TY - THES A1 - Endres, Leo Maximilian T1 - Development of multicellular \(in\) \(vitro\) models of the meningeal blood-CSF barrier to study \(Neisseria\) \(meningitidis\) infection T1 - Entwicklung multizellulärer \(in\) \(vitro\) Modelle der meningealen Blut-Liquor Schranke zur Untersuchung der \(Neisseria\) \(meningitidis\) Infektion N2 - Neisseria meningitidis (the meningococcus) is one of the major causes of bacterial meningitis, a life-threatening inflammation of the meninges. Traversal of the meningeal blood-cerebrospinal fluid barrier (mBCSFB), which is composed of highly specialized brain endothelial cells (BECs), and subsequent interaction with leptomeningeal cells (LMCs) are critical for disease progression. Due to the human-exclusive tropism of N. meningitidis, research on this complex host-pathogen interaction is mostly limited to in vitro studies. Previous studies have primarily used peripheral or immortalized BECs alone, which do not retain relevant barrier phenotypes in culture. To study meningococcal interaction with the mBCSFB in a physiologically more accurate context, BEC-LMC co-culture models were developed in this project using BEC-like cells derived from induced pluripotent stem cells (iBECs) or hCMEC/D3 cells in combination with LMCs derived from tumor biopsies. Distinct BEC and LMC layers as well as characteristic expression of cellular markers were observed using transmission electron microscopy (TEM) and immunofluorescence staining. Clear junctional expression of brain endothelial tight and adherens junction proteins was detected in the iBEC layer. LMC co-culture increased iBEC barrier tightness and stability over a period of seven days, as determined by sodium fluorescein (NaF) permeability and transendothelial electrical resistance (TEER). Infection experiments demonstrated comparable meningococcal adhesion and invasion of the BEC layer in all models tested, consistent with previously published data. While only few bacteria crossed the iBEC-LMC barrier initially, transmigration rates increased substantially over 24 hours, despite constant high TEER. After 24 hours of infection, deterioration of the barrier properties was observed including loss of TEER and altered expression of tight and adherens junction components. Reduced mRNA levels of ZO-1, claudin-5, and VE-cadherin were detected in BECs from all models. qPCR and siRNA knockdown data suggested that transcriptional downregulation of these genes was potentially but not solely mediated by Snail1. Immunofluorescence staining showed reduced junctional coverage of occludin, indicating N. meningitidis-induced post-transcriptional modulation of this protein, as previous studies have suggested. Together, these results suggest a potential combination of transcellular and paracellular meningococcal traversal of the mBCSFB, with the more accessible paracellular route becoming available upon barrier disruption after prolonged N. meningitidis infection. Finally, N. meningitidis induced cellular expression of pro-inflammatory cytokines and chemokines such as IL-8 in all mBCSFB models. Overall, the work described in this thesis highlights the usefulness of advanced in vitro models of the mBCSFB that mimic native physiology and exhibit relevant barrier properties to study infection with meningeal pathogens such as N. meningitidis. N2 - Neisseria meningitidis (der Meningokokkus) ist einer der Hauptursachen bakterieller Meningitis, einer lebensbedrohlichen Entzündung der Hirnhäute. Entscheidend für das für das Voranschreiten der Krankheit ist die Fähigkeit des Erregers, die meningeale Blut-Liquor-Schranke (mBCSFB), bestehend aus spezialisierten Hirnendothelzellen (BECs) und leptomeningealen Zellen (LMCs), zu überwinden und in den submeningealen Raum einzudringen. Da es sich bei N. meningitidis um ein rein humanes Pathogen handelt, beschränkt sich die Erforschung dieser speziellen Interaktion primär auf die Verwendung von in vitro Modellen. Bisher wurden hierfür hauptsächlich periphere oder immortalisierte BECs verwendet, welchen jedoch wichtige Barriere-Eigenschaften fehlen. Um die Interaktion von N. meningitidis mit der mBCSFB in einem physiologisch relevanteren Umfeld zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit neuartige BEC-LMC Kokulturmodelle entwickelt. Dabei wurden sowohl BEC-ähnliche Zellen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen generiert wurden (iBECs), als auch hCMEC/D3 Zellen verwendet und zusammen mit LMCs aus Tumorbiopsien kultiviert. Mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung konnten die unterschiedlichen Zellschichten und deren Expression charakteristischer zellulärer Marker dargestellt werden. Durchgängige Expression von wichtigen Bestandteilen Barriere-formender Zellverbindungen, sogenannter Tight und Adherens Junctions, wurde in der iBEC-Schicht beobachtet. Die Integrität der zellulären Barriere wurde mittels transendothelialer elektrischer Resistenz (TEER) und Permeabilität gegenüber Natrium-Fluorescein (NaF) bestimmt. Erhöhte TEER-Werte und verringerte NaF-Permeabilität, gemessen über einen Zeitraum von sieben Tagen, zeigten eine durch die Kokultur mit LMCs ausgelöste Steigerung der Dichtigkeit und Stabilität der iBEC-Barriere. Infektionsexperimente mit N. meningitidis zeigten in allen Modellen vergleichbare bakterielle Adhäsion und Invasion der BEC-Schicht. Bakterielle Transmigration durch die gesamten Zellbarriere war im iBEC-LMC Modell kurz nach Infektion nur in geringem Maße detektierbar, nahm jedoch innerhalb von 24 Stunden deutlich zu. Interessanterweise wurde bis zu 24 Stunden nach Infektion noch eine hohe Integrität der Barriere gemessen, welche allerdings im weiteren Verlauf verloren ging. Neben signifikantem TEER-Verlust wurde eine verringerte Expression der Tight und Adherens Junction Proteine ZO-1, claudin-5, und VE-cadherin mittels qPCR festgestellt. qPCR und siRNA Knockdown Experimente deuteten darauf hin, dass dies möglicherweise, aber nicht ausschließlich, auf den Transkriptionsfaktor Snail1 zurückzuführen war. Zusätzlich zu den beobachteten Effekten auf die zelluläre Transkription von Tight Junction Genen, zeigten Immunfluoreszenzfärbungen eine verringerte Expression von Occludin an den Zell-Zell-Verbindungen, was auf eine post-translationale Modulation schließen lässt. Zusammen deuten die Ergebnisse dieser Infektionsstudien auf eine mögliche Kombination aus trans- und parazellulärer bakterieller Transmigration der mBCSFB hin. Zuletzt wurden in dieser Arbeit noch die Immunaktivierung von BECs nach N. meningitidis Infektion in den neuen BEC-LMC Kokulturmodellen untersucht. Hierbei wurde eine erhöhte Expression von Zytokinen, insbesondere Interleukin-8, beobachtet. Insgesamt konnten in dieser Arbeit neue, fortschrittlicher in vitro Modelle der mBCSFB entwickelt werden, welche die humane Physiologie besser widerspiegeln und daher für Infektionsstudien mit Meningitis-verursachenden Erregern wie N. meningitidis von besonderem Nutzen sind. KW - Bakterielle Hirnhautentzündung KW - Blut-Liquor-Schranke KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Neisseria meningitidis KW - In-vitro-Kultur KW - Brain endothelial cells KW - Leptomeningeal cells KW - Hirnendothelzellen KW - Leptomeningealzellen Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346216 ER - TY - THES A1 - Fohmann, Ingo T1 - The Role of Sphingosine 1-phosphate and S1PR1-3 in the Pathophysiology of Meningococcal Meningitis T1 - Die Rolle von Sphingosin 1-Phosphat und S1PR1-3 in der Pathophysiologie der durch Meningokokken ausgelösten Meningitis N2 - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is an obligate human pathogen which causes live-threatening sepsis and meningitis. The fatality rate after meningococcal infection is high and surviving patients often suffer from severe sequelae. To cause meningitis, N. meningitidis must overcome the endothelium of the blood-brain barrier. The bacterium achieves this through the interaction with endothelial surface receptors leading to alternations of the cellular metabolism and signaling, which lastly results in cellular uptake and barrier traversal of N. meningitidis. Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a lipid mediator that belongs to the class of sphingolipids and regulates the integrity of the blood-brain barrier through the interaction with its cognate receptors S1P receptors 1-3 (S1PR1-3). In this study, high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS) was used to generate a time-resolved picture of the sphingolipid metabolism in a brain endothelial cell line (hCMEC/D3) upon meningococcal infection. Among various changes, S1P was elevated in the cellular compartment as well as in the supernatant of infected hCMEC/D3s. Analysis of mRNA expression in infected hCMEC/D3s with quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) revealed that the increase in S1P could be attributed to the enhanced expression of the S1P-generating enzyme sphingosine kinase 1 (SphK1). Antibody-based detection of SphK1 protein or phosphorylation at SphK1 residue Serine 225 in hCMEC/D3 plasma membrane fractions via Western Blot revealed that N. meningitidis also induced SphK1 phospho-activation and recruitment to the plasma membrane. Importantly, recruitment of SphK1 to the plasma membrane increases the probability of substrate encounter, thus elevating SphK activity. Enhanced SphK activity was also reflected on a functional level, as detected by a commercially available ATP depletion assay used for measuring the enzymatic activity of SphK. Infection of hCMEC/D3 cells with pilus-deficient mutants resulted in a lower SphK activation compared to the N. meningitidis wild type strain. hCMEC/D3 treatment with pilus-enriched protein fractions showed SphK activation similar to the infection with living bacteria and could be ascribed to pilus interaction with the membrane-proximal domain of cellular surface receptor CD147. Inhibition of SphK1 or SphK2 through pre-treatment with specific inhibitors or RNA interference reduced uptake of N. meningitidis into hCMEC/D3 cells, as measured with Gentamicin protection assays. Released S1P induced the phospho-activation of epidermal growth factor receptor (EGFR) via S1PR2 activation, whose expression was also increasing during infection. Furthermore, S1PR2 blockage had a preventive effect on bacterial invasion into hCMEC/D3 cells. On the contrary, activation of S1PR1+3 also reduced bacterial uptake, indicating an opposing regulatory role of S1PR1+3 and S1PR2 during N. meningitidis uptake. Moreover, SphK2 inhibition prevented inflammatory cytokine expression as well as release of interleukin-8 after N. meningitidis infection. Taken together, this study demonstrates the central role of S1P and its cognate receptors S1PR1-3 in the pathophysiology of meningococcal meningitis. N2 - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) ist ein obligat humanpathogenes Bakterium, welches lebensbedrohliche Sepsis und Meningitis auslöst. Die Todesrate nach einer Meningokokkeninfektion ist hoch und überlebende Patienten leiden oft unter gravierenden Folgeschäden. N. meningitidis muss zuerst das Endothel der Blut-Hirn-Schranke überwinden, um Meningitis auslösen zu können. Das Bakterium erzielt dies durch die Interaktion mit endothelialen Rezeptoren, welche den zellulären Metabolismus und die zellulären Signalwege beeinflusst und letztlich zur zellulären Aufnahme von N. meningitidis und zur Überwindung der Barriere führt. Sphingosine 1-phosphat (S1P) ist ein Lipidmediator, der zur Klasse der Sphingolipide gehört und die Integrität der Blut-Hirn-Schranke durch die Interaktion mit den zugehörigen S1P Rezeptoren 1-3 (S1PR1-3s) beeinflusst. In dieser Arbeit wurde Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie (LC-MS/MS) genutzt, um ein zeitlich aufgelöstes Bild des Sphingolipidmetabolismus in einer Hinendothelzelllinie (hCMEC/D3) nach Meningokokkeninfektion zu generieren. Neben zahlreichen Veränderungen zeigte sich ein Anstieg von S1P im zellulären Kompartiment und im Überstand von infizierten hCMEC/D3 Zellen. Die Analyse der mRNA Expression in infizierten hCMEC/D3 Zellen mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) offenbarte, dass der Anstieg von S1P auf eine erhöhte Expression der S1P-bildenden Sphingosinkinase 1 (SphK1) zurückzuführen war. Die ntikörperbasierte Detektion des Proteins SphK1 oder dessen Phosphorylierung an Serin 225 in den Membranfraktionen von hCMEC/D3 Zellen mittels Western Blot zeigte, dass N. meningitidis außerdem die Phospho-Aktivierung und Membrantranslokation von SphK1 induzierte. Die Plasmamembrantranslokation von SphK1 erhöht die Wahrscheinlichkeit auf das Substrat Sphingosine zu treffen und verstärkt somit die SphK-Aktivität. Die erhöhte SphK-Aktivität zeigte sich auch auf funktioneller Ebene, wie mittels eines ATP-Verbrauchs-Assays zur Messung der SphK-Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Infektion von hCMEC/D3 Zellen mit Pilus-defizienten Mutanten resultierte in einer geringeren SphK-Aktivierung im Vergleich zum Wildtypstamm. Die Behandlung von hCMEC/D3 Zellen mit Pilus-aufgereinigten Fraktionen zeigte eine SphK-Aktivierung, die mit der Aktivierung durch lebende Bakterien vergleichbar war und der Interaktion des Pilus mit der membranproximalen Domäne des zellulären Oberflächenrezeptors CD147 zugeordnet werden konnte. Die Inhibition von SphK1 und SphK2 durch die Vorbehandlung mit spezifischen Inhibitoren oder RNA-Interferenz reduzierte die Aufnahme von N. meningitidis in hCMEC/D3 Zellen, wie mittels Gentamicin Protection Assay nachgewiesen wurde. Das freigesetzte S1P induzierte die Phospho-Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) durch die Aktivierung von S1PR2, welcher während der Infektion vermehrt exprimiert wurde. Die Blockierung von S1PR2 hatte einen präventiven Effekt auf die bakterielle Invasion in hCMEC/D3 Zellen. Im Gegenzug reduzierte die Aktivierung von S1PR1+3 ebenfalls die bakterielle Aufnahme, was auf eine gegensätzliche regulatorische Rolle von S1PR1+3 und S1PR2 während der Aufnahme von N. meningitidis in hCMEC/D3 Zellen hindeutet. Darüber hinaus verhinderte die Inhibition von SphK2 die Expression von inflammatorischen Cytokinen sowie die Freisetzung von Interleukin-8 nach Infektion mit N. meningitidis. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die zentrale Rolle von S1P und den zugehörigen Rezeptoren S1PR1-3 in der Pathophysiologie der durch Meningokokken ausgelösten Meningitis. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Sphingosinkinase KW - Sphingolipide KW - Bakterielle Infektion KW - Sphingosine 1-phosphate KW - Sphingosine 1-phosphate receptor KW - Epidermal growth factor receptor KW - CD147 KW - S1P KW - S1PR KW - Meningococci KW - Basigin KW - EGFR KW - Meningitis cerebrospinalis epidemica KW - Meningitis, Meningococcal Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-369764 ER - TY - THES A1 - Münstermann, Marcel T1 - The roles of the anaphylatoxin receptors during invasive disease as well as mucosal colonization caused by \(Neisseria\) \(meningitidis\) T1 - Die Rolle der Anaphylatoxinrezeptoren während invasiver Infektion sowie mukosaler Kolonisation verursacht durch \(Neisseria\) \(meningitidis\) N2 - The human specific gram-negative bacterium Neisseria meningitidis (Nme, meningococci) is a common colonizer of the upper respiratory tract. Upon becoming invasive, Nme can cause meningitis and life-threatening sepsis. The most important immune defense mechanism in invasive meningococcal disease (IMD) is the complement mediated killing of bacteria. The complement cascade is activated through different pathogen associated patterns and finally leads to the lysis of the bacteria by the membrane attack complex. In addition to the direct bacterial killing, the complement system is also an important player in different inflammatory processes. A hallmark of IMD is an overreaction of the immune system and the release of the potent anaphylatoxins C3a and C5a by the complement system is an important factor hereby. There are three anaphylatoxin receptors (ATRs), the C3aR, the C5aR1 and the C5aR2, capable of detecting these anaphylatoxins. It has already been shown that blocking the ATR C5aR1 strongly benefitted the outcome of IMD in a murine sepsis model. However, the roles of ATRs C3aR and C5aR2 in IMD are still unclear. This work aims to analyze the role of these ATRs in meningococcal sepsis and to identify possible underlying mechanisms. Furthermore, a possible involvement of the complement system, the ATRs and the type II CRISPR/Cas system on nasopharyngeal colonization is analyzed. In vivo depletion experiments showed that without neutrophils or monocytes/macrophages the complement system alone was not able to clear a low dose Nme infection, which highlights the importance of cellular components in IMD. Analyzing the role of the ATRs in knock-out mice with high dose Nme infections, revealed that the lack of C5aR2, like the lack of C5aR1, was beneficial for the outcome of meningococcal induced sepsis. In contrast, the lack of C3aR in knock-out mice was detrimental. The positive outcome associated with the C5aRs could be reproduced by using an antagonist against both C5aRs or an antagonist specifically against C5aR1 in WT mice. These findings are giving hope to future therapeutic applications. Next, a possible contribution of neutrophils to this positive outcome was analyzed. Absence of C5aR1 led to a decrease of degranulation by neutrophils in a murine whole blood model, while the other ATRs showed no effect. Neutrophil analysis in human whole blood, on the other hand, revealed a reduced oxidative burst and IL-8 secretion upon inhibition of all three ATRs. A functional difference between the C5aRs and the C3aR in neutrophils was observed in phagocytosis, which was reduced upon C3aR inhibition, but was unaltered with C5aR1 or C5aR2 inhibition. Possible underlying mechanisms in the phosphorylation of ERK1/2 were analyzed in bone marrow derived macrophages isolated from ATR knock-out mice. The later phosphorylation of ERK1/2 in macrophages without C5aR1 or C5aR2 expression might explain, why blocking the C5aRs is beneficial for the outcome of IMD in mice. In contrast to these findings, the colonization of the nasopharynx in huCEACAM 1 expressing mice by Nme did not seem to depend on the Complement system factors C3 and C5 nor the ATRs. Additionally, no difference in the colonization could be observed in this model using Nme mutants lacking different parts of the type 2 CRISPR/Cas system. Conclusively, this work highlights the importance of the complement system, the ATRs and the cellular components in IMD. Contrariwise, these factors did not play a role in the analyzed nasopharyngeal infection model. The beneficial effects of C5aR1 and C5aR2 lack/inhibition in IMD might have medicinal applications, which could support the standard therapies of IMD in the future. N2 - Das human spezifische pathogene Gram-negative Bakterium Neisseria meningitidis (Nme, Meningokokken) ist ein Kommensale angesiedelt im Nasopharynx. Bei invasiver Erkrankung können Nme Meningitis oder eine lebensbedrohliche Sepsis verursachen. Die wichtigste Verteidigung des Immunsystems in invasiver Meningokokken-Erkrankung (IMD) ist die Abtötung von Bakterien durch das Komplementsystem. Die Komplementkaskade wird durch verschiedene pathogenassoziierte Muster in Gang gesetzt und resultiert in dem Aufbau des Membranangriffskomplex, welcher die Bakterien schließlich lysiert. Darüber hinaus spielt das Komplementsystem auch eine wichtige Rolle in verschiedenen inflammatorischen Prozessen im Körper. Ein charakteristisches Merkmal von IMD ist eine übermäßige Reaktion des Immunsystems und dabei ist die Freisetzung der Anaphylatoxine C3a und C5a, durch das Komplementsystem, ein wichtiger Faktor. Es gibt drei Anaphylatoxin Rezeptoren (ATR), den C3aR, den C5aR1 und den C5aR2, welche die jeweiligen Anaphylatoxine erkennen. In murinen Modellen wurde bereits gezeigt, dass die Inhibition des C5aR1 einen positiven Einfluss auf den Verlauf von IMD hat. Im Kontrast dazu sind die Rollen der ATRs C3aR und C5aR2 in IMD weiter unklar. Diese Arbeit hat als Ziel, die Rolle der ATRs in Meningokokken induzierter Sepsis zu untersuchen und mögliche zugrundeliegende Mechanismen zu finden. Des Weiteren soll ein möglicher Einfluss des Komplementsystems, der ATRs und des Typ II CRISPR/Cas Systems auf die Kolonisation durch Nme im Nasopharynx untersuchen werden. In vivo Depletions-Versuche zeigten, dass ohne Neutrophile oder Monozyten/Makrophagen das Komplementsystem allein nicht in der Lage war eine Nme-Infektion mit einer niedrigen Infektionsdosis zu beseitigen. Dies zeigt die Wichtigkeit von Immunzellen neben dem Komplementsystem in IMD. Experimente mit hohen Nme-Dosen in ATR knock-out Mäusen zeigten, dass die fehlende Expression von C5aR2, wie die von C5aR1, sich positiv auf den Ausgang von IMD auswirkte. Im Gegensatz dazu, verschlimmerte das Fehlen des C3aR Rezeptors den Ausgang der IMD. Die positive Wirkung in den C5aR knock-out Mäusen, konnte auch mit der Gabe von einem gegen beide C5aRs oder einem spezifisch gegen C5aR1 gerichteten Antagonisten in WT Mäusen beobachtet werden. Diese Ergebnisse geben Hoffnung auf eine mögliche zukünftige therapeutische Applikation. Als nächstes wurde eine mögliche Beteiligung von Neutrophilen an dem positiven Ausgang von IMD in Abhängigkeit von den ATRs untersucht. Eine fehlende C5aR1 Expression führte zu einer verminderten Degranulation durch Neutrophile in dem verwendeten murinen Vollblutmodel, wohingegen die fehlende Expression der anderen ATRs keinen Effekt zeigte. Im Gegensatz dazu, zeigten Versuche mit humanem Vollblut einen verminderten Oxidativen Burst sowie eine verminderte Ausschüttung von IL-8 bei der Blockade von allen drei ATRs. Ein Unterschied zwischen den C5aRs und dem C3aR zeigte sich hingegen in der Phagozytose, welche mit C3aR Inhibierung reduziert war, aber unverändert nach der Inhibierung von C5aR1 oder C5aR2 blieb. Mögliche zugrundeliegende Mechanismen in der Phosphorylation von ERK1/2 wurden anschließend in Knochenmark-gereiften Makrophagen von ATR knock-out Mäusen untersucht. Ohne C5aR1 oder C5aR2 Expression wurde eine verzögerte Phosphorylierung von ERK1/2 in den Makrophagen beobachtet, was erklären könnte warum die Blockade von C5aRs den Ausgang von Meningokokken induzierter Sepsis in Mäusen positiv beeinflusst. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurde die Kolonisation des Nasopharynx durch Nme in huCEACAM-1 exprimierenden Mäusen, weder durch die Komplementfaktoren C3 und C5 noch durch die ATRs beeinflusst. Zusätzlich konnte auch kein Unterschied in der Besiedelung des Nasopharynx durch Nme-Mutanten, die verschiedene Mutationen des Typ 2 CRISPR/Cas Systems besaßen, beobachtet werden. Diese Arbeit zeigt die Wichtigkeit des Komplementsystems, der ATRs und der Immunzellen in IMD. Zusätzlich zeigt diese Arbeit, dass das Komplementsystem und die ATRs jedoch keine Auswirkungen auf die Kolonisation des Nasopharynx in Mäusen haben. Die äußerst positive Auswirkung auf IMD, wenn C5aR1 und C5aR2 nicht gebildet oder blockiert werden, könnte medizinisch von Bedeutung sein und eventuell in der Zukunft die Standarttherapie bei IMD unterstützen. KW - Anaphylatoxine KW - Komplement C3a KW - Komplement C5a KW - Neisseria meningitidis KW - Komplement KW - anaphylatoxin receptors KW - invasive meningococcal diseases KW - Anaphylatoxinrezeptoren Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-269759 ER - TY - THES A1 - Hühne, Tom T1 - Untersuchungen zur selektiven Induktion von Zelltod in CD4+ Foxp3- konventionellen T-Zellen der Maus durch Hemmung der sauren Sphingomyelinase \(in\) \(vitro\) T1 - Analysis of the selective induction of cell death in murine CD4+ Foxp3- conventional T cells by inhibition of acid sphingomyelinase \(in\) \(vitro\) N2 - Die saure Sphingomyelinase (Asm) ist ein lysosomales Enzym, das sezerniert werden kann und die Reaktion von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphocholin katalysiert. Seine Funktion ist bedeutsam für die Aufrechterhaltung des zellulären Lipidstoffwechsels und für die Integrität der Plasmamembran. Enzymdefekte sind an der Pathogenese von Infektionen und zahlreichen Stoffwechselerkrankungen wie z.B. der Niemann-Pick-Krankheit, Diabetes mellitus Typ II und auch an der Entstehung psychischer Erkrankungen beteiligt. Immunologisch bedeutsam ist, dass durch Hemmung der Asm mit trizyklischen Antidepressiva (TZA) oder Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRI) die Frequenz CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (Treg) der Maus erhöht wird. Grund für die Frequenzerhöhung ist jedoch nicht die Erhöhung der absoluten Treg-Zellzahl, sondern das selektive Sterben CD4+ CD25- Foxp3- konventioneller T-Zellen (Tconv). Erstaunlicherweise führt die Behandlung mit dem kompetitiven Asm-Inhibitor ARC39, einem Bisphosphonat, nicht zu diesem Effekt. Es konnte gezeigt werden, dass IL-2 die regulatorischen T-Zellen vor dem durch Asm-Hemmung induziertem Zelltod schützt. In Abwesenheit von IL-2 gehen auch Treg-Zellen durch die Asm-Inhibition zugrunde. Treg-Zellen exprimieren konstitutiv CD25, den IL-2-Rezeptor, dessen α-Kette die Bindungsstelle von Interleukin-2 bildet. Die β- und γ-Kette des Rezeptors sind an der Bindung des Transkriptionsfaktors STAT5 beteiligt, das wiederum die Gentranskription von antiapoptotischen Proteinen wie bcl-2 und bcl-x sowie CD25 fördert. Dahingehend wurde versucht, den verantwortlichen Faktor für den Schutz von Treg-Zellen vor dem Zelltod in der IL-2-Signaltransduktion zu identifizieren. Der Transkriptionsfaktor STAT5 konnte hierbei ausgeschlossen werden. Weder die genetische Überexpression noch die Defizienz von STAT5 hatten Einfluss auf das T-Zell-Gleichgewicht. Die genauen molekularen Mechanismen der Treg-spezifischen IL-2-Protektion bleiben daher ungeklärt. Zu diskutieren sind der Einfluss von Zn2+-Ionen, Januskinasen und Mitgliedern der FoxO-Familie. Die zugrundeliegende Hypothese, dass das spezifische Sterben konventioneller T-Zellen auf einer Erhöhung der lysosomalen Membranpermeabilität (LMP) besteht, woraufhin proapoptotisch wirksame Cathepsine ins Zytosol freigesetzt werden und Caspasen zur Auslösung von Apoptose führen, konnte nicht abschließend bestätigt werden. Jedoch wurde nachgewiesen, dass durch Inhibition von Cathepsinen das Sterben konventioneller T-Zellen in Abwesenheit von IL-2 verlangsamt wird. Eine Protektion der Tconv-Zellen durch Caspase-Inhibitoren kann nur bei hohen 60 Konzentrationen des Inhibitors ZVAD bei gleichzeitig geringer Asm-Inhibitor-Konzentration erreicht werden. In Zusammenschau der Ergebnisse müssen weitere Formen des Zelltods neben der Apoptose, etwa eine durch Asm-Inhibition induzierte Ferroptose, in Erwägung gezogen werden. Neben dem durch Asm-Inhibition erzeugten Lipidstress begünstigt das Vorliegen von hypoxischen Bedingungen die Induktion von Zelltod. Schon das alleinige Auftreten von Hypoxie ohne den Einfluss von Asm-Inhibitoren führt zu einer Treg-Frequenzerhöhung. Der Hypoxie-induzierte Faktor HIF-1α induziert die Expression von Foxp3, wodurch die Differenzierung und Suppressivität von CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg-Zellen gefördert wird. Der Einfluss von Hypoxie spielt womöglich vor allem in der Tumortherapie eine entscheidende Rolle. HIF-1α regt hypoxische, nicht-vaskularisierte Tumorareale zur Neovaskularisation an und bremst durch die Frequenzerhöhung regulatorischer T-Zellen die eigene Immunabwehr. Ein Abbau des Transkriptionsfaktors HIF-1α stellt somit eine therapeutische Option in der Therapie solider Tumoren dar. Abschließend lässt sich also festhalten, dass die relative Frequenzerhöhung regulatorischer T-Zellen durch Asm-Inhibition nicht durch Apoptose erklärt werden kann, sondern alternative Erklärungsmodelle wie z.B. die Ferroptose in Betracht gezogen werden müssen. Die Protektion CD25+ regulatorischer T-Zellen beruht auf der Wirkung von IL-2 und wird durch Hypoxie positiv beeinflusst. Eine genaue Identifizierung der für den Zelltod relevanten Mechanismen ist erforderlich, um sichere therapeutische Maßnahmen im Rahmen von Infektionen und Autoimmunkrankheiten zu etablieren. N2 - The acid sphingomyelinase (Asm) is a lysosomal enzyme that can be secreted and catalyses the cleavage of sphingomyelin to ceramide and phosphocholine. Its function is important for the maintenance of cellular lipid metabolism and for the integrity of the plasma membrane. Enzyme defects are involved in the pathogenesis of infections and numerous metabolic diseases such as Niemann-Pick disease, diabetes mellitus type II and also in the development of mental illness. It is of immunological importance that the inhibition of the Asm with tricyclic antidepressants (TCA) or serotonin reuptake inhibitors (SSRI) leads to an increase of the frequency of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells (Treg) in the mouse. The reason for this frequency increase is not an increase in the absolute Treg cell count, but rather due to the selective death of CD4+ CD25- Foxp3- conventional T cells (Tconv) Surprisingly, treatment with the competitive Asm-inhibitor ARC39, a bisphosphonate, does not lead to this effect. It could be demonstrated that IL-2 protects regulatory T cells from cell death induced by Asm inhibition. In the absence of IL-2, Treg cells also die due to Asm inhibition. Treg cells constitutively express CD25, the IL-2 receptor, whose α-chain forms the binding site of interleukin-2. The β- and γ-chain of the receptor are involved in the binding of the transcription factor STAT5, which itself promotes gene transcription of anti-apoptotic proteins such as bcl-2 and bcl-x as well as CD25. Therefore, we tried to identify the responsible factor responsible for protecting Treg cells from cell death in IL-2 signal transduction. The transcription factor STAT5 was excluded. Neither the genetic over-expression nor the deficiency of STAT5 had any influence on the T-cell balance. The exact molecular mechanisms of Treg specific IL-2 protection remain unexplained. The influence of Zn2+ ions, Janus kinases and FoxO-family members will be discussed. The underlying hypothesis that the specific death of conventional T cells is based on an increase in lysosomal membrane permeability (LMP), whereupon proapoptotic cathepsins are released into the cytosol and caspases lead to the induction of apoptosis could not be conclusively confirmed. However, it has been shown that inhibition of cathepsins slows down the death of conventional T cells in the absence of IL-2. A protection of Tconv cells by caspase inhibitors can only be achieved at high concentrations of the inhibitor ZVAD with simultaneously low Asm inhibitor concentrations. In summary, other forms of cell death besides apoptosis, such as ferroptosis induced by Asm inhibition, need to be considered. 62 Besides lipid stress induced by Asm inhibition, the presence of hypoxic conditions favors the induction of cell death. Even the mere occurrence of hypoxia without the influence of Asm inhibitors leads to an increase in Treg frequency. Hypoxia-induced factor HIF-1α induces Foxp3 expression, promoting differentiation and suppressiveness of CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg cells. The influence of hypoxia possibly plays a decisive role especially in tumor therapy. HIF-1α stimulates hypoxic, non-vascularized tumor areas to neovascularize and slows down the own immune defense by increasing the frequency of regulatory T cells. A degradation of the transcription factor HIF-1α is therefore a therapeutic option in the therapy of solid tumors. In conclusion, it can be stated that the relative frequency increase of regulatory T cells by Asm inhibition cannot be explained by apoptosis, but alternative explanation models such as ferroptosis must be considered. The protection of CD25+ regulatory T cells is based on the effect of IL-2 and is positively influenced by hypoxia. A precise identification of the mechanisms relevant for cell death is necessary to establish safe therapeutic measures in the context of infections and autoimmune diseases. KW - Sphingomyelinphosphodiesterase KW - Desipramin KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Sphingomyelinase KW - Desipramin KW - T-Zelle KW - Regulatorische T-Lymphozyt Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248351 ER - TY - THES A1 - Krüger, Sören T1 - Unterschiedliche Einflüsse von Komplement auf Reaktionen neutrophiler Granulozyten auf die Infektion mit \(Neisseria\) \(meningitidis\) T1 - Differential influences of complement on neutrophil responses to \(Neisseria\) \(meningitidis\) infection N2 - The gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is a frequent human-specific, commensal bacterium of the upper respiratory tract. Under certain conditions especially in infants, meningococci can translocate into the bloodstream and cause invasive meningococcal disease (IMD) manifesting as meningitis or sepsis or a combination of both. IMD is feared for its rapid progression and high fatality rate if it remains untreated. IMD affects up to one million people annually causing substantial morbidity and mortality worldwide. It is well-established that the complement system is an important protective factor in meningococcal disease through opsonization of bacteria with C3b and the lytic activity of the membrane attack complex although the inflammatory C5a/C5aR1 axis can aggravate IMD. The role of neutrophil granulocytes in meningococcal infection is less clear despite their abundant recruitment throughout the course of disease. This study aimed to characterize neutrophil responses to Nme in vitro and the influence of complement on these responses. In infection assays with whole blood and isolated PMNs, effective binding, internalization and killing of Nme by neutrophils was demonstrated. A significant complement-dependence of neutrophil phagocytosis and oxidative burst was observed. The opsonizing and lytic pathway of the complement cascade were found to be most relevant for these responses since blockade of C3 using inhibitor Compstatin Cp20 reduced phagocytosis and oxidative burst significantly more than the blockade of the inflammatory branch with C5aR1-antagonist PMX53. Opsonization with specific antibodies could not replicate the effect of complement activation indicating that engagement of neutrophil complement receptors, particularly complement receptor 3, is involved. Other neutrophil effector functions such as degranulation and IL-8 release were activated in a complement-independent manner implying activation by other inflammatory signals. Considering existing evidence on the overall protective effect of PMNs, further studies investigating the contribution of each neutrophil effector function to infection survival in vivo are required. Ideally, this should be studied in a murine meningitis or sepsis model in the context of complement activation. N2 - Der Gram-negative Diplokokkus Neisseria meningitidis (Nme) ist ein weit verbreitetes, human-spezifisches, kommensales Bakterium des oberen Respirationstraktes. Unter bestimmten Bedingungen, insbesondere bei Kleinkindern, können Meningokokken in die Blutbahn translozieren und eine invasive Meningokokkenerkrankung (IMD) auslösen, die sich als Meningitis, Sepsis oder eine Kombination beider Krankheitsbilder manifestiert. IMD werden aufgrund ihrer raschen Progression und ohne Behandlung hohen Letalität gefürchtet. IMD betreffen jährlich bis zu einer Million Menschen weltweit mit substanzieller Morbidität und Mortalität. Es ist bekannt, dass das Komplement-system bei IMD als protektiver Faktor durch die Opsonisierung von Nme mit C3b und Lyse mittels Membranangriffskomplex wirkt, obwohl die inflammatorische C5a/C5aR1-Achse die Erkrankung aggravieren kann. Die Rolle neutrophiler Granulozyten (PMNs) bei IMD bleibt hingegen kontrovers, obwohl eine starke Rekrutierung dieser Zellen stattfindet. Diese Studie charakterisiert die Reaktionen neutrophiler Granulozyten auf Nme in vitro und deren Modulation durch Komplement. In Infektionsassays mit Vollblut und isolierten PMNs konnte die Bindung, Internalisierung und Elimination von Nme durch PMNs demonstriert werden. Oxidativer burst und Phagozytose zeigten dabei eine ausgeprägte Abhängigkeit von Komplement. Die opsonisierende und lytische Wirkung von Komplement erwiesen sich dabei als relevant für diese Funktionen, da die Blockade von C3 durch den Inhibitor Compstatin Cp20 Phagozytose und oxidativen Burst signifikant stärker reduzierte als die Blockade der Inflammation durch C5a mittels C5aR1-Antagonist PMX53. Die Opsonisierung mit spezifischen Antikörpern konnte den Effekt der Komplementaktivierung nicht replizieren, was auf eine Signalvermittlung durch Komplementrezeptoren insbesondere CR3 hindeutet. Andere Effektorfunktionen wie Degranulation und IL-8 Freisetzung waren komplementunabhängig, was auf deren Initiierung durch andere inflammatorische Signale hindeutet. In Anbetracht bestehender Evidenz für einen insgesamt protektiven Effekt von PMN sind weitere Studien nötig, die den Effekt der einzelnen Effektorfunktionen auf das Outcome in vivo untersuchen. Besonders geeignet wäre dafür ein murines Sepsis oder Meningitis-Modell. KW - Neisseria meningitidis KW - Neutrophiler Granulozyt KW - Komplement KW - Complement system KW - Neutrophil granulocyte Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249697 ER - TY - THES A1 - Solger, Franziska T1 - Central role of sphingolipids on the intracellular survival of \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) in epithelial cells T1 - Die zentrale Rolle von Sphingolipiden auf das intrazelluläre Überleben von \(Neisseria\) \(gonorrhoeae\) in Epithelzellen N2 - Neisseria gonorrhoeae are Gram-negative bacteria with diplococcal shape. As an obligate human pathogen, it is the causative agent of gonorrhoea, a sexually transmitted disease. Gonococci colonize a variety of mucosal tissues, mainly the urogenital tract in men and women. Occasionally N. gonorrhoeae invades the bloodstream, leading to disseminated gonococcal infection. These bacteria possess a repertoire of virulence factors, which expression patterns can be adapted to the environmental conditions of the host. Through the accumulation of antibiotic resistances and in absence of vaccines, some neisserial strains have the potential to spread globally and represent a major public health threat. Therefore, it is necessary to understand the exact molecular mechanisms underlying the successful infection and progression of gonococci within their host. This deeper understanding of neisserial infection and survival mechanisms is needed for the development of new therapeutic agents. In this work, the role of host-cell sphingolipids on the intracellular survival of N. gonorrhoeae was investigated. It was shown that different classes of sphingolipids strongly interact with invasive gonococci in epithelial cells. Therefore, novel and highly specific clickable sphingolipid analogues were applied to study these interactions with this pathogen. The formation of intra- and extracellular sphingosine vesicles, which were able to target gonococci, was observed. This direct interaction led to the uptake and incorporation of sphingosine into the neisserial membrane. Together with in vitro results, sphingosine was identified as a potential bactericidal reagent as part of the host cell defence. By using different classes of sphingolipids and their clickable analogues, essential structural features, which seem to trigger the bacterial uptake, were detected. Furthermore, effects of key enzymes of the sphingolipid signalling pathway were tested in a neutrophil infection model. In conclusion, the combination of click chemistry and infection biology made it possible to shed some light on the dynamic interplay between cellular sphingosine and N. gonorrhoeae. Thereby, a possible “catch-and-kill” mechanism could have been observed. N2 - Neisseria gonorrhoeae ist ein Gram-negatives Bakterium, welches als Diplokokke vorkommt. Als ein ausschließliches Humanpathogen sind Neisserien der Erreger für die sexuell übertragbare Infektionskrankheit Gonorrhö. Gonokokken besiedeln eine Vielzahl von Schleimhäuten, jedoch hauptsächlich den Urogenitaltrakt bei Männern und Frauen. Gelegentlich kann N. gonorrhoeae in die Blutbahn invadieren, was zu einer disseminierten Infektion führen kann. Diese Bakterien verfügen über ein Repertoire an Virulenzfaktoren, deren Expressionskombination den Umgebungsbedingungen des Wirts angepasst werden können. Durch die Anhäufung von Antibiotikaresistenzen und durch das Fehlen eines Impfstoffes, besteht die Gefahr, dass spezielle Neisserienstämme sich weltweit verbreiten und daher eine ernstzunehmende Bedrohung des Menschen sind. Daher ist es notwendig die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen der erfolgreichen Infektion und Ausbreitung der Gonokokken im Wirt genauestens zu verstehen. Das detaillierte Wissen über die Neisserieninfektion und Überlebensmechanismen ist nötig für die Entwicklung neuer Therapieansätze. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Sphingolipiden der Wirtszelle auf das intrazelluläre Überleben von N. gonorrhoeae untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Klassen von Sphingolipiden stark mit invasiven Gonokokken in Epithelzellen interagieren. Um dies zu tun, wurden neue und hochspezifische clickbare Sphingolipidanaloge eingesetzt, um deren Interaktionen mit diesem Pathogen zu studieren. Die Formation von intra- als auch extrazellulären Sphingosinvesikeln, welche Gonokokken gezielt erreichten, konnte beobachtet werden. Diese direkte Interaktion führte zu einer Aufnahme und Einbau des Sphingosins in die Neisserienmembran. Zusammen mit in vitro Ergebnissen, konnte Sphingosin als potenzieller und antibakterieller Bestandteil des zellulären Abwehrsystems identifiziert werden. Weiterhin wurde durch die Verwendung unterschiedlicher Sphingolipidklassen und deren clickbaren Analoge wichtige Strukturen erkannt, die die bakterielle Aufnahme auslösen. Des Weiteren wurden die Auswirkungen von Schlüsselenzymen des Sphingolipidsignalwegs in einem Infektionsmodell mit Neutrophilen getestet. Abschließend ist zu sagen, dass die Kombination aus Click Chemie und Infektionsbiologie es ermöglicht hat, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen zellulären Sphingosin und N. gonorrhoeae zu beleuchten. Dadurch konnte ein möglicher „catch-and-kill”-Mechanismus entdeckt werden. KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Sphingosinkinase KW - Sphingosinanaloga KW - Click-Chemie KW - sphingosine KW - sphingolipids KW - Neisseria KW - intracellular KW - vesicles Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247534 ER - TY - THES A1 - Kaiser, Lena Franziska T1 - Wirkmechanismus von Sphingolipiden und Sphingosin gegen mikrobielle Erreger T1 - Mechanism of the bactericidal effect of sphingolipids and sphingosine against microbial pathogens N2 - Die zunehmende Antibiotikaresistenz vieler Krankheitserreger ist ein weltweites Problem, welches zu einem klinischen Bedarf an neuen antimikrobiellen Substanzen führt. Sphingolipide einschließlich Ceramide stellen eine vielfältige Gruppe strukturverwandter Lipide dar und bestehen aus einem Sphingosin-Grundgerüst, welches mit einer Fettsäure verbunden ist. Sowohl das Sphingosin-Grundgerüst allein als auch Sphingolipide zeigen eine antibakterielle Wirkung gegenüber einer Vielzahl pathogener Mikroorganismen. Die Intensität der Hemmung hängt von der Sphingolipidstruktur und dem Mikroorganismus ab. Neuere Studien konnten zeigen, dass Sphingosin, Ceramide und Ceramid-Analoga in N. meningitidis aufgenommen werden und eine bakteriostatische oder bakterizide Wirkung zeigen. Jedoch ist die antibakterielle Wirkungsweise noch nicht genau bekannt. Um mehr über den Wirkmechanismus zu erfahren haben wir die ultrastrukturellen Veränderungen von N. meningitidis nach Inkubation mit azido-funktionalisierten Sphingolipiden mit elektronenmikroskopischen Verfahren (transmissionselektronenmikroskopische und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen) untersucht. Mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) konnten wir die azido-funktionalisierten Sphingolipide nach Aufnahme in N. meningitidis lokalisieren. Zum Anfärben der funktionalisierten Sphingolipide wurde die kupferfreie Azid-Alkin-Cyccloaddition verwendet. N2 - The increasing antibiotic resistance of many pathogens is a worldwide problem that leads to a clinical need of new anti-microbial compounds. Sphingolipids, including ceramides, represent a diverse group of structurally related lipids and are composed of a sphingosine backbone coupled to a fatty acid. Solely the sphingosine backbone as well as the sphingolipids show antibacterial activity against a wide range of pathogenic microorganisms. The rate of inhibition depends on the sphingolipid structure and the microbial strain. Recent studies revealed the uptake of sphingosine, ceramides and ceramide analogues by N. meningitidis and a bacteriostatic or bactericidal effect. However, the mechanism of the bactericidal effect is still unknown. To elucidate the antibacterial mechanism, we studied the ultrastructural changes after incubation of N. meningitidis with azido-modified sphingolipids by using electron microscopy techniques (transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). Due to correlative light-electron microscopy (CLEM) we were able to localize the azido-modified sphingolipids after incorporation in N. meningitidis. Copper-free azide-alkyne cycloaddition was used to stain the azido-modified sphingolipids. KW - Neisseria meningitidis KW - Sphingolipide KW - Sphingosin KW - Antimikrobieller Wirkstoff KW - Mikroskopie KW - sphingolipids Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218970 ER - TY - THES A1 - von Papen, Hans Michael T1 - Untersuchungen zum Einfluss der Meningokokkeninfektion auf den Zellzyklus von Epithelzellen T1 - Disease and carrier isolates of Neisseria meningitidis cause G1 cell cycle arrest in human epithelial cells N2 - Zahlreiche humanpathogene bakterielle Erreger können ihre Fähigkeit zur Kolonisation epithelialer Barrieren optimieren, indem sie mit dem Zellzyklus der infizierten Wirtszelle in Wechselwirkung treten und so die Abschilferung und Erneuerung des Epithels verzögern. Die hierbei wirksamen bakteriellen Effektoren sind als „Cyclomoduline“ bekannt und gelten als neue Klasse bakterieller Pathogenitätsfaktoren. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es zu untersuchen, ob durch die Infektion menschlicher pharyngealer Epithelzellen mit N. meningitidis der Zellzyklus der Wirtszelle beeinflusst wird. Mit zwei verschiedenen Untersuchungsmethoden konnte übereinstimmend gezeigt werden, dass die Infektion der Epithelzelllinie Detroit 562 mit verschiedenen Meningokokkenisolaten zu einer signifikanten Akkumulation von Epithelzellen in der G1-Phase führte. Dieser Effekt wurde sowohl von pathogenen Meningokokkenstämmen als auch von Trägerstämmen ausgelöst, jedoch nur durch Isolate, die fähig zur Adhärenz und zur Invasion in die Epithelzelle waren. Durch Hitzebehandlung der Bakterien konnte der Zellzyklusarrest vollständig aufgehoben werden. Ebenso konnte der Effekt durch Inkubation der Epithelzellen mit bakteriellen Kulturüberständen und durch Infektion der Zellen mit E. coli-Stämmen, welche die Meningokokkenadhäsine Opa und Opc überexprimieren, nicht ausgelöst werden. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die Infektion mit N. meningitidis in der Zielzelle zu einer signifikant gesteigerten Expression des CDK-Inhibitors p21WAF1/Cip1 führte, begleitet von einer vermehrten Lokalisation im Zellkern. Auch zeigte sich eine veränderte Proteinexpression der für die G1-Phase relevanten Cycline D und E. Diese scheint sich erst posttranslational zu ereignen, da die unterschiedliche Expression auf mRNA-Ebene nicht festgestellt werden konnte. Zusammenfassend konnte dargestellt werden, dass die Infektion von Pharynxepithelzellen mit lebenden, zur Adhärenz und Invasion fähigen Meningokokkenstämmen in der menschlichen Zielzelle einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase verursacht, vermutlich durch veränderte Expression der Zellzyklusregulatoren p21WAF1/Cip1, Cyclin D und Cyclin E. Möglicherweise stellt die Induktion dieses Zellzyklusarrestes einen wichtigen Schritt in der Pathogenese der bakteriellen Kolonisation des oberen Atemwegsepithels durch N. meningitidis dar. N2 - Several microbial pathogens have developed mechanisms to modulate host cell cycle progression in order to improve bacterial colonization of epithelial barriers. The required bacterial effectors were summarized as “cyclomodulins” and have been proposed to be a new class of virulence factors. The objective of this doctoral research study was to analyze the capability of N. meningitidis to interfere with the cell cycle progression in human pharyngeal epithelial cells. Using two different methods for cell cycle analysis, we show that infection of the human pharyngeal epithelial cell line Detroit 562 with different meningococcal isolates induces an arrest of epithelial host cells in the G1 phase. This effect was caused by infection with both pathogenic isolates and carriage isolates, but only by strains able to adhere to and to invade into the host cells. Heat-inactivation of the bacteria prior to infection completely prevented the cell cycle arrest. Moreover treatment of epithelial cells with bacterial supernatants, as well as infection with E. coli strains expressing neisserial adhesins Opa and Opc did not induce the cell cycle arrest. We further demonstrate that infection of Detroit 562 cells with N. meningitidis leads to a significantly increased expression of the CDK-inhibitor p21WAF1/Cip1 in the host cell, as well as its increased nuclear localization. The protein expression of cyclin D and E, which are relevant for progression through the G1 phase, were altered by bacterial infection, too. This effect is most likely induced by posttranslational modification, since bacterial infection did not affect Cyclin D and E mRNA levels. In conclusion, we demonstrate that infection of human pharyngeal epithelial cells with different isolates of N. meningitidis arrests the host cells at the G1 phase, most likely by affecting the expression of the cell cycle regulators p21WAF1/Cip1, cyclin D and Cyclin E. Potentially, induction this cell cycle arrest is an important step in the pathogenesis of meningococcal colonization and further infection. KW - Neisseria meningitidis KW - Zellzyklus KW - Epithel KW - cell cycle Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192862 ER - TY - THES A1 - Herrmann, Johannes Bernd T1 - Rolle des Komplement C5a-Rezeptors 1 in der Pathophysiologie der Meningokokken-Sepsis T1 - Role of complement C5a-Receptor 1 in Pathophysiology of Meningococcal Sepsis N2 - Das bekapselte, Gram-negative, diplokokkenförmige Bakterium Neisseria meningitidis (Nme) ist ein asymptomatischer Kommensale des oberen Nasenrachenraums im Men-schen. Gerade bei Kindern ist es dem humanspezifischen Pathogen in seltenen Fällen möglich, in den Blutstrom einzuwandern und lebensbedrohliche Krankheitsbilder wie Meningoenzephalitis und Sepsis auszulösen, welche als „Invasive Meningokokkener-krankung“ (IMD) zusammengefasst werden. Jährlich ereignen sich weltweit bis zu 1,2 Mio Fälle von IMD, welche aufgrund des fulminanten Verlaufs und der hohen Letalität gefürchtet sind. In der Bekämpfung der Nme-Sepsis ist das humane Komplementsystem von entscheidender Bedeutung. Vor diesem Hintergrund ist die protektive Rolle des lytischen (Membranangriffskomplex MAK) und opsonisierenden Arms (Opsonine iC3b und C1q) der Komplementkaskade gut dokumentiert. Dagegen ist der Beitrag des in-flammatorischen Arms (Anaphylatoxine C3a und C5a) in der Nme-Sepsis bisher unklar. Aus diesem Grunde wurde mit dieser Arbeit die Rolle des inflammatorischen Arms an-hand des Komplement C5a-Rezeptors 1 (C5aR1) in der Pathophysiologie der Nme-Sepsis am Mausmodell untersucht. Nach Etablierung des murinen, intraperitonealen In-fektionsmodells konnte ein schädlicher Effekt des C5aR1 in der Nme-Sepsis beobachtet werden. Aus der Abwesenheit des C5aR1 resultierte eine höhere Überlebensrate, ein besserer klinischer Zustand, eine niedrigere Bakteriämie und niedrigere Konzentrationen der pro-inflammatorischen Mediatoren IL-6, CXCL-1 und TNF-α. Im Hinblick auf den zellulären Pathomechanismus sprechen Ergebnisse dieser Arbeit dafür, dass der C5aR1 primär eine gesteigerte Freisetzung inflammatorischer Mediatoren durch verschiedene Zellpopulationen triggert (Zytokinsturm), wodurch sekundär Zellparalyse, steigende Bakteriämie und höhere Letalität bedingt sind. Durch Depletionsversuche und Immun-fluoreszenzfärbungen konnte, unabhängig vom C5aR1, eine allgemein protektive Rolle von neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen in der Nme-Sepsis beo-bachtet werden. Darüber hinaus präsentierte sich der zyklische C5aR1-Antagonist PMX205 als erfolgsversprechende Therapieoption, um Parameter einer murinen Nme-Sepsis zu verbessern. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die Wirksamkeit dieser Substanz in der humanen Nme-Sepsis zu erforschen. Zudem könnte das murine, intrape-ritoneale Infektionsmodell zur Klärung der Rolle des C5aR2 in der Nme-Sepsis genutzt werden. N2 - The encapsulated, Gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is an asymp-tomatic commensal in the human upper respiratory tract. In rare cases and especially in children, this human-specific pathogen is able to invade into the blood stream and cause life-threatening disorders like meningoencephalitis and septicemia, which are subsumed as „invasive meningococcal disease“ (IMD). The estimated number of cases is about 1.2 mio per year worldwide. IMD is greatly feared because of its fulminant progression and its high lethality. It is very well known, that the human complement system holds an essential role to fight meningococcal sepsis. In this context, the protective effects of the lytic (membrane attack complex MAC) and opsonizing branches (opsonines iC3b and C1q) are well established. On the contrary, very little is known about the contribution of the inflammatory branch (anaphylatoxines C3a and C5a) in meningococcal sepsis. Therefore, this work focused on the role of the C5a-Receptor 1 (C5aR1) in pathophysi-ology of meningococcal sepsis in a murine model. After having established the para-mount role of complement in murine intraperitoneal infection model, we could observe a detrimental effect of C5aR1 in Meningococcal sepsis. The absence of C5aR1 resulted in a higher overall survival, ameliorated clinical status, lower bacteremia and lower levels of the proinflammatory mediators IL-6, CXCL-1, TNF-α. Particularly with regard to results about the cellular pathomechanism, the C5aR1 seems to cause an increased re-lease of proinflammatory mediators (cytokine storm) exerted by various cell populations. As a consequence, cellular paralysis, increasing bacterial burden and higher lethality rate seems to occur. In reference to depletion experiments and immunofluorescence stain-ings, we could observe protective overall effects of neutrophils and mono-cytes/macrophages, uncorrelated to C5aR1 presence. Ultimately, the cyclic C5aR1-antagonist PMX205 appeared to be a promising option to improve parameters in murine meningococcal sepsis. Further experiments are required to examine the potential of this compound in human meningococcal sepsis. Moreover, the murine, intraperitoneal infec-tion model could be used to clarify the role of C5aR2 in meningococcal sepsis. KW - Komplement C5a KW - Neisseria meningitidis KW - Meningokokken-Sepsis KW - Komplement C5a Rezeptor 1 KW - C5aR1-Antagonist Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184533 ER - TY - THES A1 - Gomes, Sara Ferreira Martins T1 - Induced Pluripotent Stem Cell-derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection T1 - Induziert pluripotente Stammzellen-basierte Hirnendothelzellen als zelluläres Modell zur Untersuchung der Infektion mit Neisseria meningitidis N2 - Bacterial meningitis occurs when blood-borne bacteria are able to penetrate highly specialized brain endothelial cells (BECs) and gain access to the meninges. Neisseria meningitidis (Nm) is a human-exclusive pathogen for which suitable in vitro models are severely lacking. Until recently, modeling BEC-Nm interactions has been almost exclusively limited to immortalized human cells that lack proper BEC phenotypes. Specifically, these in vitro models lack barrier properties, and continuous tight junctions. Alternatively, humanized mice have been used, but these must rely on known interactions and have limited translatability. This motivates the need to establish novel human-based in vitro BEC models that have barrier phenotypes to research Nm-BEC interactions. Recently, a human induced pluripotent stem cell (iPSC) model of BECs has been developed that possesses superior BEC phenotypes and closely mimics the in vivo blood vessels present at the blood-meningeal barrier. Here, iPSC-BECs were tested as a novel cellular model to study Nm-host pathogen interactions, with focus on host responses to Nm infection. Two wild type strains and three mutant strains of Nm were used to confirm that these followed similar phenotypes to previously described models. Importantly, the recruitment of the recently published pilus adhesin receptor CD147 underneath meningococcal microcolonies could be verified in iPSC-BECs. Nm was also observed to significantly increase the expression of pro-inflammatory and neutrophil-specific chemokines IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8, and CCL20, at distinct time points of infection, and the secretion of IFN γ and RANTES by iPSC-BECs. Nm was directly observed to disrupt tight junction proteins ZO-1, Occludin, and Claudin-5 at late time points of infection, which became frayed and/or discontinuous upon infection. This destruction is preceded by, and might be dependent on, SNAI1 activation (a transcriptional repressor of tight junction proteins). In accordance with tight junction loss, a sharp loss in trans-endothelial electrical resistance, and an increase in sodium fluorescein permeability was observed at late infection time points. Notably, bacterial transmigration correlated with junctional disruption, indicating that the paracellular route contributes for bacterial crossing of BECs. Finally, RNA-Sequencing (RNA-Seq) of sorted, infected iPSC-BECs was established through the use of fluorescence-activated cell sorting (FACS) techniques following infection. This allowed the detection of expression data of Nm-responsive host genes not previously described thus far to play a role during meningitidis. In conclusion, here the utility of iPSC-BECs in vitro to study Nm infection could be demonstrated. This is the first BEC in vitro model to express all major BEC tight junctions and to display high barrier potential. Altogether, here this model provides novel insights into Nm pathogenesis, including an impact of Nm on barrier properties and tight junction complexes and suggests that the paracellular route contributes to Nm traversal of BECs. N2 - Eine bakterielle Meningitis tritt auf, wenn durch Blut übertragene Bakterien hochspezialisierte Hirnendothelzellen (BEC) durchdringen und Zugang zu den Meningen erhalten. Neisseria meningitidis (Nm) ist ein human-exklusiver Erreger, für dessen Untersuchung es an geeigneten In-vitro-Modellen mangelt. Bis vor kurzem war die Modellierung von BEC-Nm-Wechselwirkungen fast ausschließlich auf immortalisierte humane Zellen beschränkt, denen wichtige BEC-Phänotypen fehlen. Besonders hervorzuheben sind das Fehlen physiologischer Barriereeigenschaften durch unkontinuierliche dichte Zell-Zell-Verbindungen. Als alternative Modellorganismen können humanisierte Mäuse verwendet werden, die sich jedoch auf bekannte Wirt-Erreger-Wechselwirkungen stützen und durch Speziesunterschiede eine eingeschränkte Übersetzbarkeit aufweisen. Dies begründet die Notwendigkeit, neuartige humane In-vitro-BEC-Modelle zu etablieren, die physiologische Barrierephänotypen aufweisen, um Nm-BEC-Wechselwirkungen zu untersuchen. Kürzlich wurde ein humanes Modell entwickelt, welches auf aus induziert pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abgeleiteten humanen BECs basiert und sich durch einen physiologischen Blut-Hirn-Schranken-Phänotyp auszeichnet. Die iPSC-BECs wurden in dieser Arbeit als neuartiges zelluläres Modell getestet, um Nm-Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf Wirtsreaktionen auf Nm-Infektionen lag. Zwei Wildtypstämme und drei Mutantenstämme von Nm wurden verwendet, um zu bestätigen, dass diese ähnlichen Phänotypen wie in zuvor beschriebenen Modellen folgten. Hervorzuheben ist, dass die Rekrutierung des kürzlich veröffentlichten Pilus-Adhäsin-Rezeptors CD147 unter Meningokokken-Mikrokolonien in iPSC-BECs verifiziert werden konnte. Es wurde auch beobachtet, dass Nm die Expression der entzündungsfördernden und neutrophilen spezifischen Chemokine IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8 und CCL20 zu bestimmten Zeitpunkten der Infektion sowie die Sekretion von IFN-γ und RANTES durch iPSC-BECs signifikant erhöht. Es wurde zudem beobachtet, dass Nm die Tight Junction-Proteine ZO-1, Occludin und Claudin-5 zu späten Zeitpunkten der Infektion zerstört, verursacht durch die Infektion wurde ein ausgefranster und/oder diskontinuierlicher Tight Junction-Phänotyp beobachtet. Dieser Zerstörung geht die SNAI1-Aktivierung (ein Transkriptionsrepressor für Tight Junction-Proteine) voraus und könnte von ihr abhängig sein. In Übereinstimmung mit dem Verlust der Tight Junctions wurde zu späten Infektionszeitpunkten ein starker Verlust des transendothelialen elektrischen Widerstands und eine Zunahme der Natriumfluoreszein-Permeabilität beobachtet. Bemerkenswerterweise korrelierte die bakterielle Transmigration mit dem Verlust der Tight Junctions, was darauf hinweist, dass der parazelluläre Weg zur bakteriellen Überwindung von BECs eine entscheidende Rolle spielt. Schließlich wurde die RNA-Sequencing (RNA-Seq) von sortierten, infizierten iPSC-BECs durch die Verwendung von fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechniken (FACS) nach der Infektion durchgeführt. Dies ermöglichte erstmalig den Nachweis von Expressionsdaten von Nm-responsiven Wirtsgenen, welche bei der Meningitidis eine Rolle zu spielen scheinen. Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Nutzen von iPSC-BECs In-Vitro-Modellen zur Untersuchung von Nm-Infektionen gezeigt werden. Dies ist das erste BEC-In-vitro-Modell, das alle wichtigen BEC-Tight Junctions exprimiert und ein hohes Barrierepotential aufweist. Insgesamt liefert das eingesetzte Modell neue Einblicke in die Nm-Pathogenese, einschließlich der Beeinflussung der Barriereeigenschaften und der Tight Junction-Komplexe durch Nm, und gibt erste Hinweise darauf, dass die parazelluläre Route zum Nm-Übertritt von BEC-Barrieren eine entscheidende Rolle spielt. KW - Neisseria meningitidis KW - endothelial cells KW - blood brain barrier KW - blood cerebrospinal fluid barrier KW - cellular model KW - Neisseria meningitidis KW - endothelial cells Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188550 ER -