TY  - THES
A1  - Markert, Andreas
T1  - LARP7 – ein La ähnliches Protein reguliert die Elongation der PolII Transkription durch das 7SK RNP
T1  - LARP7 - a La related protein regulates the elongation of polII transcription by the 7SK RNP
N2  - Genexpression in Eukaryoten beschreibt einen mehrstufigen Prozess, welcher auf Ebene der Transkription durch den positiven Transkriptionselongationsfaktor P-TEFb entscheidend reguliert wird. PTEFb bildet einen heterodimeren Komplex aus der Cyclin abhängigen Kinase 9 und deren Kofaktor Cyclin T1/2. Dieser Komplex aktiviert die Elongation der Transkription durch Phosphorylierung der negativen Elongationsfaktoren DSIF und NELF. Darüber hinaus phosphoryliert PTEFb Serin2 Reste in der C-terminalen Domäne von RNA PolII und stimuliert so die kotranskriptionelle Prozessierung der synthetisierten prä-mRNA. In Anpassung an unterschiedliche Wachstumsbedingungen wird die Aktivität dieses Faktors durch reversible Interaktion mit 7SK RNA und HEXIM Proteinen innerhalb eines katalytisch inaktiven Ribonukleoproteinpartikels (7SK RNP) streng kontrolliert. Dieses sensible Gleichgewicht zwischen P-TEFb auf der einen und dem 7SK RNP auf der anderen Seite bildet die Grundlage der Regulation der Transkriptionselongation. Trotz der hohen Abundanz von 7SK RNA in der Zelle, assoziiert in vivo jedoch nur ein relativ kleiner Teil hiervon mit P-TEFb, sodass die effektiv zur Verfügung stehende RNA-Menge für die Bildung des 7SK RNP vermutlich limitierend wirkt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher neue 7SK RNA interagierende Faktoren zu identifizieren, welche die Interaktion von PTEFb mit dem 7SK RNP steuern und so die PolII abhängige Transkription regulieren. Anhand verschiedener chromatographischer Reinigungen konnte zunächst ein bislang uncharakterisiertes La ähnliches Protein (LARP7) mit einer spezifischen Affinität für Pyrimidinreiche RNAs isoliert werden. LARP7 bindet, wie durch immunbiochemische Analysen und RNA- Bindungsstudien gezeigt werden konnte, quantitativ an das hoch konservierte uridylreiche 3´- Ende von 7SK RNA. Diese Assoziation erfordert dessen La- und RRMDomänen und erhöht wesentlich die Stabilität der RNA. Darüber hinaus kofraktioniert LARP7 mit weiteren Faktoren des 7SK RNP, bindet direkt an HEXIM1 und P-TEFb und stellt somit ebenfalls eine integrale Komponente des 7SK RNP dar. Die gewonnenen Daten weisen außerdem erstmals darauf hin, dass P-TEFb durch einen vorgeformten trimeren Komplexes, bestehend aus HEXIM1, 7SK RNA und LARP7 inhibiert wird. Reportergenanalysen in TZMbl-Zellen, welche Luziferase unter der Kontrolle des streng P-TEFb abhängigen HIV-1-LTRPromotors exprimieren zeigten, dass diese Inhibition im Wesentlichen durch LARP7 vermittelt wird. So ließ sich nach Reduktion der LARP7 Expression mittels RNAi eine signifikante Steigerung der Transkription vom HIV-1-LTR-Promotor beobachten. Eine ähnliche Stimulation der Transkription von PolII konnte in LARP7 defizienten HeLa-Zellen durch quantitative Real-Time-PCR auch für eine Reihe zellulärer Gene nachgewiesen werden. Die Beobachtung, dass LARP7 die generelle PolII Transkription reprimiert, korreliert zudem mit einer bereits beschriebenen Tumorsupressorfunktion des LARP7 homologen mxc Proteins aus D. melanogaster. Somit beeinflusst LARP7 das zelluläre Gleichgewicht zwischen freiem und 7SK RNP-gebundenem P-TEFb und fungiert somit als negativer Regulator der PolII Transkription in vivo.
N2  - Eucaryotic gene expression is a multistep process, which is critically regulated on the level of RNA polII transcription by the positive transcription elongation factor P-TEFb. P-TEFb forms a heterodimeric complex, consisting of the cyclin-dependent kinase 9 and its cofactor cyclin T1/2. This complex stimulates transcriptional elongation as well as the cotranscriptional processing of the synthesized pre-mRNA by phosphorylation of negative elongation factors and the RNA polII Cterminal domain. To accommodate different growth conditions, P-TEFb activity is kept under tight control through its reversible interaction with 7SK RNA and HEXIM proteins in a catalytically inactive ribonucleoprotein particle (RNP). This sensitive balance between PTEFb on the one hand and the 7SK RNP on the other represents the basis of transcriptional regulation of elongation. Despite the high abundance of 7SK RNA in the cell, only a small part is associated with P-TEFb in vivo, suggesting that the actual amount of RNA available limits the formation of the 7SK RNP. Hence, the objective of the present study was to identify novel 7SK RNA interacting factors, which direct the interaction of P-TEFb with the 7SK RNP, thereby regulating polII dependent transcription. At first, using different chromatographic purification strategies, an as yet uncharacterized La related protein (LARP7) with an affinity to pyrimidine- rich RNAs was isolated. Immunobiochemical analysis and RNA binding studies revealed, that LARP7 quantitatively associates with the highly conserved 3´-UUU-OH terminus of 7SK RNA. This binding requires its La- and RRM-domain and dramatically increases RNA stability. Moreover, LARP7 co-fractionates with additional factors of the 7SK RNP, binds directly to HEXIM1 and P-TEFb and therefore likewise constitutes an integral component of the 7SK RNP. Data presented here indicate that P-TEFb is inhibited upon association with a trimeric complex consisting of HEXIM1, 7SK RNA and LARP7. Furthermore, reporter gene analysis in TZMbl cells - cells expressing luciferase under the control of the strictly P-TEFb dependent HIV-1-LTR promoter - demonstrated this inhibition to be mainly mediated by LARP7. Thus, reduction of LARP7 expression by RNA-interference led to a significant stimulation of transcription in TZMbl cells. In addition, quantitative real time pcr revealed a similar effect on transcription for a series of cellular genes in LARP7 deficient HeLa cells. Moreover, the observation, that LARP7 represses polII transcription in general correlates well with a known function of the d. melanogaster LARP7 homologue mxc as a tumor suppressor. Thus, LARP7 affects the cellular P-TEFb/7SK RNP equilibrium und serves as a negative regulator of polII transcription in vivo.
KW  - LARP7
KW  - P-TEFb
KW  - 7SK RNA
KW  - Transkription
KW  - Elongation
KW  - LARP7
KW  - P-TEFb
KW  - 7SK RNA
KW  - transcription
KW  - elongation
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-41773
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Fauser, Mareike
A1  - Weselek, Grit
A1  - Hauptmann, Christine
A1  - Markert, Franz
A1  - Gerlach, Manfred
A1  - Hermann, Andreas
A1  - Storch, Alexander
T1  - Catecholaminergic Innervation of Periventricular Neurogenic Regions of the Developing Mouse Brain
JF  - Frontiers in Neuroanatomy
N2  - The major catecholamines—dopamine (DA) and norepinephrine (NE)—are not only involved in synaptic communication but also act as important trophic factors and might ultimately be involved in mammalian brain development. The catecholaminergic innervation of neurogenic regions of the developing brain and its putative relationship to neurogenesis is thus of pivotal interest. We here determined DA and NE innervation around the ventricular/subventricular zone (VZ/SVZ) bordering the whole ventricular system of the developing mouse brain from embryonic day 14.5 (E14.5), E16.5, and E19.5 until postnatal day zero (P0) by histological evaluation and HPLC with electrochemical detection. We correlated these data with the proliferation capacity of the respective regions by quantification of MCM\(^{2+}\) cells. During development, VZ/SVZ catecholamine levels dramatically increased between E16.5 and P0 with DA levels increasing in forebrain VZ/SVZ bordering the lateral ventricles and NE levels raising in midbrain/hindbrain VZ/SVZ bordering the third ventricle, the aqueduct, and the fourth ventricle. Conversely, proliferating MCM\(^{2+}\) cell counts dropped between E16.5 and E19.5 with a special focus on all VZ/SVZs outside the lateral ventricles. We detected an inverse strong negative correlation of the proliferation capacity in the periventricular neurogenic regions (log-transformed MCM\(^{2+}\) cell counts) with their NE levels (r = −0.932; p < 0.001), but not their DA levels (r = 0.440; p = 0.051) suggesting putative inhibitory effects of NE on cell proliferation within the periventricular regions during mouse brain development. Our data provide the first framework for further demandable studies on the functional importance of catecholamines, particularly NE, in regulating neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation during mammalian brain development.
KW  - brain development
KW  - ventricular zone
KW  - catecholamines
KW  - norepinephrine
KW  - dopamine
KW  - neurogenesis
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212485
VL  - 14
ER  -