TY - JOUR A1 - Houben, Roland A1 - Hesbacher, Sonja A1 - Schmid, Corinna P. A1 - Kauczok, Claudia S. A1 - Flohr, Ulrike A1 - Haferkamp, Sebastian A1 - Müller, Cornelia S. L. A1 - Schrama, David A1 - Wischhusen, Jörg A1 - Becker, Jürgen C. T1 - High-Level Expression of Wild-Type p53 in Melanoma Cells is Frequently Associated with Inactivity in p53 Reporter Gene Assays N2 - Background: Inactivation of the p53 pathway that controls cell cycle progression, apoptosis and senescence, has been proposed to occur in virtually all human tumors and p53 is the protein most frequently mutated in human cancer. However, the mutational status of p53 in melanoma is still controversial; to clarify this notion we analysed the largest series of melanoma samples reported to date. Methodology/Principal Findings: Immunohistochemical analysis of more than 180 melanoma specimens demonstrated that high levels of p53 are expressed in the vast majority of cases. Subsequent sequencing of the p53 exons 5–8, however, revealed only in one case the presence of a mutation. Nevertheless, by means of two different p53 reporter constructs we demonstrate transcriptional inactivity of wild type p53 in 6 out of 10 melanoma cell lines; the 4 other p53 wild type melanoma cell lines exhibit p53 reporter gene activity, which can be blocked by shRNA knock down of p53. Conclusions/Significance: In melanomas expressing high levels of wild type p53 this tumor suppressor is frequently inactivated at transcriptional level. KW - Krebs KW - Hautkrebs Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69012 ER - TY - JOUR A1 - Haferkamp, Sebastian A1 - Hesbacher, Sonja A1 - Weyandt, Gerhard A1 - Vetter-Kauczok, Claudia S. A1 - Becker, Jürgen C. A1 - Motschenbacher, Stephanie A1 - Wobser, Marion A1 - Maier, Melissa A1 - Schmid, Corinna P. A1 - Houben, Roland T1 - p53 regulation by TRP2 is not pervasive in melanoma N2 - p53 is a central tumor suppressor protein and its inhibition is believed to be a prerequisite for cancer development. In approximately 50% of all malignancies this is achieved by inactivating mutations in the p53 gene. However, in several cancer entities, including melanoma, p53 mutations are rare. It has been recently proposed that tyrosinase related protein 2 (TRP2), a protein involved in melanin synthesis, may act as suppressor of the p53 pathway in melanoma. To scrutinize this notion we analyzed p53 and TRP2 expression by immunohistochemistry in 172 melanoma tissues and did not find any correlation. Furthermore, we applied three different TRP2 shRNAs to five melanoma cell lines and could not observe a target specific effect of the TRP2 knockdown on either p53 expression nor p53 reporter gene activity. Likewise, ectopic expression of TRP2 in a TRP2 negative melanoma cell line had no impact on p53 expression. In conclusion our data suggest that p53 repression critically controlled by TRP2 is not a general event in melanoma. KW - melanomas KW - melanoma cell KW - cell staining KW - histology KW - reporter genes KW - apoptosis KW - immunohistochemistry techniques KW - tumor suppressor genes Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111396 ER - TY - THES A1 - Schmid, Corinna T1 - p53-Inaktivierung im Melanom - ein therapeutischer Ansatzpunkt? T1 - p53-inactivation in melanoma - a therapeutical target? N2 - Die Therapiemöglichkeiten für Patienten im Melanom Stadium IV sind nach wie vor begrenzt und die Erkrankung nur selten heilbar. Eine mögliche Ziel¬struktur in der Melanom¬therapie der Zukunft könnte das im Melanom häufig genetisch wild¬typisch vorliegende p53 sein. Für vorliegende Arbeit wurden humane Melanomzelllinien, welche stabil mit einem p53-Reportergenkonstrukt transduziert waren, hinsichtlich ihrer p53-Expression, -Akti-vität und -Akti¬vierbarkeit untersucht. Alle verwendeten Melanom¬zell¬¬¬linien exprimierten p53 un¬ab¬hängig vom p53-Mutations¬status. Drei der sieben untersuchten p53-wild¬typischen Melanomzelllinien zeigten keine oder nur sehr niedrige p53-Reporter¬gen¬aktivität. Die anderen vier p53-wildtypischen Zelllinien dagegen waren durch hohe, mittels p53-Knockdown unterdrückbare Reportergen¬expression gekennzeichnet. Die Proliferation dieser Zellen in Gegenwart von aktivem p53 belegt, dass Melanomzellen eine hohe Toleranz gegenüber diesem Tumor¬suppressor besitzen können. Eine weitere Steige¬rung der p53-Expression und -Aktivität durch die Hemmung von MDM2 (mouse double minute 2) mit der Substanz Nutlin-3a führte in den Zellen mit messbarer p53-Aktivität jedoch zu einem G1-Zell¬zyklusarrest. Dies belegt die prinzipielle Eignung von p53 als mögliche thera¬peutische Zielstruktur. Aufgrund ihrer schlechten Biover¬füg¬barkeit und hohen Toxizität gelten MDM2-Inhibitoren bisher aber als ungeeignet für den klinischen Einsatz. Die Reduktion hoher therapeutischer Nebenwirkungen könnte durch eine Melanom-spezifische Reaktivierung von p53 gelingen. Eine mögliche negativ-modulierende Wirkung des Mela¬¬nom¬¬markers TRP2 (tyrosinase-related-protein 2) auf p53 wurde im Jahr 2010 von Sendoel et al. nach Unter¬suchungen am Fadenwurm C. elegans vorgeschlagen. TRP2 wird beim metastasierten Melanom in mehr als 80 % der Fälle exprimiert und wäre, handelte es sich beim Melanom um einen weit verbreiteten Regulationsmechanismus, ein interessantes Zielprotein, um die Aktivität von p53 zu steigern. Die dargestellten Ergeb¬nisse zeigen, dass TRP2 zwar in vier von fünf Melanomzelllinien exprimiert wurde, die Unterdrückung der TRP2-Expression jedoch weder spezifischen Einfluss auf die p53-Expression noch auf die p53-Reportergenaktivität zeigte. Auch das veränderte Wachs¬tums¬¬¬verhalten der Zellen nach Unterdrückung von TRP2 mittels drei unterschiedlicher shRNAs konnte im Rescue-Experiment, bei dem TRP nach seinem Knockdown ektop exprimiert wurde, keinem spezifischen Effekt von TRP2 auf die p53-Expression oder p53-Reporteraktivität zugeordnet werden. Auch in der TRP2-negativen Zelllinie führte die ektope TRP2-Expression nicht zu einer verminderten p53-Expression oder -Aktivität. Für das im Gegensatz zu MDM2 deutlich melanomspezifischere TRP2 konnte demensprechend kein sicherer regulatorischer Zusammenhang mit p53 dargestellt werden. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche Bedeutung wildtypischem p53 im Melanom zukommt und ob sich weitere mögliche p53-Regulatoren als therapeutische Angriffspunkte eignen. N2 - The aim of this study was to investigate the role of wildtype and transcriptional inactive p53 and tyrosinase related protein 2 (TRP2) as potential regulator of p53 in melanoma cell lines. Nine human melanoma cell lines were transduced with a lentiviral pGreenFire™ reporter construct encoding luciferase and GFP under the control of a p53 responsive element. Western blots, luciferase and green fluorescent protein (GFP) assays were used to analyze p53-expression, -activity and -upregulation before and after knockdown of p53 and TRP2 by specific shRNAs. Moreover, melanoma cells were treated with Nutlin-3a, a specific inhibitor of the p53 ubiquitinase mouse double minute 2 homolog (mdm-2), to study its effect on cell proliferation using propidium iodide cell cycle FACS-analysis. Growth of melanoma cells in the presence of active p53 suggests that they tolerate high levels of p53. Furthermore this study shows that preexisting p53 activity can be upregulated by treating the cells with Nutlin-3a. This upregulation was associated with a clear cut cell cycle arrest while the low level p53 activity melanoma cell lines did not show any comparable effect. In contrast regulation of p53 by TRP2 seems not to be common in melanoma cell lines. This study could not depict specific effects on p53 activity alteration after TRP2 knockdown. The role of TRP2 as a potential regulator of p53 in melanoma stays questionable. In principle enhancement of preexisting p53 activity by treating melanoma cells with Nutlin-3a would be a suitable therapeutic target. However, due to its toxicity in humans it might be inappropriate for clinical applications. KW - Melanom KW - p53 KW - TRP2 KW - Nutlin Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157853 ER -