TY - THES A1 - Herrmann, Ruth Magdalena T1 - Molekular- und zellbiologische Untersuchung zur Rolle des kanonischen Wnt-Signalwegs bei der Entwicklung von \(Echinococcus\) \(multilocularis\) T1 - Molecular and cell biological investigations on the role of canonical Wnt signaling in \(E.\) \(multilocularis\) development N2 - Die alveoläre Echinokokkose (AE) ist eine lebensbedrohliche Erkrankung des Menschen, welche durch das infiltrative Wachstum des Metazestoden-Larvenstadiums des Fuchsbandwurms (Echinococcus multilocularis) in der Leber verursacht wird. Das tumorartige Wachstum des Metazestoden beruht auf einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der anterior-posterioren-Körperachse (AP Achse). Es wird vermutet, dass dabei der anteriore Pol der invadierenden Oncospären-Larve zunächst abgeschaltet wird und sich der Metazestode anschließend asexuell als vesikuläres, posteriorisiertes Gewebes im Wirt vermehrt. Nach massiver Proliferation wird der anteriore Pol reetabliert und führt zur Bildung zahlreicher Bandwurm-Kopfanlagen (Protoskolizes). Da die Ausbildung der AP Körperachse evolutionsgeschichtlich konserviert über den wingless-related (Wnt)-Signalweg gesteuert wird, wurde in dieser Arbeit die Rolle von Wnt-Signaling bei der Musterbildung von E. multilocularis über molekular- und zellbiologische Studien näher beleuchtet. Zentraler methodischer Ansatz der vorliegenden Arbeit war ein E. multilocularis Stammzell-Kultursystem, das Primärzellsystem, welches die in vitro-Generierung von Metazestoden-Vesikeln durch Proliferation und Differenzierung von germinativen Zellen (Stammzellen) erlaubt. Über RNA-Sequenzierung wurde zunächst gezeigt, dass in Primärzellkulturen sowohl Markergene für posteriore Entwicklung in Richtung Metazestode wie auch für Anterior-und Protoskolexmarker exprimiert werden. Unter Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) wurde anschließend ein erfolgreicher Knockdown des vermuteten Hauptregulators des kanonischen Wnt-Signalwegs, β Catenin (em-bcat1), erreicht und führte zu einem charakteristischen, sogenannten ‚red dot‘ Phänotyp, dem ersten jemals beschriebenen RNAi Phänotyp für E. multilocularis-Primärzellen. Primärzellkulturen nach em-bcat1 RNAi zeigten eine stark verminderte Fähigkeit, Metazestoden-Vesikel zu bilden sowie eine Überproliferation von germinativen Zellen. Zusätzliche RNA-Seq-Analysen des Transkriptoms von RNAi(em-bcat1)-Kulturen zeigten eine signifikant verringerte Expression von Posterior- und Metazestodenmarkern, während Anterior- und Protoskolexmarker deutlich überexprimiert wurden. Durch umfangreiche Whole-mount-in-situ-Hybridisierung (WMISH)-Experimente wurden diese Daten für eine Reihe ausgewählter Markergene für posteriore (Metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) und für anteriore Entwicklung (Protoskolex; em sfrp, em-nou-darake, em npp36, em-frizzled10) verifiziert. In allen genannten Fällen zeigte sich durch Änderung der Polarität eine verminderte Genexpression von Posteriormarkern, während Anteriormarker deutlich erhöht exprimiert wurden. Ähnlich wie bei den verwandten, freilebenden Planarien, führt demnach ein Knockdown des zentralen Wnt-Regulators β-Catenin bei E. multilocularis zu einer anteriorisierten, Anterior- und Protoskolexmarker dominierte Genexpression, welche der posteriorisierten Entwicklung zum Metazestoden entgegenwirkt. Neben Markergenen für die Ausbildung der AP-Achse wurden in dieser Arbeit auch solche für die medio-laterale (ML)-Körperachse bei Zestoden erstmals beschrieben. So zeigte sich, dass ein Slit-Ortholog (em slit) im E. multilocularis Protoskolex im Bereich der Körper-Mittellinie exprimiert wird und lieferte Hinweise darauf, dass, ähnlich zur Situation bei Planarien, die ML Achse von E. multilocularis durch Morphogengradienten aus slit (Mittellinie) und wnt5 (lateral) definiert wird. Im Metazestoden wird hingegen nur em-slit exprimiert. Der Metazestode besitzt damit als posterior-medianisiertes Gewebe Anlagen zur Polarität zur AP- und ML-Achse, welche erst mit Bildung von Protoskolizes vollständig etabliert werden. Schließlich deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass bei der Wiederherstellung der Körperachsen während der Entwicklung von Protoskolizes Hedgehog (Hh)-Signale entscheidend mitwirken. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit der zentrale Faktor des kanonischen Wnt Signalwegs, β-Catenin, als Hauptregulator der Entwicklung des tumorartig wachsenden E. multilocularis-Metazestoden identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass zur Metazestodenbildung neben einer Echinococcus-spezifischen Modifikation der AP Körperachse auch eine solche der ML Achse beiträgt. In humanen malignen Tumoren sind der Wnt-, Slit-Robo- und Hh-Signalweg gut erforschte Wirkstofftargets und könnten in Zukunft in ähnlicher Weise für eine zielgerichtete Therapie von AE dienen. N2 - Alveolar echinococcosis (AE) is a life-threatening human disease caused by the infiltrative growth of the metacestode larval stage of the fox tapeworm (Echinococcus multilocularis) within the host liver. According to previous research, the tumor-like growth of the metacestode is due to an Echinococcus-specific modification of the anterior-posterior (AP)-body axis formation. It is thus assumed that the invading oncosphere larva transiently represses the anterior pole, giving rise to metacestode vesicles which proliferate within the host as posteriorized tissue. Upon massive proliferation, the anterior pole is re-established at numerous sites within the metacestode tissue, yielding large numbers of tapeworm heads (protoscoleces). Since the formation of the AP-body axis is evolutionarily conserved and regulated by canonical wingless-related (Wnt) signaling, the present work investigated in detail the role of the Wnt-pathway in Echinococcus metacestode formation via molecular and cell biological studies. Methodologically, this work focussed on an Echinococcus stem cell cultivation system, called the primary cell system, which allows the in-vitro generation of mature metacestode vesicles through proliferation and differentiation of germinative cells (stem cells). By genome-wide RNA-Seq transcriptomics it is shown that primary cell cultures express marker genes for both posterior development towards the metacestode as well as anterior development of head organizers. By RNA interference (RNAi), successful knockdown of the presumed central regulator of canonical Wnt-signaling, β-catenin (em-bcat1), was achieved, yielding a striking phenotype ('red dot'), the first RNAi phenotype described for E. multilocularis primary cells. Primary cell cultures after em-bcat1 RNAi showed a greatly reduced ability to form metacestode vesicles as well as an overproliferation of germinative cells. Additional RNA-Seq analysis of the transcriptome of RNAi(em-bcat1) cultures indicated significantly decreased expression of posterior and metacestode markers whereas anterior and protoscolex markers were markedly overexpressed. These data were verified using whole-mount-in-situ-hybridization (WMISH) for several selected marker genes for posterior (metazestode; em-wnt1, em-wnt11b, em-muc1) and for anterior development (protoscolex; em-sfrp, em-nou-darake, em npp36, em frizzled10). In all cases, a change in polarity showed decreased gene expression of posterior markers whereas anterior markers were significantly increased in expression. Similar to the situation in related planarians, knockdown of β Catenin in E. multilocularis lead in anteriorized, anterior- and protoscolex marker-dominated gene expression and antagonized the formation of the posteriorized metacestode. In addition to marker genes for AP-axis formation, this work also established marker genes for the medio-lateral (ML)-body axis in cestodes for the first time. In particular, a slit orthologue (em slit) was shown to be expressed in the E. multilocularis protoscolex at the body midline and provided evidence that, similar to the situation in planarians, the ML-axis of E. multilocularis is defined by morphogen gradients consisting of slit (midline) and wnt5 (lateral). In contrast, only em-slit is expressed in the metacestode. Thus, the metacestode tissue is indeed posterior-medianized and the AP- and ML-axes are established only with formation of protoscoleces. Finally, the results of this work suggest that Hedgehog (Hh) signaling plays a critical role in the reestablishment of body axes during protoscoleces development. In conclusion, this work identified the central regulator of the canonical Wnt-signaling pathway, β-catenin, as a master regulator of E. multilocularis metacestode development. Furthermore, it is herein established that metacestode formation not only involves Echinococcus-specific modification of the AP-axis but also of the ML-axis. In human malignant tumors, the Wnt, Slit-Robo, and Hh-pathway are well-studied drug targets and may similarly serve for AE targeted therapy in the future. KW - Fuchsbandwurm KW - Transkriptomanalyse KW - foxtapeworm KW - Echinococcus KW - Wnt-Signalweg KW - Körperachsen KW - Germinative Zellen KW - beta-Catenin KW - Wnt-pathway KW - body axis KW - Stammzelle Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-271937 ER - TY - THES A1 - Reis, Helena T1 - Characterization of telomere protein complexes in Trypanosoma brucei T1 - Charakterisierung von telomerischen Proteinkomplexen in Trypanosoma brucei N2 - African trypanosomiasis is a disease endemic to sub-Saharan Africa. It affects humans as well as wild and domestic animals. The human form of the disease is known as sleeping sickness and the animal form as nagana, which are usually fatal if left untreated. The cause of African trypanosomiasis is the unicellular parasite Trypanosoma brucei. During its life cycle, Trypanosoma brucei shuttles between a mammalian host and the tsetse fly vector. In the mammalian host the parasite multiplies as bloodstream form (BSF) extracellularly in the bloodstream or the lymphatic system. Survival of BSF parasites relies on immune evasion by antigenic variation of surface proteins because its extracellular lifestyle leads to direct exposure to immune responses. At any given time each BSF cell expresses a single type of variant surface glycoprotein (VSG) on its surface from a large repertoire. The active VSG is transcribed from one of 15 specialized subtelomeric domains, termed bloodstream expression sites (BESs). The remaining 14 BESs are silenced. This monoallelic expression and periodic switching of the expressed VSG enables to escape the immune response and to establish a persistent infection in the mammalian host. During developmental differentiation from BSF to the insect vector-resident procyclic form (PCF), the active BES is transcriptionally silenced to stop VSG transcription. Thus, all 15 BESs are inactive in the PCF cells as surface protein expression is developmentally regulated. Previous reports have shown that the telomere complex components TbTRF, TbRAP1 and TbTIF2 are involved in VSG transcriptional regulation. However, the precise nature of their contribution remains unclear. In addition, no information is available about the role of telomeres in the initiation and regulation of developmental BES silencing. To gain insights into the regulatory mechanisms of telomeres on VSG transcription and developmental repression it is therefore essential to identify the complete composition of the trypanosome telomere complex. To this end, we used two complementary biochemical approaches and quantitative label-free interactomics to determine the composition of telomere protein complexes in T. brucei. Firstly, using a telomeric pull-down assay we found 17 potential telomere-binding proteins including the known telomere-binding proteins TbTRF and TbTIF2. Secondly, by performing a co-immunoprecipitation experiment to elucidate TbTRF interactions we co-purified five proteins. All of these five proteins were also enriched with telomeric DNA in the pull-down assay. To validate these data, I characterized one of the proteins found in both experiments (TelBP1). In BSF cells, TelBP1 co-localizes with TbTRF and interacts with already described telomere-binding proteins such as TbTRF, TbTIF2 and TbRAP1 indicating that TelBP1 is a novel component of the telomere complex in trypanosomes. Interestingly, protein interaction studies in PCF cells suggested a different telomere complex composition compared to BSF cells. In contrast to known members of the telomere complex, TelBP1 is dispensable for cell viability indicating that its function might be uncoupled from the known telomere-binding proteins. Overexpression of TelBP1 had also no effect on cell viability, but led to the discovery of two additional shorter isoforms of TelBP1. However, their source and function remained elusive. Although TelBP1 is not essential for cell viability, western blot analysis revealed a 4-fold upregulation of TelBP1 in the BSF stage compared to the PCF stage supporting the concept of a dynamic telomere complex composition. We observed that TelBP1 influences the kinetics of transcriptional BES silencing during developmental transition from BSF to PCF. Deletion of TelBP1 caused faster BES silencing compared to wild-type parasites. Taken together, TelBP1 function illustrates that developmental BES silencing is a fine-tuned process, which involves stage-specific changes in telomere complex formation. N2 - Afrikanische Trypanosomiasis ist eine Krankheit, die in Afrika südlich der Sahara endemisch vorkommt und sowohl Menschen als auch Wild- und Haustiere betrifft. Die menschliche Form der Krankheit ist als Schlafkrankheit und die Tierform als Nagana bekannt. Ohne Behandlung verläuft die Krankheit in der Regel tödlich. Der einzellige Parasit Trypanosoma brucei ist die Ursache dieser Krankheit. Während seines Lebenszyklus bewegt sich der Parasit zwischen einem Säugetierwirt und einem Insektenvektor, der Tsetsefliege. Im Säugetierwirt vermehrt sich der Parasit als Blutstromform (BSF) extrazellulär im Blutkreislauf und im Lymphsystem. Das Fortbestehen der BSF-Parasiten im Wirt beruht auf einer Immunausweichstrategie durch antigene Variation der Oberflächenproteine. Diese Abwehrstrategie ist erforderlich, da der Parasit durch seinen extrazellulären Lebensstil direkt der Immunantwort ausgesetzt ist. Zu jedem Zeitpunkt wird nur ein variables Oberflächenprotein (VSG) auf der Zelloberfläche aus einem großen Repertoire exprimiert. Dabei wird das aktive VSG von einer von 15 spezialisierten telomerproximalen Transkriptionseinheiten transkribiert, den sogenannten Blutstromform Expression Sites (BESs). Die restlichen 14 BESs sind inaktiv. Diese monoallelische Expression und das periodische Wechseln des exprimierten VSG ermöglichen dem Parasiten der Immunantwort zu entgehen und eine persistente Infektion im Säugetierwirt zu etablieren. Während der Differenzierung von BSF zur Insektenvektor-residenten prozyklischen Form (PCF) wird die aktive BES transkriptionell herunter reguliert um die VSG-Transkription zu stoppen. Somit sind alle 15 BESs in PCF-Zellen inaktiv, da die Expression von Oberflächenproteinen stadienspezifisch reguliert ist. Frühere Veröffentlichungen haben gezeigt, dass die Proteine TbTRF, TbRAP1 und TbTIF2 des Telomerkomplexes an der Transkriptionsregulation von VSG-Genen beteiligt sind. Es ist jedoch unklar, wie genau sie zur Regulation beitragen. Darüber hinaus gibt es keine Informationen über die Rolle von Telomeren bei der Initiation und Regulation der BES-Inaktivierung während der Differenzierung. Um Einblicke in die regulatorischen Mechanismen von Telomeren auf die VSG-Transkription und differenzierungsbedingte Repression der aktiven BES zu gewinnen, ist es daher notwendig, die vollständige Zusammensetzung der Telomerkomplexe in Trypanosomen zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurden zwei komplementäre biochemische Ansätze und quantitative Massenspektrometrie genutzt um die Zusammensetzung von Telomerproteinkomplexen in T. brucei zu bestimmen. Zunächst wurden mittels einer Affinitätschromatographie mit TTAGGG-Oligonukleotiden 17 potentielle telomerbindende Proteine gefunden. Darunter waren auch die bereits bekannten telomerbindenden Proteine TbTRF und TbTIF2. Zweitens wurde mit Hilfe eines Co-Immunpräzipitationsexperiments um die Interaktionen von TbTRF aufzuklären, fünf Proteine aufgereinigt. Alle diese fünf Proteine wurden auch mit telomerischer DNA in der Affinitätschromatographie angereichert. Um diese Daten zu validieren, wurde eines der in beiden Experimenten gefundenen Proteine (TelBP1) charakterisiert. In BSF-Zellen co-lokalisiert TelBP1 mit TbTRF und interagiert mit bereits beschriebenen telomerbindenden Proteinen wie TbTRF, TbTIF2 und TbRAP1. Dies deutet darauf, dass TelBP1 eine weitere Komponente des Telomerkomplexes in Trypanosomen ist. Interessanterweise deuteten Proteininteraktionsstudien in PCF-Zellen auf eine andere Zusammensetzung des Telomerkomplexes im Vergleich zu BSF-Zellen. Im Gegensatz zu den bekannten Mitgliedern des Telomerkomplexes ist TelBP1 für das Zellwachstum nicht essentiell. Damit könnte die Funktion von TelBP1 von den bekannten telomerbindenden Proteinen entkoppelt sein. Die Überexpression von TelBP1 zeigte auch keinen Einfluss auf das Zellwachstum, führte aber zur Entdeckung von zwei weiteren kürzeren Isoformen von TelBP1. Ihr Ursprung und Funktion blieben jedoch ungeklärt. Obwohl TelBP1 für das Zellwachstum entbehrlich ist, zeigten Westernblot-Analysen eine 4-fache Hochregulierung von TelBP1 in BSF-Zellen im Vergleich zu PCF-Zellen. Die stadienspezifische Regulation von TelBP1 unterstützt damit das Konzept von einer dynamischen Zusammensetzung der Telomerkomplexe. Zudem wurde beobachtet, dass TelBP1 die Kinetik der Inaktivierung der aktiven BES während der Differenzierung von der BSF zur PCF beeinflusst. Die Deletion von TelBP1 führte zu einem schnelleren Abschalten der BES im Vergleich zu Wildtyp-Parasiten. Zusammengefasst zeigt die Funktion von TelBP1, dass das Abschalten der aktiven BES während der Differenzierung ein fein abgestimmter Prozess ist, der stadienspezifische Veränderungen der Telomerkomplexe beinhaltet. KW - Trypanosoma brucei KW - Genexpression KW - Telomer KW - telomere-binding protein KW - chromatin remodeling KW - developmental differentiation Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151323 ER - TY - THES A1 - Cicova, Zdenka T1 - Characterization of a novel putative factor involved in host adaptation in Trypanosoma brucei T1 - Charakterisierung einer neuen Komponente für die Wirtsanpassung in Trypanosoma brucei N2 - Trypanosomes are masters of adaptation to different host environments during their complex life cycle. Large-scale proteomic approaches provide information on changes at the cellular level in a systematic way. However, a detailed work on single components is necessary to understand the adaptation mechanisms on a molecular level. Here we have performed a detailed characterization of a bloodstream form (BSF) stage-specific putative flagellar host adaptation factor (Tb927.11.2400) identified previously in a SILAC-based comparative proteome study. Tb927.11.2400 shares 38% amino acid identity with TbFlabarin (Tb927.11.2410), a procyclic form (PCF) stage specific flagellar BAR domain protein. We named Tb927.11.2400 TbFlabarin like (TbFlabarinL) and demonstrate that it is a result of a gene duplication event, which occurred in African trypanosomes. TbFlabarinL is not essential for growth of the parasites under cell culture conditions and it is dispensable for developmental differentiation from BSF to the PCF in vitro. We generated a TbFlabarinL-specific antibody and showed that it localizes in the flagellum. The co-immunoprecipitation experiment together with a biochemical cell fractionation indicated a dual association of TbFlabarinL with the flagellar membrane and the components of the paraflagellar rod. N2 - Trypansomen zeigen sich im Laufe ihres komplexen Lebeszyklus als Meister der Adaption an verschiedene Umweltbedingungen ihrer Wirte. Umfangreiche proteomische Analysen geben systematisch Auskunft über Änderungen auf zellulärer Ebene. Detailierte Arbeit an einzelnen Komponenten ist jedoch nötig, um die Adaptionsmechanismen auf molekularer Ebene zu verstehen. Wir haben im Rahmen dieser Arbeit eine detaillierte Charakterisierung eines stadienspezifischen mutmaßlich flagellaren Wirtsadaptionsfaktors der Blutstromform (BSF) durchgeführt (Tb927.11.2400), der zuvor in einer SILAC-basierten vergleichenden Proteomstudie idendifiziert wurde. Tb927.11.2400 teilt 38% der mit TbFlabarin (Tb927.11.2410), eines stadienspezifischen flagellaren BAR- domänen Proteins der prozyklischen Form (PCF). Wir haben Tb927.11.2400 TbFlabarin like (TbFlabarinL) genannt und zeigen, dass es das Ergebnis eines Genduplikations-Ereignisses darstellt, das in afrikanischen Trypanosomen aufgetreten ist. TbFlabarinL ist nicht essentiell für das Wachstum der Parasiten unter Zellkultur-Bedingungen und entbehrlich für den Differenzierungprozess von BSF zu PCF in vitro. Wir haben einen TbFlabarinL-spezifischen Antikörper entwickelt und zeigen, dass er in der Flagelle lokalisiert. Das Co-immunoprezipitations-Experiment deutet zusammen mit einer biochemischen Zellfraktionierung darauf hin, dass TbFlabarinL mit der flagellaren Membran und Komponenten der paraflagellaren Stab binär assoziiert ist. KW - Trypanosoma brucei KW - Wirt KW - Anpassung KW - stage specific regulation KW - Geißel KW - flagellum KW - Flabarin Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142462 ER - TY - THES A1 - Mattern, Felix T1 - Alterungsbedingte Effekte auf DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen am Modellorganismus Bos taurus T1 - Aging-induced effects on DNA methylation profiles of developmental genes in oocytes and embryos on the model organism Bos taurus N2 - Die postovulatorische Alterung sowie die ovarielle Alterung konnten bei der Anwendung assistierter Reproduktionstechniken (ARTs) als entscheidende Faktoren identifiziert werden, die den Reproduktionserfolg nachhaltig beeinträchtigen. Die postovulatorische Alterung tritt ein, sobald die reife Eizelle nicht mehr innerhalb ihres physiologischen Zeitfensters befruchtet wird. Die ovarielle Alterung beschreibt hingegen die Abnahme des Follikel-Vorrats mit zunehmendem Alter des weiblichen Individuums bzw. des Ovars. Sowohl die postovulatorische Alterung als auch die ovarielle Alterung führen u.a. zu einer reduzierten Oozytenqualität und einer geringeren Blastozystenrate. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin, den Einfluss der postovulatorischen Alterung und der ovariellen Alterung im Holstein-Rind (Bos taurus) auf die DNA-Methylierung entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen zu untersuchen. Aus Schlachthof-Ovarien wurden Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) isoliert. Eizellen aus Follikeln der Größe 3-5 mm wurden für 24h (physiologisch) und 48h (gealtert) in vitro gereift (IVM). Die gereiften Oozyten wurden anschließend in vitro fertilisiert und Embryonen im 4-6 Zellstadium generiert. Sowohl in den unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe als auch in den gereiften Oozyten und den Embryonen wurde die Promotormethylierung der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls analysiert. Zur Untersuchung der ovariellen Alterung wurden mittelgroßen Antralfollikel aus Ovarien lebender Rinder (in vivo) unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) gewonnen. In den daraus isolierten unreifen Eizellen wurde die DNA-Methylierung der Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN bestimmt. Als Methode zur Analyse der Promotormethylierung wurde die Limiting Dilution Bisulfit-Sequenzierung angewendet. In unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) konnte ein erhöhtes Auftreten abnormal methylierter Allele in den geprägten Genen bH19 und bSNRPN von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) identifiziert werden. Dieses Ergebnis könnte eine mögliche Ursache einer bereits bekannten und mehrfach beschriebenen geringeren Entwicklungskompetenz von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) auf epigenetischer Ebene darstellen. Die verlängerte Reifungsdauer der IVM-Eizellen hatte eine signifikante Hypermethylierung in der Promotorregion des Gens DNMT3Lo von 48h-gereiften Eizellen zur Folge. Beim Übergang von 48h-gereiften Eizellen zum Embryo konnte eine signifikante Hypomethylierung von CpG7 des stammzellspezifischen Transkripts DNMT3Ls beobachtet werden. Diese CpG-Stelle wies ebenfalls einen signifikanten Anstieg von CpGs mit nicht-eindeutigem Methylierungszustand in unreifen Eizellen mit steigender Follikelgröße auf. Da sich die CpG-Position innerhalb eines Sequenz-Motivs einer Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors CREB befindet, könnten die Methylierungsdaten auf eine Interaktion zwischen dem Transkriptionsfaktor CREB und der DNA-Methylierung während der Entwicklung und Reifung der Eizelle sowie der Transition von der Eizelle zum Embryo hindeuten. Die DNA-Methylierungsprofile der untersuchten Gene in unreifen Eizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen auf. Die ovarielle Alterung bei Rindern zwischen 9 Monaten und 11 Jahren zeigte damit keinen Effekt auf die DNA-Methylierung der untersuchten Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN. Nach einer simulierten postovulatorischen Alterung durch eine in vitro Reifung für 48h konnte eine Veränderung der DNA-Methylierung der Oozyten-spezifischen (DNMT3Lo) und Stammzell-spezifischen (DNMT3Ls) Promotoren des katalytisch inaktiven Cofaktors von DNMT3A, DNMT3L, beobachtet werden. Die veränderte DNA-Methylierung von DNMT3Ls tritt dabei erst im frühen Embryo in Erscheinung und interagiert vermutlich mit dem Transkriptionsfaktor CREB. Die Veränderungen von DNMT3Lo in Eizellen und DNMT3Ls in den daraus generierten Embryonen lässt vermuten, dass es sich hierbei um eine dynamische Anpassung des Embryos auf äußere Umweltbedingungen der Eizelle über die Methylierung der DNA handelt. N2 - Postovulatory aging and ovarian aging have been identified as key factors in assisted reproductive techniques (ARTs) and have a lasting effect on reproductive success. Postovulatory aging occurs if the mature egg is not fertilized within its physiological time window. On the other hand, ovarian aging describes the decrease in the follicular reserve with increasing age of the female or the ovary, respectively. Both post-ovulatory aging and ovarian aging result in reduced oocyte quality and lower blastocyst rate. The aim of this thesis was to explore the effects of postovulatory aging and ovarian aging in Holstein cattle (Bos taurus) on the DNA methylation of developmentally important genes in oocytes and embryos. Antral follicles of different sizes (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) were isolated from slaughterhouse ovaries. Female germ cells from middle-sized follicles (3-5 mm) were matured for 24h (physiological conditions) and 48h (aged conditions) in vitro (IVM). The IVM- oocytes were subsequently fertilized in vitro and embryos at the 4-6 cell stage were generated. Promoter methylation of the genes bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo and bDNMT3Ls was analysed in immature oocytes from antral follicles of different sizes as well as in matured oocytes and the respective embryos. For studying ovarian aging, middle-sized antral follicles were obtained in vivo from animals of different age groups (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years). In the extracted immature gametes, the DNA methylation of the promoter regions of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN was examined. The limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing method was applied to determine the promoter methylation of the candidate genes at the single allele level. In immature oocytes from antral follicles of different diameters (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) an increased occurrence of abnormally methylated alleles of the imprinted genes bH19 and bSNRPN was identified in small follicles (<2 mm). This failure to establish imprinting could be a possible cause of a well-known reduced developmental potential of small follicles (<2 mm) at the epigenetic level. The extended maturation time of the IVM-oocytes resulted in a significant hypermethylation in the promoter region of DNMT3Lo in 48h matured oocytes. After transition from 48h matured oocytes to embryos, a significant hypomethylation of CpG7 of the stem cell specific transcript DNMT3Ls was detected. The same CpG site showed a significant increase of CpGs with unclear methylation state in immature female germ cells with increasing follicular size. This CpG position is located within a potential binding site of the transcription factor CREB. Thus, the methylation data indicates an interaction between the transcription factor CREB and the DNA methylation during development and maturation of oocytes as well as during transition from the oocyte to the embryo. The DNA methylation profiles of the analysed genes in immature oocytes from cows of different age (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years) showed no significant differences between age groups. Hence, the ovarian aging in cattle between 9 months and 11 years caused no effect on the DNA methylation of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN. After a simulated postovulatory aging by in vitro maturation for 48h, a change in the DNA methylation of the oocyte-specific (DNMT3Lo) and stem cell-specific (DNMT3Ls) promoters of the catalytically inactive DNA-methyltransferase DNMT3L was observed. The altered DNA methylation of DNMT3Ls occurs in the early embryo and probably interacts with the transcription factor CREB. The changes of DNMT3Lo in oocytes and DNMT3Ls in the resulting embryos might represent a dynamic adaptation to external environmental conditions. KW - Oozyte KW - Epigenetik KW - Altern KW - DNS-Methyltransferase KW - Ovarielle Alterung KW - Postovulatorische Alterung KW - Antralfollikel KW - Holstein Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144562 ER - TY - THES A1 - Mekala, SubbaRao T1 - Generation of cardiomyocytes from vessel wall-resident stem cells T1 - Erzeugung von Kardiomyozyten aus Gefäßwand-residenten Stammzellen N2 - Myocardial infarction (MI) is a major cause of health problems and is among the leading deadly ending diseases. Accordingly, regenerating functional myocardial tissue and/or cardiac repair by stem cells is one of the most desired aims worldwide. Indeed, the human heart serves as an ideal target for regenerative intervention, because the capacity of the adult myocardium to restore itself after injury or infarct is limited. Thus, identifying new sources of tissue resident adult stem or progenitor cells with cardiovascular potential would help to establish more sophisticated therapies in order to either prevent cardiac failure or to achieve a functional repair. Ongoing research worldwide in this field is focusing on a) induced pluripotent stem (iPS) cells, b) embryonic stem (ES) cells and c) adult stem cells (e. g. mesenchymal stem cells) as well as cardiac fibroblasts or myofibroblasts. However, thus far, these efforts did not result in therapeutic strategies that were transferable into the clinical management of MI and heart failure. Hence, identifying endogenous and more cardiac-related sources of stem cells capable of differentiating into mature cardiomyocytes would open promising new therapeutic opportunities. The working hypothesis of this thesis is that the vascular wall serves as a niche for cardiogenic stem cells. In recent years, various groups have identified different types of progenitors or mesenchymal stem cell-like cells in the adventitia and sub-endothelial zone of the adult vessel wall, the so called vessel wall-resident stem cells (VW-SCs). Considering the fact that heart muscle tissue contains blood vessels in very high density, the physiological relevance of VW-SCs for the myocardium can as yet only be assumed. The aim of the present work is to study whether a subset of VW-SCs might have the capacity to differentiate into cardiomyocyte-like cells. This assumption was challenged using adult mouse aorta-derived cells cultivated in different media and treated with selected factors. The presented results reveal the generation of spontaneously beating cardiomyocyte-like cells using specific media conditions without any genetic manipulation. The cells reproducibly started beating at culture days 8-10. Further analyses revealed that in contrast to several publications reporting the Sca-1+ cells as cardiac progenitors the Sca-1- fraction of aortic wall-derived VW-SCs reproducibly delivered beating cells in culture. Similar to mature cardiomyocytes the beating cells developed sarcomeric structures indicated by the typical cross striated staining pattern upon immunofluorescence analysis detecting α-sarcomeric actinin (α-SRA) and electron microscopic analysis. These analyses also showed the formation of sarcoplasmic reticulum which serves as calcium store. Correspondingly, the aortic wall-derived beating cardiomyocyte-like cells (Ao-bCMs) exhibited calcium oscillations. This differentiation seems to be dependent on an inflammatory microenvironment since depletion of VW-SC-derived macrophages by treatment with clodronate liposomes in vitro stopped the generation of Ao bCMs. These locally generated F4/80+ macrophages exhibit high levels of VEGF (vascular endothelial growth factor). To a great majority, VW-SCs were found to be positive for VEGFR-2 and blocking this receptor also stopped the generation VW-SC-derived beating cells in vitro. Furthermore, the treatment of aortic wall-derived cells with the ß-receptor agonist isoproterenol or the antagonist propranolol resulted in a significant increase or decrease of beating frequency. Finally, fluorescently labeled aortic wall-derived cells were implanted into the developing chick embryo heart field where they became positive for α-SRA two days after implantation. The current data strongly suggest that VW-SCs resident in the vascular adventitia deliver both progenitors for an inflammatory microenvironment and beating cells. The present study identifies that the Sca-1- rather than Sca-1+ fraction of mouse aortic wall-derived cells harbors VW-SCs differentiating into cardiomyocyte-like cells and reveals an essential role of VW-SCs-derived inflammatory macrophages and VEGF-signaling in this process. Furthermore, this study demonstrates the cardiogenic capacity of aortic VW-SCs in vivo using a chimeric chick embryonic model. N2 - Der Myokardinfarkt (MI) ist einer der Hauptgründe für gesundheitliche Probleme und zählt zu einer der am häufigsten tödlich verlaufenden Krankheiten weltweit. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Regeneration von funktionellem Myokardgewebe und/oder die kardiale Reparatur durch Stammzellen eines der weltweit am meisten angestrebten Ziele darstellt. Das adulte menschliche Herz stellt aufgrund seiner äußerst eingeschränkten endogenen Regenerationskapazität, die bei weitem nicht ausreicht, das geschädigte Gewebe zu erneuern, ein ideales Zielorgan für regenerative Therapieverfahren dar. Folglich könnte die Identifizierung neuer Quellen adulter Stamm- oder Vorläuferzellen mit kardiovaskulärem Differenzierungspotential dabei helfen, verfeinerte Therapien zu entwickeln, um entweder kardiale Fehlfunktionen zu verhindern oder eine deutlich verbesserte myokardiale Reparatur zu erreichen. Die aktuelle weltweite Forschung auf diesem Gebiet fokussiert sich auf: a) induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), b) embryonale Stammzellen (ES) und c) adulte Stammzellen, wie z. B. mesenchymale Stammzellen, kardiale Fibroblasten und Mesangioblasten sowie Myofibroblasten. Bisher haben jedoch alle Bemühungen noch zu keinem Durchbruch geführt, so dass die teilweise vielversprechenden experimentellen Ergebnisse nicht in die klinische Therapie des MI und der kardialen Defekte mittels Stammzellen transferiert werden können. Abgesehen davon, ob und wie stark so ein endogenes herzeigenes Potential wäre, würde die Identifizierung neuer endogener Stammzellen mit kardiogenem Potential, die genaue Charakterisierung ihrer Nischen und der Mechanismen ihrer Differenzierung einen Meilenstein in der kardioregenerativen Stammzelltherapie darstellen. Die Arbeitshypothese der hier vorgelegten Dissertation besagt, dass die Gefäßwand als Nische solcher Zellen dienen könnte. Innerhalb der letzten Jahre konnte die Adventitia und die subendotheliale Zone der adulten Gefäßwand als Nische für unterschiedliche Typen von Vorläuferzellen und multipotenten Stammzellen, die sogenannten Gefäßwand-residenten Stammzellen (VW-SCs) identifiziert werden. In Anbetracht der Tatsache, dass die Blutgefäße aufgrund ihrer hohen Dichte im Herzen eine essentielle stromale Komponente des Herzgewebes darstellen, kann die mögliche klinische Relevanz von VW-SCs für das Myokardium im Moment nur erahnt werden. Ausgehend von der Annahme, dass eine Subpopulation dieser VW-SCs die Fähigkeit besitzt, sich in Kardiomyozyten-ähnliche Zellen zu differenzieren, sollte im Rahmen dieser Dissertationsarbeit das myokardiale Potential der Gefäßwand-residenten Stammzellen aus der Aorta adulter Mäuse studiert werden, indem die Zellen unter unterschiedlichen definierten Bedingungen kultiviert und dann sowohl morphologisch als auch funktionell charakterisiert werden. Erstaunlicherweise zeigten die ersten Ergebnisse die Generierung spontan schlagender Kardiomyozyten-ähnlicher Zellen, nur durch Verwendung eines speziellen Nährmediums und ohne jegliche genetische Manipulation. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen belegen zudem, dass die Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen reproduzierbar nach ca. 9-11 Tagen in der Kultur anfangen, spontan zu schlagen. In immunzytochemischen Analysen zeigten die schlagenden Zellen ein quergestreiftes Färbemuster für α sarkomeres Actinin. Passend dazu wiesen diese spontan schlagenden Zellen, wie reife Kardiomyozyten, Sarkomerstrukturen mit Komponenten des sarkoplasmatischen Retikulums in elektronenmikroskopischen Analysen auf. Sie zeigten dementsprechend eine mit dem spontanen Schlag assoziierte Kalzium-Oszillation. Erstaunlicherweise zeigten die hier vorgelegten Befunde erstmalig, dass es nicht die Sca-1+ (stem cell antigen-1) Zellen waren, denen seit Jahren eine kardiomyozytäre Kapazität zugeschrieben wird, sondern es waren die Sca-1- Zellen der Mausaorta, die sich zu den spontan schlagenden Zellen differenzierten. Des Weiteren scheint diese Differenzierung von einer endogen generierten inflammatorischen Mikroumgebung abhängig zu sein. Die hier vorgelegten Ergebnisse legen daher den Schluss nahe, dass die VW-SCs in der vaskulären Adventitia sowohl die inflammatorische Mikroumgebung als auch die spontan schlagenden Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen bereitstellten. So entstanden in der Kultur aortaler Zellen unter anderem auch Makrophagen, die hohe Mengen des Gefäßwachstumsfaktors VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) aufweisen. Wurden die Makrophagen in der Zellkultur durch Zugabe von Clodtronat-Liposomen depletiert, so wurde damit auch die Generierung spontan schlagender Zellen aus den aortalen VW-SCs unterbunden. Um zu testen, ob und inwieweit dieser Einfluss der Makrophagen auf die Entstehung spontan schlagender Zellen aus den VW-SCs auf den VEGF zurückzuführen ist, wurden kultivierte Zellen der Mausaorta mit dem VEGF-Rezeptor-2-Blocker (E7080) behandelt. Auch diese Behandlung resultierte wie bei der Depletion von Makrophagen darin, dass keine spontan schlagenden Zellen entstanden. Um die von VW-SCs generierten spontan schlagenden Zellen funktionell zu charakterisieren, wurden die kultivierten Zellen der Mausaorta mit Isoproterenol (ß-Sympathomimetikum) und Propranolol (ß-Blocker) behandelt. Eine signifikante Steigerung der Schlagfrequenz unter Isoproterenol und eine Reduzierung bei Zugabe von Propranolol unterstreichen ebenfalls die Kardiomyozyten-ähnliche Eigenschaft der spontan schlagenden Zellen. Schließlich wurden die aus der Mausaorta isolierten Zellen Fluoreszenz-markiert und dann in das kardiale Feld des sich entwickelnden Hühnerembryos (am fünften Tag der Entwicklung) implantiert. Zwei Tage später wurden die Herzen entnommen. Immunfärbungen zeigten, dass ein Teil der implantierten Zellen auch unter diesen in vivo-Bedingungen für α-sarkomeres Actinin positiv wurde und somit einen kardiomyozytären Phänotyp aufwies. KW - vessel wall resident stem cells KW - cardiomyocytes KW - Herzmuskelzelle KW - Stammzelle Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146046 N1 - My PhD research work has been published in Circ Res. 2018 Aug 31;123(6):686-699. ER - TY - THES A1 - Stoll, Kristin T1 - Molekulare Charakterisierung von Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK)- Komponenten aus \(Echinococcus\) \(multilocularis\) T1 - Molecular characterization of mitogen-activated protein kinase (MAPK) components from \(Echinococcus\) \(multilocularis\) N2 - Die alveoläre Echinokokkose (AE), verursacht durch das Metacestoden- Larvenstadium des Fuchsbandwurms Echinococcus multilocularis (E. multilocularis), ist eine lebensbedrohliche Zoonose der nördlichen Hemisphäre mit eingeschränkten therapeutischen Möglichkeiten. Bei der Suche nach neuen Therapeutika haben Mitogen-activated Proteinkinase (MAPK) -Kaskaden als pharmakologische Zielstrukturen aufgrund ihrer essentiellen Rolle bei der Zellproliferation und -differenzierung ein großes Potenzial. In der vorliegenden Arbeit wurden durch BLAST- und reziproke BLAST-Analysen elf potenzielle MAPK Kinase Kinasen (MAP3K), fünf potenzielle MAPK Kinasen (MAP2K) und sechs potenzielle MAPK im E. multilocularis-Genom identifiziert, die teils hoch konserviert sind und in nahezu allen Entwicklungsstadien des Parasiten exprimiert werden. Diese Erkenntnisse lassen auf ein komplexes MAPK-Signaltransduktions- system in E. multilocularis mit großer Bedeutung für den Parasiten schließen. Transkriptomdatenanalysen und Whole Mount in Situ Hybridisierung (WMISH) zeigten, dass emmkkk1 (EmuJ_000389600) als einzige MAP3K neben der Expression in postmitotischen Zellen in besonderem Maße in proliferativen Stammzellen des Parasiten exprimiert wird und somit eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Stammzellen spielen könnte. In Yeast-Two-Hybrid (Y2H) -Wechselwirkungsassays wurden Interaktionen von mehreren upstream- (EmGRB2) und downstream- wirkenden Signalkaskadekomponenten des JNK (EmMKK3, EmMPK3) und ERK (EmMKK3, EmMPK4) -Signalwegs gefunden. Daraus lässt sich schließen, dass EmMKKK1, analog zu seinem humanen Homolog HsM3K1, eine zentrale Rolle bei der Echinococcus-Wachstumsregulation durch Rezeptortyrosinkinasen und vielfältige weitere Funktionen im Parasiten besitzt. Anhand von Erkenntnissen an Platyhelminthes kann daher von einem großen Potenzial dieser neu charakterisierten Signalwege als chemotherapeutische Angriffspunkte ausgegangen werden, wenngleich erste RNA-Interferenz (RNAi)- und Inhibitorstudien an emmkkk1, emmpk1 und emmpk4 keine durchschlagenden Effekte auf das Überleben von Primärzellkulturen und die Bildung von Metacestodenvesikeln zeigten. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit mit EmMKKK1 und neuen ERK- und JNK-Signalwegen zentrale Komponenten der komplexen MAPK-Signalkaskaden in E. multilocularis identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich einen großen Beitrag zur enormen Regenerationsfähigkeit der Echinococcus-Stammzellen leisten und vom Wirt abgeleitete Signale wie Insulin, Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) über EmGRB2 in Proliferationsnetzwerke des Parasiten integrieren. Arzneimittel-Screening-Assays, die auf diese Signalwege abzielen, könnten daher zu alternativen Arzneimitteln führen, die alleine oder in Kombination mit einer bestehenden Chemotherapie (Benzimidazol) die Prognose von für AE-Patienten verbessern könnten. N2 - Alveolar echinococcosis (AE), caused by the metacestode larval stage of the fox tapeworm Echinococcus multilocularis (E. multilocularis), is a life-threatening zoonosis of the Northern Hemisphere with limited therapeutic options. In searches for a new chemotherapy, mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades are of great potential as new drug targets due to their essential role in cell proliferation and differentiation. In this work eleven potential MAPK kinase kinases (MAP3K), five potential MAPK kinases (MAP2K) and six potential MAPK were identified in the E. multilocularis genome by BLAST and reciprocal BLAST analyses, of which some are highly conserved and expressed in almost all developmental stages of the parasite. These findings suggest a complex MAPK signal transduction system in E. multilocularis with major importance for the parasite. Transcriptome data analysis and Whole Mount in Situ Hybridization (WMISH) showed that emmkkk1 (EmuJ_000389600) is the only MAP3K being decisively expressed in the proliferative parasite in addition to expression in postmitotic cells, and thus could play an important role in the differentiation of stem cells. In Yeast-Two-Hybrid (Y2H) interaction assays, interactions between several upstream (EmGRB2) and downstream signaling cascade components of JNK (EmMKK3, EmMPK3) and ERK (EmMKK3, EmMPK4) signaling pathways were detected. Thus, EmMKKK1, like its human homologue HsM3K1, appears to play a central role in Echinococcus growth regulation by receptor tyrosine kinases and seems to have diverse other functions in the parasite. Based on findings on other platyhelminths it can be expected that these newly characterized signaling pathways are of great potential as drug target, although first RNA interference (RNAi) and inhibitor studies on emmkkk1, emmpk1 and emmpk4 revealed no substantive effects on the survival of primary cell cultures and the formation of metacestode vesicles. In conclusion, the present work identified with EmMKKK1 and new ERK and JNK signaling pathways central components of the complex MAPK signaling cascades in E. multilocularis, which most likely contribute to the enormous regenerative capacity of Echinococcus stem cells and integrate host derived signals such as insulin, epidermal growth factor (EGF), and fibroblast growth factor (FGF) via EmGBR2 into proliferative networks of the parasite. Targeting these signaling pathways in drug screening assays might thus lead to alternative drugs that alone, or in combination with existing chemotherapy (benzimidazole), could improve the prognose of AE patients. KW - Fuchsbandwurm KW - MAP-Kinase KW - Echinococcus multilocularis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243180 ER - TY - THES A1 - Vasquez Ospina, Juan Jose T1 - Development of tools for the study of gene regulation in Trypanosoma brucei T1 - Entwicklung neuer Methoden zur Untersuchung der Genregulation in Trypanosoma brucei N2 - The protozoan parasite Trypanosoma brucei is the causal agent of sleeping sickness and besides its epidemiological importance it has been used as model organism for the study of many aspects of cellular and molecular biology especially the post-transcriptional control of gene expression. Several studies in the last 30 years have shown the importance of mRNA processing and stability for gene regulation. In T. brucei genes are unusually arranged in polycistronic transcription units (PTUs) and a coupled process of trans-splicing and polyadenylation produces the mature mRNAs. Both processes, mRNA processing and stability, cannot completely explain the control of gene expression in the different life cycle stages analyzed in T. brucei so far. In recent years, the relevance of expression regulation at the level of translation has become evident in other eukaryotes. Therefore, in the first part of my thesis I studied the impact of translational regulation by means of a genome-wide ribosome profiling approach. My data suggest that translational efficiencies vary between life cycle stages of the parasite as well as between genes within one life cycle stage. Furthermore, using ribosome profiling I was able to identify many new putative un-annotated coding sequences and to evaluate the coding potential of upstream open reading frames (uORF). Comparing my results with previously published proteomic and RNA interference (RNAi) target sequencing (RIT-seq) datasets allowed me to validate some of the new coding sequences and to evaluate their relevance for the fitness of the parasite. In the second part of my thesis I used the transcriptomic and translatomic profiles obtained from the ribosome profiling analysis for the identification of putative non-coding RNAs (ncRNAs). These results led to the analysis of the coding potential in the regions upstream and downstream of the expressed variant surface glycoprotein (VSG), which is outlined in the third part of the results section. The region upstream of the VSG, the co-transposed region (CTR), has been implicated in an increase of the in situ switching rate upon its deletion. The ribosome profiling results indicated moderate transcription but not translation in this region. These results raised the possibility that the CTR may be transcribed into ncRNA. Therefore, in the third part of my thesis, I performed a primary characterization of the CTR-derived transcripts based on northern blotting and RACE. The results suggested the presence of a unique transcript species of about 1,200 nucleotides (nt) and polyadenylated at the 3’-end of the sequence. The deletion of the CTR sequence promoting and increase of the in situ switching rates was performed around 20 years ago by means of inserting reporter genes. With the recent development of endonuclease-based tools for genome editing, it is now possible to delete sequences in a marker-free way. In the fourth part of my thesis, I show the results on the implementation of the highly efficient genome-editing CRISPR-Cas9 system in T. brucei using episomes. As a proof of principle, I inserted the sequence coding for the enhanced green fluorescent protein (eGFP) at the end of the SCD6 coding sequence (CDS). Fluorescent cells were observed as early as two days after transfection. Therefore, after the successful set up of the CRISPR-Cas9 system it will be possible to modify genomic regions with more relevance for the biology of the parasite, such as the substitution of codons present in gene tandem arrays. The implementation of ribosome profiling in T. brucei opens the opportunity for the study of translational regulation in a genome-wide scale, the re-annotation of the currently available genome, the search for new putative coding sequences, the detection of putative ncRNAs, the evaluation of the coding potential in uORFs and the role of unstranslated regions (UTRs) in the regulation of translation. In turn, the implementation of the CRISPR-Cas9 system offers the possibility to manipulate the genome of the parasite at a nucleotide resolution and without the need of including resistant makers. The CRISPR-Cas9 system is a powerful tool for editing ncRNAs, UTRs, multicopy gene families and CDSs keeping their endogenous UTRs. Moreover, the system can be used for the modification of both alleles after just one round of transfection and of codons coding for amino acids carrying post-translational modifications (PTMs) among other possibilities.     N2 - Trypanosoma brucei ist nicht nur als Erreger der Schlafkrankheit von großer epidemiologischer Bedeutung, sondern dient auch der Zell-­‐ und Molekularbiologie – insbesondere zur Erforschung der Genregulation auf posttranskriptionaler Ebene – als wichtiger Modellorganismus. In den vergangenen 30 Jahren konnten mehrere Forschungsarbeiten zeigen, dass mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung maßgeblich zur Regulation der Genexpression beitragen. Anders als in den meisten Eukaryoten sind die Gene in T. brucei in polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTUs) angeordnet. Die reife mRNA entsteht aus dem polycistronischen Transkript in einem gekoppelten Prozess aus Trans-­‐splicing und paralleler Polyadenylierung. Beide Vorgänge allein, mRNA-­‐Stabilität und –Prozessierung, reichen nicht aus, um die Regulation der Genexpression in T. brucei vollständing zu erklären und zusätzliche Mechanismen müssen wirksam sein. Daher habe ich im ersten Teil meiner hier vorliegenden Doktorarbeit die Genregulation auf Ebene der Translation mittels genomweitem Ribosome Profiling untersucht. Die dabei gewonnen Daten deuten darauf hin, dass die Translationseffizienzen nicht nur zwischen prozyklischen-­‐ und Blutstromformen des Parasiten differieren, sondern auch die Gene innerhalb eines Stadiums verschieden effizient translatiert werden. Zudem war es mir mit diesem Ansatz möglich, neue, noch nicht annotierte kodierende Sequenzen zu identifizieren und das Kodierungspotenzial der jeweils vorgelagerten offenen Leseraster (ORFs) zu evaluieren. Mithilfe bereits veröffentlichter Proteom-­‐ und RNA Interferenz-­‐ Studien (RIT-­‐seq) konnte ich einige der neu identifizierten kodierenden Sequenzen validieren und deren Bedeutung für die Fitness des Parasiten bestimmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die ermittelten Translations-­‐ und Transkriptionsprofile miteinander verglichen, um auf diese Weise mögliche nicht-­‐kodierende RNAs (ncRNAs) zu identifizieren. Dies führte zu einer eingehenderen Betrachtung der Kodierungspotenziale der dem exprimierten variablen Oberflächenproteins (VSG) vor-­‐ und nachgeschalteten Regionen. In früheren Arbeiten wurde bereits beschrieben, dass eine Deletion der dem VSG vorgelagerten, sogenannten co-­‐transposed region (CTR), vermehrt zu einer Aktivierung einer alternativen VSG Expressionsseite (in situ switches) führt. Ribosome Profiling zeigte, dass eben jede Regionen zwar moderat transkribiert, jedoch nicht translatiert werden. Da diese Ergebnisse vermuten ließen, dass die CTR für eine ncRNA kodiert, hab ich im dritten Teil meiner Arbeit die CTR Transkripte mittels Northern Blot und RACE weiter charakterisiert. Auf diese Weise konnte ich spezifische, 1200 Nukleotide (nt) lange und am 3`-­‐Ende polyadenylierte Transkripte nachweisen. Die bereits erwähnte Deletion der CTR verbunden mit einer erhöhten Rate an in situ switches wurde vor etwa 20 Jahren durch Insertion von Reportergenen durchgeführt. Heute ist es möglich mithilfe von Endonukleasen Genome ohne solche Marker zu editieren. So beschreibt der vierte Teil der Arbeit die Konstruktion von Episomen zur Etablierung und Anwendung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei. Als Machbarkeitsnachweis wurde die kodierende Sequenz des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) am Ende des SCD6 Gens als Fusionsprotein inseriert. Grün fluoreszierende Zellen konnten bereits zwei Tage nach der Transfektion nachgewiesen werden. Nachdem CRISPR-­‐Cas9 erfolgreich in T. brucei etabliert werden konnte, werde ich im Folgenden weitere relevante Regionen im Genom modifizieren und beispielsweise die Deletion zweier Histonvarianten durchführen. Die Ribosome Profiling Studie in T. brucei erlaubt es uns, genomweit Genregulation auf Ebene der Translation zu analysieren, das uns zurzeit vorliegende Genom zu re-­‐annotieren, neue kodierende Sequenzen wie auch ncRNAs zu identifizieren und den Einfluss nicht-­‐kodierender Sequenzen auf die Translation zu untersuchen. Gleichzeitig ermöglicht die Etablierung des CRISPR-­‐ Cas9 Systems in T. brucei eine hochpräzise Manipulation des Genoms ohne den Einsatz von Resistenzmarkern. Auf diese Weise ist es möglich, Gene zu modifizieren und dabei die zugehörigen untranslatierten Bereiche (UTRs) zu erhalten, aber auch ncRNAs, UTRs und mehrfache Kopien eines Gens (gleichzeitig) zu editieren. Ebenso können einzelne Kodons in der Sequenz und somit posttranslational modifizierte Aminosäuren im Genprodukt verändert werden, was uns weitere Möglichkeiten zur Erforschung der Genregulation eröffnet. KW - Trypanosoma brucei KW - Ribosom KW - Posttranskriptionelle Regulation KW - Trypanosoma brucei KW - Gene expression regulation KW - Ribosome profiling KW - CRISPR Cas9 KW - CRISPR Cas9 system Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133996 ER - TY - THES A1 - Fiebig, Juliane T1 - Twisted gastrulation - ein BMP-Modulatorprotein mit dualer Funktionalität T1 - Twisted gastrulation - a BMP-specific modulator with dual functionality N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind extrazellulär vorkommende Wachstumsfaktoren und werden der Superfamilie der Transforming Growth Factors β (TGF-β) zugeordnet. Entgegen ihrem Namen spielen sie nicht nur eine Rolle bei der Ausbildung und Regeneration der Knochenmatrix, sondern regulieren bereits während der Embryonalentwicklung zahlreiche Abläufe. Unter anderem sind sie an der Festlegung der Körperachsen und Entwicklung der Organanlagen beteiligt. Später steuern sie das Wachstum von Organen und Geweben und sind schließlich im adulten Organismus für deren Homöostase und Regeneration verantwortlich. Bei fast allen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie erfolgt die Signalbildung nach derzeitigem Kenntnisstand durch die Bindung an transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, die in zwei Untergruppen unterteilt werden können. Dabei werden von einem Liganden jeweils zwei Typ I- und zwei Typ II-Rezeptoren gebunden, wodurch ein aktiver Komplex entsteht, der im Inneren der Zelle eine Signalkaskade auslöst. Um die vielseitigen Aufgaben der BMPs spezifisch vermitteln zu können, gibt es zahlreiche Mechanismen, die Signalbildung stringent neben der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu regulieren. Die Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad)-Signalkaskade im Zellinneren wird beispielsweise durch die Interaktion der inhibitorischen Smads mit rezeptor-regulierten Smads oder durch den proteasomalen Abbau der rezeptor-regulierten Smads durch die Bindung von Ubiquitin-Ligasen der Smurf-Familie beeinflusst. Auch auf Membranebene besteht die Möglichkeit der negativen Signalmodulation durch Pseudorezeptoren oder der Verstärkung der Signalbildung durch positive Effektoren wie beispielsweise aktivitätssteigernde Co-Rezeptoren. Ein Charakteristikum der TGF-β Superfamilie stellt jedoch die Vielzahl an sekretierten, löslichen Modulatorproteinen dar. Die meist glykosylierten Proteine üben, bis auf wenige Ausnahmen, einen antagonistischen Effekt auf die BMPs aus. Bei dem BMP-spezifischen Modulatorprotein Twisted gastrulation handelt es sich um ein extrazelluläres Glykoprotein, das im Gegensatz zu den meisten anderen BMP-Modulatoren jedoch eine duale Funktion als Besonderheit aufweist. Es zeigt zum einen eine anti-BMP-Wirkung, indem es den BMP-inhibierenden Einfluss von Chordin durch Bildung eines stabilen ternären Komplexes verstärkt; andererseits kann Twisted gastrulation in Gegenwart spezifischer Metalloproteasen eine proteolytische Spaltung von Chordin und die anschließende Freisetzung von aktivem BMP fördern und so eine BMP-Aktivität vermittelnde Wirkung aufweisen. Twisted gastrulation hat keine beziehungsweise nur eine äußerst geringe Homologie zu anderen (Modulator)Proteinen. Um daher den komplexen Wirkmechanismus detailliert molekular beschreiben zu können, ist die Aufklärung der Struktur /Funktions-beziehungen essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit konnten unterschiedliche Expressionsstrategien für die rekombinante Herstellung von Twisted gastrulation etabliert werden, welche eine umfassende Charakterisierung des Proteins in vitro ermöglichen. Erste Kristallisationsversuche von isoliertem Twisted gastrulation für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenbeugung verliefen ohne Erfolg, allerdings gelang die Präparation stabiler ternärer Proteinkomplexe für weiterführende Kristallisationsansätze. Hochdurchsatzverfahren für die Expression und Interaktionsanalyse erlauben zudem die Untersuchung einer Vielzahl von Twisted gastrulation-Proteinvarianten. Auf diese Weise konnten Aminosäuren identifiziert werden, die an der Wechselwirkung von Twisted gastrulation mit seinem Interaktionspartner BMP 2 beteiligt sind. Dies ermöglichte eine detaillierte Lokalisation des Bindeepitops im N-terminalen Bereich von Twisted gastrulation. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass die Glykosylierung von Twisted gastrulation für die Wechselwirkung mit BMP-2 von Bedeutung ist. Eine experimentelle Strukturanalyse von Twisted gastrulation für die detaillierte Aufklärung des Mechanismus der Interaktion mit BMP-2 und anderen Modulatorproteinen bleibt allerdings weiterhin aufgrund der Einzigartigkeit dieses Modulatorproteins zwingend erforderlich. Für eine Fortsetzung der Untersuchungen bietet der stabile ternäre Komplex eine gute Voraussetzung in Hinblick auf weitere Kristallisationsansätze. N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted growth factors belonging to the superfamily of Transforming Growth Factors β (TGF-β). In contrast to their name they are not only involved in bone morphogenesis and regeneration, but also regulate numerous events during embryonic development. Furthermore, they play a key role in body axis determination, embryonic patterning as well as organogenesis, later in the adult organism these factors control organ and tissue homeostasis and regeneration. At the current state of research all classical members of the TGF-β family signal through transmembrane serine/threonine kinase receptors, which can be subdivided into type I- and type II-receptors. For receptor activation the ligand induces receptor heteromerisation forming an active complex containing type I- and type II-receptors which subsequently triggers intracellular signaling cascades. To ensure highly specific signaling a complex network of regulatory mechanisms has evolved. The Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad) signaling cascade for example is modulated by inhibitory Smads interacting with the receptor-regulated Smads or through proteasomal degradation of the receptor-regulated Smads by binding to ubiquitin-ligases of the Smurf-family. In the membrane, pseudoreceptors such as BAMBI lacking a kinase domain or GPI-anchored co-receptors such as the RGM-receptor family or Cripto can positively or negatively regulate BMP/TGF-β signaling. A highlight of the TGF-β superfamily is the multitude of different secreted soluble modulator proteins. Most present glycoproteins, which act as BMP-antagonists by interfering with BMP-signaling. The BMP-specific modulator Twisted gastrulation is such an extracellular glycoprotein, which however features an unique dual function. On the one hand, by forming a stable ternary complex it strongly enhances the BMP-antagonizing (anti-BMP) activity of another BMP-modulator Chordin. On the other hand, upon proteolytic processing of Chordin in this ternary complex in the presence of specific metalloproteases such as Tolloid, Twisted gastrulation facilitates the dissociation of the ternary complex releasing active BMP an thereby exerts a pro (moting) BMP-activity. Twisted gastrulation exhibits very low if at all any homology to other proteins and seems also unique among the large variety of BMP-modulator proteins. To understand its dual mode of action on a molecular level analysis of the structure/function-relationship is a pre-requisite. In this project we have established different strategies for recombinant production of Twisted gastrulation for a comprehensive in vitro characterization. Although crystallization of Twisted gastrulation for X-ray diffraction analysis failed, we could successfully prepare stable ternary complexes consisting BMP-2, a type II-receptor and Twisted gastrulation which are ideally suited for protein crystallization. High-throughput expression and interaction-analysis schemes allowed us to study a multitude of single amino acid variants of Twisted gastrulation. This resulted in the identification of several amino acid residues in Twisted gastrulation, which form the binding epitope for BMP-2 confirming its supposed location in the N-terminal half of Twisted gastrulation. We could also show that the N-glycosylation of Twisted gastrulation is involved in high-affinity BMP binding and required for its BMP-modulatory activity in vivo. For a full analysis of its molecular mechanism of BMP-2 interaction and its interplay with other modulator proteins, a structure analysis of Twisted gastrulation is required in the near future. Providing efficient recombinant sources and the preparation of stable ternary complexes will likely facilitate this. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Twisted gastrulation KW - Bone Morphogenetic Proteins KW - Transforming Growth Factor KW - Gastrulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107270 ER - TY - THES A1 - Vellmer, Tim T1 - New insights into the histone variant H2A.Z incorporation pathway in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Neue Erkenntnisse zum Einbau der Histonvariante H2A.Z in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The histone variant H2A.Z is a key player in transcription regulation in eukaryotes. Histone acetylations by the NuA4/TIP60 complex are required to enable proper incorporation of the histone variant and to promote the recruitment of other complexes and proteins required for transcription initiation. The second key player in H2A.Z-mediated transcription is the chromatin remodelling complex SWR1, which replaces the canonical histone H2A with its variant. By the time this project started little was known about H2A.Z in the unicellular parasite Trypanosoma brucei. Like in other eukaryotes H2A.Z was exclusively found in the transcription start sites of the polycistronic transcription units where it keeps the chromatin in an open conformation to enable RNA-polymerase II-mediated transcription. Previous studies showed the variant colocalizing with an acetylation of lysine on histone H4 and a methylation of lysine 4 on histone H3. Data indicated that HAT2 is linked to H2A.Z since it is required for acetylation of lyinse 10 on histone H4. A SWR1-like complex and a complex homologous to the NuA4/TIP60 could not be identified yet. This study aimed at identifying a SWR1-like remodelling complex in T. brucei and at identifying a protein complex orthologous to NuA4/TIP60 as well as at answering the question whether HAT2 is part of this complex or not. To this end, I performed multiple mass spectrometry-coupled co-Immunoprecipitation assays with potential subunits of a SWR1 complex, HAT2 and a putative homolog of a NuA4/TIP60 subunit. In the course of these experiments, I was able to identify the TbSWR1 complex. Subsequent cell fractionation and chromatin immunoprecipitation-coupled sequencing analysis experiments confirmed, that this complex is responsible for the incorporation of the histone variant H2A.Z in T. brucei. In addition to this chromatin remodelling complex, I was also able to identify two histone acetyltransferase complexes assembled around HAT1 and HAT2. In the course of my study data were published by the research group of Nicolai Siegel that identified the histone acetyltransferase HAT2 as being responsible for histone H4 acetylation, in preparation to promote H2A.Z incorporation. The data also indicated that HAT1 is responsible for acetylation of H2A.Z. According to the literature, this acetylation is required for proper transcription initiation. Experimental data generated in this study indicated, that H2A.Z and therefore TbSWR1 is involved in the DNA double strand break response of T. brucei. The identification of the specific complex composition of all three complexes provided some hints about how they could interact with each other in the course of transcription regulation and the DNA double strand break response. A proximity labelling approach performed with one of the subunits of the TbSWR1 complex identified multiple transcription factors, PTM writers and proteins potentially involved in chromatin maintenance. Overall, this work will provide some interesting insights about the composition of the complexes involved in H2A.Z incorporation in T. brucei. Furthermore, it is providing valuable information to set up experiments that could shed some light on RNA-polymerase II-mediated transcription and chromatin remodelling in T. brucei in particular and Kinetoplastids in general. N2 - Die Histonvariante H2A.Z ist ein Schlüsselelement bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten. Histonacetylierungen die vom NuA4/Tip60 Komplex prozessiert werden, sind für den korrekten Einbau der Variante unerlässlich. Darüber hinaus erlauben diese posttranslationellen Modifikationen die Rekrutierung weiterer Proteine und Komplexe die für die Transkription notwendig sind. Ein weiteres Schlüsselelement der mittels H2A.Z regulierten Transkription ist der Komplex zur Umstrukturierung des Chromatins SWR1, welcher das kanonische Histon H2A gegen seine Variante austauscht. Zu Beginn dieses Projektes war der Wissenstand bezüglich der Histonvariante H2A.Z in dem einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei limitiert. Wie in anderen eukaryotischen Organismen wurde die Variante ausschließlich an den Startpunkten der polyzistronischen Transkriptionseinheiten gefunden, an denen es für die Öffnung des Chromatins verantwortlich ist und so die Transkription mittels RNAPolymerase II ermöglicht. Vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Variante mit einer Acetylierung des Lysins 10 im Histon H4 und einer Methylierung des Lysins 4 im Histon H3 co-lokalisiert. Einige Daten lieferten den Hinwies, dass die Histon-Acetyltransferase HAT2 mit H2A.Z in Zusammenhang steht, da diese die Acetylierung des Lysins 10 im Hinston H4 prozessiert. Komplexe die in ihrer Funktion dem SWR1 oder dem NuA4/TIP60 Komplex entsprechen, konnten bisher noch nicht gefunden werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab Komplexe zu identifizieren, die in ihrer Funktion dem SWR1 sowie dem NuA4/TIP60 Komplex entsprechen. Zudem soll die Frage geklärt werden ob HAT2 Teil eines möglichen NuA4/TIP60 Komplexes ist. In diesem Zusammenhang habe ich mehrere Massenspektrometrie gekoppelte Co-Immunopräzipitationen mit potenziellen Untereinheiten eines SWR1 Komplexes sowie HAT2 und einem Protein welches otholog zu einer NuA4/TIP60 Untereinheit ist, durchgeführt. Im Verlauf dieser Experimente konnte der SWR1 Komplex in T. brucei (TbSWR1) identifiziert werden. Anschließende Zellfraktionierungen sowie Chromatin Immunopräzipitationen gekoppelte Sequenzanalysen konnten bestätigen, dass der identifizierte Komplex für den Einbau der Histonvariante H2A.Z zuständig ist. Darüber hinaus konnten neben diesem Komplex noch zwei weitere Komplexe identifiziert werden, die jeweils die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 als Kernkomponenten enthalten. Im Verlauf meiner Arbeit wurden von der Arbeitsgruppe von Nicolai Siegel Daten publiziert die zeigten, dass die Histonacetyltransferase HAT2, in Vorbereitung auf den Einbau von H2A.Z, für die Acetylierung des Histons H4 verantwortlich ist. Im Gegenzug ist HAT1 für die Acetylierung von H2A.Z notwendig, welche wiederum für die korrekte Initiation der Transkription benötigt wird. Damit entspricht die Funktion der Acetylierung von H2A.Z in T. brucei der in der Literatur beschriebenen Funktion. Experimentelle Daten die im Verlauf dieser Arbeit generiert wurden, lieferten einen Hinweis darauf, dass H2A.Z auch an der Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen beteiligt ist. Die Aufschlüsselung der spezifischen Zusammensetzung aller drei Komplexe gab einige Hinweise darauf, wie sie sowohl während der Transkriptionsregulation als auch der Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen miteinander interagieren. Im Zuge einer molekularen Umgebungskartierung, die mit einer der Untereinheiten des TbSWR1 Komplexes durchgeführt wurde, konnten mehrere Transkriptionsfaktoren und Enzyme zur Histonmodifizierung identifiziert werden. Dabei wurden auch einige Proteine identifiziert, welche möglicherweise mit der Umformung des Chromatins in Zusammenhang stehen. Abschließend ist festzuhalten, dass diese Arbeit einige äußerst interessante Einsichten über die Zusammensetzung der Komplexe, die am H2A.Z Einbau in T. brucei beteiligt sind, liefern konnte. Darüber hinaus stellt sie einige wertvolle Informationen zur Verfügung. Diese könnten zur gezielten Planung von Experimenten genutzt werden, um mehr über RNA-Polymerase II vermittelte Transkription und Chromatin Umstrukturierung in T. brucei im speziellen und in Kinetoplastiden im Allgemeinen zu erfahren. KW - Chromatinremodelling KW - Histone KW - Transkription KW - Chromatinremodeling KW - Histones KW - Variants KW - Complexes Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-257960 ER - TY - THES A1 - Dindar, Gülcin T1 - Molecular basis for product-specificity of DOT1 methyltransferases in Trypanosoma brucei T1 - Die molekularen Grundlagen der Produktspezifität von DOT1 Methyltransferasen in Trypanosoma brucei N2 - Post-translational histone modifications (PTMs) such as methylation of lysine residues influence chromatin structure and function. PTMs are involved in different cellular processes such as DNA replication, transcription and cell differentiation. Deregulations of PTM patterns are responsible for a variety of human diseases including acute leukemia. DOT1 enzymes are highly conserved histone methyltransferases that are responsible for methylation of lysine 79 on histone H3 (H3K79). Most eukaryotes contain one single DOT1 enzyme, whereas African trypanosomes have two homologues, DOT1A and DOT1B, which methylate H3K76 (H3K76 is homologous to H3K79 in other organisms). DOT1A is essential and mediates mono- and di-methylations, whereas DOT1B additionally catalyzes tri-methylation of H3K76. However, a mechanistic understanding how these different enzymatic activities are achieved is lacking. This thesis exploits the fact that trypanosomes possess two DOT1 enzymes with different catalytic properties to understand the molecular basis for the differential product-specificity of DOT1 enzymes. A trypanosomal nucleosome reconstitution system was established to analyze methyltransferase activity under defined in vitro conditions. Homology modeling allowed the identification of critical residues within and outside the catalytic center that modulate product-specificity. Exchange of these residues transferred the product-specificity from one enzyme to the other and revealed regulatory domains adjacent to the catalytic center. This work provides the first evidence that few specific residues in DOT1 enzymes are crucial to catalyze methyl-state-specific reactions. These results have also consequences for the functional understanding of homologous enzymes in other eukaryotes. N2 - Posttranslationale Histonmodifizierungen (PTMs), wie beispielsweise die Methylierung von Lysinseitenketten, beeinflussen maßgeblich die Struktur und Funktion von Chromatin. PTMs spielen eine wichtige Rolle in verschiedensten zellulären Prozessen, darunter DNA Replikation, Transkription oder Zelldifferenzierung. Darüber hinaus liegt ein verändertes PTM-Muster einer Vielzahl humaner Erkrankungen zugrunde, wie z.B. der akuten myeloischen Leukämie. DOT1-Enzyme sind hochkonservierte Histonmethyltransferasen, die für die Methylierung von Lysin 79 in Histon H3 (H3K79) verantwortlich sind. Im Gegensatz zu den meisten Eukaryoten, die lediglich ein einziges DOT1-Enzym besitzen, finden sich zwei homologe Proteine in afrikanischen Trypanosomen (DOT1A und DOT1B), die Lysin 76 in Histon H3 (H3K76) methylieren (H3K76 ist homolog zu H3K79 in anderen Organismen). DOT1A ist essentiell und katalysiert Mono- und Di-Methylierungen, wohin gegen DOT1B darüber hinaus eine Trimethylierung an H3K76 setzen kann. Derzeit fehlt jegliches mechanistische Verständnis darüber, wie beide Enzyme diese unterschiedliche Produktspezifität erreichen. Die vorliegende Dissertation macht sich den Umstand zunutze, dass Trypanosomen zwei DOT1-Methyltransferasen mit unterschiedlichen katalytischen Eigenschaften besitzen, um Einblicke in die molekulare Grundlage der unterschiedlichen Produktspezifität zu erlangen. Zunächst wurde ein Rekonstitutionssystem für Nukleosomen aus Trypanosomen etabliert, das es ermöglichte die Methyltransferase-Aktivitäten unter definierten in vitro Bedingungen zu analysieren. Homologiemodelle erlaubten die Identifikation von wichtigen Aminosäurepositionen innerhalb und außerhalb des katalytischen Zentrums der Enzyme, die einen Einfluss auf die Produktspezifität haben. Ein Austausch der Aminosäuren an diesen Positionen führte zu einer Umwandlung der Produktspezifität und offenbarte gleichzeitig DOT1A- und DOT1B-spezifische regulatorische Domänen, die an das katalytische Zentrum angrenzen. Diese Arbeit liefert erste Hinweise, dass wenige maßgebliche Aminosäuren in DOT1-Enzymen für den H3K76-Methylierungsgrad während der Katalyse entscheidend sind. Darüber hinaus haben die hier dargestellten Ergebnisse ebenfalls Konsequenzen für das funktionale Verständnis der homologen Enzyme in anderen Eukaryoten. KW - Histon-Methyltransferase KW - Chromatin KW - Trypanosoma brucei KW - DOT1 methyltransferase KW - homology modeling KW - product specificity Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102524 ER - TY - THES A1 - Kraus, Amelie Johanna T1 - H2A.Z – a molecular guardian of RNA polymerase II transcription in African trypanosomes T1 - H2A.Z – eine molekulare Wächterin der RNA Polymerase II Transkription in Afrikanischen Trypanosomen N2 - In eukaryotes, the enormously long DNA molecules need to be packaged together with histone proteins into nucleosomes and further into compact chromatin structures to fit it into the nucleus. This nuclear organisation interferes with all phases of transcription that require the polymerase to bind to DNA. During transcription – the process in which the hereditary information stored in DNA is transferred to many transportable RNA molecules - nucleosomes form a physical obstacle for polymerase progression. Thus, transcription is usually accompanied by processes mediating nucleosome destabilisation, including post-translational histone modifications (PTMs) or exchange of canonical histones by their variant forms. To the best of our knowledge, acetylation of histones has the highest capability to induce chromatin opening. The lysine modification can destabilise histone-DNA interactions within a nucleosome and can serve as a binding site for various chromatin remodelers that can modify the nucleosome composition. For example, H4 acetylation can impede chromatin folding and can stimulate the exchange of canonical H2A histone by its variant form H2A.Z at transcription start sites (TSSs) in many eukaryotes, including humans. As histone H4, H2A.Z can be post-translationally acetylated and as acetylated H4, acetylated H2A.Z is enriched at TSSs suggested to be critical for transcription. However, thus far, it has been difficult to study the cause and consequence of H2A.Z acetylation. Even though, genome-wide chromatin profiling studies such as ChIP-seq have already revealed the genomic localisation of many histone PTMs and variant proteins, they can only be used to study individual chromatin marks and not to identify all factors important for establishing a distinct chromatin structure. This would require a comprehensive understanding of all marks associated to a specific genomic locus. However, thus far, such analyses of locus-specific chromatin have only been successful for repetitive regions, such as telomeres. In my doctoral thesis, I used the unicellular parasite Trypanosoma brucei as a model system for chromatin biology and took advantage of its chromatin landscape with TSSs comprising already 7% of the total T. brucei genome (humans: 0.00000156%). Atypical for a eukaryote, the protein-coding genes are arranged in long polycistronic transcription units (PTUs). Each PTU is controlled by its own ~10 kb-wide TSS, that lies upstream of the PTU. As observed in other eukaryotes, TSSs are enriched with nucleosomes containing acetylated histones and the histone variant H2A.Z. This is why I used T. brucei to particularly investigate the TSS-specific chromatin structures and to identify factors involved in H2A.Z deposition and transcription regulation in eukaryotes. To this end, I established an approach for locus-specific chromatin isolation that would allow me to identify the TSSs- and non-TSS-specific chromatin marks. Later, combining the approach with a method for quantifying lysine-specific histone acetylation levels, I found H2A.Z and H4 acetylation enriched in TSSs-nucleosomes and mediated by the histone acetyltransferases HAT1 and HAT2. Depletion of HAT2 reduced the levels of TSS-specific H4 acetylation, affected targeted H2A.Z deposition and shifted the sites of transcription initiation. Whereas HAT1 depletion had only a minor effect on H2A.Z deposition, it had a strong effect on H2A.Z acetylation and transcription levels. My findings demonstrate a clear link between histone acetylation, H2A.Z deposition and transcription initiation in the early diverged unicellular parasite T. brucei, which was thus far not possible to determine in other eukaryotes. Overall, my study highlights the usefulness of T. brucei as a model system for studying chromatin biology. My findings allow the conclusion that H2A.Z regardless of its modification state defines sites of transcription initiation, whereas H2A.Z acetylation is essential co-factor for transcription initiation. Altogether, my data suggest that TSS-specific chromatin establishment is one of the earliest developed mechanisms to control transcription initiation in eukaryotes. N2 - In Eukaryoten muss die genomische DNA zusammen mit Histonproteinen zu Nukleosomen und weiter zu kompakten Chromatinstrukturen verpackt werden, damit sie in den Zellkern passt. Diese Organisation behindert die Transkription bei jedem Schritt, bei dem die Polymerase an der DNA bindet. Während der Transkription – dem Prozess bei dem die in der DNA gespeicherte Erbinformation in viele transportable RNA Molekülen umgewandelt wird – stellen Nukleosomen ein physikalisches Hindernis für das Vorankommen der Polymerase dar. Aus diesem Grund wird die Transkription üblicherweise von Prozessen begleitet, die für die Destabilisierung der Nukleosomen sorgen, wie zum Beispiel post-translationale Modifizierung (PTM) der Histone oder der Austausch von kanonischen Histonproteinen durch eine ihrer Varianten. Soweit bisher bekannt ist Histonacetylierung am besten dafür geeignet, eine offene Chromatinstruktur bereit zu stellen. Die Lysinmodifizierung kann Interaktionen zwischen der DNA und den Histonen innerhalb eines Nukleosomes destabilisieren und als Andockstelle für einige Proteinkomplexe sogenannte Chromatin-Modellierer fungieren, die die Zusammensetzung eines Nukleosomes verändern können. Zum Beispiel, kann Acetylierung am Histon H4 das „Zusammenfalten“ des Chromatins erschweren und den Austausch von kanonischem H2A mit ihrer Variante H2A.Z an den Transkriptiosinitiationsstellen (TSSen) in vielen eukaryotischen Organismen, Menschen eingeschlossen, stimulieren. Wie Histon H4, kann auch H2A.Z post-translationell acetyliert werden und wie acetyliertes H4, findet man auch acetyliertes H2A.Z vor allem an TSSen. Deswegen geht man davon aus, dass es sehr wichtig für die Transkriptioninitiierung ist. Allerdings war es bisher nicht möglich, die Ursache und Wirkung von H2A.Z Acetylierung genauer zu untersuchen. Genom-weite Chromatinprofilstudien wie z.B. ChIP-Seq ermöglichen es die genomische Lokalisierung von vielen Histon-Modifizierungen und -Varianten zu bestimmen. Dennoch reichen sie nicht dafür aus alle Faktoren, die für die Bildung einer bestimmten Chromatinstruktur notwendig sind, gleichzeitig herauszufinden. Das würde voraussetzen, dass man alle Merkmale der genomischen Stelle kennt. Bisher waren Analysen von spezifischen Chromatinstellen nur erfolgreich, wenn das Chromatin von einer repetitiven Region, wie z.B. Telomeren, stammt. In meiner Doktorarbeit verwendete ich den einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei als Modelsystem für Chromatinbiologie. Dabei machte ich mir dessen Chromatinorganisation zunutze, die eher untypisch für einen eukaryotische Organismus ist. TSSen machen hier ungefähr 7% des gesamten Genoms aus (Mensch: 0.00000156%). Protein-kodierende Gene sind in langen polycistronischen Transkriptionseinheiten (PTE) angeordnet. Jede dieser Einheiten besitzt eine eigene TSS, die vor der PTE liegt, und bis zu 10 kb lang sein kann. Jedoch, wie in anderen Eukaryoten, sind an den TSSen Nukleosomen angereichert, die sich durch acetylierte Histone und den Einbau der Histonvariante H2A.Z auszeichnen. Aus diesen Gründen verwendete ich T. brucei, um während meiner Doktorarbeit die Chromatinstrukturen, die TSSen auszeichnen, genauer zu untersuchen und die Faktoren, die bei der H2A.Z Positionierung und dadurch bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten eine Rolle spielen, herauszufinden. Dafür etablierte ich zuerst eine Methode, mit der man Chromatin von einer bestimmten genomischen Stelle isolieren kann und die es mir ermöglichen würde, die Merkmale von TSS-spezifischen und -unspezifischen Chromatin zu identifizieren. Später konnte ich das entwickelte Protokoll mit einer Methode zur Quantifizierung von Lysin-spezifischen Histonacetylierung kombinieren. Dadurch konnte ich herausfinden, dass Nukleosomen an trypanosomischen TSSen stark acetyliertes H2A.Z und H4 enthalten und dass für diese Modifizierungen die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 verantwortlich sind. Eine Reduzierung der HAT2-Levels führte zu einer Reduzierung von H4 Acetylierung, verschlechterte die gezielte H2A.Z Positionierung und führte dazu, dass die Transkriptioninitiierung sich verlagerte. Wohingegen eine Reduzierung von HAT1, die zwar nur einen kleinen Einfluss auf die H2A.Z Positionierung hatte, eine sehr starke Verringerung von acetyliertem H2A.Z und der Transkriptionsrate zur Folge hatte. Durch meine Ergebnisse konnte ich zeigen, dass in T. brucei, einem evolutionär divergenten eukaryotischem Organismus, die Prozesse der Histonacetylierung, H2A.Z Positionierung und Transkriptionsinitiierung sehr stark miteinander verbunden sind. Meine Arbeit ist des weiteren ein Beweis dafür, dass T. brucei ein sehr wichtiger Modellorganismus für die Forschung an Chromatin ist. Insgesamt erlauben meine Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass H2A.Z, egal ob modifiziert oder nicht, ein Herausstellungsmerkmal für TSSen ist, während acetyliertes H2A.Z essentiell für die Transkriptionsinitiierung darstellt. Zusammengefasst, weisen die Daten meiner Doktorarbeit darauf hin, dass die Etablierung von bestimmten Chromatinstrukturen an TSSen eines der frühesten entwickelten Mechanismen zur Kontrolle der Transkriptionsinitiierung in Eukaryoten ist. KW - Chromatin KW - Histone KW - Histonacetyltransferase KW - Transcription KW - Acetylation KW - H2A.Z KW - Trypanosoma Brucei KW - Histone Acetylation KW - Transcription KW - Chromatin KW - Histone KW - Histone modification KW - Histone variant Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250568 ER - TY - THES A1 - Strack, Stefanie T1 - Rolle der Polycomb Faktoren PCGF6 und E2F6 in undifferenzierten und differenzierenden embryonalen Stammzellen der Maus T1 - Role of Polycomb Factors PCGF6 and E2F6 in undifferentiated and differentiating embryonic stem cells of mice N2 - To investigate the role of PCGF6 and E2F6 in murine embryonic stem cells (mESCs) and at the beginning of differentiation, knockout cell lines of both proteins and in combination were generated by the CRISPR/Cas9n system. Characterization of these knockout cell lines (KO) was performed by growth analysis in mESCs and differentiating murine stem cells (EBs). It was found that Pcgf6 KO cells formed smaller EBs that also could not be maintained in culture for an extended period. To resolve this specific phenotype, further molecular analyses were performed by flow cytometry (FACS). Cells of the Pcgf6 KO exhibited an increased proportion of cells in G1 phase during differentiation as well as an increased apoptotic frequency. Supporting the assumption of a cell cycle defect, RNASeq data were analysed. It could be shown that cells of the Pcgf6 KO differentiated in a temporally uncontrolled manner. Evaluation of differentially expressed genes revealed that expression of E2f6, a regulator of the cell cycle and another component of the non-canonical PRC1.6, was downregulated in mESC and EB cultures, whereas cell cycle-specific targets of E2F6-dependent gene regulation were upregulated at day 2 of differentiation. These results indicated that deletion of Pcgf6 at the beginning of differentiation must have effects on E2F6-dependent cell cycle regulation. Due to mycoplasma contamination in the cell culture at this time point, the Pcgf6 KO cell line had to be re-established. In addition, KO cell lines of E2f6 in Wt and in Pcgf6 KO mESCs were established. The replication of cellular characterization of the phenotype revealed that EB cultures of the Pcgf6 KO and the double knockout of Pcgf6 and E2f6 (dKOPcgf6/E2f6) exhibited reduced cell numbers during differentiation. Molecular characterizations of the phenotype revealed that the increased proportion of cells in the G1 phase of the Pcgf6 KO, which was detected before mycoplasma contamination, could not be reproduced. However, an increased frequency of cells in the G2 phase of dKOPcgf6/E2f6 was detected in mESC and EB culture. Analysis of apoptotic frequency in all KO cell lines indicated an increase during differentiation. RNASeq data from two publications of PCGF6 and E2F6 were used to support the analyses performed to this point (Qui et al, 2021; Dahlet et al, 2021). Gene Ontology Enrichment analyses of these data revealed that germline genes were independently upregulated in both KO cell lines in mESCs. However, both KO cell lines also showed an overlap of commonly upregulated germline genes. Following these publications, gene expression analysis of individual germline genes revealed that loss of E2f6 leads to de-repression of genes that have a binding site for E2F6. In contrast, loss of Pcgf6 had no effect on expression of these targets. These results, as well as previously published data, support the assumption that there are distinct subcomplexes that regulate the expression of germline genes in mESC and EB cultures. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurde zur Untersuchung der Rolle von PCGF6 und E2F6 in murinen embryonalen Stammzellen (mESCs) und zu Beginn der Differenzierung Knockout-Zelllinien beider Proteine und in Kombination durch das CRISPR/Cas9n Systems erstellt. Die Charakterisierung dieser Knockout-Zelllinien erfolgte durch Wachstumsanalysen in mESCs und differenzierenden murinen Stammzellen (EBs). Es konnte festgestellt werden, dass Zellen des Pcgf6 Knockout (KO) kleinere Ebs bildeten, die zudem nicht über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden konnten. Zur Klärung dieses spezifischen Phänotyps wurden weitere molekulare Analysen mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Zellen des Pcgf6 KO wiesen während der Differenzierung einen erhöhten Anteil an Zellen in der G1-Phase sowie eine erhöhte apoptotische Frequenz auf. Unterstützend zur Annahme eines Zellzyklusdefekts wurden RNASeq-Daten analysiert. Die Auswertung ergab, dass Zellen des Pcgf6 KO zeitlich unkontrolliert differenzierten. Die Auswertung differenziell exprimierter Gene ergab zudem, dass die Expression von E2f6, ein Regulator des Zellzyklus und weitere Untereinheit des nicht-kanonischen PRC1.6, in mESC und EB-Kulturen herunter reguliert war, während Zellzyklus-spezifische Targets der E2F6-abhängigen Genregulation an Tag 2 der Differenzierung hochreguliert waren. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine Deletion von Pcgf6 zu Beginn der Differenzierung Auswirkungen auf eine E2F6-abhängige Zellzyklusregulation haben muss. Auf Grund einer zu diesem Zeitpunkt aufgetretenen Mykoplasmenkontamination in der Zellkultur musste die Pcgf6 KO-Zelllinie neu erstellt werden. Zusätzlich wurden KO-Zelllinien von E2f6 in Wt und in Pcgf6 KO mESCs erstellt. Die anschließende Wiederholung der zellulären Charakterisierung des Phänotyps ergab, dass EB-Kulturen des Pcgf6 KO und des Doppelknockout von Pcgf6 und E2f6 (dKOPcgf6/E2f6) während der Differenzierung eine verringerte Zellzahl aufwiesen. Die molekularen Charakterisierungen des Phänotyps ergaben, dass der erhöhte Anteil an Zellen in der G1-Phase des Pcgf6 KO, welche vor der Mykoplasmenkontamination detektiert wurde, nicht reproduziert werden konnte. Es wurde jedoch eine erhöhte Frequenz an Zellen in der G2-Phase des dKOPcgf6/E2f6 in der mESC-und EB-Kultur ermittelt. Die Analyse der apoptotischen Frequenz in allen KO-Zelllinien zeigte einen Anstieg während der Differenzierung. Zur Unterstützung der bis dahin durchgeführte Analysen wurden RNASeq-Daten zweier Publikationen zu PCGF6 und E2F6 herangezogen (Qui et al., 2021; Dahlet et al, 2021). Gene Ontology Enrichtment Analysen dieser Daten ergaben, dass in beiden KO-Zelllinien in mESCs unabhängig voneinander Keimbahngene hochreguliert waren. Beide KO-Zelllinien zeigten aber auch eine Schnittmenge gemeinsam hochregulierter Keimbahngene. In Anlehnung an diese Veröffentlichungen, ergaben Genexpressionsanalysen einzelner Keimbahngene, dass ein Verlust von E2f6 zu einer De-Repression von Genen führt, die eine Bindestelle für E2F6 besitzen. Der Verlust von Pcgf6 hingegen hatte keine Auswirkung auf Expression dieser Targets. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es unterschiedliche Subkomplexe gibt, die die Expression von Keimbahngenen in mESC- und EB-Kulturen regulieren. KW - Murine embryonale Stammzellen KW - Pcgf6 KW - PRC1.6 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-255600 ER - TY - THES A1 - Eisenhuth, Nicole Juliana T1 - Novel and conserved roles of the histone methyltransferase DOT1B in trypanosomatid parasites T1 - Neue und konservierte Rollen der Histonmethyltransferase DOT1B in Parasiten der Ordnung Trypanosomatida N2 - The family of trypanosomatid parasites, including the human pathogens Trypanosoma brucei and Leishmania, has evolved sophisticated strategies to survive in harmful host environments. While Leishmania generate a safe niche inside the host’s macrophages, Trypanosoma brucei lives extracellularly in the mammalian bloodstream, where it is constantly exposed to the attack of the immune system. Trypanosoma brucei ensures its survival by periodically changing its protective surface coat in a process known as antigenic variation. The surface coat is composed of one species of ‘variant surface glycoprotein’ (VSG). Even though the genome possesses a large repertoire of different VSG isoforms, only one is ever expressed at a time from one out of the 15 specialized subtelomeric ‘expression sites’ (ES). Switching the coat can be accomplished either by a recombination-based exchange of the actively-expressed VSG with a silent VSG, or by a transcriptional switch to a previously silent ES. The conserved histone methyltransferase DOT1B methylates histone H3 on lysine 76 and is involved in ES regulation in T. brucei. DOT1B ensures accurate transcriptional silencing of the inactive ES VSGs and influences the kinetics of a transcriptional switch. The molecular machinery that enables DOT1B to execute these regulatory functions at the ES is still elusive, however. To learn more about DOT1B-mediated regulatory processes, I wanted to identify DOT1B-associated proteins. Using two complementary approaches, specifically affinity purification and proximity-dependent biotin identification (BioID), I identified several novel DOT1B-interacting candidates. To validate these data, I carried out reciprocal co-immunoprecipitations with the most promising candidates. An interaction of DOT1B with the Ribonuclease H2 protein complex, which has never been described before in any other organism, was confirmed. Trypanosomal Ribonuclease H2 maintains genome integrity by resolving RNA-DNA hybrids, structures that if not properly processed might initiate antigenic variation. I then investigated DOT1B’s contribution to this novel route to antigenic variation. Remarkably, DOT1B depletion caused an increased RNA-DNA hybrid abundance, accumulation of DNA damage, and increased VSG switching. Deregulation of VSGs from throughout the silent repertoire was observed, indicating that recombination-based switching events occurred. Encouragingly, the pattern of deregulated VSGs was similar to that seen in Ribonuclease H2-depleted cells. Together these data support the hypothesis that both proteins act together in modulating RNA-DNA hybrids to contribute to the tightly-regulated process of antigenic variation. The transmission of trypanosomatid parasites to mammalian hosts is facilitated by insect vectors. Parasites need to adapt to the extremely different environments encountered during transmission. To ensure their survival, they differentiate into various specialized forms adapted to each tissue microenvironment. Besides antigenic variation, DOT1B additionally affects the developmental differentiation from the mammalian-infective to the insect stage of Trypanosoma brucei. However, substantially less is known about the influence of chromatin-associated proteins such as DOT1B on survival and adaptation strategies of related Leishmania parasites. To elucidate whether DOT1B’s functions are conserved in Leishmania, phenotypes after gene deletion were analyzed. As in Trypanosoma brucei, generation of a gene deletion mutant demonstrated that DOT1B is not essential for the cell viability in vitro. DOT1B deletion was accompanied with a loss of histone H3 lysine 73 trimethylation (the lysine homologous to trypanosomal H3K76), indicating that Leishmania DOT1B is also solely responsible for catalyzing this post-translational modification. As in T. brucei, dimethylation could only be observed during mitosis/cytokinesis, while trimethylation was detectable throughout the cell cycle in wild-type cells. In contrast to the trypanosome DOT1B, LmxDOT1B was not essential for differentiation in vitro. However, preliminary data indicate that the enzyme is required for effective macrophage infection. In conclusion, this study demonstrated that the identification of protein networks and the characterization of protein functions of orthologous proteins from related parasites are effective tools to improve our understanding of the parasite survival strategies. Such insights are a necessary step on the road to developing better treatments for the devastating diseases they cause. N2 - Vertreter der Familie der Trypanosomatidae einschließlich der humanpathogenen Trypanosoma brucei und Leishmania Arten entwickelten eine Reihe von ausgeklügelten Strategien, um in ihren Wirten zu überleben. Während sich Leishmanien eine sichere Nische in den Makrophagen ihrer Wirte aufbauen, lebt Trypanosoma brucei ausschließlich extrazellulär im Blutkreislauf der Säugetiere. Dort ist der Parasit ständig dem Angriff des Immunsystems ausgesetzt. Um sein Überleben zu sichern, wechselt er regelmäßig seine variablen Oberflächenproteine (VSG), eine Strategie, die auch als antigene Variation bekannt ist. Obwohl das Genom des Parasiten über ein enormes Repertoire an VSG Genen verfügt, wird immer nur eine einzige Art von einer von 15 spezialisierten telomerproximalen Expressionsstellen (ES) transkribiert. Um die VSG-Zelloberfläche zu wechseln, können Trypanosomen das VSG Gen der aktiven ES gegen ein inaktives VSG aus dem gigantischen Repertoire mittels Rekombination eintauschen. Eine weitere Möglichkeit ist der Transkriptionswechsel zu einer zuvor stillen ES. Die konservierte Histonmethyltransferase DOT1B katalysiert die Methylierung von Histon H3 am Lysin 76 und ist an der ES-Regulation beteiligt. DOT1B gewährleistet den transkriptionell inaktiven Status der ES und beeinflusst die Kinetik eines transkriptionellen ES Wechsels. Die molekularen Komponenten, die DOT1B diese regulatorischen Funktionen an der ES ermöglichen, sind jedoch noch unbekannt. Um mehr über die von DOT1B vermittelten Mechanismen zu erfahren, ist es notwendig, DOT1B-assoziierte Proteine zu identifizieren. Durch die Anwendung von komplementären biochemischen Proteinaufreinigungsmethoden gelang es mir, mehrere potentielle Proteininteraktionen zu DOT1B zu entdecken. Um die Daten zu validieren, führte ich weitere Proteinaufreinigungen mit den vielversprechendsten Kandidaten durch. Eine Interaktion zwischen DOT1B und der Ribonuklease H2 konnte bestätigt werden - eine Interaktion, die noch nie zuvor in anderen Organismen beschrieben wurde. In Trypanosomen gewährleistet Ribonuklease H2 die Genomintegrität, indem das Enzym RNA-DNA-Hybride auflöst. Diese Strukturen können zudem, wenn sie nicht richtig prozessiert werden, antigene Variation initiieren. In dieser Studie wurde daher außerdem DOT1B’s Beitrag zu diesem Weg der Initiation der antigenen Variation analysiert. In der Tat konnte gezeigt werden, dass DOT1B RNA-DNA-Hybride moduliert und die Genomintegrität sowie VSG-Wechselrate beeinflusst. Die Tatsache, dass in DOT1B-Mutanten VSG Isoformen von den unterschiedlichsten Genomregionen exprimiert wurden, deutet darauf hin, dass rekombinations-basierte Ereignisse dem VSG-Wechsel zu Grunde lagen. Da in den DOT1B-Mutanten ähnliche VSG exprimiert wurden wie in Ribonuklease H2-Mutanten, kann vermutet werden, dass beide Proteine bei der Modulation der RNA-DNA-Hybride zusammenwirken, um antigene Variation zu regulieren. Trypanosomen und Leishmanien werden mittels Insektenvektoren auf den nächsten Säugerwirt übertragen. Sie müssen daher nicht nur im Säugerwirt überleben, sondern sich auch an die extrem unterschiedliche Umgebung im Vektor anpassen. Dafür differenzieren sich die Parasiten in speziell angepasste Zellstadien. Zusätzlich zu der antigenen Variation beeinflusst DOT1B die Entwicklungsdifferenzierung in Trypanosoma brucei. In Leishmanien hingegen ist über den Einfluss von chromatin-assoziierten Proteinen wie DOT1B auf die Überlebens- und Anpassungsstrategien wesentlich weniger bekannt. Um herauszufinden, ob die Funktionen von DOT1B in Leishmanien konserviert sind, wurden Phänotypen nach Gendeletion analysiert. Wie auch in Trypanosoma brucei konnte gezeigt werden, dass DOT1B für das Überleben der Parasiten nicht essentiell ist. Die Deletion von DOT1B ging mit einem Verlust der Trimethylierung von Histon H3 am Lysin 73 (dem zum trypanosomalen H3K76 homologen Lysin) einher, was darauf hinweist, dass DOT1B auch in Leishmanien allein für die Katalyse dieser posttranslationalen Modifikation verantwortlich ist. Wie in Trypanosoma brucei konnte eine Dimethylierung nur in der Mitose/Zytokinese beobachtet werden, wobei die Trimethylierung während des gesamten Zellzyklus in Wildtyp-Zellen nachweisbar war. Im Gegensatz zum trypanosomalen DOT1B war LmxDOT1B für die Differenzierung in vitro entbehrlich. Vorläufige Daten zeigen jedoch, dass das Enzym für eine wirksame Makrophageninfektion wesentlich ist. Zusammenfassend zeigte diese Studie, dass die Identifizierung von Proteinnetzwerken und die Charakterisierung von Funktionen orthologer Proteine aus verwandten Parasiten wirksame Werkzeuge sind, um unser Verständnis der Überlebensstrategien der Parasiten zu verbessern. Solche Erkenntnisse sind ein notwendiger Schritt auf dem Weg zu effektiveren Behandlungsmethoden für die verheerenden Krankheiten, die diese Parasiten verursachen. KW - Trypanosoma brucei KW - Leishmania KW - Chromatin KW - Histon-Methyltransferase KW - DNA repair KW - developmental differentiation KW - DOT1 KW - Ribonuclease H2 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219936 ER - TY - THES A1 - Malkmus, Christoph T1 - Establishment of a 3D \(in\) \(vitro\) skin culture system for the obligatory human parasite \(Onchocerca\) \(volvulus\) T1 - Etablierung eines 3D-\(in\)-\(vitro\)-Hautkultursystems für den obligat humanen Parasiten \(Onchocerca\) \(volvulus\) N2 - Onchocerciasis, the world's second-leading infectious cause of blindness in humans –prevalent in Sub-Saharan Africa – is caused by Onchocerca volvulus (O. volvulus), an obligatory human parasitic filarial worm. Commonly known as river blindness, onchocerciasis is being targeted for elimination through ivermectin-based mass drug administration programs. However, ivermectin does not kill adult parasites, which can live and reproduce for more than 15 years within the human host. These impediments heighten the need for a deeper understanding of parasite biology and parasite-human host interactions, coupled with research into the development of new tools – macrofilaricidal drugs, diagnostics, and vaccines. Humans are the only definitive host for O. volvulus. Hence, no small-animal models exist for propagating the full life cycle of O. volvulus, so the adult parasites must be obtained surgically from subcutaneous nodules. A two-dimensional (2D) culture system allows that O. volvulus larvae develop from the vector-derived infective stage larvae (L3) in vitro to the early pre-adult L5 stages. As problematic, the in vitro development of O. volvulus to adult worms has so far proved infeasible. We hypothesized that an increased biological complexity of a three-dimensional (3D) culture system will support the development of O. volvulus larvae in vitro. Thus, we aimed to translate crucial factors of the in vivo environment of the developing worms into a culture system based on human skin. The proposed tissue model should contain 1. skinspecific extracellular matrix, 2. skin-specific cells, and 3. enable a direct contact of larvae and tissue components. For the achievement, a novel adipose tissue model was developed and integrated to a multilayered skin tissue comprised of epidermis, dermis and subcutis. Challenges of the direct culture within a 3D tissue model hindered the application of the three-layered skin tissue. However, the indirect coculture of larvae and skin models supported the growth of fourth stage (L4) larvae in vitro. The direct culture of L4 and adipose tissue strongly improved the larvae survival. Furthermore, the results revealed important cues that might represent the initial encapsulation of the developing worm within nodular tissue. These results demonstrate that tissue engineered 3D tissues represent an appropriate in vitro environment for the maintenance and examination of O. volvulus larvae. N2 - Onchozerkose, die weltweit zweithäufigste infektionsbedingte Ursache für Erblindung von Menschen, wird durch Onchocerca volvulus (O. volvulus) verursacht, ein parasitärer Fadenwurm. Die allgemein als Flussblindheit bekannte Onchozerkose wird mit dem Medikament Ivermectin bekämpft, das jedoch nicht die adulten Parasiten tötet, die im Menschen mehr als 15 Jahre lang leben und sich vermehren. Ein tieferes Verständnis der Biologie des Parasiten und dessen Interaktionen im menschlichen Wirt ist für die Erforschung und Entwicklung neuer Instrumente – makrofilarizide Medikamente, Diagnostika und Impfstoffe – erforderlich. Da der Mensch der einzige Endwirt für O. volvulus ist, gibt es keine Tiermodelle für dessen Vermehrung. Zu Forschungszwecken werden adulte Würmer daher chirurgisch aus subkutanen Knoten erkrankter Individuen gewonnen. Ein zweidimensionales (2D) Kultursystem ermöglicht die Entwicklung von aus dem Vektor isolierten infektiösen O. volvulus-Larven (L3) bis zu einem frühen präadulten Stadium. Als problematisch erwies sich bisher die in vitro Entwicklung von O. volvulus bis zum adulten Wurm. Unsere Hypothese ist, dass eine erhöhte biologische Komplexität des Kultursystems die Entwicklung von O. volvulus-Larven in vitro unterstützt. Daher wurden entscheidende Faktoren der in vivo-Umgebung entwickelnder Larven – die menschliche Haut – auf ein dreidimensionales (3D) Kultursystem übertragen. Dieses Kultursystem sollte 1. Haut-spezifische extrazelluläre Matrix enthalten, 2. hautspezifische Zellen und 3. einen direkten Kontakt zwischen Larven und Gewebekomponenten ermöglichen. Dafür wurde ein neuartiges Fettgewebemodell entwickelt, das in ein mehrschichtiges Hautgewebe integriert wurde – bestehend aus Epidermis, Dermis und subkutanem Fettgewebe. Die Anwendung des dreischichtigen Hautgewebes als direktes Kultursystem wurde durch technische Herausforderungen verhindert. Jedoch unterstützte die indirekte Ko-Kultur von Hautmodellen das Wachstum der Larven (L4) in vitro. Die direkte Kultur mit dem Fettgewebemodell verbesserte die Viabilität der Larven signifikant. Darüber hinaus konnten Anzeichen für eine beginnende Verkapselung der Larven durch humane Zellen und Matrix gezeigt werden kann. Die Ergebnisse demonstrieren, dass humane Gewebemodelle eine angemessene in vitro-Umgebung für die Kultur und die Erforschung von O. volvulus darstellen. KW - Tissue Engineering KW - Humanparasitologie KW - In-vitro-Kultur KW - Onchozerkose KW - Multilayered skin tissue model KW - Onchocerca volvulus KW - Skin Tissue Engineering KW - Parasitology Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317171 ER - TY - THES A1 - Weisert, Nadine T1 - Characterization of telomere-associated proteins in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Charakterisierung Telomer-assoziierter Proteine in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The unicellular pathogen Trypanosoma brucei is the causative agent of African trypanosomiasis, an endemic disease prevalent in sub-Saharan Africa. Trypanosoma brucei alternates between a mammalian host and the tsetse fly vector. The extracellular parasite survives in the mammalian bloodstream by periodically exchanging their ˈvariant surface glycoproteinˈ (VSG) coat to evade the host immune response. This antigenic variation is achieved through monoallelic expression of one VSG variant from subtelomeric ˈbloodstream form expression sitesˈ (BES) at a given timepoint. During the differentiation from the bloodstream form (BSF) to the procyclic form (PCF) in the tsetse fly midgut, the stage specific surface protein is transcriptionally silenced and replaced by procyclins. Due to their subtelomeric localization on the chromosomes, VSG transcription and silencing is partly regulated by homologues of the mammalian telomere complex such as TbTRF, TbTIF2 and TbRAP1 as well as by ˈtelomere-associated proteinsˈ (TelAPs) like TelAP1. To gain more insights into transcription regulation of VSG genes, the identification and characterization of other TelAPs is critical and has not yet been achieved. In a previous study, two biochemical approaches were used to identify other novel TelAPs. By using ˈco-immunoprecipitationˈ (co-IP) to enrich possible interaction partners of TbTRF and by affinity chromatography using telomeric repeat oligonucleotides, a listing of TelAP candidates has been conducted. With this approach TelAP1 was identified as a novel component of the telomere complex, involved in the kinetics of transcriptional BES silencing during BSF to PCF differentiation. To gain further insights into the telomere complex composition, other previously enriched proteins were characterized through a screening process using RNA interference to deplete potential candidates. VSG expression profile changes and overall proteomic changes after depletion were analyzed by mass spectrometry. With this method, one can gain insights into the functions of the proteins and their involvement in VSG expression site regulation. To validate the interaction of proteins enriched by co-IP with TbTRF and TelAP1 and to identify novel interaction proteins, I performed reciprocal affinity purifications of the four most promising candidates (TelAP2, TelAP3, PPL2 and PolIE) and additionally confirmed colocalization of two candidates with TbTRF via immunofluorescence (TelAP2, TelAP3). TelAP3 colocalizes with TbTRF and potentially interacts with TbTRF, TbTIF2, TelAP1 and TelAP2, as well as with two translesion polymerases PPL2 and PolIE in BSF. PPL2 and PolIE seem to be in close contact to each other at the telomeric ends and fulfill different roles as only PolIE is involved in VSG regulation while PPL2 is not. TelAP2 was previously characterized to be associated with telomeres by partially colocalizing with TbTRF and cells show a VSG derepression phenotype when the protein was depleted. Here I show that TelAP2 interacts with the telomere-binding proteins TbTRF and TbTIF2 as well as with the telomere-associated protein TelAP1 in BSF and that TelAP2 depletion results in a loss of TelAP1 colocalization with TbTRF in BSF. In conclusion, this study demonstrates that characterizing potential TelAPs is effective in gaining insights into the telomeric complex's composition and its role in VSG regulation in Trypanosoma brucei. Understanding these interactions could potentially lead to new therapeutic targets for combatting African trypanosomiasis. N2 - Der einzellige Pathogen Trypanosoma brucei ist der Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis, eine endemische Krankheit vertreten in der Sub-Sahara Zone Afrikas. Trypanosoma brucei wechselt zwischen einem Säugerwirt und dem Insektenvektor, der Tsetse-Fliege. Der im Blutstrom des Säugers vorkommende, extrazelluläre Parasit ändert seinen Oberflächenmantel bestehend aus dem ˈvariablen Oberflächenproteinˈ (VSG) in periodischen Abständen, um der Immunantwort des Wirtes auszuweichen. Diese antigenetische Variation wird durch die monoallelische Expression einer einzelnen VSG-Variante, lokalisiert auf den ˈBlutstromform Expressionsseitenˈ (BES), zu einem bestimmten Zeitpunkt erreicht. Diese stadienspezifischen Oberflächenproteine werden während der Differenzierung der ˈBlutstromformˈ (BSF) zur ˈprozyklischen Formˈ (PCF) im Mitteldarm der Tsetse-Fliege stillgelegt und durch Prozykline ersetzt. Wegen der subtelomeren Lokalisation wird die VSG Transkription und Stilllegung teilweise durch Homologe des Säuger Telomerkomplexes TbTRF, TbTIF2 und TbRAP1 als auch durch Telomer-assoziierte Proteine (TelAPs) wie TelAP1 reguliert. Um Einblicke in die Transkriptionsregulation der VSG Gene zu erhalten, ist die Identifikation und Charakterisierung anderer Telomer-assoziierter Proteine von großem Interesse. In einer vorherigen Studie wurden zwei komplementäre biochemische Versuchsansätze verwendet, um weitere neue TelAPs zu identifizieren. Es wurde eine ko-Immunpräzipitation (co-IP) durchgeführt, um mögliche Interaktionspartner von TbTRF zu identifizieren, sowie eine Affinitätschromatographie unter Verwendung telomerischen Wiederholungseinheiten. Hierdurch wurde eine Liste von potenziellen Kandidaten generiert. Mit diesem Ansatz wurde TelAP1 als neue Komponente des Telomerkomplexes identifiziert, welches an der Kinetik der transkriptionellen BES-Stilllegung während der Differenzierung von BSF zu PCF beteiligt ist. Um weitere Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes zu erhalten, wurden zuvor angereicherte Proteine durch einen Screening-Prozess unter Verwendung von RNA-Interferenz charakterisiert. Nach der Depletion von 21 Proteinen wurden massenspektrometrische Analysen der VSG Expressionsprofiländerungen sowie allgemeine Veränderungen des Proteomenprofils analysiert. Mit dieser Methode können Erkenntnisse über die Funktion der jeweiligen Proteine und ihrer Beteiligung an der Regulierung der antigenetischen Variation von T. brucei gewonnen werden. Um die Interaktionen von Proteinen zu validieren, welche bei den Co-Immunpräzipitationen mit TbTRF und TelAP1 angereichert wurden, habe ich eine reziproke Affinitätschromatographie mit vier der vielversprechendsten Kandidaten durchgeführt (TelAP2, TelAP3, PPL2 und PolIE). Zusätzlich bestätigte ich die Co-lokalisation von zwei Kandidaten mit TbTRF via Immunfluoreszenzaufnahmen (TelAP2, TelAP3). TelAP3 ko-lokalisiert mit TbTRF und TelAP1 und interagiert potenziell mit TbTRF, TbTIF2, TelAP1 und TelAP2 als auch mit den zwei Transläsionspolymerasen PPL2 und PolIE in BSF. PPL2 und PolIE stehen in engem Kontakt zueinander und nehmen an den Telomerenden unterschiedliche Funktionen ein, da nur PolIE an der VSG Regulation beteiligt ist. TelAP2 wurde in einer vorherigen Publikation als Telomer-assoziiertes Protein durch partielle Co-Lokalisation mit TbTRF identifiziert und Zellen zeigen nach der Depletion von TelAP2 eine Derepression von zuvor stillgelegten VSGs. In dieser Studie zeige ich, dass TelAP2 mit den Telomer-bindenden Proteinen TbTRF und TbTIF2 sowie mit dem telomerassoziierten Protein TelAP1 in BSF interagiert und dass die Depletion von TelAP2 zu dem Verlust der Co-Lokalisation von TelAP1 mit TbTRF in BSF führt. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass die Charakterisierung potenzieller TelAPs dazu beiträgt, Einblicke in die Zusammensetzung des Telomerkomplexes und dessen Rolle bei der VSG-Regulation in Trypanosoma brucei zu gewinnen. Das Verständnis dieser Interaktionen könnte möglicherweise zu neuen therapeutischen Ansatzpunkten zur Bekämpfung der afrikanischen Trypanosomiasis führen. KW - Telomer KW - Trypanosoma brucei KW - telomere-associated protein Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352732 ER -