TY  - THES
A1  - Helm, Johanna Charlotte
T1  - Invasive Mykosen – Prognose und Diagnose mittels Aspergillus fumigatus-spezifischer CD154+/CD4+ Zellen
T1  - Invasive mycoses – prognosis and diagnosis based on the utilization of CD154+/CD4+ A. fumigatus-specific T cells
N2  - In den vergangenen Jahrzehnten kam es durch den Einsatz massiv immunsupprimierender Therapien zu einer steigenden Inzidenz invasiver Mykosen. Die durch eine Infektion mit A. fumigatus ausgelöste invasive Aspergillose stellt eine lebensbedrohliche Erkrankung für Patienten mit hämatologischen Malignomen oder nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation dar. Für die Behandlung solcher Erkrankungen ist eine frühzeitige Diagnosestellung unabdingbar. Da invasive diagnostische Maßnahmen bei den betroffenen Patienten jedoch häufig kontraindiziert sind, werden neue Biomarker und nicht invasive Diagnoseverfahren intensiv beforscht.
Ein kürzlich beschriebener Ansatz zur Primär- und Verlaufsdiagnostik bei Patienten mit invasiven pulmonalen Aspergillosen und Mukormykosen ist die Verwendung des auf aktivierten T-Zellen exprimierten Aktivierungsmarkers CD154 zur durchflusszytometrischen Quantifizierung A. fumigatus-spezifischer T-Helfer-Zellen.
Die Detektion dieser Zellen mit dem in der Literatur beschriebenen Protokoll erfordert die Isolation von PBMCs und duldet vor der Verarbeitung der Proben in einem spezialisierten Labor nur kurze präanalytische Lagerungszeiten. Dies stellt einen limitierenden Faktor für die klinische Verwendbarkeit des beschriebenen Assays dar.
Die vorliegende Dissertationsschrift beschäftige sich damit, den beschriebenen Assay zur Detektion A. fumigatus-spezifischer T-Zellen, hinsichtlich seiner Präanalytik und klinischen Anwendbarkeit eingehender zu evaluieren und zu optimieren.
Zunächst konnte gezeigt werden, dass mittels Verdünnung und Agitation der zur PBMC Isolation verwendeten Blutproben eine Verlängerung des präanalytischen Zeitfensters zwischen Blutentnahme und Aufbereitung auf bis zu 4 h möglich ist, ohne dass dabei die Sensitivität des CD154-basierten T-Zell-Assays beeinträchtigt wird.
Weiterhin konnte die Verwendung eines Vollblut-basierten Protokolls, das auf die zeitaufwendige Isolation von PBMCs verzichtet, etabliert werden. Hinsichtlich seiner Detektionsleistung zeigte sich das Vollblutprotokoll dem PBMC Protokoll grundsätzlich überlegen. Für verschiedene Stimulationsperioden konnte ein gegenüber dem PBMC
Standardprotokoll reproduzierbarer Konversionsfaktor ermittelt werden, welcher einen Vergleich von Ergebnissen bei alternierender Durchführung von PBMC- und Vollblut-Assay bei den selben Patienten möglich macht. Das Protokoll erlaubt die Kombination von Stimulations- und Transportzeit unter Verwendung eines auf 37 °C temperierten Transportgefäßes. Eine alleinige Stimulation bei Raumtemperatur zeigte sich hingegen nicht erfolgreich. Die Anwendung des Assays am Point-of-Care wird durch die Verwendung vorbereiteter, marktüblicher Blutentnahmeröhrchen möglich, welche bis zum Zeitpunkt der Verwendung eingefroren gelagert werden können. Eine Analyse der Material- und Arbeitskosten ergab eine Reduktion der Gesamtkosten für die Verwendung des Vollblut-basierten Protokolls von bis zu 22 % pro Probe. Prinzipiell kann davon ausgegangen werden, dass der entwickelte Assay mit jedem Peptid-Antigen durchführbar ist, das in konstanter Qualität bezogen oder generiert werden kann und einen immunogenen Effekt aufweist, ohne dabei mit anderen verwendeten Reagenzien zu interagieren.
Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit geprüft, wie sich T-Zell-inhibitorische Substanzen auf die Testergebnisse auswirken. Hierbei fand sich eine nicht unwesentliche Anzahl falsch-negativer Testergebnisse.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertationsschrift zeigen, dass eine suffiziente und sensitive Bestimmung A. fumigatus-spezifischer T-Zellen im Rahmen eines Vollblut-basierten Protokolls möglich ist. Eine Ausweitung des Assays für andere Infektionserreger, sowie die Entwicklung Brefeldin A-freier Protokolle wären wünschenswert. Ein mögliches Einsatzgebiet stellen klinisch infektiologische Studien oder umwelt- und arbeitsmedizinische Fragestellungen dar.
N2  - Over the past decades, the use of immunosuppressive therapies has led to an increasing incidence of invasive mycoses. Specifically, invasive aspergillosis, most commonly caused by Aspergillus fumigatus, is a life-threatening disease in hematopoietic stem cell transplant recipients and patients with hematologic malignancies. An early confirmation of the diagnosis is pivotal in order to improve therapeutic outcomes. As invasive diagnostic procedures are often contraindicated in high-risk patients, non-invasive diagnostic modalities and novel biomarkers for invasive mold infections are intensively studied.
A recently published method to diagnose and monitor invasive pulmonary aspergillosis utilizes flow cytometric quantification of mold-reactive T-helper cells by CD154 upregulation, an activation marker expressed on activated T cells. The published standard methodology to quantify these cells is based on isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
Among several limitations hampering the applicability of this method in the clinical routine, our group has previously shown that PBMC-based mold-reactive T-cell quantification is highly susceptible to pre-analytic delays. Therefore, my thesis focused on the optimization of pre-analytic sample handling prior to PBMC isolation in order to improve the detection efficacy of A. fumigatus-specific T-helper cells. Using agitation and dilution of blood samples prior to PBMCs isolation, the pre-analytic storage period could be extended to 4 hours without observing an adverse impact on assay sensitivity.
To overcome the many logistical limitations of PBMC-based assays, my thesis further focused on the evaluation and optimization of a whole blood-based method to quantify A. fumigatus-specific T-helper cells. Therefore, blood collection tubes containing costimulatory antibodies and an A. fumigatus mycelial lysates were prepared and inoculated with heparinized whole blood from healthy adults. Frequencies of CD154+ A. fumigatus-specific T-helper cells were then compared with PBMC-based detection rates. Using optimized stimulation schemes for both matrices, significantly higher specific T-cell detection rates were achieved by the whole blood-based method. Excellent correlation and reproducible conversion factors between whole blood- and PBMC-based results were observed. Using frozen ready-to-use test tubes, detection rates of specific T cells were comparable to those observed with freshly prepared tubes. Taken together, these results suggest that our whole blood protocol provides a robust, highly sensitive, and cost-effective method for mold-reactive T-cell quantification. Our protocol allows for point-of-care sample stimulation and may contribute to better assay standardization for multi-center studies of mold reactive T-cell assays.
Lastly, my thesis focused on the impact of T-cell-inhibitory immunosuppressive pharmacotherapy on A. fumigatus specific T-cell quantification. My results revealed significantly reduced mean detection rates of specific T-cells and considerable inter-individual variation in assay reliability upon exposure of PBMC samples to cyclosporine A, mycophenolic acid, and prednisolone. These findings suggest that false-negative results need to be considered when performing this test in immunosuppressed patient cohorts and inspired further studies of our group to attenuate the detrimental impact of immunosuppressive agents on assay performance by enhanced costimulation.
KW  - Aspergillus fumigatus
KW  - Invasive Mykosen
KW  - Aspergillus fumigatus-spezifische CD154+/CD4+ Zellen
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213406
ER  - 
TY  - THES
A1  - Page, Lukas
T1  - Entwicklung und präklinische Evaluation immunologischer und nuklearmedizinischer diagnostischer Tests für Schimmelpilz-assoziierte Hypersensitivität und invasive Mykosen
T1  - Development and preclinical evaluation of immunological and nuclear medical diagnostic assays for mould-associated hypersensitivity and invasive mycoses
N2  - Schimmelpilze können in Abhängigkeit des Immunstatus und der Vorerkrankungen betroffener Patienten unterschiedliche Krankheitsbilder wie Hypersensitivitäts-erkrankungen oder lebensbedrohliche invasive Infektionen hervorrufen. Da die Diagnosestellung dieser Erkrankungen mitunter komplex und insensitiv ist, sollten im Rahmen dieser Arbeit unterschiedliche Ansätze neuer diagnostischer Assays untersucht werden. 
In den letzten Jahren wurden Assays entwickelt, die auf Basis durchflusszytometrisch quantifizierter Pilz-spezifischer T-Zellen aus peripherem Blut einen supportiven Biomarker zur Diagnostik invasiver Mykosen liefern könnten. Da die hierfür isolierten T-Zellen anfällig gegenüber präanalytischer Lagerzeiten und immunsuppressiver Medikation sind, wurden hier Protokolloptimierungen vorgenommen, um anhand eines Vollblut-basierten Assays mit zusätzlicher CD49d-Kostimulation diesen Limitationen entgegen zu wirken. In einer Studie an gesunden Probanden konnte dabei gezeigt werden, dass die Kombination der Durchflusszytometrie mit ausgewählten Zytokin-Messungen (IL-5, IL-10 und IL-17) zu einer verbesserten Erkennung vermehrt Schimmelpilz-exponierter Personen beitragen könnte. Neben Infektionen könnten dabei im umwelt- und arbeitsmedizinischen Kontext Polarisationen der T-Zell-Populationen detektiert werden, welche mit Sensibilisierungen und Hypersensitivität assoziiert werden.
Zusätzlich wurde ein in vitro Transwell® Alveolarmodell zur Simulation pulmonaler Pilzinfektionen für Erreger der Ordnung Mucorales adaptiert, durch Reproduktion wichtiger Merkmale der Pathogenese von Mucormykosen validiert, und für Untersuchungen der Immunpathologie und Erreger-Invasion verwendet. Das Modell wurde anschließend zur in vitro Evaluation von radioaktiv markiertem Amphotericin B mit 99mTc oder 68Ga als nuklearmedizinischen Tracer verwendet. Die untersuchten Schimmelpilze zeigten dabei eine zeit- und dosis-abhängige Aufnahme der Tracer, während bakteriell infizierte Proben nicht detektiert wurden. Die erhobenen Daten dokumentieren ein vielversprechendes Potenzial von Amphotericin B-basierten Tracer, das in zukünftigen in vivo Studien weiter evaluiert werden sollte.
N2  - Depending on the immune constitution and predisposing illnesses, moulds can cause a variety of diseases ranging from hypersensitivity syndromes to life-threatening invasive infections. As the diagnosis of mould-associated diseases remains challenging, this work aimed to refine immunological assays and to develop molecular imaging protocols for pulmonary mould infections.
Recently, a flow cytometric assay for mould specific T cell quantification has been proposed as a novel supportive biomarker to diagnose invasive mycoses. As these assays are susceptible to pre-analytic delays and immunosuppressive drugs, a whole blood-based protocol with enhanced CD28 plus CD49d co-stimulation was developed and was shown to be less prone to these limitations. In addition, a study on healthy volunteers demonstrated the applicability of flow cytometric antigen-reactive T cell quantification as a surrogate of environmental mould exposure, especially when combined with T-cellular cytokine measurements (specifically, IL-5, IL-10, and IL-17). Therefore, these assays could potentially be used to detect polarizations of T-cell populations associated with sensitization and hypersensitivity, e. g. in allergology and occupational medicine.
Moreover, an in vitro Transwell® alveolar model of invasive pulmonary mould infections has been adapted to study mucormycoses, validated by recapitulation of known pathogenicity factors, and used to characterize the immunopathology and epithelial invasion of Mucorales. The Transwell® model was subsequently used to evaluate radioactively labelled Amphotericin B with either 99mTc or 68Ga as a potential nuclear medical tracer. Time- and dose-dependent enrichment of the tracers was found in both Aspergillus and Mucorales, whereas samples infected with bacteria showed negligible uptake. These in vitro data document a promising potential of radiolabeled amphotericin B for molecular imaging of invasive mycoses and encourage further evaluation in animal models.
KW  - Schimmelpilze
KW  - Diagnostik
KW  - Biomarker
KW  - Tracer
KW  - Zellkultur
KW  - Antimykotika
KW  - Mucorales
KW  - Aspergillus
KW  - T-Zellen
KW  - Immunsuppressiva
KW  - Antifungal
KW  - Mucormycosis
KW  - Aspergillosis
KW  - T cells
KW  - Immunosuppressant
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-252459
ER  - 
TY  - THES
A1  - Thielen, Vanessa Elisabeth
T1  - Charakterisierung des Beitrags von \(Pattern-Recognition-Receptors\) bei der Einleitung einer proinflammatorischen Immunantwort gegen den Schimmelpilz \(Rhizopus\) \(arrhizus\)
T1  - Characterization of pattern recognition receptors involved in the proinflammatory immune response to the mold pathogen \(Rhizopus\) \(arrhizus\)
N2  - Während der letzten Jahrzehnte ist eine steigende Inzidenz von Infektionen durch Pilze der Ordnung Mucorales zu beobachten. Rhizopus arrhizus ist der häufigste Erreger dieser lebensbedrohlichen Infektionen, die vor allem immunsupprimierte Patienten betreffen. Aufgrund der oft schwierigen Diagnosestellung und limitierter therapeutischer Optionen liegt derzeit die Letalität von Mucormykosen zwischen 50 bis 100 %. Eine Voraussetzung für die Etablierung neuer Biomarker oder immuntherapeutischer Strategien ist ein verbessertes Verständnis der immunpathologischen Prozesse bei der Abwehr von Mucorales.
In dieser Arbeit wurden daher verschiedene Immunzellpopulationen durch ruhende und ausgekeimte Stadien von R. arrhizus stimuliert und anschließend deren proinflammatorische Immunantwort gemessen. Als Vergleich diente die proinflammatorische Immunantwort der untersuchten Immunzellen nach Stimulation mit Aspergillus fumigatus. Darüber hinaus war es Gegenstand dieser Arbeit, zu charakterisieren welche Pattern Recognition Receptors (PRRs) an der Erkennung von Mucorales durch verschiedene innate Immunzellen beteiligt sind. Zugleich wurde untersucht, ob unterschiedliche Morphotypen der Pilzspezies Auswirkungen auf die Stimulation der jeweiligen PRRs haben. Hierfür wurden Koinkubations-Experimente mit neutrophilen Granulozyten sowie Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs), Monozyten und monocyte derived dendritic cells (moDCs) mit verschiedenen Morphotypen von R. arrhizus durchgeführt. Die Rezeptoren TLR2, TLR4 und/oder Dectin-1 wurden dabei durch neutralisierende Antikörper oder RNA-Interferenz blockiert. 
Ausgekeimte Stadien von A. fumigatus sowie R. arrhizus induzierten eine erhöhte ROS-Freisetzung in Neutrophilen, die durch isolierte oder kombinierte Blockade von TLR2, TLR4 und Dectin-1 abgeschwächt wurde. Ebenso wurde die Phagozytoseaktivität neutrophiler Granulozyten gegenüber R. arrhizus-Konidien durch Blockade von TLR4 und Dectin-1 deutlich reduziert.
Im Gegensatz zu A. fumigatus induzierten sowohl ruhende Konidien als auch ausgekeimte Stadien (Keimschläuche und Hyphen) von R. arrhizus eine robuste pro-inflammatorische Zytokinantwort durch moDCs. Nach Inhibition der Dectin-1 Expression durch RNA-Interferenz zeigte sich die Transkription und Sekretion von Interleukin-1β in Gegenwart aller drei untersuchten Morphotypen von 
R. arrhizus deutlich vermindert (Transkription um 46 bis 68 % und Sekretion um 75 bis 79 % vermindert). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Dectin-1 ein wichtiger Mediator bei der Einleitung der innaten Immunantwort verschiedener Zelltypen gegen R. arrhizus ist. Diese Beobachtung sollte in weiteren Studien eingehender untersucht werden, z. B. um die Eignung von Dectin-1 als Rezeptor für zelltherapeutische Ansätze wie T-Zell-Konstrukte mit chimären Antigen-Rezeptoren zu evaluieren.
N2  - While Aspergillus species remain the most common cause of opportunistic mold infections, emerging pathogens such as Mucorales account for an increasing share of invasive mycoses in immunocompromised patients. Unspecific clinical presentation, lack of reliable biomarkers, and limited therapeutic options contribute to poor outcomes of this devastating infection. Depending on the site of infection, mortality rates of mucormycoses reach up to 100%, highlighting an unmet need for advances in diagnostic and therapeutic strategies. 
To facilitate improvements in immune biomarker development and immunotherapy, better understanding of host defense and host-pathogen interplay is warranted. Therefore, this project sought to assess the activation of proinflammatory immune responses by resting and germinated stages of Rhizopus arrhizus, the most common pathogenic Mucorales species. Furthermore, we aimed to characterize the pattern recognition receptors (PRRs) which are involved in the detection of R. arrhizus. To that end, we co-incubated polymorphonuclear neutrophils (PMNs), peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), monocytes, and monocyte derived dendritic cells (moDCs) from healthy donors with different morphotypes of R. arrhizus and compared immune responses to A. fumigatus stimulation.
Oxidative burst of PMNs was only stimulated by germinated morphotypes of both fungi but not by resting conidia. Inhibition of TLR2, TLR4 and Dectin-1 by specific blocking antibodies significantly reduced the secretion of reactive oxygen species in response to R. arrhizus germlings and hyphae. Similarly, phagocytosis of 
R. arrhizus spores by PMNs was significantly reduced by blockade of TLR4 and Dectin-1, further corroborating a functional role of these receptors in the recognition of Mucorales.
Co-culture studies with PBMCs, monocytes, and moDCs revealed that both resting and germinated stages of R. arrhizus induce a proinflammatory cytokine response of mononuclear phagocytes, whereas conidia of A. fumigatus were largely inert. To determine a functional role of Dectin-1 in the recognition of 
R. arrhizus morphotypes by mononuclear cells, moDCs were transfected with CLEC7A-siRNA, resulting in a knockdown of the Dectin-1 gene. The transfected moDCs were stimulated with different A. fumigatus and R. arrhizus morphotypes and mRNA expression and secretion of IL-1β were determined by qPCR and ELISA. Significantly weaker induction of IL-1β by germinated stages of both fungi and R. arrhizus spores was seen in siCLEC7A-transfected moDCs. Collectively, these results indicate that major pattern recognition pathways with known roles in the detection of A. fumigatus are also pivotal to mount a proinflammatory immune response to R. arrhizus.
KW  - Pattern-Recognition-Receptors
KW  - Rhizopus arrhizus
KW  - Mucormykose
KW  - PRR
KW  - mucormycosis
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249408
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weis, Philipp
T1  - Translationale Untersuchung zur Anwendung der durchflusszytometrischen Bestimmung \(Aspergillus\) \(fumigatus\) spezifischer T-Zellen in der Diagnostik von Aspergillosen
T1  - Translational study on the application of flow cytometric detection of \(Aspergillus\) \(fumigatus\) specific T-cells in the diagnosis of aspergillosis
N2  - Bei Patienten mit invasiver Aspergillose fanden sich gegenüber gesunden Probanden deutlich erhöhte Werte A. fumigatus spezifischer CD154+/CD4+ Zellen. Die Anwendbarkeit dieses Assays im klinischen Routinebetrieb und bei gegenüber A. fumigatus epxonierten Probanden und Patienten sollte in dieser translationalen Arbeit untersucht werden.
Für den vorbeschriebenen Assay zur Bestimmung CD154+/CD4+ Zellen aus aufgereinigten PBMCs zeigt diese Arbeit eine signifikant reduzierte Detektionsrate nach Blutprobenlagerung von über 2 Stunden. In der Literatur beschriebene Verfahren zur verlängerten Lagerungszeit von heparinisierten Blutproben mittels vorhergehender Dilution und Agitation ermöglichen keine Verlängerung präanalytischer Lagerungszeiten über 6 Stunden. Die Kryokonservierung frisch aufbereiteter PBMCs bei −20 C vor Bestimmung A. fumigatus spezifischer T-Zellen wird als Versandmöglichkeit in einem multizentrischen Setting gezeigt. Um die klinische Anwendbarkeit zu verbessern, wird ein Vollblutprotokoll zur Detektion A. fumigatus spezifischer CD154+/CD4+ Zellen demonstriert, das die Verwendung von bettseitig mit Vollblut beimpften Blutmonovetten mit vorgelegtem A. fumigatus-Lysat ermöglicht.
Die Anwendung des Assays zur Bestimmung A. fumigatus spezifischer T-Zellen wurde bei hämatoonkologischen Patienten vor und drei Monate nach Stammzelltransplantation untersucht. Insbesondere eine reduzierte Zellzahl der gemessenen Lymphozyten ist hier ein limitierender Faktor der erfolgreichen Messung. Aufgrund der generell nied- rigen Erfolgsrate von 20 % bzw. 54 % vor bzw. nach HSCT ist die Anwendbarkeit des Assays in diesem Kollektiv fraglich. Die Erhebung von Expositionsfaktoren gesunder Probanden gegenüber A. fumigatus ermöglicht die Einteilung in eine schwach und stark gegenüber A. fumigatus exponierte Gruppe mit signifikant erhöhtem Anteil A. fumigatus spezifischer CD154+/CD4+ Zellen. Hierzu trägt insbesondere das Vorliegen antigenspezifischer T-Gedächtniszellen als Korrelat einer langfristigen Exposition bei. Retrospektiv fand sich auch nach kurzfris- tiger beruflicher Exposition ein Anstieg CD154+/CD4+ spezifischer T-Zellen. Dies legt eine Verwendung CD154+/CD4+ spezifischer T-Zellen als Biomarker in Bereichen der umweltmedizinischen Abklärung von Schimmelpilzexposition oder der Diagnostik allergischer Erkrankungen nahe.
N2  - In patients with invasive aspergillosis, significantly elevated levels of A. fumigatus specific CD154+/CD4+ cells were found compared to healthy subjects. This translational study aimed to investigate the applicability of this assay in clinical routine practice, as well as in subjects and patients exposed to A. fumigatus. For the previously described assay for determining CD154+/CD4+ cells from purified PBMCs, this study demonstrates a significantly reduced detection rate after blood sample storage for more than 2 hours. Methods described in the literature for extending the storage time of heparinized blood samples through prior dilution and agitation do not allow for pre-analytical storage times beyond 6 hours. Cryopreservation of freshly prepared PBMCs at −20°C before determining A. fumigatus-specific T-cells is presented as a shipping option in a multicenter setting. To improve clinical applicability, a whole-blood protocol for the detection of A. fumigatus-specific CD154+/CD4+ cells is demonstrated, enabling the use of blood monovettes preloaded with A. fumigatus lysate for bedside inoculation with whole blood. The application of the assay for determining A. fumigatus specific T-cells was examined in hemato-oncological patients before and three months after stem cell transplantation. A particularly limiting factor for successful measurement in this context is the reduced cell count of measured lymphocytes. Due to the generally low success rate of 20% before and 54% after HSCT, the applicability of the assay in this cohort is questionable. The assessment of A. fumigatus exposure factors in healthy subjects allows for classification into a group with weak and strong A. fumigatus exposure, with a significantly increased proportion of A. fumigatus specific CD154+/CD4+ cells. The presence of antigen-specific memory T-cells, as a correlate of long-term exposure, particularly contributes to this. Retrospectively, an increase in CD154+/CD4+ specific T-cells was also observed after short-term occupational exposure. This suggests that CD154+/CD4+ specific T-cells could be used as biomarkers in environmental medicine assessments of mold exposure or in the diagnosis of allergic diseases.
KW  - Aspergillus fumigatus
KW  - Durchflusscytometrie
KW  - Aspergillose
KW  - Immunologie
KW  - T-Zellimmunität
KW  - CD154
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371145
ER  -