TY - THES A1 - Wohlfart, Jonas T1 - Analysis of Drug Impurities by Means of Chromatographic Methods: Targeted and Untargeted Approaches T1 - Analytik von Verunreinigungen in Arzneimitteln mittels chromatographischer Methoden: Gerichtete und ungerichtete Ansätze N2 - The presented works aimed on the analysis of new impurities in APIs and medicinal products. Different subtypes of LC were coupled to suitable detection methods, i.e. UV and various MS techniques, depending on the chemical natures of the analytes and the analytical task. Unexpected impurities in medicinal products and APIs caused several scandals in the past, concomitant with fatalities or severe side effects in human and veterinary patients. The detection of nitrosamines in sartans led to the discovery of nitrosamines in various other drugs, of which the antibiotic rifampicin was analyzed in this work. An examination of the synthesis of rifampicin revealed a high potential for the formation of 4-methyl-1-nitrosopiperazine (MeNP). An LC-MS/HRMS method suitable for the quantification of MeNP was applied in the analysis of drugs collected from Brazil, Comoros, India, Nepal, and Tanzania, where a single dose of rifampicin is used in the post-exposure prophylaxis of leprosy. All batches were contaminated with MeNP, ranging from 0.7-5.1 ppm. However, application of rifampicin containing up to 5 ppm MeNP was recommended by the regulatory authorities for the post-exposure prophylaxis of leprosy. In the 1990s the aminoglycoside antibiotic gentamicin attracted attention after causing fatalities in the USA, but the causative agent was never identified unequivocally. The related substance sisomicin was recognized as a lead impurity by the Holzgrabe lab at the University of Würzburg: sisomicin was accompanied by a variety of other impurities and batches containing sisomicin had caused the fatalities. In 2016, anaphylactic reactions were reported after application of gentamicin. A contamination of the medicinal products with histamine, an impurity of the raw material fish peptone used upon the production, could be identified as the cause of the adverse effects. Batches of gentamicin sulfate, which had been stored at the University of Würzburg since the earlier investigations, were analyzed regarding their contamination with histamine to determine whether the biogenic amine was responsible for the 1990s fatalities as well. Furthermore, a correlation with the lead impurity sisomicin was checked. Histamine could be detected in all analyzed batches, but at a lower level than in the batches responsible for the anaphylactic reactions. Moreover, there is no correlation of histamine with the lead impurity sisomicin. Hence, the causative agent for the 1990s fatalities was not histamine and remains unknown. Another source of impurities is the reaction of APIs with excipients, e.g. the esterification of naproxen with PEG 600 in soft gel capsules. The influence of the formulation’s composition on this reaction was investigated by means of LC-UV. Therefore, the impurity naproxen-PEG-ester (NPEG) was synthesized and used for the development of a method suitable for the analysis of soft gel capsule formulations. Different formulations were stressed for 7 d at 60 °C and the relative amount of NPEG was determined. The formation of NPEG was influenced by the concentrations of water and lactic acid, the pH, and the drug load of the formulation, which can easily be explained by the chemistry behind esterification reactions. Keeping in mind the huge variety of sources of impurities, it might be impossible to predict all potential impurities of a drug substance/product. Targeted and untargeted approaches were combined in the impurity profiling of bisoprolol fumarate. Eight versions of an LC-HRMS method were developed to enable the detection of a maximum number of impurities: an acidic and a basic buffered LC was coupled to MS detection applying ESI and APCI, both in positive in negative mode. MS and MS/MS data were acquired simultaneously by information dependent acquisition. In the targeted approach, potential impurities were derived from a reaction matrix based on the synthesis route of the API, while the untargeted part was based on general unknown comparative screening to identify additional signals. 18 and 17 impurities were detected in the targeted and the untargeted approach, respectively. The molecular formulae were assessed based on the exact mass and the isotope pattern. Theoretical fragment spectra generated by in silico fragmentation were matched with experimental data to estimate the plausibility of proposed/elucidated structures. Moreover, the detected impurities were quantified with respect to an internal standard. N2 - In den vorgestellten Projekten wurden neue Verunreinigungen in Arzneistoffen und Arzneimitteln untersucht. Verschiedene flüssigchromatographische Methoden wurden mit geeigneten Detektionsverfahren gekoppelt. UV-Detektion und verschiedene massenspektrometrische Techniken wurden in Abhängigkeit der chemischen Eigenschaften der Analyten und der analytischen Herausforderung ausgewählt. Eine Kontamination von Wirkstoffen bzw. humanen und veterinären Arzneimittel mit unerwarteten Verunreinigungen löste mehrere Skandale aus, die mit Todesfällen oder ernsthaften Nebenwirkungen einhergingen. Die Identifikation von Nitrosamin-Verunreinigungen in Sartanen führte zur Entdeckung von Nitrosaminen in verschiedenen anderen Wirkstoffen, z.B. im Antibiotikum Rifampicin, das in dieser Arbeit untersucht wurde. Eine Betrachtung der Rifampicin-Synthese offenbarte ein hohes Potenzial der Bildung von 4-Methyl-1-nitrosopiperazin (MeNP). Arzneimittel aus Brasilien, Indien, Nepal, Tansania und von den Komoren wurden mittels LC-MS/HRMS bezüglich ihres MeNP-Gehaltes analysiert. Alle untersuchten Chargen waren mit MeNP im Bereich von 0.7-5.1 ppm belastet. Rifampicin wird in den genannten Ländern unter anderem als Einzeldosis zur Postexpositionsprophylaxe von Lepra eingesetzt. Für diese Indikation empfehlen die Zulassungsbehörden die Verwendung von Rifampicin mit bis zu 5 ppm MeNP. Das Aminoglycosid-Antibiotikum Gentamicin löste in den 1990er Jahren Todesfälle in den USA aus. Die verantwortliche Verunreinigung wurde nie eindeutig aufgeklärt, doch die verwandte Substanz Sisomicin wurde durch den Arbeitskreis Holzgrabe an der Universität Würzburg als Leitverunreinigung identifiziert: Sisomicin ging mit einer Vielzahl von weiteren Verunreinigungen einher und Sisomicin-reiche Chargen hatten die Todesfälle ausgelöst. 2016 traten anaphylaktische Reaktionen nach Gentamicin-Anwendung auf. Histamin war als Verunreinigung von Fischpepton, einem Ausgangsmaterial der Produktion, in den Wirkstoff gelangt. Um zu überprüfen, ob Histamin auch für die Todesfälle in den 1990er Jahren verantwortlich war, wurden seit den früheren Untersuchungen gelagerte Gentamicin-Chargen bezüglich ihrer Verunreinigung mit Histamin untersucht. Außerdem wurde überprüft, ob es einen Zusammenhang mit dem Sisomicin-Gehalt gibt. In allen untersuchten Proben wurde Histamin gefunden, allerdings in einer geringeren Konzentration als in Chargen, die anaphylaktische Reaktionen ausgelöst hatten. Des Weiteren konnte kein Zusammenhang mit der Leitverunreinigung Sisomicin erkannt werden. Der Auslöser der Todesfälle in den 1990er Jahren war somit nicht Histamin, sondern bleibt weiterhin unbekannt. Ein weiterer Ursprung von Verunreinigungen ist die Reaktion des Wirkstoffs mit Hilfsstoff(en), z.B. die Veresterung von Naproxen mit PEG in Weichkapseln. Der Einfluss von Veränderungen der Formulierung auf diese Reaktion wurde mittels LC-UV untersucht. Die Verunreinigung Naproxen-PEG-Ester (NPEG) wurde synthetisiert und zur Entwicklung einer Methode zur Analyse von Weichkapsel-Formulierungen verwendet. Verschiedene Formulierungen wurden für 7 Tage bei 60 °C gestresst und deren relative Gehalte an NPEG bestimmt. Dabei war die Bildung von NPEG von der Wasser- und der Milchsäure-Konzentration, dem pH und dem Wirkstoffgehalt der Formulierung abhängig. Sämtliche Einflüsse konnten durch die Art der Reaktion (Veresterung) erklärt werden. Vor dem Hintergrund der vielfältigen Quellen für Verunreinigungen erscheint es unmöglich, alle potenziellen Verunreinigungen eines Wirkstoffs/Arzneimittels vorherzusagen. Gerichtete und ungerichtete Ansätze wurden daher für die Erstellung eines Verunreinigungsprofils von Bisoprololfumarat kombiniert. Um eine möglichst große Anzahl von möglichen Substanzen zu detektieren, wurden 8 LC-MS/HRMS-Methoden entwickelt: je eine saure und eine basische mobile Phase der LC wurde mit massenspektrometrischer Detektion mittels ESI und APCI, jeweils im positiv- und negativ-Modus kombiniert. MS- und MS/MS-Daten wurden simultan durch information dependent acquisition aufgenommen. Für den gerichteten Ansatz wurde eine Reaktionsmatrix auf Basis der Synthese des Wirkstoffs angefertigt und ausgehend davon potenzielle Verunreinigungen abgeleitet. Im ungerichteten Ansatz wurden mittels general unknown comparative screening zusätzliche Signale identifiziert. Der gerichtete Ansatz zeigte die Anwesenheit von 18, der ungerichtete von 17 Verunreinigungen. Summenformeln wurden anhand der exakten Masse und des Isotopenmusters der Signale bewertet. Die Plausibilität von Strukturformeln wurde mittels In-silico-Fragmentierung abgeschätzt, wobei experimentelle und theoretische Fragmentspektren in Einklang gebracht wurden. Außerdem wurden alle detektierten Verunreinigungen mittels eines externen Standards quantifiziert. KW - LC-MS KW - Gentamicin KW - Naproxen KW - Bisoprolol KW - Rifampicin KW - Impurity Profiling Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-273878 ER - TY - JOUR A1 - Wohlfart, Jonas A1 - Holzgrabe, Ulrike T1 - Analysis of histamine and sisomicin in gentamicin: search for the causative agents of adverse effects JF - Archiv der Pharmazie N2 - In 1998, the aminoglycoside antibiotic gentamicin sulfate caused several cases of deaths in the United States, after the switch from twice- to once-daily application. Endotoxins were discussed as the cause for the adverse effects and sisomicin was identified as the lead impurity; batches containing sisomicin were contaminated with more impurities and were responsible for the fatalities. In 2016, anaphylactic reactions in horses, and later in humans with one fatality, were observed after application of gentamicin sulfate contaminated with histamine. To determine whether histamine was responsible for the 1990s death cases as well, histamine was quantified by means of liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in 30 samples of gentamicin sulfate analyzed in previous studies. Furthermore, a relative quantification of sisomicin was performed to check for a correlation between histamine and the lead impurity. A maximum amount of 11.52 ppm histamine was detected, which is below the limit for anaphylactic reactions of 16 ppm, and no correlation of the two impurities was observed. However, the European Medicines Agency recommends a stricter limit with regard to the maximum single dose of gentamicin sulfate to reach a greater gap between the maximum histamine exposition of 4.3 µg and the quantity known to cause hypotension of 7 µg. The low amounts of histamine and the fact that there is no connection with the contamination with sisomicin showed that histamine was not the cause for the death cases in the United States in 1998, and endotoxins remain the most probable explanation. KW - chemistry KW - sisomicin KW - drug impurities KW - gentamicin sulfate KW - histamine KW - LC-MS/MS Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-256596 VL - 354 IS - 12 ER -