TY  - THES
A1  - Fuhr, Viktoria
T1  - Target Identification and Validation in Ibrutinib-treated Mantle Cell Lymphoma
T1  - Target-Identifizierung und Validierung im Ibrutinib-behandelten Mantelzell-Lymphom
N2  - Ibrutinib serves as an efficient second-line therapy in relapsed/refractory mantle cell lymphoma. However, resistance to the BTK inhibitor results in a poor prognosis for patients. Since the mechanisms leading to resistance in initially responding tumor cells are poorly understood, this work aimed to decipher acquired features in ibrutinib-surviving cells of a sensitive mantle cell lymphoma cell line and evaluate these potential therapeutic targets in ibrutinib-treated mantle cell lymphoma.
Time-resolved single-cell RNA sequencing was performed to track the transcriptomic evolution of REC-1 cells across 6 and 48 hours of treatment. Single-cell analysis uncovered a subpopulation of REC-1 with potentially greater aggressiveness and survival advantage by benefiting from interaction with the tumor microenvironment. Upregulation of B-cell receptor genes, elevated surface antigen expression of CD52 and metabolic rewiring to higher dependence on oxidative phosphorylation were identified as further potential resistance features of ibrutinib-surviving cells. RNA sequencing after prolonged incubation corroborated the increase in CD52 and oxidative phosphorylation as dominant characteristics of the cells surviving the 4-day treatment, highlighting their potential as therapeutic targets in combination with ibrutinib treatment. Concomitant use of ibrutinib and the oxidative phosphorylation inhibitor IACS-010759 increased toxicity compared to ibrutinib monotherapy due to higher apoptosis and greater inhibition of proliferation. For anti-CD52 therapy, a consecutive approach with ibrutinib pretreatment followed by incubation of surviving cells with a CD52 monoclonal antibody and human serum yielded a synergistic effect, as ibrutinib-surviving mantle cell lymphoma cells were rapidly depleted by complement-dependent cytotoxicity. Regarding the effects on primary tumor cells from mantle cell lymphoma patients, ibrutinib induced upregulation of CD52 in some cases, and increased toxicity of anti-CD52 therapy was observed in ibrutinib-sensitive patient samples after pretreatment with the BTK inhibitor. The likely favorable in vivo efficacy of an anti-CD52 therapy might therefore be restricted to a subgroup of mantle cell lymphoma patients, also in view of the associated side effects.
Given the need for new therapeutic options in mantle cell lymphoma to overcome resistance to ibrutinib, this work highlights the potentially beneficial use of an oxidative phosphorylation inhibitor as add-on therapy. In addition, the findings suggest to further assess the value of anti-CD52 therapy as consolidation to ibrutinib in ibrutinib-sensitive patients with elevated CD52 surface levels on tumor cells to target resistant clones and minimize risk of minimal residual disease and relapse.
N2  - Ibrutinib dient als wirkungsvolle Zweitlinientherapie beim rezidivierten/refraktären Mantelzell-Lymphom. Jedoch führt eine Resistenz gegen den BTK-Inhibitor zu einer schlechten Prognose für die Patienten. Da die Mechanismen, die zur Resistenz in initial ansprechenden Tumorzellen führen, nur unzureichend bekannt sind, hatte diese Arbeit zum Ziel, erworbene Eigenschaften in Ibrutinib-überlebenden Zellen einer sensitiven Mantelzell-Lymphom Zelllinie aufzudecken und darauf basierende therapeutische Ansätze im Ibrutinib-behandelten Mantelzell-Lymphom zu evaluieren.
Eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Entwicklung des Transkriptoms der REC-1 Zellen über eine Behandlung von 6 und 48 Stunden zu verfolgen. Die Einzelzellanalyse offenbarte eine Subpopulation der REC-1 Zelllinie, die möglicherweise eine größere Aggressivität und einen Überlebensvorteil aufwies, da sie von der Interaktion mit dem Tumormikromilieu profitieren könnte. Die Hochregulation von B-Zell Rezeptor Genen, erhöhte Oberflächenantigenexpression von CD52 und eine Umstellung des Metabolismus auf eine stärkere Abhängigkeit von der oxidativen Phosphorylierung wurden als weitere mögliche Resistenzeigenschaften der Ibrutinib-überlebenden Zellen identifiziert. Eine RNA-Sequenzierung nach längerer Inkubation bestätigte den Anstieg von CD52 und oxidativer Phosphorylierung als dominante Merkmale der Zellen, die die 4-tägige Behandlung überlebten, was ihr Potential als therapeutische Ansatzpunkte in Kombination mit einer Ibrutinib Therapie hervorhob. Die gleichzeitige Anwendung von Ibrutinib und dem Inhibitor der oxidativen Phosphorylierung, IACS-010759, erhöhte die Toxizität im Vergleich zur Ibrutinib-Monotherapie aufgrund einer gesteigerten Apoptose und einer stärkeren Hemmung der Proliferation. Bei der Anti-CD52-Therapie erzielte der konsekutive Ansatz mit Ibrutinib-Vorbehandlung und anschließender Inkubation der überlebenden Zellen mit einem monoklonalen CD52-Antikörper und humanem Serum einen synergistischen Effekt, da die unter Ibrutinib überlebenden Zellen schnell durch die komplementabhängige Zytotoxizität eliminiert wurden. Hinsichtlich der Auswirkungen auf primäre Tumorzellen von Mantelzell-Lymphom-Patienten führte Ibrutinib in manchen Fällen zu einer Hochregulierung von CD52, und in Ibrutinib-empfindlichen Patientenproben wurde nach Vorbehandlung mit dem BTK-Inhibitor eine erhöhte Toxizität der Anti-CD52-Therapie beobachtet. Die wahrscheinlich günstige In-vivo-Wirkung einer Anti-CD52-Therapie könnte daher auf eine Subgruppe von Mantelzell-Lymphom Patienten beschränkt sein, auch im Hinblick auf die damit verbundenen Nebenwirkungen.
Angesichts des Bedarfs an neuen therapeutischen Optionen beim Mantelzell-Lymphom zur Überwindung der Ibrutinib-Resistenz unterstreicht diese Arbeit den potentiell vorteilhaften Einsatz eines Inhibitors der oxidativen Phosphorylierung als Zusatztherapie. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, den Nutzen einer Anti-CD52-Therapie als Konsolidierung zu Ibrutinib bei Ibrutinib-empfindlichen Patienten mit erhöhter CD52 Oberflächenexpression auf Tumorzellen näher zu untersuchen, um resistente Klone zu beseitigen und das Risiko einer minimalen Resterkrankung und eines Rückfalls zu minimieren.
KW  - B-Zell-Lymphom
KW  - Therapieresistenz
KW  - Mantle cell lymphoma
KW  - Ibrutinib
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310595
ER  - 
TY  - THES
A1  - Imdahl, Fabian Dominik
T1  - Development of novel experimental approaches to decipher host-pathogen interaction at the single-cell level
T1  - Entwicklung neuer experimenteller Ansätze zur Entschlüsselung von Wirt-Pathogen-Interaktion auf Einzelzellebene
N2  - Abstract:
COVID-19 has impressively shown how quickly an emerging pathogen can have a massive impact on our entire lives and show how infectious diseases spread regardless of national borders and economic stability. We find ourselves in a post-antibiotic era and have rested too long on the laurels of past research, so today more and more people are dying from infections with multi-resistant germs.
Infections are highly plastic and heterogeneous processes that are strongly dependent on the individual, whether on the host or pathogen side.
Improving our understanding of the pathogenicity of microorganisms and finding potential targets for a completely new class of drugs is a declared goal of current basic research. To tackle this challenge, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is our most accurate tool.
In this thesis we implemented different state of the art scRNA-seq technologies to better understand infectious diseases. Furthermore, we developed a new method which is capable to resolve the transcriptome of a single bacterium. Applying a poly(A)-independent scRNA-seq protocol to three different, infection relevant growth conditions we can report the faithful detection of growth-dependent gene expression patterns in individual Salmonella Typhimurium and Pseudomonas aeruginosa bacteria. The data analysis shows that this method not only allows the differentiation of various culture conditions but can also capture transcripts across different RNA species.
Furthermore, using state of the art imaging and single-cell RNA sequencing technologies, we comprehensively characterized a human intestinal tissue model which in further course of the project was used as a Salmonella enterica serovar Typhimurium infection model. While most infection studies are conducted in mice, lacking a human intestinal physiology, the in vitro human tissue model allows us to directly infer in vivo pathogenesis. Combining immunofluorescent imaging, deep single-cell RNA sequencing and HCR-FISH, applied in time course experiments, allows an unseen resolution for studying heterogeneity and the dynamics of Salmonella infection which reveals details of pathogenicity contrary to the general scientific opinion.
N2  - Zusammenfassung:
COVID-19 hat eindrucksvoll gezeigt, wie schnell ein neu auftretender Erreger massive Auswirkungen auf unser aller Leben haben kann und wie sich Infektionskrankheiten unabhängig von Landesgrenzen und wirtschaftlicher Stabilität ausbreiten. Wir befinden uns in einer post-antibiotischen Ära und haben uns zu lange auf den Lorbeeren der vergangenen Forschung ausgeruht, so dass heute immer mehr Menschen an Infektionen mit multiresistenten Keimen sterben.
Infektionen sind sehr plastische und variable Prozesse, die stark vom Individuum abhängen, sei es auf Seiten des Wirts oder des Erregers. Die Pathogenität von Mikroorganismen besser zu verstehen und potenzielle Angriffspunkte für eine völlig neue Klasse von Arzneimitteln zu finden ist ein erklärtes Ziel der aktuellen Grundlagenforschung. Um diese Herausforderung zu meistern, ist die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) unser präzisestes Werkzeug.
In dieser Arbeit haben wir verschiedene hochmoderne scRNA-seq-Technologien eingesetzt, um Infektionskrankheiten besser zu verstehen. Darüber hinaus haben wir eine neue Methode entwickelt, die in der Lage ist, das Transkriptom eines einzelnen Bakteriums aufzulösen. Durch die Anwendung eines poly(A)-unabhängigen scRNA-seq-Protokolls unter drei verschiedenen, infektionsrelevanten W achstumsbedingungen konnten wir die wachstumsabhängigen Genexpressionsmuster in einzelnen Salmonella Typhimurium- und Pseudomonas aeruginosa- Bakterien zuverlässig nachweisen. Die Datenanalyse zeigt, dass diese Methode nicht nur die Differenzierung verschiedener Kulturbedingungen ermöglicht, sondern auch Transkripte über verschiedene RNA-Spezies hinweg erfassen kann.
Darüber hinaus haben wir unter Verwendung modernster Bildgebungs- und Einzelzell-RNA- Sequenzierungstechnologien ein menschliches Darmgewebemodell umfassend charakterisiert, das im weiteren Verlauf des Projekts als Salmonella Typhimurium-Infektionsmodell verwendet wurde. Während die meisten Infektionsstudien in Mäusen durchgeführt werden, denen die menschliche Darmphysiologie fehlt, ermöglicht uns das in vitro Modell des menschlichen Gewebes direkte Rückschlüsse auf die Pathogenese in vivo. Die Kombination aus immunfluoreszierender Bildgebung, deep single-cell RNA Sequenzierung und HCR-FISH, angewandt in Zeitverlaufsexperimenten, ermöglicht eine bisher ungesehene Auflösung zur Untersuchung von Heterogenität und Dynamik einer Salmonella Infektion, welche Details der Pathogenität entgegen der allgemeinen wissenschaftlichen Meinung offenbaren.
KW  - Salmonella
KW  - Einzelzellanalyse
KW  - Dünndarm
KW  - Gewebemodell
KW  - Single-cell RNA-sequencing
KW  - Infektionsmodell
KW  - Heterogenität von Mikroorganismen
KW  - Pathogenität
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289435
ER  - 
TY  - THES
A1  - Vafadarnejad, Ehsan
T1  - Implementation and application of bioinformatics methods to analyze and visualize single-cell RNA-sequencing data
T1  - Implementierung und Anwendung von bioinformatischen Methoden zur Analyse und Visualisierung von Einzelzell-Sequenzierungsdaten
N2  - RNA sequencing (RNA-seq) has become a transformative method to profile genome-wide gene expression and whole transcriptome analysis over the last decade. In recent years, with the development of new technologies, it has become possible to study gene expression at single-cell level. This new advances in single-cell RNA-sequencing has revolutionized the way scientists study biological processes. Single-cell RNA-sequencing has been used in different areas to better understand the underlying mechanisms of biological processes.
In particular, single-RNA-sequencing is a suitable method to study infectious diseases. Infection is composed of heterogeneous mechanisms on either the host or pathogen side and the best way to understand the heterogeneity of these mechanisms and how they interact with each other is to study infectious diseases at the single-cell level. Studying infection processes at the single-cell level can reveal not only the heterogeneity but also the dynamics of infection and the interplay between the host and pathogen at the molecular level.
In this thesis, we implemented and applied different single-cell RNA-seq technologies to better understand infectious diseases. In the present work, we conducted  four independent but related research works to shed light on different aspects of infection biology:
● We took advantage of this novel technology to study the consequences of RSV infection on primary human epithelial cells. The primary human epithelial cells were collected from six donors and cultured in air liquid interface (ALI) cell culture inoculated with respiratory syncytial virus (RSV). In this project, we discovered ciliated cells as the susceptible cell types in RSV infection. We applied viral load as an indicator of infection progression and used it to reconstruct the dynamics of host response to RSV infection. Reconstruction of the dynamics of infection revealed many host genes and pathways that were suppressed or induced as a result of RSV infection. Pathways related to innate immune response and interferon response were suppressed during the progression of infection and on the other hand pathways like protein targeting to endoplasmic reticulum and apoptosis were induced.
● We developed a new method which is capable of sequencing the transcriptome of a bacterium at the single-cell level and potentially can help us to characterize the bacterial heterogeneity during the course of infection. In this research project, bacteria were cultured in three different culture conditions namely Late stationary phase, Anaerobic shock and NaCl shock and we used a poly(A)-independent single-cell RNA-sequencing protocol to sequence bacteria at the single-cell level. In this work, we report the faithful capture of growth-dependent gene expression patterns in individual Salmonella and Pseudomonas bacteria. The results of our analysis showed that not only we could capture transcripts across different RNA classes but also our method is capable of discerning the transcriptome of bacteria across different culture conditions.
● We used single-cell RNA-sequencing technology to characterize the immune cells landscape over the course of atherosclerosis. Atherosclerosis is considered a  cardiac disease which is highly related to infections and previous infections with bacteria or viruses is considered as a risk factor for atherosclerosis. We performed single-cell RNA sequencing of aortic CD45+ cells extracted from healthy and atherosclerotic aorta of mice. We managed to find certain cell populations which were specifically present in atherosclerotic mice. One of the atheroschelorotic populations was previously undescribed TREM2high macrophages showing enrichment in Trem2 gene expression. This population of macrophages seemed to be involved in functions like lipid metabolism and catabolism and lesion calcification. This work revealed the phenotypic heterogeneity and immune cells landscape of different immune cell populations at different stages of atherosclerosis. Our work paves the way to better describe the relation between different infectious diseases and cardiovascular diseases.
● We developed a web-based platform called Infection Atlas to browse and visualize single-cell RNA-sequencing data. Infection Atlas platform provides a user-friendly interface to study different aspects of infectious diseases at the single-cell level and can potentially promote targeted approaches to intervene in infectious diseases. This platform which is available at infection-atlas.org in the short term provides a user-friendly interface to browse and visualize different aspects of infectious diseases and in the long-term is expected to be a comprehensive atlas of infection in human and mouse across different tissues and different pathogens.
Overall, in this thesis we provide a framework to study infectious diseases at the single cell level with providing novel data analysis methods and this thesis paves the way for future studies to study host-pathogen encounters at the single-cell level.
N2  - RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist in den letzten zehn Jahren zu einer revolutionären Technik für genomweite Genexpressionsanalysen, sowie für Gesamt-Transkriptom-Analysen geworden. In den letzten Jahren ist es mit der Entwicklung neuer Technologien möglich geworden die Genexpression auf Einzelzell-Niveau zu untersuchen. Diese Fortschritte in der Einzelzell-RNA- Sequenzierung haben die Art wie Wissenschaftler biologische Prozesse betrachten von Grund auf verändert. Einzelzell-Sequenzierung wird in unterschiedlichen Bereichen angewendet, um die grundlegenden Mechanismen biologischer Prozesse besser zu verstehen. 
Besonders Einzelzell-Sequenzierung ist eine geeignete Methode, um Infektionskrankheiten zu untersuchen. Infektionen sind durch heterogene Mechanismen auf Wirts- und Erreger Seite gekennzeichnet. Der beste Weg die Heterogenität dieser Mechanismen zu verstehen und wie sie interagieren ist die Analyse von Infektionskrankheiten auf Einzelzell-Niveau.
Untersuchungen von Infektionsprozessen auf Einzelzell-Ebene können nicht nur die Heterogenität, sondern auch die Dynamik einer Infektion und das Wechselspiel zwischen Wirt und Pathogen auf molekularer Stufe aufzeigen. 
In dieser Dissertation wurden unterschiedliche Einzelzell-RNA-Sequenzierung Technologien implementiert und angewandt um ein besseres Verständnis von Infektionskrankheiten zu erlangen. In der vorliegenden Arbeit haben wir vier unabhängige, aber verwandte Forschungsarbeiten durchgeführt, um unterschiedliche Aspekte von Infektionsbiologie näher zu betrachten.

●	Wir nutzten die Vorteile dieser neuen Technologie, um die Konsequenzen einer RSV Infektion bei primären humanen Epithelzellen zu untersuchen. Die primären humanen Epithelzellen stammten von sechs Spendern und wurden in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen (ALI) Zellkultur mit dem Respiratorischen Syncytial-Virus (kurz RS-Virus) infiziert. In diesem Projekt konnten wir ciliierte Zellen als anfällige Zelltypen einer RSV Infektion zeigen. Wir haben die Viruslast als Indikator für den Fortschritt der Infektion herangezogen, als auch für die Rekonstruktion der Wirtsantwort Dynamik gegenüber einer RSV Infektion. Die Rekonstruktion der Infektionsdynamik zeigte viele Wirtsgene und Signalwege, die durch die RSV Infektion unterdrückt oder induziert wurden. Signalwege, die mit der angeborenen Immunantwort und der Interferonantwort assoziiert waren, wurden durch die fortschreitende Infektion unterdrückt und andererseits waren Signalwege, wie die Zielsteuerung von Proteinen zum endoplasmatischen Retikulum und Apoptose induziert.

●	Wir haben eine neue Methode entwickelt, die es ermöglicht das Transkriptom eines Bakteriums auf Einzelzell-Niveau zu sequenzieren und potenziell helfen könnte die bakterielle Heterogenität während des Verlaufs einer Infektion zu charakterisieren. In diesem Forschungsprojekt wurden Bakterien unter folgenden drei unterschiedlichen Konditionen angezogen: Späte stationäre Phase, anaerober Schock und Natriumchlorid Schock. Anschließend wendeten wir ein poly(A) unabhängiges Einzelzell-RNA Sequenzier-Protokoll an, um Bakterien auf Einzelzell-Niveau zu sequenzieren. In dieser Arbeit berichten wir die von wachstumsabhängigen Genexpressionsmustern in einzelnen Salmonellen und Pseudomonaden. Das Ergebnis unserer Analyse zeigte, dass wir nicht nur Transkripte unterschiedlicher RNA-Klassen, sondern auch das Transkriptom von Bakterien in unterschiedlichen Wachstumsbedingungen erfassen können. 

●	Wir haben Einzelzell-RNA Sequenzierungs-Technologien verwendet, um die Immunzellen Zusammensetzung während des Verlaufs der Athereosklerose zu betrachten. Die Atherosklerose wird als Herzkrankheit betrachtet, die eng mit Infektionen in Zusammenhang gebracht wird. Vorherige Infektionen mit Bakterien oder Viren werden als Risikofaktor für Atherosklerose angenommen. Wir haben für aortische CD45 Zellen von der gesunden und atherosklerotischen Aorta von Mäusen Einzelzell-RNA-Sequenzierungen durchgeführt. Hierbei konnten wir bestimmte Zellpopulationen identifizieren, die spezifisch in atherosklerotischen Mäusen vorkommen. Eine der athereosklerotischen Populationen war eine zuvor unbeschriebene TREM2high Makrophagen Population, die eine erhöhte Trem2 Genexpression zeigte. Diese Population von Makrophagen schien in Funktionen wie Lipid Metabolismus, Katabolismus, sowie Kalzifizierung von Verletzungen involviert zu sein. Diese Arbeit hat die phänotypische Heterogenität und das Feld unterschiedlicher Immunzellpopulationen in unterschiedlichen Stadien der Atherosklerose aufgezeigt. Unsere Arbeit bereitet den Weg, um die Beziehung zwischen unterschiedlichen Infektionskrankheiten und kardiovaskulären Krankheiten besser zu beschreiben.

●	Wir haben eine webbasierte Plattform namens „Infektionsatlas“ entwickelt, um Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten zu visualisieren und zu durchsuchen. Die „Infektionsatlas“ Plattform stellt eine nutzerfreundliche Oberfläche zur Untersuchung von unterschiedlichen Aspekten von Infektionskrankheiten auf Einzelzell-Niveau bereit und kann möglicherweise zielgerichtete Ansätze voranzutreiben, um Infektionskrankheiten zu verhindern. Diese Plattform, die unter „infection-atlas.org“ verfügbar ist, bietet im Moment eine nutzerfreundliche Oberfläche zum Durchsuchen und Darstellen unterschiedlicher Aspekte von Infektionskrankheiten. Langfristig soll es ein umfangreicher Atlas für Infektionen in Maus und Mesch in unterschiedlichen Geweben und unterschiedlichen Pathogenen.

Insgesamt stellen wir in dieser Dissertation einen Rahmen zur Untersuchung von Infektionskrankheiten auf Einzelzell-Ebene mit neuen Methoden für die Datenanalyse zur Verfügung und bereiten den Weg für weitere Studien um Wirts-Pathogen Interaktionen auf Einzellzell-Niveau zu untersuchen.
KW  - Einzelzellanalyse
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-269258
ER  -