TY  - THES
A1  - Niesner, Michéle G.
T1  - Pathologie von Autoantikörpern gegen das Contactin-assoziierte Protein 2
T1  - Pathology of autoantibodies against contactin-associated protein 2
N2  - Aktuell herrscht in der Wissenschaft Unklarheit über die pathologischen Prozesse, die durch Caspr2-aAK ausgelöst werden. Dissens herrscht, ob es durch die aAK im Serum oder im Liquor zu einer Internalisierung von an der Zellmembran exprimierten Caspr2 kommt.  Ebenso ist nicht abschließend geklärt, inwieweit die Struktur des VGKC durch die aAK-Bindung verändert wird.
Mit der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Pathomechanismus von Caspr2-aAK vorgenommen, indem die Oberflächenexpression von Caspr2 in DRGs im Langzeitversuch näher untersucht wurde. Dafür wurden zunächst die Caspr2-aAK in den Patientenseren mithilfe immunzytochemischer Färbungen in vitro sowohl in transfizierten HEK293, als auch in adulten DRGs nachgewiesen. Zusätzlich wurde mit der Membranpräparation von Caspr2 transfizierten HEK293-Zellen die Caspr2 Bindung mittels proteinbiochemischen Nachweises verifiziert. 
Es wurde zudem eine Subklassenbestimmung an den 9 vorliegenden Patientenseren und einer Probe mit aufgereinigtem IgG durchgeführt. Die dominante Subklasse war IgG4 was mit dem wissenschaftlichen Forschungsstand kongruiert, dass IgG4 bei Caspr2-aAK der dominierende Subtyp ist. 
Im Langzeitversuch zur Untersuchung einer möglichen Internalisierung von Caspr2 durch die Inkubation in Caspr2-aAK positiven Seren wurden in vitro kultivierte DRGs adulter Mäuse für 24h, 48h, bzw. 96 h mit den Seren konfrontiert. Zusätzlich wurde überprüft wie sich ein Rescue der Zellen – nach 48 h wurde das Caspr2-aAK positive Serum gegen ein Caspr2-negatives Serum für weitere 48 h ausgetauscht – auf die Oberflächenexpression auswirkt.  Zur Überprüfung der Dichte des an der Zellmembran exprimierten Caspr2 Proteins wurde diese abschließend quantifiziert und statistisch ausgewertet. Zusammenfassend ließ sich bei keinem der untersuchten Seren eine signifikante Veränderung der Caspr2 Oberflächenexpression erkennen.
Mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass eine vorübergehende Erniedrigung/Erhöhung der Caspr2 Expression nach Inkubation mit aAK durch primäre DRG Neurone kompensiert wird und eine erhöhte Internalisierung nicht als ursächlich für den Pathomechanismus der Caspr2-aAK in Frage kommt.
N2  - Current research findings do not provide a clear picture about the pathological processes that are triggered by Caspr2-aAK. There are contrary observations about internalisation of Caspr2 expressed at the cellular membrane following aAK binding from patient serum or cerebrospinal fluid. Moreover, it has not been clarified to what extent the structure of the VGKC is altered upon aAK binding. The present study investigated the pathomechanisms of Caspr2-aAK by examining the surface expression of Caspr2 in DRGs in a long-term experiment. First, Caspr2-aAK from patient sera were proven for their in vitro binding to both transfected HEK293 and adult DRGs. In addition, membrane preparations of Caspr2 transfected HEK293 cells were used to verify Caspr2 binding by protein biochemical analysis. 
Furthermore, a subclass determination was performed on the 9 available patient sera and one sample of purified IgG. The dominant subclass was determined as IgG4, which is in line with current literature. 
During the long-term experiment to investigate a possible internalisation of Caspr2 following incubation with Caspr2-aAK positive sera, in vitro cultured DRGs of adult mice were exposed to the sera for 24 h, 48 h and 96 h, respectively. In addition, the effect of rescuing the cells from possible changes in Caspr2 expression - after 48 h, the Caspr2-aAK positive serum was replaced with Caspr2-negative control serum for another 48 h - was examined.  To check the micron of Caspr2 expressed on the cellular membrane, Caspr2 was quantified and statistically evaluated. In summary, no significant changes in Caspr2 surface expression were detected in following incubation with any of the sera. These results demonstrate that a transient decrease/increase in Caspr2 expression after incubation with aAK is compensated by primary DRG neurons and increased internalisation cannot be considered as causative for the pathomechanism of Caspr2-aAK.
KW  - Autoantikörper
KW  - Pathologie
KW  - Caspr2
KW  - Contactin-assoziiertes Protein 2
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266769
ER  - 
TY  - THES
A1  - Langlhofer, Georg
T1  - Über die Bedeutung intrazellulärer Subdomänen des Glycinrezeptors für die Kanalfunktion
T1  - Investigations into the relevance of glycine receptor intracellular subdomains to receptor channel function
N2  - Der zur Familie der pentameren ligandengesteuerten Ionenkanäle zugehörige Glycinrezeptor (GlyR) ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im Zentralnervensystem von Säugetieren. GlyR-Mutationen führen zur neurologischen Bewegungsstörung Hyperekplexie. Aufgrund fehlender struktureller Daten ist die intrazelluläre Loop-Struktur zwischen den Transmembransegmenten 3 und 4 (TM3-4 Loop) eine weitgehend unerforschte Domäne des GlyR. Innerhalb dieser Domäne wurden Rezeptortrunkierungen sowie Punktmutationen identifiziert. Rezeptortrunkierung geht mit Funktionslosigkeit einher, welche jedoch durch Koexpression des fehlenden Sequenzabschnitts zum Teil wiederhergestellt werden kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen trunkierten, funktionslosen GlyR und sukzessiv verkürzten Komplementationskonstrukten untersucht. Dabei wurden als Minimaldomänen für die Interaktion das C-terminalen basische Motive des TM3-4 Loops, die TM4 sowie der extrazelluläre C-Terminus identifiziert. Die Rückkreuzung transgener Mäuse, die das Komplementationskonstrukt iD-TM4 unter Kontrolle des GlyR-Promotors exprimierten, mit der oscillator-Maus spdot, die einen trunkierten GlyR exprimiert und 3 Wochen nach der Geburt verstirbt, hatte aufgrund fehlender Proteinexpression keinen Effekt auf die Letalität der Mutation. Des Weiteren wurde die Bedeutsamkeit der Integrität beider basischer Motive 316RFRRKRR322 und 385KKIDKISR392 im TM3-4 Loop in Kombination mit der Loop-Länge für die Funktionalität und das Desensitisierungsverhalten des humanen GlyRα1 anhand von chimären Rezeptoren identifiziert. Eine bisher unbekannte Patientenmutation P366L innerhalb des TM3-4 Loops wurde mit molekularbiologischen, biochemischen und elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die mutierten Rezeptorkomplexe in vitro deutlich reduzierte Glycin-induzierte Maximalströme sowie eine beschleunigte Schließkinetik aufweisen. P366L hat im Gegensatz zu bereits charakterisierten Hyperekplexiemutationen innerhalb des TM3-4 Loops keinen Einfluss auf die Biogenese des Rezeptors. P366 ist Teil einer möglichen Poly-Prolin-Helix, die eine Erkennungssequenz für SH3-Domänen darstellt. Ein potenzieller Interaktionspartner des TM3-4 Loops des GlyRα1 ist Collybistin, welches eine wichtige Rolle bei der synaptischen Rezeptorintegration spielt und die Verbindung zum Zytoskelett vermittelt. An der inhibitorischen Synapse verursacht P366L durch die Reduzierung postsynaptischer Chloridströme, das beschleunigte Desensitisierungsverhalten des GlyRα1 sowie ein verändertes Interaktionsmotiv Störungen der glycinergen Transmission, die zur Ausprägung phänotypischer Symptome der Hyperekplexie führen.
N2  - The glycine receptor (GlyR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels and mediates synaptic inhibition in the central nervous system of mammals. GlyR mutations lead to the neuromotor disorder hyperekplexia. Due to the lack of structural data, the intracellular loop between transmembrane segments 3 and 4 (TM3-4 Loop) is considered as the most unexplored domain of the GlyR. Within this domain receptor truncations as well as point mutations have been identified. Receptor truncation correlates with non-functionality that can be partially restored by coexpression of the missing sequence. In this work, the interaction between a truncated non-functional GlyR and successively truncated complementation constructs was investigated. The C-terminal basic motif of the TM3-4 loop, the TM4 and the C-Terminus were identified as the minimal domain required for interaction. Backcrossing of a transgenic mouse line expressing the complementation construct iD-TM4 under the control of the GlyR promotor, with the oscillator mouse spdot expressing a truncated GlyR leading to death 3 weeks after birth, was unsuccessful and did not influence the lethality of the mutation, most probably due to the lack of transgene protein expression. In addition the importance of the integrity of both basic motifs 316RFRRKRR322 and 385KKIDKISR392 within the TM3-4 loop in combination with loop length were shown to be essential for functionality and desensitization behavior of the human GlyRα1 using chimeric receptors. An unknown TM3-4 loop mutation P366L was characterized using biomolecular, biochemical and electrophysiological approaches. It was demonstrated that mutated receptor complexes display remarkably reduced glycine-induced maximal currents in addition to accelerated channel closing kinetics in vitro. In contrast to previously analyzed hyperekplexia mutations within the TM3-4 loop, P366L exhibits no influence on receptor biogenesis. P366 is located in a sequence probably forming a poly-proline helix, which serves as a recognition sequence for SH3 domains. One prospective interaction partner is collybistin, which plays a major role in the process of synaptic receptor integration and connects the receptor complex to the cytoskeleton. At the site of the inhibitory synapse, P366L causes reduced chloride currents, accelerated desensitization behavior of the GlyRα1 and an altered interaction motif leading to disturbed glycinergic neurotransmission that result in formation of phenotypic symptoms of hyperekplexia.
KW  - Glycinrezeptor
KW  - intrazelluläre Domäne
KW  - Hyperekplexie
KW  - intracellular domain
KW  - hyperekplexia
KW  - Bewegungsstörung
KW  - Synapse
KW  - Ionenkanal
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140249
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kitzenmaier, Alexandra
T1  - GlyT2-Mutationen als zweithäufigste Ursache bei Hyperekplexie – Pathologischer Mechanismus der Mutation P429L
T1  - GlyT2 mutations as second major cause of hyperekplexia – Pathogenic mechanism of the mutation P429L
N2  - Mutationen im Glycintransporter 2 (GlyT2) stellen die präsynaptische Komponente der neurologischen Erkrankung Hyperekplexie oder Startle Disease dar. Der neuronale Na+/Cl- -abhängige GlyT2 ist für das Recycling von Glycin verantwortlich und bildet an inhibitorischen glycinergen Synapsen die Hauptquelle des freigesetzten Transmitters. Dominante, rezessive und zusammengesetzte heterozygote Mutationen wurden bereits identifiziert, von denen die meisten zu einer beeinträchtigten Glycinaufnahme führen. In dieser Arbeit konnten wir eine neue pathogene Mutation innerhalb des neuronalen Glycintransporter-2-Gens (SLC6A5, OMIM604159) in einer Familie identifizieren, in der beide Elternteile heterozygote Träger waren. Ein homozygotes Kind litt an schweren neuromotorischen Defiziten, wohingegen Heterozygote keine Symptome aufwiesen. Die neue rezessive Mutation c.1286C>T erzeugte einen missense Aminosäureaustausch von Prolin gegen Leucin an Position 429 (pP429L) in der Transmembrandomäne 5. Wir haben die GlyT2P429L-Variante mittels Homologiemodellierung, immuncytochemischer Färbungen, Western Blot Analysen, Biotinylierung und funktioneller Glycinaufnahmetests charakterisiert. Der mutierte GlyT2 zeigte beim Proteintransport durch verschiedene intrazelluläre Kompartimente zur Zelloberfläche keine Defizite. Die gesamte Proteinexpression war jedoch signifikant verringert. Obwohl GlyT2P429L an der Zelloberfläche vorhanden ist, zeigte er einen Verlust der Proteinfunktion. Die Co-Expression der Mutante mit dem Wildtyp-Protein, die die Situation der Eltern widerspiegelte, hatte keinen Einfluss auf die Transporterfunktion und erklärte somit ihren nicht symptomatischen Phänotyp. Wenn jedoch die Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Protein im Überschuss exprimiert wurde, war die Glycinaufnahme signifikant verringert. Die Strukturanalyse ergab, dass der eingeführte Leucinrest an Position 429 zu Konformationsänderungen in der α-Helix 5 führt, die in unmittelbarer Nähe zur Natriumbindungsstelle des Transporters lokalisiert sind. Dies deutet darauf hin, dass die Zugangsmechanismen des GlyT2 gestört sein könnten und einen vollständigen Verlust der Transportaktivität verursachen. Unsere Ergebnisse belegen, dass P429 in GlyT2 ein strukturell wichtiger Aminosäurerest ist, der eine wichtige funktionelle Rolle beim Glycintransport spielt.
N2  - Glycine transporter 2 (GlyT2) mutations represent the presynaptic component of the neurological disease hyperekplexia or startle disease. The neuronal Na+/Cl- -dependent GlyT2 is responsible for glycine recycling and establishes the main source of releasable transmitter at inhibitory glycinergic synapses. In humans, dominant, recessive and compound heterozygous mutations have been identified, most of them leading to impaired glycine uptake. In this study, we identified a novel pathogenic mutation within the neuronal GlyT2 gene (SLC6A5, OMIM604159) in a family with both parents being heterozygous carriers. A homozygous child suffered from severe neuromotor deficits, whereas heterozygous individuals did not reveal any symptoms. The novel recessive mutation c.1286C>T generated a missense amino acid exchange of proline to leucine at position 429 (pP429L) in transmembrane domain 5 of the protein. We characterized the GlyT2P429L variant using homology modeling, immunocytochemical stainings, Western blot analysis, biotinylation, and functional glycine uptake assays. The mutated GlyT2 revealed no deficits in protein trafficking through various intracellular compartments to cellular surface. However, the whole cell protein expression was significantly decreased. Although present at cellular surface, GlyT2P429L showed a loss of protein function. Co-expression of the mutant with the wild-type protein, reflecting the situation in the parents, did not affect transporter function, thus explaining their non-symptomatic phenotype. Nevertheless, when the mutant was expressed in excess compared with the wild-type protein, glycine uptake was significantly reduced. Structural analysis revealed that the introduced leucine residue at position 429 leads to conformational changes in α-helix 5 which is localized in close proximity to the sodium-binding site of the transporter. The data suggest that the gating mechanism of GlyT2 might be disturbed and causes a complete loss of transport activity. Thus, our results support P429 in GlyT2 as structurally important residue displaying a key functional role in glycine transport.
KW  - Glycin
KW  - Proteintransport
KW  - Inhibitorische Synapse
KW  - Bewegungsstörung
KW  - Präsynaptische Hyperekplexie
KW  - Glycintransporter 2 (GlyT2)
KW  - SLC6A5
KW  - Funktionsverlust
KW  - Konformationsänderung
KW  - startle disease
KW  - presynaptic hyperekplexia
KW  - loss of function
KW  - structural disruption
KW  - glycine uptake
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202574
ER  - 
TY  - THES
A1  - Janzen, Dieter
T1  - Functional analysis of ion channels and neuronal networks in 2D and 3D \(in\) \(vitro\) cell culture models
T1  - Funktionelle Analyse von Ionenkanälen und neuronalen Netzwerken in 2D und 3D \(in\) \(vitro\) Zellkulturmodellen
N2  - In the central nervous system, excitatory and inhibitory signal transduction processes are mediated by presynaptic release of neurotransmitters, which bind to postsynaptic receptors. Glycine receptors (GlyRs) and GABAA receptors (GABAARs) are ligand-gated ion channels that enable synaptic inhibition. One part of the present thesis elucidated the role of the GlyRα1 β8 β9 loop in receptor expression, localization, and function by means of amino acid substitutions at residue Q177. This residue is underlying a startle disease phenotype in the spontaneous mouse model shaky and affected homozygous animals are dying 4-6 weeks after birth. The residue is located in the β8 β9 loop and thus part of the signal transduction unit essential for proper ion channel function. Moreover, residue Q177 is involved in a hydrogen network important for ligand binding. We observed no difference in ion channel trafficking to the cellular membrane for GlyRα1Q177 variants. However, electrophysiological measurements demonstrated reduced glycine, taurine, and β alanine potency in comparison to the wildtype protein. Modeling revealed that some GlyRα1Q177 variants disrupt the hydrogen network around residue Q177. The largest alterations were observed for the Q177R variant, which displayed similar effects as the Q177K mutation present in shaky mice. Exchange with structurally related amino acids to the original glutamine preserved the hydrogen bond network. Our results underlined the importance of the GlyR β8 β9 loop for proper ion channel gating.
GlyRs as well as GABAARs can be modulated by numerous allosteric substances. Recently, we focused on monoterpenes from plant extracts and showed positive allosteric modulation of GABAARs. Here, we focused on the effect of 11 sesquiterpenes and sesquiterpenoids (SQTs) on GABAARs. SQTs are compounds naturally occurring in plants. We tested SQTs of the volatile fractions of hop and chamomile, including their secondary metabolites generated during digestion. Using the patch-clamp technique on transfected cells and neurons, we were able to observe significant GABAAR modulation by some of the compounds analyzed. Furthermore, a possible binding mechanism of SQTs to the neurosteroid binding site of the GABAAR was revealed by modeling and docking studies. We successfully demonstrated GABAAR modulation by SQTs and their secondary metabolites.

The second part of the thesis investigated three-dimensional (3D) in vitro cell culture models which are becoming more and more important in different part of natural sciences. The third dimension allows developing of complex models closer to the natural environment of cells, but also requires materials with mechanical and biological properties comparable to the native tissue of the encapsulated cells. This is especially challenging for 3D in vitro cultures of primary neurons and astrocytes as the brain is one of the softest tissues found in the body. Ultra-soft matrices that mimic the neuronal in vivo environment are difficult to handle. We have overcome these challenges using fiber scaffolds created by melt electrowriting to reinforce ultra-soft matrigel. Hence, the scaffolds enabled proper handling of the whole composites and thus structural and functional characterizations requiring movement of the composites to different experimental setups. Using these scaffold-matrigel composites, we successfully established methods necessary for the characterization of neuronal network formation. Before starting with neurons, a mouse fibroblast cell line was seeded in scaffold-matrigel composites and transfected with the GlyR. 3D cultured cells displayed high viability, could be immunocytochemically stained, and electrophysiologically analyzed. 
In a follow-up study, primary mouse cortical neurons in fiber-reinforced matrigel were grown for up to 21 days in vitro. Neurons displayed high viability, and quantification of neurite lengths and synapse density revealed a fully formed neuronal network already after 7 days in 3D culture. Calcium imaging and patch clamp experiments demonstrated spontaneous network activity, functional voltage-gated sodium channels as well as action potential firing. By combining ultra-soft hydrogels with fiber scaffolds, we successfully created a cell culture model suitable for future work in the context of cell-cell interactions between primary cells of the brain and tumor cells, which will help to elucidate the molecular pathology of aggressive brain tumors and possibly other disease mechanisms.
N2  - Im zentralen Nervensystem wird die exzitatorische und inhibitorische Signaltransduktion durch die präsynaptische Ausschüttung von Neurotransmittern, die an postsynaptische Rezeptoren binden, gesteuert. Glycinrezeptoren (GlyRs) und GABAA-Rezeptoren (GABAARs) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle, die die synaptische Inhibition ermöglichen. Ein Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss des GlyRα1 β8 β9-Loops auf Expression, Lokalisation und Funktion des Rezeptors. Dazu wurde ein Aminosäureaustausch an Position Q177 durchgeführt, welche dem Startle-Krankheit-Phänotyp des spontanen Mausmodells shaky zugrunde liegt. Betroffene homozygote Tiere versterben 4-6 Wochen nach Geburt. Die Position befindet sich im β8 β9-Loop und ist damit Teil einer Signaltransduktionseinheit, die essenziell für die korrekte Rezeptorfunktion ist. Zudem ist Position Q177 teil eines Wasserstoffbrückennetzwerks, welches für die Ligandenbindung erforderlich ist. Wir konnten keinen Einfluss der GlyRα1Q177-Varianten auf den Transport des Rezeptors zur Zellmembran feststellen. Allerdings zeigten elektrophysiologische Messungen eine verringerte Wirksamkeit von Glycin, Taurin und β Alanin verglichen mit dem Wildtyp-Protein. Mithilfe von Proteinmodellierung konnte gezeigt werden, dass manche der GlyRα1Q177-Varianten das Wasserstoffbrückennetzwerk im Umfeld von Position Q177 stören. Die größten Effekte wurden bei der Q177R-Variante beobachtet, die sich ähnlich zur Q177K-Mutation der shaky-Maus verhielt. Der Austausch zu einer Aminosäure, die strukturell ähnlich zum ursprünglichen Glutamin ist, störte das Wasserstoffbrückennetzwerk hingegen nicht. Unsere Ergebnisse zeigen, wie wichtig der GlyR β8 β9-Loop für die Aufrechterhaltung der Rezeptorfunktion ist.
Sowohl GlyRs als auch GABAARs können durch verschiedenste allosterische Substanzen moduliert werden. Zuletzt zeigten wir positive allosterische Modulation von GABAARs durch Monoteperne aus Pflanzenextrakten. Hier haben wir uns auf den Effekt von 11 Sesquiterpenen und Sesquiterpenoiden (SQTs) auf GABAARs fokussiert. SQTs sind natürlich in Pflanzen vorkommende Stoffe. Wir testeten SQTs aus dem flüchtigen Anteil von Hopfen und Kamille, sowie deren sekundäre Metaboliten, die während der Verdauung entstehen. Mithilfe der Patch-Clamp-Methode konnten wir in transfizierten Zellenlinien und neuronalen Primärzellen signifikante Modulation von GABAARs durch einige der SQTs beobachten. Außerdem wurde mithilfe von Docking-Simulationen eine mögliche Bindung von SQTs in der Neurosteroid-Bindungstasche gezeigt. Zusammengefasst haben wir erfolgreich die Modulation von GABAARs durch SQTs und deren sekundäre Metaboliten demonstriert.

Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit dreidimensionalen (3D) in vitro Zellkulturmodellen, die zunehmend an Bedeutung gewinnen. Die dritte Dimension erlaubt die Entwicklungen von komplexen Modellen, die sich der natürlichen Umgebung von Zellen annähern. Dafür werden Materialien benötigt, deren mechanische und biologische Eigenschaften denen des ursprünglichen Gewebes der eingeschlossenen Zellen ähneln. Dies ist insbesondere eine Herausforderung bei 3D in vitro Kulturen von primären Neuronen und Astrozyten, da das Gehirn eines der weichsten Gewebe des Körpers ist. Ultraweiche Matrizen, welche die neuronale Umgebung nachahmen, sind schwer zu handhaben. Wir haben dieses Problem gelöst, indem wir ultraweiches Matrigel mit Fasergerüsten verstärkten, die mithilfe von Melt Electrowriting gedruckt wurden. Somit können diese Matrigel-Faser-Komposite für strukturelle und funktionelle Experimente benutzt werden, die häufige Bewegung und Transport der Proben voraussetzen. Mit diesen Matrigel-Faser-Kompositen haben wir Methoden etabliert, die für die Charakterisierung von neuronalen Netzwerken erforderlich sind. Anstelle von Neuronen haben wir dafür eine Mausfibroblasten-Zelllinie benutzt und mit dem GlyR transfiziert. Zellen in den Matrigel-Faser-Komposite zeigten eine hohe Viabilität, konnten immunocytochemisch angefärbt werden, und mithilfe von elektrophysiologischen Methoden gemessen werden.
Darauf aufbauend haben wir primäre kortikale Mausneurone in faserverstärktem Matrigel für bis zu 21 Tage wachsen lassen. Die Neurone zeigten eine hohe Viabilität und durch Quantifikation von Neuritenlänge und Synapsendichte konnte ein vollständig ausgeformtes Netzwerk nach 7 Tagen in 3D-Kultur demonstriert werden. Mithilfe von Calcium-Imaging und Patch-Clamp-Experimenten wurden spontane Netzwerkaktivität, funktionelle spannungsgesteuerte Natriumkanäle, sowie Aktionspotentiale nachgewiesen. Somit konnten wir durch Kombination von einem ultraweichen Hydrogel mit Fasergerüsten erfolgreich ein Zellkulturmodell entwickeln, das zukünftig für die Erforschung von Zell-Zell-Interaktionen zwischen primären Gehirnzellen und Tumorzellen benutzt werden kann. Damit kann die molekulare Pathologie von aggressiven Hirntumoren und möglicherweise anderen Krankheitsmechanismen weiter aufgeklärt werden.
KW  - Zellkultur
KW  - Ionenkanal
KW  - Aminobuttersäure <gamma->
KW  - Glycin
KW  - Rezeptor
KW  - 3D cell culture
KW  - neuronal network
KW  - ion channel
KW  - glycine receptor
KW  - GABA receptor
KW  - 3D-Zellkultur
KW  - Nervennetz
KW  - Glycinrezeptor
KW  - GABA-Rezeptor
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251700
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hugo, Julian
T1  - ‘Signal-close-to-noise’ calcium activity reflects neuronal excitability
T1  - ‘Signal-close-to-noise’ Kalziumaktivität als Ausdruck neuronaler Erregbarkeit
N2  - Chronic pain conditions are a major reason for the utilization of the health care system. Inflammatory pain states can persist facilitated by peripheral sensitization of nociceptors. The voltage-gated sodium channel 1.9 (NaV1.9) is an important regulator of neuronal excitability and is involved in inflammation-induced pain hypersensitivity. Recently, oxidized 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholine (OxPAPC) was identified as a mediator of acute inflammatory pain and persistent hyperalgesia, suggesting an involvement in proalgesic cascades and peripheral sensitization. Peripheral sensitization implies an increase in neuronal excitability. This thesis aims to characterize spontaneous calcium activity in neuronal compartments as a proxy to investigate neuronal excitability, making use of the computational tool Neural Activity Cubic (NA3). NA3 allows automated calcium activity event detection of signal-close-to-noise calcium activity and evaluation of neuronal activity states. Additionally, the influence of OxPAPC and NaV1.9 on the excitability of murine dorsal root ganglion (DRG) neurons and the effect of OxPAPC on the response of DRG neurons towards other inflammatory mediators (prostaglandin E2, histamine, and bradykinin) is investigated. Using calcium imaging, the presence of spontaneous calcium activity in murine DRG neurons was established. NA3 was used to quantify this spontaneous calcium activity, which revealed decreased activity counts in axons and somata of NaV1.9 knockout (KO) neurons compared to wildtype (WT). Incubation of WT DRG neurons with OxPAPC before calcium imaging did not show altered activity counts compared to controls. OxPAPC incubation also did not modify the response of DRG neurons treated with inflammatory mediators. However, the variance ratio computed by NA3 conclusively allowed to determine neuronal activity states. In conclusion, my findings indicate an important function of NaV1.9 in determining the neuronal excitability of DRG neurons in resting states. OxPAPC exposition does not influence neuronal excitability nor sensitizes neurons for other inflammatory mediators. This evidence reduces the primary mechanism of OxPAPC-induced hyperalgesia to acute effects. Importantly, it was possible to establish an approach for unbiased excitability quantification of DRG neurons by calcium activity event detection and calcium trace variance analysis by NA3. It was possible to show that signal-close-to-noise calcium activity reflects neuronal excitability states.
N2  - Entzündliche Schmerzzustände können lange fortbestehen, was durch eine periphere Sensibilisierung von Nozizeptoren begünstigt wird. Der spannungsgesteuerte Natriumkanal 1.9 (NaV1.9) ist ein wichtiger Regulator neuronaler Erregbarkeit und ist nachweislich an entzündungsbedingter Schmerzüberempfindlichkeit beteiligt. Kürzlich wurde oxidiertes 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholin (OxPAPC) als Mediator akuter Entzündungsschmerzen und anhaltender Hyperalgesie identifiziert, was auf eine Beteiligung an Mechanismen der peripheren Sensibilisierung hindeutet. Periphere Sensibilisierung setzt eine Erhöhung der neuronalen Erregbarkeit voraus. In dieser Arbeit soll neuronale spontane Kalziumaktivität charakterisiert werden, um Rückschlüsse auf die neuronale Erregbarkeit zu ziehen. Dazu wurde das Tool Neural Activity Cubic (NA3) eingesetzt, welches die automatisierte Detektion von „signal-close-to-noise“ Kalziumaktivitätsereignissen und die Bewertung neuronaler Aktivitätszustände erlaubt. Mittels NA3 wurde der Einfluss von OxPAPC und NaV1.9 auf die Erregbarkeit von murinen Spinalganglion (DRG)-Neuronen untersucht. Zusätzlich wurde die Reaktion von DRG-Neuronen auf weitere Entzündungsmediatoren (Prostaglandin E2, Histamin und Bradykinin) nach Inkubation mit OxPAPC beurteilt. Mittels Calcium-Imaging konnte spontane Kalziumaktivität in murinen DRG-Neuronen identifiziert werden. NA3 wurde verwendet, um diese spontane Kalziumaktivität zu quantifizieren. NaV1.9 Knockout-Neuronen (KO) zeigten signifikant Verringerte Kalziumaktivität im Vergleich Wildtyp (WT)-Neuronen. Die Inkubation von WT-Neuronen mit OxPAPC vor Calcium-Imaging resultierte in unveränderter Kalziumaktivität. Eine OxPAPC-Inkubation hatte ebenso keinen Einfluss auf die Reaktion von DRG-Neuronen, die mit einem Gemisch aus Entzündungsmediatoren stimuliert wurden. Die von NA3 berechnete „variance ratio“ ermöglichte jedoch eine eindeutige Bestimmung der neuronalen Aktivitätszustände. Zusammenfassend weisen meine Ergebnisse auf eine wichtige Funktion von NaV1.9 bei der Bestimmung der neuronalen Erregbarkeit von DRG-Neuronen im Ruhezustand hin. Eine Exposition mit OxPAPC beeinflusst allerdings weder die neuronale Erregbarkeit noch werden Neuronen für andere Entzündungsmediatoren sensibilisiert. Dies legt akute Effekte als primären Mechanismus der OxPAPC-induzierten Hyperalgesie nahe. Es war möglich, eine Methode für die unverzerrte Quantifizierung neuronaler Erregbarkeit von durch die Erkennung von Kalziumaktivitätsereignissen und die Varianzanalyse von Kalziumsignalen mit NA3 zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass die „signal-close-to-noise“ Kalziumaktivität den Zustand der neuronalen Erregbarkeit widerspiegelt.
KW  - Entzündung
KW  - Schmerz
KW  - Natriumkanal
KW  - Erregbarkeit
KW  - Phospholipide
KW  - neuronal excitability
KW  - NaV1.9
KW  - inflammatory pain
KW  - calcium activity
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292605
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fuhl, Isabell
T1  - Untersuchung der synaptischen Lokalisation des heteromeren Glycin-Rezeptors in einem neuen Mausmodell der \(Startle\) Erkrankung - mit Fokus auf die GlyR-β-Untereinheit -
T1  - Investigation of the synaptic localisation of the heteromeric glycine receptor in a new mouse model of startle disease - with a focus on the GlyR-β subunit
N2  - Der Glycin-Rezeptor ist Teil der inhibitorischen liganden-gesteuerten Ionenkanäle im ZNS und wird am stärksten im adulten Rückenmark sowie im Hirnstamm exprimiert. In der Nerv-Muskel-Synapse sind GlyR für die rekurrente Hemmung der Motoneuronen wichtig und steuern das Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung der Muskelzellen. Für die glycinerge Neurotransmission sind neben den präsynaptischen GlyR 𝛼1 insbesondere postsynaptische GlyR 𝛼1/𝛽 verantwortlich. Durch Mutationen des GlyR entsteht das Erkrankungsbild der Hyperekplexie mit übersteigerter Schreckhaftigkeit, Muskelsteifheit und Apnoe. Hauptursächlich dafür sind Mutationen im GLRA1-Gen. Die shaky Maus stellt ein gutes Modell zur Erforschung dieser seltenen Erkrankung dar.

Die shaky Missense-Mutation Q177K in der extrazellulären 𝛽8-𝛽9 Schleife der Glycin- Rezeptor-𝛼1-Untereinheit zeigte strukturell ein gestörtes Wasserstoffbrückennetzwerk. Funktionell konnten eingeschränkt leitfähige Ionenkanäle identifiziert werden. Der letale Phänotyp äußert sich beim homozygoten shaky Tier durch Schrecksymptome mit einem einhergehenden zunehmenden Gewichtsverlust. Die Quantifizierung der Oberflächenexpression deutete auf einen Verlust synaptischer GlyR 𝛼1/𝛽 hin. Aussagen bezüglich der GlyR-𝛽-Untereinheit, die Teil des synaptischen GlyR Komplexes ist, waren aufgrund fehlender stabiler Antikörper bisher nicht möglich. Das neuartige KI- Mausmodell Glrb eos exprimiert endogen fluoreszierende 𝛽 -Untereinheiten und ermöglicht damit erstmalig eine Betrachtung der GlyR- 𝛽-Expression in Tiermodellen der Startle Erkrankung.

Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der shaky Mutation auf die Interaktion mit der 𝛽 -Untereinheit und Gephyrin zu erforschen. Dafür wurden Markerproteine der glycinergen Synapse in Rückenmarksneuronen der Kreuzung Glrb eos x Glra1 sh gefärbt und quantifiziert. Die durchgeführte Gewichtsbestimmung der Nachkommen im zeitlichen Verlauf zeigte keinen Einfluss der eingefügten mEos4b-Sequenz auf das Körpergewicht der Tiere und schließt damit funktionelle Einschränkungen bedingt durch die mEos4b-Sequenz aus. Zur Verstärkung des 𝛽 eos-Signals wurde ein Antikörper verwendet. Die Quantifizierung der GlyR- 𝛽- Untereinheit an Rückenmarksneuronen zeigte für homozygote shaky Tiere im Vergleich zum Wildtyp signifikant reduzierte 𝛽eos Oberflächenexpressionen in Gephyrin Clustern sowie signifikant erniedrigte Kolokalisationen von Gephyrin/𝛼1, 𝛽eos/𝛼1 und 𝛽eos/Gephyrin. Die mutierte GlyR-𝛼1- Untereinheit wurde hingegen vermehrt an der Oberfläche in shaky Tieren exprimiert. Die Ergebnisse der Rückenmarksschnitte unterstützen diese Befunde aus den Primärneuronen. Die Untersuchung der Präsynapse erbrachte für Glrb eos/eos x Glra1 sh/sh eine signifikant verminderte Synapsin und Synapsin/𝛼1 Expression.

Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern die Daten früherer Arbeiten zur shaky Maus und zeigen einen starken Verlust synaptischer GlyR 𝛼 1/ 𝛽 an der Oberfläche von Motoneuronen. Ein möglicher kompensatorischer Versuch durch erhöhte 𝛼1 Expression bleibt infolge der Funktionsbeeinträchtigung dieser mutierten GlyR- 𝛼 1 Rezeptoren erfolglos mit letalem Ausgang. In vorherigen Arbeiten wurde vermutet, dass die Mutation in der extrazellulären Bindungsstelle in der Lage ist, Konformationsänderungen in die TM3-TM4-Schleifenstruktur zu übertragen und dadurch die Gephyrin Bindung und synaptische Verankerung zu stören. Die Daten dieser Arbeit stützen diese Annahme und weisen darüber hinaus auf eine gestörte Rezeptorkomplexbindung hin. Die vorliegende Arbeit trägt somit zum besseren Verständnis der Startle Erkrankung auf synaptischer Ebene bei.
N2  - The glycine receptor belongs to the inhibitory ligand-gated ion channels in the CNS and is most strongly expressed in the adult spinal cord and brainstem. In the nerve-muscle synapse, GlyR are important for recurrent inhibition of motor neurons and control the balance between excitation and inhibition of muscle cells. In addition to the presynaptic GlyR 𝛼1, postsynaptic GlyR 𝛼1/ 𝛽 in particular are responsible for glycinergic neurotransmission. Mutations of the GlyR lead to the clinical symptoms of hyperekplexia with excessive startle responses, muscle stiffness and apnea. The main causes are mutations in the GLRA1 gene. The shaky mouse is a good model for studying this rare disease.

The shaky missense mutation Q177K, located in the extracellular 𝛽8-𝛽9 loop of the glycine receptor 𝛼1 subunit, showed a disrupted hydrogen bond network at the structural level. Functionally restricted conductive ion channels could be identified. The lethal phenotype in the homozygous shaky mouse is manifested by startle symptoms with accompanied increasing weight loss. Quantification of surface expression indicated a loss of synaptic GlyR 𝛼1/𝛽. So far, statements regarding the GlyR-𝛽-subunit which is part of the synaptic receptor complex had not been possible due to the lack of stable antibodies. The novel KI mouse model Glrb eos endogenously expresses fluorescent β-subunits and thus allows an observation of GlyR 𝛽-expression in animal models of startle disease for the first time.

The aim of this study was to explore the effects of the shaky mutation on the interaction with the 𝛽-subunit and gephyrin. To this aim, marker proteins of the glycinergic synapse were stained and quantified in spinal cord neurons of Glrb eos x Glra1 sh. The performed weight determination of the littermates over time showed no influence of the inserted mEos4b-sequence on the bodyweight of the animals, thus ruling out functional limitations caused by the mEos4b-sequence. An antibody was used to amplify the 𝛽eos signal. Quantification of the GlyR-𝛽- subunit at spinal cord neurons demonstrated significantly reduced 𝛽eos surface expressions in gephyrin clusters as well as significantly decreased colocalisations of gephyrin/α1, 𝛽eos/𝛼1 and 𝛽eos/gephyrin for homozygous shaky animals compared to wild type. The mutant GlyR- 𝛼1 subunit exhibited enhanced expression at the surface in isolated spinal cord neurons from shaky animals. Results from spinal cord tissues supported these findings from primary neurons. Examination of presynapses revealed significantly decreased synapsin and synapsin/ 𝛼1 expression for Glrb eos/eos x Glra1 sh/sh.

The results of this study extend the data of previous studies on the shaky mouse, showing a severe loss of synaptic GlyR 𝛼1/𝛽 at the surface of motor neurons. A potential compensatory attempt through increased α1 expression remains unsuccessful with a lethal outcome due to the functional impairment of these mutated GlyR 𝛼1 receptors. Previous studies have suggested that the mutation in the extracellular binding site is able to transduce conformational changes in the TM3-TM4 loop structure, thereby disrupting gephyrin binding and synaptic integration. The data in this study support this hypothesis and furthermore indicate a disrupted receptor complex binding. The present study thus contributes to a better understanding of Startle disease at the synaptic level.
KW  - Glycinrezeptor
KW  - glycine receptor
KW  - shaky mouse
KW  - startle disease
KW  - Hyperekplexie
KW  - Mausmodell
KW  - inhibitory snapse
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348328
ER  - 
TY  - THES
A1  - Drehmann, Paul
T1  - SLC7A10 als neues Gen für humane Hyperekplexie
T1  - SLC7A10 - a novel candidate gene for human hyperekplexia
N2  - Neuste Studien haben ergeben, dass Asc-1 Knock-out Mäuse aufgrund einer verminderten intrazellulären Glycinkonzentration in synaptischen Boutons im Gehirn, einen Hyperekplexie-ähnlichen Phänotyp entwickeln. Aufgrund nicht vollständig geklärter Ursachen für die Entstehung des Krankheitsbildes der Hyperekplexie beim Menschen, wurde eine Kohorte von 51 Patienten zusammengetragen, um vor dem Hintergrund der Forschungsergebnisse zu Asc-1 im Tiermodell, das kodierende Gen beim Menschen SLC7A10 als mögliches Kandidatengen auf Sequenzalterationen zu untersuchen. Hierfür wurde aus Vollblut der an Hyperekplexie erkrankten Patienten genomische DNA isoliert, um mittels PCR und anschließendem Screening der Sequenzen, Mutationen innerhalb funktionell wichtiger Bereiche des Gens zu eruieren. Neben weiteren Sequenzunterschieden, die meist in Introns gefunden wurden, wurde die codierende Mutation G307R innerhalb von Exon 7 identifiziert, die letztendlich der Grund für eine Versuchsreihe war, um zu hinterfragen, ob dieser Aminosäureaustausch in der Proteinsequenz funktionelle Konsequenzen zur Folge hat. HEK293-Zellen wurden mit dem zuvor hergestellten Klon G307R transfiziert, um über Biotinylierung, immuncytochemische Färbungen und funktionelle Untersuchungen die Aktivität des Transporters zu beurteilen. Hier zeigte sich ein Funktionsverlust von über 95 %, bei uneingeschränkter Oberflächenexpression. ASC-1 bestätigt sich damit als neue Ursache in der Ausprägung von Hyperekplexie. Ferner können Zusammenhänge mit geistiger Retardierung und eingeschränkter neuronaler Plastizität bestehen.
N2  - Recent studies have shown that Asc-1 knock-out mice leads to reduced intracellular glycine concentration in synaptic boutons in the brain followed by a development of a hyperekplexia-like phenotype. In humans, the underlying cause for hyperekplexia is not complexly understood. Based on findings in the Asc-1 knockout mouse model, a patient cohort of 51 patients was used to identify possible sequence alterations in the corresponding Gen SLC7A10 as a novel candidate gene for human hyperekplexia.
For this purpose, genomic DNA was extracted from blood samples of patients suffering from hyperekplexia to identify mutations within functionally important areas of the gene by means of PCR and subsequent analyses of the determined sequences. Besides other sequence alterations mainly in introns, the coding mutation G307R within exon 7 was identified and used to investigate functional consequences of this amino acid exchange in an experimental series. The clone ACS-1 G307R was transfected into HEK293 cells to assess the activity of the transporter via biotinylation, immunocytochemical stainings, and functional uptake assays. Our results showed an almost loss of function with more than 95 % reduction in the transport activity although surface expression was unaffected. In conclusion, the ASC-1 mutation was confirmed as a novel cause for human hyperekplexia. In addition, mental retardation and restricted neuronal plasticity might play a role during disease manifestation.
KW  - Knockout
KW  - Glycin
KW  - Aminosäuren
KW  - Nervenzelle
KW  - SLC7A10
KW  - Hyperekplexie
KW  - ASC-1
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-159736
ER  -