TY - THES A1 - Pleines, Irina T1 - The role of the Rho GTPases Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation T1 - Die Rolle der Rho GTPasen Rac1 und Cdc42 in Thrombozytenfunktion und -bildung N2 - Platelet activation induces cytoskeletal rearrangements involving a change from discoid to spheric shape, secretion, and eventually adhesion and spreading on immobilized ligands. Small GTPases of the Rho family, such as Rac1 and Cdc42, are known to be involved in these processes by facilitating the formation of lamellipodia and filopodia, respectively. This thesis focuses on the role Rac1 and Cdc42 for platelet function and formation from their precursor cells, the megakaryocytes (MKs), using conditional knock-out mice. In the first part of the work, the involvement of Rac1 in the activation of the enzyme phospholipase (PL) C2 in the signaling pathway of the major platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI was investigated. It was found that Rac1 is essential for PLC2 activation independently of tyrosine phosphorylation of the enzyme, resulting in a specific platelet activation defect downstream of GPVI, whereas signaling of other activating receptors remains unaffected. Since Rac1-deficient mice were protected from arterial thrombosis in two different in vivo models, the GTPase might serve as a potential target for the development of new drugs for the treatment and prophylaxis of cardio- and cerebrovascular diseases. The second part of the thesis deals with the first characterization of MK- and platelet-specific Cdc42 knock-out mice. Cdc42-deficient mice displayed mild thrombo-cytopenia and platelet production from mutant MKs was markedly reduced. Unexpectedly, Cdc42-deficient platelets showed increased granule content and release upon activation, leading to accelerated thrombus formation in vitro and in vivo. Furthermore, Cdc42 was not generally required for filopodia formation upon platelet activation. Thus, these results indicate that Cdc42, unlike Rac1, is involved in multiple signaling pathways essential for proper platelet formation and function. Finally, the outcome of combined deletion of Rac1 and Cdc42 was studied. In contrast to single deficiency of either GTPase, platelet production from double-deficient MKs was virtually abrogated, resulting in dramatic macrothrombocytopenia in the animals. Formed platelets were largely non-functional leading to a severe hemostatic defect and defective thrombus formation in double-deficient mice in vivo. These results demonstrate for the first time a functional redundancy of Rac1 and Cdc42 in the hematopoietic system. N2 - Umstrukturierungen des Zytoskeletts spielen eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten und sind in diesem Zusammenhang unerlässlich für Formänderung, Sekretion, sowie für Adhäsion und Ausbreitung auf immobilisierten Adhäsionsproteinen. Es wird vermutet, dass kleine GTPasen der Rho-Proteinfamilie, wie z.B. Rac1 und Cdc42, maßgeblich an diesen Prozessen beteiligt sind, indem sie die Bildung von Lamellipodien bzw. Filopodien bewirken. Die hier vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Funktion von Rac1 und Cdc42 sowohl für die Aktivierung von Thrombozyten, als auch für deren Neubildung aus ihren Vorläuferzellen, den Megakaryozyten (MKs). Zu diesem Zweck wurden konditionale Knock-out-Mäuse generiert und in vitro und in vivo analysiert. Der erste Teil der Arbeit beinhaltete die Untersuchung der Rolle von Rac1 im Signalweg des wichtigsten Thrombozyten-Kollagen-Rezeptors, Glykoprotein (GP) VI, dessen Stimulation zur Aktivierung des Enzyms Phospholipase 2 (PLC2) führt. Es konnte gezeigt werden, dass Rac1 notwendig für PLC2-Aktivierung ist, und zwar unabhängig von der simultan stattfindenden Tyrosin-Phosphorylierung des Enzyms. Dies führte dazu, dass in Rac1-defizienten Thrombozyten spezifisch der GPVI-Signalweg blockiert war, während die Aktivierung durch andere Rezeptoren unverändert funktionierte. Da Rac1-defiziente Mäuse vor arteriellem Gefäßverschluss (Thrombose) in zwei verschiedenen in vivo Modellen geschützt waren, könnte Rac1 einen potenziellen Angriffspunkt für die Entwicklung neuer antithrombotisch wirksamer Medikamente darstellen. Im zweiten Teil der Dissertation wurden erstmals die Auswirkungen eines MK- und Thrombozyten-spezifischen Cdc42-Knock-outs charakterisiert. Cdc42-defiziente Mäuse zeigten eine leichte Thrombozytopenie und die Neubildung von Thrombozyten aus defizienten MKs war merklich beeinträchtigt. Entgegen aller Erwartungen waren sowohl Inhalt, als auch Freisetzung von Granula aus Cdc42-defizienten Thrombozyten stark erhöht, was zu beschleunigter Thrombusbildung in vitro und Gefäßverschluss in vivo führte. Überdies war Cdc42 generell nicht essentiell für die Ausbildung von Filopodien nach Thrombozytenaktivierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Cdc42 an einer Vielzahl von Signalwegen beteiligt ist, welche für die korrekte Bildung und Funktion von Thrombozyten unabdingbar sind. Der letzte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit den Auswirkungen einer Doppel-defizienz von Rac1 und Cdc42. Im Gegensatz zur jeweiligen Einfachdefizienz war die Bildung von Thrombozyten aus doppeldefizienten MKs fast komplett blockiert, was eine stark ausgeprägte Makrothrombozytopenie in den betroffenen Tieren zur Folge hatte. Die wenigen gebildeten Thrombozyten waren in ihrer Funktion stark beeinträchtigt. Dies führte zusammen mit den extrem niedrigen Thrombozytenzahlen dazu, dass in doppeldefizienten Mäusen sowohl Hämostase als auch Thrombusbildung defekt waren. Diese Resultate zeigen erstmals eine funktionelle Redundanz von Rac1 und Cdc42 im hämatopoetischen System. KW - Thrombose KW - Rho GTPasen KW - Thrombozyt KW - platelet KW - Rho GTPase KW - platelet KW - Rho GTPase KW - Thrombosis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48572 ER - TY - JOUR A1 - Dütting, Sebastian A1 - Gaits-Iacovoni, Frederique A1 - Stegner, David A1 - Popp, Michael A1 - Antkowiak, Adrien A1 - van Eeuwijk, Judith M.M. A1 - Nurden, Paquita A1 - Stritt, Simon A1 - Heib, Tobias A1 - Aurbach, Katja A1 - Angay, Oguzhan A1 - Cherpokova, Deya A1 - Heinz, Niels A1 - Baig, Ayesha A. A1 - Gorelashvili, Maximilian G. A1 - Gerner, Frank A1 - Heinze, Katrin G. A1 - Ware, Jerry A1 - Krohne, Georg A1 - Ruggeri, Zaverio M. A1 - Nurden, Alan T. A1 - Schulze, Harald A1 - Modlich, Ute A1 - Pleines, Irina A1 - Brakebusch, Cord A1 - Nieswandt, Bernhard T1 - A Cdc42/RhoA regulatory circuit downstream of glycoprotein Ib guides transendothelial platelet biogenesis JF - Nature Communications N2 - Blood platelets are produced by large bone marrow (BM) precursor cells, megakaryocytes (MKs), which extend cytoplasmic protrusions (proplatelets) into BM sinusoids. The molecular cues that control MK polarization towards sinusoids and limit transendothelial crossing to proplatelets remain unknown. Here, we show that the small GTPases Cdc42 and RhoA act as a regulatory circuit downstream of the MK-specific mechanoreceptor GPIb to coordinate polarized transendothelial platelet biogenesis. Functional deficiency of either GPIb or Cdc42 impairs transendothelial proplatelet formation. In the absence of RhoA, increased Cdc42 activity and MK hyperpolarization triggers GPIb-dependent transmigration of entire MKs into BM sinusoids. These findings position Cdc42 (go-signal) and RhoA (stop-signal) at the centre of a molecular checkpoint downstream of GPIb that controls transendothelial platelet biogenesis. Our results may open new avenues for the treatment of platelet production disorders and help to explain the thrombocytopenia in patients with Bernard–Soulier syndrome, a bleeding disorder caused by defects in GPIb-IX-V. KW - megakaryocytes KW - blood platelets KW - regulatory circuit downstream KW - glycoprotein Ib Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170797 VL - 8 IS - 15838 ER -