TY  - THES
A1  - Großhans, Lukas Friedrich
T1  - Funktionelle Validierung von seltenen KRas-Mutationen in Zelllinien des Multiplen Myeloms
T1  - Functional Validation of rare KRas-mutations in myeloma cell lines
N2  - Das Multiple Myelom (MM) ist eine seltene, maligne Störung der Plasmazellen, welche trotz gehöriger Therapiefortschritte in den letzten Jahrzehnten nach wie vor als unheilbare Erkrankung betrachtet werden muss. Obwohl eine sehr große intra- und interindividuelle Heterogenität beim Multiplen Myelom beobachtet werden kann, gibt es verschiedene Mutationen, die mit höherer Frequenz in Myelompatientinnen und -patienten gefunden werden. Eines dieser häufiger betroffenen Proteine ist KRas mit Mutationen in etwa 20% der Fälle. Da die Ras-Proteine und somit auch ihre Isoform KRas zu Beginn der Ras/Raf/Mek/Erk-Signalkaskade stehen und dementsprechend einen großen Einfluss auf die Übermittlung von Wachstums- und Überlebenssignalen in Zellen besitzen, ist eine nähere funktionelle Analyse verschiedener KRas-Mutationen von großer Relevanz. Während für einige Mutationen von KRas bereits funktionelle Analysen existieren, wurden die häufig auftretende Exon 2-Mutation KRasp.G12A, sowie die beiden seltenen Exon 4-Mutationen KRasp.A146T und KRasp.A146V bisher in ihrer funktionellen Rolle im MM noch nicht näher charakterisiert. Um die funktionellen Aspekte dieser genannten Mutationen von KRas näher zu untersuchen, kamen im Rahmen meiner Versuchsreihe Sleeping Beauty Transposon System basierte Expressionsvektoren zur transienten und dauerhaften Proteinexpression in verschiedenen Myelomzelllinien zum Einsatz. Durch Transfektion dieser Plasmide in die KRas-Wildtyp tragenden Zellen mit nachfolgender Transposition in die genomische DNA konnte gezielt die Überexpression der verschiedenen Mutationen realisiert werden.
So konnte durch die funktionelle Proteinauslese mittels der Anfertigung von Western Blots gezeigt werden, dass jede der drei getesteten Mutationen zu einer verstärkten Phosphorylierung und damit Aktivierung von KRas-nachgeschalteten Proteinen wie z.B. Erk führt. Zusätzlich wurde für die KRas-Mutationen auch ein aktivierender Effekt auf den PI3K/Akt-Signalweg anhand einer erhöhten Phosphorylierung des Proteins Akt nachgewiesen.
Ebenso wie andere bereits besser charakterisierte KRas-Mutationen haben demnach auch die getesteten KRas-Mutationen KRasp.G12A, KRasp.A146T und KRasp.A146V einen positiven Einfluss auf die intrazellulären Überlebenssignale und könnten daher eine elementare Rolle in der Entwicklung des Multiplen Myeloms bei Patientinnen und Patienten spielen. Es gilt daher, die drei in dieser Arbeit untersuchten KRas-Mutationen, zukünftig in die Wirkstoffsuche KRas-spezifischer Therapeutika miteinzubeziehen.
N2  - Multiple Myeloma (MM) is a rare, malignant disorder of plasma cells, which despite the progress in therapy over the last decades, must still be considered an incurable disease. Although a very large intra- and interindividual heterogeneity can be observed in multiple myeloma, there are various mutations that are found at higher frequencies in myeloma patients. One of these more common proteins affected by mutations in myeloma patients is KRas, with mutations in about 20% of cases. Since the Ras proteins and thus also their KRas isoform are at the beginning of the Ras/Raf/Mek/Erk signaling cascade and therefore have a major influence on the transmission of survival signals in cells, a closer functional analysis of various KRas mutations is of great relevance. While functional analyses already exist for some KRas mutations, the frequently occurring exon 2 mutation KRasp.G12A and the two rare exon 4 mutations KRasp.A146T and KRasp.A146V have not yet been characterized in their functional role in MM. To further investigate the functional aspects of these KRas mutations, I used protein expression vectors based on the Sleeping Beauty Transposon System for transient and sustained protein expression in different myeloma cell lines. By transfection of these plasmids into KRas wild-type cells the overexpression of the different mutations could be realized.
By functional protein readout using Western blots it could be shown that each of the three tested mutations leads to increased phosphorylation and thus activation of KRas downstream proteins such as Erk. In addition, an activating effect on the PI3K/Akt signaling pathway could be demonstrated for the KRas mutations by showing an increased phosphorylation of the Akt protein. 
As with other KRas mutations that have already been better characterized, the KRas mutations KRasp.G12A, KRasp.A146T and KRasp.A146V have a positive influence on intracellular survival signals and could therefore play a fundamental role in the development of multiple myeloma in patients. It is therefore important to include the three KRas mutations investigated in this work in the drug discovery process for KRas-specific therapeutics in the future.
KW  - Plasmozytom
KW  - K-ras
KW  - KRas
KW  - Multiples Myelom
KW  - Funktionelle Validierung
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292974
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Weißbach, Susann
A1  - Heredia-Guerrero, Sofia Catalina
A1  - Barnsteiner, Stefanie
A1  - Großhans, Lukas
A1  - Bodem, Jochen
A1  - Starz, Hanna
A1  - Langer, Christian
A1  - Appenzeller, Silke
A1  - Knop, Stefan
A1  - Steinbrunn, Torsten
A1  - Rost, Simone
A1  - Einsele, Hermann
A1  - Bargou, Ralf Christian
A1  - Rosenwald, Andreas
A1  - Stühmer, Thorsten
A1  - Leich, Ellen
T1  - Exon-4 Mutations in KRAS Affect MEK/ERK and PI3K/AKT Signaling in Human Multiple Myeloma Cell Lines
JF  - Cancers
N2  - Approximately 20% of multiple myeloma (MM) cases harbor a point mutation in KRAS. However, there is still no final consent on whether KRAS-mutations are associated with disease outcome. Specifically, no data exist on whether KRAS-mutations have an impact on survival of MM patients at diagnosis in the era of novel agents. Direct blockade of KRAS for therapeutic purposes is mostly impossible, but recently a mutation-specific covalent inhibitor targeting KRAS\(^{p.G12C}\) entered into clinical trials. However, other KRAS hotspot-mutations exist in MM patients, including the less common exon-4 mutations. For the current study, the coding regions of KRAS were deep-sequenced in 80 newly diagnosed MM patients, uniformely treated with three cycles of bortezomib plus dexamethasone and cyclophosphamide (VCD)-induction, followed by high-dose chemotherapy and autologous stem cell transplantation. Moreover, the functional impact of KRAS\(^{p.G12A}\) and the exon-4 mutations p.A146T and p.A146V on different survival pathways was investigated. Specifically, KRAS\(^{WT}\), KRAS\(^{p.G12A}\), KRAS\(^{p.A146T}\), and KRAS\(^{p.A146V}\) were overexpressed in HEK293 cells and the KRAS\(^{WT}\) MM cell lines JJN3 and OPM2 using lentiviral transduction and the Sleeping Beauty vector system. Even though KRAS-mutations were not correlated with survival, all KRAS-mutants were found capable of potentially activating MEK/ERK- and sustaining PI3K/AKT-signaling in MM cells.
KW  - multiple myeloma
KW  - KRAS
KW  - MEK/ERK-signaling
KW  - AKT-signaling
KW  - amplicon sequencing
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-200617
SN  - 2072-6694
VL  - 12
IS  - 2
ER  -