TY  - THES
A1  - Jahn, Daniel
T1  - Die Bedeutung von verkürzten Spleißvarianten des Lamin A-Gens für die Meiose und für die Pathogenese von Laminopathien
T1  - The Role of truncated A-Type Lamins for Meiosis and for the Pathogenesis of Laminopathies
N2  - Die Lamina ist ein dichtes Netzwerk aus Intermediär-Filamenten, den Laminen, an der nucleoplasmatischen Seite der inneren Kernmembran. Hier interagieren Lamine sowohl mit Transmembran-Proteinen der Kernhülle als auch mit dem Chromatin. Diese Wechselwirkungen mit Interaktionspartnern verschiedener zellulärer Kompartimente macht die Lamina, neben einer Gerüststruktur mit wichtigen mechanische Aufgaben, auch zu einer zentralen Schnittstelle von Signalwegen, die eine intrazelluläre Kommunikation zwischen Nucleus und Cytoplasma ermöglichen. Die Lamina ist somit ein entscheidender Regulator der funktionellen Organisation des Chromatins und der differentiellen Genexpression. Das Expressionsmuster der Lamine während der Spermatogenese von Säugern unterscheidet erheblich von der Lamin-Expression somatischer Zellen und weist einige Besonderheiten auf. Dies schließt unter anderem die spezifische Expression der verkürzten A-Typ Lamin-Spleißvariante C2 während der meiotischen Phase der Spermatogenese ein. Diese und andere Beobachtungen deuteten bereits länger darauf hin, dass der speziellen Zusammensetzung der Lamina und vor allem dem meiosespezifischen Lamin C2 während der Gametogenese im männlichen Organismus eine entscheidende Rolle zukommen könnte. Neuere Studien im Mausmodell bekräftigen diese Hypothese und leisten darüber hinaus einen entscheidenden Betrag dazu, die Funktion der Lamina während der Meiose auf molekularer Ebene präzise zu definieren. Im deutlichen Gegensatz zu den weitreichenden Kenntnissen zur Situation in Männchen lagen zu Beginn der vorliegenden Arbeit keine Daten über die Zusammensetzung der Lamina in weiblichen Keimzellen vor. Konsequenterweise existierten auch keine funktionellen Untersuchungen zur Relevanz der Lamina für die Oogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden diese reproduktionsbiologisch hoch interessanten Fragestellungen detailliert untersucht. Dabei zeigte sich unter anderem, dass Lamin C2 auch in weiblichen Keimzellen spezifisch während der Meiose exprimiert wird. Durch Studien an einer Lamin C2-defizienten Mauslinie wurde die Funktion von Lamin C2 in der Meiose in Weibchen genau untersucht. Dabei wurde eine erhebliche Beeinträchtigung der strukturellen Paarung der homologen Chromosomen und der homologen Rekombination in Lamin C2-defizienten Weibchen festgestellt. Da die genannten Prozesse Schlüsselereignisse für die korrekte Segregation der Homologen in späteren Stadien der Meiose sind, deuten die erzielten Ergebnisse auf eine erhebliche qualitative Beeinträchtigung der reifen Gameten in Lamin C2-defizienten Weibchen hin. Ein weiterer zentraler Aspekt der Arbeit war die Analyse der molekularen Eigenschaften des meiosespezifischen Lamin C2 in vitro. Diese Experimente definieren wichtige Unterschiede hinsichtlich seiner Polymerisationseigenschaften im Vergleich zu Laminen somatischer Zellen und tragen, zusammen mit anderen Studien, dadurch erheblich dazu bei, die Funktion von Lamin C2 in der Meiose im mechanistischen Sinne besser zu verstehen. Zudem deckt die vorliegende Arbeit erstmals einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Lamina-Zusammensetzung und der Qualität der Keimzellen weiblicher Säuger auf und ermöglicht dadurch zukünftige Studien zur Rolle der Lamine in der Oogenese, die möglicherweise auch für die menschliche Fertilität sehr interessant sein könnte. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Beschreibung einer trunkierten A-Typ Lamin-Spleißvariante in einer Mauslinie, die bislang als A-Typ Lamin-defizient angesehen wurde (Lmna-/-). Die durchgeführten Untersuchungen besitzen vor allem dadurch hohe Relevanz, dass die untersuchte Lmna-/- Mauslinie seit Jahren als das wichtigste Modell zur funktionellen Untersuchung der A-Typ Lamine gilt und bereits in einer Vielzahl von Publikationen eingesetzt wurde. In den hierzu durchgeführten Versuchen konnte das in der Lmna-/- Mauslinie persistierende A-Typ Lamin mittels diverser methodischer Ansätze als C-terminale Deletionsmutante definiert werden, der die Exons 8-11 der insgesamt 12 Exons des Lmna-Gens fehlen. Daher wurde diese Lamin A-Mutante als Lamin AΔ8-11 bezeichnet. Die Konsequenzen der C-terminalen Deletion für die physiologischen Eigenschaften des Lamin Adelta8-11 sowie die Auswirkungen seiner Expression in der Lmna-/- Mauslinie auf aktuelle Modellvorstellungen zur Funktion der A-Typ Lamine und zur Entstehung Lamin-assoziierter, humaner Erkrankungen (Laminopathien) werden in der Arbeit ausführlich diskutiert.
N2  - The nuclear lamina is a dense meshwork of intermediate filament proteins termed lamins that lines the nucleoplasmatic face of the inner nuclear membrane. By its interactions with both integral membrane proteins and chromatin the lamina constitutes a cellular hub at the nucleo-cytoplasmatic interface that serves both structural and regulatory functions. With regard to this, lamins have been implicated in basic cellular processes such as transcription, signaling and chromatin organization and are therefore currently considered as major regulators of differential gene expression. Compared to somatic cells, nuclear lamina composition of male mammalian meiocytes is remarkably different. This includes the specific temporal expression of the short A-type lamin splice variant lamin C2 at meiotic stages of male germ cell development. Several lines of evidence indicated that meiosis-specific lamin C2 could serve an essential role for meiosis in males. Recently, this hypothesis has found strong support by in vivo studies in lamin C2-deficient males and these studies substantially contributed to the precise definition of lamin C2 function on a molecular level. In contrast to this, nuclear lamina subtype composition in female meiocytes has never been analyzed and, consequently, its contribution to the formation of viable gametes in females remained elusive. In the present study, these issues have systematically been addressed. Here, detailed immunohistochemical analyses demonstrate that, as in the male, female germ cells (oocytes) undergoing prophase I of meiosis specifically express lamin C2. Following functional studies performed in lamin C2-deficient mice disclosed a pivotal role of lamin C2 for central meiotic processes in females. These include the requirement of lamin C2 for precise pairing of the homologous chromosomes that occurs in meiotic prophase I as well as its contribution to the timely and efficient progression of homologous recombination events in oocytes. Since accurate segregation of paternal chromosomes during first meiotic division is known to be critically dependent on both precise homologous pairing and recombination, these data point to an as yet unanticipated role of lamin C2 for the development of viable gametes in females. Moreover, detailed in vitro experiments were performed to analyze the molecular properties of meiosis-specific lamin C2 compared to somatic lamin variants. This revealed distinct properties of lamin C2 that are compatible with models suggesting that this short lamin variant significantly modifies the structural properties of the nuclear envelope (NE) of mammalian meiocytes. These structural modifications, in turn, are considered to facilitate dynamic repositioning of NE-attached meiotic telomeres which, besides homologous pairing and recombination, is a further most central and evolutionarily conserved hallmark of meiotic prophase I with an essential relevance for accurate genome haploidization. Thus, together with other important observations made in the lamin C2-deficient mouse model, the data presented in this thesis significantly contribute to our understanding of lamin C2 function on a molecular level. The second part of the study is based on a rather unexpected finding in another lamin-deficient mouse model. This finding concerns the Lmna-/- mouse line that was established in 1999 by Sullivan and others by gene targeting of the Lmna gene encoding A-type lamins. Since then, these mice have frequently been used in a multitude of important studies that aimed to analyze various different aspects of A-type lamin function. This thesis now provides compelling evidence that, unexpectedly and contradicting previous reports, a truncated lamin A mutant persist in the Lmna-/- mouse line that was considered as completely devoid of A-type lamins thus far. By the use of various technical approaches, including detailed mass spectrometry, the presented data precisely define the lamin A variant present in Lmna-/- mice (designated lamin Adelta8-11) as a C-terminal lamin deletion mutant that lacks domains with known important functions for protein interactions and posttranslational processing. Based on these findings, implications for the interpretation of previous reports using Lmna-/- mice as well as for our current models of A-type lamin function and the pathophysiology of lamin-associated disorders in humans (laminopathies) are considered in the discussion of the thesis.
KW  - Meiose
KW  - Kernhülle
KW  - Lamine
KW  - Gamet
KW  - Laminopathie
KW  - meiosis . nuclear envelope
KW  - lamins
KW  - gamete
KW  - laminopathy
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74123
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seida, Ahmed Adel
T1  - The Immunomodulatory Role of Endogenous Glucocorticoids in Ovarian Cancer
T1  - Die immunmodulatorische Bedeutung der lokalen Aktivierung von endogenem Cortison im Ovarialkarzinom
N2  - Ovarian cancer currently causes ~6,000 deaths per year in Germany alone. Since only palliative treatment is available for ovarian carcinomas that have developed resistance against platinum-based chemotherapy and paclitaxel, there is a pressing medical need for the development of new therapeutic approaches. As survival is strongly influenced by immunological parameters, immunotherapeutic strategies appear promising. The research of our group thus aims at overcoming tumour immune escape by counteracting immunosuppressive mechanisms in the tumour microenvironment. In this context, we found that tumour-infiltrating myeloid-derived suppressor cells (MDSC) or tumour associated macrophages (TAM) which are abundant in ovarian cancer express high levels of the enzyme 11β-hydroxysteroid dehydrogenase1 (11-HSD1). This oxido-reductase enzyme is essential for the conversion of biologically inactive cortisone into active cortisol. In line with this observation, high endogenous cortisol levels could be detected in serum, ascitic fluid and tumour exudates from ovarian cancer patients. Considering that cortisol exerts strong anti-inflammatory and immunosuppressive effects on immune cells, it appears likely that high endogenous cortisol levels contribute to immune escape in ovarian cancer. We thus hypothesised that local activation of endogenous glucocorticoids could suppress beneficial immune responses in the tumour microenvironment and thereby prevent a successful immunotherapy. To investigate the in vivo relevance of this postulated immune escape mechanism, irradiated PTENloxP/loxP loxP-Stop-loxP-krasG12D mice were reconstituted with hematopoietic stem cells from either glucocorticoid receptor (GR) expressing mice (GRloxP/loxP) or from mice with a T cell-specific glucocorticoid receptor knock-out (lck-Cre GRloxP/loxP) mice. In the host mice, the combination of a conditional PTEN knock-out with a latent oncogenic kras leads to tumour development when a Cre-encoding adenovirus is injected into the ovarian bursa. Using this model, mice that had been reconstituted with GC-insensitive T cells showed better intratumoural T cell infiltration than control mice that had received functionally unaltered GRloxP/loxP cells via adoptive transfer. However, tumour-infiltrating T cells mostly assumed a Foxp3+ (regulatory) phenotype and survival was even shortened in mice with cortisol-insensitive T cells. Thus, endogenous cortisol seems to inhibit immune cell infiltration in ovarian cancer, but productive anti-tumour immune responses might still be prevented by further factors from the tumour microenvironment. Thus, our data did not provide a sufficiently strong rationale to further pursue the antagonisation of glucocorticoid signalling in ovarian cancer patients, Moreover, glucocorticoids are frequently administered to cancer patients to reduce inflammation and swelling and to prevent chemotherapy-related toxic side effects like nausea or hypersensitivity reactions associated with paclitaxel therapy. Thus, we decided to address the question whether specific signalling pathways in innate immune cells, preferentially in NK cells, could still be activated even in the presence of GC. A careful investigation of the various activating NK cell receptors (i.e. NKp30, NKp44, NKp46), DNAM-1 and NKG2D) was thus performed which revealed that NKp30, NKp44 and NKG2D are all down-regulated by cortisol whereas NKp46 is actually induced by cortisol. Interestingly, NKp46 is the only known receptor that is strictly confined to NK cells. Its activation via crosslinking leads to cytokine release and activation of cytotoxic activity. Stimulation of NK cells via NKp46 may contribute to immune-mediated tumour destruction by triggering the lysis of tumour cells and by altering the cytokine pattern in the tumour microenvironment, thereby generating more favourable conditions for the recruitment of antigen-specific immune cells. Accordingly, our observation that even cortisol-treated NK cells can still be activated via NKp46 and CD2 might become valuable for the design of immunotherapies that can still be applied in the presence of endogenous or therapeutically administered glucocorticoids.
N2  - Ovarialkarzinome verursachen allein in Deutschland jährlich ca. 6.000 Todesfälle. Da bei Ovarialkarzinomen, die eine Resistenz gegen eine platinbasierte Chemotherapie mit cis-Platin und gegen Paclitaxel entwickelt haben, nur eine palliative Behandlung möglich ist, gibt esbesteht ein dringenden dringender Bedarf an der Entwicklung von neuen Therapieansätzen. Das Überleben der Patientinnen ist sehr stark von immunologischen Parametern beeinflusst, und somit erscheinensodass immuntherapeutische Strategien als ein vielversprechender Ansatzerscheinen. Das Ziel der Forschung in unserer Gruppe ist daher, dem „Tumor-Immun-Escape“ durch eine Verhinderung von immunosuppressiven Mechanismen in im der Tumormikromilieu-Mikroumgebung entgegenzuwirken. In diesem Zusammenhang haben wir gefundenentdeckt, dass Tumor-infiltrierende Suppressorzellen der myeloiden Ursprungsschen Reihe (MDSC) oder Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), die in Ovarialkarzinomen reichlich vorhanden sind, das Enzym 11β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 1 (11β-HSD1) in großer Menge exprimieren. Diese Oxido-Reduktase ist essentiell bei derfür die Umwandlung von biologisch inaktiven Cortison in biologisch aktives Cortisol. In Übereinstimmung damit, werden hohe endogene Cortisol Spiegel in Seren, Azites und Tumorsekreten von Ovarialkarzinom-Patientinnen gemessen. Unter Berücksichtigung der starken anti-inflammatorischen und immunsuppressiven Eigenschaften von Cortisol, erscheint es sehr wahrscheinlich, dass ein hoher endogener Cortisol-Spiegel zum „Immune-Escape“ von Ovarialkarzinomzellen beiträgt. Unsere Vermutung ist Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die lokale Aktivierung von endogenen Glucocorticoiden zu einer Unterdrückung der nützlichen Immunantwort in der Tumor-Mikroumgebung führt und eine erfolgreiche Immuntherapie verhindert. Um die in vivo Relevanz dieses postulierten „Immune-Escape“ Mechanismuses zu untersuchen, wurden bestrahlte PTENloxP/loxP loxP-Stop-loxP-krasG12D Mäuse mit Hämatopoetischen hämatopoietischen Stammzellen entweder aus Glucocoprticoid-Rezeptor (GR) exprimierenden Mäusen (GRloxP/loxP) oder aus Mäusen mit einem T-Zell spezifischen Glucocoprticoid-Rezeptor knock-out (lck-Cre GRloxP/loxP) rekonstituiert. In diesen Mäusen führte die Kombination von konditionellem PTEN knock-out mit einer latenten Expression von oncogenen onkogenen Kras zur Tumorentwicklung sobald ein für Cre-Rekombinase codierendes Adenovirus in die Ovarien-ovarielle Bursa injiziert wurdewird. Mit Hilfe von diesesm Modells wurde gezeigt, dass Mäuse, die mit GC-unempfindlichen T-Zellen rekonstituiert worden waren eine bessere intratumorale T-Zell Infiltration zeigten im Vergleich zu Kontroll-Mäusen, die über einen adaptiven Transfer funktionell unveränderte GRloxP/loxP Zellen erhalten hatten. Tumor-infiltrierende T-Zellen haben aber in der Mehrzahl einen hauptsächlich angenommen Foxp3+ (regulatorischen) Phänotyp angenommen, sodass und das Überleben dieser Zellen war sogar verkürzt in Mäusen mit Cortisol-unempfindlichen T-Zellen sogar eine verkürzte Überlebenszeit aufwiesen. Somit scheint endogenes Cortisol die Infiltration von Immunzellen beim Ovarialkarzinom zu inhibieren, aber eine produktive antitumorale Immunantwort könnte scheint trotzdem verhindert werden durch andere Faktoren aus im Tumormikromilieu verhindert zu werden.der Tumor-Mikroumgebung. Somit bieten unsere Daten keine ausreichend starke Begründung, für eineum das Konzept der Antagonisierung endogener,der durch Glucocorticoide ausgelösten ausgelöster Signale in Ovarialkarzinom-Patientinnen weiter zu verfolgen. Des Weiteren werden Glucocorticoide oft Krebspatienten verabreicht, um Entzündungen und Schwellungen zu reduzieren sowie Chemotherapie. bedingte Nebeneffekte wie Übelkeit oder Überempfindlichkeitsreaktionen, die mit einer Paclitaxel-Therapy einhergehen, zu verhindern. Daher wurde der Frage nachgegangen, ob spezifische Signalwege im angeborenem Immunsystem, insbesondere in NK-Zellen, auch in Anwesenheit von GC noch aktiviert werden können. Eine Untersuchung der verschiedenen NK-Zellen aktivierenden Rezeptoren (NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1 und NKG2D) wurde durchgeführt. Dabei wurde eine Herunterregulation von NKp30, NKp44 und NKG2D sowie eine Induktion von NKp46 durch Cortisol festgestellt. Von besonderem Interesse ist, dass NKp46 der einzige bekannte Rezeptor ist, der nur von NK-Zellen exprimiert wird. Seine Aktivierung bewirkt eine Cytokinfreisetzung Zytokinfreisetzung und eine Aktivierung Induktion der zytotoxischen AktivitätNK Zell-Antwort. Eine Stimulation der NK-Zellen über NKp46 könnte zur immun-vermittelten Tumorzerstörung durch Auslösen der Tumorzell-Lyse und durch eine Veränderung des Cytokinexpressionsmusters Zytokinexpressionsmusters in im Tumormikromilieu der Tumor-Mikroumgebung beitragen. Somit würden verbesserte Bedingungen für die Rekrutierung von antigen-spezifischen Immunzellen generiert. Unsere Beobachtung, dass selbst Cortisol behandelte NK-Zellen immer noch über NKp46 und CD2 aktiviert werden können, könnten nützlich zur Entwicklung von Immuntherapien sein, die in Gegenwart von endogenen oder therapeutisch verabreichten Glucocorticoide angewendet werden sollen.
KW  - Cortison
KW  - Eierstockkrebs
KW  - Cortison
KW  - Ovarialkarzinom
KW  - Endogenous Glucocorticoids
KW  - Ovarian Cancer
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73901
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TY  - THES
A1  - Hancock, Christine [geb. Herbst]
T1  - Influence of land use on Plantago lanceolata L. and its higher trophic levels at different spatial scales and in three geographic regions
T1  - Einfluß von Landnutzung auf Plantago lanceolata L. und seine höheren trophischen Ebenen auf unterschiedlichen räumlichen Skalen und in drei geographischen Regionen.
N2  - Heutzutage prägen landwirtschaftlich genutzte Flächen einen großen Teil der deutschen Landschaft. Die Umwandlung von natürlichen Lebensräumen zu bewirtschaftetem Grünland beeinflusst grundlegend die Vielfalt von Pflanzen und Tieren. Zwar erhöht die intensive Nutzung dieser Flächen die Produktivität der Pflanzen oder die Biomasse als Viehfutter auf den Wiesen. Wie diese Einflüsse auf die Artenvielfalt, Ökosysteme und trophische Interaktionen, im Laufe der Jahre wirken ist jedoch immer noch nicht vollständig verstanden. Um die Funktionen der Biodiversität in einer landwirtschaftlich genutzten Fläche zu verstehen konzentrierte sich meine Arbeit auf den Einfluss der Landnutzung (Düngung, Beweidung und Mahd) auf ein Herbivor-Parasitoid-System von Plantago lanceolata. Der Spitzwegerich ist ein generalistisches Kraut mit kosmopolitischem Vorkommen. Er kann in einem sehr breiten Spektrum von Bodenverhältnissen (sowohl in nassen und auch in trockenen Lebensräumen) vorkommen und ist daher ein ideales Modellsystem zur Untersuchung tritrophischer Systeme in einem Landnutzungs-intensitätsgradienten. Die Rüsselkäfer Mecinus labilis und M. pascuorum ernähren sich von P. lanceolata und legen dort ihre Eier ab. Mesopolobus incultus ist ein generalistisch lebender Parasitoid, der verschiedenen Insektenordnungen parasitiert. Die einzigen Wirte auf P. lanceolata sind jedoch die beiden erwähnten Rüsselkäferarten. Das Ziel meiner Studie war es, den Einfluss der Landnutzung auf ein tritrophisches System und seiner umgebenden Vegetation (Struktur, Dichte und Artenreichtum) auf unterschiedlichen räumlichen Skalen wie Subplot, Plot und Landschaftebene in drei verschiedenen Regionen (Nord-, Mittel- und Süddeutschland) zu untersuchen. Ich untersuchte den Einfluss der Nutzungsintensität nicht nur korrelativ, sondern auch experimentell. Zusätzlich zielte ich darauf ab, aufzuzeigen wie die Vegetationszusammensetzung die Metabolite der Wirtspflanze verändert und ob diese Veränderungen Auswirkungen auf höhere trophische Ebenen im Feld haben.
N2  - Nowadays, agriculturally used areas form a major part of the German landscape. The conversion from natural habitats to agriculturally used grasslands fundamentally influences the diversity of plants and animals. Intensive use of these areas increases indeed the productivity of crop or biomass on meadows as food source for cattle. How these influences affect biodiversity, ecosystems and trophic interactions over years is still not understood completely. To understand biodiversity functions in an agriculturally used area my study focused on the influence of land use (fertilization, grazing and mowing) on a herbivore-parasitoid system of Plantago lanceolata. The ribwort plantain is a generalist herb of cosmopolitan distribution. It can grow in a very broad range of ground conditions (both in wet and dry habitats), which makes P. lanceolata an ideal model system for investigating tritrophic interactions in a gradient of land use intensity. The weevils Mecinus labilis and M. pascuorum feed and oviposit on P. lanceolata. Mesopolobus incultus is a generalist parasitoid that parasitizes different insect orders. However its only hosts on P. lanceolata are the two weevil species mentioned before. The intention of my study was to investigate the influence of land use on a tritrophic system and its surrounding vegetation (structure, density and species richness) at different spatial scales like subplot, plot and landscape level in three different regions (north, middle and south of Germany). I studied the influence of land use intensity not only correlative but also experimentally. Additionally I aimed to reveal how vegetation composition changes host plant metabolites and whether these changes impact higher trophic levels in the field.
KW  - Landnutzung
KW  - Spitzwegerich
KW  - Rüsselkäfer
KW  - Parasit
KW  - Herbivor-Parasitoid Interaktion
KW  - Landschaft
KW  - Land use
KW  - ribwort plantain
KW  - herbivore-parasitoid interaction
KW  - landscape
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73877
ER  - 
TY  - THES
A1  - Oberländer, Uwe
T1  - Untersuchung der immunstimulatorischen Effekte von Neuromelanin (NM) auf dendritische Zellen und deren Bedeutung in der Pathogenese von Morbus Parkinson
T1  - Investigation of immunostimulatory effects of Neuromelanin on dendritic cells and relevance for Parkinsons disease
N2  - Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein.
N2  - Background: The degeneration of neuromelanin (NM)-containing dopaminergic cells in the substantia nigra (SN) and a resulting reduction in striatal dopamine is a key feature in Parkinsons´s Disease (PD). Increased anti-melanin antibodies in sera of Parkinson patients had been shown recently, suggesting that NM may act as an autoantigen in PD. In this work it was asserted that NM is being recognized by dendritic cells (DCs), the major cell type for inducing T- and B-cell responses in vivo. This recognition of NM by DCs is a prerequisite to trigger an autoimmune response directed against NM-associated structures. Methods: Murine dendritic cells (mDC), generated from bone marrow, were treated with NM of SN from human subjects or with synthetic dopamine melanin (DAM) after both melanins were tested free of endotoxin contamination. Phagocytosis was documented with confocal microscopy. The expression of MHC II and CD86 was analyzed by flow cytometry. Concentrations of inflammatory cytokines TNF- and interleukin IL-6 were determined by ELISA. Finally the function of activated mDCs was tested by allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR). Results: NM was phagocytized effectively by mDCs, which subsequently developed a mature phenotype (CD86high/MHC IIhigh). In addition, NM-activated mDCs secreted the proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-. Finally, they potently triggered T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction, showing that mDC activation was functional to induce a primary T cell response. On the contrary, DAM, which lacks the protein and lipid components of NM but mimics the dopamine-melanin backbone of NM, had only very little effect on mDC phenotype and function. Discussion: NM is recognized by DCs in vitro and triggers their maturation. If this process occurs in vivo, it would allow DCs to transport and present SN antigens to the adaptive immune system, thus leading to autoimmmunity in susceptible individuals. This finding offers a rationale for an autoimmune-based pathomechanism of PD with NM as the initial trigger.
KW  - Parkinson-Krankheit
KW  - Melanin
KW  - dendritische Zellen
KW  - Autoimmunität
KW  - Parkinson
KW  - Neuromelanin
KW  - dendritische Zellen
KW  - Autoimmunität
KW  - Parkinsons Disease
KW  - Neuromelanin
KW  - dendritic cells
KW  - Autoimmunity
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73684
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TY  - THES
A1  - Pleiser, Sandra
T1  - Mouse genetic analyses of Spir functions
T1  - Maus-genetische Analysen zur Funktion von Spir
N2  - Das Aktin-Zytoskelett ist für viele zelluläre Funktionen unerlässlich, dazu gehören der strukturelle Aufbau von Zellen, die Zellwanderung und Vesikeltransportprozesse. Die funktionelle Vielfalt der Aktinstrukturen spiegelt sich in einer Vielzahl verschiedener molekularer Mechanismen wieder, welche die Polymerisierung von Aktinfilamenten regulieren. Die sponante Aktinpolymerisierung wird jedoch verhindert aufgrund der Instabilität von kleinen Aktin Oligomeren und durch Aktin Monomer bindende Proteine, welche die Bildung solcher Oligomere unterbinden. Aktinnukleationsfaktoren helfen diese kinetische Barriere der Filamentbildung zu überwinden und sind wesentlich für die Erzeugung von neuen Aktinfilamenten an bestimmten subzellulären Kompartimenten. Spir Proteine sind die ersten beschriebenen Mitglieder der neuen Klasse von WH2 Domänen Aktinnukleationsfaktoren. Sie leiten die Polymerisierung von Aktin ein, indem sie Aktinmonomere an die vier WH2 Domänen im Zentrum des Proteins binden. Trotz ihrer Eigenschaft Aktinpolymerisation in vitro selber zu nukleieren, bilden Spir Proteine einen regulatorischen Komplex mit anderen Aktinnukleatoren der formin Untergruppe von forminen. Spir hat eine Funktion bei der Regulierung von vesikulär erzeugten filamentösen Aktinstrukturen, Vesikeltransportprozessen und der Bildung der Teilungsfurche während der asymmetrischen meiotischen Zellteilung. Das Säugetiergenom kodiert zwei spir Gene, spir-1 und spir-2. Die entsprechenden Proteine haben einen identischen strukturellen Aufbau und sind zu einem großen Teil homolog zueinander. Um die Spir Funktion im sich entwickelnden und adulten Nervensystem zu untersuchen, wurde die bisher unbekannte Expression des Maus spir-2 Gens analysiert. Real-time PCR Analysen haben ergeben, dass spir-2 in adulten Mäusen in Oozyten, dem Gehirn, im Gastrointestinaltrakt, den Hoden und der Niere exprimiert wird. In situ Hybridisierungen wurden durchgeführt um die zelluläre Natur der spir Expression nachzuweisen. Während der Embryogenese haben in situ Hybridisierungen gezeigt, dass spir-2 im sich entwickelnden Nervensytem und Darmtrakt exprimiert wird. In adulten Mausgeweben, wurde die höchste Expression von spir-2 in Epithelzellen des Verdauungstraktes, in neuronalen Zellen des Nervensystems und in Spermatocyten gefunden. Im Gegensatz zur eher begrenzten Expression des Maus spir-1 Gens, welches überwiegend im Nervensystem, den Oozyten und Hoden zu finden ist, zeigen die hier aufgeführten Daten ein breiteres Expressionsmuster des spir-2 Gens und unterstützen damit eine allgemeinere zellbiologische Funktion der neuen Aktinnukleatoren. Um die Funktion des Spir Proteins im sich entwickelnden und adulten Nervensystem zu untersuchen, wurden Spir-1 defiziente Mäuse mit Hilfe der gene trap Methode generiert. Spir-1 defiziente Mäuse sind lebensfähig und eignen sich daher perfekt um die Neurobiologie des Spir-1 Aktinnukleators zu untersuchen. Die Analyse von primären kortikalen Neuronen von Spir-1 defizienten Mäusen zeigte eine Reduktion dendritischer Verzweigungen und ist die erste Beschreibung einer neuronalen Funktion von Spir-1. Desweiteren wurde eine transgene Mauslinie (thy1-GFP-M) eingesetzt, die das grüne Fluoreszenzprotein (GFP) unter der Kontrolle von Neuronen-spezifischen Elementen des thy1 Promoters exprimiert. GFP ist dabei nur in einer Teilmenge von Neuronen exprimiert, färbt diese Neuronen jedoch in ihrer Gesamtheit an. Spir-1 defiziente Mäuse, die das GFP Transgen exprimieren wurden generiert und analysiert. Es wurde herausgefunden, dass Spir-1 defiziente Mäuse eine reduzierte Anzahl an dendritischen Dornen im entorhinalen Kortex im Vergleich zu Wildtyp- Geschwistertieren aufweisen. Zusammengefasst gibt diese Studie neue Erkenntnisse über die zellbiologische Funktion von Spir und liefert Einsichten wie das neuronale Netzwerk sturkturiert wird.
N2  - The actin cytoskeleton is essential for many cellular functions, such as the regulation of cell morphology, cell migration and vesicle transport processes. The functional diversity of actin structures is reflected in a variety of distinct molecular mechanisms regulating the polymerization of actin filaments. The spontaneous polymerization of actin however is inhibited, by both the instability of small actin oligomers and by actin monomer binding proteins, which prevent the formation of such oligomers. Actin nucleation factors help to overcome this kinetic barrier of filament initiation and are essential for the generation of novel actin filaments at specified subcellular compartments. Spir proteins are the founding members of the novel class of WH2 domain containing actin nucleation factors. They initiate actin polymerization by binding of actin monomers to four WH2 domains in the central part of the protein. Despite their ability to nucleate actin polymerization in vitro by themselves, Spir proteins form a regulatory complex with the distinct actin nucleators of the formin subgroup of formins. Spir functions in the regulation of vesicular originated filamentous actin structures, vesicle transport processes and the assembly of the cleavage furrow during asymmetric meiotic cell divisions. The mammalian genome encodes two spir genes, spir-1 and spir-2. The corresponding proteins have an identical structural array and share a high degree of homology. In order to elucidate the Spir function in developing and adult mouse tissues, the yet unknown expression of the mouse spir-2 gene was addressed. Real-time PCR analysis revealed highest expression of spir-2 in oocytes, the brain, throughout the gastrointestinal tract, testis and kidney of adult mice. In situ hybridizations were performed to substantiate the cellular nature of spir gene expression. During embryogenesis in situ hybridizations show spir-2 to be expressed in the developing nervous system and intestine. In adult mouse tissues highest expression of spir-2 was detected in the epithelial cells of the digestive tract, in neuronal cells of the nervous system and in spermatocytes. In contrast to the more restricted expression of the mouse spir-1 gene, which is mainly found in the nervous system, oocytes and testis, the data presented here show a distinct and broader expression pattern of the spir-2 gene and by this support a more general cell biological function of the novel actin nucleators. In order to address the function of Spir proteins in the developing and adult nervous system, Spir-1 deficient mice were generated by a gene trap method. Spir-1 deficient mice are viable and provide a perfect tool to address the neurobiological function of the Spir-1 protein. Analyses of primary cortical neurons from Spir-1 deficient mice revealed a specific reduction of dendritic branchpoints and are the first description of a neuronal Spir-1 function. Further, a transgenic mouse line (thy1-GFP-M) was employed that expresses the green fluorescent protein (GFP) under the control of neuron specific elements from the thy1 promoter. GFP is thereby expressed in only a subset of neurons and labels the neurons in their entirety. Spir-1 deficient mice carrying the GFP transgene were generated and analyzed. It was found that Spir-1 deficient mice exhibit a reduced number of dendritic spines in the entorhinal cortex compared to wildtype littermates. All together this study gives novel information about the cell biological function of Spir and provides insights how cytoskeletal functions structure the mammalian neuronal network.
KW  - Actin-bindende Proteine
KW  - Knockout <Molekulargenetik>
KW  - Spir
KW  - Aktinnukleation
KW  - neuronale Differenzierung
KW  - Spir
KW  - Actin nucleation
KW  - knock-out mouse
KW  - neuronal differentiation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73634
N1  - Die Dissertation wurde an der Uni Regensburg geschrieben (externe Promotion)
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mihlan, Sabrina [geb. Jasper]
T1  - Identifikation von Zonula Occludens 2 (ZO-2) als neuen LASP-1 Interaktionspartner und Aufklärung der LASP-1/ZO-2 Kern-Zytosol Translokation
T1  - Identification of zonula occludens 2 (ZO-2) as a new LASP-1binding partner and the elucidation of LASP-1/ZO-2 nucleo-cytoplasmatic shuttling
N2  - LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor.
N2  - LASP-1 (LIM and SH3 protein) is ubiquitously expressed at basal levels, but was found to be pathophysiologically overexpressed in several cancer entities. LASP-1 exhibits one LIM domain, two actin binding domains and one SH3 domain. On the one hand, LASP-1 is predominantly localized at focal contacts, lamellopodia and membrane ruffles, on the other hand a nuclear localization is observed. LASP-1 works as actin-binding scaffolding protein and is essential for migration and proliferation. Silencing of LASP-1 by RNA- interference in various cancer cell lines results in a strong inhibition of proliferation and migration. However, in tumor cells, an additional striking nuclear localization of the protein was observed, which significantly correlates with tumor size and a poor long term survival of the patients. Therefore, LASP-1 might act additionally as transcription factor or transcriptional co-factor In this work, a novel LASP-1 binding partner, zonula occludens protein 2 (ZO-2), was identified and its role in the signal transduction pathway of LASP-1 nucleo-cytoplasmic shuttling was established. Upon LASP-1 phosphorylation at Ser-146 by activated cAMP-dependent protein kinase A (PKA), LASP-1 binding to Zyxin and F-actin decreases and the protein detaches, in complex with ZO-2, from the plasma membrane and translocates into the nucleus. These results were confirmed by nuclear and cytosolic separation assays. Pull-down assays with mutants revealed that ZO-2 binds with its proline-rich sequence (amino acids 1103-1121) to the SH3 domain in LASP-1. LASP-1 exhibits no nuclear localization signal and requires ZO-2 to shuttle into the nucleus. In situ proximity ligation assay confirmed the direct binding between LASP-1 and ZO-2 and visualized the shuttling. Inhibition of the nuclear export system by Leptomycin B results in an accumulation of both proteins in nuclei. Nuclear export is regulated by the newly identified nuclear export signal in LASP-1 (amino acids 70-77) and mediated by CRM1. Finally LASP-1 relocalizes to focal contacts. This new identified pathway serves presumably as a signal transductor from the focal contacts to the nucleus for gene regulation.
KW  - Tumorzelle
KW  - Skleroproteine
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Überexpression
KW  - Zellkern
KW  - Kern-Zytosoltranslokation
KW  - ZO-2
KW  - Phosphorylierung
KW  - LASP-1
KW  - nuclear cytosolic translocation
KW  - ZO-2
KW  - phosphorylation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73442
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schlegelmilch, Katrin
T1  - Molecular function of WISP1/CCN4 in the musculoskeletal system with special reference to apoptosis and cell survival
T1  - Funktionsüberprüfung von WISP1/CCN4 im mukuloskelettalen System mit besonderem Augenmerk auf Apoptose und das Überleben der Zellen
N2  - Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death.
N2  - Humaner adulter Knorpel besitzt weder Blutgefäße noch Nerven, weswegen diese Knorpelart im Vergleich zu anderen Gewebetypen ein verringertes Wachstum und Regenerierung wiederspiegelt. Den Hauptteil der Zellen im adulten Knorpel stellen die Chondrozyten (Knorpelzellen)dar, welche sich zuvor aus humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) entwickelt haben. Sie sind verantwortlich für die Bildung und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) des Knorpelgewebes, welche hauptsächlich aus Kollagen und Proteoglykanen besteht. Signale, die durch Chondrozyten erzeugt oder weitergeleitet werden, finden in der Regel durch Interaktion mit Molekülen der im Knorpel liegenden ECM statt. Mitglieder der CCN-Familie gelten hierbei als bedeutende extrazelluläre Matrixproteine, die bei verschiedenen regulatorischen Prozessen während der Skelettentwicklung und der Frakturheilung eine Rolle spielen. In dieser Doktorarbeit liegt das Hauptaugenmerk auf dem CCN Protein WISP1/CCN4. Dieses Protein gilt bereits in verschiedenen Zellen als ein notwendiger Überlebensfaktor und scheint desWeiteren eine regulatorische Funktion während der Differenzierung von hMSCs in Chondrozyten auszuüben. Die generelle Bedeutung von WISP1 für das muskuloskelettale System ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt und soll während dieser Doktorarbeit mittels einer Reihe von molekular- und zellbiologischer Methoden genauer untersucht werden. Hierfür wurde zu Beginn eine erfolgreiche Herunterregulierung endogen hergestellter WISP1 Transkripte mittels Genexpressionshemmung (gene-silencing) in verschiedenen muskuloskelettalen Zellen erzielt. Interessanterweise scheint WISP1 eine bedeutende Rolle für das Überleben dieser Zellen zu spielen, da ein Verlust bei allen untersuchten Zelllinien und primären hMSCs zum Zelltod führte. Um zu Grunde liegende Mechanismen genauer zu untersuchen, wurden daraufhin Microarray Analysen von hMSCs und Tc28a2 Chondrocyten durchgeführt (jeweils WISP1 herunterreguliert vs Kontrollzellen). In diesem Zusammenhang identifizierten bioinformatische Analysen differentielle Expressionen verschiedener apoptoseresponsiver Gene. So scheint eine Apoptoseinduktion über TRAIL und/oder p53 in hMSCs stattzufinden, wohingegen eine starke Regulation des MAPK-Signalweges in Chondrozyten detektiert wurde. Neben diesen Genregulationen, deckten die Analysen ebenso Gengruppen auf, die bei anderen wichtigen zellulären Abläufen eine Rolle spielen. Hier sind in WISP1 herunterregulierten hMSCs u.a. viele differenziell exprimierte Gene zu nennen, die durch Interferone induzierbar sind. In Chondrozyten dagegen scheint eine verringerte WISP1 Expression Genexpressionen zu beeinflussen, welche die Knorpelhomeostase regulieren. Die Ergebnisse, die während dieser Doktorarbeit erzielt wurden, verdeutlichen die Wichtigkeit von WISP1 für das Überleben von primären hMSCs und Chondrozyten. Darüberhinaus verstärken die bioinformatischen Analysen die Annahme, das WISP1 regulatorische Funktionen für die Knorpelhomeostase ausübt. Somit bietet diese Doktorarbeit ein essentielles Fundament, um die Rolle von WISP1 bei der Aufrechterhaltung der Knorpelhomeostase und des Zelltodes weiter zu erforschen.
KW  - Knorpelzelle
KW  - Extrazelluläre Matrix
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Apoptosis
KW  - WISP1/CCN4
KW  - mesenchymale Stammzellen
KW  - Apoptose
KW  - WISP1/CCN4
KW  - mesenchymal stem cells
KW  - apoptosis
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73430
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TY  - THES
A1  - Englberger, Eva
T1  - Gene regulation in hearts of Hey-mutant mouse embryos and monitoring of sub-cellular Hey1 distribution
T1  - Genregulation in Herzen Hey-mutierter Mausembryonen und Darstellung der sub-zellulären Verteilung von Hey1
N2  - Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus.
N2  - Am Embryonaltag 14,5 zeigten Herzproben von Hey2-KO-Mäusen eine deutliche Hochregulation mehrerer Gene, die auf das Fehlen von Hey2 zurückzuführen ist, da Kontroll-Tiere gezeigt haben, dass die morphologischen Veränderungen in der Herzstruktur keinen Einfluss auf die Genregulation haben. Vereinzelt wurden die regulierten Gene noch mittels in situ Hybridisierung weiter verdeutlicht. In Immunfloureszenzexperimenten wurde Hey1 im Zellkern lokalisiert. Auf Proteinebene zeigte sich allerdings auch ein Vorhandensein von Hey1 im Cytoplasma der Zellen. Die Kernlokalisaiton von Hey1 veränderte sich während des gesamten Zellzykluses nicht und wurde auch nicht durch die Co-Expression von CaMKII beeinflusst oder die Inhibition oder Stimulation anderer Signalwege in der Zelle. Hey1 scheint nicht mit den Kerntransportproteinen Importin-alpha und -beta zu interagieren, so dass weiterhin nach einem Kernimport-System für Hey1 gesucht werden muss.
KW  - Maus
KW  - Herz
KW  - Embryonalentwicklung
KW  - Genregulation
KW  - Herzentwicklung
KW  - Kerntransport
KW  - Hey
KW  - heart development
KW  - nuclear transport
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73395
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heidbreder, Meike
T1  - Association and Activation of TNF-Receptor I Investigated with Single-Molecule Tracking and Super-Resolution Microscopy in Live Cells
T1  - Assoziierung und Aktivierung des TNF-Rezeptor I untersucht mit Einzelmolekül-Tracking und hochauflösender Mikroskopie in lebenden Zellen
N2  - Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro.  
N2  - Zelluläre Antworten auf externe Stimuli sind die Basis aller biologischer Prozesse. Die Integration dieser Signale wird dabei von Proteinkaskaden ausgeführt, welche Moleküle aus der Umgebung wahrnehmen und verarbeiten. Faktoren, welche von Pathogenen oder während einer Entzündung freigesetzt werden, induzieren für gewöhnlich eine Entzündungsantwort, eine Reaktion, die oft vom Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) vermittelt wird. Die TNFα Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermitteln nach Ligandenbinding Apoptose oder Zellproliferation durch NF-kB. Diese Prozesse sind engmaschig durch Membrankompartimentierung, Proteininteraktionen und -transport reguliert. Fluoreszenzmikroskopie bietet eine zuverlässige, nicht-invasive Methode um diese zellulären Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind einige Prozesse innerhalb einer nativen Membran nicht auflösbar, da sie weit unterhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie stattfinden. Die jüngste Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethoden erlaubt die Beobachtung dieser zellulären Abläufe auf molekularer Ebene: durch das Lokalisieren, Verfolgen und Zählen von Molekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bieten diese neuen Fluoreszenzmethoden bisher unbekannte Einblicke in Proteininteraktionen. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) nutzt die reversiblen, stochastischen Ereignisse von kleinen blinkenden, kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen, während die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) die Phototransformation fluoreszierenden Proteinen nutzt. Durch das Photoaktivieren lediglich eines kleinen Bruchteils der Fluorophore innerhalb eines Zeitintervalls können einzelne Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisiert und ein hochaufgelöstes Bild daraus rekonstruiert werden. Quantum Dot Triexciton Imaging (QDTI) nutzt die Drei-Photonen-Absorption von Quantenpunkten um eine zweifache Auflösungserhöhung mittels eines Konfokalmikroskopes zu erreichen. In dieser Arbeit wurden experimentelle Ansätze zur hochauflösenden Mikroskopie an fixierten und lebenden Zellen implementiert, um die räumliche und zeitliche Dynamik von TNF und anderen zellulären Signalwegen zu untersuchen. Zur Analyse der dreidimensionalen, zellulären Verteilung von biologischen Zielen stellen wir QDTI vor, welches eine einfache Methode zur Verbesserung der Auflösung an Konfokalmikroskopen in Kombination mit optischen Schnitten darstellt. Dies ermöglicht die vorläufige Quantifizierung von markierten Proteinen. Da QDs eine hohe Elektronendichte besitzen kann QDTI auch für korrelative Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie genutzt werden, was die Vielseitigkeit der QD-Sonden verdeutlicht. Mit Hilfe des single-particle tracking PALM (sptPALM) Konzepts konnten einzelne Rezeptormoleküle verfolgt werden, um die Dynamiken einer TNF-R1-tdEos Chimäre auf der Membran zu beobachten. Die laterale Rezeptordynamik kann hier mit hoher Präzision gemessen, und die Einflüsse auf die TNF-R1-Mobilität konnte nach Ligandenzugabe oder die Störung der Membranzusammensetzung analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine komplexe Rezeptordynamik und lassen sowohl auf Internalisierungsprozesse in Reaktion auf TNFα-Stimulation, als auch auf eine wichtige Rolle von Membrandomänen mit eingeschränkter Fluidität in der TNF-R1 Kompartimentierung während der Ligandenbindung schließen. Zusätzlich wurde der aktive Transport von NF-kB-tdEos Fusionsproteinen in lebenden Neuronen unter chemischer Stimulierung bzw. Inhibierung untersucht. Im Gegensatz zu phototransformierbaren Proteinen, die keine speziellen Puffer zur Photokonversion oder Photoaktivierung benötigen, war dSTORM bisher für in vivo Anwendungen ungeeignet, da organische Farbstoffe auf die Einführung über Immunfärbung in Kombination mit einem reduktiven, Sauerstoff-freiem Medium für korrektes Photoschalten angewiesen waren. ATTO655 wurde zuvor als geeignet für die Anwendung in lebenden Zellen eingestuft, da das Schaltverhalten durch die reduktive Umgebung des Zytoplasmas katalysiert werden kann. Durch die Einführung von membranpermeablen organischen Farbstoffen über ein chemisches Markierungssystem konnte eine hohe Spezifität und ein geringer Hintergrund erreicht werden. Hier konnte durch die Markierung des Histon H2B Komplexes die Bewegung einzelner Nukleosome in lebenden Zellen über lange Zeiträume mit einer Auflösung von ~20 nm beobachtet werden. Die Umsetzung dieser neuen Ansätze für die Darstellung biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung liefert neue Einblicke in die Dynamiken und die räumliche Heterogenität von Proteinen und enthüllt Funktionen im Organismus und beleuchtet Eigenschaften, die sonst nur in vitro nachweisbar wären.
KW  - Fluoreszenzmikrosopie
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>
KW  - Hochauflösendes Verfahren
KW  - sptPALM
KW  - dSTORM
KW  - PALM
KW  - QDTI
KW  - TNF-R1
KW  - TNF-R2
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73191
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TY  - THES
A1  - Dwertmann, Anne
T1  - Impact of the Tumor Suppressor Arf on Miz1 and Sumoylation of Myc and Miz1
T1  - Wirkung des Tumorsuppressors Arf auf Miz1 und Sumoylierung von Myc und Miz1
N2  - Upon oncogenic stress, the tumor suppressor Arf can induce irreversible cell cycle arrest or apoptosis, depending on the oncogenic insult. In this study, it could be shown that Arf interacts with Myc and the Myc-associated zinc-finger protein Miz1 to facilitate repression of genes involved in cell adhesion. Formation of a DNA-binding Arf/Myc/Miz1 complex disrupts interaction of Miz1 with its coactivator nucleophosmin and induces local heterochromatinisation, causing cells to lose attachment and undergo anoikis. The assembly of the complex relies on Myc, which might explain why high Myc levels trigger apoptosis and not cell cycle arrest in the Arf response. This mechanism could play an important role in eliminating cells harboring an oncogenic mutation. Arf furthermore induces sumoylation of Miz1 at a specific lysine by repressing the desumoylating enzyme Senp3. A sumoylation-deficient mutant of Miz1 however does not show phenotypic differences under the chosen experimental conditions. Myc can also be modified by Sumo by multisumoylation at many different lysines, which is unaffected by Arf. The exact mechanism and effect of this modification however stays unsolved.
N2  - Der Tumorsuppressor Arf wird durch onkogenen Stress induziert und kann entweder einen irreversiblen Zellzyklusarrest oder Apoptose auslösen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arf mit Myc und dem Myc-interagierenden Zinkfingerprotein Miz1 assoziiert und dadurch Gene der Zelladhäsion reprimiert. Die Ausbildung eines DNA-bindenden Arf/Myc/Miz1 Komplexes verhindert eine Interaktion von Miz1 mit seinem Koaktivator Nucleophosmin und führt zur lokalen Ausbildung von Heterochromatin, was zum Ablösen der Zellen und schließlich zur Anoikis führt. Die Komplexbildung setzt die Beteiligung von Myc voraus, was erklären könnte warum hohe Mengen an Myc über Arf Apoptose und nicht Zellzyklusarrest auslösen. Dieser Mechanismus könnte eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Zellen mit einer onkogenen Mutation spielen. Arf induziert darüber hinaus die Sumoylierung von Miz1 an einem bestimmten Lysin indem es das desumoylierende Enzyme Senp3 inhibiert. Eine Mutante von Miz1 die nicht mehr sumoyliert werden kann zeigt jedoch in den durchgeführten Untersuchungen keinen anderen Phänotyp als Wildtyp Miz1. Myc kann ebenfalls an vielen verschiedenen Lysinen mit Sumo modifiziert werden, wobei Arf jedoch keine Rolle spielt. Der genaue Mechanismus und Effekt dieser Modifikation konnte jedoch nicht geklärt werden.
KW  - Apoptosis
KW  - Myc
KW  - Repression <Genetik>
KW  - Anoikis
KW  - Zelladhäsion
KW  - Miz1
KW  - Sumo
KW  - Sumoylierung
KW  - arf
KW  - anoikis
KW  - cell adhesion
KW  - Miz1
KW  - sumo
KW  - sumoylation
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71876
ER  -