TY  - THES
A1  - Youssef, Almoatazbellah
T1  - Fabrication of Micro-Engineered Scaffolds for Biomedical Application
T1  - Fabrikation von Scaffolds mit optimierter Mikroarchitektur für biomedizinische Anwendungen
N2  - Thermoplastic polymers have a history of decades of safe and effective use in the clinic as implantable medical devices. In recent years additive manufacturing (AM) saw increased clinical interest for the fabrication of customizable and implantable medical devices and training models using the patients’ own radiological data. However, approval from the various regulatory bodies remains a significant hurdle. A possible solution is to fabricate the AM scaffolds using materials and techniques with a clinical safety record, e.g. melt processing of polymers. Melt Electrowriting (MEW) is a novel, high resolution AM technique which uses thermoplastic polymers. MEW produces scaffolds with microscale fibers and precise fiber placement, allowing the control of the scaffold microarchitecture. Additionally, MEW can process medical-grade thermoplastic polymers, without the use of solvents paving the way for the production of medical devices for clinical applications. This pathway is investigated in this thesis, where the layout is designed to resemble the journey of a medical device produced via MEW from conception to early in vivo experiments. To do so, first, a brief history of the development of medical implants and the regenerative capability of the human body is given in Chapter 1. In Chapter 2, a review of the use of thermoplastic polymers in medicine, with a focus on poly(ε-caprolactone) (PCL), is illustrated, as this is the polymer used in the rest of the thesis. This review is followed by a comparison of the state of the art, regarding in vivo and clinical experiments, of three polymer melt AM technologies: melt-extrusion, selective laser sintering and MEW. The first two techniques already saw successful translation to the bedside, producing patient-specific, regulatory-approved AM implants. To follow in the footsteps of these two technologies, the MEW device parameters need to be optimized. The MEW process parameters and their interplay are further discussed in Chapter 3 focusing on the importance of a steady mass flow rate of the polymer during printing. MEW reaches a balance between polymer flow, the stabilizing electric field and moving collector to produce reproducible, high-resolution scaffolds. An imbalance creates phenomena like fiber pulsing or arcing which result in defective scaffolds and potential printer damage. Chapter 4 shows the use of X-ray microtomography (µCT) as a non-destructive method to characterize the pore-related features: total porosity and the pore size distribution. MEW scaffolds are three-dimensional (3D) constructs but have long been treated in the literature as two-dimensional (2D) ones and characterized mainly by microscopy, including stereo- and scanning electron microscopy, where pore size was simply reported as the distance between the fibers in a single layer. These methods, together with the trend of producing scaffolds with symmetrical pores in the 0/90° and 0/60/120° laydown patterns, disregarded the lateral connections between pores and the potential of MEW to be used for more complex 3D structures, mimicking the extracellular matrix. Here we characterized scaffolds in the aforementioned symmetrical laydown patterns, along with the more complex 0/45/90/135° and 0/30/60/90/120/150° ones. A 2D pore size estimation was done first using stereomicroscopy, followed by and compared to µCT scanning. The scaffolds with symmetrical laydown patterns resulted in the predominance of one pore size, while those with more complex patterns had a broader distribution, which could be better shown by µCT scans. Moreover, in the symmetrical scaffolds, the size of 3D pores was not able to reach the value of the fiber spacing due to a flattening effect of the scaffold, where the thickness of the scaffold was less than the fiber spacing, further restricting the pore size distribution in such scaffolds. This method could be used for quality assurance of fabricated scaffolds prior to use in in vitro or in vivo experiments and would be important for a clinical translation. Chapter 5 illustrates a proof of principle subcutaneous implantation in vivo experiment. MEW scaffolds were already featured in small animal in vivo experiments, but to date, no analysis of the foreign body reaction (FBR) to such implants was performed. FBR is an immune reaction to implanted foreign materials, including medical devices, aimed at protecting the host from potential adverse effects and can interfere with the function of some medical implants. Medical-grade PCL was used to melt electrowrite scaffolds with 50 and 60 µm fiber spacing for the 0/90° and 0/60/120° laydown patterns, respectively. These implants were implanted subcutaneously in immunocompetent, outbred mice, with appropriate controls, and explanted after 2, 4, 7 and 14 days. A thorough characterization of the scaffolds before implantation was done, followed by a full histopathological analysis of the FBR to the implants after excision. The scaffolds, irrespective of their pore geometry, induced an extensive FBR in the form of accumulation of foreign body giant cells around the fiber walls, in a manner that almost occluded available pore spaces with little to no neovascularization. This reaction was not induced by the material itself, as the same reaction failed to develop in the PCL solid film controls. A discussion of the results was given with special regard to the literature available on flat surgical meshes, as well as other hydrogel-based porous scaffolds with similar pore sizes. Finally, a general summary of the thesis in Chapter 6 recapitulates the most important points with a focus on future directions for MEW.
N2  - Thermoplastische Polymere werden seit Jahrzehnten erfolgreich in der Klinik eingesetzt und für die Herstellung von Medizinprodukten verwendet. Vorangetrieben durch das zunehmende klinische Interesse an additiven Fertigungsverfahren, z.B. zur Herstellung patientenspezifischer Trainingsmodelle und implantierbarer Medizinprodukte, rücken thermoplastische Materialien noch mehr in den Fokus der klinischen Forschung. Allerdings stellt die Marktzulassung durch die verschiedenen Gesundheitsbehörden eine große Hürde dar. Eine mögliche Lösung ist die Gerüstfabrikation mit Materialien und Verfahren, die bereits etablierte Sicherheitsstandards durchlaufen haben, z. B. die Schmelzverarbeitung der Polymere. Ein neuartiges und hochauflösendes additives Fertigungsverfahren, welches die Verarbeitung von Thermoplasten ermöglicht, ist Melt Electrowriting (MEW). Mittels MEW lassen sich Gerüste, die aus Fasern mit Durchmessern im Mikrometerbereich zusammengesetzt sind, herstellen. Neben der hohen Kontrolle über den Faserdurchmesser ermöglicht MEW auch eine genaue Ablage der Fasern und erlaubt dadurch, die Mikroarchitektur der Konstrukte vorzugeben. Zudem kann das Verfahren medizinisch zugelassene thermoplastische Polymere ohne die Verwendung von Lösungsmitteln verarbeiten und ist somit für die Herstellung medizinischer Produkte sehr relevant.
Diese Relevanz sollte im Rahmen der vorliegenden Dissertation evaluiert werden, indem der Weg, den ein Medizinprodukt von der Konzeption bis hin zu in vivo Vorversuchen durchlaufen muss, anhand von Konstrukten, die mittels MEW hergestellt wurden, nachgeahmt wurde. Um eine Basis für das Verständnis dieses Prozesses zu schaffen, wird in Kapitel 1 erst die Geschichte der Entwicklung medizinischer Implantate zusammengefasst sowie ein Einblick in die regenerativen Fähigkeiten des menschlichen Körpers gegeben. Das zweite Kapitel befasst sich mit der Anwendung von thermoplastischen Polymeren im Bereich implantierbarer Medizinprodukte, wobei der Hauptfokus auf Poly(ε-caprolactone) (PCL) liegt, da dies der in der vorliegenden Arbeit verwendete Thermoplast ist. Es folgt ein Vergleich von in vivo sowie klinischen Versuchen dreier für die Biomedizin relevanten additiven Fertigungsverfahren, mit denen sich thermoplastische Polymere verarbeiten lassen: Die Mikro-Schmelzextrusion, das selektive Lasersintern und das MEW. Die ersten zwei Verfahren sind bereits erfolgreich in klinischen Anwendungen etabliert und ermöglichen die routinemäßige Herstellung von additiv gefertigten, patientenspezifischen, auf dem Markt zugelassenen Implantaten. Damit MEW in diese Fußstapfen treten kann, müssen die Prozessparameter und deren Zusammenspiel genau analysiert werden. Dieser Thematik widmet sich Kapitel 3, wobei die Untersuchung des Massendurchsatzes des Polymers während des Druckens diskutiert wird. Um den MEW-Prozess kontrollieren zu können, muss eine Balance zwischen Polymerdurchsatz, dem stabilisierenden elektrischen Feld und dem beweglichen Kollektor erreicht werden. Dies ist Grundlage für die reproduzierbare Herstellung hochaufgelöster Konstrukte. Ein Ungleichgewicht der Prozessparameter verursacht Phänomene wie Fiber Pulsing oder sogar elektrischen Durchschlag, welche zu defekten Konstrukten oder sogar zur Schädigung des Druckers führen können. Kapitel 4 zeigt die Anwendung der Röntgenmikrocomputertomographie (µCT) als eine zerstörungsfreie Charakterisierungsmethode für MEW-Konstrukte, die die Quantifizierung charakteristischer Eigenschaften wie der Porosität und der Porengrößenverteilung ermöglicht. MEW-Konstrukte wurden in der Literatur lange als zweidimensional behandelt und hauptsächlich durch mikroskopische Verfahren wie die Stereo- und Rasterelektronmikroskopie charakterisiert. Die zweidimensionale Porengröße wurde hauptsächlich durch die Bestimmung des Faserabstands definiert und daraus errechnet, mit einer Tendenz der Herstellung der Konstrukte mit symmetrischen Poren in 0/90° und 0/60/120° Ablagemustern. Da es sich bei den Konstrukten jedoch um dreidimensionale (3D) Fasergerüste handelt, wurden die seitlichen Verbindungen zwischen den Poren und das Potential der Anwendung des MEW für die Herstellung von komplexeren 3D-Strukturen, wie bei der extrazellulären Matrix mit interkonnektierenden Poren, vernachlässigt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit µCT-Scans verwendet, um die Porosität der Konstrukte besser wiedergeben zu können. Hierzu wurden verschiedene Ablagemuster mit symmetrischen Poren in 0/90° und 0/60/120° Mustern und komplexere Porenstrukturen durch Ablagen von 0/45/90/135° und 0/30/60/90/120/150° Geometrien hergestellt. Diese Konstrukte wurden dann mittels mikroskopischer und tomographischer Aufnahmen charakterisiert und die Ergebnisse miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass symmetrische Ablagemuster zu Konstrukten mit der Prädominanz einer Porengröße geführt haben. Bei den komplexeren Strukturen ergab sich jedoch ein klarer Unterschied, weil die interkonnektierenden Poren nur mit Hilfe von µCT-Scans erfasst werden konnten. Dies zeigte sich durch eine breitere Porenverteilung bei der Auswertung der rekonstruierten Scans. Die Porengrößen in den Konstrukten mit den symmetrischen Mustern konnten aufgrund einer Verflachungswirkung nicht die des Faserabstands erreichen. Die Dicke der Konstrukte war geringer als der Faserabstand mit einer weiteren einschränkenden Wirkung auf die Porenverteilung in den symmetrischen Konstrukten. µCT kann deshalb für die Qualitätssicherung von medizinischen Produkten, die mittels MEW hergestellt wurden, eingesetzt werden. Da die Methode zerstörungsfrei ist, könnte sie auch vor in vitro oder in vivo Versuchen verwendet werden. Kapitel 5 präsentiert eine Machbarkeitsstudie eines subkutanen in vivo Implantationsversuchs. Aus der Literatur ist zwar bekannt, dass MEW-Konstrukte bereits in vivo in Kleintierversuchen verwendet wurden, eine Analyse der Fremdkörperreaktion (FKR) zu solchen Implantaten wurde bisher jedoch noch nicht durchgeführt. FKR ist eine Immunreaktion gegen fremde, implantierte Materialien, einschließlich medizinischer Geräte, um den Wirt vor potenziellen Nebenwirkungen zu schützen. Allerdings könnte sie die Funktion verschiedener medizinischer Implantate beeinträchtigen Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation PCL mittels MEW zu Konstrukten mit 50 und 60 µm Fiberabstand in 0/90° bzw. 0/60/120° Ablagemuster verarbeitet. Diese Konstrukte wurden subkutan in immunkompetente, fremdgezüchtete Mäuse mit entsprechenden Kontrollen implantiert und nach 2, 4, 7 und 14 Tagen explantiert. Vor der Implantation wurde die Konstrukte ausführlich charakterisiert, gefolgt von einer vollen histopathologischen Analyse des FKR. Unabhängig von der Porengeometrie haben die Konstrukte eine deutliche Immunreaktion im Sinne einer Ansammlung von Fremdkörperriesenzellen um die Fasern der Konstrukte hervorgerufen. Hierbei wurden die Poren fast komplett verschlossen, ohne dass es zu einer Neovaskularisation kam. Es konnte nachgewiesen werden, dass die deutliche Immunantwort nicht durch das Material hervorgerufen wurde, da sie bei der Implantation von dichtem PCL-Film nicht beobachtet wurde. Eine Diskussion der Ergebnisse erfolgte unter Berücksichtigung aktueller Literatur zu klinischen Versuchen von flachen chirurgischen Netzen sowie porösen Hydrogel-basierten Implantaten mit vergleichbarer Porengröße. Abschließend wird die Arbeit in Kapitel 6 zusammengefasst und die wichtigsten Punkte rekapituliert. Der Fokus des Kapitels liegt hierbei auf dem zukünftigen Potential des MEW als Fabrikationsmethode für medizinische Produkte.
KW  - melt electrowriting
KW  - medical device
KW  - biomaterials
KW  - subcutaneous implanation
KW  - x-ray micro computed tomography
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235457
ER  - 
TY  - THES
A1  - Oliveira Alves Pereira, Ana Rita
T1  - Modelling of Mesenchymal Stromal Cells Interactions within the Skeletal Niche
T1  - Modellierung der Interaktionen von Mesenchymalen Stromazellen in der skelettalen Nische
N2  - Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) are a rare subpopulation of cells first identified in bone marrow with the potential to proliferate in plastic-adherent colonies and to generate de novo bone marrow stroma and its environment upon serial transplantation to heterotopic anatomical sites. Given their multipotency and self renewal competence, MSCs are prime prospective candidates for most modern musculoskeletal-tissue engineering and regenerative medicine approaches. Still, their envisioned therapeutic use is being questioned with concerns regarding their definition, characterization and integrative functions in vivo. It is well established that microenvironmental cues such as the extracellular matrix (ECM)-chemistry, the mechanical environment and local cellular and/or paracrine interactions critically control MSCs behavior. Yet, most of the scientific knowledge regarding the biology and therapeutic effect of MSCs originates from mechanistic in vitro studies where microenvironmental cues are hardly addressed. Therefore, manifestable changes in cell proliferation behavior and multilineage differentiation potential might be triggered that eventually compromise the translation of results to clinics. This thesis aims to address the complexity of MSCs interactions within the skeletal niche microenvironment in order to provide alternative methods to bypass the current MSCs in vitro culture limitations. Firstly, the influence of ECM-chemistry on MSCs behavior in vitro was explored by means of decellularized human bone models here established. Basal or osteogenic tailored cell-derived decellularized 2D matrices (dECM), proved to be suitable culture substrates for MSCs expansion by providing close-to-native cell-ECM interactions. Moreover, quantified morphological shape changes suggested a material osteo supportive potential, further functionally validated by observable spontaneous mineralization of MSCs. Aiming to identify novel intrinsic ECM regulatory features specific to the skeletal niche, 3D decellularized human trabecular bone scaffolds (dBone) were additionally developed and comprehensively characterized. Remarkably, the MSCs cultured on dBone scaffolds exhibit upregulation of genes associated with stemness as well as niche-related protein expression advocating for the conservation of the naïve MSCs phenotype. vi On the other hand, the effect of biomimetic mineralization on MSCs osteogenic lineage differentiation potential was further addressed by hydroxyapatite functionalization of type-I collagen in presence of magnesium. Mineralized scaffolds exhibited higher cell viability and a clear trend of osteogenic genes upregulation comparing with non-mineralized scaffolds. Lastly, in order to mimic the complexity of the native MSCs environment, a dynamic culture system was applied to the 3D decellularized bone constructs, previously studied in single static conditions. Mechanical stimuli generated by (1) continuous perfusion of cell culture medium at 1.7 mL/min and (2) compressive stress from 10% uniaxial load at 1 Hz, resulted in an improved cell repopulation within the scaffold and boosting of de novo ECM production. The stress-induced gene expression pattern suggested early MSCs commitment towards the osteogenic lineage mediated by integrin matrix adhesion, therefore further corroborating the recapitulation of a reliable in vitro bone niche model in dBone scaffolds. To conclude, the here developed in vitro models provide a progressive increased biomimicking complexity through which significant insights regarding MSC interactions with microenvironmental features in the skeletal niche can be obtained, thus surely paving the way for a better understanding of the role of MSCs in bone homeostasis and regeneration.
N2  - Mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSZ) sind eine seltene Subpopulation von Zellen, die erstmals im Knochenmark identifiziert wurden und die das Potenzial haben, sich in plastikadhärenten Kolonien zu vermehren und bei serieller Transplantation an heterotopen anatomischen Stellen de novo das Knochenmarkstroma und seine Umgebung zu bilden. Aufgrund ihrer Multipotenz und ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung sind MSZ erstklassige Kandidaten für moderne Ansätze des muskuloskelettalem Gewebe-Engineering und der regenerativen Medizin. Dennoch wird ihr therapeutischer Einsatz aufgrund von Bedenken hinsichtlich ihrer Definition, Charakterisierung und in vivo Integration in Frage gestellt.
	Es ist hinlänglich bekannt, dass die Mikroumgebung wie die Komposition der extrazellulären Matrix (EZM), die mechanische Umgebung und die lokalen zellulären und/oder parakrinen Interaktionen das Verhalten der MSZ entscheidend beeinflussen. Die meisten wissenschaftlichen Erkenntnisse über die Biologie und die therapeutische Wirkung von MSZ stammen jedoch aus mechanistischen In-vitro-Studien, in denen Faktoren aus der naiven Mikroumgebung von MSZ kaum berücksichtigt wurden. Dies kann zu offensichtlichen Veränderungen des Zellproliferationsverhaltens und des Differenzierungspotenzials der Zellen führen, was die Übertragung der Ergebnisse in die klinische Praxis beeinträchtigt. 
Diese Arbeit zielt darauf ab, die Komplexität der Interaktionen von MSZ in der Mikroumgebung der skelettalen Nische zu untersuchen, um Methoden zur Umgehung der derzeitigen Limitationen bei der In-vitro-Kultur von MSZ zu etablieren.
	Zunächst wurde der Einfluss der EZM auf das Verhalten von MSZ in vitro mit Hilfe von dezellularisierten menschlichen Knochenmodellen untersucht. Basale oder dezellularisierte 2D-Matrizen (dECM) osteogen differenzierter Zellen erwiesen sich als geeignete Zellkultursubstrate für die MSZ-Expansion, da sie nahezu native Zell-EZM-Interaktionen ermöglichen. Darüber hinaus deutet die quantifizierten morphologischen Formveränderungen in MSZ auf ein osteoinduktives Potenzial des Materials hin, was durch eine beobachtete spontane Mineralisierung der MSZ funktionell bestätigt wurde. Mit dem Ziel, neue intrinsische EZM-Faktoren zu identifizieren, die für die skelettale Nische spezifisch sind, wurden zusätzlich dezellularisierte 3D-Gerüste aus menschlichem trabekulärem Knochen (dBone) entwickelt und umfassend charakterisiert. Bemerkenswerterweise zeigen die auf dBone-Gerüsten kultivierten MSZ eine Hochregulierung von typischen Stammzell-assoziierten Genen, sowie die Expression von charakteristischen Nischenproteinen, was für die Erhaltung des Phänotyps naiver MSZ spricht.
	Andererseits wurde die Auswirkung einer biomimetischen Mineralisierung auf das osteogene Potenzial von MSZ durch Hydroxyapatit-Funktionalisierung von Typ-I-Kollagen Trägermaterialien in Gegenwart von Magnesium untersucht. Mineralisierte Gerüste zeigten eine höhere Zellviabilität und einen klaren Trend zur Hochregulierung osteogener Gene im Vergleich zu nicht-mineralisierten Gerüsten. 
	Um die Komplexität der nativen MSZ-Umgebung zu imitieren, wurde schließlich ein dynamisches Kultursystem auf die dezellularisierten 3D-Knochenkonstrukte angewandt, die zuvor unter statischen Bedingungen untersucht worden waren. Mechanische Stimuli, die durch (1) kontinuierliche Perfusion des Zellkulturmediums bei 1,7 ml/min und (2) Druckbelastung durch eine einachsige Last von 10 % bei 1 Hz erzeugt wurden, führten nachweislich zu einer verbesserten Zellrepopulation innerhalb des Gerüsts und zu einer Steigerung der de novo EZM-Produktion. Das stressinduzierte Genexpressionsmuster deutet darauf hin, dass es schon früh durch Integrin-Matrix-Adhäsion zu einer Festlegung der MSZ auf die osteogene Linie kommt, was die Rekapitulation eines Zuverlässigen in vitro-Knochennischenmodells in dBone-Konstrukten weiter bestätigt.
	Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier entwickelten in vitro-Modelle eine zunehmende Komplexität der zellulären Mikroumgebung darstellen, durch die wichtige Erkenntnisse über die Interaktionen von MSZ mit der Mikroumgebung in der Knochennische gewonnen werden können, was sicherlich den Weg für ein besseres Verständnis der Rolle von MSZ in der Knochenhomöostase und -regeneration ebnet.
KW  - Stem Cells
KW  - In vitro models
KW  - Bone regeneration
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266603
ER  -