TY - THES A1 - Wiesner, Miriam T1 - Stem Cell-based Adipose Tissue Engineering - Engineering of Prevascularized Adipose Tissue Constructs In Vitro & Investigation on Gap Junctional Intercellular Communication in Adipose-derived Stem Cells T1 - Stammzellbasiertes Tissue Engineering von Fettgewebe - Entwicklung eines prävaskularisierten Fettgewebekonstrukts in vitro & Untersuchung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions in Stammzellen aus dem Fettgewebe N2 - In reconstructive and plastic surgery, there exists a growing demand of adequate tissue implants, since currently available strategies for autologous transplantation are limited by complications including transplant failure and donor site morbidity. By developing in vitro and in vivo autologous substitutes for defective tissue sites, adipose tissue engineering can address these challenges, although there are several obstacles to overcome. One of the major limitations is the sufficient vascularization of in vitro engineered large constructs that remains crucial and demanding for functional tissues. Decellularized jejunal segments may represent a suitable scaffolding system with preexisting capillary structures that can be repopulated with human microvascular endothelial cells (hMVECs), and a luminal matrix applicable for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells (hASCs). Hence, co-culture of these cells in jejunal segments, utilizing a custom-made bioreactor system, was characterized in terms of vascularization and adipose tissue development. Substantial adipogenesis of hASCs was demonstrated within the jejunal lumen in contrast to non-induced controls, and the increase of key adipogenic markers was verified over time upon induction. The development of major extracellular matrix components of mature adipose tissue, such as laminin and collagen IV, was shown within the scaffold in induced samples. Successful reseeding of the vascular network with hMVECs was demonstrated in long-term culture and co-localization of vascular structures and adipogenically differentiated hASCs was observed. Therefore, these results represent a novel approach for in vitro engineering of vascularized adipose tissue constructs that warrants further investigations in preclinical studies. Another still existing obstacle in adipose tissue engineering is the insufficient knowledge about the applied cells, for instance the understanding of how cells can be optimally expanded and differentiated for successful engineering of tissue transplants. Even though hASCs can be easily isolated from liposuction of abdominal fat depots, yielding low donor site morbidity, huge numbers of cells are required to entirely seed complex and large 3D matrices or scaffolds. Thus, cells need to be large-scale expanded in vitro on the premise of not losing their differentiation capacity caused by replicative aging. Accordingly, an improved differentiation of hASCs in adipose tissue engineering approaches remains still desirable since most engineered constructs exhibit an inhomogeneous differentiation pattern. For mesenchymal stem cells (MSCs), it has been shown that growth factor application can lead to a significant improvement of both proliferation and differentiation capacity. Especially basic fibroblast growth factor (bFGF) represents a potent mitogen for MSCs, while maintaining or even promoting their osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation potential. As there are currently different contradictory information present in literature about the applied bFGF concentration and the explicit effect of bFGF on ASC differentiation, here, the effect of bFGF on hASC proliferation and differentiation capacity was investigated at different concentrations and time points in 2D culture. Preculture of hASCs with bFGF prior to adipogenic induction showed a remarkable effect, whereas administration of bFGF during culture did not improve adipogenic differentiation capacity. Furthermore, the observations indicated as mode of action an impact of this preculture on cell proliferation capacity, resulting in increased cellular density at the time of adipogenic induction. The difference in cell density at this time point appeared to be pivotal for increased adipogenic capacity of the cells, which was confirmed in a further experiment employing different seeding densities. Interestingly, furthermore, the obtained results suggested a cell-cell contact-mediated mechanism positively influencing adipogenic differentiation. As a consequence, subsequently, studies were conducted focusing on intercellular communication of these cells, which has hardly been investigated to date. Despite the multitude of literature on the differentiation capacity of ASCs, little is reported about the physiological properties contributing to and controlling the process of lineage differentiation. Direct intercellular communication between adjacent cells via gap junctions has been shown to modulate differentiation processes in other cell types, with connexin 43 (Cx43) being the most abundant isoform of the gap junction-forming connexins. Thus, in the present study we focused on the expression of Cx43 and gap junctional intercellular communication (GJIC) in hASCs, and its significance for adipogenic differentiation of these cells. Cx43 expression in hASCs was demonstrated histologically and on the gene and protein expression level and was shown to be greatly positively influenced by cell seeding density. Functionality of gap junctions was proven by dye transfer analysis in growth medium. Adipogenic differentiation of hASCs was shown to be also distinctly elevated at higher cell seeding densities. Inhibition of GJIC by 18α-glycyrrhetinic acid significantly compromised adipogenic differentiation, as demonstrated by histology, triglyceride quantification, and adipogenic marker gene expression. Flow cytometry analysis showed a lower proportion of cells undergoing adipogenesis when GJIC was inhibited, further indicating the importance of GJIC in the differentiation process. Altogether, these results demonstrate the impact of direct cell-cell communication via gap junctions on the adipogenic differentiation process of hASCs and may contribute to further integrate direct intercellular crosstalk in rationales for tissue engineering approaches. N2 - In der rekonstruktiven und plastischen Chirurgie besteht ein wachsender Bedarf an adäquaten Gewebetransplantaten, da die derzeit verfügbaren Strategien für autologe Transplantationen von Geweben durch Komplikationen wie beispielsweise Transplantatversagen sowie Morbiditäten an der Entnahmestelle beeinträchtigt werden. Das Tissue Engineering kann dieser Problematik jedoch durch die Entwicklung von in vitro und in vivo gezüchtetem, autologen Gewebeersatz für defekte Gewebestellen begegnen, wobei es dabei noch mehrere Hindernisse zu überwinden gilt. Eine der größten Limitationen ist die ausreichende Vaskularisierung der in vitro hergestellten, großen Konstrukte, welche für die Funktion des Gewebes entscheidend ist. Hierfür können dezellularisierte, jejunale Segmente ein geeignetes Gerüstsystem darstellen, deren bereits vorhandene Kapillarstrukturen mit humanen, mikrovaskulären Endothelzellen (hMVECs) und deren luminale Matrix mit humanen Stammzellen aus dem Fettgewebe (hASCs), mit anschließender adipogen Differenzierung, besiedelt werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden diese Konstrukte mit Hilfe eines maßgeschneiderten Bioreaktorsystems kultiviert und die Kokultur der Zellen in der jejunalen Matrix hinsichtlich der Fettgewebeentwicklung untersucht. Im Gegensatz zu nicht-induzierten Kontrollen wurde nach adipogener Induktion innerhalb des jejunalen Lumens eine substanzielle Fettgewebebildung der hASCs, sowie ein Anstieg wichtiger adipogener Marker im zeitlichen Verlauf nachgewiesen. Die Bildung wesentlicher extrazellulärer Matrixkomponenten des reifen Fettgewebes, wie beispielsweise Laminin und Kollagen IV, wurde innerhalb der Matrix bei induzierten Proben ebenso beobachtet. Die erfolgreiche Neubesiedlung des Gefäßnetzes mit hMVECs konnte in der Langzeitkultur gezeigt und eine Kolokalisation von Gefäßstrukturen und differenzierten hASCs beobachtet werden. Somit stellen diese Ergebnisse einen vielversprechenden, neuen Ansatz für die in vitro Entwicklung von vaskularisierten Fettgewebekonstrukten dar, welcher jedoch noch weitere Untersuchungen in präklinischen Studien erfordert. Eine weitere Limitation in der Entwicklung von Fettgewebe ist das unzureichende Wissen über die verwendeten Zellen – so zum Beispiel wie Zellen optimal expandiert und differenziert werden können, um einen Gewebeersatz erfolgreich herzustellen. Auch wenn hASCs leicht aus abdominalen Liposuktionen, welche zu einer relativ geringen Morbidität an der Entnahmestelle führen, isoliert werden können, ist eine sehr große Anzahl an Zellen erforderlich, um komplexe und große 3D-Matrizes vollständig mit Zellen zu besiedeln. So müssen Zellen in vitro im großen Maßstab expandiert werden, wobei auf die Erhaltung ihrer Differenzierungskapazität und die Vermeidung des replikativen Alterns geachtet werden muss. Da viele der entwickelten Konstrukte des Weiteren ein inhomogenes Differenzierungsmuster aufweisen, ist eine Verbesserung der adipogenen Differenzierung von ASCs im Rahmen von Tissue Engineering Ansätzen wünschenswert. Für mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurde bereits gezeigt, dass die Anwendung von Wachstumsfaktoren zu einer deutlichen Verbesserung der Proliferations- und Differenzierungskapazität führen kann. Insbesondere der Wachstumsfaktor bFGF (basic fibroblast growth factor) stellt ein starkes Mitogen für MSCs dar, wobei er das osteogene, chondrogene und adipogene Differenzierungspotenzial der Zellen aufrechterhält und sogar fördert. Da es in der Literatur derzeit unterschiedliche und teilweise widersprüchliche Informationen über die verwendeten bFGF Konzentrationen und den expliziten Effekt von bFGF auf die Differenzierung von ASCs gibt, wurde der Effekt von bFGF auf die Proliferations- und Differenzierungsfähigkeit mit unterschiedlichen Konzentrationen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der 2D Kultur untersucht. Die Vorkultur der hASCs mit bFGF vor der adipogenen Induktion hatte einen beachtlichen Effekt auf die Differenzierung, während die Verabreichung von bFGF während der Kultur, die adipogene Differenzierungsfähigkeit der Zellen nicht verbesserte. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse einen Einfluss der Vorkultur auf die Zellproliferation, was zu einer erhöhten Zelldichte zum Zeitpunkt der adipogenen Induktion führte. Der Unterschied in der Zelldichte zu diesem Zeitpunkt schien entscheidend für die gesteigerte Differenzierungskapazität der Zellen zu sein, was sich in einem weiteren Experiment mit unterschiedlichen Aussaatdichten bestätigte. Interessanterweise deuteten die Ergebnisse außerdem darauf hin, dass ein Zell-Zell-Kontakt-vermittelter Mechanismus die adipogene Differenzierung positiv beeinflusst. Daher wurden anschließend Untersuchungen zur interzellulären Kommunikation dieser Zellen durchgeführt, welche bisher kaum erforscht wurde. Trotz der Vielzahl an Literatur über die Differenzierungsfähigkeit von ASCs ist wenig über die physiologischen Prozesse bekannt, die zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen beitragen und diese kontrollieren. So wurde gezeigt, dass die direkte interzelluläre Kommunikation zwischen benachbarten Zellen über Gap Junctions Differenzierungsprozesse moduliert. Connexin 43 (Cx43) stellt dabei die häufigste Isoform der Gap Junction-bildenden Connexine dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von Cx43 und die interzelluläre Kommunikation durch Gap Junctions (gap junctional intercellular communication; GJIC) in hASCs, sowie ihre Bedeutung für die adipogene Differenzierung untersucht. Die Cx43 Expression in hASCs wurde histologisch und auf Gen- und Proteinexpressionsebene nachgewiesen und wurde durch die Zellaussaatdichte nachweislich stark beeinflusst. Die Funktionalität der Gap Junctions konnte mit Hilfe eines Assays zur Übertragung von Farbstoffen untersucht werden. Es zeigte sich hierbei eine zelldichteabhängige, adipogene Differenzierungkapazität der hASCs. Die Hemmung der GJIC durch 18α-Glycyrrhetinsäure beeinträchtigte die adipogene Differenzierung deutlich, wie sich durch die Histologie, die Triglyceridquantifizierung und die adipogene Markergenexpression beobachten ließ. Bei Hemmung der GJIC zeigte sich mit Hilfe der Durchflusszytometrie, dass weniger Zellen adipogen differenzieren konnten, was die Bedeutung von GJIC im Differenzierungsprozess hervorhebt. Zusammenfassend veranschaulichen diese Ergebnisse den Einfluss direkter Zell-Zell-Kommunikation über Gap Junctions auf den adipogenen Differenzierungsprozess von hASCs und könnten somit in Zukunft dazu beitragen, direkte interzelluläre Kommunikation in Tissue Engineering Ansätze zu integrieren. KW - Tissue Engineering KW - Fettgewebe KW - Gap Junction KW - Adipose Tissue Engineering Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185005 ER - TY - THES A1 - Koschitzki, Kim Christine Cornelia T1 - Evaluation of preclinical animal models in bone tissue engineering and their success in clinical translation T1 - Evaluierung von vorklinischen Tiermodellen für Bone Tissue Engineering und von ihrem Erfolg in der klinischen Umsetzung N2 - Autologous bone still represents today’s gold standard for the treatment of critical size bone defects and fracture non-unions despite associated disadvantages regarding limitations in availability, donor site morbidity, costs and efficacy. Bone tissue engineered constructs would present a promising alternative to currently available treatments. However, research on preclinical animal studies still fails to provide clinical applicable results able to allow the replacement of currently applied methods. It seems that the idea of bone tissue engineering, which has now been integral part of academic studies for over 30 years, got somehow stuck at an intermediate level, in between intense preclinical research and striven stages of initial clinical trial phases. A clear discrepancy exists between the number of studies with preclinical animal models for bone tissue engineering and the number of clinically approved bone tissue engineered constructs available to patients. The aim of this thesis was hence to evaluate preclinical animal models for bone tissue engineering as well as the perception of scientists and clinicians towards these models. Moreover, the general role of bone tissue engineering and its clinical need assessed by scientists and surgeons was investigated. A survey was conducted questioning both scientific and clinical opinions on currently available study designs and researchers’ satisfaction with preclinical animal models. Additionally, a literature research was conducted, resulting in 167 papers from the last 10 years that report current designs of preclinical orthotopic animal studies in bone tissue engineering. Thereby, the focus lied on the description of the models regarding animal species, strain, age, gender and defect design. The outcome of the literature search was evaluated and compared to the outcome obtained from the survey. The survey data revealed that both scientists and surgeons generally remain positive about the future role of bone tissue engineering and its step to clinical translation, at least in the distant future, where it then might replace the current gold standard, autologous bone. Moreover, most of the participants considered preclinical animal models as relevant and well developed but the results as not yet realizable in the clinics. Surgeons thereby demonstrated a slightly more optimistic perception of currently conducted research with animal models compared to scientists. However, a rather inconsistent description of present preclinical study designs could be discerned when evaluating the reported study designs in the survey and the papers of the literature search. Indeed, defining an appropriate animal species, strain, age, gender, observation time, observation method and surgical design often depends on different indications and research questions and represents a highly challenging task for the establishment of a preclinical animal model. The existing lack of valid guidelines for preclinical testing of bone tissue engineering leads hence to a lack of well standardized preclinical animal models. Moreover, still existing knowledge gaps regarding aspects that affect the process of fracture healing, such as vascularization or immunological aspects, were found to hinder clinical translation of bone tissue engineered constructs. Using literature review and survey, this thesis points out critical issues that need to be addressed to allow clinical translation of bone tissue engineered constructs. It can be concluded that currently existing study designs with preclinical animal models cannot live up to the claim of providing suitable results for clinical implementation. The here presented comprehensive summary of currently used preclinical animal models for bone tissue engineering reveals a missing consensus on the usage of models such as an apparent lack of reporting and standardization regarding the study designs described in both papers from the literature review and the survey. It thereby indicates a crucial need to improve preclinical animal models in order to allow clinical translation. Despite the fact that participants of the survey generally revealed a positive perception towards the use of bone tissue engineered constructs and affirmed the clinical need for such novel designs, the missing standardization constitutes a main weak point for the provision of reliable study outcome and the translational success of the models. The optimization of reproducibility and reliability, as well as the further understanding of ongoing mechanisms in bone healing in order to develop effective tissue engineered constructs, need to form the basis of all study designs. The study outcomes might then fulfill the requirements of maybe today's and hopefully tomorrow's aging population. N2 - Über die letzten 30 Jahre hat die Rolle von Bone Tissue Engineering vielversprechenden Fortschritt gemacht und immer neue Ansätze werden etabliert. Somit stellt Bone Tissue Engineering eine aussichtsvolle Alternative zu dem heutigen Goldstandard (autogene Knochenersatzmaterialien) dar, nachdem diese häufig mit Nachteilen einhergehen: limitierte Verfügbarkeit, Morbidität durch Zweiteingriffe, ungenügend Stabilität und Kosten. Die klinische Umsetzung findet jedoch nicht so schnell statt, wie ursprünglich erhofft und es scheint, als würde die vorklinische Forschung auf der Stelle treten. Das Ausbleiben von reproduzierbaren und standardisierten vorklinischen Studien verhindert dabei eine "bench to bedside" Translation. Ziel dieser Doktorarbeit war es, derzeitige präklinische Tiermodelle für Bone Tissue Engineering zu evaluieren und dabei zu untersuchen, woran es liegen könnte, dass die Lücke zwischen vorklinischen Studienergebnissen und klinischer Umsetzung noch immer existiert. Es wurde ein Fragebogen erstellt, anhand dessen die generelle Meinung gegenüber Bone Tissue Engineering und die Effizienz derzeitiger präklinischer Studienmodelle aus sowohl klinischer, als auch wissenschaftlicher Sicht hinterfragt wurde. Hier wurde außerdem auf die Beurteilung der Zufriedenstellung solcher Modelle seitens der Forscher eingegangen. Darüber hinaus erfolgte eine systemische Literatursuche auf der Online-Plattform “Pubmed” mit dem Ziel Studien der letzten zehn Jahre über präklinische orthotopische Tiermodelle in Bone Tissue Engineering zusammenzufassen und die verschiedenen Studiendesigns zu evaluieren. Der Fokus lag dabei auf der Beschreibung der Tiermodelle bezüglich Tierart, Geschlecht, Alter und Defektdesign. Ergebnisse der Literatursuche wurden anschließend evaluiert und mit den Antworten aus dem Fragebogen verglichen und diskutiert. Es hat sich anhand des Fragebogens gezeigt, dass sowohl Wissenschaftler, als auch Chirurgen positiv gestimmt sind, was die zukünftige Anwendung von Bone Tissue Engineering in den Kliniken betrifft. Jedoch beurteilten die meisten Teilnehmer des Fragebogens die präklinischen Tiermodelle zwar als relevant und gut entwickelt, deren Ergebnisse als klinisch allerdings nicht anwendbar. Dabei fiel die Einschätzung präklinischer Forschung mit Tiermodellen unter den Chirurgen etwas optimistischer aus als unter den Forschern. Die Evaluierung der Studien aus dem Fragebogens und der Literatursuche zeigte jedoch auch, dass die darin beschriebenen Tiermodelle einen eher uneinheitlichen Studienaufbau aufweisen. Tatsächlich stellt die Etablierung eines fundierten Studiendesigns im Anbetracht der zahlreichen Möglichkeiten eine immense Herausforderung dar. Die Festlegung eines Versuchsaufbaus hängt dabei von der Wahl der Tierart, dessen Geschlecht und Alter, des chirurgischen Ablaufs, sowie der technischen und zeitlichen Beobachtungsmöglichkeit ab. Es stellte sich heraus, dass für viele Studien eine diesbezüglich notwendige Standardisierung kaum existiert und dadurch Studienergebnisse entstehen, die schwer reproduzierbar sind und somit den Ansprüchen einer klinischen Umsetzung nicht gerecht werden können. Hinzu kommen außerdem die noch immer bestehenden Wissenslücken in Bezug auf Knochenheilung beeinflussende Faktoren wie Vaskularisation und Abläufe des Immunsystems. Abschließend lässt sich sagen, dass die durchgeführte Evaluierung von Studien mit präklinischen Tiermodellen eine fehlende Standardisierung derzeit existierender Studiendesigns darlegt und eine klinische Umsetzung der daraus resultierenden Studienergebnissen somit noch nicht möglich ist. Auch wenn die Teilnehmer des Fragebogens den Bedarf an neuen, klinisch anerkannten Methoden für Knochenaufbauten nahelegten und eine generell positive Einstellung gegenüber dem potentiellen Gebrauch von Bone Tissue Engineering Konstrukte in den Kliniken zeigten, ist die Ablösung von autologem Knochen durch solch neuartige Designs nicht realisierbar, solange die Reproduzierbarkeit der Daten aus präklinischen Tiermodellstudien fehlt. Zusammen mit wegweisenden Richtlinien und fundiertem Wissen über grundliegende Mechanismen im Knochenheilungsprozess, sollte sie die Basis eines jeden Studienaufbaus mit präklinischen Tiermodellen darstellen, um schließlich zu den Ergebnissen zu gelangen, die es für eine klinische Umsetzung von Bone Tissue Engineering bedarf. KW - bone KW - tissue KW - engineering Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207593 ER -