TY - THES A1 - Dolles, Dominik T1 - Development of Hybrid GPCR Ligands: Photochromic and Butyrylcholinesterase Inhibiting Human Cannabinoid Receptor 2 Agonists T1 - Entwicklung von hybriden GPCR Liganden: Photochrome und Butyrylcholinesterase-inhibierende Cannabinoid Rezeptor 2 Agonisten N2 - While life expectancy increases worldwide, treatment of neurodegenerative diseases such as AD becomes a major task for industrial and academic research. Currently, a treatment of AD is only symptomatical and limited to an early stage of the disease by inhibiting AChE. A cure for AD might even seem far away. A rethinking of other possible targets is therefore necessary. Addressing targets that can influence AD even at later stages might be the key. Even if it is not possible to find a cure for AD, it is of great value for AD patients by providing an effective medication. The suffering of patients and their families might be relieved and remaining years may be spent with less symptoms and restrictions. It was shown that a combination of hCB2R agonist and BChE inhibitor might exactly be a promising approach to combat AD. In the previous chapters, a first investigation of dual-acting compounds that address both hCB2R and BChE was illustrated (figure 6.1). A set of over 30 compounds was obtained by applying SARs from BChE inhibitors to a hCB2R selective agonist developed by AstraZeneca. In a first in vitro evaluation compounds showed selectivity over hCB1R and AChE. Further investigations could also prove agonism and showed that unwanted off-target affinity to hMOP receptor could be designed out. The development of a homology model for hCB2R (based on a novel hCB1R crystal) could further elucidate the mode of action of the ligand binding. Lastly, first in vivo studies showed a beneficial effect of selected dual-acting compounds regarding memory and cognition. Since these first in vivo studies mainly aim for an inhibition of the BChE, it should be the aim of upcoming projects to proof the relevance of hCB2R agonism in vivo as well. In addition, pharmacokinetic as well as solubility studies may help to complete the overall picture. Currently, hybrid-based dual-acting hCB2R agonists and selective BChE inhibitors are under investigation in our lab. First in vitro evaluations showed improved BChE inhibition and selectivity over AChE compared to tacrine.78 Future in vitro and in vivo studies will clarify their usage as drug molecules with regard to hepatotoxicity and blood-brain barrier penetration. Since the role of hCB2R is not yet completely elucidated, the use of photochromic toolcompounds becomes an area of interest. These tool-compounds (and their biological effect) can be triggered upon irradiation with light and thus help to investigate time scales and ligand binding. A set of 5-azobenzene benzimidazoles was developed and synthesized. In radioligand binding studies, affinity towards hCB2R could be increased upon irradiation with UV-light (figure 6.2). This makes the investigated compounds the first GPCR ligands that can be activated upon irradiation (not vice versa). The aim of upcoming research will be the triggering of a certain intrinsic activity by an “efficacy-switch”. For this purpose, several attempts are currently under investigation: an introduction of an azobenzene moiety at the 2-position of the benzimidazole core already led to a slight difference in efficacy upon irradiation with UV light. Another approach going on in our lab is the development of hCB1R switches based on the selective hCB1R inverse agonist rimonabant. First in vitro results are not yet available (figure 6.3). N2 - Durch die weltweit steigende Lebenserwartung rückt die Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, wie der Alzheimer’schen Krankheit, immer mehr in den Fokus der industriellen und akademischen Forschung. Momentan erfolgt die Behandlung der Alzheimer’schen Krankheit durch die Blockade der AChE nur symptomatisch und in einem Frühstadium. Eine Heilung scheint dabei in weiter Ferne zu liegen, weshalb ein Umdenken nach neuen Ansätzen stattfinden sollte. Der Schlüssel könnte darin liegen, dass man biologischen Funktionen adressiert, die den Verlauf der Alzheimer’schen Krankheit auch in einem späteren Stadium beeinflussen. Selbst wenn eine Heilung in absehbarer Zeit unmöglich bleibt, ist es für die betroffenen Patienten eine erhebliche Erleichterung auf eine effektive Medikation zurückgreifen zu können. Das Leid der Patienten und ihrer Familien könnte dadurch gelindert und die verbleibenden Lebensjahre ohne Symptome und Einschränkungen genossen werden. In den vorangegangenen Kapiteln wurde bereits gezeigt, dass die Kombination aus einem hCB2R Agonisten und einem BChE Hemmer genau diesen vielversprechenden Ansatz verfolgt. Ein erster Entwicklungsansatz von dual-aktiven hCB2R Agonisten / BChE Hemmern wurde in den Kapiteln 3 und 4 ausführlich dargestellt (Abb. 7.1). Ein Set von 30 verschiedenen Verbindungen wurde synthetisiert, indem die Erkenntnisse der Struktur-Wirkungsbeziehungen von anderen BChE Hemmern auf einen von AstraZeneca entwickelten selektiven hCB2R Agonisten angewendet wurden. Erste in vitro Untersuchungen zeigten eine hohe Selektivität gegenüber hCB1R und AChE auf. Desweiteren verhielten sich alle getesteten Substanzen wie Agonisten. Nachdem ausgewählte Substanzen auf ihre „off-target“ Wechselwirkung mit dem hMOP Rezeptor untersucht wurden, konnten diese strukturellen Merkmale in nachfolgenden Entwicklungsbemühungen berücksichtigt werden. Die Entwicklung eines hCB2R Homologiemodells (basierend auf einer erst kürzlich veröffentlichten hCB1R Kristallstruktur) lieferte wertvolle Informationen zum Bindemodus und der Wirkweise der Liganden am Rezeptor. Schlussendlich konnte in einer ersten in vivo Studie bewiesen werden, dass ausgewählte dual-aktive Substanzen eine positive Auswirkung auf das Gedächtnis und die kognitiven Eigenschaften haben. Da diese in vivo Untersuchungen hauptsächlich die Hemmung der BChE berücksichtigen, wäre es sinnvoll, in zukünftigen Studien den Einfluss der hCB2R Agonisten zu untersuchen. Pharmakokinetik- und Löslichkeitsstudien könnten zudem helfen, das Gesamtbild zu komplettieren. Im Moment befinden sich auch dual-aktive hCB2R Agonisten / BChE Hemmer in der Entwicklung, die den Hybrid-Ansatz verfolgen. Erste in vitro Untersuchungen dazu ergaben vielversprechende Ergebnisse mit einer guten Selektivität gegenüber AChE und einer erhöhten Hemmung der BChE verglichen mit Tacrin.78 Es wird Gegenstand zukünftiger in vitro und in vivo Untersuchungen sein, herauszufinden, ob sich diese Hybride mit Hinblick auf Hepatotoxizität und Blut-Hirnschrankengängigkeit als Wirkstoffe eignen. Da die Rolle des hCB2R noch nicht komplett erforscht ist, erfreut sich die Entwicklung von sog. „tool-compounds“ großen wissenschaftlichen Interesses. Durch die Bestrahlung mit Licht können diese „tool-compounds“ (und ihr nachgeschalteter biologischer Effekt) gesteuert werden. Eine genauere Untersuchung von Zeitskalen und Ligandbindung an den Rezeptor wird dadurch ermöglicht. Ein Set von 5-Azobenzolbenzimidazolen wurde zu diesem Zwecke entwickelt und synthetisiert. In Radioligandbindungsstudien konnte gezeigt werden, dass sich die Affinität gegenüber dem hCB2R durch die Bestrahlung mit UV-Licht erhöhen lässt (Abb. 7.2). Diese Eigenschaft macht die entwickelten Substanzen zu den ersten GPCR-Liganden, die durch Licht aktiviert werden können (nicht umgekehrt wie bei den bisher beschriebenen photochromen GPCR-Liganden). Ziel zukünftiger Forschungsbemühungen wird die Steuerung einer bestimmten intrinsischen Aktivität / Effekts durch die Bestrahlung mit Licht sein. Zu diesem Zwecke werden aktuell mehrere Herangehensweisen untersucht: die Einführung eines Azobenzol-Strukturelements an Position 2 des Benzimidazol-Grundgerüsts zeigte in ersten in vitro Untersuchungen bereits Unterschiede bei Bestrahlung mit UV-Licht. Eine weitere Herangehensweise ist die Entwicklung von „Photo-Schaltern“ auf Basis von Rimonabant, einem selektiven hCB1R inversen Agonisten. Hier stehen erste in vitro Ergebnisse jedoch noch aus (Abb. 7.3). KW - Ligand KW - Hybrid KW - GPCR KW - Cannabinoid Receptor KW - Butyrylcholinesterase KW - Agonist KW - Agonist KW - Cholinesterase KW - G-Protein gekoppelte Rezeptor KW - Hybrid GPCR Ligands Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163445 ER - TY - THES A1 - Plank, Christina T1 - Untersuchung von Dihydroisochinolinonderivaten als mögliche Inhibitoren von Hsc70 T1 - Analyzing dihydroisoquinolinone derivatives as potential inhibitors of Hsc70 N2 - Einhergehend mit einer steigenden Lebenserwartung nimmt auch die Zahl der am Multiplen Myelom Erkrankten zu. Bis dato gibt es nur wenige Therapieansätze dieser selten vorkommenden Blutkrebserkrankung. Im Zusammenhang mit der Entstehung des Multiplen Myeloms stehen vor allem zwei bedeutende Hitzeschockproteine: Hsp90 und Hsp70. Beide haben die Aufgabe, Zellen vor Apoptose zu schützen. In proliferierenden Plasmazellen ist eine Überexpression an Hsp90 zu beobachten. Entwickelte Inhibitoren führten zwar zu einer verminderten Hsp90-Aktivität, allerdings wurde diese durch eine vermehrte Expression von Hsp70 kompensiert, weshalb Myelomzellen weiterhin proliferierten. Aus diesem Grund bietet sich Hsp70 als weiterer Angriffspunkt in der Therapierung des Multiplen Myeloms an. Die bislang entwickelten Inhibitoren binden entweder an die Nukleotid- oder Substratbindedomäne. Da beide Stellen unspezifisch sind, wurden durch virtuelles Screening potenzielle Inhibitoren für Hsp70 identifiziert, welche in vitro und in vivo tatsächlich Effekte hinsichtlich der Herunterregulierung von Hsp70 zeigten. Ob die entwickelten Substanzen jedoch direkt an Hsp70 binden, war die Fragestellung der vorliegenden Arbeit. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern die entwickelten Inhibitoren an Hsp70 binden und dieses inhibieren. Die humane Hsp70-Familie besitzt sechzehn Mitglieder, die alle ähnliche Aufgaben und Strukturmerkmale aufweisen. Für die durchgeführten Versuche wurde die Hsp70-Isoform Hsc70 verwendet. In einem Protein-Ligand-Assay konnte gezeigt werden, dass die meisten Verbindungen durch Aggregatbildung zu einer Inhibition von Hsc70 führten. Durch Zugabe von Detergenz konnten die gebildeten Aggregate aufgebrochen und so der Inhibitionseffekt aufgehoben bzw. deutlich reduziert werden. Damit konnte gezeigt werden, dass die in Zell- und Mausversuchen beobachteten Effekte vermutlich nicht auf eine direkte Inhibition von Hsc70 zurückzuführen sind. Ob diese Effekte nun ebenfalls auf Aggregatbildung beruhen oder aber ein anderes Protein als das vermutete Hsc70 inhibiert wird, was über eine Signalkaskade zur Inhibition von Hsc70 führt, wäre eine interessante Fragestellung für weitere Untersuchungen. Da sowohl in NMR-Versuchen als auch dem durchgeführten Protein-Ligand-Assay gezeigt werden konnte, dass die vormals als potenzielle Inhibitoren entwickelten Verbindungen nur schwach aktiv sind, wurde durch Fragment-basierte Ansätze eine andere Bindestelle für mögliche Inhibitoren identifiziert. Hierbei konnte N-Acetyl-D-Glucosamin in der Nukleotidbindedomäne von Hsc70 detektiert werden. Hieraus könnten sich neue Ansätze zur Entwicklung neuartiger in silico entwickelter Hsc70-Inhibitoren ergeben. Ausgangspunkt für die Docking-Studien zur Entwicklung neuer Hsp70-Inhibitoren war die Kristallstruktur von bHsc70 ED 1-554, einer trunkierten Doppelmutante des nativen Hsc70. Bis dato ist diese 554 Aminosäuren umfassende Mutante die einzige Hsc70-Variante von der die Zweidomänenstruktur kristallisiert werden konnte. Für dieses Konstrukt wurde zunächst ein optimiertes Aufreinigungsprotokoll entwickelt, um dann Kristallisationsversuche mit ausgewählten AH-Verbindungen, die in den Docking-Studien entwickelt wurden, durchzuführen. Hierbei konnte jedoch keine Bindung festgestellt werden. Die Kristallisation mit Ver-155008, einem bekannten Hsc70-Inhibitor, führte jedoch zur ersten Zweidomänenstruktur von Hsc70 mit gebundenem Ver-155008. Neben der obigen Fragestellung wurde außerdem untersucht, wie funktional aktiv das trunkierte Hsc70-Konstrukts ist. Hier zeigte sich, dass aufgrund des fehlenden C-Terminus zwar eine geringe Aktivität von 30 % im Vergleich zur Volllänge zu beobachten war. Für eine nahezu vollständige Rückfaltungsaktivität ist aber der C-Terminus essentiell. Weiterhin konnte in ITC-Versuchen der Kd-Wert von Ver-155008 an die verwendete Mutante ermittelt werden, der dem bereits bekannten Kd von Ver-155008 an das native Hsc70 ähnlich ist. N2 - Coming along with an increasing life span, the number of multiple myeloma incidences permanently increases. By now, there is no possibility to cure this rare blood cancer disease. In multiple myeloma, there are two major proteins playing a crucial role in its development: Hsp70 and Hsp90. Both prevent cells from apoptosis. In proliferating plasma cells, Hsp90 is overexpressed. Inhibitors for Hsp90, however, led to an overexpression of Hsp70. Therefore, Hsp70 seems to be an attractive target in multiple myeloma. Developed Hsp70 inhibitors are likely to bind either to the nucleotide or substrate binding domain. Since both domains are likely unspecific, new inhibitors were designed by virtual screening which indeed showed inhibition effects on Hsp70 in vitro and in vivo. Nevertheless, the question had to be answered whether these compounds directly bind to Hsp70 or if the expression of Hsp70 is downregulated through a signal cascade in the cell. In this thesis, it was analyzed whether and how in silico designed and in cell-based assays active compounds inhibit Hsp70. The human Hsp70 family comprises 16 members which have similar structures and functions in the cell. For all conducted experiments, Hsp70 isoform 8, also known as Hsc70, was used. In a protein-ligand assay, it was shown that the compounds inhibit Hsc70 due to aggregate formation. Upon the addition of detergent, aggregates were broken down and the inhibition effect was reversed. Therefore the effects that have been observed in cell and mouse experiments are most likely not due to a direct inhibition of Hsc70. Whether these effects are due to aggregate formation or whether another protein was inhibited which then led to a downregulation of Hsc70 via a signal cascade, is a challenging question for further studies. Since it was shown both in protein-ligand assays and NMR experiments that the favored compounds were only weakly active, fragment-based screening was used to find a new core structure for further design studies. N-acetyl-D-glucosamine was found to bind to the NBD of Hsc70 which now might serve as a starting point for the development of novel Hsp70 inhibitors. For all docking studies that have been conducted to develop novel Hsc70 inhibitors, the crystal structure of bHsc70 ED 1-554 was used, which is a truncated and double-mutated version of the native Hsc70. This construct has been the only crystal structure so far of which the two-domain structure of Hsc70 has been determined. For this construct a purification protocol was optimized to use bHsc70 ED 1-554 for crystallization experiments to determine the binding of the in silico developed AH compounds. Although no binding of these compounds could be observed, the two-domain structure of bHsc70 ED 1-554 with bound Ver-155008, a known Hsc70 inhibitor, could be determined. Besides, the activity of this truncated Hsc70 double-mutant was analyzed. Due to the lacking C terminus, which is important for the interaction with client proteins, a reduced activity of about 30 % was observed. Nevertheless, in ITC experiments the Kd value of the binding of Ver-155008 to bHsc70 ED 1-554 showed that the affinity is similar to that of native Hsc70. KW - Hitzeschockproteine KW - Dihydroisochinolinderivate KW - Hsc70 KW - Inhibitor KW - Multiples Myelom KW - Dihydroisochinolinonderivate Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162655 ER - TY - THES A1 - Peinz, Ulrich T1 - Strukturbasiertes computergestütztes Wirkstoffdesign an flexiblen Proteintargets: Aldose Reduktase und Hsp70 T1 - Structure-based computer-aided drug design on flexible protein targets: aldose reductase and Hsp70 N2 - Proteine sind dynamische makromolekulare Systeme, die nativ in verschiedenen Konfor-mationen vorliegen. Besonders Proteine mit einer ausgeprägten intrinsischen Flexibilität stellen als biologische Zielstrukturen für das computergestützte strukturbasierte Wirkstoff-design auch heute noch eine große Herausforderung dar. Die vorliegende Arbeit thematisiert die computergestützte Identifizierung neuer Liganden mit inhibitorischer Aktivität für zwei strukturell sehr flexible Enzyme, die bei verschiedenen Krankheiten eine pathophysio-logische Rolle spielen. Ein Schwerpunkt lag in diesem Zusammenhang auf der Entwicklung virtueller Screeningverfahren, die es ermöglichten, die Flexibilität der Proteine adäquat zu berücksichtigen. Der erste Teil der Arbeit beschreibt ein virtuelles Screeningverfahren für die Identifizierung von Liganden einer neuen, durch Molekulardynamik (MD) Simulationen generierten Proteinkonformation der Aldose Reduktase (AR), einem Enzym, das im Zusammenhang mit der Entstehung von Folgeerkrankungen bei Diabetes mellitus steht. Die angewandte Vorgehensweise zeigt Möglichkeiten auf, wie eine ausgeprägte Proteinflexibilität mit Hilfe computerbasierter Methoden im Rahmen eines virtuellen Screenings explizit berücksichtigt werden kann. Die Studie war auf der einen Seite hinsichtlich methodischer Aspekte von Interesse, da dadurch sowohl eine Beurteilung der Aussagekraft computergenerierter Proteinkonformationen, als auch eine Überprüfung der prinzipiellen Eignung MD-generierter Enzymkonformationen als Template für strukturbasierten Ligandendesignstudien, erfolgen konnte. Auf der anderen Seite war diese Studie aufgrund einer möglichen Erweiterung des bekannten Konformationsraumes der AR auch aus strukturbiologischer Sicht von Interesse. Bei der Suche nach geeigneten Liganden in Moleküldatenbanken kommerziell erhältlicher Verbindungen wurde eine protein- und eine ligandbasierte Strategie verfolgt. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zunächst eine vergleichende Strukturanalyse verschiedener AR-Ligand-Komplexstrukturen, um Informationen hinsichtlich experimentell aufgeklärter Bindemotive, Protein-Ligand-Interaktionen sowie bestehender struktureller Differenzen zwischen der MD-Konformation und anderen Bindetaschenkonformationen der AR zu sammeln. Anschließend wurde die Bindetasche der MD-generierten Proteinstruktur hinsichtlich günstiger Interaktionspunkte analysiert, um aus den Erkenntnissen Pharmako-phormodelle als Filter für die nachfolgenden virtuellen Datenbanksuchen zu entwickeln. Als Ergänzung zum proteinbasierten Ansatz wurde eine ligandbasierte Strategie für die Identifizierung potenzieller Kandidatenmoleküle verfolgt. Dabei diente ein bekannter AR-Inhibitor als Templatstruktur, bei dem aufgrund zuvor durchgeführter Dockingexperimente die begründete Annahme bestand, dass dieser die Bindetaschenform der MD-Proteinkonfor-mation stabilisieren könnte. Hierbei wurde zunächst eine Moleküldatenbank aus kommerziell erhältlichen Verbindungen, die alle über eine bestimmte Substruktur als Ankergruppe verfügten, aufgebaut und anschließend durch Berechnung molekularer Ähnlichkeiten zu der Templatstruktur auf mögliche Kandidatenmoleküle durchsucht. Die virtuell identifizierten Moleküle der beiden Ansätze wurden im Anschluss mit Hilfe von Dockingsimulationen in die Bindetasche der MD-generierten Proteinkonformation gedockt und die berechneten Bindeposen mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren bewertet. Im nächsten Schritt erfolgte eine Untersuchung der Selektivität der Kandidatenmoleküle anhand eines Cross-Dockingexperiments an verschiedenen Bindetaschenkonformationen der AR. Auf der Grundlage aller durch das virtuelle Screeningverfahren gesammelten Informationen wurde eine finale Molekülauswahl getroffen und sechs kommerziell verfügbare Moleküle für experimentelle Untersuchungen bezogen. Die experimentelle Bestimmung der Enzyminhibition wurde dabei von Kooperationspartnern mit Hilfe eines in vitro Assays untersucht. Aufgrund einer unzureichenden Löslichkeit von vier Substanzen unter den Assaybedingungen konnte lediglich das Inhibitionspotenzial von zwei Verbindungen untersucht werden. Eine der Verbindungen zeigte bemerkenswerterweise eine inhibitorische Aktivität im einstelligen mikromolaren Bereich. Eine finale Beurteilung, ob die Zielsetzung dieser Studie, eine neue computergenerierte Bindetaschenkonformation der AR experi-mentell zugänglich zu machen, durch die vorgeschlagenen Verbindungen erfüllt werden konnte, konnte zum Zeitpunkt der Anfertigung der Dissertation aufgrund ausstehender Kristallstrukturen der jeweiligen AR-Ligand-Komplexe nicht erfolgen und bleibt das Ziel zukünftiger Arbeiten. Die Studie zeigte jedoch deutlich, dass nicht nur experimentell aufgeklärte Proteinstrukturen sondern auch die Nutzung von mit Hilfe computerbasierter Verfahren, wie z.B. mittels MD Simulationen, berechneter Proteinkonformationen als Templatstrukturen für die Identifi-zierung neuer Liganden hilfreich sein kann und daher deren Verwendung für diese Zielsetzung ihre Berechtigung hat. Der zweite Teil der Arbeit handelt von der computergestützten Identifizierung nieder-molekularer Liganden einer neuen potenziellen Bindestelle der biologischen Zielstruktur Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren. Hsp70 spielt eine pathophysiologische Rolle bei verschiedenen Krebserkrankungen sowie diversen weiteren Erkrankungen, wie z.B. neurodegenerativen Erkrankungen und Infektions-krankheiten. Bei der neuen potenziellen Bindestelle, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit näher untersucht wurde, handelte es sich um das Interdomäneninterface, der Schnittstelle zwischen der Nukleotid- und Substratbindedomäne von Hsp70. Zum Zeitpunkt der Arbeit waren keine Liganden dieser Proteinregion in der Literatur beschrieben, weshalb es zunächst galt, die Hypothese der Adressierbarkeit dieser Zielregion durch niedermolekulare Liganden zu verifizieren. Hierfür wurde ein virtuelles Screening durchgeführt, bei dem protein- sowie ligandbasierte Suchstrategien zum Einsatz kamen. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zunächst eine Analyse der Hsp70 Tertiär-struktur auf potenziell vorhandene Ligandenbindestellen. Im Anschluss wurde das Interdomäneninterface auf günstige Interaktionspunkte für bestimmte Atomtypen und funktionelle Gruppen zukünftiger Liganden untersucht. Basierend auf diesen Informationen wurde ein Pharmakophormodell als Filter für nachfolgende virtuelle Datenbanksuchen entwickelt. Bei dem ligandbasierten Ansatz fungierte der bekannte Hsp70-Ligand Apoptozol als Templatstruktur für die virtuelle Datenbanksuche, da die Ergebnisse eines vorab durchge-führten Cross-Dockingexperiments deutlich auf eine Bindung des Moleküls an das Interdomäneninterface hinwiesen. Diese Dockingstudie lieferte erste wertvolle Hinweise hinsichtlich der Bindestelle und potenzieller Bindemodi des Moleküls an Hsp70. Im Anschluss an die virtuellen Datenbanksuchen wurden die identifizierten Kandidaten-moleküle hinsichtlich möglicher Bindemodi und Bindungsaffinitäten mittels Docking-simulationen in Verbindung mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren untersucht. Abschließend wurden neun ausgewählte Kandidatenmoleküle von kommerziellen Anbietern bezogen und mit Hilfe von in vitro Assays von Kooperationspartnern innerhalb der Klinischen Forschergruppe 216 auf ihre zytotoxische Aktivität gegenüber Multiplen Myelomzellen untersucht. Dabei konnte für fünf der neun getesteten Verbindungen bereits bei Konzentrationen im ein- bzw. zweistelligen mikromolaren Bereich eine Aktivität gemessen werden, was einer formalen Trefferquote von 56% entspricht. Weiterhin wurde und wird in Folgearbeiten von Kooperationspartnern versucht, eine Bindung der ausgewählten Kandidatenmoleküle an Hsp70 näher zu charakterisieren und sowohl am separierten Protein, als auch in der Targetzelle nachzuweisen. Darüber hinaus wurde zusätzlich ein fragmentbasierter Ansatz, basierend auf einer bestimmten Substruktur, die als eine Art Ankergruppe fungieren sollte, verfolgt. Dabei diente bei der virtuellen Suche in Moleküldatenbanken kommerzieller Anbieter ein Molekülfragment als Suchanfrage. Aus dem identifizierten Molekülsatz wurden Verbindungen unterschied-lichster struktureller Klassen für nachfolgende Dockingexperimente ausgewählt. Die berechneten Bindeposen wurden einem Re-Scoringverfahren für eine zusätzliche Abschätzung der Bindungsaffinität unterzogen. Schließlich wurden die fünf vielver-sprechendsten Verbindungen für nachfolgende experimentelle Untersuchungen kommerziell bezogen. Die Ergebnisse der nachfolgenden röntgenkristallographischen Aufklärung der Protein-Ligand-Komplexe lagen bei der Anfertigung der vorliegenden Dissertation noch nicht abschließend vor und sind Bestandteil aktueller Forschungarbeiten. Mit den durchgeführten virtuellen Screeningverfahren konnten erstmals potenzielle Liganden des Hsp70-Interdomäneninterfaces als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren identifiziert werden. Weiterhin können die identifizierten, zytotoxisch aktiven Verbindungen als Leitstrukturen zukünftiger Inhibitordesignstudien dienen, mit dem Ziel sowohl die Zytotoxizität dieser Moleküle zu optimieren, als auch Struktur-Wirkungsbeziehungen für die Entwicklung von Inhibitoren mit verbesserten biologischen Aktivitätsprofilen abzuleiten. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der computerbasierten Charakterisierung der Proteinflexibilität von Hsp70 mit Hilfe von MD Simulationen. In diesem Zusammenhang erfolgte eine Untersuchung intrinsischer Proteinbewegungen sowie des Konformations-raumes anhand von verschiedenen Hsp70-Enzymstrukturen. Die durchgeführten MD Simulationen waren zum Zeitpunkt der Arbeit die ersten Untersuchungen dieser Art, die nicht nur an einer einzelnen Domäne, sondern an ganzen Zweidomänenstrukturen von Hsp70 erfolgten. Die generierten Trajektorien bestätigten die überdurchschnittlich hohe Flexibilität der Zielstruktur Hsp70. Die im Rahmen der Studie identifizierten, zum Zeitpunkt der Arbeit noch nicht beschriebenen Proteinkonformere erweiterten das Spektrum der bekannten Hsp70-Proteinkonformationen erheblich und lieferten mögliche Enzymkonformationen, die als Templatstrukturen für zukünftige strukturbasierte Wirkstoffdesignstudien dienen können. Darüber hinaus stützten die Beobachtungen die Hypothese der prinzipiellen Eignung des Interdomäneninterfaces von Hsp70 als eine Bindestelle für neue Inhibitoren. Auf der Grundlage der gewonnenen Informationen war es weiterhin möglich, eine erste Hypothese hinsichtlich eines potenziellen inhibitorischen Wirkmechanismus der Liganden des Interdomäneninterfaces zu formulieren. Abschließend lässt sich festhalten, dass durch die vorliegende Arbeit viele neue strukturbiologische Erkenntnisse über Hsp70 gewonnen wurden. Dennoch besteht weiterer Forschungsbedarf, um die Strukturbiologie von Hsp70 umfassend aufzuklären. Möglicher-weise können in zukünftigen Studien Enzymstrukturen aufgeklärt werden, die die Existenz der in silico erzeugten und in der Arbeit beschriebenen Proteinkonformere bestätigen. N2 - Proteins are dynamic macromolecular systems, natively existing in different conformations. Particularly proteins with a marked intrinsic flexibility serving as biological targets issue a challenge to computational structure-based drug design even today. This thesis addresses the computer-aided identification of new inhibitors of two structurally highly flexible enzymes which are playing a pathophysiological role in different diseases. Thus, the focus was on the development of virtual screenings that enable considering the protein flexibility adequately. The first part of this thesis describes a virtual screening aiming to identify ligands of a new protein conformation of aldose reductase (AR) that was generated by molecular dynamics (MD) simulations. AR is an enzyme that is related to secondary diseases of diabetes mellitus. The conducted strategy reveals possibilities how pronounced protein flexibility can explicitly be considered by computer-based methods within the scope of a virtual screening. On the one hand, the study was of special interest because of methodical aspects as both an assessment of the significance of computer-generated protein conformations and an examination of the suitability of MD-generated enzyme conformations as templates for structure-based ligand design studies could be made. On the other hand, the study was of interest with regard to structural biology due to a possible expansion of the known conformational space of the enzyme. The identification of suitable ligands out of a database of commercially available compounds was performed with the help of a protein-based as well as a ligand-based approach. During the protein-based approach a comparative structural analysis of different AR-ligand complexes was first done to collect information about experimentally elucidated binding motives, protein-ligand interactions and existing structural differences between the MD-conformation and other existing AR-binding pocket conformations. Afterwards, the binding pocket of the MD-generated protein structure was analysed with regard to favoured interaction sites. These findings served as basis for the development of pharmacophore models serving as a filter in subsequent in silico database screenings. In addition to the protein-based approach a ligand-based strategy was followed to identify potential candidate molecules. A well-known inhibitor of AR served as template structure. Based on previously conducted docking experiments one may assume that this compound might be able to stabilise the binding pocket of the MD-conformation. Consequently, a database of commercially available compounds all containing a certain substructure as anchor group was generated and feasible candidate molecules were searched via calculation of molecular similarities between database molecules and the template structure. All identified compounds were subsequently docked into the binding pocket of the MD-generated protein conformation and predicted binding poses were assessed by a re- and consensus scoring procedure. In the next step selectivity investigations at different AR binding pocket conformations were performed on the basis of a cross-docking experiment. In accordance with all information received during the virtual screening process a final compound selection was made and six commercially available molecules were ordered for further experimental analyses. These experiments were performed by cooperation partners using a well established in vitro assay. As a result of an insufficient solubility of four compounds under the assay conditions, the inhibitory potency of only two molecules could be determined. Remarkably, one compound showed an inhibitory activity at a one-digit micromolar concentration. However, as crystal structures of the particular AR-ligand complexes were pending at the time of preparing the thesis, it was not possible to finally conclude whether the purpose of this study to make a new computationally generated binding pocket conformation of AR experimentally accessible could be achieved. This task remains the aim of future projects. The study clearly demonstrated that not only the use of experimentally elucidated protein structures as template structures can be useful for the identification of new ligands but also the use of structures generated by computer-based procedures like MD simulations. The second part of this thesis is about the computer-aided identification of small ligands of a new potential binding site of the biological target heat shock protein 70 (Hsp70), as a novel Hsp70 inhibitor class. Hsp70 plays a pathophysiological role in different cancer diseases and other diseases such as neuro-degenerative disorders and infectious diseases. The interdomain interface between the nucleotide and the substrate binding domain of Hsp70 represents the new potential binding site and was comprehensively investigated as part of the present thesis. At the time of the study no ligand of this protein region was described in the literature. Thus, the hypothesis whether the target site represents an addressable binding site was needed to be proven by small ligands. For this purpose a virtual screening was conducted by using both protein- and ligand-based search strategies. During the protein-based approach, the tertiary structure of Hsp70 was analysed with regard to potentially existing ligand binding sites. Subsequently, the interdomain interface was scanned to identify favourable interaction sites of specific atom types and functional groups of future ligands. Based on the gathered information a pharmacophore model was developed, serving as a query in following in silico database screenings. The known Hsp70 ligand Apoptozol was of use as template structure for virtual database screenings as results of a previously performed cross-docking experiment indicated that the molecule binds to the interdomain interface. The study provided initial valuable hints about the binding site and potential binding modes of the molecule at Hsp70. After database screenings the identified candidate molecules were tested with regard to their possible binding modes and binding affinities by docking simulations combined with a re- and a consensus scoring procedure. Finally, nine selected compounds were purchased from commercial suppliers and their cytotoxic activity towards multiple myeloma cells was tested in an in vitro assay by cooperation partners of the clinical research group 216. Thereby, five out of nine tested compounds showed a cytotxic activity at one- to two-digit micromolar concentrations, resulting in a formal hit rate of 56%. Ongoing research projects are being made to further characterise the binding of the chosen molecules to Hsp70 and to verify the binding to both the isolated protein and the protein inside the target cells. Furthermore, a fragment-based approach was followed based on a specific substructure that might be serving as an anchor group for a targeted binding to the interdomain interface. A molecular fragment served as query during the virtual search in several compound databases of commercial suppliers. Out of the resulting molecule collection, only members of different, most diverse structural classes were chosen for subsequent docking experiments. As a next step, the calculated binding poses were submitted to a re-scoring procedure to verify the particular binding affinities. Finally, the five most promising compounds were purchased for further experimental analyses. The results of the X-ray crystallography to determine the respective protein-ligand complexes were not finally available at the time of preparing the present thesis and related experiments are still the subject of current research work. With the performed virtual screenings it was possible for the first time to identify potential ligands of the Hsp70 interdomain interfaces as a novel class of Hsp70 inhibitors. Further on, the identified, cytotoxic active compounds might serve as lead structures in future inhibitor design studies that aim to optimise the cytoxicity of these molecules as well as to deduce structure-activity relationships from ligand series for the development of inhibitors that have more favourable biological activity profiles. Another emphasis of the thesis was on the computer-based characterisation of the protein flexibility of Hsp70 with the help of MD simulations. In this context an analysis of intrinsic protein dynamics together with the conformational space was done on the basis of different Hsp70 enzyme structures. At the time of the work, the conducted MD simulations were the first of this type which addressed Hsp70 two-domain-structures instead of structures of separated protein domains. Thus, this thesis provided initial insights into potential intrinsic protein movements. The evaluation of the generated trajectories confirmed the high flexibility of Hsp70. Thereby, at the time of the study so far unknown protein conformations could be identified that considerably expanded the spectrum of known Hsp70 protein conformations and proposed possible enzyme conformations that might be used as template structures for future structure-based drug design studies. Furthermore, the observations supported the hypothesis that the Hsp70 interdomain interface may principally be suitable as a binding site for new inhibitors. In the light of all this information, it was possible to postulate a first hypothesis about a potential mechanism of action of an enzyme inhibition by ligands of the interdomain interface. In summary, the present thesis revealed various aspects with regard to the structural biological elucidation of Hsp70. Nevertheless, structural analyses of Hsp70 will be ongoing in the future. It might be possible that in future studies enzyme structures will be identified that confirm the existence of the in silico generated protein conformers, described in the present thesis. KW - Arzneimittelforschung KW - Hitzeschock-Proteine KW - Enzyminhibitor KW - Molekulardesign KW - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign KW - molekulardynamische Simulationen KW - virtuelles Screening KW - structure-based drug design KW - molecular dynamics KW - virtual screening Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147103 ER - TY - THES A1 - Zilian, David T1 - Neuartige, empirische Scoring-Modelle für Protein-Ligand-Komplexe und computergestützte Entwicklung von Hsp70-Inhibitoren T1 - Novel empirical scoring-functions for protein-ligand complexes and computer-aided development of Hsp70 inhibitors N2 - Techniken des computergestützten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schlüsselrolle im strukturbasierten computergestützen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zunächst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergrößern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex beschäftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivität klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich überlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im nächsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinitäten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivität der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verfügbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repräsentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings ermöglicht. Für die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der größten, die bisher für die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datensätze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten für beide Datensätze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datensätzen zeigt - ein Phänomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datensätze ergab darüber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie über die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor für die protein-abhängigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verlässliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums möglich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' für die SFCscore-Funktionen definieren lässt. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zusätzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverlässlichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgeschätzt werden könnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren für das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur für die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Domänen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zunächst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erklärt werden. Für die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Domänen-System, dass verschiedene allostere Zustände einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilität auf die Stabilität der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen für das Protein durchgeführt. Diese zeigen, dass das Protein tatsächlich eine überdurchschnittlich hohe Flexibilität aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Domänen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgeführten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise dafür gefunden werden, dass die Mutationen, welche die für die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilität des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Domänenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilität auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verknüpft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt für die Inhibtion des Proteins darstellt. N2 - Methods of computational drug design play a crucial role in the development of new pharmaceutical drugs. The work presented here comprises the methodological development and the practical application of structure-based techniques in computational drug design. The first part of this dissertation focuses on the development of empirical scoring functions, which play an essential part in structure-based computer-aided drug design. The basis for this work are the empirical descriptors and scoring functions of the SFCscore software package. First, the influence of the training data composition on the prediction of empirical scoring functions was analyzed. A new training data set was created to spread the prediction range of the function and thus achieve a better separation of high and low affinity binders. The resulting function indeed yielded better predictions in the low affinity area compared to the original functions. In another approach, which also addresses the issue of discriminating active and inactive compounds, the Machine Learning method RandomForest (RF) was used to derive a classification model. Different to classical empirical scoring functions, this model no longer predicts a precise value but classifies the compounds according to their potential affinity as 'active' or 'inactive'. The example of the mycobacterial enzyme InhA showed that such models are clearly superior to different classical scoring function in terms of separating active and inactive compounds. The RandomForest algorithm was also used to derive a new scoring function for the prediction of binding affinities. This new function was implemented into the SFCscore software package under the name SFCscoreRF. This new function differs from the original SFCscore functions in several essentials points. On the one hand, the RF-algorithm is a non-linear method, which - in contrast to classical methods used for the derivation of empirical scoring functions - does not assume the additivity of the single descriptors. On the other hand, the algorithm allowes for using the whole set of available SFCscore descriptors and is therefore able to utilize a more comprehensive representation of a protein ligand complex as the basis for the prediction. Additionally, the training data set used to derive SFCscoreRF comprised 1005 complexes. This training set is one of the largest data sets used to train an empirical scoring function. The evaluation against two widely-used benchmark sets confirmed that SFCscoreRF yields superior predicitons as compared to the original functions. The comparison with other functions tested for these benchmarks shows that SFCscoreRF also achieves top results on an international level. Further analyses using a leave-cluster-out validation scheme and the participation in the CSAR 2012 Benchmark Exercise revealed that - similar to other scoring functions - SFCscoreRF shows varying performances when applied to protein-specific data sets. Additionally, by analysing the results of the CSAR 2012 data sets, valuable insight were gained regarding the prediction of docking poses and the statistical significance for the evaluation and comparison of scoring functions. The fact that empirical scoring functions are trained within a certain chemical space, is an important reason for the target-dependent performance observed in this work. Reliable predictions can only be expected within the calibrated area. Different approaches for the definition of this ``applicability domain'' are presented in this work. PCA analyses have been used to create a two dimensional representation of the ``applicability domain''. Additionally, different numerical descriptors have been tested to estimate the reliability of SFCscore predicitons. The RF-proximity has been found to be a promising starting point for future research. The development of new inhibitors for the molecular chaperone Hsp70 - a promising target in the therapy of multiple myeloma - comprises the second part of this dissertation. The basis for this work was a lead structure that was found in a previous work and attacks a novel binding pocket in the interface between the two domains of the Hsp70 protein. The optimization and development of that lead structure - a tetrahydroisochinolinone - was the primary focus of the present work. Potential binding poses in the interface were elucidated by detailed docking analyses. Based on that information, a compound library was compiled, which was synthezised and biologically analyzed by cooperation partners within the CRU 216. The resulting structure activity relationships can partially be explained on the basis of the corresponding docking poses. However, some of the effects remain unexplained. For the further development of new derivatives a comprehensive experimental characterization of the current compounds is needed. This information can be used as a basis for the refinement of the existing binding models. Hsp70 is a two-domain system, which can visit different allosteric states. To further investigate the effects of the resulting flexibility on the stability of the structure and on inhibitor binding, molecular dynamics simulations were conducted. These simulations show an above-average felxibility of the protein, which is primarily dominated by the movement of the two domains NBD and SBD relatively to each other. However, the basic conformation that is observed in the crystal structure hscaz, which was used in this work, remains stable in all simulations. Furthermore, the trajectories showed no evidence that the mutations, in which hscaz differs from the wild type protein, have a significant effect on the overall protein conformation. Although, the overall conformation of the interface between NDB and SBD remains stable, the exact conformation in this area is signficantly influenced by the domain movement. As this region includes the binding pocket of the tetrahydroisochinolinones, the conformational space of this area was analyzed in detail. The analyses expectedly reveal a high flexibility in the interface area that is dominated by the SBD-NBD movement. Furthermore, it could be shown that the conformation and dynamics can be influenced by a bound ligand (apoptozole), in terms of an induced fit mechanism. It is highly probable that the binding of the tetrahydroisochinolinones trigger similar effects, influencing the binding mechanism of this compound class. Thus, molecular dynamics simulations should play a crucial role in the future development of new compounds. The analyses also show that the dynamics of the interface region have large effects on the overall structure of the protein and vice versa. Especially, the relative orientation of NBD and SBD has a large impact on the binding pocket. This underlines the hypothesis that the interface region constitutes a promising target area for the inhibition of Hsp70. KW - Arzneimittelforschung KW - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign KW - Structure-based drug design KW - Computational chemistry KW - Molekulardesign KW - Proteine KW - Hitzeschock-Proteine KW - Scoring-Funktionen KW - Docking KW - molekulardynamische Simulationen KW - Hsp70 KW - Strukturoptimierung KW - scoring functions KW - molecular dynamics KW - lead structure optimization KW - Ligand KW - Maschinelles Lernen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105055 ER - TY - THES A1 - Merget, Benjamin T1 - Computational methods for assessing drug-target residence times in bacterial enoyl-ACP reductases and predicting small-molecule permeability for the \(Mycobacterium\) \(tuberculosis\) cell wall T1 - Computermethoden zur Bestimmung von Protein-Ligand Verweilzeiten in bakteriellen Enoyl-ACP Reduktasen und Vorhersage der Permeabilitätswahrscheinlichkeit kleiner Moleküle gegenüber der \(Mycobacterium\) \(tuberculosis\) Zellwand N2 - \textbf{Molecular Determinants of Drug-Target Residence Times of Bacterial Enoyl-ACP Reductases.} Whereas optimization processes of early drug discovery campaigns are often affinity-driven, the drug-target residence time $t_R$ should also be considered due to an often strong correlation with \textit{in vivo} efficacy of compounds. However, rational optimization of $t_R$ is not straightforward and generally hampered by the lack of structural information about the transition states of ligand association and dissociation. The enoyl-ACP reductase FabI of the fatty acid synthesis (FAS) type II is an important drug-target in antibiotic research. InhA is the FabI enzyme of \textit{Mycobacterium tuberculosis}, which is known to be inhibited by various compound classes. Slow-onset inhibition of InhA is assumed to be associated with the ordering of the most flexible protein region, the substrate binding loop (SBL). Diphenylethers are one class of InhA inhibitors that can promote such SBL ordering, resulting in long drug-target residence times. Although these inhibitors are energetically and kinetically well characterized, it is still unclear how the structural features of a ligand affect $t_R$. Using classical molecular dynamics (MD) simulations, recurring conformational families of InhA protein-ligand complexes were detected and structural determinants of drug-target residence time of diphenyl\-ethers with different kinetic profiles were described. This information was used to deduce guidelines for efficacy improvement of InhA inhibitors, including 5'-substitution on the diphenylether B-ring. The validity of this suggestion was then analyzed by means of MD simulations. Moreover, Steered MD (SMD) simulations were employed to analyze ligand dissociation of diphenylethers from the FabI enzyme of \textit{Staphylococcus aureus}. This approach resulted in a very accurate and quantitative linear regression model of the experimental $ln(t_R)$ of these inhibitors as a function of the calculated maximum free energy change of induced ligand extraction. This model can be used to predict the residence times of new potential inhibitors from crystal structures or valid docking poses. Since correct structural characterization of the intermediate enzyme-inhibitor state (EI) and the final state (EI*) of two-step slow-onset inhibition is crucial for rational residence time optimization, the current view of the EI and EI* states of InhA was revisited by means of crystal structure analysis, MD and SMD simulations. Overall, the analyses affirmed that the EI* state is a conformation resembling the 2X23 crystal structure (with slow-onset inhibitor \textbf{PT70}), whereas a twist of residues Ile202 and Val203 with a further opened helix $\alpha 6$ corresponds to the EI state. Furthermore, MD simulations emphasized the influence of close contacts to symmetry mates in the SBL region on SBL stability, underlined by the observation that an MD simulation of \textbf{PT155} chain A with chain B' of a symmetry mate in close proximity of the SBL region showed significantly more stable loops, than a simulation of the tetrameric assembly. Closing Part I, SMD simulations were employed which allow the delimitation of slow-onset InhA inhibitors from rapid reversible ligands. \textbf{Prediction of \textit{Mycobacterium tuberculosis} Cell Wall Permeability.} The cell wall of \textit{M. tuberculosis} hampers antimycobacterial drug design due to its unique composition, providing intrinsic antibiotic resistance against lipophilic and hydrophilic compounds. To assess the druggability space of this pathogen, a large-scale data mining endeavor was conducted, based on multivariate statistical analysis of differences in the physico-chemical composition of a normally distributed drug-like chemical space and a database of antimycobacterial--and thus very likely permeable--compounds. The approach resulted in the logistic regression model MycPermCheck, which is able to predict the permeability probability of small organic molecules based on their physico-chemical properties. Evaluation of MycPermCheck suggests a high predictive power. The model was implemented as a freely accessible online service and as a local stand-alone command-line version. Methodologies and findings from both parts of this thesis were combined to conduct a virtual screening for antimycobacterial substances. MycPermCheck was employed to screen the chemical permeability space of \textit{M. tuberculosis} from the entire ZINC12 drug-like database. After subsequent filtering steps regarding ADMET properties, InhA was chosen as an exemplary target. Docking to InhA led to a principal hit compound, which was further optimized. The quality of the interaction of selected derivatives with InhA was subsequently evaluated using MD and SMD simulations in terms of protein and ligand stability, as well as maximum free energy change of induced ligand egress. The results of the presented computational experiments suggest that compounds with an indole-3-acethydrazide scaffold might constitute a novel class of InhA inhibitors, worthwhile of further investigation. N2 - \textbf{Molekulare Determinanten von Wirkstoff-Angriffsziel Verweilzeiten bakterieller Enoyl-ACP Reduktasen.} In frühen Phasen der Wirkstoffentwicklung sind Optimierungsprozesse häufig affini\-täts\-geleitet. Darüber hinaus sollte zusätzlich die Wirkstoff-Angriffsziel Verweilzeit $t_R$ berücksichtigt werden, da diese oft eine starke Korrelation zur \textit{in vivo} Wirksamkeit der Substanzen aufweist. Rationale Optimierung von $t_R$ ist jedoch auf Grund eines Mangels an struktureller Information über den Übergangszustand der Ligandbindung und Dissoziierung nicht einfach umsetzbar. Die Enoyl-ACP Reduktase FabI der Fettsäurebio\-synthese (FAS) Typ II ist ein wichtiger Angriffspunkt in der Antibiotikaforschung. InhA ist das FabI Enzym des Organismus \textit{Mycobacterium tuberculosis} und kann durch Substanzen diverser Klassen gehemmt werden. Es wird vermutet, dass Hemmung von InhA durch langsam-bindende (``slow-onset'') Inhibitoren mit der Ordnung der flexibelsten Region des Enzyms assoziiert ist, dem Substratbindungsloop (SBL). Diphenylether sind eine InhA Inhibitorenklasse, die eine solche SBL Ordnung fördern und dadurch lange Verweilzeiten im Angriffsziel aufweisen. Obwohl diese Inhibitoren energetisch und kinetisch gut charakterisiert sind, ist noch immer unklar, wie die strukturellen Eigenschaften eines Liganden $t_R$ beeinflussen. Durch die Verwendung klassischer Molekulardynamik (MD) Simulationen wurden wiederkehrende Konformationsfamilien von InhA Protein-Ligand Komplexen entdeckt und strukturelle Determinanten der Wirkstoff-Angriffsziel Verweilzeit von Diphenylethern mit verschiedenen kinetischen Profilen beschrieben. Anhand dieser Ergebnisse wurden Richtlinien zur Wirksamkeitsoptimierung von InhA Inhibitoren abgeleitet, einschließlich einer 5'-Substitution am Diphenylether B-Ring. Die Validität dieses Vorschlags wurde mittels MD Simulationen nachfolgend analysiert. Darüber hinaus wurden ``Steered MD'' (SMD) Simulationen als MD Technik für umfangreicheres Sampling verwendet um die Liganddissoziation von Diphenylethern aus dem FabI Enzym von \textit{Staphylococcus aureus} zu untersuchen. Dieser Ansatz resultierte in einem sehr akkuraten, quantitativen linearen Regressionsmodell der experimentellen Verweilzeit $ln(t_R)$ dieser Inhibitoren als Funktion der berechneten maximalen freien Energieänderung induzierter Ligandextraktion. Dieses Modell kann genutzt werden um die Verweilzeiten neuer potentieller Inhibitoren aus Kristallstrukturen oder validen Dockingposen vorherzusagen. Die korrekte strukturelle Charakterisierung des intermediären und des finalen Zustandes (EI und EI*-Zustand) eines Enzym-Inhibitor Komplexes bei einem zweistufigen Inhibitionsmechanismus durch langsam-bindende Hemmstoffe ist essentiell für rationale Verweilzeitoptimierung. Daher wurde die gegenwärtige Ansicht des EI und EI*-Zustandes von InhA mittels Kristallstrukturanalyse, MD und SMD Simulationen erneut aufgegriffen. Insgesamt bestätigten die Analysen, dass der EI*-Zustand einer Konformation ähnlich der 2X23 Kristallstruktur (mit langsam-bindenden Inhibitor \textbf{PT70}) gleicht, während eine Drehung der Reste Ile202 und Val203 mit einer weiter geöffneten Helix $\alpha 6$ dem EI-Zustand entspricht. Des Weiteren zeigten MD Simulationen den Einfluss naher Kristallkontakte zu Symmetrie-Nachbarn in der SBL Region auf die SBL Stabilität. Dies wird durch die Beobachtung hervorgehoben, dass die Ketten A und B' eines InhA-\textbf{PT155}-Komplexes und des angrenzenden Symmetrie-Nachbars, welche in engem Kontakt in der SBL Region stehen, signifikant stabilere SBLs aufweisen, als die Ketten A und B in einer Simulation des Tetramers. Zum Abschluss von Teil I wurden SMD Simulationen angewandt, auf deren Basis es möglich war, langsam-bindende InhA Inhibitoren von schnell-reversiblen (``rapid reversible'') Liganden zu unterscheiden. \textbf{Vorhersage von \textit{Mycobacterium tuberculosis} Zellwand Permeabilität.} Die Zellwand von \textit{M.~tuberculosis} erschwert die antimycobakterielle Wirkstofffindung auf Grund ihrer einzigartigen Zusammensetzung und bietet eine intrinsische Antibiotikaresistenz gegenüber lipophilen und hydrophilen Substanzen. Um den chemischen Raum wirkstoffähnlicher Moleküle gegen diesen Erreger (``Druggability Space'') einzugrenzen, wurde eine groß angelegte Dataminingstudie durchgeführt, welche auf multivariater statistischer Analyse der Unterschiede der physikochemischen Zusammensetzung eines normalverteilten wirkstoffähnlichen chemischen Raumes und einer Datenbank von antimycobakteriellen -- und somit höchstwahrscheinlich permeablen -- Substanzen beruht. Dieser Ansatz resultierte in dem logistischen Regressionsmodell MycPermCheck, welches in der Lage ist die Permeabilitätswahrscheinlichkeit kleiner organischer Moleküle anhand ihrer physikochemischen Eigenschaften vorherzusagen. Die Evaluation von MycPermCheck deutet auf eine große Vorhersagekraft hin. Das Modell wurde als frei zugänglicher online Service und als lokale Kommandozeilenversion implementiert. Methodiken und Ergebnisse aus beiden Teilen dieser Dissertation wurden kombiniert um ein virtuelles Screening nach antimycobakteriellen Substanzen durchzuführen. Myc\-PermCheck wurde verwendet um den chemischen Permeabilitätsraum von \textit{M.~tuberculosis} anhand der gesamten ZINC12 Datenbank wirkstoffähnlicher Moleküle abzuschätzen. Nach weiteren Filterschritten mit Bezug auf ADMET Eigenschaften, wurde InhA als exemplarisches Angriffsziel ausgewählt. Docking nach InhA führte schließlich zu einer Treffersubstanz, welche in darauffolgenden Schritten weiter optimiert wurde. Die Interaktionsqualität ausgewählter Derivate mit InhA wurde daraufhin mittels MD und SMD Simulationen in Bezug auf Protein und Ligand Stabilität, sowie auch der maximalen freien Energieänderung induzierter Ligandextraktion, untersucht. Die Ergebnisse der vorgestellten computerbasierten Experimente legen nahe, dass Substanzen mit einem Indol-3-Acethydrazid Gerüst eine neuartige Klasse von InhA Inhibitoren darstellen könnten. Weiterführende Untersuchungen könnten sich somit als lohnenswert erweisen. KW - Computational chemistry KW - Arzneimitteldesign KW - Molekulardynamik KW - Permeabilität KW - Tuberkelbakterium KW - Computational drug-design KW - steered molecular dynamics KW - molecular dynamics KW - residence time KW - mycobacterium tuberculosis KW - staphylococcus aureus KW - permeability KW - InhA KW - FabI KW - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase KW - Drug design KW - Computational chemistry Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127386 ER - TY - THES A1 - Wehle, Sarah T1 - In silico Studien zu Bis-Tacrinen, Chinazolinen und Chinazolinonen sowie Synthese von Chinazoliniumverbindungen als Inhibitoren von Cholinesterasen T1 - In silico studies concerning bis-tacrines, quinazolines and quinazolinones and syntheses of quinazolinium compounds as inhibitors of cholinesterases N2 - Die Alzheimer'sche Erkrankung wird derzeit durch die Gabe von Acetylcholinesterase- Inhibitoren (AChEI) symptomatisch behandelt. Durch die AChE-Hemmung steht mehr Acetylcholin (ACh) für die Neurotransmission zur Verfügung. Bei Progression der Erkran-kung nimmt der Anteil an AChE drastisch ab, so dass die Enzymisoform Butyrylcholin- esterase (BChE) die Hydrolyse des Neurotransmitters ACh übernimmt. In späten Phasen der Alzheimer'schen Erkrankung ist daher der Einsatz selektiver BChE-Hemmer erfolgsver- sprechend. Inhibitoren können verschiedene Bindestellen in der Cholinesterase-Bindetasche adressie-ren und dadurch in dieser stabilisiert werden. Zu den Bindestellen zählen die katalytisch aktive Stelle (CAS) am Ende eines 20 Å langen Bindetaschentunnels, die Oxyanion-Vertie-fung, die Cholinbindestelle, sowie die periphere anionische Bindestelle (PAS), welche am Bindetascheneingang lokalisiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurden durch in silico Dockingstudien gezielt Protein-Ligand- Interaktionen untersucht, um Strukturmerkmale hochaffiner Inhibitoren von Cholinesterasen zu identifizieren. Damit soll die zukünftige Entwicklung von Cholinesteraseinhibitoren hinsichtlich der Affinität zum Enzym verbessert werden. Ferner dienten synthetische Untersuchungen eines Naturstoffes dazu, Chinazoliniumverbindungen als Leitstruktur für die Inhibition der Cholinesterasen zu etablieren. Für hochaffine tri- und tetrazyklische aminsubstituierte AChE-selektive Chinazolin- und Chinazolinoninhibitoren sollte die bevorzugte Orientierung der Liganden in der Bindetasche ermittelt werden. Hierfür ist die Lokalisation des Aminsubstituenten in der CAS (invertierter Bindemodus) oder die dortige Bindung des Chinazolin-/Chinazolinongerüstes (klassischer Bindemodus) denkbar. Anhand eines präferierten einheitlichen Bindemodus sollten die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen erklärt werden. Dockingstudien zeigten die klare Präferenz für den invertierten Bindemodus, bei dem der Aminsubstituent in der Nähe der CAS platziert wird. Ein strukturelles Merkmal für hochaffine Inhibitoren ist ein unter Assaybedingungen protoniertes Amin, welches eine Kation-π-Wechselwirkung zu dem Indolringsystem des Tryptophans der Cholinbindestelle eingehen kann. Für das Ligandengrundgerüst wurde lediglich für tetrazyklische Verbindungen eine π-π-Interaktion mit der peripheren Bindestelle (PAS) am Bindetascheneingang identifiziert. Der Datensatz umfasste auch chirale Chinazolinon- und Chinazolinderivate mit hydrierter C=N-Doppelbindung, die eine schwächere Affinität zu AChE zeigten. Diese ist vermutlich auf das nicht-planare Ligandengrundgerüst zurückzuführen, da vor allem für tetrazyklische chi-rale Verbindungen die Stabilisierung des Ligandengrundgerüstes durch π-π-Interaktionen am Bindetascheneingang aufgrund der Sterik entweder gar nicht, oder nur für ein Enantio-mer möglich ist. Aufgrund der nanomolaren Affinität der achiralen Chinazolin- und Chinazolinonverbindungen wurden weitere gerichtete Wechselwirkungen in der Bindetasche erwartet. Derartige Wechselwirkungen konnten in Form von Wasserstoffbrücken durch die Verwendung von sieben ausgewählten strukturellen Wassermolekülen im Docking identifiziert werden. Durch diese Wassermoleküle werden Wasserstoffbrücken vom Ligandengrundgerüst zum Protein vermittelt. Diese Wechselwirkungen scheinen essentiell für die Stabilisierung hoch-affiner Chinazolin- und Chinazolinoninhibitoren in der AChE-Bindetasche zu sein. Zwei photochrome Bis-Tacrin-Konstitutionsisomere (Ring-geöffnete und Ring-geschlossene Form) inhibieren die AChE und zeigen einen unterschiedlichen Effekt in der Hemmung der Amyloid-β Fibrillenbildung. Die Fibrillenbildung wird durch eine unbesetzte periphere Bindestelle (PAS) am Eingang der AChE-Bindetasche katalysiert, weshalb eine unterschiedliche Interaktion der Liganden mit ebendieser Bindestelle vermutet wird. Dockingstudien lieferten für beide Konstitutionsisomere einen ähnlichen Bindemodus, der vor dem Hintergrund der ähnlichen IC50-Werte von 4.3 und 1.8 nM für die Ring-geöffnete und Ring-geschlossene Form plausibel erscheint. Durch die Auswahl einer geeigneten Röntgenstruktur wurden Dockinglösungen erhalten, bei denen ein Tacrinsubstituent in der PAS bindet und dort π-π-Interaktionen mit einem Tryptophan und einem Tyrosin eingeht. Eine solche Lage des PAS-bindenden Tacrinsubstituenten ist energetisch bevorzugt und drückt sich durch bessere Scores gegenüber Dockinglösungen, bei denen dieser auf der Protein-oberfläche lokalisiert ist, aus. Der andere Tacrinsubstituent bindet in der CAS wie dies von bereits kristallisierten Tacrinderivaten bekannt ist. Mittels molekulardynamischer Simulati-onen wurde die Stabilität der Protein-Dockinglösungs-Komplexe beider Konstitutionsiso-mere verglichen. Dabei wurde die bessere Stabilisierung des CAS-bindenden Tacrinsubsti-tuenten für die Ring-geöffnete Form des Liganden ermittelt. Ferner zeigt sich für die Ring-geöffnete Inhibitorform während der Simulation der Einstrom von sechs Wassermolekülen in einen Hohlraum der PAS. Dies hat zur Folge, dass der PAS-bindende Tacrinsubstituent während der Hälfte der Simulationszeit durch Wasserstoffbrücken in der PAS stabilisiert wird. Ein Wasserstoffbrückennetzwerk diesen Ausmaßes kann für die Ring-geschlossene Inhibitorform nicht ermittelt werden. Die bessere Hemmung der Amyloid-β Fibrillenbildung der Ring-geöffneten Inhibitorform wird daher auf die bessere Stabilisierung des Liganden durch Wasserstoffbrücken in der AChE-Bindetasche zurückgeführt. Für carbamatsubstituierte Tetrahydrochinazolinverbindungen sollten die bevorzugten Interaktionen in der BChE-Bindetasche ermittelt werden. Die Carbamatverbindungen sind pseudo-irreversible Inhibitoren und zeigen eine zeitabhängige Hemmung mit diversen Interaktionszuständen zwischen Protein und Ligand. Darüber hinaus stellen Dockingstudien in der BChE bislang eine Herausforderung dar, da es derzeit nur zwei Röntgenstrukturen dieses Enzyms mit reversiblen Liganden gibt, weshalb kaum Studien zur Identifikation einer geeigneten Bewertungsfunktion durchgeführt werden können. Im Docking wurde sich für die Analyse des reversiblen Anlagerungskomplexes entschieden, da das Docking des tetraedrischen Übergangszustandes energetisch entartete Dockinglösungen lieferte. Eine weitere Herausforderung stellte die Größe der BChE-Bindetasche dar, die auch im reversiblen Docking entartete Dockinglösungen lieferte. Aufgrund einer ähnlichen Übertragungsrate aller getesteten Inhibitoren wurde eine konservierte Lage des Carbamates in der Bindetasche angenommen. Deshalb wurde eine repräsentative Dockinglösung einer Referenzverbindung als Ausgangspose für einen Modelling-Ansatz gewählt, die hinsichtlich der Interaktionen in der Bindetasche ausgewählt wurde. Diese Interaktionen sind: 1) Eine Wasserstoffbrückendistanz zwischen der Carbamat-Carbonylgruppe und der Oxyanion-Vertiefung sowie 2) eine Distanz, die den nucleophilen Angriff des Serins auf den Carbamatkohlenstoff erlaubt. Im Modelling-Ansatz wurde die repräsentative Bindepose dazu verwendet die entsprechenden Inhibitoren in der Bindetasche aufzubauen. Die bevorzugte Position der N-Methylgruppe wurde für beide Enantiomere über die berechneten Spannungsenergien der Bindeposen abgeschätzt. Für die S-Enantiomere ergab sich die präferierte Bindung mit quasi-„axialer“ Methlygruppe und für die R-Enantiomere mit quasi-„äquatorialer“ Stellung dieser. Die Carbamatstrukturen liegen somit mit der Heptylkette in der Acyltasche und die Ligandengrundgerüste werden in einer Seitentasche der BChE-Bindetasche platziert, in der hydrophobe Wechselwirkungen dominieren. Zusätzlich zu den hochaffinen Chinazolinonverbindungen sollten artverwandte Chinazolini-umverbindungen als Leitstruktur für Cholinesteraseinhibitoren untersucht werden. Zunächst erfolgten Studien zur chemischen Reaktivität und Stabilität des Naturstoffes Dehydroevodiamin (DHED) sowie seines Benz-Derivates (Benz-DHED). Insbesondere Benz-DHED war unter den bisher verwendeten und in der Literatur beschriebenen Synthesemethoden instabil. Die Untersuchungen erforderten daher zunächst die Einführung einer geeigneten Syntheseroute, in diesem Fall die Oxidation mit KMnO4, einhergehend mit der Verbesserung der Ausbeute und ohne Nebenproduktbildung. Für die zukünftige Synthese von Derivaten wurde die Verwendung einer geeigneten Lewis-Säure-labilen Schutzgruppe herausgearbeitet. Die untersuchten Chinazoliniumverbindungen zeigen die Eigenschaft, dass sie in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen in zwei Formen (Ring-geöffnet und Ring-geschlossen = Chi-nazoliniumsalz) isoliert werden können. Mittels UV/Vis-Untersuchungen wurde das Gleich-gewicht dieser Spezies aufgeklärt und in wässrigen alkalischen Lösungen die Anreicherung einer dritten, bislang nicht in diesem Zusammenhang beschriebenen, Spezies beobachtet. Als biologisch aktive Spezies konnte die Chinazoliniumform identifiziert werden. In Dockingstudien der Chinazoliniumform von Benz-DHED, nach dem für Carbamatverbindungen entwickelten Modelling-Ansatz, konnte auch hierfür die Stabilisierung der Docking- lösung über eine Wasserstoffbrücke in der BChE-Bindetasche zu einem strukturellen Wassermolekül identifiziert werden. Dies verdeutlicht erneut, dass die Berücksichtigung von Wassermolekülen in Dockingstudien dazu dienen kann zusätzliche Protein-Ligand-Interaktionen festzustellen. Auf Grundlage der Forschung zu Chinazoliniumverbindungen kann die zukünftige Inhibitorentwicklung von Strukturen basierend auf dieser Substanzklasse erfolgen. Die durchgeführten synthetischen und theoretischen Studien liefern wichtige Beiträge zum Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Inhibitoren und Cholinesterasen, die in der zukünftigen Inhibitorentwicklung Anwendung finden können. N2 - Alzheimer's disease is currently treated symptomatically by the administration of acetyl-cholinesterase inhibitors (AChEI). By AChE inhibition more acetylcholine (ACh) is available for neurotransmission. During disease progression the amount of AChE drastically decreases, so that the enzyme butyrylcholinesterase (BChE) takes over hydrolysis of this neurotransmitter. In late stages of Alzheimer's disease, the use of selective BChE in-hibitors may therefore be advantageous. Inhibitors can adress different binding sites in the cholinesterase binding pocket. The bind-ing sites includes the catalytic active site (CAS), which is located at the end of a 20 Å long binding gorge, the oxyanion hole, the choline binding site and the peripheral anionic site (PAS), located at the entrance of the binding gorge. In the present study, specific protein-ligand interactions were investigated by means of in silico docking studies to identify structural features of high-affinity inhibitors of cholinester-ases. Thereby the aim is to improve the affinitiy of newly developed cholinesterase- inhibitors. Furthermore, synthetic studies of a natural product served to establish a new lead compound for cholinesterase inhibitors. For high affinity tri- and tetracyclic amine substituted AChE-selective quinazoline and quinazolinone inhibitors, the aim was to determine the preferred ligand orientation in the binding site. To this end, the localization of the amine substituents in the CAS (inverted binding mode) or the binding of the quinazoline-/quinazolinone moiety there (classical binding mode) is conceivable. The aim was to explain structure-activity-relationships by the identified preferred and consistent binding mode. Docking studies showed a clear preference for the inverted binding mode in which the amine substituent is placed in the vicinity of the CAS. A structural characteristic of high affinity inhibitors is a protonated amine which can form a cation-π-interaction to the tryptophan indole ring system of the choline binding site. Furthermore, a π-π-interaction with the peripheral binding site (PAS) has been identified for the ligand backbone of tetra-cyclic inhibitors. The data set also included chiral quinazolinone- and quinazoline derivatives with hydrogenated C=N-double bond, which showed weaker affinity to AchE compared to non chiral compounds. The weaker affinity is probably due to the non-planar ligand back-bone. Due to steric reasons, especially for tetracyclic chiral compounds, stabilisation of the ligand backbone through π-π interactions is either not possible at all, or possible only for one enantiomeric form. Due to the nanomolar affinity of non chiral quinazoline and quinazolinone compounds, other directional interactions between protein and ligand were expected. Several inter- actions were identified in form of hydrogen bonds through the use of conserved water molecules in docking. These water molecules mediate hydrogen bonds from the ligand backbone to the protein. These interactions seem to be essential for the stabilization of high affinity quinazoline and quinazolinone inhibitors in the AChE binding site. Two photochromic bis-tacrine constitutional isomers (ring-open and ring-closed form) inhibit AChE and show a different effect with regard to the inhibition of amyloid-β fibril formation. Fibril formation is catalyzed by an unoccupied peripheral site (PAS) at the entrance of the AChE-binding pocket, which is why a different interaction of the ligands is expected with this binding site. Docking studies provided a similar binding mode for both constitutional isomers, which appears plausible for the ring-open and ring-closed form in the light of similar IC50-values of 4.3 and 1.8 nM. By selecting a suitable crystal structure, docking solutions were obtained in which one tacrine substituent is placed in the PAS and undergoes π-π-interactions with a tryptophan and a tyrosine. This placement of the PAS-binding tacrine-substituent is energetically favored which is expressed through better scores, compared to docking solutions where the tacrine-substituent is placed on the protein surface. The other tacrine substituent binds in the CAS in a manner which is known from other already crystalized tacrines. Molecular dynamic simulations were subsequently used for stability comparison of the protein-docking solution-complex of both isomers. Here, the better stabilization of the CAS-binding tacrine-substituent for the ring-open form was determined. The complex with the ring-open form shows the influx of six water molecules in a cavity of the PAS at the beginning of the simulation. As a consequence, the PAS-binding tacrine substituent is stabilized by hydrogen bonds to these water molecules during half of the simulation time. A hydrogen bond network of this magnitude was not observed for the ring-closed form of the inhibitor. The better inhibition of amyloid-β fibril formation by the ring-open form may be due to better stabilization of this ligand through hydrogen bonds in the AChE-binding site, which is not observed for the ring-closed form. Preferred interactions could also be identified for carbamate-based quinazoline inhibitors in the BChE-binding site. These carbamate compounds are pseudo-irreversible inhibitors and show a time-dependent inhibition with several interaction possibilities between protein and ligand. Docking studies in the BChE are challenging, as there currently exist only two X-ray structures of this enzyme with reversible ligands. Therefore, it is difficult to identify a suitable scoring function for the data set under investigation. Docking of the tetrahedral transition state delivered energetically degenerate docking solutions wherefore the aim was to investigate the reversible attachment complex in more detail. Thereby the challenge was the size of the BChE-binding pocket, which also supplied degenerate docking solutions in the reversible docking. Due to a similar carbamoylation rate of all the inhibitors tested, a conserved position of the carbamate moiety in the binding pocket was presumed. Therefore, a representative docking solution of a reference compound, which was selected in the binding pocket in terms of interactions, was chosen for a modeling approach. These interactions are 1) A hydrogen bond distance between the carbamate carbonyl and the oxyanion hole and 2) a distance between the carbamate carbon and the serine which allows for a nucleophilic attack and thus the transfer of the carbamate moiety onto the enzyme. For the modeling approach, the representative binding pose was used to construct the appropriate inhibitor structures. The preferred position of the N-methyl group was calculated for both enantiomers via the tension energy of the corresponding binding poses. For S-enantiomers the preferred posi-tion of the methyl group is quasi-"axial" and for R-enantiomers quasi-"equatorial". The conserved binding mode thus is characterized by the heptyl chain being placed in the acyl pocket and the ligand scaffold in a side pocket of the BChE-binding site where hydrophobic interactions dominate. In addition to high affinity quinazoline and quinazolinone inhibitors, it was intended to make quinazolinium compounds accessible as lead compounds for future cholinesterase inhibitors. Synthetic studies initially focused on chemical reactivity and stability of the natural product dehydroevodiamine (DHED) and its benz-derivative (benz-DHED). In particular, benz-DHED was unstable under the synthesis conditions applied so far and described in the literature. The investigations therefore required introduction of a suitable synthetic route, in this case oxidation with KMnO4, accompanied by improvement of yield and no by-product formation. For future syntheses of derivatives, the use of a Lewis-acid-labile protecting group is suggested. Depending on the reaction conditions, the quinazolinium compounds can be isolated in two forms (ring-opened and ring-closed = quinazolinium-salt). By means of UV/Vis-studies, the equilibrium of these two forms was elucidated. In aqueous alkaline solutions the enrichment of a third, hitherto in this context undescribed species, was observed. These studies helped in identification of the quinazolinium-form as biologically active species. Docking studies of this form, using the modeling-approach which was evolved for carbamates, showed a possible stabilization of this compound via a hydrogen bond mediated by a struc-tural water molecule in the BChE-binding site. The role of water here again shows that consideration of water molecules in docking studies might be able to describe preffered binding modes by means of additional protein-ligand-interactions better, compared to docking studies without explicit water molecule consideration. Based on the basic research carried out for quinazolinium compounds, future inhibitor development based on this substance class can be performed. Finally, the herein conducted synthetic and theoretical studies provide important contributions to the understanding of the interaction between inhibitors and cholinesterases, which can be used for future inhibitor development. KW - Cholinesteraseinhibitor KW - Docking KW - Organische Synthese KW - Acetylcholinesterase KW - Chinazolinone KW - Chinazoliniumverbindungen KW - Chinazoline KW - Carbamate KW - Bis-Tacrine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139955 ER - TY - THES A1 - Hartung, Andreas Walter T1 - Entwicklung neuartiger pharmakologischer Wirkstoffe als Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems zur Behandlung des Multiplen Myeloms T1 - Development of novel pharmacological drugs as inhibitores of HSF-1/HSP70-System for the treatment of multiple myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) zeichnet sich durch eine krankhafte Entartung der Plasmazellen im Knochenmark aus und gilt heute trotz zahlreicher Behandlungsfortschritte immer noch als unheilbar. Als attraktive Zielstrukturen für neue Therapiemöglichkeiten haben sich in den vergangenen Jahren „Heat-Shock“-Proteine etabliert. Diese liegen häufig überexprimiert vor und sind bei der Stabilisierung mehrerer onkogener Signalwege des MM von zentraler Bedeutung. Zunächst wurden von Pharmaunternehmen verschiedene Inhibitoren von HSP90 entwickelt, die sich in präklinischen MM-Studien als erfolgreich herausstellten, in klinischen Studien jedoch nur eine begrenzte Wirksamkeit zeigten, da eine Inhibition von HSP90 zu einer schnellen HSF-1-vermittelten Hochregulation der HSP70- Expression führt. Dies kompensiert die Inhibition von HSP90 und führt damit zu einer Abschwächung der Anti-Tumoraktivität. Eine duale Hemmung von HSP90 und des HSF-1/HSP70-Systems wird daher als vielversprechende Strategie für eine wirksame Behandlung des MM betrachtet. Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen der klinischen Forschergruppe 216 erstellt wurde, befasst sich daher mit der Entwicklung von Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems. Hierzu wurden zwei unabhängige Strategien verfolgt. Neben einem indirekten Ansatz, der auf einer blockierten HSP70-Expression via Inhibition des HSF-1-Signalwegs beruht, stand die direkte Inhibition von HSP70 im Fokus. Die erzielten Ergebnisse im Einzelnen: 1) In Anlehnung an den HSF-1-Inhibitor NZ28 (12) sollte untersucht werden, ob das dort enthaltene Tetrahydroisochinolin-Gerüst eine Leitstruktur für die Entwicklung von Hemmstoffen des HSF-1-Signalwegs darstellt. Hierzu wurde eine Reihe unterschiedlich substituierter Tetrahydroisochinolinon-Derivate hergestellt. Die Synthese erfolgte über eine sequenzielle Ugi-Heck-Reaktion, da hierbei drei Substituenten des Tetrahydro- isochinolin-Gerüsts hochflexibel und unabhängig voneinander variiert werden können und sich so leicht ein breites Spektrum verschiedener Tetrahydroisochinolinon-Derivate aufbauen lässt. Eine Bioaktivitätsanalyse zeigte jedoch, dass keine der so erhaltenen Verbindungen (26) die HSF-1-vermittelte HSP70-Expression zu inhibieren vermochte. Um den Einfluss des spezifischen Substitutionsmusters der via Ugi-Heck-Reaktion erhaltenen Produkte zu untersuchen, wurde außerdem eine Auswahl der als HSP70- Inhibitoren synthetisierten Tetrahydroisochinolinone (24 und 36) im HSF-1-Assay getestet. Da auch für diese Verbindungen keine Inhibition des Signalwegs beobachtet werden konnte, besteht Grund zur Annahme, dass substituierte Tetrahydroisochinolin-Derivate nicht als Leitstruktur für die Entwicklung von HSF-1-Inhibitoren geeignet sind. 2) Im Gegensatz zu den synthetisierten Tetrahydroisochinolinonen zeigten einige der als Zwischenprodukte der Ugi-Heck-Reaktion isolierten α-Acylaminocarboxamide, die durch ein Michael-System charakterisiert sind, eine Inhibition der HSF-1-vermittelten HSP70- Expression. Zwar konnten keine eindeutigen Struktur-Wirkungsbeziehungen bezüglich einzelner Substituenten abgeleitet werden, aber es zeigte sich, dass die beobachtete Bioaktivität nicht vom enthaltenen Michael-System abhängig ist. Dem Wirkprinzip der α-Acylaminocarboxamide scheint somit keine kovalente Bindung mit nukleophilen Seitenketten von Proteinen zugrunde zu liegen, was das Potenzial unspezifischer Interaktionen reduziert. 3) Bei der Ugi-Multikomponentenreaktion wurden als Carbonsäurederivate auch β-Acyl-substituierte Acrylsäuren eingesetzt. Dabei wurde beobachtet, dass dieser Austausch zur Bildung von pharmakologisch interessanten 2,5-Diketopiperazinderivaten (35) führt. Die in nur einem Reaktionsschritt erhaltenen 2,5-DKPs zeigten eine spezifische und dosisabhängige antiproliferative Wirkung auf aktivierte T-Zellen, was sie als potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Behandlung von unbeabsichtigten T-Zell-vermittelten Autoimmunantworten interessant macht (AG Topp). Eine Analyse der Struktur-Wirkungsbeziehungen zeigte unter anderem eine Präferenz für trans-konfigurierte 2,5-DKPs. Die Aktivität der potentesten Verbindungen der syntheti- sierten Serie lag in derselben Größenordnung wie die der Positiv-Kontrolle 17-Dimethoxyaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, 4b). 4) Ausgangspunkt für die Entwicklung neuartiger HSP70-Inhibitoren war das Ergebnis eines virtuellen Screenings (AG Sotriffer), das darauf abzielte die Proteinfunktion durch eine Interaktion mit dem Interdomänen-Interface von HSP70 zu blockieren. Im ersten Schritt wurde eine diastereoselektive und hochflexible Reaktionssequenz zum virtuelle Screening-Hits (trans-24a) etabliert, mit der im zweiten Schritt eine Bibliothek verwandter Substanzen aufgebaut wurde. Gezielte strukturelle Modifikationen erlaubten dabei wesentliche Strukturelemente zu identifizieren sowie Informationen für die Generierung von Derivaten mit höherer Aktivität zu gewinnen. Die wichtigsten Erkenntnisse dabei waren: - Ausschließlich trans-konfigurierte Tetrahydroisochinolinon-Derivate sind wirksam. - Carboxamide (Pos. 4) sind aktiver als analoge Carbonsäuren. - Die Methoxyfunktion am Phenylsubstituenten in Pos.3 ist für die Aktivität wichtig, dagegen führt das Entfernen der OCH3- Gruppe am Phenylring in Pos. 2 zu einer Aktivitätssteigerung. - Eine aliphatische MeNH-Einheit am exozyklischen Amid reduziert die Aktivität gegenüber Arylamidsubstituenten um eine Zehnerpotenz. Darüber hinaus führt ein tertiärer Dimethylcarboxamid-Rest zum vollständigen Aktivitätsverlust. Zur Falsifizierung der postulierten Bindetasche wurden zusätzlich gezielt Derivate mit sterisch anspruchsvollen Substituenten (Tetrahydronaphthyl, Phenoxyphenyl) hergestellt, die nicht in der Lage sein sollten im berechneten Bindemodus am Interdomänen-Interface zu binden. Dabei stand das so ermittelte verfügbare Platzangebot in Einklang mit den aufgrund der Docking-Analysen getroffenen Annahmen. Um die Enantioselektivität der Aktivität der trans-Verbindungen zu prüfen, wurde für zwei repräsentative Carboxamide (24a und 24i) eine Enantiomerentrennung mittels chiraler HPLC durchgeführt und die Enantiomere einzeln getestet. Dabei erwiesen sich die R,R-Derivate als Träger der Anti-MM-Wirksamkeit. Zur Abschätzung der Permeabilität wurden die PSA-Werte der Carboxamide (24) berechnet. Mit Ausnahme der hydroxylsubstituierten Verbindung 24r lagen die Werte aller Derivate (24a-q) in einem Bereich von 65–88Å2, was einen akzeptablen Resorptionsanteil von 55–90% erwarten lässt. Die Bestimmung der Lipophilie der hergestellten Carboxamide mittels HPLC ergab einen logD-Bereich von 1–3, in dem Wirkstoffe einen ausgewogenen lipophilen Charakter besitzen. Die Effizienz der hergestellten Inhibitoren wurde darüber hinaus anhand der ermittelten LE- (engl. ligand efficiency) und LLE-Werte (engl. ligand lipophilic efficiency) beurteilt. Die günstigste Kombination aus LE und LLE wurde für Verbindung 24j (EC50 = 0.20 μM) ermittelt. Dieses Derivat zeichnet sich durch einen Phenylsubstituenten in Position2 des Tetrahydroisochinolin-Gerüsts, einen Methoxyphenylrest in Position3 und einen Pyrimidinsubstituenten am exozyklischen Amid aus. Zur Beurteilung unspezifisch toxischer Effekte wurde neben der Wirksamkeit an MM-Zellen auch der Einfluss der Tetrahydroisochinolin-Derivate auf die Viabilität von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersucht (AG Chatterjee). Während die aktivsten Carboxamide an MM-Zellen im submikromolaren Bereich wirksam waren, zeigte mit Ausnahme des phenolsubstituierten Derivats trans-24r keine der getesteten Verbindungen toxische Effekte an PBMCs (EC50 > 100 μM). Darüber hinaus legen detaillierte Westernblot-Analysen einen HSP70-spezifischen Wirkmechanismus nahe. Außerdem führte eine duale Hemmung von HSP70 und HSP90 durch gleichzeitige Inkubation mit trans-24i und NVP-AUY922 (5) zu einem additiven pro-apoptotischen Effekt bei MM-Zellen. Aufgrund der vielversprechenden In-vitro-Ergebnisse und seiner guten Löslichkeit wurde trans-39c in vivo untersucht. Zu diesem Zweck wurden zunächst die physikochemischen Parameter pKa, logP und Löslichkeit sowie die Plasma-Proteinbindung ermittelt (in Kooperation mit AG Meinel). Auf Basis einer im Anschluss durchgeführten Pharmakokinetik-Simulation wurden zwei unterschiedliche Dosierungen gewählt. Toxizitätsuntersuchungen von trans-39c zeigten keine Hämolyseaktivität und keinen Effekt auf die Viabilität von Leber- und Nierenzellen (H. Bruhn). Für die In-vivo-Studie wurde ein murines MM-Modell verwendet, das auf MOPC-315.BM-Luciferase+-Zellen basiert und eine nicht-invasive In-vivo-Bestimmung der Tumorentwicklung via Biolumineszenz ermöglicht (AG Beilhack). Über einen Zeitraum von zehn Tagen wurde zwei Gruppen mit jeweils fünf Tieren behandelt. Dazu wurde trans-39c (4 bzw. 40 μg) im Abstand von 12 h intraperitoneal appliziert. Alle Versuchstiere tolerierten die Behandlung und die mit einer Dosis von 40 μg therapierte Gruppe zeigte eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums gegenüber einer unbehandelten Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis konnte zusätzlich durch eine im Anschluss durchgeführte Ex-vivo-Untersuchung bestätigt werden, bei der die Tumorlast in verschiedenen Knochen und Geweben ermittelt wurde. Die Tetrahydroisochinolinon-Derivate haben sich damit als ausgezeichnete Leitstruktur für die Weiterentwicklung als HSP70-Inhibitoren erwiesen und könnten in Zukunft zu einem deutlichen Fortschritt bei der Behandlung des Multiplen Myeloms beitragen. N2 - Multiple Myeloma (MM) is generally characterized by a malignant disorder of the plasma cells within the bone marrow. Despite some progress made in treatment, it still remains incurable. Since the past years heat shock proteins (HSPs) have been established as attractive targets for new therapies. HSPs are frequently overexpressed in MM and play an important role in stabilizing multiple oncogene signaling pathways. Initially pharmaceutical companies had developed various inhibitors of HSP90, which proved to be successful in preclinical MM studies. However, in clinical therapies they just showed limited potency since the inhibition of HSP90 leads to a strong and fast HSF-1-mediated upregulation of the HSP70 expression. This response is compensating the inhibition of HSP90 and leads to an attenuation of the antitumor activity. Therefore a dual depletion of HSP90 and the HSF- 1/HSP70 system is regarded as a promising strategy for an efficient treatment of MM. The present work, established within the Clinical Research Unit 216, deals with the development of inhibitors of the HSF-1/HSP70 system. Therefore two independent strategies were implemented, i.e. an inhibition of the HSF-1 signaling pathway and the direct inhibition of HSP70. The obtained results in detail: 1) According to the HSF-1 inhibitor NZ28 (12) it was tested whether its tetrahydro- isoquinoline-scaffold can serve as a lead structure for the development of HSF-1 pathway inhibitors. Hence a series of variously substituted tetrahydroisoquinolinone derivatives was prepared. The synthesis followed a sequential Ugi-Heck reaction, as this procedure offers the opportunity to vary three substituents of the tetrahydroisoquinoline-scaffold independently and highly flexible and therefore gives access to a library of different tetrahydroisoquinolinones. However, bioactivity analysis revealed that none of the obtained compounds (26) was able to inhibit the HSF-1-mediated HSP70 expression. In order to analyze the influence of the specific substitution pattern of the products from the Ugi-Heck reaction, a variety of the tetrahydroisoquinolinones (24 and 36) synthesized as inhibitors of HSP70 were additionally tested with the HSF-1 assay. As these compounds also showed no inhibition of the signaling pathway, it is supposed that substituted tetrahydroisoquinolines are no suitable lead structures for the development of HSF-1 inhibitors. 2) In contrast to the synthesized tetrahydroisoquinolinones, several α-acylaminocarbox- amides showed an inhibition of the HSF-1-mediated HSP70 expression. These compounds were obtained as intermediates of the Ugi-Heck reaction and are characterized through a Michael system. Although no distinct structure-activity relationship could be derived with regard to individual substituents, it could be shown that the observed bioactivity is independent from the Michael system included. Thus, the activity of the α-acylamino-carboxamides is apparently not restricted to a covalent bond formed along with nucleophilic protein side chains. This reduces the potential of unspecific interactions. 3) The Ugi reaction was also performed with β-acyl-substituted acrylic acids. Making use of such carbonic acids, access to pharmacological interesting 2,5-diketopiperazines (35) was gained in just one reaction step. The products obtained showed specific anti-proliferative properties towards activated T-cells in a dose-dependent manner. Therefore they represent potential candidates for treating unwanted T cell-mediated immune responses (explored in the group of Prof. Topp). Analyzing the structure-activity relationship revealed an explicit preference for trans-configured 2,5-DKPs. Moreover, the activity of the most potent compound was of the same magnitude as the positive control 17-dimethoxyaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, 4b) 4) For the development of novel HSP70 inhibitors it was aimed to prevent the protein function by an interaction with the interdomain interface of HSP70. A corresponding Virtual Screening (performed in the group of Prof. Sotriffer) yielded the tetrahydro- isoquinolinone trans-24a as most potent compound. Initially a diastereoselective and highly flexible reaction sequence to the virtual screening hit (trans-24a) was established which was then utilized to create a library of modified compounds. By means of systemic structural modifications significant moieties were identified and furthermore detailed information for creating derivatives with higher potency important results were: - Exclusively trans-configured tetrahydroisoquinolinones are highly active against MM cells. - Carboxamides (Pos. 4) are more potent than the corresponding carbonic acid and carboxylate analogues. - The methoxy function at the phenyl substituent in pos. 3 is important for the activity, whereas its absence at the phenyl ring in pos. 2 increases the potency. - An aliphatic MeNH-group at the exocyclic amide is reducing the activity against arylamide substituents by an order of magnitude. Moreover, a tertiary dimethylcarboxamide moiety causes the complete loss of activity. To falsify the postulated binding pocket, specific derivatives bearing structural challenging substituents (tetrahydronaphthyl, phenoxyphenyl) were synthetized additionally. They should not be able to bind to the interdomain interface in the calculated binding mode. As a result the available space was in good agreement with the assumptions made upon the docking analyses. In order to prove whether the activity of the trans-compounds is induced by only one enantiomer, two representative carboxamides (24a und 24i) were subjected to an enantioseparation by means of chiral HPLC. Exclusively the R,R-compounds were active. To estimate the compounds’ permeability, the PSA values of the carboxamides (24) were calculated. With exception of the hydroxyl substituted compound 24r, the values of all other derivatives (24a-q) ranged between 65–88 Å2. Thus, the fraction of absorption is expected to be 55–90%. The lipophilicity determined by means of HPLC yielded logD- values of 1–3, complying to a well-balanced lipophilic character. The efficiency of the synthesized inhibitors was evaluated by means of the calculated ligand efficiency (LE) and lipophilic ligand efficiency (LLE). The most favorable combination of LE and LLE was found for compound 24j (EC50 = 0.20 μM). It is characterized by a phenyl substituent in position 2 of the tetrahydroisoquinoline-scaffold, a methoxyphenyl group in position 3 and a pyrimidine substituent at the exocyclic amide. In addition to the analyzed potency against MM cells, the influence of the tetrahydroisoquinolines on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was determined in order to appraise unspecific toxic effects (performed in the group of Dr. Chatterjee). While the most potent carboxamides showed activity against MM cells in a submicromolar concentration range, none of the tested compounds showed toxic effects against PBMCs (EC50 > 100 μM) with exception of the phenol substituted derivative trans-24r. Furthermore, detailed Westernblot analyses suggest a HSP70 specific mode of action. As expected the dual inhibition of HSP70 and HSP90 by means of concomitant incubation with trans-24i and NVP-AUY922 (5) yielded an additive pro-apoptotic effect against MM cells. Based on these promising in vitro results compound trans-39c was subjected to an in vivo study. For this purpose the physicochemical parameters pKa, logP and solubility were determined initially (in collaboration with the group of Prof. Meinel) as well as the degree of plasma protein binding. Pharmacokinetic simulations were the fundamental for the two different dosages selected afterwards. In order to evaluate the potential of toxicity in more detail, the compounds’ hemolysis activity and its impact on the viability of liver and kidney cells were determined by H. Bruhn. These analyses did not reveal any cytotoxic effect. The in vivo study was performed with a novel murine MM model that based on MOPC-315.BM luciferase+ cells and therefore allows the none-invasive determination of tumor growth by means of bioluminescence imaging (developed and performed in the group of Prof. Beilhack). Two groups of five animals each were treated over a period of ten days. Therefore trans-39c (4 and 40μg, respectively) was injected intraperitoneal every 12 h. The therapy was well tolerated by all animals and the group treated with the higher dose of 40μg showed a significant reduction of tumor growth compared to the untreated control group. This result could be supplemented by ex vivo analyses performed subsequently where the tumor burden in different bones and tissues was determined. Ultimately the tetrahydroisoquinolinones have been established as excellent lead structures for an advanced development as HSP70 inhibitors and may contribute to a considerable progress in treatment of Multiple Myeloma in the future. KW - Plasmozytom KW - Hitzeschock Proteine KW - Hitzeschock-Proteine KW - Hitzeschocktranskriptionsfaktor KW - Multiples Myelom KW - HSF-1 KW - HSP70 KW - therapeutisches Target KW - Heatshock Proteins KW - Multiple Myeloma KW - therapeutic strategy Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91390 ER - TY - THES A1 - Hein, Michael T1 - Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen und Entwurf niedermolekularer MIP-Inhibitoren T1 - Development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses and design of small-molecule MIP inhibitors N2 - Dockingbasierte Ansätze zählen zu den wichtigsten Komponenten im virtuellen Screening. Sie dienen der Vorhersage der Ligandposition und -konformation in der Bindetasche sowie der Abschätzung der Bindungsaffinität zum Protein. Bis heute stellt die korrekte Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen ein noch nicht vollständig gelöstes Problem für Scoringfunktionen dar. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit ist daher der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gewidmet. Der Fokus eines ersten Teilprojektes lag auf der Berücksichtigung der Absättigung vergrabener Wasserstoffbrückenakzeptoren (HBA) und -donoren (HBD) bei der Bewertung von Docking-Lösungen. Nicht-abgesättigte vergrabene HBA und HBD stellen einen der Bindungsaffinität abträglichen Beitrag dar, der bis dato aufgrund fehlender Struktur- bzw. Affinitätsdaten in Scoringfunktionen vernachlässigt wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis einer detaillierten Untersuchung zur Häufigkeit vergrabener nicht-abgesättigter HBA und HBD in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes eine empirische Filterfunktion („vnaHB“-Filterfunktion) entwickelt, die unerwünschte Ligandbindeposen erkennt und von der Bewertung mittels Scoringfunktionen ausschließt. Der praktische Nutzen der empirischen Filterfunktion wurde für die Scoringfunktionen SFCscore und DSX anhand vorgenerierter Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes untersucht. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass eine Absättigung vergrabener polarer Gruppen in Protein-Ligand-Komplexen für eine hochaffine Protein-Ligand-Bindung notwendig ist, da vergrabene nicht-abgesättigte HBA und HBD nur selten auftreten. Eine vollständige Absättigung durch entsprechende Proteinpartner wird für ca. 48 % der untersuchten Komplexe beobachtet, ca. 92 % weisen weniger als drei hauptsächlich schwache, nicht-abgesättigte HBA bzw. HBD (z. B. Etherfunktionen) auf. Unter Einbeziehung von Wassermolekülen in die Häufigkeitsanalyse sind sogar für ca. 61 % aller Komplexe alle wasserstoffbrückenbindenden Gruppen abgesättigt. Im Gegensatz zu DSX werden für SFCscore nach Anwendung der empirischen Filterfunktion erhöhte Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose (≤ 2.0 Å Abweichung) unter den am besten bewerteten Docking-Posen erzielt. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::229m) werden Steigerungen dieses als „Docking Power“ bezeichneten Kriteriums für die Top-3-Posen (Erfolgsrate für die Identifizierung einer kristallnahen 2.0 Å Pose unter den besten drei Docking-Lösungen) von 63.1 % auf 64.2 % beobachtet. In einem weiteren Teilprojekt wurden repulsive Protein-Ligand-Kontakte infolge sterischer Überlappungen der Bindungspartner bei der Bewertung von Docking-Lösungen berücksichtigt. Die adäquate Einbeziehung solcher repulsiver Kontakte im Scoring ist für die Identifizierung proteingebundener Ligandkonformationen entscheidend, jedoch aufgrund fehlender Affinitäts- bzw. Strukturdaten problematisch. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde auf der Basis des Lennard-Jones-Potentiales des AMBER-Kraftfeldes zunächst ein neuer Deskriptor zur Beschreibung repulsiver Kontakte („Clash“-Deskriptor) entwickelt und zur Untersuchung der Häufigkeit ungünstiger Protein-Ligand-Kontakte in hochaufgelösten Protein-Ligand-Komplexen des Hartshorn-Datensatzes herangezogen. Eine aus der Häufigkeitsverteilung abgeleitete empirische Filterfunktion („Clash“-Filterfunktion) wurde anschließend der Bewertung von Docking-Lösungen des Cheng-Datensatzes mittels der Scoringfunktionen SFCscore und DSX vorgeschaltet, um unerwünschte Ligandbindeposen auszuschließen. Die Häufigkeitsuntersuchung zeigt, dass vorwiegend schwache repulsive Kontakte in Protein-Ligand-Komplexen auftreten. So werden in 75 % der Komplexe des Hartshorn-Datensatzes abstoßende Potentiale unter 0.462 kcal/mol beobachtet. Zwar betragen die ungünstigen Beiträge pro Komplex für 50 % aller Strukturen ca. 0.8 kcal/mol bis 2.5 kcal/mol, jedoch können diese auf Ungenauigkeiten der Kristallstrukturen zurückzuführen sein bzw. durch günstige Protein-Ligand-Wechselwirkungen kompensiert werden. Die Anwendung der „Clash“-Filterfunktion zeigt signifikante Verbesserungen der Docking Power für SFCscore. Für die beste SFCscore-Funktion (SFCscore::frag) werden Steigerungen der Erfolgsraten für das Auffinden einer kristallnahen Pose unter den drei am besten bewerteten Docking-Lösungen von 61.4 % auf 86.9 % erzielt, was an die Docking Power der bis dato besten Scoringfunktionen aus der Literatur (z. B. DSX, GlideScore::SP) heranreicht (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). Die „Clash“-Filterfunktion allein ist auch der Kombination der „Clash“- und der „vnaHB“-Filterfunktion überlegen. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit wurde auf die Einbeziehung von Decoy-Daten (Struktur- und Affinitätsdaten schwach affiner und inaktiver Liganden) im Zuge der Entwicklung computergestützter Methoden zur Bewertung von Docking-Lösungen gelegt. Dadurch soll eine adäquate Berücksichtigung ungünstiger Beiträge zur Bindungsaffinität ermöglicht werden, die für die Richtigkeit und Zuverlässigkeit ermittelter Vorhersagen essentiell ist. In der vorliegenden Arbeit wurden binäre Klassifizierungsmodelle zur Bewertung von Docking-Lösungen entwickelt, die die Einbeziehung von Decoy-Daten ohne die Verfügbarkeit von Affinitätsdaten erlauben. Der Random-Forest-Algorithmus (RF), SFCscore-Deskriptoren, der neu entwickelte „Clash“-Deskriptor, und die Decoy-Datensätze von Cheng und Huang (Trainingsdaten) bilden die Grundlage des leistungsfähigsten Klassifizierungsmodells. Der praktische Nutzen des „besten“ RF-Modells wurde nach Kombination mit der Scoringfunktion DSX anhand der Docking Power für das Auffinden einer kristallnahen Pose auf Rang 1 am unabhängigen Cheng-/Huang- (Komplexe, die nicht in den Trainingsdaten enthalten sind) und CSAR-2012-Testdatensatz untersucht. Gegenüber einer alleinigen Anwendung von DSX werden an beiden Testdatensätzen weitere Verbesserungen der Docking Power erzielt (Cheng-/Huang-Testdatensatz: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012-Testdatensatz: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). Das „beste“ Modell zeichnet sich durch die zuverlässige Vorhersage richtig-positiver Docking-Lösungen für einige wenige Komplexe aus, für die DSX keine kristallnahe Ligandkonformation identifizieren kann. Ein visueller Vergleich der jeweils am besten bewerteten RF- und DSX-Pose für diese Komplexe zeigt Vorteile des RF-Modells hinsichtlich der Erkennung für die Protein-Ligand-Bindung essentieller Wechselwirkungen. Die Untersuchung der Bedeutung einzelner SFCscore-Deskriptoren für die Klassifizierung von Docking-Lösungen sowie die Analyse der Misserfolge nach Anwendung des Modells geben wertvolle Hinweise zur weiteren Optimierung der bestehenden Methode. Hinsichtlich der zu bewertenden Eigenschaften ausgeglichenere Trainingsdaten, Weiterentwicklungen bestehender SFCscore-Deskriptoren sowie die Implementierung neuer Deskriptoren zur Beschreibung bis dato nicht-berücksichtigter Beiträge zur Bindungsaffinität stellen Ansatzpunkte zur Verbesserung dar. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit umfasst die Anwendung dockingbasierter Methoden im Rahmen der Entwicklung neuer Inhibitoren des „Macrophage Infectivity Potentiator“-(MIP)-Proteins von Legionella pneumophila und Burkholderia pseudomallei. Das MIP-Protein von Legionella pneumophila stellt einen wichtigen Virulenzfaktor und daher ein attraktives Zielprotein für die Therapie der Legionellose dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgten systematische Optimierungen des Pipecolinsäure-Sulfonamides 1, des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM). Nach Hot-Spot-Analysen der Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Die Ergebnisse der Hot-Spot-Analysen zeigen günstige Wechselwirkungsbereiche für Donorgruppen und hydrophobe Substituenten in meta-Position sowie Akzeptorgruppen in para-Position des Benzylringes von 1 auf. Die Einführung einer Nitrofunktion in para-Position des Benzylringes von 1 (2h) resultiert in einer erhöhten MIP-Inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), was wahrscheinlich auf die Ausbildung einer zusätzlichen Wasserstoffbrücke zu Gly116 zurückzuführen ist. Selektivitätsverbesserungen gegenüber dem strukturverwandten humanen FKBP12-Protein werden insbesondere für das para-Aminoderivat von 1 (2n) erzielt (Selektivitätsindex (1): 45, Selektivitätsindex (2n): 4.2; mit Selektivitätsindex = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring (2s) führt zu einer verbesserten Löslichkeit bei vergleichbarer MIP-Inhibition. Das MIP-Protein von Burkholderia pseudomallei spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Melioidose und stellt daher ein attraktives Zielprotein für die Entwicklung neuer Arzneistoffe dar. In der vorliegenden Arbeit erfolgten Optimierungen des bis dato besten niedermolekularen MIP-Inhibitors 1. Ausgehend von einem Strukturvergleich von Burkholderia pseudomallei MIP mit Legionella pneumophila MIP und einer Hot-Spot-Analyse der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche wurden Docking-Studien zur Auswahl aussichtsreicher Kandidaten für die Synthese und Testung auf MIP-Inhibition durchgeführt. Der Strukturvergleich zeigt eine hohe Homologie beider Bindetaschen. Größere konformelle Änderungen werden lediglich für den von Ala94, Gly95, Val97 und Ile98 geformten Bindetaschenbereich beobachtet, was unterschiedliche Optimierungsstrategien für 1 erforderlich macht. Günstige Wechselwirkungsbereiche der Burkholderia pseudomallei MIP-Bindetasche finden sich einerseits für Donorgruppen oder hydrophobe Substituenten in para-Position des Benzylringes (Region A) von 1, andererseits für Akzeptor- bzw. Donorgruppen in para- bzw. meta-/para-Position des Trimethoxyphenylringes (Region B). Anhand von Docking-Studien konnten sowohl für Variationen in Region A als auch in Region B aussichtsreiche Kandidaten identifiziert werden. Initiale MIP-Inhibitionsmessungen der bis dato synthetisierten Derivate deuten auf erhöhte Hemmungen im Vergleich zu 1 hin. Der Ersatz des hydrophoben Trimethoxyphenylrestes von 1 durch einen Pyridinring führt auch hier zu vergleichbarer MIP-Inhibition bei verbesserter Löslichkeit. Derzeit sind weitere Synthesen und Testungen aussichtsreicher Liganden durch die Kooperationspartner geplant. Die Ergebnisse der Inhibitionsmessungen sollen deren Nutzen als MIP-Inhibitoren aufzeigen und wertvolle Informationen für weitere Zyklen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns liefern. N2 - Docking-based approaches belong to important virtual screening components and aim at predicting both the ligand position and conformation within the protein binding site as well as the binding affinity. To date scoring functions are still not fully reliable in correctly identifying near-native ligand conformations generated by docking. Thus, the first part of the current work is dedicated to the development of computer-aided methods for the evaluation of docking poses. A first project focused on considering the saturation of hydrogen bond acceptors (HBA) and donors (HBD) for the evaluation of docking poses. Since structural and affinity data are missing, current scoring functions neglect unpaired buried HBA and HBD, which strongly disfavour high-affinity binding. Based on a detailed frequency analysis of unpaired buried HBA and HBD within high-quality protein-ligand complexes of the Hartshorn dataset, an empirical filter function (“vnaHB” filter function) was developed to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with scoring functions. The practical benefit of the filter function was investigated for the scoring functions SFCscore and DSX using pre-generated docking poses of the Cheng dataset. As shown in the frequency analysis, the saturation of buried polar groups is of utmost importance for high-affinity binding, as unpaired buried HBA and HBD are extremely rare. A complete saturation by proper protein counterparts is observed for about 48 % of all complexes under study, whereas approximately 92 % have less than three, mostly weak unpaired buried HBA or HBD (e.g. ether functions). Including also the saturation by water molecules reveals that actually for about 61 % of all complexes every hydrogen bonding group is saturated. Unlike DSX, the application of the filter function with SFCscore results in higher success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the top scored poses, a criterion termed “Docking Power”. For the best SFCscore function (SFCscore::229m) the Docking Power with respect to the top three poses increases from 63.1 % to 64.2 %. A further project focused on considering repulsive intermolecular contacts due to sterical overlap of the protein-ligand binding partners for the evaluation of docking poses. Although an inclusion of such repulsive contacts in scoring is of utmost importance for the identification of protein-bound ligand conformations, it remains challenging because of missing structural and affinity data. Based on the Lennard-Jones potential of the AMBER force field a new descriptor accounting for repulsive protein-ligand contacts (“clash” descriptor) was developed and used for analysing the frequency of unfavourable protein-ligand contacts among high-quality structures of the Hartshorn dataset. An empirical filter function (“clash” filter function) derived from the frequency distribution was applied to pre-generated docking poses of the Cheng dataset to remove unfavourable ligand binding poses prior to the ranking with SFCscore and DSX. As shown in the frequency analysis, mostly weakly repulsive contacts occur within protein-ligand complexes. For 75 % of the complexes of the Hartshorn dataset repulsive potentials of less than 0.462 kcal/mol are observed. Indeed, unfavourable contributions add up to not more than 0.8 kcal/mol to 2.5 kcal/mol per complex for 50 % of all structures; values in this range may be attributed to inaccuracies of crystal structures or could be counterbalanced by favourable protein-ligand interactions. The application of the “clash” filter function shows significant improvements of the Docking Power of SFCscore. For the best SFCscore function (SFCscore::frag) the success rates for identifying a near-native 2.0 Å pose under the three top scored poses increases from 61.4 % to 86.9 %, which is comparable to the Docking Power of the best scoring functions (e.g. DSX, GlideScore::SP) currently available in literature (Docking Power (DSX): 92.6 %; Docking Power (GlideScore::SP): 86.9 %). The “clash” filter function alone is also superior to the combination of the “clash” and the “vnaHB” filter function. Another focus of the work was the inclusion of decoy data (structure and affinity data of weakly active and inactive ligands) in scoring function development. Thus, unfavourable contributions to the binding affinity should be adequately considered, which appears essential for improving accuracy and reliability of the predictions. Within the scope of this work a binary classification model was developed for the evaluation of docking poses, allowing the inclusion of decoy poses without affinity data. The random forest algorithm (RF), SFCscore descriptors, the new “clash” descriptor, and the decoy datasets of Cheng and Huang (training data) provide the basis of the best-performing model. The practical benefit of the “best” RF model was investigated after combination with the scoring function DSX based on the Docking Power for identifying a near-native pose on rank 1 using the independent Cheng/Huang (only complexes not used for training) and the CSAR-2012 dataset. With respect to the standalone application of DSX, improvements of the Docking Power regarding both test sets are achieved (Cheng/Huang test set: DSX 84.24 %, RF 87.27 %; CSAR-2012 test set: DSX 87.93 %, RF 91.38 %). A key feature of the “best” model are reliable predictions of true positive docking poses for those complexes for which DSX fails to identify a near-native ligand conformation. A visual comparison of the best RF and DSX pose highlights advantages of the RF model regarding the recognition of interactions crucial for protein-ligand binding. The importance analysis of SFCscore descriptors for the classification of docking poses as well as the investigation of failures after model application provide useful hints for further improvements. Thus, more property-balanced training data, the further development of established SFCscore descriptors, and the implementation of new descriptors accounting for neglected contributions to the binding affinity constitute possible starting points for future improvements. The second part of this work is dedicated to the application of docking-based methods for the development of new inhibitors of the "`Macrophage Infectivity Potentiator"'-(MIP) proteins of Legionella pneumophila and Burkholderia pseudomallei. The MIP protein of Legionella pneumophila constitutes an important virulence factor and thus an attractive target for the treatment of legionellosis. Within the scope of this work the pipecolic acid sulfonamide 1, one of the best small-molecule MIP inhibitors to date (IC50 (1): 9 ± 0.7 µM), was systematically optimised. After hot spot analysis of the binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing MIP inhibition. The results of the hot spot analysis show favourable interaction fields for donor groups and hydrophobic substituents in meta position as well as acceptor groups in para position of the benzyl ring of 1. Introducing a nitro function in para position of the benzyl ring of 1 (2h) results in an increased MIP inhibition (IC50 (2h): 5 ± 1.5 µM), which is likely due to the formation of an additional hydrogen bond to Gly116. An improvement in the selectivity compared to the structurally related human FKBP12 protein is achieved particularly with the para amino derivative of 1 (2n) (selectivity index (1): 45, selectivity index (2n): 4.2, where the selectivity index = IC50 (MIP)/IC50 (FKBP12)). Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (2s) leads to improved solubility and comparable MIP inhibition. The MIP protein of Burkholderia pseudomallei plays an important role in the pathogenesis of melioidosis and thus constitutes an attractive target for the development of new drugs against this disease. Within the scope of this work the currently best small-molecule MIP inhibitor 1 was optimised. Starting with a structural comparison of Burkholderia pseudomallei MIP and Legionella pneumophila MIP, as well as a hot spot analysis of the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket, docking studies were conducted to select promising candidates for synthesis and testing for MIP inhibition. The structural comparison reveals a high homology of the two binding pockets. Major conformational changes are observed for the binding pocket region formed by Ala94, Gly95, Val97 and Ile98, which necessitates different optimisation strategies for 1. Favourable interaction fields for the Burkholderia pseudomallei MIP binding pocket are found for donor groups or hydrophobic substituents in para position of the benzyl ring (region A) of 1 as well as for acceptor or donor groups in para or meta/para position of the trimethoxyphenyl ring (region B). On the basis of the docking studies promising candidates could be identified for variations in both regions. Initial MIP inhibition measurements of synthesised derivatives indicate increased inhibition compared to 1. Replacing the hydrophobic trimethoxyphenyl residue of 1 with a pyridine ring (yielding a more soluble derivative) leads again to comparable MIP inhibition. Further syntheses and tests of promising ligands are currently being planned by the collaboration partners. The results of the inhibition measurements should demonstrate their suitability as MIP inhibitors and provide useful information for future structure-based drug design cycles. KW - Arzneimitteldesign KW - Computational chemistry KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia KW - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign KW - Docking KW - Scoringfunktionen KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia pseudomallei KW - Structure-based drug design KW - Docking KW - Scoring functions KW - Legionella pneumophila KW - Burkholderia pseudomallei KW - Maschinelles Lernen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101585 ER - TY - THES A1 - Bothe, Sebastian Helmut T1 - Fragmentbasiertes Design von p97-Liganden: Identifizierung von Startstrukturen zur Entwicklung von Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren für die SHP-Bindestelle der AAA+ ATPase p97 T1 - Fragment-based design of p97-ligands: Identification of starting points for the development of protein-protein-interaction inhibitors targeting the SHP-binding site of the AAA+ ATPase p97 N2 - Die AAA+ ATPase p97 ist ein essenzielles Protein, das an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt ist und eine Schlüsselrolle in der Protein-Homöostase spielt. Die funktionale Diversität von p97 beruht auf der Interaktion zahlreicher unterschiedlicher Kofaktoren, die vorwiegend an die N-Domäne von p97 binden. Aufgrund seiner Bedeutung in der Regulierung diverser physiologischer und pathologischer Prozesse stellt p97 eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer Wirkstoffe dar, die insbesondere in der Krebstherapie von Bedeutung sein könnte. Bekannte p97-Inhibitoren greifen vor allem die ATPase-Funktion des Proteins an. Ein neuer pharmakologischer Ansatz stellt die Inhibierung der Kofaktorbindung an die N-Domäne dar. Ein solcher Protein-Protein-Interaktionsinhibitor wäre nicht nur von therapeutischem Interesse, sondern hätte auch einen besonderen Nutzen für die Entschlüsselung molekularer und zellulärer Funktionen von p97-Kofaktoren. In dieser Arbeit wurde ein fragmentbasierter Ansatz für die Identifizierung von chemischen Startstrukturen für die Entwicklung eines Protein-Protein- Interaktionsinhibitors verfolgt. Als Zielstruktur wurde die SHP-Bindestelle in der N-Domäne gewählt. Die Identifizierung von Liganden erfolgte sowohl durch computergestützte Methoden (insbesondere virtuelles Screening und Molekulardynamik-Simulationen) als auch experimentell durch biophysikalische Techniken (wie Biolayer-Interferometrie, Röntgenstrukturanalyse und ligandbasierte NMR-Techniken). Die Grundlage des computerbasierten Designs stellte eine Analyse der bekannten Kristallstrukturen der p97-Komplexe mit den SHP-Motiven der Kofaktoren UFD1 und Derlin-1 dar. Darüber hinaus dienten Molekulardynamik-Simulationen der Analyse der Wassereigenschaften innerhalb der SHP-Bindestelle. Darauf aufbauend wurden verschiedene Pharmakophormodelle entwickelt, die die Grundlage des im Anschluss durchgeführten virtuellen Screenings und Dockings bildeten. Anhand der Ergebnisse von Molekulardynamik-Simulationen wurden zehn Verbindungen für die experimentelle Validierung ausgewählt. Hiervon konnten zwei Fragmente in STD-NMR- und Biolayer-Interferometrie-Experimenten als Liganden bestätigt werden. In einem parallel durchgeführten biophysikalischen Fragmentscreening mittels Biolayer-Interferometrie wurden unter mehr als 650 Verbindungen 22 identifiziert, die an die N-Domäne binden. 15 dieser Fragmente wurden durch einen orthogonalen STD-NMR-Assay bestätigt. Fünf dieser Verbindungen zeigten Affinitäten mit KD-Werten kleiner 500μMund günstigen Ligandeffizienzen. Des Weiteren konnte die Bindungskinetik und Affinität des in der Literatur als p97-Inhibitor berichteten Naturstoffes Xanthohumol bestimmt und eine Bindung an die N-Domäne bestätigt werden. Zur Identifizierung möglicher Bindestellen dieser fünf Fragmente wurden mixed-solvent Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt. Diese ergaben, dass alle Verbindungen die SHP-Bindestelle in der N-Domäne adressieren. Die Regionen fielen mit hot spots der Kofaktorwechselwirkungen zusammen und stellen somit mögliche Ankerpunkte für die Weiterentwicklung dar. Für zwei Fragmente konnten die postulierten Bindestellen mittels Röntgenstrukturanalyse bzw. STD-NMR-Messungen an p97-Alanin-Mutanten bestätigt werden. Die erhaltene Röntgenstruktur ist die erste p97-Struktur, die ein gebundenes Fragment an der N-Domäne zeigt. N2 - The AAA+ATPase p97 is an essential protein involved in numerous cellular pro-cesses and plays a key role in multiple aspects of protein homeostasis. Its functio-nal diversity is mediated through the interaction with a large number of distinctcofactors binding to the N-domain of p97. Due to its significant role in regulatinga variety of physiological responses, p97 has emerged as a potential therapeu-tic target. A small molecule inhibiting the cofactor binding would be importantto dissect the molecular and cellular functions of p97 cofactors, thus helping tounravel their specific role in controlling p97 activity. Such compounds may alsoopen routes to new cancer therapies.In this work, a fragment-based approach was pursued for the identification ofchemical starting points for the development of a protein-protein interaction in-hibitor addressing the SHP binding site. Therefore, computer-assisted methods,such as virtual screenings and molecular dynamics simulations, as well as bio-physical techniques including biolayer interferometry, X-ray crystallography, andligand-based NMR techniques, were applied.The computer-based design started with an analysis of the known p97 crystalstructures in complex with the SHP motifs of cofactors UFD1 and Derlin-1. In ad-dition, molecular dynamics simulations were used to analyze the water proper-ties within the SHP binding site. Based on these results, pharmacophore modelswere developed and utilized in the subsequent virtual screening and dockingprocess. With the help of molecular dynamics simulations, ten compounds wereselected for experimental validation. Two of these were confirmed as ligands inSTD-NMR and biolayer interferometry experiments.In parallel, a biophysical fragment screening of over 650 compounds was perfor-med using the biolayer interferometry method. This led to the identification of22 compounds binding to the N-domain. Fifteen of these fragments were con-firmed in an orthogonal STD-NMR assay. Five compounds showed affinities withKDvalues below 500 μM and favourable ligand efficiencies for further optimiza-tion. Furthermore, the binding kinetics and affinity of xanthohumol, a naturalproduct reported in the literature as a p97 inhibitor, were determined and bin-ding to the N-domain was confirmed. xToidentify possible binding sites of these five fragments, mixed solvent mole-cular dynamics simulations were performed. These revealed that all compoundsaddress the SHP binding site in the N-domain. The regions coincide with hotspots of the cofactor binding and, thus, represent potential anchor points for aprotein-protein interaction inhibitor. For two fragments, the postulated bindingsites were confirmed by X-ray crystallography and STD-NMR measurements onp97 alanine mutants, respectively. The X-ray structure obtained is the first p97structure showing a fragment bound to the N-domain. KW - Arzneimitteldesign KW - Fragmentscreening KW - p97 KW - Biolayerinterferometrie KW - Protein-Protein-Interaktion KW - Kofaktorbindung KW - fragment screening KW - p97 KW - biolayerinterferometry KW - protein-protein-interaction KW - cofactorbinding KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Wirkstoffdesign Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239112 ER - TY - THES A1 - Lehmann [geb. Hofmann], Anna T1 - Entwicklung potenzieller Inhibitoren der Hitzeschockkomponenten HSF1 und HSP70 am Modell des Multiplen Myeloms T1 - Development of potential inhibitors of the heat shock components HSF1 and HSP70 on the model of the multiple myeloma N2 - Krebs gehört zu einem der zentralen Leiden der 21. Jahrhunderts und ist in den einkommensstarken Ländern die zweithäufigste Todesursache. Die Erkrankung Multiples Myleom (MM) gehört mit 1.3 % aller Krebserkrankungen zwar zu den seltenen Formen, verläuft jedoch meist tödlich und zeichnet sich durch eine unkontrollierte Entartung der monoklonaler Plasmazellen im Knochenmark aus. Da maligne Zellen dauerhaft internen und externen Stressfaktoren ausgesetzt sind und auf die Hitzeschutzantwort angewiesen sind, stellen die Komponenten des Hitzeschocksystems wie z.B. Chaperone HSP70 und HSP90 bzw. der Hitzeschockfaktor HSF1 ein attraktives therapeutisches Ziel dar. Nachweislich führt die Inhibition des Chaperons HSP90 zur HSF1-vermittelten Hochregulation des Proteins HSP70, sodass die Hitzeschutzantwort der zytotoxischen Aktivität der Inhibitoren entgegenwirkt und die Therapieerfolgschancen mindert. Die vorliegende Doktorarbeit, die im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216 (CRU216) ausgearbeitet wurde, befasste sich einerseits mit der Erweiterung der bereits vorhandenen Substanzbibliotheken sowohl zur Inhibition des Proteins HSP70 als auch des Transkriptionsfaktors HSF1. Hierdurch sollten detailliertere Struktur-Wirkungs-Bezeugungen evaluiert werden. Weiterhin wurden die kooperierenden Arbeitsgruppen des Forschungsprojektes durch die Entwicklung und Herstellung von Substanzen unterstützt, um mit Hilfe vielseitiger Methoden die exakten Wirkmechanismen beider Verbindungsklassen zu verstehen und aufzuklären. Die bereits bestehende Substanzbibliothek der 3,4-Dihydroisochinolin-1(2H)-on-Derivate aus der vorangehenden Arbeit wurde erfolgreich um neue Carbonsäure- ((±) 6a-j) und Carbonsäureamidverbindungen ((±) 7b-e) erweitert. Durch die Substitution phenolischer Seitengruppen der Isoquinolinone gelang es, Säurederivate herzustellen, die eine höhere Zytotoxizität auf den INA-6-Zellen als die Leitstruktur AH073t aufwiesen. Dabei handelt es sich um die monobromierte Verbindung (±) 6c (EC50 = 0.17 µM) oder das Derivat mit einem kurzem Bromoethoxylinker (±) 6j (EC50 = 0.18 µM). Parallel hierzu wurde festgestellt, dass die Substitution aromatischer Seitengruppen durch aliphatische Reste ((±) 6h-i) zum kompletten Aktivitätsverlust führte. Durch dir fortführende Umsetzung zu den Amiden gelang die Herstellung des Derivates (±) 7c (EC50 = 0.47 µM), welches eine ähnliche Aktivität im Vergleich zu der Struktur AH122t ((±) 7a) zeigte. Weiterhin wurde Verbindung (±) 7d identifiziert, die eine sechsfach höhere Zytotoxizität von 34.8 nM im Vergleich zu der Leitstruktur (±) 7a (EC50 = 200 nM) aufwies. Die Trennung der trans-Enantiomere der Leitstruktur AH073t wurde erfolgreich mit Hilfe einer chiralen chromatographischen Methode durchgeführt und die Absolutkonfiguration mit Hilfe der Circulardichroismus-Spektroskopie (Arbeitskreis Bringmann) bestimmt. Durch die biologische Untersuchung an den MM-INA-6-Zellen (Arbeitskreis Chatterjee) wurde die enantiospezifische Aktivität des 3R,4R-Enantiomers bestätigt, wohingegen das 3S,4S-Isomer hingegen nicht aktiv war. Die angestrebte Amidierung zu enantiomerenreinen Substanzen führte gegen die Erwartung zu einem Diastereomerengemisch, da aufgrund des aciden Protons am Kohlenstoff C-4 die Carbonsäuren im Laufe der Synthese epimerisierten. Um die Epimerisierung an der aciden Position zu vermeiden, wurden neuartige Isochinolinoncarbonsäure-Derivate hergestellt, die erstmalig an dem Kohlenstoff C 4 substituiert wurden. Mit Hilfe einer Schutzgruppentechnik wurden in drei Syntheseschritten erfolgreich drei neue Derivate, nämlich eine fluorierte ((±) 11), methylierte ((±) 15) und ethylierte Verbindung ((±) 16), erhalten. Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der fluorierten und ethylierten Spezies gelang durch die Röntgenstrukturanalyse der Einkristalle (Arbeitskreis Braunschweig). Dabei wurde festgestellt, dass die Alkylierungsreaktion stereospezifisch verliefen und ausschließlich cis-Derivate erhalten wurden. Die biologische Untersuchung dieser Substanzen bestätigte die Konfiguration, da alle drei Verbindungen keine Aktivität auf MM-INA-6-Zellen zeigten (EC50 >100 µM). Weiterhin wurde mit Hilfe einer UV-metrischen Messung die Sättigungskonzentration der neuen Derivate untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass die Substitution am Kohlenstoff C-4 zur Senkung der Löslichkeit geführt hat. Anhand der Proteinkristallstruktur des bHSC70 (C.Grimm) wurde ein TMAO-Molekül in der Nähe der der Interface-Oberfläche identifiziert. Basierend auf diesem Ergebnis wurde eine Methode zur Herstellung eines TMAO-Isochinolinonhybrides entwickelt, welches sich an der Leitstruktur AH073t orientierte. Während der Synthesesequenz ist es zu der Decarboxylierung des angestrebten 3,4-Dihydroisochinolin-1(2H)-on-Derivates gekommen, wodurch das neue Derivat 17 erhalten wurde. Nachdem die Reaktionsbedinungen variiert und die gewünschte Verbindung nicht erhalten wurde, wurde 17 im darauffolgenden Syntheseschritt erfolgreich zum TMAO-Hybrid 18 umgesetzt. Der Szintillationsnähenachweis (SPA) ist eine etablierte Methode, um mit Hilfe von radioaktivmarkierten Liganden Bindungsstudien im Hochdurchsatzformat durchzuführen und hier die Bindungsposition der Isochinolinon-Derivate zu untersuchen. Die Substanz AH122t diente hierbei als Leitstruktur zur Entwicklung einer Methode zur Radioaktivmarkierung der potentiellen HSP70-Inhibitoren, sodass die aktivierte Stanylverbindung (±) 19 erhalten wurde. Diese Verbindung konnte in der Gegenwart von Chloramin T und des NaI-Salzes innerhalb von wenigen Sekunden zum Radioliganden (±) 7d* umgesetzt werden. Die Herstellung des Radioliganden wurde mittels einer entwickelten HPLC-Methode analysiert und validiert. Eine weitere Möglichkeit zur Evaluieren der potentiellen Bindungspartner der hergestellten Isochinolinon-Verbindungen bietet die Affinitätschromatographie gekoppelt mit der proteomischen Analyse mittels quantitativer Massenspektrometrie (Arbeitskreis Schlosser). Es gelang die Herstellung der Biotin-markierter Liganden (±) 23, der sich an der Leitstruktur AH073t orientierte, und (±) 25, der sich an AH081t orientierte. Die ersten Analysen mittels Affinitätschromatographie zeigten, dass mit dem Liganden (±) 23 überraschenderweise keine Proteine signifikant angereichert wurden, während mit dem Liganden (±) 25 zwar keine HSP70-Proteine angereichert, aber einige Komponenten der Hitzeschutzantwort wie die Phosphatidylinositol-Kinasen DNA-PK und ATM, und die Untereinheiten des Chaperons HSP90 identifiziert werden konnten. Die bereits bestehende Substanzbibliothek der -Acylaminocarboxamide wurde erfolgreich mit Hilfe der Ugi-Multikomponentenreaktion um die Derivate (±) 38c-g erweitert. Die Evaluierung der biologischen Aktivität erfolgte semiquantitativ mittels Westernblot und quantitativ mittels ELISA-Assay (Arbeitskreis Chatterjee), wobei die Beurteilung indirekt anhand des HSF1-vermittelten Regulationslevels des Chaperons HSP72 erfolgte. Hierbei wurden neue Verbindungen (±) 38c und (±) 38g mit dem ,-gesättigten Carbonylsystem identifiziert, die eine vergleichbare inhibitorische Aktivität wie die bereits bekannten ungesättigten Derivaten (±) 37l oder (±) 37m zeigten, was darauf hinweist, dass die inhibitorische Aktivität der  Acylaminocarboxamide nicht von der kovalenten Bindung des Michael-Systems verursacht wird. Um das Target der -Acylaminocarboxamide zu evaluieren, wurde auch hier die Durchführung der Affinitätschromatographie gekoppelt mit der Analyse mittels der quantitativer Massenspektrometrie angestrebt (Arbeitskreis Schlosser). In Anlehnung an die Synthesemethodik für die HSP70-Liganden wurden hierfür die Biotin-markierten Liganden (±) 42, (±) 44 und (±) 46 erfolgreich hergestellt, die sich durch die Position des Biotinlinkers unterscheiden. Die proteomische Untersuchung wurde erfolgreich mit den Liganden (±) 44 und (±) 46 durchgeführt und es wurden 68 Proteine signifikant angereichert. Viele dieser Proteine tragen die sogenannte Armadillo-Domäne, die eine wichtige Rolle in der Protein-Protein-Interaktion spielt und eine hochkonservierte Bindungstasche aufweist. Unter den angereicherten Proteinen befanden sich mitunter der MICOS-Komplex, der CCR4-NOT-Komplex und die Kinasen des Phosphatidylinositol-Signalwegs. Von den letzteren konnten explizit die Kinasen DNA-PK, ATM, ATR und mTOR identifiziert werden, die möglicherweise die HSF1-regulierte HSP70-Expression beeinflussen. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Position des Linkers die Bindung an zwei unterschiedliche Proteingruppen beeinflusst. Während der Ligand (±) 44 ausschließlich mit den Proteinen des CCR4-NOT-Komplexes interagierte, wurden für den Liganden (±) 46 die Komponenten des COG Komplexes identifiziert. N2 - Cancer is one of the emerging diseases of the current century and leads to every second death in the high-income countries. Multiple Myeloma (MM) is characterised by clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow. MM causes only about 1.3 % of all cancer cases but remains incurable due to resistance and huge relapse numbers. The heat shock response helps cells to deal with situation of stress and provides protection from cell death. Especially malignant cells must cope numerous internal and external stress factors and rely on proteins of the heat shock response as the chaperones HSP70/HSP90 but also the transcriptions factor HSF1. To date, it was already demonstrated that the pharmacological inhibition of the protein HSP90 leads to the HSF1-dependent upregulation of HSP70 causing resistance against agents. The current thesis, which was realised within the Clinical Research Unit 216 (CRU216), proposed the enlargement of the established substance libraries of both targets HSF70 and HSF1 to intense the investigation of the structure-activity relationships. Furthermore, the collaborating research groups within the CRU216 were supported by development of numerous compounds and realisation of diverse analytical methods for research of the interaction of new compounds and the potential targets HSP70 and HSF1. The substance library of 3,4-dihydroisoquinolin-1(2H)-one derivatives, which was established in the previous work, was successfully expanded with new carboxylic acid derivatives (±) 6a-j and amide derivatives (±) 7b-e. The substitution of the phenolic moieties enabled the synthesis of agents with higher activity towards INA-6-cell as the lead compound AH073t (Chatterjee group). The brominated derivative (±) 6c and the derivative with a short bromoethoxy linker (±) 6j showed similar EC50 values of 0.17 µM and 0.18 µM, respectively. Concurrently, the replacement of the aromatic residues with aliphatic moieties ((±) 6h-i) led to complete abrogation of the biological activity. In conclusion, the aromatic molecule residues are essential for the interaction of the inhibitors to the potential target. Among the new amide derivatives, the compound (±) 7c showed similar inhibitory activity as the lead compound AH122t ((±) 7a) from the previous work. Furthermore, it was possible to identify the derivative (±) 7d with the EC50 value of 34.8 nM which was six times more active than the lead compound A122t (EC50 = 200 nM). The enantiomers of the racemic lead compound AH073t were successfully separated by means of a chiral chromatographical method. The configuration of the enantiomers was determined by circular dichroism spectroscopy (Bringmann group). The investigation of the biological activity on INA-6-cells determined that the 3R,4R-isomer is the eutomer whereas the 3S,4S-enantiomer did not show any inhibitory activity (Chatterjee group). Unfortunately, the following amide synthesis led to the epimerisation due to the acidic proton at the carbon C-4 so that the isolation of enantiomeric pure amide compounds could not be achieved. As next, the acidic position of the 3,4-dihydroisoquinolinones was substituted to prevent the epimerisation. It was possible to establish three novel derivatives (±) 11 (fluorinated), (±) 15 (methylated) and (±) 16 (ethylated) in three synthesis steps. The analysis of the steric configuration of the compound (±) 11 and (±) 16 was achieved by X-ray crystallography. Additionally, the alkylation reactions were found to be stereospecific leading to formation of pure cis isomers. The investigation of the biological activity on INA-6-cells confirmed these results as all three compounds were not active (EC50 >100 µM). Furthermore, the saturation concentration of the novel substances was analysed UV-metric and it was observed that the substitution on the carbon C-4 led to decreased solubility. The protein crystal structure of the bovine HSC70 (C.Grimm) showed that a TMAO molecule was bound next to the identified interface domain. Based on this result, a method for synthesis of a TMAO-isoquinolinone hybrid was developed. During the synthesis, unexpected decarboxylation of the planed isoquinolinone carboxylic acid occurred so that the novel compound 17 was isolated. As changed reaction conditions did not lead to the formation of the desired product, 17 was successfully oxidised to the TMAO-derivative 18. Scintillation proximity assay (SPA) is a radioisotopic assay technique that allows fast performance of binding studies and could support the evaluation of the binding target of the 3,4 dihydroisoquinolinones. A synthesis method for a radiolabelled ligand was successfully developed using the iodised analogue of the lead compound AH122t. The synthesis of the activated trialkylstannane (±) 19 was accomplished, which was radiolabelled within seconds by the reaction with Chloramine T and NaI to obtain the radioligand (±) 7d*. The formation of the radioligand was controlled by a developed HPLC method. A further method for the identification of the drug target is affinity chromatography in combination with quantitative mass spectrometry (Schlosser group). A synthesis route was developed and two affinity ligands (±) 23 and (±) 25, which differ by the position of the Biotinlinker, were obtained. The initial experiments indicated that surprisingly no proteins were captured by means of the ligand (±) 23. The ligand (±) 25 enabled the capturing and identification of some significantly enriched heat shock response proteins as the PI3-kinases DNA-PK and ATM, and the subunits of the heat shock protein HSP90. However, HSP70 could not be determined as a target of (±) 25. The established library of the -acyl aminocarboxamides from the previous work was successfully enlarged by usage of the Ugi four component reaction and the derivatives (±) 38c g were obtained. The semi-quantitative Western blot analysis and quantitative ELISA-analysis were used as complementary readouts for the HSF1-dependent upregulation of HSP72 in the MM-INA-6 cell model (Chatterjee group). The ,-saturated carbonyl compounds (±) 38c and (±) 38g showed similar inhibitory activity as known derivatives with ,-unsaturated carbonyl moiety, e.g. (±) 37l or (±) 37m indicating that the Michael system and the related covalent binding to the target are unlikely. For the identification of the target of the -acyl aminocarboxamides affinity capturing experiment connected to quantitative mass spectrometry was performed (Schlosser group). The established synthesis method for preparation of biotinylated ligands was successfully applied to obtain three ligands (±) 42, (±) 44 and (±) 46. The derivatives (±) 42 und (±) 44 differ by a phenolic hydroxyl group and are linked at the same position to Biotin. The ligand (±) 46 was immobilised at a different molecule moiety to evaluate the binding effects to the target. The proteomic investigation with the ligands (±) 44 and (±) 46 allowed the identification of 68 significantly enriched proteins. Several captured proteins contain the so-called armadillo domain which is important for protein-protein interactions and exposes a highly conserved binding pocket. The significantly enriched proteins of both ligands were the MICOS-complex, the CCR4-NOT-complex and the kinases of the phosphatidylinositol-3-kinases signalling pathway, especially the kinases DNA-PK, ATM, ATR and mTOR. Further investigation of (±) 44 and (±) 46 revealed that the position of the linker affected the capturing results. While the ligand (±) 44 exclusively captured the proteins of the CCR4-NOT-complex, the proteins of the COG-complex only bound by the compound (±) 46. KW - Plasmozytom KW - Hitzeschocktranskriptionsfaktor KW - Hitzeschock-Proteine KW - Isochinolinderivate KW - Ugi-Reaktion KW - multiple muyloma KW - inhibition KW - heat shock response Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153477 ER - TY - THES A1 - Narkhede, Yogesh T1 - In silico structure-based optimisation of pyrrolidine carboxamides as Mycobacterium tuberculosis enoyl-ACP reductase inhibitors T1 - In silico Struktur-basierte Optimierung von Pyrrolidin-Carbonsäureamiden als Mycobacterium tuberculosis Enoyl-ACP-Reduktase-Inhibitoren N2 - The high infection rates and recent emergence of extremely drug resistant forms of Mycobacterium tuberculosis pose a significant challenge for global health. The NADH- dependent enoyl-ACP-reductase InhA of the type II mycobacterial fatty acid biosynthesis pathway is a well-validated target for inhibiting mycobacterial growth. InhA has been shown to be inhibited by a variety of compound series. Prominent classes of InhA inhibitors from literature include diaryl ethers, pyrrolidine carboxamides and arylamides which can be subjected to further development. Despite the progress in this area, very few compounds are in clinical development phase. The present work involves a detailed computational investigation of the binding modes and structure-based optimisation of pyrrolidine carboxamides as InhA inhibitors. With substituents of widely varying bulkiness, the pyrrolidine carboxamide dataset presented a challenge for prediction of binding mode as well as affinity. Using advanced docking protocols and in-house developed pose selection procedures, the binding modes of 44 compounds were predicted. The poses from docking were used in short molecular dynamics (MD) simulations to ascertain the dominant binding conformations for the bulkier members of the series. Subsequently, an activity-based classification strategy could be developed to circumvent the affinity prediction problems observed with this dataset. The prominent motions of the bound ligand and the active site residues were then ascertained using Essential Dynamics (ED). The information from ED and literature was subsequently used to design a total of 20 compounds that were subjected to extensive in-silico evaluations. Finally, the molecular determinants of rapid-reversible binding of pyrrolidine carboxamides were investigated using long MD simulations. N2 - Hohe Infektionsraten und das Auftreten von multiresistenten Formen von Mycobacterium tuberculosis stellen eine große Herausforderung f ̈ ur das globale Gesundsheitswesen dar. Die NADH-abh ̈angige Enoyl-ACP-Reduktase des mykobakteriellen Fetts ̈aure-Biosynthesewegs II, InhA, ist ein gut validiertes Target zur Hemmung des mykobakteriellen Wachstums. Es wurde gezeigt, dass InhA durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Verbindungs- klassen gehemmt wird. Zu den bekanntesten Klassen von InhA-Inhibitoren aus der Literatur geh ̈ oren Diphenylether, Pyrrolidincarboxamide und Arylamide, die zur weiteren Entwicklung verwendet werden k ̈onnen. Trotz der Fortschritte in diesem Bereich sind sehr wenige Verbindungen in einer klinischen Entwicklungsphase. Die vorliegende Arbeit beinhaltet eine detaillierte computergest ̈ utzte Untersuchung der Bindungsmodi und die strukturbasierte Optimierung von Pyrrolidincarboxamiden als InhA-Inhibitoren. Aufgrund von Substituenten mit stark variierendem Raumanspruch stellt der Pyrrolidin- carboxamid-Datensatz eine Herausforderung f ̈ ur die Vorhersage von Bindungsmodi und Affinitit ̈aten dar. Mit aufw ̈andigen Docking-Protokollen und speziell zu diesem Zweck entwickelten Posen-Auswahlverfahren wurden die Bindungsmodi f ̈ ur 44 Verbindungen vorhergesagt. Die Posen des Dockings wurden in kurzen Molekulardynamik (MD) Sim- ulationen verwendet, um die bevorzugten Bindungskonformationen f ̈ ur die r ̈ aumlich anspruchsvollen Vertreter des Datensatzes zu ermitteln. Anschließend konnte eine akt- ivit ̈atsbasierte Klassifizierungsstrategie entwickelt werden, um die in diesem Datensatz beobachteten Probleme in der Affinit ̈ atsvorhersage zu umgehen. Die wesentlichen Bewe- gungen des gebundenen Liganden und der Aminos ̈auren der Bindetasche wurden daraufhin mit Essential Dynamics (ED) ermittelt. Informationen aus der ED-Analyse und der Literatur wurden anschließend verwendet, um insgesamt 20 Verbindungen zu entwerfen, die umfangreichen in-silico-Bewertungen unterzogen wurden. Schließlich wurden die molekularen Determinanten der schnell-reversiblen Bindung von Pyrrolidincarboxamiden unter Verwendung von langen MD Simulationen untersucht. KW - Tuberkelbakterium KW - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase KW - Pyrrolidinderivate KW - Arzneimitteldesign KW - Computational drug design KW - Mycobacterium tuberculosis InhA KW - Pyrrolidine carboxamides KW - Mycobacterium tuberculosis KW - Structure-based KW - enoyl ACP reductase KW - pyrrolidine carboxamides Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152468 ER - TY - THES A1 - Kehrein, Josef T1 - Simulationsstudien zur ortsspezifischen Biokonjugation maßgeschneiderter Polymere T1 - Simulation Studies on the Site-Specific Bioconjugation of Polymers N2 - Polymer-Biokonjugationen, vornehmlich mit dem Goldstandard PEG, führen zu einer verbesserten Pharmakokinetik, beeinflussen aber auch die konformative Stabilität von Proteinen. Bisherige Mutationsstudien, in denen überwiegend (Asn)PEG4 -Konjugate der Beta-faltblattstrukturreichen, humanen Pin 1 WW-Domäne untersucht wurden, postulieren auf einer Proteindesolvatation beruhende Stabilisierungsmechanismen: eine Stärkung intramolekularer Salzbrücken und NH-pi-Bindungen, sowie entropisch günstige Wasserverdrängungen um apolare Aminosäuren und Hydroxylgruppen. Ziel dieser Arbeit ist es, die Protein-Polymer-Dynamik auf molekularer Ebene zu charakterisieren, um damit rationale Ansätze zum Design neuer Biokonjugate voranzutreiben und mögliche PEG-Alternativen zu etablieren. Hierzu wurde eine Vielzahl an Deskriptoren mittels Molekulardynamik-Simulationen der WW-Konjugate gewonnen und mit publizierten Stabilitätsdaten in multivariaten Regressions- und logistischen Klassifikationsmodellen korreliert. Die gewonnenen QSPR-Modelle decken im Vergleich zu einer bereits publizierten, kristallstrukturbasierten Richtlinie einen größeren und strukturell vielfältigeren Datensatz an Konjugaten ab und zeigen gleichzeitig, auch für ein Konjugat der Src SH3-Domäne, eine deutlich verbesserte Leistung. Die Modelldeskriptoren beschreiben sowohl eine Modulation der Solvatation als auch Protein-Polymer-Interaktionen. Metadynamik-Simulationen zeigten zudem die Polymerdynamik während einer partiellen Proteinentfaltung auf. Mithilfe weiterer Simulationen von Konjugaten des alpha-helikalen Her2-Affibodys wurde die Dynamik von PEG und verschiedener Alternativen (LPG, PEtOx, PMeOx) systematisch studiert. PEG interagierte mit positiv geladenen Lysinen und Argininen in der Nähe hydrophober Aminosäuren. LPG zeigte zusätzliche Wechselwirkungen der Hydroxylgruppen mit Aspartaten und Glutamaten. POx-Polymere interagierten mit Phenylalaninen, Tyrosinen und über Carbonylgruppen mit HB-Donatoren. Größere Konjugate (10 - 50 kDa PEG/LPG/PEtOx) des antiviralen Biologikums Interferon-alpha2a wurden mittels gaußbeschleunigter MDs und einer CG-Simulation analysiert. Charakteristische Wechselwirkungspartner stimmten mit den Beobachtungen zu Oligomer-Konjugaten überein. In Einklang mit experimentellen Daten der Kooperationspartner zu den 10-kDa-Varianten deuteten zusätzliche Constrained-Network-Analysen, welche die Proteinflexibilität evaluieren, auf eine thermische Destabilisierung hin. Die Bioaktivität der untersuchten Konjugate wurde weiterhin erfolgreich mit den Gyrationsdurchmessern der modellierten Strukturen korreliert. N2 - Bioconjugation of polymers, mainly the gold standard PEG, can improve pharmakokinetic properties but also modulate conformational stability of proteins. Mutation studies on (Asn)PEG4 conjugates of the beta-sheet rich human Pin 1 WW domain suggest various desolvation effects playing a crucial role: strengthening of intramolecular salt-bridges and NH-pi bonds, as well as entropically favorable water expulsion around hydrophobic patches and hydroxyl groups. The goal of this study is to characterize protein-polymer dynamics on a molecular level to drive forward rational design of new bioconjugates and establish viable PEG alternatives. A variety of descriptors was calculated from molecular dynamics simulations of WW conjugates and correlated with published stability data generating multivariate regression and logistic classification models. Compared to a previously published crystal structure-based guideline, QSPR models covered a structurally more diverse and bigger dataset and showed significantly improved predictions, including for a conjugate of the Src SH3 domain. Model descriptors captured modulations of solvation as well as protein-polymer interactions. Metadynamics simulations depicted PEG dynamics upon partial protein unfolding. Combined with simulations for conjugates of the alpha-helical Her2 affibody, data was further used to systematically dissect the dynamics of PEG and its alternatives LPG, PEtOx and PMeOx. PEG interacted with lysines and arginines near hydrophobic patches. LPG additionally adressed aspartates and glutamates via its hydroxyl groups. POx variants interacted with phenylalanines, tyrosines, as well as hydrogen bond donors via carbonyl groups. Larger conjugates (10 - 50 kDa PEG/LPG/PEtOx) of antiviral biologic Interferon-alpha2a were analyzed via Gaussian accelerated MDs and an exemplary CG simulation. Interaction patterns agreed with observations for oligomer conjugates. In accordance with experimental data of collaboration partners for 10 kDa variants, constrained network analyses, assessing protein flexibility, suggested a thermal destabilization upon bioconjugation. Bioactivity of conjugates was further successfully correlated with diameters of gyration of modeled structures. KW - Konjugate KW - Polymere KW - Molekulardynamik KW - QSPR KW - Polymer-Biokonjugate KW - Molekulardynamik-Simulationen KW - QSPR-Modeling KW - Poly(ethylenglykol) KW - Poly(2-oxazolin) KW - Poly(glycerol) Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289589 ER - TY - THES A1 - Diebold, Mathias T1 - Virtuelles Screening und Entwicklung selektiver Liganden des Aurora-A – MYCN Komplexes und computergestützte Methoden zur Analyse und Design von PROTACs T1 - Virtual screening and development of selective ligands for the Aurora-A - MYCN complex and computational methods for analysis and design of PROTACs N2 - Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein. Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden synthetisiert. Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays. Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein. Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt. Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden. Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht. N2 - The association of the oncogenic transcription factor MYCN with the Ser/Thr kinase Aurora-A prevents its degradation via the ubiquitin proteasome system by preventing the SCF FbxW7 complex from binding. The kinase adopts an active conformation when bound to MYCN, enabling kinase activity without prior phosphorylation on Thr288 or the presence of an activator like TPX2, and therefore at inappropriate times during the cell cycle. As high levels of MYCN have been shown to drive cancers like neuroblastoma, disrupting the complex formation is thought to be a viable development strategy for chemotherapeutics. Several small-molecule inhibitors of Aurora-A, like Alisertib (MLN8237), are able to induce a conformational change in the kinase, preventing the formation of the protein – protein complex and therefore promoting MYCN degradation. However, since Aurora-A has important roles during mitosis targeting only the complex could be a more promising approach than the systemic inhibition of the kinase. This project aimed to identify small molecules which selectively bind at the Aurora-A – MYCN interface and can be further optimized to induce targeted degradation via a PROTAC approach. Virtual screenings and molecular dynamics simulations were performed to identify commercially available compounds which should bind to a pocket formed only when the two proteins come together. Of a first set of ten potential binders, four showed binding to the Aurora-A – MYCN complex but not the individual proteins in STD-NMR experiments. Two of these hit molecules contained the same scaffold and were used as a starting point for optimization towards more potent ligands. In a fragment-based fashion, the scaffold was grown to achieve better affinity in-silico and provide linkage points for functionalization such as the attachment of E3 ligase ligands to create PROTACs. Nine of these second-generation compounds were then synthesized. In order to obtain quantitative binding data a covalently linked Aurora-A – MYCN construct was designed. Its structural and functional validity was shown in STD-NMR and BLI experiments with known Aurora-A inhibitors and in NMR-based ATPase assays. In addition, a crystal structure of the construct was solved, validating the designed structure. Quantitative measurements with the synthesized compounds revealed a positive hit (HD19S) with a ten-fold higher affinity to the covalently linked AuroraA – MYCN as compared to Aurora-A alone. Additionally, effects of PROTACs designed to degrade Aurora-A were studied in-silico. Interactions between Aurora-A, the E3-ligase Cereblon and small molecules were modelled and successfully used to explain the differences in activities observed with different PROTACs. The most active PROTAC also showed a high selectivity for Aurora-A over Aurora-B, even though the recognition unit (Alisertib) can bind both family members. Through energetic analysis of molecular dynamics simulations of the ternary complexes, these differences could be explained. Optimizations for a more efficient degradation of Aurora-A by the PROTACs were examined by changing the recognition unit and improving linkers. KW - Arzneimitteldesign KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Vernetzung KW - Wirkstoffdesign KW - PROTAC KW - Proteolysis-Targeting-Chimera KW - Aurora-A KW - MYCN KW - Aurora-A-MYCN-Komplex Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317594 ER - TY - THES A1 - Kuhn, Maximilian T1 - Strukturbasiertes Design von MIP-Inhibitoren und computergestützte Selektivitätsuntersuchung gegenüber MIP- und humanen FKB-Proteinen T1 - Structure-based design of MIP-Inhibitors and computer-aided selectivity studies towards MIP and human FKB proteins N2 - Bakterielle und parasitäre MIP-Proteine stellen wichtige Virulenzfaktoren dar, deren Inhibition das Überleben der Erreger sowie deren Penetration in menschliche Zellen stark einschränken kann. In dieser Arbeit standen die MIP-Proteine von Burkholderia pseudomallei (Auslöser der Melioidose) und Legionella pneumophila (Legionärskrankheit) im Fokus. Außerdem wurde das MIP-Protein von Trypanosoma cruzi (Chagas-Krankheit) untersucht. Die strukturverwandten humanen FKB-Proteine FKBP12 und FKBP52 sind relevante „off-targets“, wie Experimente mit Knockout-Mäusen gezeigt haben. Ziel dieser Arbeit war die Verbesserung von bekannten MIP-Inhibitoren im Hinblick auf ihre Affinität und Selektivität für MIP-Proteine gegenüber den beiden genannten FKB-Proteinen bei gleichzeitig verbesserter Löslichkeit, mit Hilfe von in silico Methoden. Ausgangspunkt waren hierbei zwei von Dr. Christina Juli und Dr. Florian Seufert entwickelte Leitstrukturen, welche ein Pipecolinsäuregrundgerüst aufweisen. Diese Referenzliganden beinhalten einen 3,4,5-Trimethoxyphenylring (TMPR, vgl. Ref_t) bzw. einen Pyridinylring (Ref_p). Beim Vergleich von insgesamt 32 MIP- und FKB-Proteinen konnten in zwei Loop-Bereichen, welche 50er bzw. 80er Loop genannt werden, relevante Unterschiede in der Aminosäuresequenz identifiziert werden. Die Nummerierung bezieht sich stets auf FKBP12. Diese Unterschiede ließen sich zum Design von vergleichsweise selektiv an MIP-Proteine bindenden Molekülen nutzen. Der 50er Loop ist in nahezu allen MIP-Proteinen (jedoch nicht in BpsMIP) im Vergleich zu den FKB-Proteinen um zwei Aminosäuren verkürzt. Dadurch befindet sich das Proteinrückgrat von LpnMIP (Gln49) und TcrMIP (Arg49) näher am Zentrum der Bindetasche (definiert als Ile56, welches durch die Pipecolinsäureesterfunktion der Liganden adressiert wird). MD-Simulationen der beiden Apoproteine belegten, dass die geringere Distanz nicht durch Artefakte beim Modellieren der Strukturen bedingt ist. Aufbauend auf dieser Erkenntnis wurde gezeigt, dass der Pyridinylring von Ref_p eine Wasserstoffbrücke zu Gln49 ausbildet. Experimentell wurde dieser Befund durch eine entsprechende chemische Verschiebung der Aminosäure im NMR-Experiment von Dr. Kristian Schweimer bestätigt. Durch Überbrückung des Pipecolinsäurerings (Ligand 6bp) konnte die Wasserstoffbrücke in MD-Simulationen weiter stabilisiert werden. Durch Rechnungen zur Abschätzung der freien Bindungsenthalpien (mittels LIE und MM/GBSA) wurde eine erhöhte Affinität von 6bp im Vergleich zu Ref_p in LpnMIP ermittelt. Im Laufe der Arbeit wurde anhand von pIC50-Werten, welche von Dr. Mathias Weiwad bestimmt wurden, erkannt, dass Liganden mit Pyridinylring oftmals eine bessere Affinität in LpnMIP aufweisen als die entsprechenden Liganden mit TMPR. Durch MD Simulationen wurde nachgewiesen, dass der TMPR in LpnMIP nur schwer an der in den anderen Proteinen bevorzugten Position binden kann. Grund hierfür ist die Mutation einer Aminosäure (zu Pro57) in diesem Bereich von LpnMIP: Diese verfügt über eine wenig flexible Seiten-kette, an welche sich der TMPR auf Grund seiner Rigidität nicht anpassen kann, was die Interaktion zwischen Protein und Ligand stört. Der Pyridinylring von Ref_p ist hiervon nicht betroffen, da er bevorzugt an einer anderen Stelle (Gln49, s. o.) bindet. Der 80er Loop weist in vielen MIP-Proteinen deutlich hydrophobere Aminosäuren auf als in FKB-Proteinen. Von besonderem Interesse ist die Position 90, da hier in BpsMIP und LpnMIP sterisch weniger anspruchsvolle Aminosäuren (Val, Pro) vorliegen als in den bei-den FKB-Proteinen (Ile, Lys). Dieser Unterschied wurde mit kleinen hydrophoben Substituenten am Phenylring der Liganden adressiert. Bereits im Docking zeigten sich die positiven Effekte der para-Substitution durch Halogenatome oder eine Methylgruppe. Die von Dr. Mathias Weiwad und Dr. Mirella Vivoli ermittelten pIC50- bzw. pKi-Werte bestätigten diesen Trend. Zugleich nahm die Affinität zu FKBP12 deutlich ab. Bei der Untersuchung der Referenzliganden sowie deren Chlor- und Bromderivate in MD-Simulationen zeigte sich, dass der Phenylring der Liganden in den MIP-Proteinen bevorzugt in Richtung des 80er Loops orientiert ist; in den FKB-Proteinen liegt er hingegen um etwa 110° gedreht vor und kann somit schlechter mit der Bindetasche interagieren. Besonders ausgeprägt ist dieser Effekt in FKBP12. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der Phenylring durch einen 4-Bromo-1H-imidazol-2-ylsubstituenten ersetzt (Ligand 8ap). Dieser ist in der Lage, in der erwarteten Orientierung im Bereich des 80er Loops von BpsMIP zu binden und gleichzeitig eine stabile Wasserstoffbrücke zu Asp37 auszubilden. Hieraus resultiert für den Liganden eine deutlich höhere Affinität in LIE- und MM/GBSA-Rechnungen; in FKBP12 blieb sie auf Grund der dort instabilen Interaktion unverändert. Die berechneten Energien können unmittelbar für einen relativen Vergleich verschiedener Liganden in einer Bindetasche verwendet werden. Für die Vorhersage von pKi- bzw. pIC50-Werten in den verschiedenen Proteinen ist eine Kalibrierung gegen die gemessenen Affinitäten erforderlich. Dies wurde für BpsMIP durchgeführt, indem eine lineare Korrelation zwischen den pKi- bzw. pIC50-Werten und den mit MM/GBSA ermittelten Energien aufgestellt wurde. Für LIE wurde auf publizierte Werte von Lamb et al. zurückgegriffen. Die berechneten Affinitäten stimmen für die bereits getesteten Inhibitoren gut mit den experimentellen pKi- und pIC50-Werten überein. Anhand der Modelle werden für 8ap Werte vorhergesagt, die besser als die experimentellen Affinitäten bekannter Liganden sind. Idealerweise können auch aus den Scores, die durch Docking erhalten werden, bereits Rückschlüsse auf die Affinitäten der Liganden gezogen werden. Für die untersuchten Proteine war dies, auf Grund des engen Bereichs der experimentell ermittelten pKi- und pIC50-Werte, nicht mit hinreichender Richtigkeit möglich. Um die Scores dennoch für die Beurteilung neuer Liganden verwenden zu können, wurden logistische Regressionsmodelle erstellt. Anhand dieser kann abgeschätzt werden, ob ein Molekül in BpsMIP submikromolare Affinität aufweist. Die Richtigkeit dieser Vorhersagemodelle konnte durch die Berücksichtigung dreier weiterer Deskriptoren (Konfiguration am Stereozentrum der Pipecolinsäure, Molekulargewicht und logD-Wert) deutlich verbessert werden, wobei die AUC der entsprechenden ROC-Kurven Werte bis zu 0.9 erreichte. Diese Modelle können für die Postprozessierung eines Dockings angewendet werden, um die vielversprechendsten Kandidaten zu identifizieren und anschließend in rechnerisch anspruchsvolleren MD-Simulationen genauer zu untersuchen. Mit dieser Arbeit wurde zur Weiterentwicklung der Leitstrukturen Ref_t und Ref_p beigetragen. Viele der getesteten Derivate wiesen deutlich verbesserte Löslichkeit bei gleichbleibender Affinität auf. Ferner wurden erstmalig detailliert die Unterschiede in den Bindetaschen zwischen 32 MIP- und FKB-Proteinen evaluiert. Hiervon wurden fünf in MD-Simulationen als Apoprotein und im Komplex mit verschiedenen Inhibitoren verglichen. Anhand dieser Simulationen wurde nachgewiesen, dass jeweils eine Aminosäure in BpsMIP und LpnMIP im Vergleich zum wichtigsten „off-target“ FKBP12 selektiv durch eine Wasserstoffbrücke adressiert werden kann. Durch LIE- und MM/GBSA-Rechnungen konnte gezeigt werden, dass in diesen hochkonservierten Bindetaschen eine bedeutende Modulation der Affinität zugunsten von BpsMIP möglich ist. N2 - Bacterial and parasitic MIP proteins constitute important virulence factors. Inhibiting these proteins can considerably reduce the survival of the pathogens as well as their penetration into human host cells. The work presented in this thesis focused on the MIP proteins of Burkholderia pseudomallei (the causative agent of melioidosis) and Legionella pneumophila (Legionnaires’ disease). Furthermore, the MIP protein of Trypanosoma cruzi (Chagas disease) was also investigated. The structurally homologous human FKB proteins FKBP12 and FKBP52 were taken into account as relevant off-targets. The aim of this thesis was to improve MIP inhibitors by means of in silico methods with respect to affinity and selectivity (for MIP proteins over FKBP12 and FKBP52) as well as solubility. The starting point for this task were two lead structures with a pipecolic acid scaffold from the work of Dr. Christina Juli and Dr. Florian Seufert. These reference ligands contain a 3,4,5-trimethoxyphenyl ring (TMPR, cf. Ref_t) or a pyridinyl ring (Ref_p). By comparison of 32 MIP and FKB proteins major differences with regard to the amino acid sequence could be identified in two loop regions, the so called 50s and 80s loop (numbering always with respect to FKBP12). It was possible to utilise these differences for the design of molecules with preferential binding to MIP proteins. The 50s loop is truncated by two amino acids in nearly all MIP proteins compared to the FKB proteins, except for BpsMIP. Thus, the protein backbone of LpnMIP (Gln49) and TcrMIP (Arg49) is located closer to the centre of the binding pocket. The centre is defined as Ile56, which is binding to the pipecolic ester function of the ligands. MD simulations of both apoproteins proved that the smaller distance is not caused by artefacts introduced during modelling of the structures. Expanding on this knowledge, it could be shown that the pyridinyl ring of Ref_p forms a hydrogen bond to Gln49. This finding was proven ex-perimentally by a corresponding chemical shift of the amino acid in an NMR experiment conducted by Dr. Kristian Schweimer. The hydrogen bond was stabilised further in MD simulations via bridging of the pipecolic acid ring (ligand 6bp). Calculations by MM/GBSA and LIE, estimating the binding free energies of the ligands, yielded im-proved affinity for 6bp compared to Ref_p in LpnMIP. It was noted in the course of this work, based on pIC50 measurements conducted by Dr. Mathias Weiwad, that ligands containing a pyridinyl ring often exhibit better affinity in LpnMIP than their corresponding counterparts with a TMPR. It could be shown with MD simulations that the TMPR is barely able to bind to LpnMIP at the position preferred in the other proteins. This is caused by mutation of an amino acid (to Pro57) in this region of LpnMIP. Due to its rigidity, the TMPR is not able to adjust to the hardly flexible side chain of proline. Consequently, the interaction between protein and ligand is disrupted. The pyridinyl ring of Ref_p is not affected by this mutation since it binds at another position (Gln49, see above). The 80s loop contains more hydrophobic amino acids in MIP proteins than in FKB proteins. Position 90 is of particular interest, as there are sterically less demanding amino acids in BpsMIP and LpnMIP (Val, Pro) than in both FKB proteins (Ile, Lys). This difference was addressed with small hydrophobic substituents at the ligands’ phenyl ring. The favourable effects of the substitution in para-position by halogen atoms or a methyl group could be observed in initial docking experiments. pIC50 and pKi values measured by Dr. Mathias Weiwad und Dr. Mirella Vivoli confirmed this trend. Furthermore, the affinity for FKBP12 clearly decreased. MD simulations of both reference ligands as well as their derivatives substituted with chlorine or bromine showed that the phenyl ring preferentially adopts a conformation pointing towards the 80s loop in MIP proteins. In contrast, the phenyl ring is rotated by approximately 110° in FKB proteins, leading to decreased interactions with the binding pocket. This effect is especially pronounced in FKBP12. Based on these results, the phenyl ring was substituted by 4-Bromo-1H-imidazol-2-yl (ligand 8ap). A ligand containing this substituent can bind next to the 80s loop of BpsMIP maintaining the previously described orientation and simultaneously form a stable hydrogen bond to Asp37. Hence, a considerably higher binding affinity of this ligand to BpsMIP was predicted via LIE and MM/GBSA calculations. There were no changes in affinity for FKBP12 due to the instable interaction in this protein. The calculated energies can directly be used to rank different ligands in a binding pocket. In order to predict pIC50 and pKi values in different proteins, these energies require calibration versus experimentally measured affinities. Such a calibration was carried out for BpsMIP by linearly correlating pIC50 and pKi values with energies gained from MM/GBSA calculations. For the LIE method, parameters published by Lamb et al. were used. Both computational approaches yielded affinities in good agreement with experimentally measured pIC50 and pKi values of known ligands. The affinities predicted by these models for 8ap are better than the inhibition constants of all currently known inhibitors. Ideally, scores obtained by docking can directly be used to gain insights into the ligands’ affinities. However, sufficient accuracy for the proteins investigated could not be gained, due to the narrow range of the experimental pIC50 and pKi values. Consequently, logistic regression models were created to allow for assessment of the ligands based on their score. These models predict whether a ligand is likely to show submicromolar affinity in BpsMIP. The accuracy of these models was considerably increased by implementing three other descriptors (configuration at the stereo centre of the pipecolic acid, molecular weight and logD value). Thus, AUCs up to 0.9 could be achieved in the corresponding ROC curves. The models can be used for postprocessing a docking calculation in order to identify the most promising ligands and subsequently investigating them with computationally more demanding MD simulations. This work contributed to the improvement of the lead structures Ref_t and Ref_p. Many of the tested derivatives exhibited increased solubility while affinity was maintained. Furthermore, differences in the binding pockets of 32 MIP and FKB proteins were evaluated in detail for the first time. Five of these proteins were compared in MD simulations, both as apoproteins as well as complexed with different inhibitors. It was proven by these simulations that one amino acid in BpsMIP as well as in LpnMIP can selectively be addressed with a hydrogen bond. These interactions cannot be formed in the most prominent off-target FKBP12. LIE and MM/GBSA calculations proved that considerable modulation of the binding affinity towards BpsMIP is possible in these highly conserved binding pockets. KW - Computational chemistry KW - Macrophage Infectivity Potentiator Protein KW - Arzneimitteldesign KW - MIP protein KW - FKBP KW - docking KW - MD simulation KW - Burkholderia pseudomallei KW - Legionella pneumophila KW - Trypanosoma cruzi KW - Drug design KW - molecular dynamics Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-165757 ER - TY - THES A1 - Bach, Matthias T1 - Massenspektrometrische Analyse der Interaktionen von Protein mit Proteinen und Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen T1 - Protein-protein and small molecule-protein interaction analyzed by mass spectrometry N2 - Proteine können aufgrund ihrer biochemischen Vielfalt eine Vielzahl von Interaktionen mit anderen Proteinen oder chemischen Verbindungen eingehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Protein-Protein Interaktionen mittels chemischen Quervernetzens untersucht. Das Ziel war, neue und verbesserte Methoden zu entwickeln, um Interaktionsnetzwerke zu erstellen. Im zweiten Teil wurden die Interaktionen von Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen untersucht, um Drug Targets zu identifizieren und zu validieren. Die Untersuchung von Protein-Protein Interaktionen mittels Massenspektrometrie (MS) ist eine leistungsfähige Methode, um alle potentiellen Interaktionen eines Proteins nach einer Anreicherung (Co-IP) aus einem Zelllysat zu detektieren. Durch das zusätzliche Quervernetzen dieser Proteine und anschließender MS kann ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden, um direkte von indirekten Interaktionen unterscheiden zu können (Topology Mapping). Zur Methodenetablierung wurden kommerzielle Crosslinker und rekombinante Proteine von bekannten Interaktionspartnern mit niedriger Komplexität verwendet. Die beiden Interaktionspartner NPL4 und UFD1 konnten mit dem Crosslinker BS3 erfolgreich quervernetzt und anhand der vernetzten Peptide identifiziert werden. Im nächsten Schritt wurde dieser Arbeitsablauf auf eine Co-IP des Mediatorkomplexes aus Hefe angewendet. Die Probenkomplexität ist hierbei 500 - 1000-fach höher als bei der Verwendung von rekombinanten Proteinen. Nach der erfolgreichen Quervernetzung konnte innerhalb des Komplexes ein Interaktionsnetzwerk erstellt werden. Diese Daten passen zu dem bereits bekannten Modell des Mediatorkomplexes. Interaktionen zu bekannten Interaktionspartnern, wie der RNA-Pol II, konnten aufgrund deren substöchiometrischen Anreicherung nicht identifiziert werden. Aufgrund der genannten Limitationen beim Quervernetzen von Proteinen wurden folgende neue und verbesserte Methoden entwickelt: 1. Verwendung des spaltbaren Crosslinkers (DSSO), der während der Messung selektiv durch niedrige Kollisionsenergie gespalten werden kann, um die Datenbanksuche zu vereinfachen. Die Funktionalität der DSSO-Strategie konnte erfolgreich am Protein Cytochrom C getestet werden. Bei der ersten Fragmentierung wird der Linker gespalten, anschließend können die getrennten Peptide separat fragmentiert werden. Die erzeugten Daten sind mit einer Standarddatenbanksuche kompatibel, was bei gemischten Spektren von zwei Peptiden nicht der Fall wäre. Beim Quervernetzen der rekombinanten Interaktionspartner UBX und p97N mit DSSO konnte der zu bestätigende Crosslink zwischen zwei Lysinen nicht identifziert werden. Grund hierfür könnte eine zu kurze Linkerlänge von DSSO sein. Diese Versuche brachten jedoch einige Limitationen des Ansatzes zum Vorschein, wie die Beschränkung auf die Protease Trypsin, aufgrund der positiven Ladung am C-Terminus und die Notwendigkeit von großen Proteinmengen, da das Spalten des Linkers einen zusätzlichen Intensitätsverlust für die folgende Identifizierung der Peptide mit sich bringt. 2. Da die niedrige Abundanz von quervernetzten Peptiden das Hauptproblem bei deren Identifizierung ist, wurde eine Methode entwickelt, um während der Messung direkt nach diesen niedrig abundanten Spezies zu suchen. Entscheidendes Kriterium hierfür war, dass quervernetzte Peptide zwei C-Termini haben. Diese wurden zur Hälfte enzymatisch mit 18O bzw. 16O markiert und wieder vereinigt. Der resultierende Massenunterschied von 8 Da (4 x 18O) kommt ausschließlich bei zwei quervernetzten Peptiden vor und kann während der Messung direkt gesucht werden. Die vollständige Markierung von Peptiden mit 18O wurde zunächst am Protein Beta-Galaktosidase getestet. Bereits hier stellte sich heraus, dass der enzymatische Rücktausch von 18O zu 16O ein Problem darstellt und die Markierungseffizienz von Aminosäuren beeinflusst wird, die sich C-terminal nach der Spaltstelle befinden. Mit dieser Strategie ließ sich somit keine vollständige Markierung für alle Peptide erreichen, was für diese Strategie essentiell gewesen wäre. 3. Um alle Probleme zu umgehen, die bei der Identifizierung von quervernetzten Peptiden auftreten, wurde eine Methode entwickelt, um quervernetzte Proteine anhand von Profilen nach einer Auftrennung im Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) zu identifizieren. Durch das Quervernetzen von Proteinen entstehen zusätzliche Proteinbanden nach einer SDSPAGE, die im Gel nach oben verschoben sind. Alle Proteine in diesen neu erzeugten Bereichen stellen somit potentielle Interaktionspartner dar. Als Modellsystem wurde der Mediatorkomplex verwendet. Er wurde aus einem Zelllysat mittels Co-IP angereichert und anschließend quervernetzt. Aus den mittels LC-MS/MS gemessenen Gelfraktionen wurden Proteinprofile erstellt und miteinander verglichen. Die Intensitätsmaxima der Proteine des Mediatorkomplexes konnten in bestimmten zusätzlichen Fraktionen gefunden werden, was den indirekten Nachweis für eine Interaktion darstellt. Die Funktionalität der Strategie konnte somit bestätigt werden. Ein verbleibender Nachteil ist jedoch die zu geringe Trennleistung von Polyacrylamidgelen. Befinden sich mehr als 50 Proteine in einer Fraktion, können potentielle Interaktionspartner nicht eindeutig zu einer Untereinheit eines Komplexes zugeordnet werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216 (CRU216) Interaktionen von Proteinen mit verschiedenen niedermolekularen Verbindungen massenspektrometrisch untersucht, um potentielle Drug Targets zu identifizieren. Diese Versuche sind vergleichbar mit Co-IP Experimenten, da sich der Arbeitsablauf nur durch die Anreicherung mittels chemischer Verbindung unterscheidet. Hierzu wurden biotinylierte Verbindungen immobilisiert und potentielle Drug Targets aus einem komplexen Zelllysat angereichert. Die Identifzierung der echten Bindungspartner wurde über quantitive Massenspektrometrie erreicht. Dabei wurden die angereicherten Proteine, die an die niedermolekularen Substanzen binden mit einer geeigneten Kontrollanreicherung verglichen. Mit den getesteten α-acyl Aminocarboxamiden konnten verschiedene Proteinkomplexe und interagierende Proteine spezifisch angereichert werden. Hierbei waren die vier Kinasen DNA-PK, ATM, ATR und mTOR besonders interessant, da sie mit onkogenem Signalling und Überlebensmechanismen wie der Hitzeschockantwort in Zellen des Multiplen Myeloms (MM) in Verbidnung stehen. Die Inhibition der DNA-PK, ATM, ATR und mTOR mit α- acyl Aminocarboxamiden stellt somit einen möglichen Therapieansatz dar, wenn er zusammen mit hitzestressauslösenden Inhibitoren verwendet wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Armadillodomäne innerhalb der potentiellen Drug targets signifkant angereichert wurde. Sie stellt damit eine potentielle Bindestelle der α-acyl Aminocarboxamide dar. Abschließend wurden Proteine mit biotinylierten Naphtylisochinolinen aus einem MMZelllysat angereichert, deren Vorläufersubstanzen eine Wirkung auf Tumorzellen und den Malariaparasit Plasmodium falciparum gezeigt hatten. Hierbei konnten vor allem RNAbindende- und mRNA-Splicing Proteine identifiziert werden, die zum Teil essentiell für das Spleißen in-vivo sind. Hierzu gehören mehrere Untereinheiten der Splicing Factoren 3A und 3B. Die Veränderung der transkriptionellen Regulation und der resultierende Effekt auf Krebszellen konnte bereits in anderen Studien mit dem Inhibitor Spliceostatin A gezeigt werden, der das Spleißen beeinflusst. N2 - Based on the huge biochemical variety of proteins they can interact in many different ways with other proteins or small molecules. The first part of this work is about protein-Protein interactions which were investigated with chemical crosslinking. The aim of this work was the development of new and improved methods for the construction of interaction networks. The second part is about protein-small molecule interactions to identify new drug targets with subsequent validation. Mass spectrometry (MS) is a powerful tool to investigate all protein-protein interactions after enrichment from a cell lysate (Co-IP). By adding crosslinking to Co-IP experiments it is possible to create a topology map which is important to differenciate between direct and indirect interactions. To validate the crosslinking procedure, a commercial available crosslinker and recombinant proteins of known interaction partners with low sample complexity were used. The interaction partners NPL4 and UFD1 were successfully crosslinked with BS3 and crosslinked peptides were identified with MS. Next step was to apply this workflow on the Co-IP of the yeast mediator complex. Here the sample complexity is 500 to 1000 times higher than with recombinant proteins. After successfully crosslinking, a topology map of the subunits of the mediator complex was created. The result matches the latest model of the complex. Crosslinks to known interation partners, like the RNA-Pol II, were not identified because of their substoichiometric enrichment. Because of the known limitations of protein crosslinking, new and improved methods were developed: 1. Application of the MS-cleavable crosslinker DSSO, which could be cleaved with low collision energy, to improve the database search of crosslinked peptides. Proof of concept was done by crosslinking Cytochrom C. In the first fragmentation step only DSSO is cleaved. Fragmentation of the separated peptides is done in the next step with higher energy. Peptid fragments are compatible with a standard database search. The application of this method on the interacting proteins UBX and p97N failed because the predicted crosslink could not be identified. This could be due to the lack of linker length of DSSO. But more important, this experiment revealed the drawbacks of the DSSO approach. Trypsin is needed because this leads to a positive charge on the C-Terminus. Furthermore large amounts of protein are required to reach the needed intensity for all fragmentation steps. 2. Since the low abundancy of crosslinked peptides is the main issue for their identification, a new method was developed to directly search for them during the MS measurement. The defining criterion for this search was the occurrence of two C-termini in crosslinked peptides. Samples were splitted, labeled with 18O or 16O, and mixed again to generate a mass shift of 8 Da which is unique for crosslinked peptides. This mass shift can be used to directly search for these peptides during the measurement. Proof of concept was tested by labeling beta-galactosidase. Complete labeling could not be reached because of enzymatic back-exchange from 18O with 16O. Furthermore the neighbouring amino acids at the C-termini influence the labeling efficiency. Due to the incomplete labeling, the method could not be used for identifying crosslinked peptides. 3. To circumvent all problems which occur with the identification of crosslinked peptides, another method was developed to identifiy crosslinked proteins by their mass shift after separation on a polyacrylamide gel (SDS-PAGE). By crosslinking proteins additional protein bands are generated which appear in the upper part of the gel. All proteins in this region are potential interation partners. Proof of concept was done by enrichment (Co-IP) of the yeast mediator complex from a cell lysate with subsequent crosslinking. From the LC-MS/MS data, profiles for every protein of the complex were generated. The additionally generated crosslink intensity peaks of interacting subunits overlapped with each other, which is the indirect proof of the functionality of this approach. The main problem with this strategy is the low separation performance. When about 50 proteins are located in one fraction, it is not possible to unambiguously match a protein to a specific subunit of the protein complex. In the second part of this work, the interactions of proteins with small molecules were investigated by mass spectrometry, to identify potential drug targets. Biotinylated versions of active compounds were immobilized to magnetic streptavidin beads and incubated with INA6 cell lysate. By quantitiative analysis of proteins, which bind to the control beads and proteins, which bind to the inhibitor beads, potential drug targets were identified. With the used α-acyl aminocarboxamides several protein complexes and interacting proteins were specifically enriched. These included the four kinases DNA-PK, ATM, ATR and mTOR, which are involved in oncogenic signaling and survival mechanisms. Moreover it is known, that the DNA-PK interacts with HSF1 and therefore regulates the HSF1-mediated heat shock response. The inhibition of DNA-PK, ATM, ATR and mTOR with α-acyl aminocarboxamides is a new therapeutic opportunity when it is combined with other substances which trigger the heat shock response. A potential binding site of the α-acyl aminocarboxamides is the armadillo domain, because it was significantly enriched among the potential drug targets. Several naphtylisochinolines were also biotinylated, immobilized and incubated with INA6 cell lysate. Precursors of these substances showed activity against multiple myeloma cells and the malaria pathogen Plasmodium falciparum. Here we could enrich proteins which are associated with RNA-binding and mRNA splicing, including several subunits of the splicing factors 3A and 3B, which are essential for splicing. The change of the transcriptional regulation and the resulting effect on cancer cells by influencing mRNA splicing is already known and was shown by other inhibitors like Spliceostatin A. KW - Massenspektrometrie KW - Proteininteraktionen KW - Molekulare Zielstrukturen KW - Proteinquervernetzungen KW - Methodenentwicklung KW - Mass spectrometry KW - Protein interactions KW - Drug targets KW - Protein crosslinking KW - Method development Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-160462 ER - TY - THES A1 - Ferraro, Antonio T1 - Entwicklung potenzieller (ir-)reversibler Inhibitoren der Enoyl-ACP-Reduktase FabI in S. aureus/ E. coli und der Thiolase FadA5 in M. tuberculosis T1 - Development of potential irreversible/reversible inhibitors of the enoyl-ACP reductase FabI in S. aureus/ E. coli and of the thiolase FadA5 in M. tuberculosis N2 - Antimikrobielle Resistenzen stellen eine weltweite Herausforderung dar und sind mit einer hohen Morbidität und Mortalität verbunden. Die Letalitätsrate durch multiresistente Keime steigt stetig an, weshalb die WHO im Jahr 2017 eine Prioritätenliste resistenter Keime erstellte, die die Entwicklung neuer Antibiotika vorantreiben soll. Diese umfasst vornehmlich gramnegative Bakterien, da diese aufgrund ihres Zellaufbaus sowie diverser Resistenzmechanismen besonders widerstandsfähig gegenüber dem Angriff vieler Antibiotika sind. Einige grampositive Keime (z.B. S. aureus) stehen ebenfalls auf dieser Liste und stellen eine große Herausforderung für die Medizin dar. Infolgedessen ist die Entwicklung neuer Antiinfektiva mit neuen Angriffspunkten gegen resistente Pathogene zwingend nötig, um mit bisherigen Resistenzen umgehen zu können. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Synthese von kovalent (reversibel) bindenden Inhibitoren der Enoyl-ACP-Reduktase FabI (Staphylococcus aureus, Escherichia coli) und der Thiolase FadA5 (Mycobacterium tuberculosis). Beide Enzyme sind essenziell für das Überleben des jeweiligen Bakteriums. FabI ist ein wichtiges und geschwindigkeitsbestimmendes Schlüsselenzym der Fettsäuresynthese Typ II diverser Bakterien. Hierbei werden wichtige Phospholipide hergestellt, die für den Aufbau der Zellmembran nötig sind. Schiebel et al. ist es gelungen, einen potenten Inhibitor für den Erreger S. aureus sowie E. coli zu entwickeln und zu charakterisieren. Ausgehend von dieser Verbindung wurde eine Substanzbibliothek mit verschiedenen „warheads“ hergestellt. Hierbei wurde die Verknüpfung zwischen dem Pyridon-Grundgerüst und der elektrophilen Gruppe sowie die über den Ether verknüpften aromatischen Ringsysteme variiert. Diese Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer inhibitorischen Aktivität am jeweiligen Enzym getestet. Anschließend wurde von Verbindung 32 und 33, die jeweils eine gute Inhibition des Enzyms aufweisen, der IC50-Wert gemessen. Beide Verbindungen weisen eine 50-prozentige Reduktion der Enzymaktivität im mittleren nanomolaren Bereich auf. Zusätzlich wurde Verbindung 32 in einem sogenannten „jump-dilution“-Assay auf kovalente Inhibition getestet. Durch dieses Experiment konnte eine kovalente Inhibition des Enzyms ausgeschlossen werden. Die Reaktivität der eingesetzten „warheads“ wurde gegenüber einem Tripeptid mittels eines LC/MS-Iontrap-Systems bestimmt. Die untersuchten Verbindungen zeigten keine signifikante Reaktion mit der im Tripeptid eingebauten nukleophilen Aminosäure Tyrosin, deren Nukleophilie bei dem pH-Wert des Tests (pH = 8.2 und 10.8) nicht hoch genug ist. Um einen Einblick in den Bindemodus der Verbindungen zu erhalten, wurden ferner Kristallisationsversuche durchgeführt. Die erhaltenen Kristallstrukturen zeigen, dass die Verbindungen mit dem gewünschten Bindemodus am Zielenzym binden, aber eine kovalente Modifizierung des Tyrosins146 durch die eingesetzten „warheads“ aufgrund der großen Entfernung (6 Å zwischen elektrophiler Gruppe und Tyrosin146), unwahrscheinlich ist. Zusätzlich wurden die physikochemischen Eigenschaften (Stabilität, Wasserlöslichkeit und logP) der Verbindung 32 sowie Verbindung 33 charakterisiert. M. tuberculosis ist der Erreger der global verbreiteten Infektionskrankheit Tuberkulose (TB), die zu den zehn häufigsten Todesursachen weltweit gehört. Das Bakterium kann das im menschlichen Körper vorkommende Cholesterol metabolisieren und nutzt dessen Abbauprodukte als wichtige Kohlenstoffquelle. Die Thiolase FadA5 ist bei diesem Abbau ein wichtiges Enzym und konnte als potenzielles innovatives Target für neue Antibiotika definiert werden. Durch Dockingstudien konnten zwei potenzielle Leitstrukturen als Inhibitoren der Thiolase FadA5 identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die vorgeschlagenen Strukturen mit dem gewünschten „warhead“ synthetisiert und hinsichtlich ihrer inhibitorischen Aktivität gegenüber dem Enzym untersucht. Die Zielverbindungen zeigen keine signifikante Hemmung sowie kovalente Bindung über die eingesetzten „warheads“ an die Thiolase FadA5. N2 - Antimicrobial resistance poses a global challenge and is associated with high morbidity and mortality. The case fatality rate of infections caused by multidrug-resistant pathogens continues to be on the rise, causing the WHO to compile a priority pathogens list that is supposed to advance the development of new antimicrobial compounds. The list is mainly comprised of gramnegative bacteria, since these are especially resilient to many antibiotics. This is due to their cellular structure and various mechanisms of resistance. Some grampositive bacteria are also a danger to public health and are therefore part of this list. Consequently, there is an urgent need for the development of new antiinfectives with novel modes of action, so that the current resistance situation can be adequately addressed. This work is concerned with the development and synthesis of covalent reversible inhibitors of the enoyl-ACP reductase FabI (Staphylococcus aureus, Escherichia Coli) and the thiolase FadA5 (Mycobacterium tuberculosis). Both enzymes are critically important for the survival of the respective bacteria. FabI is an essential and rate determining enzyme of the type II fatty acid synthesis of various bacteria. A number of important phospholipids required for the cell membrane are biosynthesized via this metabolic pathway. Schiebel et al. were able to develop and characterize a potent inhibitor for S. aureus and E. Coli. Using this compound as a starting point, a library of compounds carrying various “warheads” was synthesized. Further structural variations were introduced by using different linkers between the pyridone scaffold and the electrophilic group as well as diverse aromatic rings connected via the ether bridge. These compounds were assayed concerning their inhibitory activity at the respective enzyme. Of these, substances 32 and 33 showed good inhibition of the enzyme, prompting the determination of the IC50 values. The two substances were able to reduce enzymatic activity by 50% at nanomolar concentration levels. In addition, substance 32 was characterized concerning its ability to covalently inhibit its molecular target by means of the so-called jump dilution assay. This experiment showed no covalent inhibition of the target enzyme. The individual reactivity of the warhead moieties present in the library was determined against a synthetic tripeptide by using a LC/MS iontrap system. All the examined compounds showed no reaction with the nucleophilic amino acid tyrosine contained in the tripeptide at significant levels, which indicates that its nucleophilicity is insufficient at the pH of the assay (pH = 8,2 and 10,8, respectively). Crystallization experiments were conducted to ascertain the binding mode of the compounds. The crystal structures showed the substances binding to the enzyme in the desired pose, yet a covalent modification of tyrosine146 remains unlikely due to the large distance (6 Å) between the electrophilic moiety and the amino acid. Additionally, some physicochemical properties (Stability, aqueous solubility and logP) of compounds 32 and 33 were characterized. M. tuberculosis is the causative pathogen of the globally occurring infectious disease tuberculosis, which belongs to the 10 most frequently occurring causes of death worldwide. The germ is able to metabolize the cholesterol present in the human body and uses its degradation products as an important carbon source. The thiolase FadA5 is involved in this metabolic pathway and was identified as a potentially innovative target for novel antibiotics. Docking studies enabled the identification of two potential lead structures for inhibitors of FadA5. In this work, the proposed structures carrying the desired warheads were synthesized and characterized concerning their inhibitory activity at the target enzyme. The target compounds showed no significant inhibition or covalent binding to FadA5. KW - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase KW - Enoyl-ACP-Reduktase KW - Thiolase KW - FadA5 KW - M. tuberculosis KW - FabI KW - Acyltransferasen KW - Inhibitor Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238392 ER - TY - THES A1 - He, Feng T1 - Drug Discovery based on Oxidative Stress and HDAC6 for Treatment of Neurodegenerative Diseases T1 - Arzneimittelforschung basierend auf oxidativem Stress und HDAC6 zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen N2 - Most antioxidants reported so far only achieved limited success in AD clinical trials. Growing evidences suggest that merely targeting oxidative stress will not be sufficient to fight AD. While multi-target directed ligands could synergistically modulate different steps in the neurodegenerative process, offering a promising potential for treatment of this complex disease. Fifteen target compounds have been designed by merging melatonin and ferulic acid into the cap group of a tertiary amide HDAC6 inhibitor. Compound 10b was screened as the best hybrid molecule exhibit potent HDAC6 inhibition and potent antioxidant capacity. Compound 10b also alleviated LPS-induced microglia inflammation and led to a switch from neurotoxic M1 to the neuroprotective M2 microglial phenotype. Moreover, compound 10b show pronounced attenuation of spatial working memory and long-term memory damage in an in vivo AD mouse model. Compound 10b can be a potentially effective drug candidate for treatment of AD and its druggability worth to be further studied. We have designed ten novel neuroprotectants by hybridizing with several common antioxidants, including ferulic acid, melatonin, lipoic acid, and trolox. The trolox hybrid compound exhibited the most potent neuroprotective effects in multiple neuroprotection assays. Besides, we identified the synergistic effects between trolox and vitamin K derivative, and our trolox hybrid compound showed comparable neuroprotection with the mixture of trolox and vitamin K derivative. We have designed and synthesized 24 quinone derivatives based on five kinds of different quinones including ubiquinone, 2,3,5-trimethyl-1,4-benzoquinone, memoquin, thymoquinone, and anthraquinone. Trimethylbenzoquinone and thymoquinone derivatives showed more potent neuroprotection than other quinones in oxytosis assay. Therefore, trimethylbenzoquinone and thymoquinone derivatives can be used as lead compounds for further mechanism study and drug discovery for treatment of neurodegenerative disease. We designed a series of photoswitchable HDAC inhibitors, which could be effective molecular tools due to the high spatial and temporal resolution. In total 23 target compounds were synthesized and photophysicochemically characterized. Azoquinoline-based compounds possess more thermally stable cis-isomers in buffer solution, which were further tested in enzyme-based HDAC inhibition assay. However, none of those tested compounds show significant differences in activities between trans-isomers and corresponding cis-isomers. N2 - Die meisten bisher berichteten Antioxidantien erzielten in klinischen-Studien zur Alzheimer-Krankheit nur einen begrenzten Erfolg. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die bloße Bekämpfung von oxidativem Stress nicht ausreicht, um die Alzheimer-Krankheit zu bekämpfen. Während Multipotente Liganden verschiedene Schritte im neurodegenerativen Prozess synergistisch modulieren könnten und ein vielversprechendes Potenzial für die Behandlung dieser komplexen Krankheit bieten. Im ersten Projekt dieser Dissertation wurden 15 Zielverbindungen entworfen, indem Melatonin und Ferulasäure in die Deckel-Gruppe eines tertiären Amid-HDAC6-Inhibitors fusioniert wurden. Verbindung 10b wurde als bestes Hybridmolekül gescreent, das eine potente HDAC6-Hemmung und eine starke antioxidative Kapazität aufweist. Hierbei linderte Verbindung 10b die LPS-induzierte Mikroglia-Entzündung und führte zu einem Wechsel vom neurotoxischen M1- zum neuroprotektiven M2-Mikroglia-Phänotyp. Darüber hinaus zeigt Verbindung 10b eine ausgeprägte Abschwächung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses und eine Schädigung des Langzeitgedächtnisses in einem in vivo Alzheimer-Krankheit-Mausmodell. Verbindung 10b kann ein potenzieller Wirkstoffkandidat zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit sein, und eignet sich für weiterführende Studien. Basierend auf den starken neuroprotektiven Wirkungen von Vitamin-K-Derivaten gegen den Oxytoseweg, haben wir zehn neue Verbindungen entwickelt, indem wir Vitamin K mit mehreren Antioxidantien, darunter Ferulasäure, Melatonin, Liponsäure und Trolox, hybridisieten. Die Trolox-Hybridverbindung zeigte die stärksten neuroprotektiven Wirkungen in mehreren Neuroprotektionsassays. Außerdem haben wir die synergistischen Effekte zwischen Trolox und dem Vitamin-K-Derivat identifiziert, und unsere Trolox-Hybridverbindung zeigte eine vergleichbare Neuroprotektion mit der Mischung aus Trolox und Vitamin-K-Derivat. Ermutigt durch die starke antioxidative Kapazität und der neuroprotektiven Wirkung von Vitamin-K-Hybriden, haben wir die Struktur-Aktivitäts-Beziehung von Chinon-Derivaten mit der antioxidativen Kapazität und der neuroprotektiven Wirkungen untersucht, um Leitlinien für das weitere Design neuer neuroprotektive Verbindungen bereitzustellen. Wir haben 24 Chinon-Derivate entwickelt und synthetisiert, die auf fünf verschiedenen Chinonen basieren, darunter Ubichinon, 2,3,5-Trimethyl-1,4-Benzochinon, Memoquin, Thymochinon und Anthrachinon. Darüber hinaus zeigten Trimethylbenzochinon- und Thymochinon-Derivate im Oxytose-Assay eine stärkere Neuroprotektion als andere Chinone. Daher können Trimethylbenzochinon- und Thymochinon-Derivate als Leitverbindungen für die weitere Untersuchung des Mechanismus und die Wirkstoffforschung zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen verwendet werden. Wir haben hier eine Reihe von photoschaltbaren HDAC-Inhibitoren entwickelt, die aufgrund der hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung effektive molekulare Werkzeuge sein könnten. Insgesamt wurden 23 Zielverbindungen synthetisiert und photophysikochemisch charakterisiert. Die Verbindungen auf Azochinolinbasis besitzen thermisch stabilere cis-Isomere in Pufferlösung, die in einem enzymbasierten HDAC-Inhibitionsassay weiter getestet wurden. Keine dieser getesteten Verbindungen zeigt jedoch signifikante Unterschiede in der Aktivität zwischen trans-Isomeren und den entsprechenden cis-Isomeren. KW - Alzheimerkrankheit KW - Oxidativer Stress KW - Oxytosis KW - Photoswitch KW - Histon-Deacetylase KW - HDAC Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-253497 ER -