelierten während der Belohnungserwartung positiv mit Aktivität im Hippocampus (HC). Zusätzlich zeigte sich, dass bei stark ausgeprägten H/I-Symptomen eine höhere HC-Aktivierung mit höherer Motivation auf Verhaltensebene einher ging. Dies deutet da-rauf hin, dass Lernprozesse und ein Bewusstsein für Kontingenz bei der Verarbeitung von Belohnungen bei ADHS eine Rolle spielen könnten. In einer zweiten Studie wurde eine mögliche serotonerge Modulation von WI und dem WI-ADHS Zusammenhang betrachtet. Eine Teilstichprobe von 86 Probanden aus Studie I wurde untersucht. Eine funktionelle Genvariante des Enzyms, welches den entschei-denden Schritt in der Serotonin-Synthese im Gehirn katalysiert, wurde bezüglich seiner Effekte auf WI-Verhalten sowie Struktur und Funktion des WI-Netzwerks getestet. Mode-rationsanalysen zeigten, dass auf Verhaltensebene eine negative Korrelation zwischen IA und der Sorgfaltsleistung bei GG-Homozygoten, aber kein signifikanter Zusammenhang für Träger des T-Allels bestand. Unterschiedliche Effekte von serotonerger Modulation auf die Aufmerksamkeitsleistung in Abhängigkeit von ADHS-Symptomatik wurden be-reits in der Literatur berichtet. Ein Trend-Effekt für die Interaktion zwischen Genotyp und IA und dem Volumen des rechten Gyrus frontalis medius wurde als Hinweis auf eine Be-teiligung des PFC in diesem Zusammenhang interpretiert. Auf Grund möglicher Entwick-lungseffekte, ist aber ein komplexeres Zusammenspiel der verschiedenen Faktoren an-zunehmen. Interaktionseffekte von Genotyp und IA für Aktivität der Amygdala (AMY) und dem HC sowie für H/I und Genotyp bezüglich des Volumens der rechten AMY könn-ten auf eine serotonerge Modulation der emotionalen Bewertung von Belohnung hindeu-ten, die je nach ADHS-Symptomatik unterschiedlich ausfällt. Zusammenfassend zeigte sich, dass mittels des 4-CSRTT ADHS-relevante Aspekte von Impulsivität untersucht werden können: Schwierigkeiten der Antwortinhibition im Kontext von Belohnungserwartung. Sowohl IA als auch H/I hatten unterschiedlichen Einfluss auf WI. Sie sollten in der ADHS-Forschung differenziert betrachtet werden. Die Ergebnisse der zweiten Studie verdeutlichen, dass die serotonerge Transmission bei ADHS beson-ders bei Aufmerksamkeitsprozessen und emotionaler Verarbeitung eine Rolle spielt. Die vorliegenden Befunde sollten in homogeneren Alterskohorten überprüft werden. Sie ma-chen jedoch Hoffnung, dass mittels des 4-CSRTT und dimensionaler Forschungsansätze psychiatrische Störungen der Impulskontrolle besser verstanden werden können. KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - Impulsivität KW - ADHD KW - Waiting Impulsivity Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246368 ER - TY - THES A1 - Beudert, Matthias T1 - Bioinspired Modification and Functionalization of Hydrogels for Applications in Biomedicine T1 - Biologisch-inspirierte Modifizierung und Funktionalisierung von Hydrogelen für Anwendungen in der Biomedizin N2 - Over the years, hydrogels have been developed and used for a huge variety of different applications ranging from drug delivery devices to medical products. In this thesis, a poly(2-methyl-2-oxazoline) (POx) / poly(2-n-propyl-2-oxazine) (POzi) bioink was modified and analyzed for the use in biofabrication and targeted drug delivery. In addition, the protein fibrinogen (Fbg) was genetically modified for an increased stability towards plasmin degradation for its use as wound sealant. In Chapter 1, a thermogelling, printable POx/POzi-based hydrogel was modified with furan and maleimide moieties in the hydrophilic polymer backbone facilitating post-printing maturation of the constructs via Diels-Alder chemistry. The modification enabled long-term stability of the hydrogel scaffolds in aqueous solutions which is necessary for applications in biofabrication or tissue engineering. Furthermore, we incorporated RGD-peptides into the hydrogel which led to cell adhesion and elongated morphology of fibroblast cells seeded on top of the scaffolds. Additional printing experiments demonstrate that the presented POx/POzi system is a promising platform for the use as a bioink in biofabrication. Chapter 2 highlights the versatility of the POx/POzi hydrogels by adapting the system to a use in targeted drug delivery. We used a bioinspired approach for a bioorthogonal conjugation of insulin-like growth factor I (IGF-I) to the polymer using an omega-chain-end dibenzocyclooctyne (DBCO) modification and a matrix metalloprotease-sensitive peptide linker. This approach enabled a bioresponsive release of IGF-I from hydrogels as well as spatial control over the protein distribution in 3D printed constructs which makes the system a candidate for the use in personalized medicine. Chapter 3 gives a general overview over the necessity of wound sealants and the current generations of fibrin sealants on the market including advantages and challenges. Furthermore, it highlights trends and potential new strategies to tackle current problems and broadens the toolbox for future generations of fibrin sealants. Chapter 4 applies the concepts of recombinant protein expression and molecular engineering to a novel generation of fibrin sealants. In a proof-of-concept study, we developed a new recombinant fibrinogen (rFbg) expression protocol and a Fbg mutant that is less susceptible to plasmin degradation. Targeted lysine of plasmin cleavage sites in Fbg were exchanged with alanine or histidine in different parts of the molecule. The protein was recombinantly produced and restricted plasmin digest was analyzed using high resolution mass spectrometry. In addition to that, we developed a novel time resolved screening protocol for the detection of new potential plasmin cleavage sites for further amino acid exchanges in the fibrin sealant. N2 - Hydrogele wurden im Laufe der Jahre für eine Vielzahl von Anwendungen, von der Verabreichung von Medikamenten bis hin zu medizinischen Produkten, entwickelt und eingesetzt. In dieser Arbeit wurde eine Poly(2-methyl-2-oxazolin) POx) / Poly(2-n-propyl-2- oxazin) (POzi) Biotinte modifiziert und für den Einsatz in der Biofabrikation und für die gezielte Verabreichung von Medikamenten analysiert. Außerdem wurde das Protein Fibrinogen (Fbg) gentechnisch verändert, um seine Stabilität gegenüber dem Plasminabbau in seiner Funktion als Wundkleber zu erhöhen In Kapitel 1 wurde ein thermogelierendes, druckbares Hydrogel auf POx/POzi-Basis mit Furan- und Maleimid-Funktionen im hydrophilen Polymerrückgrat modifiziert, was die Reifung der Konstrukte nach dem Druck durch Diels-Alder-Chemie bewirkt. Die Modifizierung ermöglichte eine langfristige Stabilität der Hydrogele in wässrigen Lösungen, was für Anwendungen im Bereich der Biofabrikation oder im Tissue Engineering erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir RGD-Peptide in das Hydrogel integriert, was zur Zelladhäsion und einer verlängerten Morphologie von Fibroblasten, die auf den Gelen ausgesät wurden, führte. Weitere Druckexperimente zeigen außerdem, dass das POx/POzi-System eine vielversprechende Plattform für den Einsatz als Biotinte in der Biofabrikation ist. Kapitel 2 unterstreicht die Vielseitigkeit der POx/POzi-Hydrogele, indem das System für die gezielte Abgabe von Medikamenten angepasst wird. Wir verwendeten einen von der Natur inspirierten Ansatz für eine biorthogonale Konjugation vom Insuline-like Growth Factor I (IGF- I) an das Polymer unter Verwendung einer Dibenzocyclooctin-Modifikation des Polymers am Ende der Omega-Kette und eines Matrix-Metalloproteasen-empfindlichen Peptid-Linkers. Dieser Ansatz ermöglichte eine bioresponsive Freisetzung von IGF-I aus Hydrogelen sowie eine räumliche Kontrolle über die Proteinverteilung in 3D-gedruckten Konstrukten, was das System zu einem Kandidaten für den Einsatz in der personalisierten Medizin macht. Kapitel 3 gibt einen allgemeinen Überblick über die Notwendigkeit von Wundversiegelungsmitteln und die derzeit auf dem Markt befindlichen Generationen von Fibrinklebern einschließlich der Vorteile und Herausforderungen. Darüber hinaus werden Trends und potenzielle neue Strategien zur Lösung aktueller Probleme und zur Erweiterung der Toolbox für künftige Generationen von Fibrinklebern aufgezeigt. In Kapitel 4 werden die Konzepte der rekombinanten Proteinexpression und des Molecular Engineering auf eine neue Generation von Fibrin Wundklebern angewandt. In einer Proof-of- Concept-Studie haben wir ein neues rekombinantes Fbg Expressionsprotokoll und eine Fbg Mutante entwickelt, die weniger anfällig für einen Abbau durch Plasmin ist. Gezielte Lysine in Plasmin-Schnittstellen in Fbg wurde entweder durch Alanin oder Histidin in unterschiedlichen Teilen des Moleküls ausgetauscht. Das Protein wurde rekombinant hergestellt und eine verminderte Schnittrate wurde mittels hochauflösender Massenspektrometrie gezeigt. Zusätzlich haben wir ein neues zeitaufgelöstes Screening-Protokoll entwickelt, mit dem sich neue potenzielle Plasmin-Spaltstellen für weitere Aminosäurenaustausche in Fibrin-Klebern auflösen lassen. KW - Hydrogel KW - Targeted drug delivery KW - 3 D bioprinting KW - Hydrogels KW - Modification KW - Bioinks KW - Fibrinogen KW - Drug Delivery Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322887 ER - TY - THES A1 - Gründl, Marco T1 - Biochemical characterization of the MMB-Hippo crosstalk and its physiological relevance for heart development T1 - Biochemische Charakterisierung des MMB-Hippo Signalweges und dessen physiologische Rolle in der Herzentwicklung N2 - The Myb-MuvB (MMB) complex plays an essential role in the time-dependent transcriptional activation of mitotic genes. Recently, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP, the transcriptional coactivator of the Hippo pathway, to coregulate a subset of mitotic genes (Pattschull et al., 2019). Several genetic studies have shown that the Hippo-YAP pathway is essential to drive cardiomyocyte proliferation during cardiac development (von Gise et al., 2012; Heallen et al., 2011; Xin et al., 2011). However, the exact mechanisms of how YAP activates proliferation of cardiomyocytes is not known. This doctoral thesis addresses the physiological role of the MMB-Hippo crosstalk within the heart and characterizes the YAP-B-MYB interaction with the overall aim to identify a potent inhibitor of YAP. The results reported in this thesis indicate that complete loss of the MMB scaffold protein LIN9 in heart progenitor cells results in thinning of ventricular walls, reduced cardiomyocyte proliferation and early embryonic lethality. Moreover, genetic experiments using mice deficient in SAV1, a core component of the Hippo pathway, and LIN9-deficient mice revealed that the correct function of the MMB complex is critical for proliferation of cardiomyocytes due to Hippo-deficiency. Whole genome transcriptome profiling as well as genome wide binding studies identified a subset of Hippo-regulated cell cycle genes as direct targets of MMB. By proximity ligation assay (PLA), YAP and B-MYB were discovered to interact in embryonal cardiomyocytes. Biochemical approaches, such as co-immunoprecipitation assays, GST-pulldown assays, and µSPOT-based peptide arrays were employed to characterize the YAP-B-MYB interaction. Here, a PY motif within the N-terminus of B-MYB was found to directly interact with the YAP WW-domains. Consequently, the YAP WW-domains were important for the ability of YAP to drive proliferation in cardiomyocytes and to activate MMB target genes in differentiated C2C12 cells. The biochemical information obtained from the interaction studies was utilized to develop a novel competitive inhibitor of YAP called MY-COMP (Myb-YAP competition). In MY-COMP, the protein fragment of B-MYB containing the YAP binding domain is fused to a nuclear localization signal. Co-immunoprecipitation studies as well as PLA revealed that the YAP-B-MYB interaction is robustly blocked by expression of MY-COMP. Adenoviral overexpression of MY-COMP in embryonal cardiomyocytes suppressed entry into mitosis and blocked the pro-proliferative function of YAP. Strikingly, characterization of the cellular phenotype showed that ectopic expression of MY-COMP led to growth defects, nuclear abnormalities and polyploidization in HeLa cells. Taken together, the results of this thesis reveal the mechanism of the crosstalk between the Hippo signaling pathway and the MMB complex in the heart and form the basis for interference with the oncogenic activity of the Hippo coactivator YAP. N2 - Der Myb-MuvB Komplex spielt eine essenzielle Rolle in der transkriptionellen Aktivierung von Zellzyklusgenen. Unser Labor hat kürzlich einen bis dahin unbekannten Mechanismus zwischen dem MMB-Komplex und Hippo-YAP Signalweg, der zur Aktivierung von Mitosegenen beiträgt, identifiziert. Der Hippo-YAP Signalweg ist beteiligt an der Gewebehomöostase und am Wachstum von Organen. So reguliert der Hippo-YAP Signalweg zum Beispiel während der Herzentwicklung die Proliferation von Herzmuskelzellen. Der exakte Mechanismus wie YAP die Zellteilung von Kardiomyozyten aktiviert, ist jedoch bisher nicht bekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wird das Zusammenspiel zwischen dem Hippo-Signalweg und dem MMB-Komplex im Herzen untersucht. Außerdem wird die Interaktion zwischen YAP und B-MYB biochemisch charakterisiert, um einen Inhibitor zu entwickeln, der die Aktivität von YAP vermindert. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit zeigen, dass der Verlust der zentralen Untereinheit des MMB-Komplexes, LIN9, in Vorläuferzellen der Kardiomyozyten zu einer Reduktion der Herzwand sowie zu einer niedrigeren Proliferationsrate von Herzmuskelzellen und einer erhöhten Embryonalsterblichkeit führt. Außerdem wurde in genetischen Experimenten mit Hippo- und LIN9-defizienten Mäusen gezeigt, dass der MMB-Komplex wichtig für die Aktivierung der Proliferation in Hippo-defizienten Kardiomyozyten ist. Eine globale Analyse der Transkription und Chromatinbindung von YAP und LIN9 im Herzen zeigte, dass eine Untergruppe von Zellzyklusgenen, die nach Inaktivierung des Hippo-Signalwegs vermehrt exprimiert werden, gleichzeitig den MMB-Komplex am Promoter gebunden haben. Durch Interaktionsstudien konnte gezeigt werden, dass YAP und B-MYB in embryonalen Kardiomyozyten miteinander interagieren. Die Bindung der beiden Transkriptionsfaktoren wurde durch Co-Immunpräzipitation, GST-Pulldown-Analysen und Peptid-Arrays biochemisch untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass ein PY-Motiv im N-terminus von B-MYB direkt an die WW-Domänen von YAP bindet. Im Umkehrschluss wurde festgestellt, dass die WW-Domänen von YAP essenziell sind, um sowohl die Proliferation in Herzmuskelzellen als auch die Expression von Mitosegenen in differenzierten C2C12 Zellen zu aktivieren. Letztendlich wurden die Ergebnisse der Interaktionsstudie genutzt, um einen neuartigen kompetitiven Inhibitor von YAP zu entwickeln. Für MY-COMP (Myb-YAP Competition) wurde der Proteinabschnitt von B-MYB, der die YAP Bindedomäne enthält, mit einer Kernlokalisierungssequenz fusioniert. Bindestudien zeigten, dass MY-COMP die Interaktion zwischen YAP und B-MYB effektiv blockiert. Eine durch Adenoviren vermittelte Überexpression von MY-COMP in embryonalen Herzmuskelzellen resultierte in einer verminderten Anzahl von mitotischen Zellen. Somit wird durch Expression von MY-COMP, die proliferative Fähigkeit von YAP vermindert. Interessanterweise wurden in HeLa Zellen, die mit MY-COMP behandelt wurden, vermehrt Abnormalitäten der Zellkerne, polyploide Zellen sowie ein Wachstumsdefizit beobachtet. Zusammengefasst verdeutlichen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit die Bedeutung des Zusammenspiels zwischen dem MMB-Komplex und dem Hippo-YAP-Signalweg für die Herzentwicklung und bilden die Grundlage, für die effektive Inhibierung der onkogenen Eigenschaften des Hippo-Coaktivators YAP. KW - Zellzyklus KW - Heart development KW - Hippo pathway KW - Myb-MuvB complex KW - Cardiomyocyte Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213328 ER - TY - THES A1 - Knobloch, Gunnar T1 - Biochemical and structural characterization of chronophin T1 - Die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Chronophin N2 - The haloacid dehalogenase (HAD) family of phosphatases is an ancient, ubiquitous group of enzymes, and their emerging role in human health and disease make them attractive targets for detailed analyses. This thesis comprises the biochemical and structural characterization of chronophin, an HAD-type phosphatase, which has been shown to act on Ser3-phosphorylated cofiln-1, a key regulator of actin dynamics, and on the Ser/Thr-phosphorylated steroid receptor co-activator 3 (SRC-3). Besides being a specific phosphoprotein phosphatase, chronophin also acts on the small molecule pyridoxal 5'-phosphate (PLP, vitamin B6), implying that chronophin serves as a regulator of a variety important physiological pathways. The analysis of chronophin was performed on different levels, ranging from intrinsic regulatory mechanisms, such as the allosteric regulation via dimerization or the characterization of specificity determinants, to modes of extrinsic modulation, including the association with putative interacting proteins or the generation of chronophin-specific inhibitors. The association of the previously identified putative chronophin interactors calcium- and integrinbinding protein 1 (CIB1) and calmodulin was investigated using recombinantly expressed and purified proteins. These studies revealed that the interaction of chronophin with CIB1 or calmodulin is mutually exclusive and regulated by calcium. Neither CIB1 nor calmodulin had an effect on the in vitro chronophin phosphatase activity towards PLP or phospho-cofilin-1, but might regulate other functions of this important phosphatase. The role of chronophin dimerization was studied by generating a constitutively monomeric variant, which showed reduced PLP hydrolyzing activity. X-ray crystallographic studies revealed that dimerization is essential for the positioning of the substrate specificity loop in chronophin, unraveling a previously unknown mechanism of allosteric regulation through a homophilic interaction. This mechanism potentially applies to other enzymes of the C2a subfamily of HAD-type phosphatases, as all structurally characterized members show a conserved mode of dimerization. The general determinants of substrate specificity in the C2a subfamily of HAD phosphatases were investigated by performing domain swapping experiments with chronophin and its paralog AUM and subsequent biochemical analyses of the hybrid proteins. The X-ray crystallographic structure determination of the chronophin catalytic domain equipped with the AUM capping domain revealed the first partial structure of AUM. This structural information was then used in subsequent studies that analyzed the divergent substrate specificities of AUM and chronophin in an evolutionary context. Finally, a set of four chronophin inhibitors were generated based on the structure of PLP and characterized biochemically, showing moderate inhibitory effects with IC50-values in the micromolar range. These compounds nevertheless constitute valuable tools for future in vitro experiments, such as studies concerning the structure-function relationship of chronophin as a PLP phosphatase. In addition, the crystal structure of one inhibitor bound to chronophin could be solved. These results provide the basis for the further development of competitive chronophin inhibitors with increased specificity and potency. N2 - HAD Phosphatasen gehören zu einer phylogenetisch alten Proteinfamilie, die in allen drei Domänen des Lebens vertreten ist. Enzyme dieser vergleichsweise wenig charakterisierten Familie von Phosphatasen erweisen sich zunehmend als biomedizinisch interessante Zielmoleküle, da immer mehr Krankheiten identifiziert werden, bei denen HAD Phosphatasen eine Rolle spielen. In der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde die HAD Phosphatase Chronophin biochemisch und strukturell charakterisiert. Bisher konnte gezeigt werden, dass Chronophin die Proteine Cofilin-1, ein Schlüsselprotein in der Regulation des Aktin-Zytoskeletts, und den Steroidrezeptor Coaktivator 3 (SRC-3) dephosphoryliert. Darüberhinaus ist bekannt, dass Chronophin eine spezifische Pyridoxal 5'-Phosphat (PLP, Vitamin B6) Phosphatase ist, und somit an der Regulation verschiedenster Signalwege beteiligt ist. Die hier beschriebene Analyse von Chronophin beinhaltet die Untersuchung intrinsischer Regulationsmechanismen, wie z.B. Determinanten der Substratspezifität, die allosterische Regulation über Dimerisierung, bis hin zur Kontrolle durch extrinsische Faktoren wie interagierende Proteine oder Inhibitoren. Die Interaktion von Chronophin mit den kürzlich in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Interaktionspartnern CIB1 (Kalzium- und Integrin-bindendes Protein 1) und Calmodulin wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter und gereinigter Proteine untersucht. Dabei kam heraus, dass sich die Assoziation von CIB1 und Calmodulin an Chronophin gegenseitig ausschließt, und dass dieser Prozess durch Kalzium reguliert wird. Dabei beeinflusst weder die Bindung an CIB1 noch an Calmodulin die Phosphataseaktivität von Chronophin gegenüber den Substraten PLP oder phosphoryliertem Cofilin-1. Möglicherweise regulieren die beiden interagierenden Proteine die Funktion von Chronophin auf eine andere, hier nicht weiter untersuchte Art und Weise. Der Einfluss der Chronophin-Dimerisierung wurde untersucht, indem wir eine konstitutiv monomere Variante des üblicherweise dimeren Chronophins geschaffen haben. Diese monomere Variante des Enzyms wies eine deutlich reduzierte Aktivität gegenüber PLP auf. Durch röntgenkristallographische Analysen des wild-typischen Proteins und der monomeren Variante konnten wir zeigen, dass die Dimerisierung von Chronophin notwendig ist, um ein Strukturelement, welches wichtig für die Substratspezifität ist, in einer korrekten Position zu halten. Dieser allosterische Mechanismus zur Aufrechterhaltung der Substratspezifität war bisher unbekannt, und trifft möglicherweise auf alle Proteine der C2a Unterfamilie von HAD Phosphatasen zu, die strukturell mit Chronophin verwandt sind. Die Faktoren, welche auf die Substratspezifität von Chronophin Einfluss nehmen wurden untersucht, indem einzelne Proteindomänen mit dem paralogen Protein AUM ausgetauscht, und die so geschaffenen Protein-Hybride biochemisch untersucht wurden. Durch das Lösen der röntgenkristallographischen Struktur eines Protein-Hybrids, bestehend aus der katalytischen Domäne von Chronophin und der capping-Domäne von AUM, konnte die die erste partielle Struktur von AUM untersucht werden. Mit Hilfe dieser strukturellen Information und durch bioinformatische Analysen konnten anschließend die unterschiedliche Substratspezifitäten der beiden paralogen Phosphatasen Chronophin und AUM in einem evolutionsbiologischen Kontext untersucht werden. Zusätzlich wurden vier mögliche Chronophin-Inhibitoren auf der Basis der PLP-Struktur synthetisiert. Die biochemische Analyse der Substanzen als Chronophin-Hemmer ergab moderate inhibitorische Eigenschaften mit IC50-Werten im micromolaren Bereich. Jedoch stellen die hier charakterisierten Inhibitoren nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen von Chronophin als PLP-Phosphatase dar. Die röntgenkristallographische Struktur von Chronophin mit einem der Inhibitoren liefert außerdem eine wichtge Grundlage für die zukünfitige Verbesserung der Inhibitoren bezüglich Effektivität und Spezifität. KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Dimerisierung KW - Inhibitor KW - Chronophin KW - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase KW - Haloacid dehalogenase KW - HAD phosphatase KW - PLP phosphatase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-110088 ER - TY - THES A1 - Viswanathan, Aravindan T1 - Biochemical and structural characterisation of modules within the SMN complex T1 - Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Modulen des SMN-Komplexes N2 - Cellular proteome profiling revealed that most biomolecules do not exist in isolation, but rather are incorporated into modular complexes. These assembled complexes are usually very large, consisting of 10 subunits on an average and include either proteins alone, or proteins and nucleic acids. Consequently, such macromolecular assemblies rather than individual biopolymers perform the vast majority of cellular activities. The faithful assembly of such molecular assemblies is often aided by trans-acting factors in vivo, to preclude aggregation of complex components and/or non-cognate interactions. A paradigm for an assisted assembly of a macromolecular machine is the formation of the common Sm/LSm core of spliceosomal and histone-mRNA processing U snRNPs. The key assembly factors united in the Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) and the Survival Motor Neuron (SMN) complexes orchestrate the assembly of the Sm/LSm core on the U snRNAs. Assembly is initiated by the PRMT5-complex subunit pICln, which pre-arranges the Sm/LSm proteins into spatial positions occupied in the mature U snRNPs. The SMN complex subsequently binds these Sm/LSm units, displaces pICln and catalyses the Sm ring closure on the Sm-site of the U snRNA. The SMN complex consists of the eponoymous SMN protein linked in a modular network of interactions with eight other proteins, termed Gemins 2-8 and Unrip. Despite functional and structural characterisation of individual protein components and/or sub-complexes of this assembly machinery, coherent understanding of the structural framework of the core SMN complex remained elusive. The current work, employing a combined approach of biochemical and structural studies, aimed to contribute to the understanding of how distinct modules within the SMN complex coalecse to form the macromolecular SMN complex. A novel atomic resolution (1.5 Å) structure of the human Gemin8:7:6 sub-complex, illustrates how the peripheral Gemin7:6 module is tethered to the SMN complex via Gemin8’s C-terminus. In this model, Gemin7 engages with both Gemin6 and Gemin8 via the N- and C-termini of its Sm-fold like domain. This highly conserved interaction mode is reflected in the pronounced sequence conservation and identical biochemical behaviour of similar sub-complexes from divergent species, namely S. pombe and C. elegans. Despite lacking significant sequence similarity to the Sm proteins, the dimeric Gemin7:6 complex share structural resemblance to the Sm heteromers. The hypothesis that the dimeric Gemin7:6 functions as a Sm-surrogate during Sm core assembly could not be confirmed in this work. The functional relevance of the structural mimicry of the dimeric Gemin7:6 sub-complex with the Sm heterodimers therefore still remains unclear. Reduced levels of functional SMN protein is the cause of the devastating neurodegenerative disease, Spinal Muscular Atrophy (SMA). The C-terminal YG-zipper motif of SMN is a major hot-spot for most SMA patient mutations. In this work, adding to the existing inventory of the human and fission yeast YG-box models, a novel 2.2 Å crystal structure of the nematode SMN’s YG-box domain adopting the glycine zipper motif has been reported. Furthermore, it could be assessed that SMA patient mutations mapping to this YG-box domain greatly influences SMN’s self-association competency, a property reflected in both the human and nematode YG-box biochemical handles. The shared molecular architecture and biochemical behaviour of the nematode SMN YG-box domain with its human and fission yeast counterparts, reiterates the pronounced conservation of this oligomerisation motif across divergent organisms. Apart from serving as a multimerization domain, SMN’s YG-box also acts as interaction platform for Gemin8. A systematic investigation of SMA causing missense mutations uncovered that Gemin8’s incorporation into the SMN complex is influenced by the presence of certain SMA patient mutations, albeit independent of SMN’s oligomerisation status. Consequently, loss of Gemin8 association in the presence of SMA patient mutations would also affect the incorporation of Gemin7:6 sub-complex. Gemin8, therefore sculpts the heteromeric SMN complex by bridging the Gemin7:6 and SMN:Gemin2 sub-units, a modular feature shared in both the human and nematode SMN complexes. These findings provide an important foundation and a prospective structural framework for elucidating the core architecture of the SMN complex in the ongoing Cryo-EM studies. N2 - Systematische Untersuchungen von zellulären Bestandteilen haben gezeigt, dass viele Proteine nicht isoliert, sondern vielmehr in modularen Komplexen organisiert vorliegen. Mit durchschnittlich zehn Untereinheiten sind diese Komplexe sehr groß, wobei sie entweder ausschließlich aus Proteinen oder aber aus Proteinen und Nukleinsäuren bestehen können. Daher wird der Großteil zellulärer Aktivitäten nicht von einzelnen Biopolymeren, sondern von makromolekularen Komplexen verrichtet. Die Zusammenlagerung dieser Komplexe wird in vivo häufig von Hilfsfaktoren unterstützt, um die Aggregation der Einzelkomponenten und/oder unspezifische Wechselwirkungen zu verhindern. Ein Beispiel für eine derartige Zusammenlagerungshilfe ist die Bildung des Sm/LSm-Cores der mRNA-prozessierenden U snRNPs. Dabei wird die Anlagerung von Sm/LSm Proteinen an die U snRNAs durch eine Anzahl von Hilfsfaktoren orchestriert, die in Protein-Arginin-Methyltransferase 5 (PRMT5)- und dem Survival Motor Neuron (SMN)-Komplexen organisiert sind. Die Zusammenlagerung wird durch die PRMT5-Untereinheit pICln initiiert, die die räumliche Anordnung von Sm/LSm-Proteinen in höher-geordneten Komplexen stabilisiert. Diese werden anschließend auf den SMN-Komplex übertragen, wobei pICln verdrängt und die Verbindung mit der Sm-Seite der U snRNA sichergestellt wird. Der SMN-Komplex besteht aus dem SMN-Protein, das in einem modularen Netzwerk mit acht weiteren Proteinen (Gemins 2-8 und Unrip) interagiert. Auch wenn funktionale und strukturelle Charakterisierungen einzelner Proteinkomponenten und Module dieser Zusammenlagerungs-Maschinerie vorliegen, steht ein tiefergehendes Verständnis des strukturellen Organisation des Gesamt-Komplexes noch aus. In der vorliegenden Arbeit sollte unter Anwendung biochemischer und struktureller Techniken ein Beitrag dazu geleistet werden, die Interaktionen der verschiedenen Komponenten innerhalb des SMN-Komplexes zu verstehen, die so die dreidimensionale Organisation des SMN-Komplexes zu verstehen. Eine neuartige Kristallstruktur des humanen Gemin8:7:6-Subkomplexes bei einer Auflösung von 1.5 Å zeigt, wie der periphere Gemin7:6-Abschnitt durch den C-Terminus von Gemin8 zum SMN-Komplex dirigiert wird. In diesem Modell interagiert Gemin7 sowohl mit Gemin6 als auch Gemin8 über den N- und C-Terminus der Sm-ähnlichen Domäne. Dieser hochkonservierte Interaktionsmodus wird in der erwähnten konservierten Sequenz und dem gleichen biochemischen Verhalten ähnlicher Subkomplexe in divergenten Spezies einschließlich S. pombe und C. elegans widergespiegelt. Obwohl es keine signifikante Übereinstimmung mit der Sequenz von Sm-Proteinen gibt, weist der dimere Gemin7:6-Komplex markante strukturelle Ähnlichkeit mit dem einem Sm-Heterodimer auf. Die Annahme, der dimere Gemin7:6-Subkomplex würde als Hilfsfaktor über die direkte Interaktion mit Sm-Proteinen fungieren konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden. Folglich bleibt die Funktion des dimeren Gemin7:6-Subkomplexes im Kontext der SMN-Zusammenlagerungsmaschinerie unklar. Verringerte Mengen des funktionellen SMN-Proteins sind die Ursache für die neurodegenerative Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA). Das C-terminale YG-Zipper-Motiv von SMN stellt einen Hotspot für die meisten SMA-Mutationen dar. In dieser Arbeit wurde der bereits bekannten YG-Box aus H. sapiens und S. pombe eine neuartige Kristallstruktur der SMN YG-Box aus C. elegans mit einer Auflösung von 2.2 Å hinzugefügt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass SMA-verursachende Missense-Mutationen in der YG-Box einen beträchtlichen Einfluss auf die Selbst-Interaktion von SMN haben, was aus biochemischen Versuchen mit der YG-Box aus H. sapiens und C. elegans ersichtlich wurde. Der molekulare Aufbau und das biochemische Verhalten der SMN YG-Box aus C. elegans, S. pombe und H. sapiens betont die Konservierung dieses Oligomerisierungsmotives über mehrere Organismen hinweg. Neben der Funktion als Multimerisationsdomäne dient die YG-Box von SMN auch als Interaktionsplattform für Gemin8. Eine systematische Untersuchung von SMA-verursachenden Missense-Mutationen ergab, dass die Einbindung von Gemin8 in den SMN-Komplex durch definierte Substitutionen massiv beeinflusst wird. Interessanterweise ist dieser Bindungsdefekt unabhängig vom SMN-Oligomerisierungsstatus. Demzufolge würde diese Klasse von SMA-Mutationen spezifisch die Inkorporation des Gemin7:6-Subkomplexes beeinflussen. Die Resultate dieser Arbeit bilden eine wichtige Grundlage für weitere strukturelle Untersuchungen des SMN-Komplexes über Kryo-Elektronenmikroskopie. KW - SMN complex KW - Macromolecular machine KW - Structural organisation KW - Proteom KW - Motoneuron Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-194749 ER - TY - THES A1 - Kasaragod, Vikram Babu T1 - Biochemical and Structural Basis for the Moonlighting Function of Gephyrin T1 - Biochemische und Strukturelle Basis für die duale Funktionalität von Gephyrin N2 - Neurons are specialized cells dedicated to transmit the nerve impulses throughout the human body across specialized structures called synapses. At the synaptic terminals, a crosstalk between multiple macromolecules regulates the structure and function of the presynaptic nerve endings and the postsynaptic recipient sites. Gephyrin is the central organizer at inhibitory postsynaptic specializations and plays a crucial role in the organization of these structures by anchoring GABAA receptors (GABAAR) and glycine receptors (GlyR) to the postsynaptic membrane. This 93 kDa protein features an N-terminal G domain and a C-terminal E domain and the latter interacts directly with the intracellular loop between transmembrane helices 3 and 4 of certain subunits of the GlyRs and GABAARs. Biochemical and structural analyses have already provided valuable insights into the gephyrin-GlyR interaction. Interestingly, biochemical studies on the gephyrin-GABAAR interaction demonstrated that the GABAARs also depend on the same binding site as the GlyRs for the interaction with the gephyrin, but the molecular basis for this receptor specific interaction of gephyrin was still unknown. Co-crystal structures of GephE-GABAAR α3- derived peptides with supporting biochemical data presented in this study deciphered the receptor-specific interactions of gephyrin in atomic detail. In its moonlighting function, gephyrin also catalyzes the terminal step of the evolutionarily conserved molybdenum cofactor biosynthesis. Molybdenum, an essential transition element has to be complexed with a pterin-based cofactor resulting in the formation of the molybdenum cofactor (Moco). Moco is an essential component at the active site of all molybdenum-containing enzymes with the exception of nitrogenase. Mutations in enzymes involved in this pathway lead to a rare yet severe disease called Moco deficiency, which manifest itself in severe neurodevelopmental abnormalities and early childhood death. Moco biosynthesis follows a complex multistep pathway, where in the penultimate step, the N-terminal G domain of gephyrin activates the molybdopterin to form an adenylated molybdopterin intermediate. In the terminal step, this intermediate is then transferred to the C-terminal E domain of gephyrin, which catalyzes the metal insertion and deadenylation reaction to form active Moco. Previous biochemical and structural studies provided valuable insights into the penultimate step of the Moco biosynthesis but the terminal step remained elusive. Through the course of my dissertation, I crystallized the C-terminal E domain in the apo-form as well as in complex with ADP and AMP. These structures shed lightonto the deadenylation reaction and the formation of a ternary E-domain-ADP-Mo/W complex and thus provide structural insight into the metal insertion mechanism. Moreover, the structures also provided molecular insights into a mutation leading to Moco deficiency. Finally, ternary complexes of GephE, ADP and receptor-derived peptides provided first clues regarding the integration of gephyrin’s dual functionality. In summary, during the course of the dissertation I was able to derive high resolution structural insights into the interactions between gephyrin and GABAARs, which explain the receptor-specific interaction of gephyrin and, furthermore, these studies can be extended in the future to understand GABAAR subunit-specific interactions of gephyrin. Finally, the understanding of Moco biosynthesis shed light on the molecular basis of the fatal Moco deficiency. N2 - Neurone sind spezialisierte Zellen, die über die Synapsen Nervenimpulse im menschlichen Körper übertragen. An den synaptischen Enden reguliert ein Netzwerk aus einer Vielzahl von Makromolekülen die Struktur und die Funktion der präsynaptischen Nervenenden und der postsynaptischen Kontaktstellen. Gephyrin ist der Hauptorganisator an inhibitorischen, postsynaptischen Spezialisierungen und spielt durch die Verankerung von GABAA-Rezeptoren (GABAAR) und Glycinrezeptoren (GlyR) in der postsynaptischen Membran eine zentrale Rolle für den Aufbau dieser Strukturen. Dieses 93 kDa Protein enthält eine N-terminale G-Domäne (GephG) und eine C-terminale E-Domäne (GephE), wobei letztere direkt mit der intrazellulären unstrukturierten Region zwischen Transmembranhelices 3 und 4 bestimmter Untereinheiten der GlyR und GABAAR interagiert. Biochemische und strukturelle Analysen lieferten bereits wertvolle Erkenntnisse über die Gephyrin-GlyR Interaktion. Interessanterweise zeigten Versuche zur Gephyrin-GABAAR Interaktion, dass GABAARs die gleiche Bindungsstelle auf Gephyrin benutzen wie GlyRs, wobei die molekulare Basis für diese Interaktion nicht bekannt war. In dieser Arbeit zeige ich Co-Kristallstrukturen von GephE-GABAARα3 sowie unterstützende biochemische Daten, die die atomaren Details der rezeptorspezifischen Interaktionen von Gephyrin entschlüsseln. Als zweite Funktion katalysiert Gephyrin den terminalen Schritt der evolutionär konservierten Molybdän Cofaktor Biosynthese. Dabei muss das essentielle Übergangselement Molybdän mit einem Pterin-basierten Cofaktor komplexiert werden, um den Molybdän Cofaktor (Moco) zu bilden. Moco ist essentieller Bestandteil im aktiven Zentrum aller Molybdän-enthaltenden Enzyme mit Ausnahme der Nitrogenase. Mutationen in Enzymen, die in die Molybdän Cofaktor Biosynthese involviert sind, verursachen eine Moco Defizienz, eine seltene, jedoch schwere Erkrankung, die sich durch schwere neurologische Entwicklungsstörungen und Tod im frühen Kindesalter äußert. Die Moco Biosynthese folgt einem komplexen mehrstufigen Ablauf. Im vorletzten Schritt adenyliert GephG das Molybdopterin und ein Zwischenprodukt entsteht. Im letzten Schritt wird dieses Zwischenprodukt auf GephE übertragen, das die Insertion des Metalls und die Deadenylierungsreaktion katalysiert, wodurch der aktive Moco entsteht. Frühere biochemische und strukturelle Studien brachten wertvolle Erkenntnisse über den vorletzten Schritt der Moco Biosynthese, aber die Kenntnisse über den letzten Schritt blieben vage. Während meiner Dissertation kristallisierte ich GephE in der apo-Form sowie im Komplex mit ADP oder AMP. Diese Strukturen gaben Aufschluss über die Deadenylierungsreaktion und die Formation eines ternären GephE-ADP-Mo/W Komplexes und gewährten so einen strukturellen Einblick in den Mechanismus der Metallinsertion. Darüber hinaus ermöglichten die Strukturen eine Mutation, die zu Moco Mangel führt, auf molekularer Ebene zu verstehen. Schließlich lieferten ternäre Komplexe aus GephE, ADP und von Rezeptoren abgeleiteten Peptiden ersten Aufschluss bezüglich der Verflechtung von Gephyrins dualer Funktion. Zusammenfassend konnte ich während der Dissertation hochauflösende strukturelle Einblicke in den Komplex aus GephE und GABAAR α3 Untereineinheit gewinnen, die die rezeptorspezifische Interaktion von Gephyrin erklären. Weiterhin können diese Studien in der Zukunft ausgeweitet werden, um die GABAAR-untereinheitenspezifische Interaktion mit Gephyrin zu verstehen. Schließlich erlauben die Studien zur Moco Biosynthese die tödliche Moco Defizienz auf molekularer Ebene zu verstehen. KW - Gephyrin KW - Moco biosynthesis Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143077 ER - TY - THES A1 - Huber, Hannes T1 - Biochemical and functional characterization of DHX30, an RNA helicase linked to neurodevelopmental disorder T1 - Biochemische und funktionelle Charakterisierung von DHX30, einer RNA Helikase assoziiert mit neurologischen Entwicklungsstörungen N2 - RNA helicases are key players in the regulation of gene expression. They act by remodeling local RNA secondary structures as well as RNA-protein interactions to enable the dynamic association of RNA binding proteins to their targets. The putative RNA helicase DHX30 is a member of the family of DEAH-box helicases with a putative role in the ATP-dependent unwinding of RNA secondary structures. Mutations in the DHX30 gene causes the autosomal dominant neuronal disease “Neurodevelopmental Disorder with severe Motor Impairment and Absent Language” (NEDMIAL;OMIM#617804). In this thesis, a strategy was established that enabled the large-scale purification of enzymatically active DHX30. Through enzymatic studies performed in vitro, DHX30 was shown to act as an ATP-dependent 3’ → 5’ RNA helicase that catalyzes the unwinding of RNA:RNA and RNA:DNA substrates. Using recombinant DHX30, it could be shown that disease-causing missense mutations in the conserved helicase core caused the disruption of its ATPase and helicase activity. The protein interactome of DHX30 however, was unchanged indicating that the pathogenic missense-mutations do not cause misfolding of DHX30, but rather specifically affect its catalytic activity. DHX30 localizes predominantly in the cytoplasm where it forms a complex with ribosomes and polysomes. Using a cross-linking mass spectrometry approach, a direct interaction of the N-terminal double strand RNA binding domain of DHX30 with sites next to the ribosome’s mRNA entry channel and the subunit interface was uncovered. RNA sequencing of DHX30 knockout cells revealed a strong de-regulation of mRNAs involved in neurogenesis and nervous system development, which is in line with the NEDMIAL disease phenotype. The knockdown of DHX30 results in a decreased 80S peak in polysome gradients, indicating that DHX30 has an effect on the translation machinery. Sequencing of the pool of active translating mRNAs revealed that upon DHX30 knockout mainly 5’TOP mRNAs are downregulated. These mRNAs are coding for proteins of the translational machinery and translation initiation factors. This study identified DHX30 as a factor of the translation machinery that selectively impacts the expression of a subset of proteins and provides insight on the etiology of NEDMIAL. N2 - RNA-Helikasen sind Schlüsselfaktoren bei der Regulierung der Genexpression. Sie remodellieren RNA-Sekundärstrukturen und RNA-Protein Interaktionen und dadurch die dynamische Interaktion von RNA-bindenden Proteinen mit deren Substraten. Die putative RNA-Helikase DHX30 ist Mitglied der DEAH-box Helikasen, welche in Abhängigkeit von ATP in der Lage sind, RNA-Sekundärstrukturen aufzulösen. Mutationen im DHX30 Gen verursachen die autosomal-dominante neuronale Krankheit “Neurodevelopmental Disorder with Severe Motor Impairment and Absent Language” (NEDMIAL; OMIM#617804). In dieser Arbeit wurde eine Aufreinigungs-Strategie etabliert, um im präparativen Maßstab enzymatisch-aktives DHX30 Protein zu gewinnen. Mit dem aufgereinigten Protein wurden enzymatische Experimente durchgeführt, wodurch DHX30 als ATP abhängige RNA-Helikase charakterisiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass es in der Lage ist RNA:RNA sowie RNA:DNA Substrate in einer 3’ → 5’ Richtung zu entwinden. Mithilfe des rekombinanten Proteins konnte weiter gezeigt werden, dass krankheitsverursachende Mutationen im hoch-konservierten Helikase-Kern von DHX30 zur Beeinträchtigung der ATPase und Helikase-Aktivität des Proteins führen. Des Weiteren ergab sich, dass das Protein-Interaktom der DHX30 Mutanten sich im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert, was impliziert, dass die Mutationen nicht zu einer Missfaltung des Proteins, sondern dessen katalytische Aktivität inhibieren. DHX30 lokalisiert hauptsächlich im Cytoplasma und bildet dort einen Proteinkomplex mit Ribosomen und Polysomen. Mittels eines cross-linking mass spectrometry-Experiments konnte eine direkte Interaktion von DHX30 mit Stellen der ribosomalen mRNA Eintrittsstelle und dem Interface der ribosomalen Untereinheiten identifiziert werden. Die RNA Sequenzierung von DHX30-deletieren Zellen zeigte eine starke Deregulierung von mRNAs welche für die Entwicklung des Nervensystems und in der Neurogenese eine Rolle spielen, was mit dem Krankheits-Phänotyp von NEDMIAL korreliert. Weiter konnte gezeigt werden, dass es in DHX30-deletierten Zellen zur Abnahme von 80S Ribosomen in Polysomen-Gradienten kommt, was auf eine Funktion von DHX30 während der Translation schließen lässt. Durch das Sequenzieren aktiv translatierender mRNAs zeigte sich, dass der KO von DHX30 zur Abnahme von 5‘TOP mRNAs führt. Diese mRNAs kodieren für Proteine der Translations-Maschinerie und für Translations-Initiations Faktoren. Diese Studie identifiziert DHX30 als Faktor der Translations-Maschinerie, der selektiv die Expression einer mRNA-Untergruppe beeinflusst und Einblicke in die Ätiologie von NEDMIAL liefert. KW - DHX30 KW - NEDMIAL KW - Neurodevelopmental diseases KW - RNA helicase KW - RNA metabolism Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280505 ER - TY - THES A1 - Sharan, Malvika T1 - Bio-computational identification and characterization of RNA-binding proteins in bacteria T1 - Bioinformatische Identifikation und Charakterisierung von RNA-bindenden Proteinen in Bakterien N2 - RNA-binding proteins (RBPs) have been extensively studied in eukaryotes, where they post-transcriptionally regulate many cellular events including RNA transport, translation, and stability. Experimental techniques, such as cross-linking and co-purification followed by either mass spectrometry or RNA sequencing has enabled the identification and characterization of RBPs, their conserved RNA-binding domains (RBDs), and the regulatory roles of these proteins on a genome-wide scale. These developments in quantitative, high-resolution, and high-throughput screening techniques have greatly expanded our understanding of RBPs in human and yeast cells. In contrast, our knowledge of number and potential diversity of RBPs in bacteria is comparatively poor, in part due to the technical challenges associated with existing global screening approaches developed in eukaryotes. Genome- and proteome-wide screening approaches performed in silico may circumvent these technical issues to obtain a broad picture of the RNA interactome of bacteria and identify strong RBP candidates for more detailed experimental study. Here, I report APRICOT (“Analyzing Protein RNA Interaction by Combined Output Technique”), a computational pipeline for the sequence-based identification and characterization of candidate RNA-binding proteins encoded in the genomes of all domains of life using RBDs known from experimental studies. The pipeline identifies functional motifs in protein sequences of an input proteome using position-specific scoring matrices and hidden Markov models of all conserved domains available in the databases and then statistically score them based on a series of sequence-based features. Subsequently, APRICOT identifies putative RBPs and characterizes them according to functionally relevant structural properties. APRICOT performed better than other existing tools for the sequence-based prediction on the known RBP data sets. The applications and adaptability of the software was demonstrated on several large bacterial RBP data sets including the complete proteome of Salmonella Typhimurium strain SL1344. APRICOT reported 1068 Salmonella proteins as RBP candidates, which were subsequently categorized using the RBDs that have been reported in both eukaryotic and bacterial proteins. A set of 131 strong RBP candidates was selected for experimental confirmation and characterization of RNA-binding activity using RNA co-immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing (RIP-Seq) experiments. Based on the relative abundance of transcripts across the RIP-Seq libraries, a catalogue of enriched genes was established for each candidate, which shows the RNA-binding potential of 90% of these proteins. Furthermore, the direct targets of few of these putative RBPs were validated by means of cross-linking and co-immunoprecipitation (CLIP) experiments. This thesis presents the computational pipeline APRICOT for the global screening of protein primary sequences for potential RBPs in bacteria using RBD information from all kingdoms of life. Furthermore, it provides the first bio-computational resource of putative RBPs in Salmonella, which could now be further studied for their biological and regulatory roles. The command line tool and its documentation are available at https://malvikasharan.github.io/APRICOT/. N2 - RNA-bindende Proteine (RBPs) wurden umfangreich in Eukaryoten erforscht, in denen sie viele Prozesse wie RNA-Transport, -Translation und -Stabilität post-transkriptionell regulieren. Experimentelle Methoden wie Cross-linking and Koimmunpräzipitation mit nachfolgedener Massenspektromentrie / RNA-Sequenzierung ermöglichten eine weitreichende Charakterisierung von RBPs, RNA-bindenden Domänen (RBDs) und deren regulatorischen Rollen in eukaryotischen Spezies wie Mensch und Hefe. Weitere Entwicklungen im Bereich der hochdurchsatzbasierten Screeningverfahren konnten das Verständnis von RBPs in Eukaryoten enorm erweitern. Im Gegensatz dazu ist das Wissen über die Anzahl und die potenzielle Vielfalt von RBPs in Bakterien dürftig. In der vorliegenden Arbeit präsentiere ich APRICOT, eine bioinformatische Pipeline zur sequenzbasierten Identifikation und Charakterisierung von Proteinen aller Domänen des Lebens, die auf RBD-Informationen aus experimentellen Studien aufbaut. Die Pipeline nutzt Position Specific Scoring Matrices und Hidden-MarkovModelle konservierter Domänen, um funktionelle Motive in Proteinsequenzen zu identifizieren und diese anhand von sequenzbasierter Eigenschaften statistisch zu bewerten. Anschließend identifiziert APRICOT mögliche RBPs und charakterisiert auf Basis ihrer biologischeren Eigenschaften. In Vergleichen mit ähnlichen Werkzeugen übertraf APRICOT andere Programme zur sequenzbasierten Vorhersage von RBPs. Die Anwendungsöglichkeiten und die Flexibilität der Software wird am Beispiel einiger großer RBP-Kollektionen, die auch das komplette Proteom von Salmonella Typhimurium SL1344 beinhalten, dargelegt. APRICOT identifiziert 1068 Proteine von Salmonella als RBP-Kandidaten, die anschließend unter Nutzung der bereits bekannten bakteriellen und eukaryotischen RBDs klassifiziert wurden. 131 der RBP-Kandidaten wurden zur Charakterisierung durch RNA co-immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing (RIP-seq) ausgewählt. Basierend auf der relativen Menge an Transkripten in den RIP-seq-Bibliotheken wurde ein Katalog von angereicherten Genen erstellt, der auf eine potentielle RNA-bindende Funktion in 90% dieser Proteine hindeutet. Weiterhin wurden die Bindungstellen einiger dieser möglichen RBPs mit Cross-linking and Co-immunoprecipitation (CLIP) bestimmt. Diese Doktorarbeit beschreibt die bioinformatische Pipeline APRICOT, die ein globales Screening von RBPs in Bakterien anhand von Informationen bekannter RBDs ermöglicht. Zudem enthält sie eine Zusammenstellung aller potentieller RPS in Salmonella, die nun auf ihre biologsche Funktion hin untersucht werden können. Das Kommondozeilen-Programm und seine Dokumentation sind auf https://malvikasharan.github.io/APRICOT/ verfügbar. KW - Bioinformatics Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153573 ER - TY - THES A1 - Herweg, Andreas T1 - Beyond the state of the art, towards intuitive and reliable non-visual Brain-Computer-Interfacing T1 - Entwicklung intuitiver und zuverlässiger nicht-visueller Gehirn-Computer-Schnittstellen N2 - For the present work three main goals were formulated: goal 1 To design a tactile BCI used for mobility which is intuitive (G1.1), reliable and fast while being usable by participants aged 50 years and above. goal 2 To design an auditory BCI used for communication which is intuitive and reliable. goal 3 To examine the effects of training on tactile and auditory BCI performance. Three studies were performed to achieve these goals. In the first study nine participants aged above 50 years performed a five-session training after which eight participants were able to navigate a virtual wheelchair with mean accuracy above 95% and an ITR above 20 bits / min. In the second study 15 participants, four of them endusers with motor-impairment, were able to communicate meaningful with high accuracies using an auditory BCI. In the third study nine healthy and nine visually impaired participants (regarded as sensory experts for non-visual perception) performed tactile, auditory and visual (for healthy participants only) copy tasks. Participants with trained perception significantly outperformed control participants for tactile but not for auditory performance. Tactile performance of sensory experts was on equal levels as the visual performance of control participants. We were able to demonstrate viability of intuitive gazeindependent tactile and auditory BCI. Our tactile BCI performed on levels similar to those of visual BCI, outperforming current tactile BCI protocols. Furthermore, we were able to demonstrate significant beneficial effect of training on tactile BCI performance. Our results demonstrate previously untapped potential for tactile BCI and avenues for future research in the field of gaze-independent BCI. N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden folgende drei Hauptziele formuliert: ziel 1 Entwicklung eines taktilen Mobilitäts-BCIs, das sowohl intuitiv, zuverlässig und schnell als auch von Personen älter als 50 Jahre verlässlich benutzt werden kann.. ziel 2 Entwicklung eines auditorischen Kommunikations- BCIs, das intuitiv und zuverlässig sein soll. ziel 3 Untersuchung des Effekts von sensorischem Training auf die Leistung bei Verwendung eines BCIs. Um die genannten Ziele zu erreichen, wurden drei Studien durchgeführt. In der ersten Studie absolvierten neun Teilnehmer älter als 50 Jahre ein BCI-Training, das fünf Sitzungen umfasste. Nach Abschluss des Trainings konnten acht Teilnehmer einen virtuellen Rollstuhl mit mittleren Genauigkeiten von über 95% und einer ITR über 20 bits / min steuern. In der zweiten Studie waren insgesamt 15 Teilnehmer, davon vier End-Nutzer mit motorischen Einschränkungen, in der Lage, bedeutungsvoll und mit hohen Genauigkeiten mittels unseres BCIs zu kommunizieren. An der dritten Studie nahmen neun sehende und neun blinde (sensorische Experten für nicht visuelle Wahrnehmung) Versuchspersonen teil und absolvierten taktile, auditorische und visuelle (nur für sehende Teilnehmer) Copy-Aufgaben. Verglichen mit den Sehenden waren die sensorische Experten signifikant besser in der taktilen, jedoch nicht in der auditiven Modalität. Leistungen von Blinden in der taktilen Modalität waren gleich gut wie die von Sehenden in der visuellen Modalität. Zusammenfassend konnte im Rahmen der Arbeit gezeigt werden, dass intuitive blickunabhängige taktile und auditorische BCI eine gültige Alternative zu bestehenden visuellen BCI darstellen. Mit dem vorgestellten taktilen BCI konnten Leistungen erbracht werden, die mit denen visueller BCIs vergleichbar sind. Zusätzlich wurde ein signifikant positiver Einfluss von Training auf die taktile Leistungsfähigkeit gezeigt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse bisher ungenutzes Potenzial für taktile BCI aufzeigen und wertvolle Ansätze für zukünftige Forschung liefern. KW - Gehirn-Computer-Schnittstelle KW - tactile KW - non-visual KW - auditory KW - tactil KW - nicht-visuell KW - auditorisch Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133447 ER - TY - THES A1 - Fronhofer, Emanuel Alexis T1 - Beyond classical metapopulations: trade-offs and information use in dispersal ecology T1 - Differentielle Energieallokation und informierte Emigration: Eine Erweiterung des Metapopulationskonzeptes N2 - All animal and plant species must disperse in order to survive. Although this fact may seem trivial, and the importance of the dispersal process is generally accepted, the eco-evolutionary forces influencing dispersal, and the underlying movement elements, are far from being comprehensively understood. Beginning in the 1950s scientists became aware of the central role of dispersal behaviour and landscape connectivity for population viability and species diversity. Subsequently, dispersal has mainly been studied in the context of metapopulations. This has allowed researchers to take into account the landscape level, e.g. for determining conservation measures. However, a majority of theses studies classically did not include dispersal evolution. Yet, it is well known that dispersal is subject to evolution and that this process may occur (very) rapidly, i.e. over short ecological time-scales. Studies that do take dispersal evolution into account, mostly focus on eco-evolutionary forces arising at the level of populations - intra-specific competition or Allee effects, for example - and at the level of landscapes - e.g. connectivity, patch area and fragmentation. Yet, relevant ecological and evolutionary forces can emerge at all levels of biological complexity, from genes and individuals to populations, communities and landscapes. Here, I focus on eco-evolutionary forces arising at the gene- and especially at the individual level. Combining individual-based modelling and empirical field work, I explicitly analyse the influence of mobility trade-offs and information use for dispersal decisions - i.e. individual level factors - during the three phases of dispersal - emigration, transfer and immigration. I additionally take into account gene level factors such as ploidy, sexual reproduction (recombination) and dominance. Mobility-fertility trade-offs may shape evolutionarily stable dispersal strategies and lead to the coexistence of two or more dispersal strategies, i.e. polymorphisms and polyphenisms. This holds true for both dispersal distances (chapter 3) and emigration rates (chapter 4). In sessile organisms - such as trees or corals - maternal investment, i.e. transgenerational trade-offs between maternal fertility and propagule dispersiveness, can be the cause of bimodal and fat-tailed dispersal kernels. However, the coexistence of two or more dispersal strategies may be critically dependent on gene level factors, such as ploidy or dominance (chapter 4). Passively dispersing individuals may realize such multimodal dispersal kernels by mixing different dispersal vectors. Active choice of these vectors allows to optimize the kernel. As most animals have evolved some kind of memory and sensory apparatus - chemical, acoustic or optical sensors - it is obvious that these capacities should be used for dispersal decisions. Chapter 5 explores the use of chemical cues for vector choice in passively dispersed animals. I find that the neotropical phoretic flower mites Spadiseius calyptrogynae non-randomly mix different dispersal vectors, i.e. one short- and one long-distance disperser, in order to achieve fat-tailed dispersal kernels. Such kernels allow an optimal exploitation of patchily distributed habitats. In addition, this strategy increases the probability of successful immigration as the short-distance dispersal vectors show directed dispersal towards suitable habitats. Results from individual-based simulations support and explain my empirical findings. The use of memory and sensory apparatus in dispersal is also the main topic of chapter 6 which strives to bridge the gap between dispersal and movement ecology. In this part of my thesis I develop a model of non-random, memory-based animal movement strategies. Extending the movement ecology paradigm of Nathan (2008a) I postulate that four elements may be relevant for the emergence of efficient movement strategies: perception, memory, inference and anticipation. Movement strategies including these four elements optimize search efficiency at two scales: within patches and between patches. This leads to a significantly increased search efficiency over a comparable area restricted search strategy. These four chapters are completed by a general analysis of metapopulation dynamics (chapter 2). I find that although the metapopulation concept is very popular in theoretical ecology, classical metapopulations can be predicted to be rare in nature, as suggested by lacking empirical evidence. This is especially the case when gene level factors, such as ploidy and sex, are taken into account. In summary, my work analyses the effects of ecological and evolutionary forces arising at the gene- and individual level on the evolution of dispersal and movement strategies. I highlight the importance of including these limiting factors, mechanisms and processes and show how they impact the evolution of dispersal in spatially structured populations. All chapters demonstrate that these forces may have dramatic effects on resulting ecological and evolutionary dynamics. If we intend to understand animal and plant dispersal or movement, it is crucial to include eco-evolutionary forces emerging at all levels of complexity, from genes to communities and landscapes. This endeavour is certainly not purely academic. Particularly nowadays, with rapidly changing landscape structures and anticipated drastic shifts of climatic zones due to global change, dispersal is a factor that cannot be overestimated. N2 - Alle Tier- und Pflanzenarten müssen sich ausbreiten, um ihr Überleben zu sichern. Diese Feststellung mag trivial erscheinen und es wird inzwischen allgemein anerkannt, dass Ausbreitungsverhalten von groß er Relevanz ist. Trotzdem sind wir weit davon entfernt, die öko-evolutionären Kräfte zu verstehen, die Ausbreitungsverhalten und zu Grunde liegende Bewegungsstrategien determinieren. Erst in den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts begannen Ökologen die zentrale Rolle von Ausbreitungsverhalten und Konnektivität für die langfristige Überlebensfähigkeit von Populationen sowie für die Entstehung und Aufrechterhaltung von Artenvielfalt zu begreifen. Bis heute wurde Ausbreitungsverhalten vor allem im Kontext von Metapopulationen analysiert. So konnte, über die Untersuchung der Dynamik von lokalen Populationen hinaus, die Landschaftsebene mit einbezogen werden, um beispielsweise effiziente Naturschutzmaßnahmen abzuleiten. Die Evolution von Ausbreitungsverhalten wurde in diesen Studien allerdings traditionellerweise nicht berücksichtigt. Inzwischen ist jedoch zweifelsfrei erwiesen, dass Ausbreitungsverhalten sehr schnell evolvieren kann, wodurch dieser Prozess bereits auf kurzen ökologischen Zeitskalen von Bedeutung ist. Untersuchungen zur Evolution von Ausbreitungsverhalten berücksichtigen aber meist nur öko-evolutionäre Kräfte die auf der Populations- und Landschaftsebene entstehen, wie etwa intra-spezifische Konkurrenz oder Allee Effekte beziehungsweise Konnektivität, Habitatgröße und Fragmentierungsgrad. Es ist jedoch einleuchtend, dass ökologische und evolutionäre Kräfte auf allen Ebenen biologischer Komplexität, von Genen und Individuen über Populationen und Artengemeinschaften bis hin zu Landschaften, entstehen können. In dieser Arbeit möchte ich die Bedeutung von öko-evolutionären Kräften, die speziell auf der individuellen und genetischen Ebene begründet sind, näher beleuchten. Ich verbinde einen individuen-basierten Modellierungsansatz mit empirischer Feldforschung, um den Einfluss von differentieller Energieallokation (“life-history trade-offs'”) und Informationsnutzung für Ausbreitungsentscheidungen während der drei Ausbreitungsphasen - Emigration, Transition und Immigration - zu untersuchen. Zusätzlich berücksichtige ich genetische Mechanismen und Rahmenbedigungen wie Ploidie, sexuelle Reproduktion (Rekombination) und Dominanz. Differentielle Allokation von Energie für Ausbreitungsverhalten und Reproduktion kann evolutionär stabile Ausbreitungsstrategien entscheidend beeinflussen und zur stabilen Koexistenz zweier oder mehrerer Strategien führen, also Polymorphismen und Polyphenismen bedingen. Dies gilt sowohl für Ausbreitungsdistanzen (Kapitel 3) als auch für Ausbreitungsraten (Kapitel 4). In sessilen Organismen, wie beispielsweise Bäumen oder Korallen, kann mütterliche Investition in die Ausbreitungsfähigkeit von Propagulen zu Bimodalität und zu einer Häufung von besonders langen Ausbreitungsdistanzen (“fat tail”) in der evolutionär stabilen Häufigkeitsverteilung der Ausbreitungsdistanzen (“dispersal kernel”) führen. Die stabile Koexistenz zweier oder mehrerer Ausbreitungsstrategien kann jedoch sehr stark von genetischen Faktoren, wie Ploidie oder Dominanz, abhängen. Arten, die sich aufgrund zu geringer Mobilität nicht selbst aktiv ausbreiten können, werden solch bimodale Häufigkeitsverteilungen von Ausbreitungsdistanzen, z.B. durch eine gezielte Mischstrategie mit zwei Vektoren, realisieren. Eine aktive Auswahl der entsprechenden Vektoren ermöglicht es, die resultierende Verteilung der Ausbreitungsdistanzen zu optimieren. Da die meisten Tiere über eine Form von Gedächtnis und sensorischem Apparat verfügen - um chemische, akustische oder optische Reize aufzunehmen und zu verarbeiten - ist es naheliegend, dass diese Fähigkeiten auch für Ausbreitungsentscheidungen genutzt werden. In Kapitel 5 untersuche ich die Nutzung chemischer Signale für die Auswahl von Ausbreitungsvektoren bei Tieren mit passiver Ausbreitung. Ich zeige, dass die neotropischen, phoretischen Blütenmilben der Art Spadiseius calyptrogynae gezielt zwei Ausbreitungsvektoren nutzen - einen Vektor, der v.a. kurze Strecken, und einen, der besonders lange Strecken zurücklegt - und damit, wie oben beschrieben, eine Häufung von groß en Werten in der Häufigkeitsverteilung der Ausbreitungdistanzen (“fat-tailed dispersal kernel”) erzielen. Solche Strategien sind optimal an die Ausbreitung in fragmentierten Habitaten angepasst. Zusätzlich erhöhen diese Blütenmilben durch ihre Vektorwahl die Wahrscheinlichkeit, sich erfolgreich auszubreiten, da einer der beiden Vektoren bevorzugt die Futterpflanze der Milben, also geeignetes Habitat, anfliegt. Diese empirische Studie wird durch eine individuen-basierte Simulation des Systems vervollständigt, deren Ergebnisse die empirischen Befunde erklären und deren Interpretation bestätigen. Die Nutzung von Gedächtnis und sensorischen Kapazitäten steht auch in Kapitel 6 im Vordergrund. In diesem Teil meiner Arbeit entwickle ich ein individuen-basiertes Modell für Bewegungs- und Suchstrategien, das, im Gegensatz zu den meisten Modellen in diesem Bereich, nicht auf Diffusionsprozessen (“random walks”) sondern auf der Nutzung von mentalen und sensorischen Kapazitäten basiert. Ziel ist es, ein mechanistisches Bewegungsmodell im Sinne von Nathan und Kollegen (2008a) zu schaffen und dadurch Ausbreitungs- und Bewegungsökologie zu vereinen. Ich postuliere, dass vier Elemente für die Emergenz von effizienten Bewegungs- und Suchstrategien von zentraler Bedeutung sind: Wahrnehmung, Erinnerung, Inferenz und Antizipation. Suchstrategien, die diese vier Elemente berücksichtigen, sind im Vergleich zu analogen Modellen, die auf Diffusionsprozessen basieren, besonders effizient, da sie ihre Sucheffizienz auf zwei Skalen, nämlich innerhalb und außerhalb von Ressourcenansammlungen, optimieren. Diese vier Kapitel werden durch eine allgemeine Analyse von Metapopulationsdynamiken in Kapitel 2 ergänzt. Hier zeige ich, dass, obwohl sich das Metapopulationskonzept in der theoretischen Ökologie großer Beliebtheit erfreut, klassische Metapopulationsdynamiken in natürlichen Systemen selten zu erwarten sind. Damit bestätigen sich Hinweise empirischer Studien, die seit Längerem berichten, dass klassische Metapopulationen wenig häufig aufzutreten scheinen. Klassische Metapopulationsdynamiken entstehen auch in Modellen besonders selten, wenn diese evolutionäre Faktoren, die auf der Genebene begründet sind, wie Ploidie und Rekombination, berücksichtigen. In der vorliegenden Arbeit analysiere ich die Effekte von ökologischen und evolutionären Kräften, die auf der Gen- und Individuenebene entstehen und evolutionär stabile Ausbreitungs- und Suchstrategien bestimmen. Ich hebe die zentrale Bedeutung dieser Rahmenbedigungen, Mechanismen und Prozesse hervor und zeige, wie sie die Evolution von Ausbreitungsstrategien in räumlich strukturierten Populationen maßgeblich beeinflussen. Aus meiner Arbeit wird unmittelbar ersichtlich, dass die Berücksichtigung öko-evolutionärer Kräfte auf allen Ebenen, von Genen bis hin zu Artengemeinschaften und Landschaften, von zentraler Bedeutung ist, wenn wir Ausbreitungsstrategien von Tieren und Pflanzen verstehen wollen. Dieses Ziel ist über den rein akademischen Bereich hinaus, z.B. auch für den Naturschutz, von großer Relevanz, denn besonders heutzutage, in Anbetracht schneller, anthropogener Veränderungen von Landschaftsstrukturen und des globalen Klimawandels ist die Fähigkeit zur Ausbreitung essentiell. KW - Metapopulation KW - Verbreitungsökologie KW - Ressourcenallokation KW - metapopulation KW - dispersal KW - trade-offs KW - information use KW - Differentielle Ressourcenallokation KW - Ausbreitungsverhalten KW - Informationsnutzung Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85816 ER - TY - THES A1 - Schampel, Andrea T1 - Beneficial therapeutic effects of the L-type calcium channel antagonist nimodipine in experimental autoimmune encephalomyelitis – an animal model for multiple sclerosis T1 - Günstige therapeutische Effekte des L-Typ-Calciumkanal-Antagonisten Nimodipin in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis ̶ einem Tiermodell der Multiplen Sklerose N2 - Multiple sclerosis (MS) is the most prevalent neurological disease of the central nervous system (CNS) in young adults and is characterized by inflammation, demyelination and axonal pathology that result in multiple neurological and cognitive deficits. The focus of MS research remains on modulating the immune response, but common therapeutic strategies are only effective in slowing down disease progression and attenuating the symptoms; they cannot cure the disease. Developing an option to prevent neurodegeneration early on would be a valuable addition to the current standard of care for MS. Based on our results we suggest that application of nimodipine could be an effective way to target both neuroinflammation and neurodegeneration. We performed detailed analyses of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS, and in in vitro experiments regarding the effect of the clinically well-established L-type calcium channel antagonist nimodipine. Nimodipine treatment attenuated the course of EAE and spinal cord histopathology. Furthermore, it promoted remyelination. The latter could be due to the protective effect on oligodendrocytes and oligodendrocyte precursor cells (OPCs) we observed in response to nimodipine treatment. To our surprise, we detected calcium channel-independent effects on microglia, resulting in apoptosis. These effects were cell type-specific and independent of microglia polarization. Apoptosis was accompanied by decreased levels of nitric oxide (NO) and inducible NO synthase (iNOS) in cell culture as well as decreased iNOS expression and reactive oxygen species (ROS) activity in EAE. Overall, application of nimodipine seems to generate a favorable environment for regenerative processes and could therefore be a novel treatment option for MS, combining immunomodulatory effects while promoting neuroregeneration. N2 - Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste neurologische Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) von jungen Erwachsenen und charakterisiert durch Inflammation, Demyelinisierung und axonale Pathologie. Diese Prozesse bewirken zahlreiche neurologische und kognitive Defizite. Der Schwerpunkt in der MS-Forschung besteht derzeit vor allem in der Modulation der Immunantwort, jedoch sind herkömmliche Therapiestrategien bislang nur in der Lage die Progression der Erkrankung zu verlangsamen und die Symptome zu lindern, die Krankheit kann jedoch immer noch nicht geheilt werden. Die Möglichkeit, den Prozess der Neurodegeneration früh aufzuhalten, würde eine wertvolle Ergänzung zu herkömmlichen Therapien darstellen. Basierend auf den Ergebnissen dieser Studie schlagen wir vor, dass die Applikation von Nimodipin eine elegante Möglichkeit wäre, um sowohl die Neuroinflammation als auch die -degeneration zu bekämpfen. Um den Effekt des klinisch gut etablierten Calciumkanal-Antagonisten Nimodipin zu untersuchen, haben wir detaillierte Analysen der Degeneration in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), einem Tiermodell der MS, und in in vitro Untersuchungen durchgeführt. Applikation von Nimodipin verringerte das klinische Erscheinungsbild der EAE sowie die Histopathologie des Rückenmarkes. Außerdem förderte es die Regeneration. Die Ursache für letzteres liegt vermutlich am protektiven Effekt der Behandlung mit Nimodipin auf die Oligodendrozyten und deren Vorläuferzellen. Überraschenderweise, konnten wir Calciumkanal-unspezifische Effekte auf Mikroglia feststellen, die in Apoptose resultierten und sowohl Zelltyp-spezifisch als auch unabhängig von der Polarisierung der Mikrogliazellen waren. Apoptose wurde begleitet von reduzierten Spiegeln an Stickstoffmonoxid (NO) und der induzierbaren NO Synthase (iNOS) in Zellkultur, sowie einer reduzierten Expression von iNOS und dem geringeren Vorkommen von reaktiven oxygenen Spezies (ROS) in der EAE. Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass die Applikation von Nimodipin eine günstige Umgebung für regenerative Prozesse schafft. Daher stellt die Applikation dieser Substanz eine neue Behandlungsmöglichkeit für die MS dar, insbesondere da sie Möglichkeiten der Immunmodulation mit der Förderung von Neuroregeneration verbindet. KW - Nimodipin KW - Multiple Sklerose KW - l-type calcium channel antagonist KW - experimental autoimmune encephalomyelitis KW - L-typ Calciumkanal Antagonist KW - experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis KW - neuroprotection KW - multiple sclerosis Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148952 ER - TY - THES A1 - Aboagye, Benjamin T1 - Behavioral and physiologic consequences of inducible inactivation of the \(Tryptophan\) \(hydroxylase\) 2 gene in interaction with early-life adversity T1 - Verhaltens- und physiologische Konsequenzen einer induzierbaren Inaktivierung des \(Tryptophan\) \(hydroxylase\) 2-Gens Interaktion mit frühkindlichen Stresses N2 - Disruptions in brain serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT) signaling pathways have been associated with etiology and pathogenesis of various neuropsychiatric disorders, but specific neural mechanisms of 5-HT function are yet to be fully elucidated. Tryptophan hydroxylase 2 (TPH2) is the rate-limiting enzyme for brain 5-HT synthesis. Therefore, in this study a tamoxifen (Tam)-inducible cre-mediated conditional gene (Tph2) knockout in adult mouse brain (Tph2icKO) has been established to decipher the specific role of brain 5-HT in the regulation of behavior in adulthood. Immunohistochemistry and high-performance liquid chromatography (HPLC) were used first to test the efficacy of Tam-inducible inactivation of Tph2 and consequential reduction of 5-HT in adult mouse brain. Tam treatment resulted in ≥90% reduction in the number of 5-HT immuno-reactive cells in the anterior raphe nuclei. HPLC revealed a significant reduction in concentration of 5-HT and its metabolite 5-hydroxyindole acetic acid (5-HIAA) in selected brain regions of Tph2icKO, indicating the effectiveness of the protocol used. Second, standard behavioral tests were used to assess whether reduced brain 5-HT concentrations could alter anxiety-, fear- and depressive-like behavior in mice. No altered anxiety- and depressive-like behaviors were observed in Tph2icKO compared to control mice (Tph2CON) in all indices measured, but Tph2icKO mice exhibited intense and sustained freezing during context-dependent fear memory retrieval. Tph2icKO mice also exhibited locomotor hyperactivity in the aversive environments, such as the open field, and consumed more food and fluid than Tph2CON mice. Lastly, the combined effect of maternal separation (MS) stress and adult brain 5-HT depletion on behavior was assessed in male and female mice. Here, MS stress, 5-HT depletion and their interaction elicited anxiety-like behavior in a sex-dependent manner. MS reduced exploratory behavior in both male and female mice. Reduced 5-HT enhanced anxiety in female, but not in male mice. Furthermore, expression of genes related to the 5-HT system and emotionality (Tph2, Htr1a, Htr2a, Maoa and Avpr1a) was assessed by performing a quantitative real-time PCR. In Tph2icKO mice there was a reduction in expression of Tph2 in the raphe nuclei of both male and female mice. Interaction between MS stress and 5-HT deficiency was detected showing increased Htr2a and Maoa expression in raphe and hippocampus respectively of female mice. In male mice, MS stress and 5-HT depletion interaction effects reduced Avpr1a expression in raphe, while the expression of Htr1a, Htr2a and Maoa was differentially altered by 5-HT depletion and MS in various brain regions. N2 - Unterbrechungen der Serotonin-Stoffwechselwege (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) im Gehirn wurden mit der Ätiologie und der Pathogenese von verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert, wobei die neuronalen Mechanismen der 5-HT Funktionen noch vollständig entschlüsselt werden müssen. Die Tryptophan-Hydroxylase 2 (TPH2) ist das limitierende Enzym für die 5-HT Synthese im Gehirn, weshalb der durch Tamoxifen (Tam) induzierbare, cre-vermittelte Tph2 Gen-Knockout (Tph2icKO) im adulten Mausgehirn möglicherweise helfen könnte die spezifische Rolle von 5-HT im Gehirn in der Regulation von adultem Verhalten zu entschlüsseln. Zuerst wurden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Immunhistochemische Analysen durchgeführt um die Effizienz der Tam induzierten Inaktivierung des Tph2 und die daraus folgende Reduktion von 5-HT im Gehirn zu überprüfen. Die Behandlung mit Tam resultierte in einer ≥86% Reduktion der Anzahl von 5-HT immunoreaktiven Zellen in der anterioren Raphe im Gehirn. Die HPLC zeigte eine signifikante Reduktion der 5-HT Konzentration und dessen Stoffwechselprodukts 5-Hydroxyindolylessigsäure (5-HIAA) in ausgewählten Gehirn regionen von Tph2icKO, was auf die Effektivität des benutzten Protokolls hindeutet. Danach wurden standarisierte Verhaltens tests durchgeführt um festzustellen, ob eine reduzierte 5-HT Konzentrationen im Gehirn zu einer Veränderung in der Angstreaktion, Depression und im Furchtverhalten der Mäuse führt. Bei allen Tests konnte sowohl in den Tph2icKO-Mäusen als auch in den Kontrolltieren kein offensichtliches angstbezogenes und depressionsähnliches Verhalten festgestellt werden, wobei die Tph2icKO-Mäuse intensive und anhaltende Furcht im Kontext „dependent fear retrieval“ zeigten. Tph2icKO-Mäuse zeigten zudem lokomotorische Hyperaktivität und konsumierten mehr Futter und Flüssigkeit als die Kontrolltiere. Zuletzt wurde der kombinierte Effekt von Stress durch mütterliche Trennung (MS) und adulter 5-HT Reduktion im Gehirn auf das Verhalten von männlichen und weiblichen Mäusen untersucht. Wieder rief nicht der depressionsähnliche Phänotyp, sondernder Stress durch die mütterliche Trennung (MS) und 5-HT Verarmung und deren Interaktion ein angstähnliches Verhalten in Abhängigkeit vom Geschlecht hervor. Reduziertes 5-HT vergrößerte die Angst in weiblichen, aber nicht in männlichen Mäusen. Stress durch mütterliche Trennung (MS) reduzierte das explorative Verhalten sowohl in Männchen als auch in Weibchen. Die Expression von Genen, welche im Bezug zum 5-HT System stehen (Tph2, Htr1a, Htr2a, Maoa und Avpr1a) wurden mit Hilfe von quantitativer Real-Time PCR untersucht. Die Tam Behandlung reduzierte dasTph2 Level in der Raphe bei beiden Geschlechtern signifikant. In weiblichen Mäusen steigertedie Interaktion zwischen Stress durch mütterliche Trennung (MS) und 5-HT Verarmung das Htr2a und Maoa Expressions level in der Raphe und im Hippokampus. In männlichen Mäusen reduzierte die Interaktion von Stress durch mütterliche Trennung (MS) und 5-HT Reduktion die Avpr1a Expression in der Raphe. Die Expression von Htr1a, Htr2a und Maoa wurde in verschiedenen Gehirn regionen unterschiedlich von Tam und Mütterliche Trennung MS verändert. In der Amygdala wurde nur ein MS Effekt auf die Tph2 Expression in den Mäusen sichtbar. KW - Anxiety KW - Angst KW - Depression KW - Serotonin KW - Tamoxifen KW - Tryptophan hydroxylase Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173581 ER - TY - THES A1 - Lüffe, Teresa Magdalena T1 - Behavioral and pharmacological validation of genetic zebrafish models for ADHD T1 - Pharmakologische und verhaltensbasierte Validierung genetischer Zebrafischmodelle für ADHS N2 - Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) is the most prevalent neurodevelopmental disorder described in psychiatry today. ADHD arises during early childhood and is characterized by an age-inappropriate level of inattention, hyperactivity, impulsivity, and partially emotional dysregulation. Besides, substantial psychiatric comorbidity further broadens the symptomatic spectrum. Despite advances in ADHD research by genetic- and imaging studies, the etiopathogenesis of ADHD remains largely unclear. Twin studies suggest a heritability of 70-80 % that, based on genome-wide investigations, is assumed to be polygenic and a mixed composite of small and large, common and rare genetic variants. In recent years the number of genetic risk candidates is continuously increased. However, for most, a biological link to neuropathology and symptomatology of the patient is still missing. Uncovering this link is vital for a better understanding of the disorder, the identification of new treatment targets, and therefore the development of a more targeted and possibly personalized therapy. The present thesis addresses the issue for the ADHD risk candidates GRM8, FOXP2, and GAD1. By establishing loss of function zebrafish models, using CRISPR/Cas9 derived mutagenesis and antisense oligonucleotides, and studying them for morphological, functional, and behavioral alterations, it provides novel insights into the candidate's contribution to neuropathology and ADHD associated phenotypes. Using locomotor activity as behavioral read-out, the present work identified a genetic and functional implication of Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b in ADHD associated hyperactivity. Further, it provides substantial evidence that the function of Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b in activity regulation involves GABAergic signaling. Preliminary indications suggest that the three candidates interfere with GABAergic signaling in the ventral forebrain/striatum. However, according to present and previous data, via different biological mechanisms such as GABA synthesis, transmitter release regulation, synapse formation and/or transcriptional regulation of synaptic components. Intriguingly, this work further demonstrates that the activity regulating circuit, affected upon Foxp2 and Gad1b loss of function, is involved in the therapeutic effect mechanism of methylphenidate. Altogether, the present thesis identified altered GABAergic signaling in activity regulating circuits in, presumably, the ventral forebrain as neuropathological underpinning of ADHD associated hyperactivity. Further, it demonstrates altered GABAergic signaling as mechanistic link between the genetic disruption of Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b and ADHD symptomatology like hyperactivity. Thus, this thesis highlights GABAergic signaling in activity regulating circuits and, in this context, Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b as exciting targets for future investigations on ADHD etiopathogenesis and the development of novel therapeutic interventions for ADHD related hyperactivity. Additionally, thigmotaxis measurements suggest Grm8a, Grm8b, and Gad1b as interesting candidates for prospective studies on comorbid anxiety in ADHD. Furthermore, expression analysis in foxp2 mutants demonstrates Foxp2 as regulator of ADHD associated gene sets and neurodevelopmental disorder (NDD) overarching genetic and functional networks with possible implications for ADHD polygenicity and comorbidity. Finally, with the characterization of gene expression patterns and the generation and validation of genetic zebrafish models for Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b, the present thesis laid the groundwork for future research efforts, for instance, the identification of the functional circuit(s) and biological mechanism(s) by which Grm8a, Grm8b, Foxp2, and Gad1b loss of function interfere with GABAergic signaling and ultimately induce hyperactivity. N2 - Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) ist mit einer weltweiten Prävalenz von rund 5 % die am häufigsten vorkommende Neuroentwicklungsstörung. Das Krankheitsbild, das zumeist im Kindesalter auftritt und bis ins Erwachsenenalter bestehen kann, zeigt sich im Wesentlichen durch eine Beeinträchtigung der Aufmerksamkeit, der Aktivität, der Impuls-kontrolle und zum Teil durch emotionale Dysregulation. Darüber hinaus führt das vermehrte Auftreten von psychischen Begleiterkrankungen (so genannte Komorbiditäten) zu einer komplexen Symptomatik vieler Betroffener, die über die klassischen Merkmale von ADHS hinausgeht. Während das Krankheitsbild vielfach beschrieben wurde, ist die Ätiopathogenese trotz intensiver wissenschaftlicher Bemühungen bis heute weitestgehend ungeklärt. Zwillingsstudien weisen darauf hin, dass ADHS zu 70-80 % erblich bedingt ist. Aufgrund mehrerer Genom-Studien wird vermutet, dass es sich dabei um eine polygene Vererbbarkeit handelt und sowohl kleine (SNPs), verhältnismäßig häufig auftretende, als auch große (CNVs) verhältnismäßig seltene Genpolymorphismen beteiligt sind. Die Anzahl der potenziellen Risikogene für ADHS ist in den letzten Jahren kontinuierlich gestiegen, jedoch ist es nach wie vor unklar, inwiefern und durch welche biologischen Prozesse die meisten zur Neuropathologie und Symptomatik von ADHS Patienten beitragen. Diese Prozesse zu identifizieren ist von zentraler Bedeutung für ein besseres Verständnis der Erkrankung, der Identifizierung neuer Angriffsziele und somit, der Entwicklung gezielterer und möglicherweise personalisierter Behandlungsmöglichkeiten. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit diesen Prozessen am Beispiel der potenziellen Risikogene GRM8, FOXP2 und GAD1. Durch die Etablierung und Validierung entsprechender (geneti-scher) Knockout und Knockdown Zebrafischmodelle und der anschließenden Untersuchung auf Verhaltens-, morphologische und funktionelle Veränderungen liefert die vorliegende Dissertation wichtige Erkenntnisse über die funktionelle Relevanz der einzelnen Kandidaten für die Neuropathologie und die Symptomatik von ADHS. Beispielsweise zeigen die erfassten Aktivitätsdaten von Knockdown und Knockout Larven, dass Grm8a, Grm8b, Foxp2 und Gad1b an der Regulation von Bewegungsaktivität beteiligt sind und dass dies, die korrekte Funktion GABAerger Prozesse bedarf. Des Weiteren liefert die Arbeit Hinweise, dass der Effekt im Subpallium/Striatum verankert ist. Jedoch ist aufgrund vorliegender und bereits publizierter Daten anzunehmen, dass im Falle der einzelnen Kandidaten, zum Teil unterschiedliche Me-chanismen wie die Transmittersynthese, die Transmitterfreisetzung, die Synapsenbildung und die Expression synaptischer Komponenten betroffen sind. Interessanterweise scheinen die durch die Kandidaten betroffenen Signalwege außerdem, laut erhobener Daten, am Wirkmechanismus von Methylphenidat beteiligt zu sein. Kurzum, die vorliegende Dissertation identifiziert die Beeinträchtigung GABAerger Signalübertragung eines, mutmaßlich subpallialen/striatalen aktivitäts-regulierenden neuronalen Netzwerks als neurobiologische Grundlage ADHS-assoziierter Hyperaktivität. Gleichzeitig präsentiert die Arbeit diese Prozesse als funktionelles Bindeglied zwischen der genetischen Veränderung von GRM8, FOXP2 und GAD1 und Hyperaktivität in ADHS. Folglich sind die entwicklungs- und neurobiologischen Mechanismen rund um die GABAerge Übertragung in diesem Netzwerk, und in diesem Zusammenhang die Funktion von Grm8a, (Grm8b), Foxp2 und Gad1b, spannende Ziele für zukünftige Projekte zur Erforschung der Ätiopathogenese und der Entwicklung neuer Therapien von Hyperakti-vität in ADHS. Neben der Rolle in ADHS-assoziierter Hyperaktivität, präsentieren die erhobenen Verhaltensdaten Grm8a, Grm8b und Gad1b außerdem, als interessante Kandidaten für die Erforschung komorbider Angststörung in ADHS. Foxp2 dagegen, wurde mit Hilfe einer Genexpressionsanalyse als Regulator zahlreicher ADHS Risikogene und Entwicklungsstörungs-übergreifenden genetischen und funktionellen Netzwerken, mit möglicher Relevanz für die Polygenie und Komorbidität von ADHS, identifiziert. Im Allgemeinen schafft die vorliegende Dissertation mit der Bestimmung der Genexpressionsmuster und Etablierung und Validierung der (genetischen) Zebrafischmodelle für Grm8a, Grm8b, Foxp2 und Gad1b die Grundlage, diese und weitere Aspekte in zukünftigen Forschungsprojekten zu untersuchen. Beispielsweise die Identifizierung der Netzwerke und Mechanismen, mit dessen Hilfe Grm8a, (Grm8b), Foxp2 und Gad1b in die GABAerge Signalübertragung eingreifen und so letztlich die Aktivität beeinflussen. KW - ADHD KW - Zebrafish KW - FOXP2 KW - GRM8 KW - GAD1 KW - Genetic etiology KW - Animal model KW - Thigmotaxis KW - Locomotor activity KW - Hyperactivity Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-257168 ER - TY - THES A1 - Rösler, Lara T1 - Behavioral and Neural Mechanisms of Social Attention T1 - Behaviorale und Neuronale Mechanismen der Sozialen Aufmerksamkeit N2 - Humans in our environment are of special importance to us. Even if our minds are fixated on tasks unrelated to their presence, our attention will likely be drawn towards other people’s appearances and their actions. While we might remain unaware of this attentional bias at times, various studies have demonstrated the preferred visual scanning of other humans by recording eye movements in laboratory settings. The present thesis aims to investigate the circumstances under and the mechanisms by which this so-called social attention operates. The first study demonstrates that social features in complex naturalistic scenes are prioritized in an automatic fashion. After 200 milliseconds of stimulus presentation, which is too brief for top-down processing to intervene, participants targeted image areas depicting humans significantly more often than would be expected from a chance distribution of saccades. Additionally, saccades towards these areas occurred earlier in time than saccades towards non-social image regions. In the second study, we show that human features receive most fixations even when bottom-up information is restricted; that is, even when only the fixated region was visible and the remaining parts of the image masked, participants still fixated on social image regions longer than on regions without social cues. The third study compares the influence of real and artificial faces on gaze patterns during the observation of dynamic naturalistic videos. Here we find that artificial faces, belonging to humanlike statues or machines, significantly predicted gaze allocation but to a lesser extent than real faces. In the fourth study, we employed functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of reflexive social attention. Analyses of the evoked blood-oxygenation level dependent responses pointed to an involvement of striate and extrastriate visual cortices in the encoding of social feature space. Collectively, these studies help to elucidate under which circumstances social features are prioritized in a laboratory setting and how this prioritization might be achieved on a neuronal level. The final experimental chapter addresses the question whether these laboratory findings can be generalized to the real world. In this study, participants were introduced to a waiting room scenario in which they interacted with a confederate. Eye movement analyses revealed that gaze behavior heavily depended on the social context and were influenced by whether an interaction is currently desired. We further did not find any evidence for altered gaze behavior in socially anxious participants. Alleged gaze avoidance or hypervigilance in social anxiety might thus represent a laboratory phenomenon that occurs only under very specific real-life conditions. Altogether the experiments described in the present thesis thus refine our understanding of social attention and simultaneously challenge the inferences we can draw from laboratory research. N2 - Menschen in unserer Umgebung sind von besonderer Bedeutung für uns. Selbst wenn wir uns gänzlich auf eine Aufgabe konzentrieren, wird unsere Aufmerksamkeit voraussichtlich immer wieder auf Menschen in unserer Nähe und ihre Handlungen gelenkt. Auch wenn wir uns dieser bevorzugten Betrachtung anderer nicht jederzeit bewusst sind, haben diverse Labortstudien anhand von Augenbewegungen diese Präferenz für andere Menschen aufgezeigt. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden die Mechanismen dieser sozialen Aufmerksamkeit und die Bedingungen, unter denen sie auftritt, untersucht. So zeigt die erste Studie, dass die bevorzugte Betrachtung anderer Menschen in komplexen Szenen ein reflexiver Prozess ist. Nach einer Darbietungszeit von 200 Millisekunden, welche zu kurz für das Auftreten von zielgerichteten Prozessen ist, landen Sakkaden signifikant häufiger auf Bildregionen, die einen Menschen abbilden, als man basierend auf einer Zufallsverteilung der Sakkaden erwarten würde. Zusätzlich treten diese Sakkaden zeitlich früher auf als Sakkaden, die auf nicht-sozialen Bildelementen landen. In der zweiten Studie wird anhand eines blickkongruenten Paradigmas deutlich, dass Menschen auch dann am meisten betrachtet werden, wenn nur der aktuell fixierte Teil des Bildes sichtbar ist. Dies bedeutet, dass die Präferenz sozialer Information auch dann erfolgt, wenn Blickbewegung intentional gesteuert werden. In der dritten Studie wird geprüft, inwiefern sich soziale Aufmerksamkeit bei verschiedenen Gesichtstypen unterscheidet. Künstliche Gesichter, die zu menschenähnlichen Gestalten oder Maschinen gehören, haben zwar einen signifikanten Einfluss auf das Blickverhalten der Betrachter – dieser ist jedoch deutlich geringer als der Einfluss von Gesichtern, die zu echten Menschen in den gezeigten Videos gehören. In der vierten Studie werden die neuronalen Korrelate des reflexiven sozialen Aufmerksamkeitsprozesses untersucht. Analysen der funktionellen Bildgebung deuten auf eine Rolle der primären und assoziativen Sehrinde in der Lokalisierung sozialer Elemente hin. Gemeinsam helfen diese Studien zu klären, unter welchen Umständen die präferierte Betrachtung sozialer Merkmale in Laborumgebungen stattfindet und wie diese Priorisierung auf neuronaler Ebene erreicht werden könnte. Das letzte experimentelle Kapitel befasst sich mit der Frage, inwiefern die berichteten Laborergebnisse auf die reale Welt übertragen werden können. In dieser Studie befanden sich die TeilnehmerInnen in einem Wartezimmer-Szenario, in welchem sie mit einem Komplizen interagierten. Die Analyse der Augenbewegungen ergab, dass das Blickverhalten stark vom sozialen Kontext abhängt und davon beeinflusst wird, ob eine Interaktion aktuell gewünscht wird. Darüber hinaus fanden wir keine Hinweise auf ein verändertes Blickverhalten bei sozial ängstlichen TeilnehmerInnen. Die in der Literatur zuvor berichtete angebliche Blickvermeidung oder Hypervigilanz bei sozialer Angst könnte somit ein Laborphänomen darstellen, das nur unter ganz bestimmten Bedingungen im realen Leben auftritt. Insgesamt ermöglichen die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Experimente somit ein vollständigeres Verständnis von sozialer Aufmerksamkeit. Gleichzeitig wird im finalen Kapitel aber auch deutlich, wie essenziell Vergleiche mit dem wirklichen Leben für die Schlussfolgerungen in der Aufmerksamkeitsforschung sind. KW - Aufmerksamkeit KW - social attention KW - Soziale Wahrnehmung KW - social anxiety KW - eye-tracking KW - fMRI Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216092 ER - TY - THES A1 - Frank, Erik Thomas T1 - Behavioral adaptations in the foraging behaviour of \(Megaponera\) \(analis\) T1 - Verhaltensanpassungen im Furagierverhalten von \(Megaponera\) \(analis\) N2 - An efficient foraging strategy is one of the most important traits for the fitness of animals. The theory of optimal foraging tries to predict foraging behaviour through the overarching question: how animals should forage so as to minimize costs while maximizing profits? Social insects, having occupied nearly every natural niche through widely different strategies, offer themselves as an ideal group to study how well optimal foraging theory can explain their behaviour and success. Specialization often leads to unique adaptations in morphology and behaviour. I therefore decided to investigate the behaviour of Megaponera analis. This ponerine ant species is specialized on hunting only termites of the subfamily Macrotermitinae at their foraging sites. Their foraging behaviour is regulated by a handful of individual scouts (10-20) that search for termite foraging sites before returning to the nest to recruit a large number of nestmates (200-500 ants). These ants then follow the scout in a column formation to the termites and after the hunt return together to the nest, these raids occur two to five times per day. Predators of highly defensive prey likely develop cost reducing adaptations. The evolutionary arms race between termites and ants led to various defensive mechanisms in termites, e.g. a caste specialized in fighting predators. As M. analis incurs high injury/mortality risks when preying on termites, some risk mitigating adaptations have evolved. I show that a unique rescue behaviour in M. analis, consisting of injured nestmates being carried back to the nest, reduces combat mortality. These injured ants “call for help” with pheromones present in their mandibular gland reservoirs. A model accounting for this rescue behaviour identifies the drivers favouring its evolution and estimates that rescuing allows for maintaining a 29% larger colony size. Heavily injured ants that lost too many legs during the fight on the other hand are not helped. Interestingly, this was regulated not by the helper but by the uncooperativeness of the injured ant. I further observed treatment of the injury by nestmates inside the nest through intense allogrooming directly at the wound. Lack of treatment increased mortality from 10% to 80% within 24 hours, with the cause of death most likely being infections. Collective decision-making is one of the main mechanisms in social insects through which foraging is regulated. However, individual decision-making can also play an important role, depending on the type of foraging behaviour. In M. analis only a handful of individuals (the scouts) hold all the valuable information about foraging sites. I therefore looked at predictions made by optimal foraging theory to better understand the interplay between collective and individual decision-making in this obligate group-raiding predator. I found a clear positive relation between raid size and termite abundance at the foraging site. Furthermore, selectivity of the food source increased with distance. The confirmation of optimal foraging theory suggests that individual scouts must be the main driver behind raid size, choice and raiding behaviour. Therefore most central place foraging behaviours in M. analis were not achieved by collective decisions but rather by individual decisions of scout ants. Thus, 1% of the colony (10–20 scouts) decided the fate and foraging efficiency of the remaining 99%. Division of labour is one of the main reasons for the success of social insects. Worker polymorphism, age polyethism and work division in more primitive ants, like the ponerines, remain mostly unexplored though. Since M. analis specializes on a defensive prey, adaptations to reduce their foraging costs can be expected. I found that the work division, task allocation and column-formation during the hunt were much more sophisticated than was previously thought. The column-formation was remarkably stable, with the same ants resuming similar positions in subsequent raids and front ants even returning to their positions if displaced in the same raid. Most of the raid tasks were not executed by predetermined members of the raid but were filled out as need arose during the hunt, with a clear preference for larger ants to conduct most tasks. I show that specialization towards a highly defensive prey can lead to very unique adaptations in the foraging behaviour of a species. I explored experimentally the adaptive value of rescue behaviour focused on injured nestmates in social insects. This was not only limited to selective rescuing of lightly injured individuals by carrying them back (thus reducing predation risk) but moreover includes a differentiated treatment inside the nest. These observations will help to improve our understanding of the evolution of rescue behaviour in animals. I further show that most optimal foraging predictions are fulfilled and regulated by a handful of individuals in M. analis. Lastly, I propose that the continuous allometric size polymorphism in M. analis allows for greater flexibility in task allocation, necessary due to the unpredictability of task requirements in an irregular system such as hunting termites in groups. All of my observations help to further understand how a group-hunting predator should forage so as to minimize costs while maximizing profits. N2 - Ein effizientes Furagierverhalten ist eine der wesentlichsten Voraussetzungen für die Überlebensfähigkeit von Tieren. Die Theorie des „Optimal Foraging“ versucht, das Furagierverhalten durch die übergreifende Frage zu verstehen: Wie sollten Tiere nach Futter suchen/jagen, um die Kosten zu minimieren und gleichzeitig die Gewinne zu maximieren? Soziale Insekten, die fast jede natürliche Nische durch diverse Strategien besetzt haben, bieten sich als ideale Gruppe an, um zu untersuchen, wie gut „Optimal Foraging“ ihr Verhalten und ihren Erfolg erklären kann. Da Spezialisierung oft zu einzigartigen Anpassungen in Morphologie und Verhalten führt, war das Jagdverhalten von Megaponera analis diesbezüglich sehr vielversprechend. Diese Ponerinae Ameisenart ist spezialisiert auf die Jagd von Termiten der Unterfamilie Macrotermitinae an ihren Futterstellen. Ihr Jagdverhalten wird durch eine Handvoll von einzelner Späher (10-20) geregelt, die nach Termiten-Futterstellen suchen, bevor sie zum Nest zurückkehren, um eine große Anzahl von Nestgenossinnen (200-500 Ameisen) zu rekrutieren. Die Ameisen folgen dann dem Späher in einer Kolonne zu den Termiten und zurück, diese Überfälle finden zwei bis fünf Mal am Tag statt. Es ist wahrscheinlich, dass Prädatoren von defensiver Beute kostenreduzierende Anpassungen entwickeln. Das evolutionäre Wettrüsten zwischen Termiten und Ameisen führte zu verschiedenen Abwehrmechanismen bei Termiten, z.B. eine Soldaten-Kaste, die sich auf die Bekämpfung von Raubtieren spezialisiert hat. Da M. analis ein hohes Verletzungsrisiko durch Termitensoldaten hat, haben sich bei ihr einige kostenreduzierende Anpassungen entwickelt. Ich zeige, dass ein einzigartiges Rettungsverhalten bei M. analis, bestehend aus verletzten Nestgenossinnen, die zum Nest zurückgetragen werden, die Mortalität reduziert. Diese verletzten Ameisen „rufen“ um Hilfe mit Pheromonen, die in ihren mandibularen Drüsenreservoirs vorhanden sind. Ein Modell, das dieses Rettungsverhalten berücksichtigt, hilft dabei die wichtigsten Faktoren zu identifizieren, welche die Evolution dieses Rettungsverhaltens begünstigen. Ferner wird schwerverletzten Ameisen, die während des Kampfes zu viele Beine verloren haben, nicht geholfen. Interessanterweise wird dies nicht durch den Helfer reguliert, sondern durch die mangelnde Kooperation der verletzten Ameise. Des Weiteren beobachtete ich die Behandlung der Verletzten durch Nestgenossinnen im Nest durch intensives „Allogrooming“/lecken direkt an der Wunde. Eine Unterbindung der Behandlung erhöhte die Mortalität von 10% auf 80% innerhalb von 24 Stunden, höchstwahrscheinlich aufgrund von Infektionen. Die kollektive Entscheidungsfindung ist einer der Hauptmechanismen bei sozialen Insekten, durch die die Futtersuche reguliert wird. Allerdings spielt die individuelle Entscheidungsfindung, je nach Art des Furagierverhaltens, auch eine wichtige Rolle. In M. analis haben nur eine Handvoll von Individuen (die Späher) alle Informationen über die Futterstellen. Ich betrachtete daher die Vorhersagen, die durch „Optimal Foraging“ gemacht werden, um das Zusammenspiel von kollektiver und individueller Entscheidungsfindung bei diesem obligaten Gruppenjäger besser zu verstehen. Ich fand eine klare positive Beziehung zwischen Raubzugsgröße und Termitenabundanz an der Futterstelle. Außerdem erhöhte sich die Selektivität der Futterstelle mit der Entfernung zum Nest. Die Bestätigung der „Optimalen Foraging“ Theorie deutet darauf hin, dass einzelne Späher der Haupttreiber hinter Raubzugsgröße, Wahl und Raubzugsverhalten sein müssen. Dies bedeutet, dass in M. analis das Furagierverhalten nicht durch kollektive Entscheidungen, sondern durch individuelle Entscheidungen der Späher reguliert wird. So entschied 1% der Kolonie (10-20 Späher) das Schicksal und die Furagier-Effizienz der restlichen 99%. Die Arbeitsteilung ist einer der Hauptgründe des Erfolgs sozialer Insekten. Arbeiterpolymorphismus, Alterspolyethismus und Arbeitsteilung bei primitiveren Ameisen, wie den Ponerinen, blieben bisher jedoch meist unerforscht. Da M. analis sich auf eine defensive Beute spezialisiert hat, sind Anpassungen zur Reduzierung ihrer Furagierkosten zu erwarten. Ich zeige, dass die Arbeitsteilung und Kolonnenformation während der Jagd viel anspruchsvoller ist, als bisher angenommen. Die Kolonnenformation war bemerkenswert stabil: dieselben Ameisen nahmen ähnliche Positionen in späteren Raubzügen ein und die vorderen Ameisen kehrten sogar zu ihrer Position zurück, wenn diese absichtlich verändert wurde. Dies weist auf unbekannte Regulationsmechanismen für die Bildung der Kolonne hin. Darüber hinaus wurden die meisten der Raubzugsaufgaben nicht von vorgegebenen Mitgliedern des Raubzugs ausgeführt, sondern wurden je nach Bedarf während der Jagd verteilt. Meine Versuche zeigen, dass die Spezialisierung auf eine hoch defensive Beute zu sehr einzigartigen Anpassungen im Furagierverhalten einer Art führen kann. Ich erforschte experimentell den adaptiven Wert eines Rettungsverhaltens, das auf verletzte Nestgenossinnen bei sozialen Insekten fokussiert war. Dies beschränkte sich nicht nur auf die selektive Rettung von leicht verletzten Individuen, welche zurückgetragen wurden (wodurch das Prädationsrisiko reduziert wurde), sondern umfasst darüber hinaus eine differenzierte Behandlung im Nest. Ich zeige weiter, dass die meisten „Optimal Foraging“ Vorhersagen von einer Handvoll Individuen in M. analis erfüllt und reguliert werden. Schließlich postuliere ich die Hypothese, dass der kontinuierliche allometrische Größenpolymorphismus in M. analis eine größere Flexibilität bei der Aufgabenverteilung ermöglicht, die aufgrund der Unberechenbarkeit der Aufgabenanforderungen in einem unregelmäßigen System wie dem Jagen von Termiten in Gruppen Erforderlich ist. Alle meine Beobachtungen verbessern unser Verständnis des Verhaltens eines Gruppenjägers, das während der Jagd die Kosten zu minimieren und die Gewinne zu maximieren hat. KW - Stechameisen KW - Nahrungserwerb KW - Verhalten KW - Optimal foraging KW - Rescue behaviour KW - Myrmecology KW - Behaviour KW - Ecology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156544 ER - TY - THES A1 - Seitz, Nicola T1 - Bee demise and bee rise: From honey bee colony losses to finding measures for advancing entire bee communities T1 - Bienenschwund und Bienenaufschwung: Von Honigbienen-Kolonieverlusten zur Förderung von gesamten Bienengemeinschaften N2 - My dissertation comprises three studies: (1) an assessment of honey bee colony losses in the USA between 2014 and 2015, (2) an exploration of the potential of reclaimed sand mines as bee habitat, and (3) an evaluation of native and non-native pollinator friendly plants in regard to their attraction to bees. While the first study focuses on honey bees, the latter two studies primarily take wild bees or entire bee communities in focus. The study on honey bee colony losses was conducted within the framework of the Bee Informed Partnership (BIP, beeinformed.org) and aligns with the annual colony loss surveys which have been conducted in the USA since the winter of 2006/2007. It was the fourth year for which summer and annual losses were calculated in addition to winter losses. Among participants, backyard beekeepers were the largest group (n = 5690), although sideline (n = 169) and commercial (n = 78) beekeepers managed the majority (91.7 %) of the 414 267 surveyed colonies. Overall, 15.1 % of the estimated 2.74 million managed colonies in the USA were included in the study. Total honey bee colony losses (based on the entirety of included colonies) were higher in summer (25.3 %) than in winter (22.3 %) and amounted to 40.6 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Average colony losses per beekeeper or operation were higher in winter (43.7 %) than in summer (14.7 %) and amounted to 49 % for the entire 2014/2015 beekeeping year. Due to the dominance of backyard beekeepers among participants, average losses per operation (or unweighted loss) stronger reflected this smaller type of beekeeper. Backyard beekeepers mainly named colony management issues (e.g., starvation, weak colony in the fall) as causes for mortality, while sideline and commercial beekeepers stronger emphasized parasites or factors outside their control (e.g., varroa, nosema, queen failure). The second study took place at reclaimed sand mines. Sand mines represent anthropogenically impacted habitats found worldwide, which bear potential for bee conservation. Although floral resources can be limited at these habitats, vegetation free patches of open sandy soils and embankments may offer good nesting possibilities for sand restricted and other bees. We compared bee communities as found in three reclaimed sand mines and at adjacent roadside meadows in Maryland, USA, over two years. Both sand mines and roadsides hosted diverse bee communities with 111 and 88 bee species, respectively. Bee abundances as well as richness and Shannon diversity of bee species were higher in sand mines than at roadsides and negatively correlated with the percentage of vegetational ground cover. Species composition also differed significantly between habitats. Sand mines hosted a higher proportion of ground nesters, more uncommon and more ‘sand loving’ bees similar to natural sandy areas of Maryland. Despite the destruction of the original pre-mining habitat, sand mines thus appear to represent a unique habitat for wild bees, particularly when natural vegetation and open sand spots are encouraged. Considering habitat loss, the lack of natural disturbance regimes, and ongoing declines of wild bees, sand mines could add promising opportunities for bee conservation which has hitherto mainly focused on agricultural and urban habitats. The third study was an experimental field study on pollinator friendly plants. Bees rely on the pollen and nectar of plants as their food source. Therefore, pollinator friendly plantings are often used for habitat enhancements in bee conservation. Non-native pollinator friendly plants may aid in bee conservation efforts, but have not been tested and compared with native pollinator friendly plants in a common garden experiment. In this study, we seeded mixes of 20 native and 20 non-native pollinator friendly plants in two separate plots at three sites in Maryland, USA. For two years, we recorded flower visitors to the plants throughout the blooming period and additionally sampled bees with pan traps. A total of 3744 bees (120 species) were sampled in the study. Of these, 1708 bees (72 species) were hand netted directly from flowers for comparisons between native and non-native plants. Depending on the season, bee abundance and species richness was either similar or lower (early season and for richness also late season) at native plots compared to non-native plots. Additionally, the overall bee community composition differed significantly between native and non-native plots. Furthermore, native plants were associated with more specialized plant-bee visitation networks compared to non-native plants. In general, visitation networks were more specialized in the early season than the later seasons. Four species (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, and Xylocopa virginica) out of the five most abundant bee species (also including Apis mellifera) foraged more specialized on native than non-native plants. Our study showed that non-native plants were well accepted by a diverse bee community and had a similar to higher attraction for bees compared to native plants. However, we also demonstrated alterations in foraging behavior, bee community assemblage, and visitation networks. As long as used with caution, non-native plants can be a useful addition to native pollinator friendly plantings. This study gives a first example of a direct comparison between native and non-native pollinator friendly plants. N2 - Meine Dissertation umfasst drei Studien: (1) eine Erfassung von Honigbienen-Kolonieverlusten in den USA zwischen 2014 und 2015, (2) die Erforschung des Potenzials renaturierter Sandminen als Habitat für Bienen und (3) eine Evaluierung nativer sowie standortfremder bestäuberfreundlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Attraktivität für Bienen. Während die erste Studie Honigbienen im Fokus hat, verschiebt sich der Fokus der zwei weiteren Studien hin zu Wildbienen bzw. gesamten Bienengemeinschaften. Die Studie zu Honigbienenkolonieverlusten wurde im Rahmen des Bee Informed Partnerships (BIP, beeinformed.org) durchgeführt und reiht sich ein in die seit dem Winter 2006/2007 jährlich durchgeführten Untersuchungen in den USA. Es ist das vierte Jahr in dem Sommer- und Jahresverluste zusätzlich zu den Winterverlusten kalkuliert wurden. Unter den Teilnehmern bildete die Gruppe der Hobby-Imker den größten Anteil (n = 5690), obwohl nebenberufliche (n = 169) und kommerzielle (n = 78) Imker den Großteil (91,7 %) der 414 267 begutachteten Bienenvölkern bzw. Kolonien hielten. Insgesamt enthielt die Studie 15,1 % der auf 2,74 Mio. geschätzten Gesamtzahl an gehaltenen Bienenvölkern in den USA. Die Gesamtverluste an Honigbienenvölkern (basierend auf der Gesamtheit der erfassten Völker) waren im Sommer mit 25,3 % höher als im Winter mit 22,3 % und bezifferten sich auf 40,6 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Durchschnittliche Kolonieverluste pro Imkerbetrieb waren höher im Winter (43,7 %) als im Sommer (14,7 %) und betrugen 49 % für das gesamte Imkerjahr in 2014/2015. Aufgrund der hohen Anzahl an Hobby-Imkern unter den Teilnehmern reflektieren die durchschnittlichen Kolonieverluste pro Imkerbetrieb (oder ungewichtete Verluste) v.a. die Situation dieser kleineren Imkerbetriebe. Hobby-Imker nannten als Gründe für die Honigbienenmortalität hauptsächlich Probleme des Koloniemanagements (z.B. Verhungerung, schwache Völker im Herbst), während nebenberufliche und kommerzielle Imker stärker Faktoren betonten, die außerhalb ihrer Kontrolle lagen (z.B. Varroamilben, Nosemasporen, Versagen der Königin). Die zweite Studie fand in renaturierten Sandminen statt. Sandminen sind weltweit zu findende anthropogen veränderte Landschaften, die ein Potenzial für Bienenschutz haben. Obwohl florale Ressourcen in diesen Habitaten limitiert sein können, könnten die vegetationsfreien Flecken auf offenen Sandböden und Böschungen gute Nistplätze für auf Sand spezialisierte und andere Bienen bieten. Wir haben Bienengemeinschaften aus drei renaturierten Sandminen sowie jeweils nahe gelegenen bepflanzten Straßenrändern in Maryland, USA verglichen. Sowohl die Sandminen als auch die Straßenränder enthielten vielfältige Bienengemeinschaften mit 111 (Sandminen) und 88 (Straßenränder) Bienenarten. Bienenabundanz, Artenreichtum und Shannon Diversität waren höher in den Sandminen als an den Straßenrändern und korrelierten negativ mit dem Anteil an vorhandener Bodenvegetation. Darüber hinaus unterschied sich die Artzusammensetzung signifikant zwischen den beiden Habitattypen. Sandminen enthielten einen größeren Anteil an Bodennistern, mehr seltene Arten und mehr sandliebende Arten, ähnlich natürlicher sandiger Gebiete in Maryland. Trotz der Zerstörung des ursprünglichen prä-Minen Habitats, scheinen Sandminen daher ein einzigartiges Bienenhabitat für Wildbienen darzustellen, besonders wenn die natürliche Besiedlung von Vegetation und offene Sandflächen gefördert werden. Im Hinblick auf Habitatverluste, auf das Fehlen von natürlichen Landschaftsstörungen und auf den weiterschreitenden Rückgang an Wildbienen, könnten Sandminen eine vielversprechende Möglichkeit für Bienenschutz darstellen, der sich bisher stark auf landwirtschaftliche und urbane Habitate konzentrierte. Bei der dritten Studie handelt es sich um eine experimentelle Feldstudie zu bestäuberfreundlichen Pflanzen. Bienen sind auf Pollen und Nektar von Pflanzen als Nahrungsquelle angewiesen. Aus diesem Grund werden bestäuberfreundliche Pflanzen oft für Habitatverbesserungen im Rahmen von Bienenschutzmaßnahmen gepflanzt. Standortfremde bestäuberfreundliche Pflanzen können dabei die Bienenschutzmaßnahmen unterstützen, wurden aber bisher nicht in einem Common Garden Experiment zusammen mit nativen bestäuberfreundlichen Pflanzen getestet bzw. verglichen. In dieser Studie haben wir Saatgutmischungen mit jeweils 20 nativen und 20 standortfremden Pflanzen in zwei separaten Plots in drei Gebieten in Maryland, USA ausgesät. Zwei Jahre lang protokollierten wir über die gesamten Blühzeiträume hinweg Pflanzenbesucher und sammelten Bienen mit Farbschalen. Insgesamt erfassten wir 3744 Bienen (120 Arten), von denen 1708 Individuen (72 Arten) per Hand direkt von den Blüten gesammelt wurden für die Vergleiche zwischen nativen und standortfremden Pflanzen. Abhängig von der Saison waren Bienenabundanz und Artenreichtum entweder ähnlich oder niedriger (frühe Saison und für Artenreichtum auch späte Saison) in nativen Plots verglichen mit den standortfremden Plots. Zusätzlich unterschied sich die Zusammensetzung der Bienengemeinschaft signifikant zwischen nativen und standortfremnden Pflanzen. Darüber hinaus waren die Bienen-Pflanzen-Besuchs-Netzwerke nativer Pflanzen spezialisierter als die Besuchs-Netzwerke standortfremder Pflanzen. Im Allgemeinen waren die Besuchs-Netzwerke in der frühen Saison spezialisierter als in der späten Saison. Vier Arten (Bombus impatiens, Halictus poeyi/ligatus, Lasioglossum pilosum, und Xylocopa virginica) der fünf am häufigsten vorkommenden Arten (zusätzlich auch Apis mellifera) fouragierten spezialisierter auf nativen Pflanzen als auf standortfremden Pflanzen. Unsere Studie zeigte, dass standortfremde Pflanzen weitläufig von einer artenreichen Bienengemeinschaft angenommen wurden und eine ähnliche bis höhere Attraktivität für Bienen aufwiesen verglichen mit nativen Pflanzen. Allerdings demonstrierten wir auch Änderungen im Fouragierverhalten, in der Zusammensetzung der Bienengemeinschaft und in den Besuchs-Netzwerken. Insgesamt kann ein vorsichtiger Einsatz standortfremder Pflanzen eine sinnvolle Ergänzung zu nativen bestäuberfreundlichen Anpflanzungen sein. Diese Studie stellt ein erstes Beispiel eines direkten Vergleichs von nativen und standortfremden bestäuberfreundlichen Anpflanzungen dar. KW - Biene KW - Wildbienen KW - Renaturierung <Ökologie> KW - Naturschutz KW - Honigbienen KW - exotische Pflanzen KW - Sandminen KW - Pflanzen-Bienen-Netzwerke KW - bestäuberfreundliche Pflanzen KW - wild bees KW - honey bees KW - sand mine KW - pollinator friendly plants KW - plant-bee visitation networks Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184180 ER - TY - THES A1 - Polzien, Lisa T1 - BAD Phosphorylation: A Novel Link between Apoptosis and Cancer T1 - BAD Phosphorylierung: Eine Neue Verbindung zwischen Apoptose und Krebs N2 - BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) is a pro-apoptotic member of the Bcl-2 protein family that is regulated by phosphorylation in response to survival factors. Although much attention has been devoted to the identification of phosphorylation sites in murine BAD (mBAD), little data are available with respect to phosphorylation of human BAD (hBAD) protein. In this work, we investigated the quantitative contribution of BAD targeting kinases in phosphorylating serines 75, 99 and 118 of hBAD (Chapter 3.1). Our results indicate that RAF kinases phosphorylate hBAD in vivo at these established serine residues. RAF-induced phosphorylation of hBAD was not prevented by MEK inhibitors but could be reduced to control levels by use of the RAF inhibitor Sorafenib (BAY 43-9006). Consistently, expression of active RAF suppressed apoptosis induced by hBAD and the inhibition of colony formation caused by hBAD could be prevented by RAF. In addition, using surface plasmon resonance technique we analyzed the direct consequences of hBAD phosphorylation by RAF with respect to complex formation of BAD with 14-3-3 proteins and Bcl-XL. Phosphorylation of hBAD by active RAF promotes 14-3-3 protein association, whereby the phosphoserine 99 represents the major binding site. Furthermore, we demonstrate in this work that hBAD forms channels in planar bilayer membranes in vitro. This pore-forming capacity is dependent on phosphorylation status and interaction with 14-3-3 proteins. Additionally, we show that hBAD pores possess a funnel-shaped geometry that can be entered by ions and non-charged molecules up to 200 Da (Chapter 3.2). Since both lipid binding domains of hBAD (LBD1 and LBD2) are located within the C-terminal region, we investigated this part of the protein with respect to its structural properties (Chapter 3.3). Our results demonstrate that the C-terminus of hBAD possesses an ordered β-sheet structure in aqueous solution that adopts helical disposition upon interaction with lipid membranes. Additionally, we show that the interaction of the C-terminal segment of hBAD with the BH3 domain results in the formation of permanently open pores, whereby the phosphorylation of serine 118 proved to be necessary for effective pore-formation. In contrast, phosphorylation of serine 99 in combination with 14-3-3 association suppresses formation of channels. These results indicate that the C-terminal part of hBAD controls hBAD function by structural transitions, lipid binding and phosphorylation. Using mass spectrometry we identified in this work, besides the established in vivo phosphorylation sites at serines 75, 99 and 118, several novel hBAD phosphorylation sites (serines 25, 32/34, 97, 124 and 134, Chapter 3.1). To further analyze the regulation of hBAD function, we investigated the role of these newly identified phosphorylation sites on BAD-mediated apoptosis. We found that in contrast to the N-terminal phosphorylation sites, the C-terminal serines 124 and 134 act in an anti-apoptotic manner (Chapter 3.4). Our results further indicate that RAF kinases and PAK1 effectively phosphorylate BAD at serine 134. Notably, in the presence of wild type hBAD, co-expression of survival kinases, such as RAF and PAK1, leads to a strongly increased proliferation, whereas substitution of serine 134 by alanine abolishes this process. Furthermore, we identified hBAD serine 134 to be strongly involved in survival signaling in B-RAF-V600E containing tumor cells and found phosphorylation of this residue to be crucial for efficient proliferation in these cells. Collectively, our findings provide new insights into the regulation of hBAD function by phosphorylation and its role in cancer signaling. N2 - BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) ist ein pro-apoptotisches Mitglied der Bcl-2 Proteinfamilie und wird in Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren durch Phosphorylierung reguliert. Obwohl der Identifizierung von Phosphorylierungsstellen in murinem BAD (mBAD) in den vergangenen Jahren viel Aufmerksamkeit gewidmet wurde, ist die Phosphorylierung des humanen BAD (hBAD) Proteins kaum charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wird der quantitative Beitrag unterschiedlicher Kinasen in Bezug auf die Phosphorylierung der etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118 von hBAD dargestellt (Kapitel 3.1). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass RAF-Kinasen hBAD in vivo an diesen etablierten Stellen phosphorylieren. Die RAF-bedingte Phosphorylierung konnte nicht durch MEK-Inhibitoren beeinflusst werden, dagegen bewirkte die Gabe des RAF-Inhibitors Sorafenib (BAY 43-9006) eine Reduktion der Phosphorylierung auf das Niveau der Kontrollproben. Übereinstimmend konnte durch die Expression von aktiven RAF-Kinasen die BAD-induzierte Apoptose sowie die BAD-bedingte Inhibierung der Koloniebildung unterdrückt werden. Zusätzlich verwendeten wir Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie um die Auswirkungen der RAF-bedingten BAD-Phosphorylierung auf die Komplexbildung von hBAD mit 14-3-3-Proteinen und Bcl-XL zu analysieren. Dabei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von hBAD durch aktive RAF-Kinasen die Assoziierung von 14-3-3 begünstigt, wobei Phosphoserin 99 die Hauptbindungsstelle darstellt. Weiterhin gelang der Nachweis, dass hBAD in vitro Poren in Lipid-Doppelschicht-Membranen bilden kann. Wir wiesen nach, dass die Fähigkeit von hBAD Poren zu bilden phosphorylierungsabhängig ist und durch die Interaktion mit 14-3-3-Proteinen beeinflusst wird. Außerdem demonstrieren wir in dieser Arbeit, dass die BAD-Poren eine zylinderförmige Geometrie aufweisen und sowohl für Ionen als auch für ungeladene Moleküle mit einer Größe von bis zu 200 Da zugänglich sind (Kapitel 3.2). Da beide Lipid-Bindungsstellen (LBD1 und LBD2) am C-Terminus des hBAD lokalisiert sind, charakterisierten wir des Weiteren diesen Teil des Proteins in Hinblick auf seinen strukturellen Aufbau (Kapitel 3.3). Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass der hBAD-C-Terminus in wässriger Lösung eine geordnete β-Faltblattstruktur aufweist und bei Eintritt in eine Lipidumgebung helikale Elemente ausbildet. Zusätzlich zeigen wir in dieser Arbeit, dass die Interaktion des C-terminalen hBAD-Segments mit der BH3-Domäne zur Ausbildung von permanent offenen Poren führt, wobei die Phosphorylierung an Serin 118 eine Notwendigkeit für effektive Porenbildung darstellt. In Gegensatz dazu bewirkte die Phosphorylierung von Serin 99 in Kombination mit der Assoziierung von 14-3-3-Protein eine Inhibierung der Porenbildung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der C-terminale Teil von hBAD durch strukturelle Veränderungen, Lipidbindung und Phosphorylierung entscheidend die Funktion von hBAD reguliert. Mit Hilfe von Massenspektroskopie konnten wir im Rahmen dieser Arbeit, zusätzlich zu den etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118, einige neue in vivo Phosphorylierungsstellen von hBAD identifizieren (Serin 25, 32/34, 97, 124 und 134, Kapitel 3.1). Um die Regulierung der Funktion von hBAD weiter zu analysieren, untersuchten wir die Rolle dieser neu identifizierten Phosphorylierungsstellen in Bezug auf die BAD-induzierte Apoptose (Kapitel 3.4). Wir fanden heraus, dass im Gegensatz zu den N-terminalen Phosphorylierungsstellen, die Phosphorylierungsstellen am C-Terminus an der Apoptoseregulation mitwirken. Weiterhin weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass RAF-Kinasen, neben PAK1, an der Phosphorylierung von Serin 134 von hBAD beteiligt sind. Interessanterweise bewirkte die Co-Expression von RAF oder PAK1 mit dem wildtypischen hBAD eine erhebliche Verstärkung der Zellproliferation. Diese verstärkte Proliferation konnte durch einen Serin-zu-Alanin-Austausch in hBAD an der Stelle 134 vollständig verhindert werden. Weiterhin entdeckten wir, dass die Phosphorylierung dieser Stelle in B-RAF-V600E enthaltenden Tumorzellen bei der Regulation der Zellproliferation mitwirkt und für eine effiziente Proliferation entscheidend ist. Zusammenfassend gewähren unsere Ergebnisse neue Einblicke in die Regulierung der Funktion von hBAD durch Phosphorylierung sowie in die Rolle von hBAD bei der Krebsentwicklung. KW - Krebs KW - Apoptosis KW - Bcl-2-Proteinfamilie KW - Raf KW - BH3-only proteins KW - BAD KW - cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56919 ER - TY - THES A1 - Vidal, Marie T1 - b-adrenergic receptors and Erk1/2-mediated cardiac hypertrophy T1 - b-adrenerge Rezeptoren und Erk1/2-vermittelte Herzhypertrophie N2 - Chronische Aktivierung von b-Adrenorezeptoren (b-ARs) durch Katecholamine ist ein Stimulus für kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Ebenso führt die Expression von b1-ARs oder Gas-Proteinen in genetisch modifizierten Mäusen zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Allerdings führt die direkte Aktivierung dem Gas nachgeschalteten Komponenten des b-adrenergen Signalwegs wie z.B. die Aktivierung der Adenylylcyclase (AC) oder der Proteinkinase A (PKA) nicht im signifikanten Ausmaß zur Herzhypertrophie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zusätzlich zu dem klassischen Signalweg, auch weitere durch Gas-Proteine aktivierte Komponenten in die b-adrenerg vermittelte Hypertrophieentwicklung involviert sind. Interessanterweise wurde vor kurzem ein hypertropher Signalweg beschrieben, der eine direkte Involvierung von Gbg-Untereinheiten bei der Induktion von Herzhypertrophie durch die extrazellulär-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) zeigt: Nach Aktivierung Gaq-gekoppelter Rezeptoren binden Gbg-Untereinheiten an die aktivierte Raf/Mek/Erk Kaskade. Die Bindung der freigesetzten Gbg-Untereinheiten an Erk1/2 führt zu einer Autophosphorylierung von Erk1/2 an Threonin 188 (bzw. Thr208 in Erk1; im folgenden ErkThr188-Phosphorylierung genannt), welche für die Vermittlung kardialer Hypertrophie verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch die Aktivierung von b-ARs in Mäusen sowie von isolierten Kardiomyozyten zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung führt. Darüberhinaus führte die Überexpression von Erk2 Mutanten (Erk2T188S und Erk2T188A), die nicht an Threonin 188 phosphoryliert werden können, zu einer deutlich reduzierten Hypertrophieantwort von Kardiomyozyten auf Isoproterenol. Auch die kardiale Expression der Erk2T188S Mutante im Mäusen verminderte die Hypertrophieantwort auf eine 2-wöchige Isoproterenol-Behandlung deutlich: Die linksventrikuläre Wanddicke, aber auch interstitielle Fibrose und Herzinsuffizienzmarker wie z.B. BNP waren signifikant reduziert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass tatsächlich ein Zusammenspiel von Ga und Gbg-vermittelten Signalen zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung und damit zur Induktion von b-adrenerg vermittelter Hypertrophie notwendig ist. Während die Hemmung von Gbg-Signalen mit dem C-Terminus der GRK2 oder die Hemmung von Adenylylzyklase eine ErkThr188-Phosphorylierung und eine Hypertrophieantwort nach Isoprenalingabe effektiv reduzierten, führt die alleinige Aktivierung von Adenylylzyklase nicht zu einer Hypertrophieantwort. Diese Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer möglicher therapeutischen Strategien zur Therapie b-adrenerg induzierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz helfen. N2 - b-adrenergic receptors (b-ARs) participate strongly in the development of cardiac hypertrophy and human heart failure. Stimulation of b-adrenergic receptors with catecholamines as well as cardiac overexpression of b1-ARs or of Gas-proteins in transgenic mice induces cardiac hypertrophy. However, direct activation of their downstream targets, such as adenylyl cyclase (AC) or protein kinase A do not promote a significant degree of cardiac hypertrophy. These findings suggest that additional events may occur and that these events require Gas-protein activation. A hypertrophic pathway involving Gaq-protein coupled receptors has recently been described. Upon activation of Gaq-coupled receptors Gbg-subunits are released from Gaq and bind directly to the activated Raf/Mek/Erk cascade. Direct interaction between bg-subunits and activated Erk1/2 leads to an additional autophosphorylation of Erk2 at threonine 188, which mediates cardiac hypertrophy. Murine hearts, as well as isolated cardiomyocytes present an increase in Erk2Thr188-phosphorylation upon b-AR activation. Similarly overexpression of phosphorylation deficient Erk2 mutants (Erk2T188S and Erk2T188A) reduces b-AR mediated cardiomyocyte hypertrophy. Increase in left ventricular wall thickness, fibrosis and up-regulation of natriuretic peptide synthesis, which are physiological features for cardiac hypertrophy, are strongly inhibited in transgenic mice with a cardiac expression of Erk2T188S after two weeks of sustained isoproterenol treatment. It could further be shown in this work that b-AR mediated cardiac hypertrophy requires two distinct pathways initiated by Gs-protein activation: the canonical phosphorylation of Erk1/2 via adenylyl cyclase and the direct interaction of released bg-subunits with activated Erk1/2. Coincidence of both events leads to Erk2Thr188-phosphorylation, which activates then different transcription factors responsible for cardiac hypertrophy. Sequestration of bg-subunits by overexpression of the C-terminus of GRK2 bark-ct and inhibition of adenylyl cyclase efficiently reduced the hypertrophic response to isoproterenol, whereas direct activation of AC by forskolin failed to induce Erk2Thr188-phosphorylation and cardiomyocyte hypertrophy. These findings may help to develop new therapeutic strategies for the prevention of cardiac hypertrophy and maladaptive remodeling of the heart. KW - Adrenerger Rezeptor KW - Herzhypertrophie KW - MAP-Kinase KW - adrenerge Rezeptoren KW - Herzhypertrophie KW - Erk1/2 KW - adrenergic receptors KW - cardiac hypertrophy KW - Erk1/2 Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83671 ER - TY - THES A1 - Röschert, Isabelle T1 - Aurora-A prevents transcription-replication conflicts in MYCN-amplified neuroblastoma T1 - Aurora-A verhindert Transkriptions-Replikationskonflikte in MYCN-amplifizierten Neuroblastomen N2 - Neuroblastoma is the most abundant, solid, extracranial tumor in early childhood and the leading cause of cancer-related childhood deaths worldwide. Patients with high-risk neuroblastoma often show MYCN-amplification and elevated levels of Aurora-A. They have a low overall survival and despite multimodal therapy options a poor therapeutic prognosis. MYCN-amplified neuroblastoma cells depend on Aurora-A functionality. Aurora-A stabilizes MYCN and prevents it from proteasomal degradation by competing with the E3 ligase SCFFBXW7. Interaction between Aurora-A and MYCN can be observed only in S phase of the cell cycle and activation of Aurora-A can be induced by MYCN in vitro. These findings suggest the existence of a profound interconnection between Aurora-A and MYCN in S phase. Nevertheless, the details remain elusive and were investigated in this study. Fractionation experiments show that Aurora-A is recruited to chromatin in S phase in a MYCN-dependent manner. Albeit being unphosphorylated on the activating T288 residue, Aurora-A kinase activity was still present in S phase and several putative, novel targets were identified by phosphoproteomic analysis. Particularly, eight phosphosites dependent on MYCN-activated Aurora-A were identified. Additionally, phosphorylation of serine 10 on histone 3 was verified as a target of this complex in S phase. ChIP-sequencing experiments reveal that Aurora-A regulates transcription elongation as well as histone H3.3 variant incorporation in S phase. 4sU-sequencing as well as immunoblotting demonstrated that Aurora-A activity impacts splicing. PLA measurements between the transcription and replication machinery revealed that Aurora-A prevents the formation of transcription-replication conflicts, which activate of kinase ATR. Aurora-A inhibitors are already used to treat neuroblastoma but display dose-limiting toxicity. To further improve Aurora-A based therapies, we investigated whether low doses of Aurora-A inhibitor combined with ATR inhibitor could increase the efficacy of the treatment albeit reducing toxicity. The study shows that the combination of both drugs leads to a reduction in cell growth as well as an increase in apoptosis in MYCN-amplified neuroblastoma cells, which is not observable in MYCN non-amplified neuroblastoma cells. This new approach was also tested by a collaboration partner in vivo resulting in a decrease in tumor burden, an increase in overall survival and a cure of 25% of TH-MYCN mice. These findings indicate indeed a therapeutic window for targeting MYCN-amplified neuroblastoma. N2 - Das Neuroblastom ist der häufigste, solide, extrakranielle Tumor der frühesten Kindheit und die häufigste mit Krebs verbundene Todesursache von Kleinkindern weltweit. Patienten mit geringerer Überlebenswahrscheinlichkeit und schlechterer Therapieprognose zeigen oft eine MYCN-Amplifikation und erhöhte Mengen von Aurora-A. Aurora-A ist eine Serin/Threonin-Protein Kinase, die wichtige mitotische Prozesse reguliert. Aurora-A stabilisiert MYCN und verhindert dadurch den proteasomalen Abbau von MYCN. Die Interaktion zwischen Aurora-A und MYCN ist S Phasen-spezifisch und MYCN ist in vitro in der Lage, durch seine Bindung Aurora-A zu aktivieren. Die Funktionen und Prozesse, die von Aurora-A in der S Phase reguliert werden, sind noch nicht hinreichend untersucht und daher Gegenstand dieser Dissertation. Zell-Fraktionierungen zeigen, dass Aurora-A in der S Phase in einer MYCN-abhängigen Weise an das Chromatin gebunden ist. Phosphoproteom-Analysen mittels Massenspektrometrie identifizierten zahlreiche neue Substrate von Aurora-A, sowie acht Substrate von MYCN-aktiviertem Aurora-A. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass Histon 3 Serin 10 von Aurora-A in Abhängigkeit von MYCN in S Phase phosphoryliert wird. ChIP-Sequenzierungen zeigen, dass Aurora-A die Elongation der Transkription und den Einbau der Histone Variante H3.3 in S Phase beeinflusst. 4sU-Sequenzierung sowie Immunoblots zeigen einen Zusammenhang zwischen der Aktivität von Aurora-A und dem Spleißosom in der S Phase. Zusätzlich konnte mittels PLA nachgewiesen werden, dass Aurora-A die Entstehung von Transkriptions-Replikationskonflikten verhindert, die andernfalls die Kinase ATR aktivieren würden. Aurora-A Inhibitoren wurden unter anderem zur Therapie von Neuroblastomen eingesetzt, allerdings ist die Dosis des Aurora-A Inhibitors durch die hohe Toxizität limitiert, was die Effizienz der Therapie stark beeinträchtigt. Daher wurde untersucht, ob die gleichzeitige Gabe von geringeren Mengen Aurora-A Inhibitor in Kombination mit einem ATR Inhibitor zur Therapie geeignet ist. In vitro konnte gezeigt werden, dass die Kombination beider Inhibitoren das Zellwachstum reduziert und das MYCN-amplifizierte Zellen im Vergleich zu MYCN nicht-amplifizierten Zellen verstärkt durch Apoptose sterben. Durch einen Kollaborationspartner konnte die Kombination der beiden Inhibitoren an Mäusen getestet werden. Die mit der Kombination behandelten Mäuse, zeigen ein deutlich reduziertes Tumorwachstum, sowie längeres Überleben. Somit stellt diese Kombination ein therapeutisches Fenster dar und könnte zur Behandlung von Neuroblastompatienten genutzt werden. KW - Neuroblastom KW - Aurora-A KW - MYCN KW - neuroblastoma Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243037 ER - TY - THES A1 - Käthner, Ivo R. J. T1 - Auditory and visual brain-computer interfaces as communication aids for persons with severe paralysis T1 - Akustische und visuelle Gehirn-Computer Schnittstellen als Kommunikationshilfen für Menschen mit schweren Muskellähmungen N2 - Brain-computer interfaces (BCIs) could provide a muscle-independent communication channel to persons with severe paralysis by translating brain activity into device commands. As a means of communication, in particular BCIs based on event-related potentials (ERPs) as control signal have been researched. Most of these BCIs rely on visual stimulation and have been investigated with healthy participants in controlled laboratory environments. In proof-of-principle studies targeted end users gained control over BCI systems; however, these systems are not yet established as an assistive technology for persons who would most benefit from them. The main aim of this thesis is to advance the usability of ERP-BCIs for target users. To this end, five studies with BCIs have been conducted that enabled users to communicate by focusing their attention on external stimuli. Two studies were conducted in order to demonstrate the advantages and to further improve the practical application of visual BCIs. In the first study, mental workload was experimentally manipulated during prolonged BCI operation. The study showed the robustness of the visual ERP-BCI since users maintained a satisfactory level of control despite constant distraction in the form of background noise. Moreover, neurophysiological markers that could potentially serve as indicators of high mental workload or fatigue were revealed. This is a first step towards future applications in which the BCI could adapt to the mental state of the user (e.g. pauses if high mental workload is detected to prevent false selections). In the second study, a head-mounted display (HMD), which assures that stimuli are presented in the field of view of the user, was evaluated. High accuracies and information transfer rates, similar to a conventional display, were achieved by healthy participants during a spelling task. Furthermore, a person in the locked-in state (LIS) gained control over the BCI using the HMD. The HMD might be particularly suited for initial communication attempts with persons in the LIS in situations, where mounting a conventional monitor is difficult or not feasible. Visual ERP-BCIs could prove valuable for persons with residual control over eye muscles and sufficient vision. However, since a substantial number of target users have limited control over eye movements and/or visual impairments, BCIs based on non-visual modalities are required. Therefore, a main aspect of this thesis was to improve an auditory paradigm that should enable motor impaired users to spell by focusing attention on different tones. The two conducted studies revealed that healthy participants were able to achieve high spelling performance with the BCI already in the first session and stress the importance of the choice of the stimulus material. The employed natural tones resulted in an increase in performance compared to a previous study that used artificial tones as stimuli. Furthermore, three out of five users with a varying degree of motor impairments could gain control over the system within the five conducted sessions. Their performance increased significantly from the first to the fifth session - an effect not previously observed for visual ERP-BCIs. Hence, training is particularly important when testing auditory multiclass BCIs with potential users. A prerequisite for user satisfaction is that the BCI technology matches user requirements. In this context, it is important to compare BCIs with already established assistive technology. Thus, the fifth study of this dissertation evaluated gaze dependent methods (EOG, eye tracking) as possible control signals for assistive technology and a binary auditory BCI with a person in the locked-in state. The study participant gained control over all tested systems and rated the ease of use of the BCI as the highest among the tested alternatives, but also rated it as the most tiring due to the high amount of attention that was needed for a simple selection. Further efforts are necessary to simplify operation of the BCI. The involvement of end users in all steps of the design and development process of BCIs will increase the likelihood that they can eventually be used as assistive technology in daily life. The work presented in this thesis is a substantial contribution towards the goal of re-enabling communication to users who cannot rely on motor activity to convey their thoughts. N2 - Gehirn-Computer Schnittstellen (engl. brain-computer interfaces, BCIs) könnten Menschen mit schweren Muskellähmungen muskelunabhängige Kommunikation ermöglichen, indem sie Gehirnaktivität in Steuerungsbefehle übersetzen. Zu Kommunikationszwecken wurden insbesondere BCIs erforscht, die auf ereigniskorrelierten Potenzialen (EKPs) als Steuerungssignal beruhen. Die Mehrzahl dieser BCIs basiert auf visuellen Paradigmen und wurde unter kontrollierten Laborbedingungen mit gesunden Versuchsteilnehmern untersucht. In Machbarkeitsstudien konnten auch Menschen mit schweren Muskellähmungen Kontrolle erlangen. Jedoch sind BCIs noch nicht im Alltag als Hilfsmittel für diejenigen etabliert, die am meisten von ihnen profitieren würden. Die Gebrauchstauglichkeit für diese Zielgruppe zu erhöhen, ist das Hauptziel der vorliegenden Arbeit. Zu diesem Zweck wurden fünf Studien mit BCIs durchgeführt, die Nutzern durch die Aufmerksamkeitsfokussierung auf externe Reize ermöglichen zu kommunizieren. Um die Vorteile der visuellen Paradigmen zu zeigen und die praktische Anwendbarkeit weiter zu verbessern, wurden zwei Studien durchgeführt. In der ersten Studie wurde die mentale Arbeitsbelastung während längerer Benutzung eines BCI experimentell manipuliert. Die Studie demonstrierte die Robustheit des EKP-BCI. Nutzer konnten trotz konstanter Ablenkung durch Hintergrundgeräusche ein zufriedenstellendes Kontrollniveau aufrechterhalten. Darüber hinaus wurden neurophysiologische Marker gefunden, die als Indikatoren hoher mentaler Arbeitsbelastung oder Ermüdung dienen können. Dies ist ein erster Schritt hin zu Anwendungen, bei denen sich das BCI dem mentalen Zustand des Benutzers anpasst (z.B. indem die Anwendung pausiert, wenn hohe Arbeitsbelastung detektiert wird, um Falschauswahlen zu verhindern). In der zweiten Studie wurde ein Head- Mounted Display (HMD) evaluiert, welches sicherstellt, dass alle Stimuli im Gesichtsfeld des Nutzers angezeigt werden. Dabei wurden von gesunden Versuchsteilnehmern hohe Genauigkeiten und Informationstransferraten beim Schreiben von Wörtern erzielt, vergleichbar mit denen eines herkömmlichen Bildschirms. Zusätzlich erlangte ein Nutzer im Locked-in-Zustand Kontrolle über das BCI mittels des HMD. Das HMD könnte sich insbesondere für initiale Kommunikationsversuche für Personen im Locked-in-Zustand eignen, wenn sich das Aufstellen eines konventionellen Bildschirms als schwierig oder unmöglich erweist. Visuelle EKP-BCIs könnten sich insgesamt als wertvoll für Personen herausstellen, die noch ihre Augenbewegungen kontrollieren können und über ausreichend Sehkraft verfügen. Da eine nicht unerhebliche Zahl von potenziellen Endbenutzern jedoch eingeschränkte Kontrolle über Augenbewegungen und/oder Sehbeeinträchtigungen hat, sind BCIs notwendig, die auf nicht-visuellen Modalitäten beruhen. Im Rahmen dieser Arbeit lag ein Fokus deshalb auf der Weiterentwicklung eines akustischen Paradigmas, welches Nutzern mit motorischen Einschränkungen das Buchstabieren durch die Aufmerksamkeitsfokussierung auf verschiedene Töne ermöglichen soll. Die beiden hierzu durchgeführten Studien zeigten, dass gesunde Versuchsteilnehmer bereits in der ersten Sitzung hohe Buchstabiergenauigkeiten erzielen konnten. Zudem unterstreichen diese Studien die Wichtigkeit der Wahl der Stimuli. Die in den beiden Studien verwendeten natürlichen Geräusche, führten zu einer Leistungsverbesserung verglichen mit einer vorausgegangenen Studie, die künstliche Töne verwendete. Darüber hinaus konnten drei von fünf Nutzern mit Muskellähmungen innerhalb von fünf Sitzungen Kontrolle über das System erlangen. Für die drei Nutzer war die Leistung in der fünften Sitzung dabei deutlich höher als in der ersten. Ein solcher Trainingseffekt wurde mit visuellen Paradigmen in vorausgegangenen Studien bisher nicht berichtet. Dieses Ergebnis betont daher die Bedeutsamkeit von Training während der Erprobung von akustischen Multi-Klassen-BCIs mit Endbenutzern. Eine Grundvoraussetzung für Nutzerzufriedenheit ist, dass die BCI Technologie den Bedürfnissen der Nutzer entspricht. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, BCIs mit bereits etablierten Hilfsmitteln zu vergleichen. Daher wurden in der fünften Studie dieser Dissertation sowohl blickabhängige Methoden (EOG, Eye-Tracking) als auch ein akustisches BCI zur binären Kommunikation mit einem Nutzer im Locked-in-Zustand evaluiert. Der Studienteilnehmer erlangte über alle getesteten Systeme die Kontrolle und bewertete den Bedienkomfort des BCI am höchsten verglichen mit den anderen getesteten Methoden. Das BCI wurde jedoch aufgrund der hohen Konzentration, die für die Auswahl eines einzelnen Befehls benötigt wurde, als die ermüdendste bewertet. Weitere Entwicklungen sind notwendig, um die Bedienung des BCI noch stärker zu vereinfachen. Die Einbeziehung von Endbenutzern in alle Schritte des Entwicklungsprozesses eines BCI wird die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass es schließlich als Hilfsmittel im Alltag genutzt werden kann. Die vorliegende Dissertation leistet wesentliche Beiträge, um dieses Ziel zu erreichen: Nämlich Nutzern, welche sich nicht mittels motorischer Aktivität ausdrücken können, eine neue Form der Kommunikation zu ermöglichen. KW - Gehirn-Computer Schnittstelle KW - Elektronencephalographie KW - Kommunikationshilfe KW - Brain-computer interface KW - BCI KW - EEG KW - P300 KW - ALS KW - LIS KW - AAC Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135477 ER - TY - THES A1 - Kastner, Anna Katharina T1 - Attention mechanisms in contextual anxiety and cued fear and their influence on processing of social cues T1 - Aufmerksamkeitsmechanismen bei kontextueller Angst und reizspezifischer Furcht und deren Einfluss auf die Verarbeitung von sozialen Reizen N2 - Anxiety is an affective state characterized by a sustained, long-lasting defensive response, induced by unpredictable, diffuse threat. In comparison, fear is a phasic response to predictable threat. Fear can be experimentally modeled with the help of cue conditioning. Context conditioning, in which the context serves as the best predictor of a threat due to the absence of any conditioned cues, is seen as an operationalization of sustained anxiety. This thesis used a differential context conditioning paradigm to examine sustained attention processes in a threat context compared to a safety context for the first time. In three studies, the attention mechanisms during the processing of contextual anxiety were examined by measuring heart rate responses and steady-state-visually evoked potentials (ssVEPs). An additional focus was set on the processing of social cues (i.e. faces) and the influence of contextual information on these cues. In a last step, the correlates of sustained anxiety were compared to evoked responses by phasic fear, which was realized in a previously established paradigm combining predictable and unpredictable threat. In the first study, a contextual stimulus was associated with an aversive loud noise, while a second context remained unpaired. This conditioning paradigm created an anxiety context (CTX+) and a safety context (CTX-). After acquisition, a social agent vs. an object was presented as a distractor in both contexts. Heart rate and cortical responses, with ssVEPs by using frequency tagging, to the contexts and the distractors were assessed. Results revealed enhanced ssVEP amplitudes for the CTX+ compared to the CTX− during acquisition and during presentation of distractor stimuli. Additionally, the heart rate was accelerated in the acquisition phase, followed by a heart rate deceleration as a psychophysiological marker of contextual anxiety. Study 2 used the same context conditioning paradigm as Study 1. In contrast to the first study, persons with different emotional facial expressions were presented in the anxiety and safety contexts in order to compare the differential processing of these cues within periods of threat and safety. A similar anxiety response was found in the second study, although only participants who Abstract VIII were aware of the contingency between contexts and aversive event showed a sensory amplification of the threat context, indicated by heart rate response and ssVEP activation. All faces irrespective of their emotional expression received increased attentional resources when presented within the anxiety context, which suggests a general hypervigilance in anxiety contexts. In the third study, the differentiation of predictable and unpredictable threat as an operationalization of fear and anxiety was examined on a cortical and physiological level. In the predictable condition, a social cue was paired with an aversive event, while in the unpredictable condition the aversive event remained unpaired with the respective cue. A fear response to the predictable cue was found, indicated by increased oscillatory response and accelerated heart rate. Both predictable and unpredictable threat yielded increased ssVEP amplitudes evoked by the context stimuli, while the response in the unpredictable context showed longer-lasting ssVEP activation to the threat context. To sum up, all three studies endorsed anxiety as a long-lasting defensive response. Due to the unpredictability of the aversive events, the individuals reacted with hypervigilance in the anxiety context, reflected in a facilitated processing of sensory information and an orienting response. This hypervigilance had an impact on the processing of novel cues, which appeared in the anxiety context. Considering the compared stimuli categories, the stimuli perceived in a state of anxiety received increased attentional resources, irrespective of the emotional arousal conveyed by the facial expression. Both predictable and unpredictable threat elicited sensory amplification of the contexts, while the response in the unpredictable context showed longer-lasting sensory facilitation of the threat context. N2 - Angst wird als ein langanhaltender Zustand, induziert durch eine unvorhersehbare, diffuse Bedro-hung, gesehen. Furcht hingegen wird als eine kürzere Reaktion auf einen spezifischen Bedrohungsreiz definiert. Diese phasische Reaktion kann durch Furchtkonditionierung induziert werden. Bei der Kontextkonditionierung hingegen wird durch die Abwesenheit vorhersagender Hinweisreize der Kontext zum besten Prädiktor für den aversiven Reiz und induziert dadurch eine chronische Erwartung der Bedrohung und einen langanhaltenden Angstzustand. Diese Promotionsarbeit präsentiert ein neu angepasstes differentielles Kontextkonditionierungspara-digma, welches implementiert wurde, um ein kontinuierliches Maß langanhaltender Angst im Be-drohungskontext zu erhalten. In drei Studien wurden Aufmerksamkeitsmechanismen mittels Erhebung von Herzrate und steady-state visuell evozierte Potentiale (ssVEPs) untersucht. Ein zusätzlicher Fokus lag in der Verarbeitung von sozialen Reizen (d.h. Gesichtern) und dem Einfluss von kontextuellen Informationen. Zusätzlich wurden mittels eines bereits etablierten Paradigma, welches die Vorhersagbarkeit von Bedrohungsreizen moduliert, die elektrokortikalen und physiologischen Korrelate von Angst mit Furchtreaktionen verglichen. In der ersten Studie wurde ein Kontextstimulus mit einem aversiven lauten unvorhersagbaren Geräusch assoziiert, während ein zweiter Kontextstimulus ungepaart blieb. In diesem differenti-ellen Paradigma entstanden so ein Angstkontext (CTX+) und ein Sicherheitskontext (CTX-). Nach der Akquisition wurden ein sozialer Agent und ein Objekt als Distraktoren in beiden Kontexten präsentiert. Die Herzrate und die kortikale Aktvierung mittels ssVEPs in Reaktion auf beide Kontexte und beide Distraktoren wurden gemessen. Die Ergebnisse zeigten erhöhte ssVEP-Amplituden in Reaktion auf den CTX+ im Vergleich zum CTX- während der Akquisitionsphase und der simultanen Präsentation der Distraktoren. Diese langanhaltende Angstreaktion wurde unterstützt durch Befunde von einer Akzeleration der Herzrate während der Konditionierungsphase und einer darauffolgenden Dezeleration im Angstkontext. Studie 2 verwendete dasselbe Kontextkonditionierungsparadigma wie die erste Studie, allerdings wurden hier Personen mit unterschiedlichen emotionalen Gesichtsausdrücken als Distraktoren Zusammenfassung X im Angst- und Sicherheitskontext präsentiert, um die differentielle Verarbeitung von emotionalen Reizen innerhalb von Phasen der Angst und Sicherheit zu untersuchen. Es konnte eine ähnliche Angstreaktion wie in der ersten Studie nachgewiesen werden, allerdings zeigte sich diese nur bei den kontingenzbewussten Probanden, die den Zusammenhang zwischen den aversiven Konse-quenzen und den beiden Kontexten richtig wiedergeben konnten. Sie zeigte sich in einer sensorischen Verstärkung des CTX+, abgeleitet durch Herzrate und ssVEP-Aktivierung. Alle Gesichter, unabhängig ihres emotionalen Gehalts, evozierten verstärkte Aufmerksamkeitsres-sourcen im CTX+, was auf eine generelle Hypervigilanz in Angstkontexten hindeutet. In der dritten Studie wurde die Differenzierung von vorhersagbarer und unvorhersagbarer Be-drohung, als Operationalisierung von Furcht und Angst, auf kortikaler und physiologischer Ebene untersucht. In der vorhersagbaren Bedingung wurde ein sozialer Reiz mit einem aversiven Ereignis gepaart; in der unvorhersagbaren Bedingung wurde dieses aversive Ereignis zufällig prä-sentiert. Eine Furchtreaktion auf den vorhersagbaren Reiz konnte mit erhöhten ssVEP-Amplituden sowie einer erhöhten Herzrate gezeigt werden. Sowohl die vorhersagbare als auch die unvorhersagbare Bedrohung lösten eine sensorische Verstärkung der Kontexte gegenüber der Sicherheitsbedingung aus, wobei die Reaktion auf den unvorhersagbaren Kontext eine länger an-dauernde ssVEP-Aktivierung beinhaltete. Die Ergebnisse von den drei Studien konnten Angst als eine langanhaltende defensive Reaktion bestätigen. Aufgrund der Unvorhersagbarkeit der aversiven Ereignisse reagieren Individuen mit einer erhöhten Wachsamkeit im Angstkontext, gezeigt in einer erleichterten Verarbeitung von sensorischer Information und einer Orientierungsreaktion. Diese erhöhte Wachsamkeit hatte auch einen Einfluss auf die Verarbeitung von neuen Reizen, welche im Angstkontext erschienen. Abhängig von den Vergleichsstimuli, erhielten Stimuli die im Angstkontext wahrgenommen wurden, erhöhte Aufmerksamkeitsressourcen, unabhängig vom emotionalen Gehalt der Gesichter. Sowohl vorhersagbare als auch unvorhersagbare Bedrohungen förderten eine ver-stärkte sensorische Verarbeitung der Kontexte, während diese im Angst- im Gegensatz zum Furchtkontext länger andauerte. KW - Angst KW - Konditionierung KW - psychophysiology KW - steady-state visually evoked potentials KW - Aversive Konditionierung KW - Ereigniskorreliertes Potenzial KW - Furcht Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123747 ER - TY - THES A1 - Asthana, Manish T1 - Associative learning – Genetic modulation of extinction and reconsolidation and the effects of transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) T1 - Assoziatives Lernen - Genetische Modulation der Auslöschung und Rück-verfestigung und die Auswirkungen der transkraniellen Gleichstromstimulation (tDCS) N2 - Scientific surveys provide sufficient evidence that anxiety disorders are one of the most common psy-chiatric disorders in the world. The lifetime prevalence rate of anxiety disorder is 28.8% (Kessler, et al., 2005). The most widely studied anxiety disorders are as follows panic disorder (PD), post-traumatic stress disorder (PTSD), obsessive-compulsive disorder (OCD), social phobia (or social anxiety disorder), specific phobias, and generalized anxiety disorder (GAD). (NIMH Article, 2009). Classical conditioning is the stable paradigm used from the last one century to understand the neurobi-ology of fear learning. Neurobiological mechanism of fear learning is well documented with the condi-tioning studies. In the therapy of anxiety disorders, exposure based therapies are known to be the most effective approaches. Flooding is a form of exposure therapy in which a participant is exposed to the fear situation and kept in that situation until their fear dissipates. The exposure therapy is based on the phenomena of extinction; this means that a conditioned response diminishes if the conditioned stimulus (CS) is repeatedly presented without an unconditioned stimulus (UCS). One problem with extinction as well as with exposure-based therapy is the problem of fear return (for e.g. renewal, spontaneous recov-ery and reinstatement) after successful extinction. Therefore, extinction does not delete the fear memory trace. It has been well documented that memory processes can be modulated or disrupted using several sci-entific paradigms such as behavioral (for e.g. exposure therapy), pharmacological (for e.g. drug manipu-lation), non-invasive stimulation (for e.g. non-invasive stimulation such as electroconvulsive shock (ECS), transcranial magnetic stimulation (TMS), transcranial direct current stimulation (tDCS), etc. However, modulation of memory processes after reactivation or via non-invasive stimulation is still not clear, which is the focus of the current study. In addition, study of genetic variant suggests that genetic differences play a vital role in the psychiatric disorder especially in fear learning. Hence, it is also one of the concerns of the current dissertation to investigate the interaction between gene and reconsolidation of memory. With respect to fear-conditioning, there are three findings in the current dissertation, which are as fol-lows: (i) In the first study we investigated that non-invasive weak electrical stimulation interferes with the consolidation process and disrupts the fear consolidation to attain stable form. This might offer an effective treatment in the pathological memories, for e.g. PTSD, PD, etc. (ii) In the second study we demonstrated whether a brief single presentation of the CS will inhibit the fear recovery. Like earlier studies we also found that reactivation followed by reconsolidation douses fear return. Attenuation of fear recovery was observed in the reminder group compared to the no-reminder group. (iii) Finally, in our third study we found a statistically significant role of brain derived neurotrophic factor (BDNF) polymorphism in reconsolidation. Results of the third study affirm the involvement of BDNF variants (Met vs. Val) in the modulation of conditioned fear memory after its reactivation. In summary, we were able to show in the current thesis modulation of associative learning and recon-solidation via transcranial direct current stimulation and genetic polymorphism. N2 - Mit einer lebenslangen Prävalenz von etwa 28% (Kessler Rc, 2005) stellen Angststörungen eine der häufigsten psychischen Störungen weltweit dar. Zu den am besten untersuchten Angststörungen gehö-ren Panikstörungen (PD), posttraumatische Belastungsstörungen (PTSD), Zwangsstörungen (OCD), soziale Phobien (oder soziale Angststörungen), spezifische Phobien und generalisierte Angststörungen (GAD) (NIMH Artikel, 2009). Die klassische Konditionierung ist das seit dem letzten Jahrhundert gültige Paradigma zur Erforschung der neurobiologischen Mechanismen des Angstlernens. Bei der Behandlung von Angststörungen haben sich Konfrontationstherapien als äußerst wirksam herausgestellt. Reizüberflutung (Flooding) ist bei-spielsweise eine Form der Konfrontationstherapie, bei der der Teilnehmer einer furchteinflößenden Situation ausgesetzt und in ihr gehalten wird, bis seine Furcht vergeht. Die Konfrontationstherapie ba-siert auf dem Phänomen der Extinktion, also dem Rückgang eines konditionierten Verhaltens nach wie-derholter Präsentation eines konditionierten Stimulus (CS) ohne einen unkonditionierten Stimulus (UCS). Ein Problem der Extinktion und der Konfrontationstherapien ist, dass das Furchtgefühl nach einer erfolgreichen Extinktion zurückkehren kann, was darauf hinweist, dass eine Extinktion nicht die Spuren des Angstgedächtnisses löscht. Vieles deutet darauf, dass der Erinnerungsprozess mittels verschiedenener wissenschaftlicher Para-digmen moduliert oder unterbrochen werden kann. Hierzu gehören etwa behavioristische (z.B. Kon-frontationstherapie), pharmakologische oder nicht-invasive Interventionen (z.B. Elektrokonvulsions-therapie (ECS), transkranielle Magnetstimulation (TMS) oder transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS)). Da die Modulation von Erinnerungsprozessen nach einer Reaktivierung oder durch eine nicht-invasive Stimulation derzeit noch unzureichend erforscht ist, wurde der Schwerpunkt der vorliegenden Studie auf diese Thematik gelegt. Ein weiteres Ziel ist es, die Wechselwirkung bestimmter Gene mit der Rekonsolidierung des Gedächtnisses zu untersuchen, also Prozesse, denen eine entscheidende Rolle für Angststörungen im Allgemeinen und Furcht-Lernen im Speziellen zugeschrieben wird. Die vorliegende Dissertation umfasst drei zentrale Ergebnisse zur konditionierten Angst: (i.) In der ers-ten Studie wurde herausgefunden, dass eine nicht-invasive, schwache Stimulation den Konsolidie-rungsprozess beeinflusst und verhindert, dass die Angstkonsolidierung eine stabile Form erreicht. Dies könnte eine neue Möglichkeit darstellen, pathologische Gedächtnisinhalte, die z.B. bei Störungen wie PTSD oder PD vorkommen, effektiv zu behandeln. (ii.) Die zweite Studie untersuchte, ob eine kurze, einfache Präsentation des CS das Wiederaufkommen von Angst hemmen kann. Ähnlich wie in früheren Studien beschrieben, fanden auch wir, dass eine Reaktivierung gefolgt von einer Rekonsolidierung die Rückkehr der Angst unterbindet. Insbesondere wurde in der Gruppe, deren Teilnehmer erneut kon-frontiert wurden (reminder), im Vergleich zur Kontroll-Gruppe (no-reminder) ein verringertes Wieder-aufkommen von Angst beobachtet. (iii.) Die dritte Studie zeigte, dass ein Polymorphismus im BDNF-Gen (Met vs Val) eine signifikante Rolle für die Rekonsolidierung und die Modulation des konditionierten Angstgedächtnisses nach seiner Reaktivierung spielt. KW - Konditionierung KW - Angststörung KW - Associative learning KW - transcranial Direct Current Stimulation (tDCS) KW - Elektrotherapie KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - Assoziatives Lernen KW - transkranielle Gleichstromstimulation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-84158 ER - TY - THES A1 - Eißler, Christoph Marcel T1 - Assessment of the left ventricular systolic and diastolic function in rats using electrocardiogram-gated cardiac positron emission tomography T1 - Bestimmung der linksventrikulären systolischen und diastolischen Funktion in Ratten durch Elektrokardiogramm-getriggerte kardiale Positronen-Emissions-Tomographie N2 - DD is a cardiac disturbance, which has gained increasing importance in recent years due to its important role in different cardiac disease and cardiomyopathies including ischemic cardiomyopathy, arterial hypertension and diabetic cardiomyopathy. ECG-gated 18F-FDG PET is an imaging technique, that can distinguish between districts of myocardial viability and myocardial scars and further provides information of great interest on the efficacy of experimental approaches designed to improve the cardiac function and/or myocardial metabolism in experimental small animal models. However, ECG-gated 18F-FDG PET is a technique whose feasibility in the assessment of the LV diastolic function in small animals has not been a subject of study. In this thesis, the ability of the ECG-gated 18F-FDG PET for the assessment of both the systolic and diastolic function in eight control rats and in seven ZDF rats, which are an experimental animal model mimicking T2DM conditions and diabetic related complications in humans including DCM, has been investigated The ECG-gated 18F-FDG PET imaging was performed under hyperinsulinemic-euglycemic clamping and the data were stored in list mode files and retrospectively reconstructed. The systolic and diastolic parameters were achieved from the time/volume and the time/filling curve calculated from the software HFV. Additionally, the influence of the number of gates per cardiac cycle on the LV volumes and function parameters has been studied. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp procedure and blood glucose measurement did confirm the development of a manifest diabetes in the ZDF rats at the timepoint of the experiments. Regarding the systolic parameters, no significant difference could be detected between the ZDF and ZL rats. The values for the CO were similar in both groups, which demonstrates a similar LV systolic function in the ZDF and the ZL rats at the age of 13 weeks. Values for the systolic parameters are in good line with previous PET, MRI and cardiac catheterization-based studies in diabetic rats. The main finding of this study was that by using in vivo ECG-gated 18F-FDG PET and the software HFV, reliable diastolic parameters could be calculated. Moreover, it was possible to detect the presence of a mild impaired diastolic filling in the ZDF rats in absence of any systolic alteration. This impaired diastolic function in an early stage of diabetes could also be detected by other investigators, who used echocardiography or cardiac catheterization. Therefore, this is the first study showing, that the assessment of the diastolic function in rats can be carried out by ECG-gated 18F-FDG PET imaging. In conclusion, additionally to calculating LV volumes and LV EF, ECG-gated 18F-FDG PET can evaluate the diastolic function of healthy and diabetic rats and is able to detect a DD in ZDF rats. N2 - Die DD ist eine Störung der Herzdynamik, welche, aufgrund ihrer Beteiligung in verschiedenen Herzerkrankungen und Kardiomyopathien wie der ischämischen Kardiomyopathie, der arteriellen Hypertonie und der diabetischen Kardiomyopathie, in den letzten Jahren zunehmend in das Interessenzentrum der Herzforschung gerückt ist. Die EKG-getriggerte 18F-FDG PET ist eine Bildgebungsmethode, welche die Unterscheidung von vitalem Myokard und Narben ermöglicht und zusätzlich noch in der Lage ist, wichtige Informationen zu erheben, welche von Bedeutung für die Beurteilung von experimentelle Behandlungen zur Verbesserung der Herzfunktion und/oder des kardialen Stoffwechsels in präklinischen Tiermodellen sind. Trotz dieser Möglichkeiten wurde bisher noch nicht die Fähigkeit der EKG-getriggerten 18F-FDG PET zur Bestimmung der LV diastoischen Funktion in Kleintiermodellen untersucht. Deshalb wurde in dieser Arbeit das Potential der EKG-getriggerten 18F-FDG PET in Bezug auf die Bestimmung der LV systolischen und diastolischen Funktion in acht Kontrollratten (ZL) und sieben ZDF-Ratten, welche eine experimentelles Tiermodell für T2DM und die damit verbundenen Komplikationen einschließlich der diabetischen Kardiomyopathie sind, untersucht. Die EKG-getriggerte 18F-FDG PET wurde unter der hyperinsulinämischen euglykämischen Klemm Methode durchgeführt, die Daten in „list-mode“ Dateien gespeichert und retrospektiv rekonstruiert. Die Berechnung der LV systolischen und diastolischen Parameter erfolge aus der Zeit-Volumen-Kurve und der Zeit-Füllungs-Kurve durch das Programm HFV. Zudem wurde der Einfluss der pro Rekonstruktion verwendeten „frames“ pro kardialen Zyklus auf die LV Volumina und die linksventrikulären Funktionsparameter untersucht. Durch die hyperinsulinämische euglykämische Klemm Methode und durch Blutglukose Messungen konnte die Entwicklung eines manifesten Diabetes zum Zeitpunkt der Experimente in den ZDF Ratten nachgewiesen werden. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den systolischen Parametern der ZDF und der ZL Ratten gefunden werden. Der kardiale Auswurf war nahezu identisch in den beiden Gruppen zum Zeitpunkt der Experimente, was eine vergleichbare systolische Funktion in beiden Gruppen demonstriert. Die erhobenen Werte für die systolischen Parameter befinden sich in guter Übereinstimmung mit den Werten der Literatur von vorherigen PET, MRT und Katheter-gestützten Experimenten in diabetischen Rattenmodellen. Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Erhebung von verlässlichen diastolischen Parametern durch den kombinierten Einsatz von EKG-getriggerter 18F-FDG PET und HFV. Zudem war es möglich, eine gestörte diastolische Füllung des LV in den ZDF Ratten nachzuweisen, in Abwesenheit von systolischen Funktionseinschränkungen. Eine Beeinträchtigung der diastolischen Funktion in der frühen Phase des Diabetes wurde bereits in anderen Rattenstudien mittels Echokardiografie und Katheter basierten Untersuchungen gezeigt. Dennoch ist dies hier die erste Studie, welche demonstriert, dass die Bestimmung der diastolischen Funktion auch mit Hilfe der EKG-getriggerten 18F-FDG PET durchgeführt werden kann. In Zusammenfassung lässt sich festhalten, das zusätzlich zu der Bestimmung der LV-Volumina und der LVEF durch EKG-getriggerten 18F-FDG PET auch die Bestimmung der diastolischen Funktion in gesunden und diabetischen Ratten möglich ist und dass durch EKG-getriggerten 18F-FDG PET die Identifikation einer DD in ZDF Ratten möglich ist. KW - Positronen-Emissions-Tomografie KW - preclinical PET KW - ECG-gated PET KW - diastolic dysfunction KW - diabetic cardiomyopathy KW - HFpEF Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219765 ER - TY - THES A1 - Liaqat, Anam T1 - Artificial Evolution of Nucleic Acid Catalysts and their Use for Studying RNA T1 - Artifizielle Evolution von katalytischen Nucleinsäuren und deren Anwendung für die Untersuchung von RNA N2 - RNA molecules play diverse roles in biological systems. Post-transcriptional RNA modifications and dynamic structures enhance the functional diversity of RNA. A prerequisite for studying their biological significance is the availability of reliable methods for the detection of RNA modifications and structures. Several promising approaches have been developed in the last few decades; however, efficient, and versatile tools are still required to study the dynamic features of RNA. This thesis focuses on the development of nucleic acid catalysts as a tool to address the current needs in studying RNA. The major part of this thesis aimed at the development of deoxyribozymes as a tool for the detection of RNA modifications. Using in vitro selection from a random DNA library, we found deoxyribozymes that are sensitive to N 6 -isopentenyladenosine (i6A), a native tRNA modification and structural analogue of m6A. The in vitro evolution identified three classes of DNA enzymes: AA, AB08, and AC17 DNAzymes that showed distinct response to i6A modification and showed strong discrimination between structural analogues, i.e., m6A and i6A. In the continuation of the project, we attempted to develop RNA-cleaving deoxyribozymes that differentially respond to monomethylated cytidine isomers, 3-methylcytidine (m3C), N4 - methylcytidine (m4C), and 5-methylcytidine (m5C). Several deoxyribozymes were identified from in vitro selection, which are selective for a specific methylated cytidine isomer. The characterization of AL112, AM101, AN05, and AK104 catalysts confirmed the successful evolution of modification-specific and general deoxyribozymes that showed a broad substrate scope. In order to accelerate the DNAzymes discovery, a high throughput sequencing method (DZ-seq) was established that directly quantifies the RNA cleavage activity and cleavage site from deep sequencing data. The libraries contained information about cleavage status, cleavage site and sequence of deoxyribozymes and RNA substrate. The fraction cleaved (FC) data obtained from Dz-seq was validated for a subset of deoxyribozmes using conventional gel based kinetic assay and showed a good linear correlation (R2 = 0.91). Dz-seq possesses a great potential for the discovery of novel deoxyribozymes for the analysis of various RNA modifications in the future. The second objective of the current study was the development of structure-specific RNA labeling ribozymes. Here, we attempted to develop ribozymes that targets RNA of interest by structure-specific interaction rather than base-pairing and focused on a specific RNA G-quadruplex as the target. Two subsequent selection experiments led to the identification of the adenylyltransferase ribozymes AO10.2 and AR9. The partial characterization of these catalysts showed that A010.2 was unable to recognize intact BCL2 structure, but it turned out as the first reported trans-active ribozyme that efficiently labeled uridine in a defined substrate RNA hybridized to the ribozyme. The other ribozyme AR9 was shown to serve as a trans-active, self-labeling ribozyme that catalyzed adenylyl transferase reaction in the presence of the intact BCL2 sequence. Based on these preliminary findings, we envision that AR9 could potentially serve as a reporter RNA by self-labeling in the presence of an RNA G-quadruplex. However, both AO10.2 and AR9 still require more detailed characterization for their potential applications. N2 - RNA hat zahlreiche Funktionen in verschiedensten biologischen Systemen. Sowohl posttranskriptionelle Modifikationen als auch die Dynamik der dreidimensionalen Struktur von RNA trägt zu deren funktionalen Diversität bei. Eine Voraussetzung, um die biologische Bedeutung von RNA genauer zu untersuchen, ist die Verfügbarkeit zuverlässiger Methoden zur Detektion von RNA-Modifikationen und -Strukturen. In den letzten Jahrzenten wurden hierfür zahlreiche vielversprechende Ansätze entwickelt und berichtet. Allerdings besteht weiterhin der Bedarf an effizienten und vielseitig einsetzbaren Hilfsmitteln, um die Dynamik von RNA weiter zu erforschen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung von Nucleinsäure basierten Katalysatoren, die in Zukunft als Werkzeug zur Untersuchung von RNA eingesetzt werden können. Der Großteil dieser Arbeit strebte die Entwicklung von Desoxyribozymen als Werkzeug für die Detektion von RNA-Modifikation an. Vor kurzem wurden m6A-sensitive DNA-Enzyme berichtet, die RNA schneiden können und damit Auskunft über deren Methylierungs-Status geben können. Diese sind auch in der Lage m6A in natürlichen RNAs wie lncRNAs und C/D box snoRNAs zu detektieren. Allerdings fehlen detaillierten strukturelle und mechanistische Erkenntnissen darüber, wie Desoxyribozyme solche Modifikationen detektieren. Deshalb ist es noch nicht möglich bereits vorhandene DNA-Enzyme umzuarbeiten, damit diese auch andere RNA-Modifikationen erkennen können. Aus diesem Grund fokussierten wir uns hier auf die Entwicklung neuer DNA-Enzyme für die Detektion von RNA-Modifikationen über m6A hinaus. Mit Hilfe von in vitro Selektion konnten wir ausgehend von einer randomisierten DNA-Bibliothek, Desoxyribozyme finden, die sensitiv gegenüber N6-Isopentenyladenosin (i6A) sind. Bei dieser Modifikation handelt es sich um ein strukturelles Analogon von m6A, die natürlicherweise in tRNA vorkommt. Als Ergebnis der in vitro Selektion konnten drei Klassen an DNA-Enzymen identifiziert werden: AA, AB08 und AC17 Desoxyribozyme. AA DNA-Enzyme spalteten unmodifizierte RNA und wurden durch i6A stark inhibiert. AB08 schnitten i6A-modifizierte RNA signifikant schneller als unmodifizierte RNA. Im Gegensatz hierzu zeigte AC17 ein einzigartiges Verhalten, indem es die Schneide-Position innerhalb der RNA um ein Nukleotid Richtung 5‘-Ende verschob, wenn eine i6A-Modifikation vorhanden war. Des weiteren konnten alle drei Klassen an DNA-Enzymen eindeutig zwischen m6A und i6A unterscheiden. Im weiteren Verlauf des Projektes strebten wir an RNA-schneidente Desoxyribozyme zu entwickeln, die die mono-methylierten Cytidin-Isomere 3-Methylcytidin (m3C), N4-Methylcytidin (m4C) und 5-Methylcytidine (m5C) voneinander unterscheiden können. Um vielseitigere DNA-Enzyme zu erhalten, benutzten wir RNA-Substrate, die ein randomisiertes Nukleotid in 5‘-Richtung neben dem methylierten Cytidin besaßen. Mehrere Desoxyribozyme konnten identifiziert werden, die selektiv und spezifisch für eines der methylierten Cytidin Isomere waren. Die Charakterisierung der DNA-Enzyme AL112, AM101, AN05 und AK104 bestätigte die erfolgreiche Evolution von einerseits modifikations-spezifischen sowie aber auch generellen DNA-Enzymen, die einen großen Substrat-Bereich abdecken. Zudem konnte gezeigt werden, dass AL112, AN05 und AK104 als programmierbare Werkzeuge zur Bestätigung von m3C- und m5C-Modifikationen in menschlicher mitochondrialen tRNA eingesetzt werden können. Um die Entdeckung von DNA-Enzymen weiter zu beschleunigen, wurde eine Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode (DZ-seq) entwickelt. Diese nutzt die Sequenzierungsdaten, um direkt die Schneideaktivität einzelner Desoxyribozyme zu quantifizieren sowie die genaue Stelle der RNA-Spaltung festzustellen. Illumina Sequenzierungsbibliotheken wurden ausgehend von aktiven DNA-Pools hergestellt, welche an bestimmte RNA-Substrate ligiert wurden. Nachdem die Schneide-Reaktion stattgefunden hatte, wurden sowohl die geschnittenen als auch die ungeschnittenen Fraktionen mit Hilfe von Poly(A)-Polymerase verlängert, woraufhin eine reverse Transkription mit Oligo-dT Primern folgte. Zu diesem Zeitpunkt beinhalteten die Bibliotheken bereits Informationen über den Schneide-Status, die exakte Schnittstelle innerhalb der RNA sowie über die Sequenzen des entsprechenden DNA-Enzyms und der Substrat-RNA. Die Daten, die durch Dz-Seq über die Schneideaktivität der einzelnen Desoxyribozyme erhalten wurden, wurde für einen Teil der Enzyme anhand konventioneller, gel-basierter kinetischer Assays validiert. Diese zeigten eine gute lineare Korrelation (R2 = 0.91). Interessanterweise zeigte Dz-Seq aber nur eine schwache Korrelation zwischen der Schneideaktivität und der Häufigkeit der Desoxyribozyme in der letzten Runde der in vitro Selektion. Zum Beispiel war AM301 nur zu einem geringen Anteil im DZ-seq Datensatz zu finden, war jedoch sehr aktiv. Dies ist nur ein Beispiel des großen Potentials von DZ-seq für die Entdeckung neuer DNA-Enzyme, die für die zukünftige Analyse zahlreicher RNA-Modifikationen angewendet werden könnten. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung von Ribozymen, die spezifisch eine Ziel-RNA anhängig von deren Struktur markieren können. Die Inspiration hierfür stammt von den kürzlich berichteten Ribozymen FH14 und FJ1. Hierbei handelt es sich um Ribozyme, die über Watson-Crick-Basenpaarung ihre Ziel-RNA erkennen und diese dann sequenz-spezifisch markieren. Unser Ziel war es nun Ribozyme zu entwickeln, die ihre Ziel-RNA über Struktur-spezifische Wechselwirkungen anstelle von Basenpaarung erkennen. Hierbei fokussierten wir uns auf einen RNA G-Quadruplex als entscheidendes Strukturelement. Bei der in vitro Selektion wurde eine RNA Bibliothek verwendet, die kovalent an ein Fragment der 5‘-UTR der BCL2 RNA gebunden war. Von dieser RNA ist bekannt, dass sie einen G-Quadruplex formt. Zwei aufeinanderfolgende Selektionen führten zur Identifikation der Adenylyltransferasen AO10.2 und AR9. Die vorläufige Charakterisierung dieser beiden Ribozyme zeigte, dass AO10.2 die intakte BCL2-Struktur nicht erkennen kann. Stattdessen stellte sich heraus, dass dies das erste trans-aktive Ribozym ist, das effizient Uridin markieren kann, welches sich in einer definierten RNA-Struktur befindet, die mit dem Ribozym hybridisiert ist. Demnach hat es großes Potential als Werkzeug für die spezifische Markierung von RNA eingesetzt werden zu können. Beim zweiten Ribozym AR9 stellte sich heraus, dass es sich um ein trans-aktives, selbst-markierendes RNA-Enzym handelt, welches die gewünschte Reaktion nur bei Vorhandensein der intakten BCL2-Sequenz katalysiert. Basierend auf diesen vorläufigen Ergebnissen könnte AR9 als Reporter-RNA dienen, die sich RNA G-Quadruplexes selbst markiert. Allerdings benötigen sowohl AO10.2 als auch AR9 noch eine detailliertere Charakterisierung, bevor sie für potenzielle Anwendungen eingesetzt werden können. KW - Deoxyribozymes KW - Ribozymes KW - RNA modifications KW - RNA structures KW - RNA G-quadruplex Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-283111 ER - TY - THES A1 - Kuklovsky [former Finke], Valerie T1 - Are some bees smarter than others? An examination of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees T1 - Sind manche Bienen schlauer als andere? Eine Untersuchung von konsistenten individuellen Unterschieden in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen N2 - Cognition refers to the ability to of animals to acquire, process, store and use vital information from the environment. Cognitive processes are necessary to predict the future and reduce the uncertainty of the ever-changing environment. Classically, research on animal cognition focuses on decisive cognitive tests to determine the capacity of a species by the testing the ability of a few individuals. This approach views variability between these tested key individuals as unwanted noise and is thus often neglected. However, inter-individual variability provides important insights to behavioral plasticity, cognitive specialization and brain modularity. Honey bees Apis mellifera are a robust and traditional model for the study of learning, memory and cognition due to their impressive capabilities and rich behavioral repertoire. In this thesis I have applied a novel view on the learning abilities of honey bees by looking explicitly at individual differences in a variety of learning tasks. Are some individual bees consistently smarter than some of her sisters? If so, will a smart individual always perform good independent of the time, the context and the cognitive requirements or do bees show distinct isolated ‘cognitive modules’? My thesis presents the first comprehensive investigation of consistent individual differences in the cognitive abilities of honey bees. To speak of an individual as behaving consistently, a crucial step is to test the individual multiple times to examine the repeatability of a behavior. I show that free-flying bees remain consistent in a visual discrimination task for three consecutive days. Successively, I explored individual consistency in cognitive proficiency across tasks involving different sensory modalities, contexts and cognitive requirements. I found that free-flying bees show a cognitive specialization between visual and olfactory learning but remained consistent across a simple discrimination task and a complex concept learning task. I wished to further explore individual consistency with respect to tasks of different cognitive complexity, a question that has never been tackled before in an insect. I thus performed a series of four experiments using either visual or olfactory stimuli and a different training context (free-flying and restrained) and tested bees in a discrimination task, reversal learning and negative patterning. Intriguingly, across all these experiments I evidenced the same results: The bees’ performances were consistent across the discrimination task and reversal learning and negative patterning respectively. No association was evidenced between reversal learning and negative patterning. After establishing the existence of consistent individual differences in the cognitive proficiency of honey bees I wished to determine factors which could underlie these differences. Since genetic components are known to underlie inter-individual variability in learning abilities, I studied the effects of genetics on consistency in cognitive proficiency by contrasting bees originating from either from a hive with a single patriline (low genetic diversity) or with multiple patrilines (high genetic diversity). These two groups of bees showed differences in the patterns of individually correlated performances, indicating a genetic component accounts for consistent cognitive individuality. Another major factor underlying variability in learning performances is the individual responsiveness to sucrose solution and to visual stimuli, as evidenced by many studies on restrained bees showing a positive correlation between responsiveness to task relevant stimuli and learning performances. I thus tested whether these relationships between sucrose/visual responsiveness and learning performances are applicable for free-flying bees. Free-flying bees were again subjected to reversal learning and negative patterning and subsequently tested in the laboratory for their responsiveness to sucrose and to light. There was no evidence of a positive relationship between sucrose/visual responsiveness and neither performances of free-flying bees in an elemental discrimination, reversal learning and negative patterning. These findings indicate that relationships established between responsiveness to task relevant stimuli and learning proficiency established in the laboratory with restrained bees might not hold true for a completely different behavioral context i.e. for free-flying bees in their natural environment. These results show that the honey bee is an excellent insect model to study consistency in cognitive proficiency and to identify the underlying factors. I mainly discuss the results with respect to the question of brain modularity in insects and the adaptive significance of individuality in cognitive abilities for honey bee colonies. I also provide a proposition of research questions which tie in this theme of consistent cognitive proficiency and could provide fruitful areas for future research. N2 - Unter Kognition versteht man die Fähigkeit von Tieren, essenzielle Informationen aus der Umwelt zu erfassen, zu verarbeiten, zu speichern und zu nutzen. Kognitive Prozesse sind notwendig, um die Zukunft vorherzusagen und die Unvorhersehbarkeit der sich ständig verändernden Umwelt zu verringern. Die Forschung der Kognition von Tieren konzentriert sich klassischerweise auf entscheidende kognitive Tests, um die Fähigkeit einer Spezies anhand der Leistungen einiger weniger Individuen zu bestimmen. Bei diesem Ansatz wird die Variabilität zwischen Individuen als unerwünschtes Rauschen betrachtet und daher vernachlässigt. Die interindividuelle Variabilität liefert jedoch wichtige Erkenntnisse über die Plastizität des Verhaltens, die kognitive Spezialisierung und die Modularität des Gehirns. Die Honigbiene Apis mellifera ist aufgrund ihrer eindrucksvollen Fähigkeiten und ihres reichen Verhaltensrepertoires ein robuster und traditioneller Modellorganismus für die Untersuchung von Lernen, Gedächtnis und Kognition. In dieser Arbeit habe ich das Lernverhalten von Honigbienen in einem neuen Blickwinkel betrachtet, indem ich explizit die individuellen Unterschiede bei diversen Lernaufgaben untersucht habe. Zeigen manche Bienen durchweg eine erhöhte Lernleistung im Vergleich zu ihren Schwestern? Wenn ja, erbringt ein Individuum unabhängig von der Zeit, dem Kontext und den kognitiven Anforderungen der Lernaufgaben immer gute Leistungen, oder zeigen Bienen ausgeprägte unabhängige "kognitive Module"? Die vorliegende Doktorarbeit stellt die erste umfassende Untersuchung konsistenter individueller Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Honigbienen dar. Um von einem konsistenten Verhalten sprechen zu können, ist es entscheidend das Individuum mehrfach zu testen, um die Wiederholbarkeit eines Verhaltens zu untersuchen. Ich konnte zeigen, dass frei fliegende Bienen bei einer visuellen Unterscheidungsaufgabe an drei aufeinanderfolgenden Tagen eine konsistente Lernleistung zeigen. Im Anschluss untersuchte ich die individuelle Konsistenz der kognitiven Fähigkeiten bei Lernaufgaben mit unterschiedlichen sensorischen Modalitäten, Kontexten und kognitiven Anforderungen. Frei fliegende Bienen zeigten eine kognitive Spezialisierung zwischen visuellem und olfaktorischem Lernen, während sie bei einer einfachen Unterscheidungsaufgabe und einer komplexen Konzeptlernaufgabe konsistent im Lernverhalten blieben. Anschließend wollte ich die individuelle Konsistenz im Lernverhalten bei Aufgaben unterschiedlicher kognitiver Komplexität weiter erforschen, eine Frage, die bisher noch nie bei einem Insekt behandelt wurde. Ich führte dazu eine Reihe von vier Experimenten durch, bei denen entweder visuelle oder olfaktorische Stimuli und ein unterschiedlicher Trainingskontext (frei fliegend oder eingespannt) verwendet wurden. Die Bienen wurden in einer Unterscheidungsaufgabe, einer Umlernaufgabe und in Negative Patterning getestet. Erstaunlicherweise wurden bei diesen Experimenten die gleichen Ergebnisse festgestellt: Die Lernleitung der Bienen in der Unterscheidungsaufgabe zeigte eine positive Korrelation mit der Lernleistung im Umlernen und Negative Patterning. Zwischen dem Umkehrlernen und Negative Patterning konnte jedoch kein Zusammenhang festgestellt werden. Nachdem ich festgestellt hatte, dass es konsistente individuelle Unterschiede in den kognitiven Fähigkeiten von Bienen gibt, wollte ich die Faktoren ermitteln, die diesen Unterschieden zugrunde liegen könnten. Es war bereits bekannt, dass genetische Komponenten der interindividuellen Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegen. Deshalb untersuchte ich den Einfluss von genetischer Vielfalt auf die Beständigkeit von kognitiven Fähigkeiten, indem ich Bienen gegenüberstellte, die entweder aus einem Bienenstock mit einer einzigen Patriline (geringe genetische Vielfalt) oder mit mehreren Patrilinen (hohe genetische Vielfalt) stammten. Diese beiden Gruppen von Bienen wiesen Unterschiede in den Mustern der individuellen korrelierten Lernleistungen auf, was darauf hindeutet, dass eine genetische Komponente für kognitive Individualität verantwortlich ist. Ein weiterer wichtiger Faktor, welcher der Variabilität im Lernverhalten zugrunde liegt, ist die individuelle Reaktionsfähigkeit auf Saccharose Lösungen und auf visuelle Stimuli. Dies wurde durch viele Studien an eingespannten Bienen gezeigt, die eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Reize und den Lernfähigkeiten feststellten. Ich habe daher untersucht, ob diese Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und visuellen Stimuli und den Lernleistungen auch für frei fliegende Bienen zutreffen. Die individuellen Lernleistungen im Umlernen und Negative patterning von frei fliegenden Bienen wurden erneut ermittelt und anschließend wurde im Labor die Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht getestet. Es gab keine Hinweise auf eine positive Korrelation zwischen der Reaktionsfähigkeit auf Saccharose und Licht und den Lernleistungen von frei fliegenden Bienen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Beziehungen zwischen der Reaktionsfähigkeit auf aufgabenrelevante Stimuli und der Lernleistung, die im Labor mit eingespannten Bienen festgestellt wurden, möglicherweise nicht für einen anderen Verhaltenskontext gelten, d. h. für frei fliegende Bienen in ihrer natürlichen Umgebung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Honigbiene ein hervorragendes Insektenmodell ist, um die Konsistenz kognitiver Fähigkeiten zu untersuchen und die zugrunde liegenden Faktoren zu ermitteln. Ich diskutiere die Ergebnisse vor allem im Hinblick auf die Frage der Modularität des Gehirns bei Insekten und die adaptive Bedeutung von individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten für Honigbienenvölker. Ich schlage auch Forschungsfragen vor, die mit individuellen konsistenten kognitiven Fähigkeiten zusammenhängen und wertvolle Bereiche für künftige Forschungen darstellen könnten. KW - Lernen KW - Biene KW - Kognition KW - Individual differences KW - Cognitive consistency KW - Cognitive profile KW - Learning KW - Honeybee KW - Cognition Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323012 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Christin Marliese T1 - Approaching antimicrobial resistance – Structural and functional characterization of the fungal transcription factor Mrr1 from Candida albicans and the bacterial ß-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from Mycobacterium tuberculosis T1 - Auf den Spuren der antimikrobiellen Resistenz – Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Transkriptionsfaktors Mrr1 aus Candida albicans und der bakteriellen β-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 aus Mykobakterium tuberculosis N2 - The number of fungal infections is rising in Germany and worldwide. These infections are mainly caused by the opportunistic fungal pathogen C. albicans, which especially harms immunocompromised people. With increasing numbers of fungal infections, more frequent and longer lasting treatments are necessary and lead to an increase of drug resistances, for example against the clinically applied therapeutic fluconazole. Drug resistance in C. albicans can be mediated by the Multidrug resistance pump 1 (Mdr1), a membrane transporter belonging to the major facilitator family. However, Mdr1-mediated fluconazole drug resistance is caused by the pump’s regulator, the transcription factor Mrr1 (Multidrug resistance regulator 1). It was shown that Mrr1 is hyperactive without stimulation or further activation in resistant strains which is due to so called gain of function mutations in the MRR1 gene. To understand the mechanism that lays behind this constitutive activity of Mrr1, the transcription factor should be structurally and functionally (in vitro) characterized which could provide a basis for successful drug development to target Mdr1-mediated drug resistance caused by Mrr1. Therefore, the entire 1108 amino acid protein was successfully expressed in Escherichia coli. However, further purification was compromised as the protein tended to form aggregates, unsuitable for crystallization trials or further characterization experiments. Expression trials in the eukaryote Pichia pastoris neither yielded full length nor truncated Mrr1 protein. In order to overcome the aggregation problem, a shortened variant, missing the N-terminal 249 amino acids named Mrr1 ‘250’, was successfully expressed in E. coli and could be purified without aggregation. Similar to the wild type Mrr1 ‘250’, selected gain of function variants were successfully cloned, expressed and purified with varying yields and with varying purity. The Mrr1 `250’ construct contains most of the described regulatory domains of Mrr1. It was used for crystallization and an initial comparative analysis between the wild type protein and the variants. The proposed dimeric form of the transcription factor, necessary for DNA binding, could be verified for both, the wild type and the mutant proteins. Secondary structure analysis by circular dichroism measurements revealed no significant differences in the overall fold of the wild type and variant proteins. In vitro, the gain of function variants seem to be less stable compared to the wild type protein, as they were more prone to degradation. Whether this observation holds true for the full length protein’s stability in vitro and in vivo remains to be determined. The crystallization experiments, performed with the Mrr1 ‘250’ constructs, led to few small needle shaped or cubic crystals, which did not diffract very well and were hardly reproducible. Therefore no structural information of the transcription factor could be gained so far. Infections with M. tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, are the leading cause of mortality among bacterial diseases. Especially long treatment times, an increasing number of resistant strains and the prevalence of for decades persisting bacteria create the necessity for new drugs against this disease. The cholesterol import and metabolism pathways were discovered as promising new targets and interestingly they seem to play an important role for the chronic stage of the tuberculosis infection and for persisting bacteria. In this thesis, the 3-ketoacyl-CoA thiolase FadA5 from M. tuberculosis was characterized and the potential for specifically targeting this enzyme was investigated. FadA5 catalyzes the last step of the β-oxidation reaction in the side-chain degradation pathway of cholesterol. We solved the three dimensional structure of this enzyme by X-ray crystallography and obtained two different apo structures and three structures in complex with acetyl-CoA, CoA and a hydrolyzed steroid-CoA, which is the natural product of FadA5. Analysis of the FadA5 apo structures revealed a typical thiolase fold as it is common for biosynthetic and degradative enzymes of this class for one of the structures. The second apo structure showed deviations from the typical thiolase fold. All obtained structures show the enzyme as a dimer, which is consistent with the observed dimer formation in solution. Thus the dimer is likely to be the catalytically active form of the enzyme. Besides the characteristic structural fold, the catalytic triad, comprising two cysteines and one histidine, as well as the typical coenzyme A binding site of enzymes belonging to the thiolase class could be identified. The two obtained apo structures differed significantly from each other. One apo structure is in agreement with the characteristic thiolase fold and the well-known dimer interface could be identified in our structure. The same characteristics were observed in all complex structures. In contrast, the second apo structure followed the thiolase fold only partially. One subdomain, spanning 30 amino acids, was in a different orientation. This reorientation was caused by the formation of two disulfide bonds, including the active site cysteines, which rendered the enzyme inactive. The disulfide bonds together with the resulting domain swap still permitted dimer formation, yet with a significantly shifted dimer interface. The comparison of the apo structures together with the preliminary activity analysis performed by our collaborator suggest, that FadA5 can be inactivated by oxidation and reactivated by reduction. If this redox switch is of biological importance requires further evaluation, however, this would be the first reported example of a bacterial thiolase employing redox regulation. Our obtained complex structures represent different stages of the thiolase reaction cycle. In some complex structures, FadA5 was found to be acetylated at the catalytic cysteine and it was in complex with acetyl-CoA or CoA. These structures, together with the FadA5 structure in complex with a hydrolyzed steroid-CoA, revealed important insights into enzyme dynamics upon ligand binding and release. The steroid-bound structure is as yet a unique example of a thiolase enzyme interacting with a complex ligand. The characterized enzyme was used as platform for modeling studies and for comparison with human thiolases. These studies permitted initial conclusions regarding the specific targetability of FadA5 as a drug target against M. tuberculosis infection, taking the closely related human enzymes into account. Additional analyses led to the proposal of a specific lead compound based on the steroid and ligand interactions within the active site of FadA5. N2 - Die Zahl der Pilzinfektionen, welche hauptsächlich durch den opportunistisch-pathogenen Pilz C. albicans verursacht werden, ist nicht nur in Deutschland, sondern weltweit steigend. Die auftretenden Infektionen betreffen vor allem immunsupprimierte Personen. Dieser Anstieg an Pilzinfektionen verursacht häufigere und immer länger andauernde Behandlungen und resultiert auch im vermehrten Auftreten von Resistenzen gegen Antimykotika, unter anderem gegen das klinisch eingesetzte Fluconazol. Eine Möglichkeit der Resistenzbildung in C. albicans ist die Expression der ‚Multidrug resistance pump 1‘ (Mdr1), einer Membranpumpe, die zur Major-Facilitator-Superfamilie zählt. Diese durch Mdr1-vermittelte Fluconazolresistenz wird durch den Mdr1 regulierenden Transkriptionsfaktor Mrr1 (‚Multidrug resistance regulator 1‘) gesteuert. In resistenten C. albicans Stämmen befindet sich Mrr1 ohne weitere Stimulation oder externe Aktivierung bereits in einem hyperaktiven Zustand, der durch Mutationen mit Funktionsgewinn im MRR1 Gen verursacht wird. Um die Mechanismen, die sich hinter der konstitutiven Aktivität von Mrr1 verbergen, zu entschlüsseln, sollte dieser Transkriptionsfaktor in vitro strukturell und funktionell charakterisiert werden. Diese Charakterisierung könnte im Anschluss genutzt werden, um Wirkstoffe gegen die von Mrr1 gesteuerte und von Mdr1-vermittelte Resistenz zu entwickeln. Zu diesem Zweck, wurde das gesamte, 1108 Aminosäuren umfassende, Protein in Escherichia coli exprimiert. Die anschließende Proteinreinigung war allerdings durch Aggregatbildung beeinträchtigt, welche Kristallisationsansätze oder eine weitere Charakterisierung dieses Proteinkonstruktes verhinderten. Im Eukaryot Pichia pastoris durchgeführte Expressionsanalysen, waren leider erfolglos und weder die Expression des Volllängen-Mrr1 noch seiner verkürzten Proteinvarianten konnte nachgewiesen werden. Um Proteinaggregation zu umgehen, wurde deshalb ein N-terminal, um 249 Aminosäuren, verkürztes Proteinkonstrukt, Mrr1 ‚250‘, in E. coli exprimiert und erfolgreich, ohne Aggregation, gereinigt. Zusätzlich zum wildtypischen Mrr1 ‚250‘ Protein wurden auch ausgewählte Varianten kloniert, exprimiert und gereinigt, allerdings mit unterschiedlicher Ausbeute und Reinheit. Da das verkürzte Mrr1 ‚250‘ Protein noch immer fast alle in der Literatur beschriebenen Regulierungsdomänen besitzt, wurde es zur Kristallisation und für einen initialen Vergleich zwischen Wildtyp und Varianten genutzt. So konnte zum Beispiel die vermutete Dimerisierung des Transkriptionsfaktors sowohl für das Wildtypprotein als auch für die Varianten gezeigt werden. Eine weiterführende Untersuchung der Sekundärstruktur mittels zirkular Dichroismus Messungen zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mutanten und dem Wildtypprotein. Allerdings erscheinen die Funktionsgewinn Varianten von Mrr1 in vitro instabiler als das Wildtypprotein, was sich durch stärkeren Abbau der Variantenproteine zeigt. Ob diese Beobachtungen allerdings vom verkürzten Protein auf das Gesamtprotein und dessen in vitro und in vivo Stabilität übertragbar sind, ist derzeit noch unklar. Kristallisationsansätze, die mit den verschiedenen Varianten des Mrr1 ‚250‘ Konstrukts durchgeführt wurden, führten zu sehr wenigen, nadelförmigen oder kubischen Kristallen, die kaum reproduzierbar waren und schlecht diffraktierten. Bisher konnten deshalb keine strukturellen Daten für den untersuchten Transkriptionsfaktor erhalten werden. Noch immer sind Infektionen, die durch M. tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose, verursacht werden die Haupttodesursache im Bereich der bakteriellen Infektionen. In diesem Zusammenhang stellen vor allem lange Behandlungszeiten, das vermehrte Auftreten resistenter Stämme und das Vorkommen persistierender Bakterien, die Jahrzehnte in ihrem Wirt überdauern können, nach wie vor große Herausforderungen dar und die Entwicklung neuer Tuberkulosemedikamente ist dringend erforderlich. Sowohl der Cholesterinimport als auch dessen Stoffwechselweg wurden als vielversprechende Wirkstoffziele identifiziert. Nicht zuletzt, da beide Mechanismen eine wichtige Rolle während der chronischen Phase der Tuberkuloseinfektion und für persistierende Bakterien zu spielen scheinen. Im Laufe dieser Arbeit wurde die 3-ketoacyl-CoA Thiolase FadA5 aus M. tuberculosis strukturell charakterisiert und auf ihre Tauglichkeit als spezifisches Wirkstoffziel hin untersucht. FadA5 katalysiert den letzten Schritt der β-Oxidation im Zuge des Seitenkettenabbaus von Cholesterin. Wir konnten die Proteinstruktur des FadA5 Proteins mittels Röntgenkristallographie ermitteln und erhielten zwei unterschiedliche apo-Strukturen sowie drei Komplexstrukturen. In den Komplexstrukturen waren entweder Acetyl-CoA, CoA oder ein hydrolisiertes Steroid-CoA, welches das natürliche Produkt von FadA5 darstellt, an das Enzym gebunden. Die Strukturanalyse der apo-Strukturen lies für eine der beiden Modelle die typische Thiolasefaltung erkennen, welche für biosynthetische und degradative Enzyme dieser Klasse üblich ist. In der zweiten apo-Struktur konnte diese Faltung nur teilweise identifiziert werden. Das Protein liegt in allen erhaltenen Strukturen als Dimer vor, was auch in Lösung beobachtet werden konnte und darauf hinweist, dass das Dimer die katalytisch aktive Form des Proteins darstellt. Neben der charakteristischen Faltung, wurde das aktive Zentrum, bestehend aus zwei Cysteinen und einem Histidin, sowie die für Thiolasen übliche Coenzym A Bindetasche identifiziert. Die erhaltenen apo-Strukturen unterschieden sich deutlich voneinander. Die zuvor beschriebene typische Dimer-Interaktionsfläche wird auch in den Komplexstrukturen beobachtet. Dahingegen war die Thiolasefaltung in der zweiten Apo-Struktur nur teilweise vorhanden, da beispielsweise eine Domäne, die 30 Aminosäuren umfasst, umorientiert vorlag. Die Bildung zweier Disulfidbrücken, welche beide katalytischen Cysteine involviert, verursachte die beschriebene Umorientierung und damit gepaart eine wahrscheinliche Inaktivität des Enzyms. Trotz der beschriebenen Umorientierung und Disulfidbrückenbildung liegt das Protein noch immer als Dimer vor, allerdings mit einer deutlich verschobenen Interaktionsfläche. Der Vergleich der beiden apo-Strukturen in Kombination mit einer vorläufigen Aktivitätsanalyse, die von unseren Kollaborationspartnern durchgeführt wurde, lassen vermuten, dass FadA5 durch Oxidation inaktiviert und durch Reduktion reaktiviert werden kann. Ob diese Redoxregulierung biologisch relevant ist, muss noch geklärt werden, allerdings wäre dies der erste beschriebene Fall einer redoxregulierten bakteriellen Thiolase. Die Komplexstrukturen stellen verschiedene Stufen der Thiolasereaktion dar. In einigen dieser Strukturen lag FadA5 am katalytischen Cystein acetyliert vor und befand sich im Komplex mit acetyl-CoA oder CoA. Durch eine weitere Struktur, in der FadA5 im Komplex mit einem hydrolisierten Steroid-CoA vorlag, konnten wichtige Einblicke in die Enzymdynamik während der Ligandenbindung und Freisetzung gewonnen werden. Die Steroid gebundene Struktur stellt derzeit ein einzigartiges Beispiel einer Thiolase im Komplex mit einem großen, mehrere Ringsysteme umfassenden Liganden dar. Das charakterisierte Enzym diente als Ausgangspunkt für Modellierungsversuche und Vergleiche mit humanen Thiolasen. Diese Analysen erlaubten initiale Schlussfolgerungen bezüglich einer Verwendung von FadA5 als spezifisches Wirkstoffziel gegen Tuberkuloseinfektionen, im Kontext verwandter humaner Enzyme. Zusätzliche Untersuchungen ermöglichten die Ausarbeitung einer spezifischen Leitsubstanz, die auf den analysierten Interaktionen zwischen dem aktiven Zentrum von FadA5 und den gebundenen Liganden basiert. KW - Multidrug-Resistenz KW - Candida albicans KW - Tuberkulose KW - Röntgenkristallographie KW - Cholesterinstoffwechsel KW - Structural Biology KW - Transcription factor KW - Thiolase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108400 ER - TY - THES A1 - Yu, Yanying T1 - Applied machine learning for the analysis of CRISPR-Cas systems T1 - Angewandtes maschinelles Lernen für die Analyse von CRISPR-Cas-Systemen N2 - Among the defense strategies developed in microbes over millions of years, the innate adaptive CRISPR-Cas immune systems have spread across most of bacteria and archaea. The flexibility, simplicity, and specificity of CRISPR-Cas systems have laid the foundation for CRISPR-based genetic tools. Yet, the efficient administration of CRISPR-based tools demands rational designs to maximize the on-target efficiency and off-target specificity. Specifically, the selection of guide RNAs (gRNAs), which play a crucial role in the target recognition of CRISPR-Cas systems, is non-trivial. Despite the fact that the emerging machine learning techniques provide a solution to aid in gRNA design with prediction algorithms, design rules for many CRISPR-Cas systems are ill-defined, hindering their broader applications. CRISPR interference (CRISPRi), an alternative gene silencing technique using a catalytically dead Cas protein to interfere with transcription, is a leading technique in bacteria for functional interrogation, pathway manipulation, and genome-wide screens. Although the application is promising, it also is hindered by under-investigated design rules. Therefore, in this work, I develop a state-of-art predictive machine learning model for guide silencing efficiency in bacteria leveraging the advantages of feature engineering, data integration, interpretable AI, and automated machine learning. I first systematically investigate the influential factors that attribute to the extent of depletion in multiple CRISPRi genome-wide essentiality screens in Escherichia coli and demonstrate the surprising dominant contribution of gene-specific effects, such as gene expression level. These observations allowed me to segregate the confounding gene-specific effects using a mixed-effect random forest (MERF) model to provide a better estimate of guide efficiency, together with the improvement led by integrating multiple screens. The MERF model outperformed existing tools in an independent high-throughput saturating screen. I next interpret the predictive model to extract the design rules for robust gene silencing, such as the preference for cytosine and disfavoring for guanine and thymine within and around the protospacer adjacent motif (PAM) sequence. I further incorporated the MERF model in a web-based tool that is freely accessible at www.ciao.helmholtz-hiri.de. When comparing the MERF model with existing tools, the performance of the alternative gRNA design tool optimized for CRISPRi in eukaryotes when applied to bacteria was far from satisfying, questioning the robustness of prediction algorithms across organisms. In addition, the CRISPR-Cas systems exhibit diverse mechanisms albeit with some similarities. The captured predictive patterns from one dataset thereby are at risk of poor generalization when applied across organisms and CRISPR-Cas techniques. To fill the gap, the machine learning approach I present here for CRISPRi could serve as a blueprint for the effective development of prediction algorithms for specific organisms or CRISPR-Cas systems of interest. The explicit workflow includes three principle steps: 1) accommodating the feature set for the CRISPR-Cas system or technique; 2) optimizing a machine learning model using automated machine learning; 3) explaining the model using interpretable AI. To illustrate the applicability of the workflow and diversity of results when applied across different bacteria and CRISPR-Cas systems, I have applied this workflow to analyze three distinct CRISPR-Cas genome-wide screens. From the CRISPR base editor essentiality screen in E. coli, I have determined the PAM preference and sequence context in the editing window for efficient editing, such as A at the 2nd position of PAM, A/TT/TG downstream of PAM, and TC at the 4th to 5th position of gRNAs. From the CRISPR-Cas13a screen in E. coli, in addition to the strong correlation with the guide depletion, the target expression level is the strongest predictor in the model, supporting it as a main determinant of the activation of Cas13-induced immunity and better characterizing the CRISPR-Cas13 system. From the CRISPR-Cas12a screen in Klebsiella pneumoniae, I have extracted the design rules for robust antimicrobial activity across K. pneumoniae strains and provided a predictive algorithm for gRNA design, facilitating CRISPR-Cas12a as an alternative technique to tackle antibiotic resistance. Overall, this thesis presents an accurate prediction algorithm for CRISPRi guide efficiency in bacteria, providing insights into the determinants of efficient silencing and guide designs. The systematic exploration has led to a robust machine learning approach for effective model development in other bacteria and CRISPR-Cas systems. Applying the approach in the analysis of independent CRISPR-Cas screens not only sheds light on the design rules but also the mechanisms of the CRISPR-Cas systems. Together, I demonstrate that applied machine learning paves the way to a deeper understanding and a broader application of CRISPR-Cas systems. N2 - Unter den Verteidigungsstrategien, welche sich über Millionen von Jahren in Mikroben entwickelt haben, hat sich das angeborene adaptive CRISPR-Cas Immunsystem in vielen Bakterien und den meisten Archaeen verbreitet. Flexibilität, Einfachheit und Spezifizität von CRISPR-Cas Systemen bilden die Grundlage für CRISPR-basierten genetischen Werkzeugen. Dennoch verlangt die effiziente Anwendung CRISPR-basierter genetischer Werkzeuge ein rationales Design, um die Effektivität zu maximieren und Spezifizität zu gewährleisten. Speziell die Auswahl an Leit-RNAs, oder auch „guide“ RNAs (gRNAs), welche eine essentielle Rolle in der Ziel-Erkennung des CRISPR-Cas Systems spielen, ist nicht trivial. Trotz aufkommender Techniken des maschinellen Lernens, die mit Hilfe von Vorhersage-Algorithmen eine Unterstützung im gRNA-Design darstellen, sind die Design-Regeln für viele CRISPR-Cas Systeme schlecht definiert und die breite Anwendung dadurch bisher gehindert. CRISPR Interferenz (CRISPRi), eine Methode der Genrepression, nutzt ein katalytisch inaktives Cas-Protein, um die Gen-Transkription zu verhindern und ist eine führende Technik für Gen-Funktionsstudien, der Manipulation von Stoffwechselwegen und genomweiter Screens in Bakterien. Auch wenn viele der Anwendungen vielversprechend sind, ist die Umsetzung aufgrund der wenig untersuchten Design-Regeln schwierig. Daher entwickele ich in dieser Arbeit ein hochmodernes auf maschinellem Lernen basierendes Modell für die Vorhersage der gRNA Genrepressions-Effizienz in Bakterien, wobei die Merkmalskonstruktion, Datenintegration, interpretierbare künstliche Intelligenz (KI) und automatisiertes maschinelles Lernen genutzt wurden. Zuerst untersuche ich systematisch die Einflussfaktoren, welche zum Ausmaß der Depletion in genomweiten CRISPRi-Screens zur Gen-Essentialität in Escherichia coli beitragen und demonstriere den überraschend dominanten Beitrag genspezifischer Effekte, wie z. B. dem Genexpressionslevel. Diese Beobachtungen erlaubten mir die genspezifischen Störvariablen mit einem sogenannten mixed-effect random forest (MERF) Modell zu segregieren, um eine bessere Einschätzung der gRNA Effizienz zu erreichen und durch die Integration zusätzlicher Screen-Daten noch weiter zu verbessern. Das MERF Modell übertraf dabei bereits existierende Werkzeuge in einem unabhängigen Hochdurchsatz Sättigungs-Screen. Als nächstes interpretiere ich die Modell Vorhersage, um Design-Regeln für eine solide Genrepression zu extrahieren, wie z. B. eine Präferenz für Cytosin und eine Abneigung gegenüber Guanin und Thymin innerhalb und der „protospacer adjacent motif“ (PAM) direkt umgebenden Sequenz. Weiterhin integrierte ich das MERF Modell in einem Web-basierten Werkzeug, welches unter www.ciao.helmholtz-hiri.de frei zugänglich ist. Ein Vergleich von existierenden Werkzeugen mit dem MERF Modell zeigt, dass alternative, für CRISPRi in Eukaryoten optimierte, gRNA Design-Werkzeuge schlecht abschneiden, sobald sie in Bakterien angewandt werden. Dies lässt Zweifel an einer robusten Übertragbarkeit dieser Vorhersage-Algorithmen zwischen verschiedenen Organismen. Zusätzlich haben CRISPR-Cas Systeme, trotz einiger genereller Gemeinsamkeiten, höchst diverse Wirkungsmechanismen. Die Vorhersagemuster eines Datensets sind daher schlecht generalisierbar, sobald sie auf andere Organismen oder CRISPR-Cas Techniken angewandt werden. Diese Lücke kann mit dem hier präsentierten Ansatz des maschinellen Lernens für CRISPRi geschlossen werden und als eine Vorlage für die Entwicklung effektiver Vorhersage-Algorithmen für spezifische Organismen oder CRISPR-Cas Systeme dienen. Der explizite Arbeitsablauf beinhaltet drei Hauptschritte: 1) Aufnehmen des Merkmalsets des jeweiligen CRISPR-Cas Systems bzw. der CRISPR-Cas Technik; 2) Optimierung des maschinellen Lernen Modells durch automatisiertes maschinelles Lernen; 3) Erklärung des Modells mit interpretierbarer KI. Um die Anwendbarkeit des Arbeitsablaufs und die Diversität der Ergebnisse, im Zusammenhang mit unterschiedlichen Organismen und CRISPR-Cas Systemen, zu demonstrieren, habe ich diese Arbeitsschritte zur Analyse drei unterschiedlicher genomweiter Screens angewandt. Von dem CRISPR „base editor“ Essentialitäts-Screen in E. coli, konnten die PAM Präferenzen und der Sequenzkontext innerhalb des Editierungsfensters für eine effiziente Editierung abgeleitet werden. Beispielsweise tragen ein A an der zweiten PAM Position, ein A/TT/TG an der PAM direkt nachgeschalten Position und ein TC an der vierten oder fünften gRNA Position zur effizienten Editierung bei. Im CRISPR-Cas13a Screen in E. coli, stellten wir eine starke Korrelation zwischen dem Genexpressionslevel und der gRNA-Depletion fest. Zusätzlich ist das Expressionslevel des Ziel-Gens der stärkste Vorhersagefaktor des Modells, was das Expressionslevel als Hauptdeterminante für die Cas13-induzierte Immunität hervorhebt und die bessere Charakterisierung von CRISPR-Cas13 Systemen ermöglicht. Aus dem CRISPR-Cas12a Screen in Klebsiella pneumoniae, habe ich gRNA Design Regeln für die robuste antimikrobielle Aktivität über unterschiedliche K. pneumoniae Stämme hinweg extrahiert und einen Vorhersage-Algorithmus für das gRNA Design bereitgestellt. Dies ermöglicht die Nutzung von Cas12a als eine alternative Lösung, um Antibiotikaresistenzen zu bekämpfen. Zusammengefasst präsentiert diese Thesis einen akkuraten Vorhersage-Algorithmus für die CRISPRi gRNA Effizienz in Bakterien und gibt Einblicke in die Determinanten für eine effiziente Genrepression und optimales gRNA Design. Die systematische Exploration führte zu einem robusten Ansatz des maschinellen Lernens für effektive Modell Entwicklungen in unterschiedlichen bakteriellen Spezies und CRISPR-Cas Systemen. Durch die Anwendung dieses Ansatzes auf unabhängige CRISPR-Cas Screens, konnte ich nicht nur wichtige Design Regeln ableiten, sondern auch die Mechanismen der jeweiligen CRISPR-Cas Systeme besser erleuchten. Zu guter Letzt demonstriere ich hier, dass angewandtes maschinelles Lernen den Weg zu einem tieferen Verständnis und einer breiteren Anwendung von CRISPR-Cas Systemen ebnen kann. KW - Maschinelles Lernen KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Bakterien KW - machine learning KW - CRISPR-Cas KW - guide effiiciency Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320219 ER - TY - THES A1 - Flegler, Vanessa Judith T1 - Application of electron cryomicroscopy for structural and functional studies on the mechanosensitive channels of small conductance T1 - Kryoelektronenmikroskopie zur strukturellen und funktionellen Untersuchung der mechanosensitiven Kanäle kleiner Leitfähigkeit N2 - Bacteria thrive and survive in many different environments, and as a result, they have developed robust mechanisms to adapt rapidly to alterations in their surroundings. The protection against osmotic forces is provided by mechanosensitive channels: their primary function is to maintain the integrity of the cell upon a hypoosmotic shock. The mechanosensitive channel of small conductance (MscS) is not only the smallest common structural unit of a diverse family that allows for a tailored response in osmoregulation; it is also the most intensively studied homologue. Mechanosensitive channels directly sense elevated membrane tension levels generated by increased pressure within the cell and open transiently. Escherichia coli has six paralogues that differ in their gating properties and the number of additional transmembrane (TM) helices. These TM helices, termed sensor paddles, are essential for sensing, as they directly contact the surrounding membrane; however, the role of the additional TM helices is still unclear. Furthermore, lipids occupy hydrophobic pockets far away from the membrane plane. A recent gating model for MscS states that increased membrane tension triggers the expulsion of lipids out of those pockets, modulating different conformational states of MscS. This model focuses on bound lipids, but it is still unclear to what extent the direct interaction with the membrane influences sensing and how relevant it is for the larger paralogues. In the herein described work, structural studies on two larger paralogues, the medium-sized channel YnaI and the large channel YbiO were realised using electron cryomicroscopy (cryo-EM). Lipids were identified in YnaI in the pockets in a similar position and orientation as in MscS, suggesting a conserved sensing mechanism. Moreover, the copolymer diisobutylene/maleic acid (DIBMA) allowed the extraction of artificially activated YnaI from plasma membranes, leading to an open-like form of this channel. This novel conformation indicated that the pore helices bend at a GGxGG motif during gating, which is unique among the Escherichia coli paralogues, concomitant with a structural reorganisation of the sensor paddles. Thus, despite a high similarity of their closed states, the gating mechanisms of MscS and YnaI are surprisingly different. Furthermore, the comparison of MscS, YnaI, and YbiO accentuates variations and similarities between the differently sized family members, implying fine-tuning of channel properties in the pore regions and the cytosolic lateral entry sides into the channel. Structural analyses of MscS reconstituted into different systems showed the advantages and disadvantages of certain polymers and detergents. The novel DIBMA copolymer and the more conventional amphiphilic polymers, so-called Amphipols, perturb contacting transmembrane helices or lead to their denaturation. Due to this observation, the obtained structures of YnaI must also be cautiously considered. The structures obtained in detergents resulted in unaffected channels; however, the applicability of detergents for MscS-like channels is limited by the increased required sample concentration. The role of lipids for gating MscS in the absence of a membrane was examined by deliberately removing coordinated lipid molecules from MscS using different amounts and kinds of detergent. The effects on the channel were inspected by cryo-EM. These experiments showed that closed MscS adopts the open conformation when it is enough delipidated by incubation with the detergent n-dodecyl-β-D-maltoside, and adding lipids to the open channel reverses this process. The results agree with the state-of-the-art model that the amount of lipid molecules in the pockets and grooves is responsible for the conformational state of MscS. Furthermore, incubation with the detergent lauryl maltose neopentyl glycol, which has stabilising and delipidating characteristics, resulted in a high-resolution structure of open MscS exhibiting an intricate network of ligands. Based on this structure, an updated gating model is proposed, which states that upon opening, lipids from the pockets migrate into the cytosolic membrane leaflet, while lipids from the periplasmic leaflet enter the grooves that arise between the sensor paddles. N2 - Bakterien gedeihen und überleben in vielen unterschiedlichen Umgebungen. Daher haben sie robuste Mechanismen entwickelt, um sich rasch an Veränderungen in ihrer Umgebung anzupassen. Den Schutz vor osmotischen Kräften gewährleisten mechanosensitive Kanäle: Ihre Hauptfunktion besteht darin, die Unversehrtheit der Zelle bei einem hypoosmotischen Schock zu erhalten. Der mechanosensitive Kanal geringer Leitfähigkeit (mechanosensitive channel of small conductance, MscS) stellt nicht nur die kleinste gemeinsame Struktureinheit einer Familie von Kanälen dar, die eine maßgeschneiderte Antwort auf hypoosmotischen Stress ermöglicht; er ist auch das intensivste untersuchte Familienmitglied. Mechanosensitive Kanäle registrieren erhöhte Membranspannungen, die durch steigenden Druck innerhalb der Zelle entstehen, und öffnen vorübergehend. In Escherichia coli gibt es sechs paraloge Kanäle, die sich in ihren Öffnungs-Eigenschaften und der Anzahl zusätzlicher transmembranen Helices unterscheiden. Diese Helices, die als sensor paddles bezeichnet werden, sind für das Erfassen ansteigender Membranspannung unerlässlich, da sie direkt mit der umgebenden Membran in Kontakt stehen; die Rolle der zusätzlichen transmembranen Helices ist jedoch noch nicht geklärt. Außerdem sitzen Lipide in hydrophoben Taschen weit entfernt von der Membran. Ei kürzlich vorgeschlagenes Öffnungs-Modell für MscS besagt, dass eine erhöhte Membranspannung zum Ausstoß der Lipide aus diesen Taschen führt, wodurch verschiedene Konformationszustände von MscS moduliert werden. Dieses Modell konzentriert sich auf die Rolle der Lipide, aber es ist noch immer unklar, inwieweit die direkte Wechselwirkung mit der Membran das Wahrnehmen der Membranspannung beeinflusst und welche Bedeutung sie für die größeren paralogen Kanäle hat. In der vorliegenden Arbeit wurden Strukturstudien an zwei größeren paralogen Kanälen, dem mittelgroßen Kanal YnaI und dem großen Kanal YbiO, mittels Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) durchgeführt. In YnaI wurden Lipide in den Taschen in ähnlicher Position und Ausrichtung wie in MscS gefunden, was auf einen konservierten Mechanismus zur Wahrnehmung der Membranspannung schließen lässt. Darüber hinaus ermöglichte das Copolymer Diisobutylen/Maleinsäure (DIBMA) die Isolation von artifiziell aktiviertem YnaI aus Plasmamembranen, was zur Struktur einer anscheinend offenen Form dieses Kanals führte. Diese neuartige Konformation deutet darauf hin, dass sich die Porenhelices während des Öffnens im Bereich eines GGxGG-Motiv biegen, das unter den paralogen Kanälen von Escherichia coli einzigartig ist und mit einer strukturellen Reorganisation der sensor paddles einhergeht. Trotz der großen Ähnlichkeit ihrer geschlossenen Zustände sind die Öffnungs-Mechanismen von MscS und YnaI also überraschend unterschiedlich. Darüber hinaus zeigte der Vergleich von MscS, YnaI und YbiO Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den unterschiedlich großen Familienmitgliedern. Diese Erkenntnissse deuten auf eine Feinabstimmung der Kanaleigenschaften im Bereich der Pore und an den zytosolischen seitlichen Eingängen der Kanäle hin. Strukturanalysen von MscS, in verschiedene Systeme rekonstituiert, zeigten die Vor- und Nachteile von ausgewählten Polymeren und Detergenzien. Das neuartige DIBMA-Copolymer und herkömmlichere amphiphile Polymere, die sogenannten Amphipole, stören die kontaktierenden transmembranen Helices oder führen zu deren Denaturierung. Im Zuge dieser Beobachtung müssen auch die erhaltenen Strukturen von YnaI vorsichtig betrachtet werden. Die in Detergenzien erhaltenen Strukturen zeigen unbeeinträchtigte Kanäle; die Anwendbarkeit von Detergenzien für MscS-ähnliche Kanäle wird jedoch durch die erhöhte erforderliche Proteinkonzentration eingeschränkt. Die Rolle der Lipide für das Öffnen von MscS wurde in Abwesenheit einer Membran untersucht, indem koordinierte Lipidmoleküle mit verschiedenen Mengen und Arten von Detergenzien bewusst von MscS entfernt wurden. Die Auswirkungen auf den Kanal wurden mittels Kryo-EM untersucht. Dabei zeigte sich, dass die geschlossene Form von MscS in die offene Konformation übergeht, wenn es durch Inkubation mit dem Detergenz n-Dodecyl-β-D-Maltosid ausreichend delipidiert wird, und dass die Zugabe von Lipiden zum offenen Kanal diesen Prozess wieder umkehrt. Die Ergebnisse stimmen mit dem Öffnungs-Modell überein, das besagt, dass die Menge der Lipidmoleküle in den Taschen und Furchen für den Konformationszustand von MscS verantwortlich ist. Darüber hinaus führte die Inkubation mit dem Detergenz Laurylmaltose-neopentylglykol, das sowohl stabilisierende als auch delipidierende Eigenschaften hat, zu einer hochaufgelösten Struktur des offenen MscS, die ein ausgeprägtes Netzwerk von Liganden zeigt. Auf der Grundlage dieser Struktur wird ein aktualisiertes Öffnungs-Modell vorgeschlagen, das besagt, dass bei der Öffnung Lipide aus den Taschen in die zytosolische Lipidschicht der Membran wandern, während Lipide aus der periplasmatischen Lipidschicht in die Furchen gelangen, die zwischen den sensor paddles entstehen. KW - mechanosensitive channels KW - electron cryomicroscopy KW - MscS KW - YnaI KW - protein-lipid interactions KW - delipidation KW - mechanosensing KW - electron microscopy Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-268979 ER - TY - THES A1 - Jaud, Tobias Armin T1 - Application based personalized food choices and health sustainment: scientific background and investigation of biomarkers in human tissue specimens T1 - Gesundheitserhaltende Ernährung: Wissenschaftlicher Hintergrund einer App zur personalisierten Lebensmittelauswahl und Identifizierung von Biomarkern für die Ernährungsweise in Humangewebe N2 - Dietary fatty acids serve as objective biomarkers for the estimation of habitual diet mainly because biomarkers are free of memory bias or inaccuracies of food databases. The aim of the present work encompassed the implementation of a gas chromatographical method coupled with a mass spectrometrical and flame-ionization detector for analysis of fatty acid biomarkers in human biospecimens, their analytical determination and statistical evaluation in two different study populations and different biospecimens as well as the elaboration of adverse reactions to food ingredients with special focus on food allergies and food intolerances in the context of a possible implementation into an application for consumer health. The first aim was the identification of potential influence of fatty acid biomarkers on desaturase and elongase indexes (Δ9DI, Δ6DI, Δ5DI and ELOVLI5), which are factors in type 2 diabetes risk, in breast adipose tissue from healthy women. Influence of further variables on respective indexes was also investigated. 40 samples were investigated and potential variables were either collected by questionnaire or determined. Principle component analysis was applied for fatty acid biomarkers (PCdiet1, PCdiet2 and PCdiet3 representative for the dietary intake of vegetable oils/nuts, fish and partially hydrogenated vegetable oils), endogenous estrogens (PCE1) and oxysterols (PCOxy1). Multiple linear regression models were applied. Δ9DI and Δ6DI were influenced non-significantly and significantly negatively by PCdiet2 supporting a putative beneficial effect of vegetable oils and nuts on type 2 diabetes risk factors. ELOVLI5 and Δ5DI were influenced significantly and non-significantly positively by PCdiet1 supporting a putative beneficial effect of fish consumption on type 2 diabetes risk factors. On the other hand, PCdiet1 also significantly and non-significantly positively influenced Δ9DI and Δ6DI supporting a putative adverse effect of fish biomarkers on type 2 diabetes risk factors. The opposing influences of PCdiet1 suggesting an ambivalent role of dietary intake of fish on investigated indexes. Δ6DI was significantly positively influenced by PCdiet3 and number of pregnancies supporting a putative adverse effect of partially hydrogenated vegetable oils and pregnancies on type 2 diabetes risk factors. Lifestyle factors like smoking significantly and non-significantly influenced Δ9DI and Δ6DI putatively adversely. Δ5DI was influenced significantly positively by estrogen active drugs suggesting a putative beneficial effect on type 2 diabetes risk factors. It must be considered that a variation coefficient of up to 0.44 only explained 44% of variance of the respective indexes, suggesting other influencing factors might play a role. The second aim was the implementation of a gas chromatographical method coupled with a mass spectrometrical and flame-ionization detector for analysis of fatty acid biomarkers in human biospecimens. The method was optimized for separation and detection of 40 fatty acids. Mean recovery for tridecanoic acid was x(tridecanoic acid) = 90.51% and for nonadecanoic acid x(nonadecanoic acid) = 96.21%. Thus, there was no significant loss of fatty acids with shorter and longer carbon chains over the extraction process to be expected. Limit of detections were calculated in adipose tissue samples and ranged from 0.007 to 0.077% of the proportion of the respective fatty acid to total fatty acids. The third aim was the investigation if differentiation between breast glandular and adipose tissue had a relevant impact on the analysis of dietary fatty acid biomarkers or if contamination of breast glandular with breast adipose tissue and vice versa was neglectable for the analysis of dietary fatty acid biomarkers. No statistical significant differences were observed for all investigated fatty acid biomarkers (pentadecanoic-, heptadecanoic-, trans palmitoleic-, eicosapentaenoic-, docosahexaenoic-, linoleic and α-linolenic acid) between breast glandular and adipose tissue. Thus, differentiation between breast glandular and adipose tissue seems not to be necessary for the analysis of fatty acids serving as biomarkers for the intake of specific food groups. Potential influence of mixed breast tissue on fatty acid biomarkers analysis seems to be neglectable. The fourth aim was the determination of fatty acid biomarkers in adipose tissue in another study population from healthy participants. 27 adipose tissue samples were analyzed. Milk and ruminant fat biomarkers exhibited proportions of 0.47% for pentadecanoic acid, 0.34% for heptadecanoic acid and 0.25% for trans palmitoleic acid. Fish fatty acid biomarkers revealed proportions of 0.034% for eicosapentaenoic acid and 0.061% for docosahexaenoic acid. The mean proportion of vegetable oils and nuts biomarkers were 9.58% for linoleic acid and 0.48% for α-linolenic acid in all adipose tissues. Principle component analysis was applied for the fatty acid biomarkers to provide objective markers of habitual diet for this study population. PCdiet1 was mainly characterized by pentadecanoic acid, heptadecanoic acid and trans palmitoleic acid and therefore served as a principle component for the dietary intake of milk and ruminant fat. PCdiet2 and PCdiet3 only exhibited pattern for ω3 and ω6 fatty acids but not for dietary intake of specific food groups and could therefore not used as objective marker. PCdiet1, 2 and 3 explained 82.76% of variance. The last aim of this thesis was the elaboration of adverse reactions to food ingredients with special focus on food allergies and food intolerances in the context of a possible implementation into an application for consumer health. Scientific information on adverse reactions to food ingredients and trigger substances was provided in this thesis and possible implementation strategies were evaluated. For food allergens, which have regulatory requirements in the context of labelling, a strategy was elaborated, where it is necessary to provide information on the list of ingredients, the nexus ’contain’ and the respective food allergen as well as information on the name of the product. For food intolerances, which do not have regulatory requirements, limits were shown in the context of the application. If the elaborated food intolerances shall be implemented into the application, a professional dietary concept has to be developed for every food intolerance because of the complexity of the implementation. N2 - Die vorliegende Arbeit umfasste die Implementierung einer analytischen Methode zur Bestimmung von Fettsäurebiomarkern in unterschiedlichen Bioproben, die analytische Bestimmung und statistische Evaluation von Fettsäurebiomarkern in zwei Studienpopulationen und unterschiedlichen Bioproben sowie die Ausarbeitung und Bereitstellung wissenschaftlicher Information zu adversen Reaktionen von Lebensmittelzutaten mit besonderem Fokus auf Nahrungsmittelallergien sowie Nahrungsmittelunverträglichkeiten im Kontext einer strategischen Implementierung dieser adversen Reaktionen in eine Applikation im Sinne des Verbraucherschutzes. Das erste Ziel war die Identifizierung von potentiellen Einflüssen durch Fettsäurebiomarker der Ernährung auf Desaturase- und Elongase-Indices (Δ9DI, Δ6DI, Δ5DI, ELOVLI5), welche Einflussfaktoren auf das Typ 2 Diabetes Risiko darstellen, in Brustfettgewebe von gesunden Frauen. Der potentielle Einfluss von weiteren Variablen auf Desaturase- und Elongase-Indices wurde ebenfalls untersucht. 40 Proben wurden untersucht und potentielle Variablen sowohl mithilfe eines Fragebogens erhoben als auch analytisch ermittelt. Hauptkomponentenanalysen wurden für Fettsäurebiomarker (PCdiet1, PCdiet2 und PCdiet3 repräsentativ für eine Ernährung reich an pflanzlichen Ölen/Nüssen, Fisch und gehärteten Ölen), endogene Estrogene (PCE1) und Oxysterole (PCOxy1) angewendet. Potentielle Einflussfaktoren wurden mittels multiple linearer Regressionsanalyse ermittelt. Δ9DI und Δ6DI wurden nicht-signifikant und signifikant durch PCdiet2 beeinflusst. Dies unterstützt einen möglicherweise vorteilhaften Effekt von Fettsäurebiomarkern repräsentativ für die Aufnahme von pflanzlichen Ölen und Nüssen auf Typ 2 Diabetes Risikofaktoren. PCdiet1 hatte einen möglicherweise vorteilhaften signifikanten und nicht-signifikanten Einfluss auf ELOVLI5 und Δ5DI. Auf der anderen Seite hatte PCdiet1 einen möglicherweise adversen signifikanten Einfluss auf Δ9DI und Δ6DI, was auf eine ambivalente Rolle von Fettsäurebiomarkern des Fischkonsums hindeutet. Möglicherweise adverse signifikante Einflüsse auf Δ6DI hatten PCdiet3 sowie die Anzahl an Schwangerschaften. Rauchen hatte einen signifikanten und nicht-signifikanten möglicherweise adversen Einfluss auf Δ9DI und Δ6DI. Einen möglicherweise vorteilhaften Einfluss auf ELOVLI5 wurde mit der Einnahme von estrogenaktiven Substanzen beobachtet. Berücksichtigt werden muss allerdings, dass mit einem Variationskoeffizienten von bis zu 0.44 nur 44% der Varianz der entsprechenden Indices erklärt werden konnte und somit weitere Einflussfaktoren eine Rolle spielen könnten. Das zweite Ziel war die Implementierung einer gaschromatographischen Methode für die Trennung und Detektion von 40 Fettsäuren. Die Chromatographie war simultan an einen Massenspektrometer und einen Flammenionisationsdetektor gekoppelt. Recovery Versuche zeigten für die Internen Standards Tridecansäure und Nonadecansäure Wiederfindungs raten von x(Tridecansäure) = 90.51% und x(Nonadecansäure) = 96.21%. Die Nachweisgrenzen der Fettsäuren wurden mit Fettgewebsproben bestimmt und reichten von 0.007 bis 0.077% Anteil der jeweiligen Fettsäuren an der Gesamtfettsäureverteilung. Die Untersuchung der Fragestellung ob die Differenzierung zwischen Brustdrüsen- und Brustfettgewebe einen relevanten Einfluss auf die Analyse von Fettsäurebiomarkern repräsentativ für eine Ernährung reich an Milch, Fisch und pflanzlichen Ölen/Nüssen hat war das dritte Ziel der vorliegenden Arbeit. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den prozentualen Anteilen der Fettsäurebiomarkern (Pentadecan-, Heptadecan-, trans Palmitolein-, Eicosapentaen-, Docosahexaen-, Linol- und α-Linolensäure) in Brustdrüsen und Brustfettgewebe entdeckt. Eine Differenzierung zwischen Brustdrüsen- und Brustfettgewebe scheint daher in Bezug auf die Analyse von Fettsäurebiomarker der Ernährung nicht notwendig zu sein. Der potentielle Einfluss von, mit Brustdrüsen- und Brustfettgewebe, gemischtem Gewebe scheint damit in Bezug auf die Analyse von Fettsäurebiomarkern vernachlässigbar zu sein. Das vierte Ziel der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Fettsäureverteilung mit besonderem Fokus auf Fettsäurebiomarker für die Ernährung in Fettgewebe in einer anderen Studienpopulation von gesunden Teilnehmerinnen und Teilnehmern. 27 Fettgewebsproben wurde untersucht. Der Anteil an Fettsäurebiomarker für den Konsum von Milch- und Wiederkäuerfette betrug 0.47% für Pentadecansäure, 0.34% für Heptadecansäure und 0.25% für trans Palmitoleinsäure. Fettsäurebiomarker repräsentativ für Fischkonsum hatten Anteile von 0.034% für Eicosapentaensäure und 0.061% für Docosahexaensäure. Für Fettsäurebiomarker repräsentativ für den Konsum von pflanzlichen Fetten und Nüssen wurden Anteile von 9.58% für Linolsäure und 0.48% für α-Linolensäure gefunden. Anschließend wurde eine Hauptkomponentenanalyse der Fettsäurebiomarker für die Ernährung durchgeführt. PCdiet1 wurde hauptsächlich durch Pentadecansäure, Heptadecansäure und trans Palmitoleinsäure charakterisiert. PCdiet1 wurde folglich als Hauptkomponente für den Konsum von Milch- und Wiederkäuerfetten interpretiert. PCdiet2 und PCdiet3 wurden ausschließlich von ω3 und ω6 Fettsäuren charakterisiert. Eine eindeutige Zuordnung zu speziellen Lebensmittelgruppen war nicht möglich. Die Biomarker für den Konsum von Fisch und pflanzlichen Fetten sowie Nüssen können daher nicht durch PCdiet2 und PCdiet3 zusammengefasst werden. PCdiet1, 2 und 3 erklärten 82.76% der Varianz. Das letzte Ziel der vorliegenden Arbeit war die Ausarbeitung von adversen Reaktionen gegenüber Lebensmittelinhaltsstoffen mit speziellem Fokus auf Nahrungsmittelallergien und Nahrungsmittelunverträglichkeiten im Kontext einer möglichen Implementierung in eine Applikation im Sinne des Verbraucherschutzes. Hierfür wurden wissenschaftliche Informationen zu adversen Reaktionen gegenüber Lebensmittelinhaltsstoffen und potentiellen Triggersubstanzen zusammengetragen und mögliche Implementierungsstrategien evaluiert. Für Nahrungsmittelallergene, welche spezielle regulatorische Voraussetzungen im Sinne von Beschriftung und Deklaration besitzen, wurde eine Strategie ausgearbeitet, welche die Notwendigkeit der Informationen von Zutatenliste, der Verknüpfung der Signalwörter ’enthält’ und dem entsprechenden Allergen wie auch den Namen des Produktes beinhaltet. Zutaten und Inhaltsstoffe, die Nahrungsmittelunverträglichkeiten hervorrufen können, haben keine speziellen regulatorischen Voraussetzungen. Limitierungen einer möglichen Implementierung von Nahrungsmittelunverträglichkeiten in die Applikation wurden im Rahmen dieser Arbeit aufgezeigt. Aufgrund der Komplexizität der Implementierung einer jeder einzelnen Nahrungsmittelunverträglichkeit in die Applikation sollte für jede einzelne ausgewählte Unverträglichkeit ein individuelles Konzept entwickelt werden. KW - Lebensmittelchemie KW - Massenspektrometrie KW - Biomarker KW - Gaschromatographie KW - Masspectrometry KW - Biomarker KW - Gas chromatography Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298646 ER - TY - THES A1 - Busch, Martin T1 - Aortic Dendritic Cell Subsets in Healthy and Atherosclerotic Mice and The Role of the miR-17~92 Cluster in Dendritic Cells T1 - Subsets dendritischer Zellen in der Aorta gesunder und atherosklerotischerMäuse und die Rolle des miR-17~92 Clusters in dendritischen Zellen N2 - Atherosclerosis is accepted to be a chronic inflammatory disease of the arterial vessel wall. Several cellular subsets of the immune system are involved in its initiation and progression, such as monocytes, macrophages, T and B cells. Recent research has demonstrated that dendritic cells (DCs) contribute to atherosclerosis, too. DCs are defined by their ability to sense and phagocyte antigens, to migrate and to prime other immune cells, such as T cells. Although all DCs share these functional characteristics, they are heterogeneous with respect to phenotype and origin. Several markers have been used to describe DCs in different lymphoid and non-lymphoid organs; however, none of them has proven to be unambiguous. The expression of surface molecules is highly variable depending on the state of activation and the surrounding tissue. Furthermore, DCs in the aorta or the atherosclerotic plaque can be derived from designated precursor cells or from monocytes. In addition, DCs share both their marker expression and their functional characteristics with other myeloid cells like monocytes and macrophages. The repertoire of aortic DCs in healthy and atherosclerotic mice has just recently started to be explored, but yet there is no systemic study available, which describes the aortic DC compartment. Because it is conceivable that distinct aortic DC subsets exert dedicated functions, a detailed description of vascular DCs is required. The first part of this thesis characterizes DC subsets in healthy and atherosclerotic mice. It describes a previously unrecognized DC subset and also sheds light on the origin of vascular DCs. In recent years, microRNAs (miRNAs) have been demonstrated to regulate several cellular functions, such as apoptosis, differentiation, development or proliferation. Although several cell types have been characterized extensively with regard to the miRNAs involved in their regulation, only few studies are available that focus on the role of miRNAs in DCs. Because an improved understanding of the regulation of DC functions would allow for new therapeutic options, research on miRNAs in DCs is required. The second part of this thesis focuses on the role of the miRNA cluster miR- 17~92 in DCs by exploring its functions in healthy and atherosclerotic mice. This thesis clearly demonstrates for the first time an anti-inflammatory and atheroprotective role for the miR17-92 cluster. A model for its mechanism is suggested. N2 - Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung der arteriellen Gefäßwand und zahlreiche Zellen des Immunsystems, wie zum Beispiel Monozyten, Makrophagen, T und B Zellen sind an der Entstehung und Entwicklung beteiligt. Aktuelle Forschungsergebnisse haben gezeigt, dass auch dendritische Zellen (DCs) zur Atherosklerose beitragen. DCs sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, Antigene zu erkennen, aufzunehmen, zu migrieren und andere Immunzellen, wie zum Beispiel T Zellen, zu aktivieren. Auch wenn alle DCs diese funktionellen Merkmale teilen, so sind sie in Bezug auf ihren Phänotyp oder Ursprung eine eher heterogene Gruppe. Zahlreiche Oberflächenmoleküle wurden in der Vergangenheit genutzt, um DCs in lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben zu beschreiben. Allerdings hat sich keines dieser Moleküle als spezifisch und unverwechselbar erwiesen. Die Expression von Oberflächenmolekülen ist sehr variabel und hängt nicht nur vom Aktivierungszustand der DCs, sondern auch vom umliegenden Gewebe ab. Dazu kommt, dass DCs in der Aorta, beziehungsweise im atherosklerotischen Plaque, von designierten Vorläuferzellen, aber auch von Monozyten abstammen können und DCs das Profil ihrer Oberflächenmoleküle, sowie ihre funktionellen Eigenschaften, mit anderen myeloiden Zellen wie Monozyten und Makrophagen teilen. Neuere Arbeiten haben damit begonnen das Repertoire an DCs in der Aorta von gesunden und atherosklerotischen Mäusen zu untersuchen. Da es naheliegt, dass verschiedene DC Untergruppen ganz bestimmte Funktionen ausüben, wird eine detaillierte Beschreibung vaskulärer DCs in der Forschung benötigt. Weil es hierzu allerdings bislang kaum Studien gibt, untersucht der erste Teil dieser Arbeit zum ersten Mal systematisch die in gesunden und atherosklerotischen Mäusen vorkommenden Gruppen an DCs. Sie beschreibt außerdem eine zuvor nicht beachtete DC-Untergruppe und gibt Aufschluss über den Ursprung vaskulärer DCs. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass microRNAs (mirRNAs) zahlreiche zelluläre Vorgänge wie Apoptose, Differenzierung, Entwicklung und Proliferation regulieren. Obwohl viele Zelltypen in Bezug auf die in ihrer Regulation eingebundenen mirRNAs charakterisiert wurden, gibt es nur wenige Studien, die sich mit der Rolle von mirRNAs in DCs beschäftigen. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Rolle der miRNA Gruppe miR-17~92 in DCs und untersucht deren Rolle in gesunden und atherosklerotischen Mäusen. Diese Arbeit zeigt erstmals eine deutliche anti-inflammatorische und protektive Rolle dieser miRNA und schlägt ein Modell für die entdeckten Mechanismen vor. KW - Aorta KW - Maus KW - Zelle KW - Cluster KW - miRNS KW - Dendritische Zelle KW - Arteriosklerose KW - miR-17~92 KW - dendritic cells KW - atherosclerosis KW - mice KW - murine Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71683 ER - TY - THES A1 - Abdelmohsen, Usama Ramadan T1 - Antimicrobial Activities from Plant Cell Cultures and Marine Sponge-Associated Actinomycetes T1 - Antimikrobielle Aktivitäten aus Pflanzenzellkulturen und marinen Schwamm-assoziierten Actinomyceten N2 - This thesis is divided into three parts with the main goal allocating novel antimicrobial compounds that could be used as future antibiotics. The first part aimed to evaluate the potential of plant suspension cultures for the production of antimicrobial proteins. The extracellular, intracellular and cell wall bound fractions of seven heterotrophic and photomixotrophic plant cell suspension cultures treated with nine different elicitors were tested for the elicitor dependent production of antimicrobial proteins. Bioactivities were tested against a selected panel of human isolates including Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as fungi using the disc diffusion assay. The intracellular fractions of elicited cell cultures were more active than extracellular fractions while the cell wall bound fractions showed lowest activities. Among the 21 fractions tested, the intracellular fraction of Lavendula angustifolia elicited with DC3000 was most active against Candida maltosa. The second most active fraction was the intracellular fraction of Arabidopsis thaliana elicited with salicylic acid which was moreover active against all test strains. The antimicrobial activity of elicited Arabidopsis thaliana cell cultures was tested by bioautography to locate the antimicrobial proteins in the crude extract. The intracellular fraction of photomixotrophic Arabidopsis thaliana cells elicited with salicylic acid was selected for further gel filtration chromatography on S-200 column leading to the purification of one 19 kDa antimicrobially active protein, designated, AtAMP. Our findings suggest that elicited plant cell cultures may present a new promising alternative source of antimicrobial proteins. The second part comprises the isolation of actinomycetes associated with marine sponges and testing the bioactivities of new species for further investigations. Actinobacterial communities of eleven taxonomically different sponges that had been collected from offshore Ras Mohamed (Egypt) and from Rovinj (Croatia) were investigated by a culture-based approach using different standard media for isolation of actinomycetes and media enriched with aqueous sponge extract to target rare and new actinomycete species. Phylogenetic characterization of 52 representative isolates out of 90 based on almost complete sequences of genes encoding 16S rRNA supported their assignment to 18 different actinomycete genera. Altogether 14 putatively new species were identified based on sequence similarity values below 98.2% to other strains in the NCBI database. The use of M1 agar amended with aqueous sponge extract yielded a putative new genus related to Rubrobacter which highlighting the need for innovative cultivation protocols. Biological activity testing showed that five isolates were active against Gram-positives only, one isolate was active against Candida albicans only and one isolate showed activity against both groups of pathogens. Moreover, the antiparasistic activity was documented for four isolates. These results showed a high diversity of actinomycetes associated with marine sponges as well as highlighted their potential to produce anti-infective agents. The third part of the thesis focused on the isolation and structure elucidation of new bioactive compounds. Streptomyces strain RV15 recovered from sponge Dysidea tupha, was selected for further chemical analysis by virtue of the fact that it exhibited the greatest antimicrobial potential against Staphylococcus aureus as well as Candida albicans among the all tested strains. Moreover, members of the genus Streptomyces are well known as prolific producers of interesting pharmacologically active metabolites. Chemical analysis of the methanolic crude extract using different chromatographic tools yielded four new compounds. The structures of the new compounds were spectroscopically elucidated to be four new cyclic peptides, namely, cyclodysidins A-D. Their bioactivity was tested against different proteases, bacteria and Candida as well as tumor cell lines. The compounds did not show any significant activities at this point. N2 - Die hier vorliegende Dissertation ist in drei Kapitel gegliedert und hatte die Bereitstellung neuer antimikrobieller Substanzen, die zukünftig als Antibiotika genutzt werden könnten, zum Hauptziel. Das erste Kapitel befasst sich mit dem Potenzial von Pflanzen zur Produktion von Proteinen mit antimikrobieller Wirkung. Pflanzenzellkulturen wurden mit neun verschiedenen Induktoren stimuliert und anschließend auf die Produktion von Proteinen mit antimikrobieller Wirkung hin untersucht. Dafür wurden die extra-, intrazellulären sowie die membrangebundenen Proteinfraktionen von sieben heterotrophen und photomixotrophen Pflanzenzellkulturen extrahiert. Mittels Diffusionstests wurden die Wirkung der Proteine gegen eine Sammlung menschlicher Pathogene inklusive Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien, sowie Pilze getestet. Die intrazellulären Fraktionen zeigten dabei höhere Aktivitäten als die extrazellulären, wohingegen die membrangebundenen Proteine die geringsten Aktivitäten aufwiesen. Von den insgesamt 21 getesteten Proteinfraktionen wies die mit DC3000 induzierte intrazelluläre Fraktion von Lavendula angustifolia die größte Wirkung gegen Candida maltosa auf. Die mit Salicylsäure induzierte intrazelluläre Proteinfraktion von Arabidopsis thaliana zeigte eine Hemmung aller getesteten pathogenen Stämme. Die antimikrobielle Aktivität der induzierten Arabidopsis thaliana-Zellkultur wurde mittels Bioautography weiter untersucht, um das wirksame Protein im Gesamt-(Roh-) extrakt einzugrenzen. Die intrazelluläre Fraktion der photomixotrophen Arabidopsis thaliana-Zellkultur wurde ausgewählt, um ein 19 kDa Protein mit antimikrobieller Wirkung, genannt AtAMP, mittels Gelfitrationschromatography über eine S-200 Säule aufzureinigen. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass induzierte Pflanzenzellkulturen zukünftig als aussichtsreiche alternative Quelle für antimikrobiell wirksame Proteine herangezogen werden können. Der zweite Teil dieser Dissertation beinhaltet die Isolation von mit marinen Schwämmen assoziierten Actinomyceten und deren Testung auf Bioaktivität. Aus 11 taxonomisch verschiedenen, an den Küsten von Ras Mohamed (Ägypten) und Rovinj (Kroatien) gesammelten Schwammspezies, wurden Actinobakterien auf verschiedenen Standardmedien kultiviert. Um seltene, neue Stämme zu isolieren, wurden diese Medien mit wässrigen Schwammextrakten angereichert. Die auf der 16S rRNA-Gensequenz basierenden phylogenetischen Charakterisierung von 52 der insgesamt 90 Isolate, zeigte die Zugehörigkeit zu 18 verschiedenen Actinomyceten-Gattungen. Die 16S rRNA-Gene von 14 Isolaten zeigten Homologien von weniger als 98,2% zu denen anderer in Datenbanken abgelegten Bakterien und stellen somit vermutlich neue Arten dar. Die Verwendung von mit Schwammextrakt angereichertem M1-Agar resultierte in der Kultivierung einer mutmaßlich neuen, mit Rubrobacter verwandten Gattung und bestätigt die Notwendigkeit der Entwicklung neuer innovativer Kultivierungsprotokolle. Aktivitätstests von fünf Isolaten zeigten deren hemmende Wirkung nur gegen Gram-positive Bakterien, ein Isolat zeigte Aktivität nur gegen Candida albicans und ein Isolat war wirksam gegen beide genannten Pathogengruppen. Desweiteren konnten antiparasitäre Wirkungen von vier Isolaten dokumentiert werden. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen die große Diversität von mit Schwämmen assoziierten Actinomyceten und deren Potential Antiinfektiva zu produzieren. Der dritte Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf die Isolation und Strukturaufklärung neuer bioaktiver Substanzen. Streptomyceten sind bekannt für die Produktion von interessanten, pharmakologisch aktiven Metaboliten. Der aus dem Schwamm Dysidea tupha isolierte Stamm Streptomyces RV 15 zeigte eine hohe Aktivität gegen Staphylococcus aureus und C. albicans und wurde deshalb für nähere Untersuchungen ausgewählt. Die chemische Analyse des Methanol-Rohextrakts unter der Verwendung verschiedener Chromatographie-Verfahren resultierte in der Isolation von vier Substanzen. Die spektroskopische Analyse zeigte, dass diese neuen Substanzen zyklische Peptidstrukturen aufweisen und wurden daraufhin als Cyclodysidin A-D benannt. Die Bioaktivitäten dieser Substanzen wurden gegen verschiedene Proteasen, Bakterien und Candida sowie gegen verschiedene Tumorzelllinien getestet. Bis zum jetzigen Zeitpunkt zeigte keine der getesteten Peptide eine aussagekräftige Wirkung. KW - Antimikrobieller Wirkstoff KW - Pflanzenzelle KW - Zellkultur KW - Antimikrobielle Aktivitäten KW - Pflanzenzellkulturen KW - Proteinen mit antimikrobieller Wirkung KW - Actinomyceten KW - zyklische Peptide KW - Antimicrobial activities KW - Plant cell cultures KW - Antimicrobial proteins KW - Actinomycetes KW - Cyclic peptides Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51483 ER - TY - THES A1 - Janaki Raman, Sudha Rani T1 - Analysis of the molecular mechanisms underlying the role of SREBP1 in Glioblastoma tumour development and progression T1 - Analyse der molekularen Mechanismen, die der Rolle von SREBP1 bei der Entwicklung und Progression von Glioblastom-Tumoren zugrunde liegen N2 - Glioblastoma (GB) is the most aggressive malignant adult brain tumour with a median survival rate of only 15 months. GB tumours are characterized by necrotic and hypoxic core, which leads to nutrient deficient areas contributing to invasive, diffuseinfiltrative and angiogenic nature of these tumours. Cells exposed to nutrient deficient conditions and are known to reprogram their metabolism to produce or procure macro molecules from their environment. This makes cancer cells uniquely dependent on transcriptional regulators and a window of opportunity to target them. Sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) is a transcriptional regulator of de-novo fatty acid synthesis in cells. The aim of this thesis was to investigate if SREBP1 was involved in restructuring the transcriptional regulation of genes involved in fatty acid biosynthesis upon low serum condition, in mediating interaction with other cell types in the tumour bulk such as endothelial cells, in regulating cancer stem like cells and finally to study its upstream regulation in GB. Global transcriptional analysis on GB cells exposed to low serum conditions revealed that SREBP1 regulated several fatty acid biosynthesis and phospholipid metabolic processes. PLA2G3 was identified as a novel target of SREBP1 in GB that was uniquely regulated in low serum condition. Analysis of total fatty acid and lipid species revealed that loss of SREBP1 in low serum condition changes the proportion of saturated, MUFAs and PUFAs. These changes were not specific to loss of PLA2G3 but as a result of downregulation of many genes regulated by SREBP1 in the fatty acid biosynthetic pathway. Next, treatment of HUVEC’s (endothelial cells) with condition medium from SREBP1-silenced U87 cells inhibited sprouting and tube formation capacity compared to the control condition, emphasizing the role of SREBP1 in angiogenesis and release of signalling mediators. Further, SREBP1 was shown to be important for proliferation of patient derived stem like cells and becomes indispensable for forming neurospheres in long term cultures, indicating its role in maintaining stemness. Also, inhibition of SREBP function by blocking the esterification of cholesterol using inhibitors targeting SOAT1 showed impairment in the viability of GB cells exposed to serum-depleted condition. Overall, SREBP1 plays an important role in maintaining tumour growth in nutrient deficient conditions and help in interaction with tumour microenvironment contributing to the aggressiveness of this tumour and poses itself as an attractive and unique target for GB treatment N2 - Das Glioblastoma (GB) ist der aggressivste bösartige Gehirntumor bei Erwachsenen mit einer medianen Überlebensrate von nur 15 Monaten. GB-Tumore zeichnen sich durch einen nekrotischen und hypoxischen Kern aus, der zu nährstoffarmen Bereichen führt, die zu invasiven, diffus-infiltrierenden und angiogenen Natur dieser Tumore beitragen. Zellen, die einem Nährstoffmangel ausgesetzt sind, sind dafür bekannt, ihren Stoffwechsel umzuprogrammieren, um Makromoleküle zu produzieren oder diese aus ihrer Umgebung zu beziehen. Dies macht Krebszellen in einzigartiger Weise abhängig von Transkriptionsregulatoren und eröffnet die Möglichkeit diese gezielt anzugreifen. Das sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) ist ein Transkriptionsregulator der de-novo Fettsäuresynthese in Zellen. Das Ziel dieser Arbeit war es zu erforschen, ob SREBP1 an der Umstrukturierung der Transkriptionsregulation der Gene involviert ist, die unter niedrigen Serumbedingungen an der Fettsäurebiosynthese beteiligt sind. Des Weiteren richtete sich die Arbeit darauf, ob SREBP1 die Interaktion mit anderen Zelltypen im Tumor wie den Endothelzellen vermittelt, ob es die stammzellähnlichen Krebszellen reguliert und letztlich, dessen Stromaufwärts-Regulierung in GB zu untersuchen. Eine globale Transkriptionsanalyse von GB-Zellen, die niedrigen Serumbedingungen ausgesetzt waren, ergab, dass SREBP1 mehrere Fettsäurebiosynthese- und Phospholipid-Stoffwechselprozesse reguliert. Dabei wurde PLA2G3 als ein neuartiges Ziel von SREBP1 in GB identifiziert, welches unter geringen Serumbedingungen auf einzigartige Weise reguliert wurde. Die Analyse der gesamten Fettsäure- und Lipidspezies ergab, dass der Verlust von SREBP1 unter niedrigen Serumbedingungen das Verhältnis zwischen gesättigten, MUFAs und PUFAs verändert. Diese Veränderungen waren nicht spezifisch auf den Verlust von PLA2G3 zurückzuführen, sondern eine Folge der Herunterregulierung vieler Gene, die im Fettsäurebiosyntheseweg durch SREBP1 reguliert werden. Als Nächstes zeigte die Behandlung von HUVECs (Endothelzellen) mit dem konditionierten Medium von SREBP1-stillgelegten U87 Zellen, dass die Sprieß- und Röhrenbildungsfähigkeit im Vergleich zur Kontrollbedingung gehemmt war. Dies unterstreicht die Rolle von SREBP1 bei der Angiogenese und der Freisetzung von Signalmediatoren. Außerdem wurde nachgewiesen, dass SREBP1 wichtig für die Proliferation von aus Patienten stammenden stammzellähnlichen Zellen und für die Bildung von Neurosphären in Langzeitkulturen unverzichtbar ist, was auf die Rolle von SREBP1 bei der Aufrechterhaltung der Stammzellfähigkeit hindeutet. Auch die Hemmung der SREBP Funktion durch die Blockierung der Veresterung von Cholesterin mittels SOAT1-Inhibitoren wies eine Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit von GB-Zellen auf, die einer serumarmen Bedingung ausgesetzt waren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass SREBP1 eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des Tumorwachstums unter nährstoffarmen Bedingungen und bei der Interaktion mit der Tumormikroumgebung spielt, die zur Aggressivität des Tumors beiträgt und sich somit als ein attraktives und einzigartiges Ziel für die Behandlung von GB darstellt. KW - Glioblastoma KW - NA Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280245 ER - TY - THES A1 - Hampe, Irene Aurelia Ida T1 - Analysis of the mechanism and the regulation of histatin 5 resistance in \(Candida\) \(albicans\) T1 - Analyse des Mechanismus und der Regulierung von Histatin 5 Resistenz in \(Candida\) \(albicans\) N2 - Antimycotics such as fluconazole are frequently used to treat C. albicans infections of the oral mucosa. Prolonged treatment of the fungal infection with fluconazole pose a risk to resistance development. C. albicans can adapt to these stressful environmental changes by regulation of gene expression or by producing genetically altered variants that arise in the population. Adapted variants frequently carry activating mutations in zinc cluster transcription factors, which cause the upregulation of their target genes, including genes encoding efflux pumps that confer drug resistance. MDR1, regulated by the zinc cluster transcription factor Mrr1, as well as CDR1 and CDR2, regulated by the zinc cluster transcription factor Tac1, are well-known examples of genes encoding efflux pumps that extrude the antimycotic fluconazole from the fungal cell and thus contribute to the survival of the fungus. In this study, it was investigated if C. albicans can develop resistance to the antimicrobial peptide histatin 5, which serves as the first line of defence in the oral cavity of the human host. Recently, it was shown that C. albicans transports histatin 5 outside of the Candia cell via the efflux pump Flu1. As efflux pumps are often regulated by zinc cluster transcription factors, the Flu1 efflux pump could also be regulated by a zinc cluster transcription factor which could in a hyperactive form upregulate the expression of the efflux pump, resulting in increased export of histatin 5 and consequently in histatin 5 resistance. In order to find a zinc cluster transcription factor that upregulates FLU1 expression, a comprehensive library of C. albicans strains containing artificially activated forms of zinc cluster transcription factors was screened for suitable candidates. The screening was conducted on medium containing mycophenolic acid because mycophenolic acid is also a substrate of Flu1 and a strain expressing a hyperactive zinc cluster transcription factor that upregulates FLU1 expression should exhibit an easily recognisable mycophenolic acid-resistant phenotype. Further, FACS analysis, quantitative real-time RT-PCR analysis, broth microdilution assays as well as histatin 5 assays were conducted to analyse the mechanism and the regulation of histatin 5 resistance. Several zinc cluster transcription factors caused mycophenolic acid resistance and upregulated FLU1 expression. Of those, only hyperactive Mrr1 was able to confer increased histatin 5 resistance. Finding Mrr1 to confer histatin 5 resistance was highly interesting as fluconazole-resistant strains with naturally occurring Mrr1 gain of function mutations exist, which were isolated from HIV-infected patients with oral candidiasis. These Mrr1 gain of function mutations as well as artificially activated Mrr1 cause fluconazole resistance by upregulation of the efflux pump MDR1 and other target genes. In the course of the study, it was found that expression of different naturally occurring MRR1 gain-of-function mutations in the SC5314 wild type background caused increased FLU1 expression and increased histatin 5 resistance. The same was true for fluconazole-resistant clinical isolates with Mrr1 gain of function mutations, which also caused the overexpression of FLU1. Those cells were less efficiently killed by histatin 5 dependent on Mrr1. Surprisingly, FLU1 contributed only little to histatin 5 resistance, rather, overexpression of MDR1 mainly contributed to the Mrr1-mediated histatin 5 resistance, but also additional Mrr1-target genes were involved. These target genes are yet to be uncovered. Moreover, if a link between the yet unknown Mrr1-target genes contributing to fluconazole resistance and increased histatin 5 resistance can be drawn remains to be discovered upon finding of the responsible target genes. Collectively, this study contributes to the understanding of the impact of prolonged antifungal exposure on the interaction between host and fungus. Drug therapy can give rise to resistance evolution resulting in strains that have not only developed resistance to fluconazole but also to an innate host mechanism, which allows adaption to the host niche even in the absence of the drug. N2 - Antimykotika wie Fluconazol werden häufig zur Behandlung von C. albicans Infektionen der Mundschleimhaut verwendet. Dabei stellt eine langzeitige Behandlung der Pilzinfektion mit Fluconazol ein Risiko zur Resistenzentwicklung dar. C. albicans kann sich an solche Umweltveränderungen anpassen, indem es die Genexpression reguliert oder genetisch veränderte Varianten produziert, welche in der Population entstehen. Adaptierte Varianten tragen häufig aktivierende Mutationen in Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren, welche die Hochregulierung der Expression von Genen verursachen, darunter solche, die für Multidrug-Effluxpumpen kodieren und dadurch Antimykotikaresistenz verleihen können. MDR1, reguliert durch den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktor Mrr1, sowie CDR1 und CDR2, reguliert durch den Zink-Cluster-Transkriptionsfaktor Tac1, sind bekannte Beispiele für Effluxpumpen, die das Antimykotikum Fluconazol aus der Pilzzelle extrudieren und somit zum Überleben der Pilzzelle beitragen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob C. albicans eine Resistenz gegen das antimikrobielle Peptid Histatin 5 entwickeln kann, das in der Mundhöhle des menschlichen Wirtes als erste Verteidigungsbarriere gegen den Pilz dient. Kürzlich wurde gezeigt, dass C. albicans Histatin 5 über die Effluxpumpe Flu1 aus der Candia-Zelle heraustransportiert (Li et al., 2013). Da Effluxpumpen häufig durch Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren reguliert werden, könnte auch die Flu1-Effluxpumpe durch solch einen Transkriptionsfaktor reguliert werden, der in einer hyperaktiven Form die Expression der Effluxpumpe hochregulieren könnte, was wiederrum zu einem erhöhten Export von Histatin 5 und folglich zur Histatin 5 Resistenz führen könnte. Um einen Zink-Cluster-Transkriptionsfaktor zu finden, der die FLU1-Expression hochreguliert, wurde mit Hilfe einer Bibliothek von C. albicans-Stämmen, die künstlich aktivierte Formen von Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren enthält, nach geeigneten Kandidaten gesucht. Das Screening wurde auf Mycophenolsäure-haltigem Medium durchgeführt, da Mycophenolsäure ebenfalls ein Substrat von Flu1 ist. Folglich sollte ein Stamm mit hyperaktivem Zink-Cluster-Transkriptionsfaktor, welcher die FLU1-Expression hochreguliert, einen leicht erkennbaren Mycophenolsäure-resistenten Phänotyp aufweisen. Weiterhin wurden FACS-Analysen, quantitative real-time RT-PCR-Analysen, Broth microdilution-Assays sowie Histatin 5-Assays durchgeführt, um den Mechanismus und die Regulierung der Histatin-5-Resistenz zu analysieren. Mehrere Zink-Cluster-Transkriptionsfaktoren verursachten Mycophenolsäure-Resistenz und erhöhten die FLU1-Expression. Von diesen war nur hyperaktives Mrr1 in der Lage, eine erhöhte Histatin-5-Resistenz zu verleihen. Das Auffinden von Mrr1 als Regulator der Histatin 5-Resistenz war hochinteressant, da fluconazolresistente Stämme mit natürlich vorkommenden MRR1 gain-of-function Mutationen existieren, die aus HIV-infizierten Patienten mit oropharyngealer Candidiasis isoliert wurden. Diese gain-of-function Mutationen sowie künstlich aktivierendes Mrr1 verursachen Fluconazol-Resistenz durch Hochregulation der Effluxpumpe MDR1 und anderer Zielgene. Im Verlauf der Studie wurde herausgefunden, dass verschiedene natürlich vorkommende MRR1 gain-of-function Mutationen im SC5314 Wildtyp Hintergrund eine erhöhte FLU1-Expression und eine erhöhte Histatin-5-Resistenz verursachten. Das Gleiche galt für Fluconazol-resistente klinische Isolate mit Mrr1 gain-of-function Mutationen, welche die Überexpression von FLU1 verursachten. Zellen dieser Isolate wurden, abhängig von Mrr1, weniger wirksam durch Histatin 5 abgetötet. Überraschenderweise trug FLU1 nur wenig zur Histatin-5-Resistenz bei, vielmehr trug die Überexpression von MDR1 hauptsächlich zur Mrr1-vermittelten Histatin-5-Resistenz bei, aber auch weitere Mrr1-Zielgene waren daran beteiligt. Diese Mrr1-Zielgene gilt es nun noch zu entdecken. Ob ein Zusammenhang zwischen diesen noch unbekannten Mrr1-Zielgenen hergestellt werden kann, die zur Fluconazolresistenz sowie zu einer erhöhten Histatin-5-Resistenz beitragen, wird erst nach dem Auffinden der verantwortlichen Zielgene geprüft werden können. Zusammenfassend trägt diese Studie zum Verständnis der Auswirkungen einer anhaltenden antimykotischen Exposition auf die Interaktion zwischen Wirt und Pilz bei. Eine medikamentöse Therapie kann zu einer Resistenzentwicklung führen, aus der Stämme hervorgehen, welche nicht nur eine Resistenz gegen Fluconazol entwickelt haben, sondern gleichzeitig eine Resistenz gegen einen angeborenen Wirtsabwehrmechanismus, der eine Adaption an die Wirtsnische auch in Abwesenheit des Antimykotikums ermöglicht. KW - Histatin 5 KW - Candida albicans KW - Efflux pump KW - MDR1 KW - MRR1 KW - Mrr1 KW - MDR1 KW - Fluconazole KW - Efflux pump Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159634 ER - TY - THES A1 - Mueller, Felicitas T1 - Analysis of the factor XII-driven contact system activation in vivo T1 - Charakterisierung der Faktor XII-vermittelten Aktivierung des Kontaktsystemsin vivo N2 - Platelets play a central role in thrombosis, hemostasis, and inflammation. Here, we show that activated platelets release inorganic polyphosphate (polyP), a polymer of 60- 100 phosphate residues that directly bound to and activated the plasma protease factor XII. PolyP-driven factor XII-activation triggered release of the inflammatory mediator bradykinin by plasma kallikrein-mediated kininogen processing. PolyP increased vascular permeability and induced fluid extravasation in skin microvessels of mice. Mice deficient in factor XII or bradykinin receptors were resistant to polyP-induced leakage. PolyP initiated clotting of plasma via the contact pathway. Ablation of intrinsic coagulation pathway proteases factor XII and factor XI protected mice from polyPtriggered lethal pulmonary embolism. Targeting polyP with phosphatases interfered with procoagulant activity of activated platelets and blocked platelet-induced thrombosis in mice. Infusion of polyP restored defective plasma clotting of Hermansky- Pudlak Syndrome patients, which lack platelet polyP. The data identify polyP as a new class of mediator having fundamental roles in platelet-driven proinflammatory and procoagulant disorders. N2 - Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei Thrombose, Hämostase und Entzündungsprozessen. Wir zeigen, dass aktivierte Thrombozyten Polyphosphate (polyP) mit einer Kettenlänge von 60-100 Phosphatuntereinheiten sekretieren. PolyP binden und aktivieren die Serinprotease Faktor XII. PolyP-induzierte Faktor XIIAktivierung führt über Kallikrein zur Freisetzung des Entzündungsmediators Bradykinin aus seinem Vorläufermolekül, dem hochmolekularen Kininogen. In einem Ödem- Modell zeigen wir, dass polyP die Gefäßpermeabilität in der Rückenhaut von Wildtyp- Mäusen erhöhen. Faktor XII- oder Bradykinin B2 Rezeptor-defiziente Tiere waren vor polyP-induzierter Ödembildung geschützt. PolyP aktivieren die intrinsische Blutgerinnungskaskade im Plasma. In einem polyP-vermittelten lethalen Lungenemboliemodell waren Faktor XII- und Faktor XI-defiziente Mäuse im Gegensatz zu Wildtyp Tieren geschützt. Behandlung mit Phosphatase hebt die prokoagulante Aktivität stimulierter Thrombozyten auf und blockiert die Plättchen-induzierte Thrombusbildung in Mäusen. PolyP normalisieren die verlängerte Blutgerinnungszeit von Hermansky-Pudlack Patienten. Die Daten zeigen, dass es sich bei polyP um eine neue Klasse von Mediatoren mit prokoagulanten und proinflammtorischen Eigenschaften handelt. KW - Blutstillung KW - Thrombosis KW - Haemostasis KW - Polyphosphate KW - Blutstillung Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46071 ER - TY - THES A1 - Füller, Jochen T1 - Analysis of the binding properties of the kinase C-RAF to mitochondria and characterization of its effects on the cellular and molecular level T1 - Untersuchung der Bindungseigenschaften der Kinase C-RAF an Mitochondrien und Charakterisierung der Effekte auf zellulärer und molekulare Ebene N2 - The proteins of the RAF family (A-RAF, B-RAF, and C-RAF) are serine/threonine-kinases that play important roles in development, mature cell regulation and cancer. Although it is widely held that their localization on membranes is an important aspect of their function, there are few data addressing this aspect of their mode of action. Here, we report that each member of the RAF family exhibits a specific distribution at the level of cellular membranes, and that C-RAF is the only isoform that directly targets mitochondria. We find that the RAF kinases exhibit intrinsic differences in terms of mitochondrial affinity, and that C-RAF is the only isoform that binds this organelle efficiently. This affinity is conferred by the C-RAF amino-terminal domain, and does not depend on the presence of RAS GTPases on the surface of mitochondria. Furthermore, we analyze the consequences of C-RAF activation on the cellular and molecular level. C-RAF activation on mitochondria dramatically changes their morphology and their subcellular distribution. On the molecular level, we examine the role of C-RAF in the regulation of the pro-apoptotic Bcl-2 family member BAD. This protein exhibits the original mode of regulation by phosphorylation. Although several reports addressed the regulation of BAD by C-RAF, the exact mode of action as well as the consequences of C-RAF activation on BAD are still not completely understood. We show that the inducible activation of C-RAF promotes the rapid phosphorylation of BAD on Serine-112 (Ser-75 in the human protein), through a cascade involving the kinases MEK and RSK. Our findings reveal a new aspect of the regulation of BAD protein and its control by the RAF pathway: we find that C-RAF activation promotes BAD poly-ubiquitylation in a phosphorylation-dependent fashion, and increases the turn-over of this protein through proteasomal degradation. N2 - Die Proteine der RAF-Familie (A-RAF, B-RAF, C-RAF) sind Serin/Threonin-Kinasen, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung, in der Zellregulation und in Krebs spielen. Obwohl es weitgehend anerkannt ist, dass die Lokalisation an Membranen ein wichtiger Aspekt ihrer Funktion ist, gibt es nur wenige Daten, die diesen Punkt ihrer Wirkungsweise beschreiben. Wir zeigen hier, dass jedes Mitglied der RAF-Familie eine spezifische Verteilung an zellulären Membranen besitzt, und dass C-RAF die einzige Isoform ist, die direkt an Mitochondrien bindet. Weiterhin zeigen wir, dass RAF-Kinasen intrinsische Unterschiede in ihrer mitochondrialen Affinität aufweisen, wobei C-RAF die einzige Isoform ist, die an dieses Organell effizient bindet. Diese Affinität wird von der amino-terminalen Domäne von C-RAF vermittelt und ist unabhängig vom Vorkommen der RAS-GTPasen auf der Oberfläche von Mitochondrien. Des Weiteren haben wir die Konsequenzen der Aktivierung von C-RAF auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene untersucht. C-RAF Aktivierung an Mitochondrien hat drastische Änderungen in deren Morphologie und subzellulärer Verteilung zur Folge. Auf molekularer Ebene haben wir die Rolle von C-RAF in der Regulation des pro-apoptotischen Bcl-2 Familien Proteins BAD untersucht. Dieses Protein wird über Phosphorylierung reguliert. Obwohl eine Vielzahl von Arbeiten die Regulation von BAD durch C-RAF untersuchten, sind die exakte Wirkungsweise wie auch die Konsequenzen der C-RAF Aktivierung im Hinblick auf BAD immer noch unklar. Wir zeigen, dass die induzierbare Aktivierung von C-RAF die rapide Phosphorylierung von BAD an Serin 112 (Serin 75 im humanen Protein) zur Folge hat. Dieser Prozess wird durch eine Kaskade vermittelt, welche die Kinasen MEK und RSK einbezieht. Des Weiteren decken unsere Ergebnisse einen neuen Aspekt der Regulation des BAD Proteins auf und dessen Kontrolle durch den RAF-Signalweg: Wir zeigen, dass die Aktivierung von C-RAF die phosphorylierungs-abhängige Poly-ubiquitylierung von BAD zur Folge hat. Weiterhin beschleunigt die Aktivierung von C-RAF den Umsatz des BAD Proteins durch proteasomalen Abbau. KW - Apoptosis KW - Raf-Kinasen KW - Mitochondrium KW - BAD KW - BCL-2 Familie KW - BAD KW - BCL-2 family Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35096 ER - TY - THES A1 - Fouquet, Wernher T1 - Analysis of synapse assembly in Drosophila melanogaster T1 - Analyse des synaptischen Aufbaus der Drosophila melanogaster N2 - The majority of rapid cell-to-cell communication mechanisms and information processing within the nervous system makes use of chemical synapses. Fast neurotransmission on these sites not only requires very close apposition of pre- and postsynaptic partners, but also depends on an effective structural arrangement of cellular components on both sides of the synaptic cleft. Synaptic vesicles fuse at active zones (AZs), characterized by an electron-dense protein mesh of insufficiently characterized composition and function. EM analysis of synapses identified electron dense structures thought (but not proven) to play an important role for vesicle release efficacy. The molecular organization of presynaptic AZs during Ca2+ influx–triggered neurotransmitter release is currently a focus of intense investigation. Due to its appearance in electron micrographs, dense bodies at Drosophila synapses were named T-bars. Together with the lab of Erich Buchner, we recently showed that Bruchpilot (BRP) of the Drosophila melanogaster, homologous to the mammalian CAST/ERC family in its N-terminal half, is essential for the T-bar assembly at AZs and efficient neurotransmitter release respectively. The question, in which way BRP contributes to functional and structural organization of the AZ, was a major focus of this thesis. First, stimulated emission depletion microscopy (STED), featuring significantly increased optical resolution, was used to achieve first insights into ‘cytoarchitecture’ of the AZ compartment. In addition, in vivo live imaging experiments following identified populations of synapses over extended periods were preformed to address the trafficking of protein at forming synapses and thereby providing a temporal sequence for the AZ assembly process. Apart from BRP, two additional AZ proteins, DLiprin-α and DSyd-1, were included into the analysis, which were both shown to contribute to efficient AZ assembly. Drosophila Syd-1 (DSyd-1) and Drosophila Liprin-α (DLiprin-α) clusters initiated AZ assembly, finally forming discrete ‘quanta’ at the AZ edge. ELKS-related Bruchpilot, in contrast, accumulated late from diffuse pools in the AZ center, where it contributed to the electron dense specialization by adopting an extended conformation vertical to the AZ membrane. We show that DSyd-1 and DLiprin-α are important for efficient AZ formation. The results of this thesis describe AZ assembly as a sequential protracted process, with matured AZs characterized by sub-compartments and likely quantal building blocks. This step-wise, in parts reversible path leading to mature AZ structure and function offers new control possibilities in the development and plasticity of synaptic circuits. N2 - Durch Ca2+ abhängige Neurotransmitterfreisetzung vermitteln chemische Synapsen die schnelle Informationsübertragung zwischen Nervenzellen. Vorausetzung hierfür sind gewisse zelluläre Eigenschaften, wie eine enge Korrelation zwischen der Prä- und Postsynapse und eine hoch spezialisierte Zusammensetzung von Proteinen. Synaptische Vesikel fusionieren mit der präsynaptischen aktiven Zone (AZ), welche sich aus einem dichten Netzwerk an vielfach noch unerforschter synaptischer Proteine zusammensetzt, das im Transmissionselektronenmikroskop elektronendicht erscheint. Des Weiteren sind ultrastrukturell elektronendichte präsynaptische Spezialisierungen erkennbar (dense bodies), die vermutlich (aber nicht nachweislich) bei der Freisetzung synaptischer Vesikel eine tragende Rolle spielen. Der molekulare Aufbau der AZ ist zurzeit ein weitverbreitetes Studienthema. Die Synapsen der Fruchtfliege Drosophila melanogaster sind präsynaptisch gekennzeichnet durch eine elektronendichte Struktur, welche aufgrund ihrer charakteristischen Form auch als „T-bar“ bezeichnet wird. Durch die Kooperation mit dem Labor von Erich Buchner gelang es uns, das synaptische Protein Bruchpilot (BRP) zu identifizieren. BRP weist im N-terminalen Bereich Homologien zu der in Säuger gefundenen CAST/ERC Proteinfamilie auf, und ist essenziell für die Ausbildung der elektronendichten T-bars an den AZs und für eine effiziente Ausschüttung von Neurotransmitter. In wie weit BRP für die funktionelle und strukturelle Organisation der AZ verantwortlich ist, sollte in der vorliegenden Arbeit erläutert werden. Durch die neu entdeckte „stimulated emission depletion“ Mikroskopie (STED), ist es nun möglich, dank der erhöhten optischen Auflösung, neue Einsichten in die Architektur der AZ zu erlangen. Zusätzlich wurden mit Hilfe von in vivo Experimenten an lebenden Tieren Populationen von Synapsen über längere Zeiträume verfolgt, um so die Synapsenentstehung und den Proteintransport zu untersuchen. Auf diesem Weg sollte eine Abfolge der an der AZ Assemblierung beteiligten Proteine erstellt werden. Neben BRP wurden daher noch zwei weitere AZ Proteine berücksichtigt (DLiprin-α und DSyd-1), welche ebenfalls bei der Bildung neuer synaptischer Kontakten mitwirken. Es konnte gezeigt werden, dass Proteincluster aus Drosophila Syd-1 (DSyd-1) und Drosophila Liprin-α (DLiprin-α) sehr früh während der Bildung neuer synaptischer Kontakte erscheinen und hierbei diskrete ‚Quanta‘ ausbilden, welche sich am Rand der AZ anlagerten. BRP hingegen erreichte die AZ zu einem späteren Zeitpunkt, wahrscheinlich aus diffusen Reservoirs und akkumulierte schließlich im Zentrum der AZ. Mit Hilfe der STED und konfokalen Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass sich BRP in einer getreckten, vertikal zur Membran stehenden Orientierung in die elektronendichte Stuktur, den T-bar, einfügt. Zudem sind DSyd-1 und DLiprin-α für eine effiziente Entstehung neuer AZs erforderlich. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse deuten auf ein länger andauerden sequenziellen Assemblierungsprozess der AZ hin, in dem aus quantalen Baueinheiten Subkompartimente an ausgereiften AZs gebildet werden. Dieser gestaffelte, teils reversible Reifungsablauf der AZ eröffnet neue Möglichkeiten zur Kontrolle der Entwicklung und Plastizität neuronaler Netzwerke durch einen noch nicht beschriebenen Mechanismus. KW - Synapse KW - Drosophila KW - STED KW - confocal microscopy KW - active zone KW - Bruchpilot Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38173 ER - TY - THES A1 - Jiménez Martín, Ovidio Manuel T1 - Analysis of MYCN and MAX alterations in Wilms Tumor T1 - Analyse von MYCN- und MAX-Verändungen im Wilms Tumor N2 - Wilms tumor (WT) is the most common renal tumor in childhood. Among others, MYCN copy number gain and MYCN P44L and MAX R60Q mutations have been identified in WT. The proto-oncogene MYCN encodes a transcription factor that requires dimerization with MAX to activate transcription of numerous target genes. MYCN gain has been associated with adverse prognosis. The MYCN P44L and MAX R60Q mutations, located in either the transactivating or basic helix-loop-helix domain, respectively, are predicted to be damaging by different pathogenicity prediction tools. These mutations have been reported in several other cancers and remain to be functionally characterized. In order to further describe these events in WT, we screened both mutations in a large cohort of unselected WT patients, to check for an association of the mutation status with certain histological or clinical features. MYCN P44L and MAX R60Q revealed frequencies of 3 % and 0.9 % and also were significantly associated to higher risk of relapse and metastasis, respectively. Furthermore, to get a better understanding of the MAX mutational landscape in WT, over 100 WT cases were analyzed by Sanger sequencing to identify other eventual MAX alterations in its coding sequence. R60Q remained the only MAX CDS alteration described in WT to date. To analyze the potential functional consequences of these mutations, we used a doxycycline-inducible system to overexpress each mutant in HEK293 cells. This biochemical characterization identified a reduced transcriptional activation potential for MAX R60Q, while the MYCN P44L mutation did not change activation potential or protein stability. The protein interactome of N-MYC-P44L was likewise not altered as shown by mass spectrometric analyses of purified N-MYC complexes. However, we could identify a number of novel N-MYC partner proteins, several of these known for their oncogenic potential. Their correlated expression in WT samples suggested a role in WT oncogenesis and they expand the range of potential biomarkers for WT stratification and targeting, especially for high-risk WT. N2 - Der Wilms Tumor (WT) ist der im Kindesalter am häufigsten auftretende Nierentumor. Neben anderen genetischen Veränderungen, wurden MYCN-Kopienzahlgewinn und der MYCN P44L- und MAX R60Q-Mutationen in WT identifiziert. Das Proto-Onkogen MYCN kodiert einen Transkriptionsfaktor, der eine Dimerisierung mit MAX erfordert, um die Transkription zahlreicher Zielgene zu aktivieren. Der MYCN-Gewinn wurde mit einer negativen Prognose assoziiert. Die MYCN P44L- und MAX R60Q-Mutationen, die sich entweder in der transaktivierenden oder in der basischen Helix-Loop-Helix-Domäne befinden, wurden durch verschiedene pathogene Vorhersage-Werkzeuge als schädigend prognostiziert. Über diese Mutationen wird bei mehreren anderen Krebsformen berichtet, doch sie wurden noch nicht umfassend biochemisch charakterisiert. Um diese Vorgänge in WT weitergehend zu charakterisieren, untersuchten wir beide Mutationen in einer großen Gruppe zufällig ausgewählter WT-Patienten mit dem Ziel, einen Zusammenhang zwischen dem Mutationsstatus und gewissen histologischen und klinischen Eigenschaften zu überprüfen. MYCN P44L und MAX R60Q ergaben eine Frequenz von 3 % bzw. 0,9 % in WT und wurden jeweils mit einem signifikant höheren Rückfall- und Metastasierungsrisiko assoziiert. Um ein besseres Verständnis der MAX-Mutationsszenarien in WT zu erlangen, wurden darüber hinaus mehr als einhundert WT-Fälle durch Sanger-Sequenzierung analysiert, mit dem Ziel, andere mögliche Veränderungen in der MAX-Kodierungssequenz zu identifizieren. R60Q blieb dabei die einzige bis heute beschriebene Veränderung der MAX-Kodierungssequenz in WT. Um die potentiellen funktionalen Folgen dieser Mutationen zu untersuchen, nutzten wir ein Doxycyclin-induziertes System, um eine Überexprimierung jedes Mutanten in HEK293-Zellen zu erzielen. Diese biochemische Charakterisierung identifizierte ein reduziertes Transkriptionsaktivierungspotential für MAX R60Q, während die MYCN P44L-Mutation das Aktivierungspotential oder die Proteinstabilität nicht veränderte. Das N-MYC Interaktom wurde während der Massenspektrometrie-Analyse von gereinigten N-MYC-Komplexen ebenfalls nicht verändert. Jedoch konnten wir eine Anzahl von neuartigen N-MYC Partnerproteinen bestimmen, von denen einige für ihr onkogenes Potenzial bekannt sind. Deren korrelierte Expression in WT-Proben deuteten auf eine Rolle bei der WT Onkogenese hin und erweitern die Auswahl potentieller Biomarker für die Stratifizierung von WTs und Gentargeting, insbesondere bei Hochrisiko-WTs. KW - Nephroblastom KW - Genmutation KW - Wilms Tumor KW - MYCN KW - MAX KW - Mutation KW - Protein interactor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242919 ER - TY - THES A1 - Kayisoglu-Kaya, Özge T1 - Analysis of gastrointestinal epithelial innate immune barrier using human and murine organoids as a model T1 - Analyse der Gastrointestinalen angeborenen Immunbarriere durch Humane und Murine Organoide als Modell N2 - The epithelial layer of the gastrointestinal (GI) tract provides a barrier between the environment and the body. Dysfunction of the epithelium, including changes of the innate immune response facilitated by pattern recognition receptors (PRRs), plays a major role in the development of GI disorders. However, the organization of innate immune sensing, the expression and activity of PRRs and the factors contri¬buting to such possible organization along the GI tract are unclear. In recent years, stem cell-derived organoids gained increasing attention as promising tissue models. Here, a biobank of human and murine organoids comprising three lines from each GI segment; corpus, pylorus, duodenum, jejunum, ileum, colon was generated. RNA sequencing of 42 lines confirmed the preservation of tissue identity and revealed an extensive organization of innate immune signaling components along the cephalocaudal axis, giving each segment a specific innate immune profile. Comple-menting the region-specific expression analysis, several PRRs in human and murine organoids showed region- and species-specific function. To investigate the factors contributing to the patterning of innate immunity in the GI tract, the impact of microbial components was analyzed using murine embryo-derived, never colonized gastric and proximal intestinal organoids. Transcriptional profiling of embryo-derived organoids showed that while expression of some PRRs may depend on environmental cues as expected, an unexpectedly large part of segment-specific expression of PRR signaling components is independent of prior contact with microbial products. Further, analysis of published RNA-seq data as well as in vitro experiments using directed differentiation of organoids into specific cell types showed that expression of innate immune gene also depended on cellular differentiation along the crypt-villus axis. This underlined the importance of cellular differentiation rather than contact to microbial compounds for expression of PRRs. Lastly, analysis of published datasets of RNA-seq and ATAC-seq after knockout of the intestinal transcription factor Cdx2 demonstrated that Cdx2 is likely important for the expression of Nlrp6 and Naip1 in the murine intestine. Future experiments have to support these preliminary findings. Taken together, the expression of a large part of epithelial innate immunity is develop¬mentally defined and conserved in tissue-resident stem cells. The identification of mechanisms governing expression of genes related to immunity will provide further insights into the mechanisms that play a role in the progress of inflammatory diseases. N2 - Das Epithel des gastrointestinalen (GI) Traktes fungiert als Barriere zwischen der Umwelt und dem Körperinneren. Störungen des Epithels, darunter Veränderungen in der angeborenen Immunantwort, welche über „Pattern Recognition Receptors“(PRRs) ermöglicht wird, spielen eine bedeutende Rolle in der Entstehung gastrointestinaler Krankheiten. Auf welche Weise die angeborene Immunantwort im gastrointestinalen Trakt zwischen symbiotischen und schädlichen Mikroben unterscheidet, wie die Expression und Aktivität von PRRs organisiert sind, und die Faktoren die zu einer möglichen Organization beitragen sind bisher allerdings nicht bekannt. In den letzten Jahren haben aus Stammzellen gewonnene Organoide als vielversprechende Gewebemodelle steigende Aufmerksamkeit erregt. In dieser Arbeit wurde eine „Biobank“ humaner und muriner Organoide, jeweils bestehend aus 3 Linien jedes der gastrointestinalen Segmente Korpus, Pylorus, Duodenum, Jejunum, Ileum und Kolon generiert. Die RNA Sequenzierung von 42 Linien bestätigte den Erhalt der Gewebsidentität und zeigte eine umfangreiche Organization innerhalb der Signalkomponenten des angeborenen Immunsystems entlang der kraniokaudalen Achse, wodurch jedes Segment ein spezifisches Immunprofil erhält. Ergänzend zur regions-spezifischen Expressionsanalyse zeigten einige PRRs sowohl in humanen als auch in murinen Organoiden eine regions- und spezies-spezifische Funktion. Zur Untersuchung der Faktoren, die zur Strukturierung des angeborenen Immunsystems im GI-Trakt beitragen, wurde der Einfluss mikrobieller Komponenten untersucht. Hierfür wurden aus embryonalem Gewebe gewonnene Organoide des Magens und des proximalen Dünndarms verwendet, welche noch nicht mit dem Mikrobiom in Kontakt waren. Transkriptionsprofile embryonaler Organoide zeigten, dass die Expression einiger PRRs wie erwartet wahrscheinlich von Umweltfaktoren abhängt, dass ein unerwartet großer Anteil der segment-spezifischen Expression von Komponenten der PRR-induzierten Signalwege sich allerdings unabhängig vom Kontakt mit mikrobiellen Komponenten entwickelt. Des Weiteren zeigte die Analyse von bereits publizierten RNA Sequenzierungsdaten und in vitro Experimenten bei denen durch gezielte Differenzierung von Organoiden spezifische Zelltypen generiert wurden, dass die Expression von Genen des angeborenen Immunsystems auch von der zellulären Differenzierung entlang der Krypten-Zotten-Achse abhängt. Dies unterstreicht die Bedeutung von zellulärer Differenzierung für die Expression von PRRs, anstelle des Kontaktes zu mikrobiellen Komponenten. Auch konnte durch die Analyse bereits publizierter RNA- und ATAC-Sequenzierungsdaten nach knockout des im Dünndarm exprimierten Transkriptionsfaktors Cdx2 nachgewiesen werden, dass Cdx2 mit hoher Wahrscheinlichkeit wichtig für die Expression von Nlrp6 und Naip1 im murinen Dünndarm ist. Diese Erkenntnisse müssen in zukünftigen Experimenten validiert werden. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die Expression eines Großteils der angeborenen Immunität entwicklungsbiologisch festgelegt und in gewebe-spezifischen Stammzellen konserviert ist. Die zukünftige Identifikation von Mechanismen die die Expression von zur Immunität zugehörigen Genen steuern, wird weitere Erkenntnisse über die Mechanismen die eine Rolle in der Entwicklung entzündlicher Erkrankungen spielen bringen. KW - Organoid KW - Angeborene Immunität KW - Mustererkennungsrezeptoren KW - Gastrointestinaltrakt KW - Epithel KW - Organoids KW - Innate immunity KW - Pattern recognition receptors KW - Gastrointestinal tract KW - Epithelial layer Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-277497 ER - TY - THES A1 - Calderón Giraldo, Jeniffer T1 - Analysis of estrogen profiles including methoxyestrogen glucuronides: method validation and applicability to human plasma and breast tissue T1 - Analyse von Estrogenprofilen einschließlich Methoxyestrogenglucuroniden: Methodenvalidierung und Anwendbarkeit auf menschliches Plasma und Brustgewebe N2 - Estrogens, namely 17β-estradiol (E2) and estrone (E1) are considered to play an important role in the initiation and promotion of breast cancer (summarized in Raftogianis et al., 2000), a malignancy responsible for around 500,000 deaths per year (summarized in Ghislain et al., 2016). Two major mechanisms have been postulated to explain the carcinogenic effects of estrogens: (1) the estrogen receptor-mediated stimulation of breast cell proliferation with a concomitant enhanced rate of mutations and (2) the metabolism of hydroxylated estrogens to quinone derivatives which can react with the DNA (Russo and Russo, 2006, summarized in Yager and Davidson, 2006). Nevertheless, as a detoxifying mechanism, E1, E2, and their hydroxylated and methoxylated metabolites are reversibly conjugated into sulfates and glucuronides devoid of biological activity (summarized in Guillemette et al., 2004). Yet, despite the key detoxifying function of these conjugates, the study of their circulating levels face some significant problems: (1) analysis by techniques such as radioimmunoassay lack specificity and accuracy and requires enzymatic/chemical hydrolysis before analysis, being unable to differentiate between sulfates and glucuronides (summarized in Stanczyk et al., 2007, summarized in Wang et al., 2016), (2) very little knowledge in healthy women, which has been identified as a barrier to advance in breast cancer research (summarized in Liu, 2000), and (3) far fewer studies in pre- than in postmenopausal women (summarized in Samavat and Kurzer, 2015). Therefore, to get more insights into the research of breast cancer etiology and prevention, the analysis of circulating levels of estrogens (including metabolites and conjugates) in women without breast cancer through reliable analytical techniques, is required. N2 - Estrogene spielen eine zentralle Rolle bei der Entstehung von Brustkrebs. Jedoch haben nicht alle Estrogenmetabolite die gleiche Wirkung. Deshalb ist das Wissen über das Profil der zikulierenden Estrogene bei gesunden Frauen von entscheidender Bedeutung. Die meisten Methoden zur Analyse von Estrogenen zielen jedoch entweder nicht auf konjugierte Estrogene ab oder erfassen nur die Summe der jeweiligen freien und konjugierten Form. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war demzufolge, die Möglichkeit der Einbeziehung von Methoxyestrogenglucuroniden in eine bestehende Methode zur Analyse von Estrogenen zu evaluieren und somit die Analyse von Estrogenprofilen im menschlichen Plasma und im Brustgewebe von Frauen ohne Brustkrebs zu ergänzen. ... KW - Estrogens KW - profiles KW - human plasma Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209396 ER - TY - THES A1 - Horn, Hannes T1 - Analysis and interpretation of (meta-)genomic data from host-associated microorganisms T1 - Analyse und Interpretation von (meta-)genomischen Daten aus Wirt-assoziierten Mikroorganismen N2 - Host–microbe interactions are the key to understand why and how microbes inhabit specific environments. With the scientific fields of microbial genomics and metagenomics, evolving on an unprecedented scale, one is able to gain insights in these interactions on a molecular and ecological level. The goal of this PhD thesis was to make (meta–)genomic data accessible, integrate it in a comparative manner and to gain comprehensive taxonomic and functional insights into bacterial strains and communities derived from two different environments: the phyllosphere of Arabidopsis thaliana and the mesohyl interior of marine sponges. This thesis focused first on the de novo assembly of bacterial genomes. A 5–step protocol was developed, each step including a quality control. The examination of different assembly software in a comparative way identified SPAdes as most suitable. The protocol enables the user to chose the best tailored assembly. Contamination issues were solved by an initial filtering of the data and methods normally used for the binning of metagenomic datasets. This step is missed in many published assembly pipelines. The described protocol offers assemblies of high quality ready for downstream analysis. Subsequently, assemblies generated with the developed protocol were annotated and explored in terms of their function. In a first study, the genome of a phyllosphere bacterium, Williamsia sp. ARP1, was analyzed, offering many adaptions to the leaf habitat: it can deal with temperature shifts, react to oxygen species, produces mycosporins as protection against UV–light, and is able to uptake photosynthates. Further, its taxonomic position within the Actinomycetales was infered from 16S rRNA and comparative genomics showing the close relation between the genera Williamsia and Gordonia. In a second study, six sponge–derived actinomycete genomes were investigated for secondary metabolism. By use of state–of–the–art software, these strains exhibited numerous gene clusters, mostly linked to polykethide synthases, non–ribosomal peptide synthesis, terpenes, fatty acids and saccharides. Subsequent predictions on these clusters offered a great variety of possible produced compounds with antibiotic, antifungal or anti–cancer activity. These analysis highlight the potential for the synthesis of natural products and the use of genomic data as screening toolkit. In a last study, three sponge–derived and one seawater metagenomes were functionally compared. Different signatures regarding the microbial composition and GC–distribution were observed between the two environments. With a focus on bacerial defense systems, the data indicates a pronounced repertoire of sponge associated bacteria for bacterial defense systems, in particular, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, restriction modification system, DNA phosphorothioation and phage growth limitation. In addition, characterizing genes for secondary metabolite cluster differed between sponge and seawater microbiomes. Moreover, a variety of Type I polyketide synthases were only found within the sponge microbiomes. With that, metagenomics are shown to be a useful tool for the screening of secondary metabolite genes. Furthermore, enriched defense systems are highlighted as feature of sponge-associated microbes and marks them as a selective trait. N2 - Mikroben–Wirt Interaktionen sind der Schlüssel, um zu verstehen “Wie?” und “Warum?” Mikroben in bestimmten Umgebungen vorkommen. Mithilfe von Genomik und Metagenomik lassen sich Einblicke auf dem molekularen sowie ökolgischen Level gewinnen. Ziel dieser Arbeit war es, diese Daten zugänglich zu machen und zu vergleichen, um Erkenntnisse auf taxonomischer und funktionaler Ebene in bakterielle Isolate und bakterielle Konsortien zu erhalten. Dabei wurden Daten aus zwei verschiedenen Umgebungen erhoben: der Phyllosphäre von Arabidopsis thaliana und aus der Mesohyl–Matrix mariner Schwämme. Das Ziel war zunächst, bakterieller Genome denovo zu assemblieren. Dazu wurde ein Protokoll, bestehend aus 5 Schritten, entwickelt. Durch Verwendung verschiedener Soft- ware zum Assemblieren konnte SPAdes als am besten geeignet für die gegebenen Daten herausgearbeitet werden. Durch anfängliches Filtern der Daten konnte erste Kontamina- tion entfernt werden. Durch das Anwenden weiterer Methoden, welche ursprünglich für metagenomische Datensätze entwickelt wurden, konnten weitere Kontaminationen erkannt und von den “echten” Daten getrennt werden. Ein Schritt, welcher in den meisten pub- lizierten Assembly–Pipelines fehlt. Das Protokoll ermöglicht das Erstellen hochqualitativer Assemblies, welche zur weiteren Analyse nicht weiter aufbereitet werden müssen. Nachfolgend wurden die generierten Assemblies annotiert. Das Genom von William- sia sp. ARP1 wurde untersucht und durch dessen Interpretation konnten viele Anpassungen an die Existenz in der Phyllosphäre gezeigt werden: Anpassung an Termperaturveränderun- gen, Produktion von Mycosporinen als Schutz vor UV–Strahlung und die Möglichkeit, von der Pflanze durch Photosynthese hergestellte Substanzen aufzunehmen. Seine taxonomische Position wurde aufgrund von 16S rRNA sowie vergleichende Genomik bestimmt. Dadurch konnte eine nahe Verwandtschaft zwischen den Gattungen Williamsia und Gordonia gezeigt werden. In einer weiteren Studie wurden sechs Actinomyceten–Genome, isoliert aus Schwämmen, hinsichtlich ihres Sekundärmetabolismus untersucht. Mihilfe moderner Software konnten in zahlreiche Gen–Cluster identifiziert werden. Zumeist zeigten diese eine Zugehörigkeit zu Polyketidsynthasen, Nichtribosomalen Peptidsynthasen, Terpenen, Fettsäuren oder Sac- chariden. Durch eine tiefere Analyse konnten die Cluster mit chemischen Verbindungen assoziiert werden, welche antibakterielle oder fungizide Eigenschaften besitzen. In der letzten Untersuchung wurden Metagenome von drei Schwämmen sowie Meerwasser auf funktioneller Ebene verglichen. Beobachtet wurden Unterschiede in deren mikrobiellen Konsortien und GC–Gehalt. Schwamm–assoziierte Bakterien zeigten ein ausgeprägtes Inventar an Verteidigungsmechanismen gegenüber deren Vertretern aus dem Meerwasser. Dies beinhaltete vor allem: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, das Restriktions-Modifikationssystem, DNA Phosphorothioation, oder Gene, welche das Wachstum von Phagen hemmen können. Gene für Sekundärmetabolite waren zwischen Schwamm– und Meerwasser–Metagenomen unterschiedlich stark ausgeprägt. So konnten Typ I Polyketidsynthasen ausschließlich in den Schwamm–Metagenomen gefunden werden. Dies zeigt, dass metagenomische Daten ebenso wie genomische Daten zur Untersuchung des Sekundärmetabolismus genutzt werden können. Des Weiteren zeigt die Anhäufung an Verteidigungsmechanismen eine Anpassung von Schwamm–assoziierten Mikroben an ihre Umgebung und ist ein Hinweis auf deren mögliche selektive Eigenschaft. KW - Bakterien KW - Meeresschwämme KW - Metagenom KW - Phyllosphäre KW - Ackerschmalwand KW - Metagenomics KW - Genomics KW - Phyllosphere KW - Sponges KW - Bacteria KW - Deep sequencing KW - Arabidopsis thaliana KW - Bioinformatics Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152035 ER - TY - THES A1 - Zancolli, Giulia T1 - Amphibian diversity along the slope of Mount Kilimanjaro: from species to genes T1 - Diversität von Amphibien im Höhengradienten des Mount Kilimanjaro: von Arten zu Genen N2 - 1. Since the early nineteenth century describing (and understanding) patterns of distribution of biodiversity across the Earth has represented one of the most significant intellectual challenges to ecologists and biogeographers. Among the most striking patterns of species richness are: the latitudinal and elevational gradients, with peaks in number of species at low latitudes and somewhere at mid altitudes, although other patterns, e.g. declines with increasing elevation, are often observed. Even in highly diverse tropical regions, species richness is not evenly distributed but there are “hotspots” of biodiversity where an exceptional number of species, especially endemics, are concentrated. Unfortunately, such areas are also experiencing dramatic loss of habitat. Among vertebrate taxa, amphibians are facing the most alarming number of extinctions. Habitat destruction, pollution and emergence of infectious diseases such as chytridiomycosis, are causing worldwide population declines. Responses to these drivers can be multidirectional and subtle, i.e. they may not be captured at the species but at the genetic level. Moreover, present patterns of diversity can result from the influence of past geological, climatic and environmental changes. In this study, I used a multidisciplinary and multilevel approach to understand how and to which extent the landscape influences amphibian diversity. Mount Kilimanjaro is an exceptional tropical region where the landscape is rapidly evolving due to land use changes; additionally, there is a broad lack of knowledge of its amphibian fauna. During two rainy seasons in 2011, I recorded anurans from the foothills to 3500 m altitude; in addition, I focused on two river frog species and collected tissue samples for genetic analysis and swabs for detection of chytridiomycosis, the deadly disease caused by Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). 2. I analyzed how species richness and composition change with increasing elevation and anthropogenic disturbance. In order to disentangle the observed patterns of species diversity and distribution, I incorporated inferences from historical biogeography and compared the assemblage of Mt. Kilimanjaro and Mt. Meru (both recent volcanoes) with those of the older Eastern Arc Mountains. Species richness decreased with elevation and locally increased in presence of water bodies, but I did not detect effects of either anthropogenic disturbance or vegetation structure on species richness and composition. Moreover, I found a surprisingly low number of forest species. Historical events seem to underlie the current pattern of species distribution; the young age of Mt. Kilimanjaro and the complex biogeographic processes which occurred in East Africa during the last 20 million years prevented montane forest frogs from colonizing the volcano. 3. I focused on the genetic level of biodiversity and investigated how the landscape, i.e. elevation, topographic relief and land cover, influence genetic variation, population structure and gene flow of two ecologically similar and closely related river frog species, namely Amietia angolensis and Amietia wittei. I detected greater genetic differentiation among populations in the highland species (A. wittei) and higher genetic variation in the lowland species (A. angolensis), although genetic diversity was not significantly correlated with elevation. Importantly, human settlements seemed to restrict gene flow in A. angolensis, whereas steep slopes were positively correlated with gene flow in A. wittei. This results show that even ecologically similar species can respond differently to landscape processes and that the spatial configuration of topographic features combined with species-specific biological attributes can affect dispersal and gene flow in disparate ways. 4. River frogs of the genus Amietia seem to be particularly susceptible to chytridiomycosis, showing the highest pathogen load in Kenya and other African countries. In the last study, I collected swab samples from larvae of A. angolensis and A. wittei for Bd detection. Both species resulted Bd-positive. The presence of Bd on Mt. Kilimanjaro has serious implication. For instance, Bd can be transported by footwear of hikers from contaminated water and soil. Tourists visiting Mt. Kilimanjaro may translocate Bd zoospores to other areas such as the nearby Eastern Arc Mts. where endemic and vulnerable species may still be naïve to the fungus and thus suffer of population declines. 5. My study significantly contributed to the knowledge of the amphibian fauna of Mt. Kilimanjaro and of East Africa in general, and it represents a valuable tool for future conservation actions and measures. Finally, it highlights the importance of using a multidisciplinary (i.e. community ecology, historical biogeography, landscape genetics, disease ecology) and multilevel (i.e. community, species, population, gene) approach to disentangle patterns of biodiversity. N2 - Seit Ende des 19. Jahrhunderts ist es eine der größten intellektuellen Herausforderungen für Ökologen und Biogeographen, die Verteilungsmuster der Biodiversität auf der Erde zu beschreiben und letztlich zu verstehen. Zu den auffälligsten Mustern des Artenreichtums gehören die Gradienten, die sich in Abhängigkeit von der geographischer Breite und der Höhe über dem Meeresspiegel ergeben. Dabei treten Maxima der Artenzahl in den niederen Breiten und stellenweise in mittleren Höhenregionen auf; es lassen sich aber auch andere Muster beobachten, z.B. eine Abnahme der Artenzahl mit zunehmender Höhe. Selbst in den hochdiversen Tropen sind Arten nicht gleichmäßig verteilt. So gibt es sog. „hotspots“ der Biodiversität mit einer außergewöhnlich großen Zahl von Arten (meist Endemiten). Gerade diese Regionen sind es, die heute dramatische 1. Seit Ende des 19. Jahrhunderts ist es eine der größten intellektuellen Herausforderungen für Ökologen und Biogeographen, die Verteilungsmuster der Biodiversität auf der Erde zu beschreiben und letztlich zu verstehen. Zu den auffälligsten Mustern des Artenreichtums gehören die Gradienten, die sich in Abhängigkeit von der geographischer Breite und der Höhe über dem Meeresspiegel ergeben. Dabei treten Maxima der Artenzahl in den niederen Breiten und stellenweise in mittleren Höhenregionen auf; es lassen sich aber auch andere Muster beobachten, z.B. eine Abnahme der Artenzahl mit zunehmender Höhe. Selbst in den hochdiversen Tropen sind Arten nicht gleichmäßig verteilt. So gibt es sog. „hotspots“ der Biodiversität mit einer außergewöhnlich großen Zahl von Arten (meist Endemiten). Gerade diese Regionen sind es, die heute dramatische Habitatverluste verzeichnen. Unter den Wirbeltieren sind es die Amphibien, die dabei die höchsten Aussterberaten aufweisen. Ihre Populationen gehen weltweit zurück, wofür neben Lebensraumzerstörung auch Umweltverschmutzung und die Ausbreitung von Infektionskrankheiten, z.B. Chytridiomykose, verantwortlich sind. Reaktionen auf solche Faktoren können vielschichtig sein und fast unmerklich bleiben, was bedeutet, dass sie nicht auf Artniveau, sondern nur auf genetischer Ebene erfasst werden können. Hinzu kommt, dass die aktuellen Muster der Biodiversität auf den Einfluss vergangener Veränderungen hinsichtlich Geologie, Klima und Umwelt zurückgeführt werden können ... KW - Kilimandscharo KW - biodiversity KW - Amphibien KW - Lurche KW - Biodiversität KW - Vielfalt Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91792 ER - TY - THES A1 - Sun, Ping T1 - Alzheimer`s disease and brain insulin resistance: The diabetes inducing drug streptozotocin diminishes adult neurogenesis in the rat hippocampus – an in vivo and in vitro study T1 - Alzheimer-Krankheit und Insulinresistenz im Gehirn: Streptozotocin, das Änderungen im Insulinstoffwechsel hervorruft, reduziert die Neubildung von Neuronen im Hippocampus von adulten Ratten - In vivo- und In vitro-Untersuchungen N2 - Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disease of the brain, which is characterized by a progressive loss of memory and spatial orientation. Only less than 5-10% of AD sufferers are familial cases due to genetic mutations in the amyloid precursor protein (APP) gene or presenilin (PS) 1 and 2 genes. The cause of sporadic AD (sAD) which covers > 95% of AD patients is still unknown. Current research found interactions between aging, diabetes and cognitive decline including dementia in general and in AD in particular. Disturbances of brain glucose uptake, glucose tolerance and utilization and impairment of the insulin/insulin receptor (IR) signaling cascade are thought to be key targets for the development of sAD. In the brain of AD patients, neural plasticity is impaired indicated by synaptic and neuronal loss. Adult neurogenesis (AN), the generation of functional neurons in the adult brain, may be able to restore neurological function deficits through the integration of newborn neurons into existing neural networks. The dentate gyrus of the hippocampus is one out of few brain regions where life-long AN exists. However, there is a big controversy in literature regarding the involvement of AN in AD pathology. Most animal studies used transgenic mice based on the Amyloid ß (Aß) hypothesis which primarily act as models for the familial form of AD. Findings from human post mortem AN studies were also inconstistent. In this thesis, we focused on the possible involvement of AN in the pathogenesis of the sporadic form of AD. Streptozotocin intracerebroventricularily (STZ icv) treated rats, which develop an insulin-resistant brain state and learning and memory deficits preceding Aß pathology act as an appropriate animal model for sAD. We used STZ treatment for both parts of my work, for the in vivo and in vitro study. In the first part of my thesis, my coworkers and I investigated STZ icv treatment effects on different stages of AN in an in vivo approach. Even if STZ icv treatment does not seem to considerably influence stem cell proliferation over a short-term (1 month after STZ icv treatment) as well as in a long-term (3 months after STZ icv treatment) period, it results in significantly less immature and newborn mature neurons 3 months after STZ icv treatment. This reduction detected after 3 months was specific for the septal hippocampus, discussed to be important for spatial learning. Subsequently we performed co-localization studies with antibodies detecting BrdU (applied appr. 27 days before sacrifice) and cell-type specific markers such as NeuN, and GFAP, we found that STZ treatment does not affect the differentiation fate of newly generated cells. Phenotype analysis of BrdU-positive cells in the hilus and molecular layer revealed that some of the BrdU-positive cells are newborn oligodendrocytes but not newborn microglia. In the second part of my thesis I worked with cultured neural stem cells (NSCs) isolated from the adult rat hippocampus to reveal STZ effects on the proliferation of of NSCs, and on the survival and differentiation of their progeny. Furthermore, this in vitro approach enabled me to study cellular mechanisms underlying the observed impaired neurogenesis in the hippocampus of STZ-treated rats. In contrast to our findings of the STZ icv in vivo study we revealed that STZ supplied with the cell culture medium inhibits the proliferation of NSCs in a dose-dependent and time-dependent manner. Moreover, performing immunofluorescence studies with antibodies detecting cell-type specific markers after triggering NSCs to differentiate, we could show that STZ treatment affects the number of newly generated neurons but not of astrocytes. Analyzing newborn cells starting to differentiate and migrate I was able to demonstrate that STZ has no effect on the migration of newborn cells. Trying to reveal cellular mechanisms underlying the negative influence of STZ on hippocampal AN, we performed qRT-PCR and immunofluorescence staining and thus could show that in NSCs the expression of glucose transporter (GLUT)3 mRNA as well as IR and GLUT3 protein levels are reduced after STZ treatment. Therefore, the inhibition of the proliferation of NSCs may be (at least partially) caused by these two molecules. Interestingly, the effect of STZ on differentiating cells was shown to be different, as IR protein expression was not significantly changed but GLUT3 protein levels were decreased in consequence of STZ treatment. In summary, this project delivered further insights into the interrelation between AN the sporadic form of sAD and thus provides a basis of new therapeutic approaches in sAD treatment through intervening AN. Discrepancies between the results of the two parts of my thesis, the in vivo and in vitro part, were certainly caused to a certain extent by the missing microenvironment in the in vitro approach with cultured NSCs. Future studies e.g. using co-culture systems could at least minimize the effect of a missing natural microenvironment of cultured NSCs, so that the use of an in vitro approach for the investigation of STZ treatment underlying cellular mechanisms can be improved. N2 - Die Alzheimer-Krankheit (AK) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit. Nur etwa 5 bis 10% der Betroffenen leiden an der familiären Form, die auf bestimmten Mutationen in einzelnen Genen, wie z.B. dem Amyloid precursor protein (APP)-Gen, zurückzuführen ist. Die Ursache der sporadischen Form der AK (sAK), die mehr als 95% der Betroffenen ausmacht, ist hingegen noch weitgehend unbekannt. Jüngste Erkenntnisse weisen auf eine Wechselwirkung von hohem Alter, Stoffwechselkrankheiten wie z.B. Diabetes, und kognitiven Defiziten, welche eine Demenz im Allgemeinen und die Alzheimer-Krankheit im Besonderen kennzeichnen, hin. Deshalb werden Störungen in der Glukoseaufnahme, in der Glukosetoleranz, und in der Funktion des Insulin/Insulinrezeptorsignalweges als Schlüsselelemente für die Entstehung einer sAK angesehen. Die neuronale Plastizität der Gehirne von AK-Patienten ist stark eingeschränkt, was sich vor allem durch den Verlust von Synapsen als auch durch den Verlust ganzer Nervenzellen zeigt. Die adulte Neurogenese (AN), die Neubildung von Neuronen im Gehirn von erwachsenen Individuen, könnte durch den Einbau neu gebildeter Neurone in existierende neuronale Netzwerke eine wichtige Rolle bei der Regenerierung neurologischer Defizite spielen. Der Gyrus dentatus im Hippocampus ist eine der wenigen Gehirnregionen, in welcher lebenslang AN stattfindet. Jedoch ist noch unklar, ob eine veränderte AN an der Pathogenese der AK beteiligt ist. Es wurden bereits viele Untersuchungen zur AN in Tiermodellen durchgeführt, wobei die überwiegende Anzahl von bisher verwendeten Tiermodellen auf der Amyloid ß-(Aß) Hypothese basieren, und somit primär Modelle für die familiäre AK darstellen. Studien mit humanem post mortem-Gewebe gaben bisher jedoch auch noch keine klaren Hinweise auf die mögliche Bedeutung einer veränderten AN für die AK. In dieser Thesis sollte die Rolle der AN für die Pathogenese der sAD untersucht werden. Dafür wurden Ratten mit Streptozotocin intracerebroventrikulär (STZ icv) behandelt. Diese so behandelten Ratten gelten als Tiermodell für die sAK, da sie bereits kurze Zeit nach ihrer STZ icv-Behandlung kognitive Defizite zeigen, ihr Gehirn eine Insulin-Resistenz entwickelt, und etwas später dann auch erste Anzeichen einer Aß-Pathologie nachweisbar sind. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde in einem in vivo-Ansatz der mögliche Einfluss einer STZ icv-Behandlung auf die verschiedenen Stadien der AN untersucht. Wir konnten zeigen, dass 1 Monat nach STZ icv-Behandlung weder die Proliferation neuraler Stammzellen (neural stem cells, NSCs) noch die Bildung junger Neurone verändert war, dass aber nach 3 Monaten signifikant weniger junge unreife und auch reife Neurone entstanden sind. Diese reduzierte Anzahl neu gebildeter Neurone konnte nur im septalen Teil des Hippocampus, dem eine bedeutende Rolle beim räumlichen Lernen zugesprochen wird, nachgewiesen werden. Durch eine quantitativ ausgewertete Ko-Lokalisationsstudie mit Antikörpern gegen Bromodesoxyuridin (BrdU) (mehrmalige i.p.-Gabe 27 Tage vor Gewebeentnahme) und zelltyp-spezifischen Markern wie dem Neuronenmarker NeuN und dem Marker für Astrozypen GFAP konnten wir zeigen, dass die STZ icv-Gabe nur die Anzahl der neu gebildeten Neuronen, aber nicht die Differenzierungsrichtung der neu gebildeten Zellen verändert. Eine qualitative Phänotypanalyse BrdU-positiver Zellen ergab außerdem, dass im Hilus und in der Molekularschicht des Gyrus dentatus lokalisierte BrdU-positive Zellen neu gebildeten Oligodendrozyten, aber nicht neu gebildeten Mikrogliazellen, zugeordnet werden konnten. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich NSCs aus dem adulten Hippocampus isoliert und kultiviert, um auch auf diese Art und Weise mögliche Effekte von STZ auf die Proliferation von NSCs als auch auf das Überleben und die Differenzierung von neu geborenen Zellen zu untersuchen. Ziel dieser in vitro-Studie war eine genauere Analyse der durch STZ-Gabe ausgelösten grundlegenden zellulären Mechanismen. Im Widerspruch zu den Ergebnissen der in vivo-Studie konnte ich einen Dosis- und Zeit-abhängigen negativen Effekt von STZ auf die Proliferation der NSCs zeigen. Darüber hinaus führte die Zugabe von STZ zum Medium letztendlich zu einer verringerten Bildung von Neuronen, die Neubildung von Astrozyten zeigte sich jedoch unverändert. In einem Test zur Untersuchung der Migration neu gebildeter Zellen konnte ich keinen Einfluss von STZ auf die Migration nachweisen. Weitere Analysen ergaben, dass die verringerte Proliferation der NSCs im Zusammenhang mit einer reduzierten mRNA- als auch Protein-Expression des Glukosetransporters(GLUT)3 und mit reduzierten Insulinrezeptorkonzentrationen stehen könnte. In sich differenzierenden Zellen jedoch wurde neben einer ebenfalls reduzierten GLUT3- Proteinexpression keine veränderte Insulinrezeptorenausstattung detektiert. Zusammenfassend gibt die vorliegende Arbeit mithilfe des in vivo- als auch in vitro-Ansatzes Hinweise auf eine Bedeutung der hippocampalen AN für die Entstehung der sAK und bietet dadurch Ansatzpunkte für neue therapeutische Ansätze. Die im in vivo- und in vitro-Ansatz erzielten unterschiedlichen Resultate, die sicherlich zum Teil durch die fehlende Mikroumgebung der NSCs und sich differenzierenden Zellen im in vitro-Ansatz verursacht wurden, können in Zukunft z.B. durch Ko-Kulturen zumindest verringert werden, so dass mithilfe von in vitro-Ansätzen grundlegende zelluläre Mechanismen einer STZ-Effekts in Zukunft besser untersucht werden können. KW - Alzheimerkrankheit KW - Insulinresistenz KW - adult neurogenesis KW - streptozotocin KW - Alzheimer`s disease KW - insulin resistance Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119252 ER -