TY - THES A1 - Momper, Laurent T1 - Interaktion der Schlüsselenzyme der Mineralisierung (AP, ENPP1, AnkH, PHOSPHO1) im Phosphatstoffwechsel in vitro T1 - Interaction of the Key Enzymes of Mineralization (AP, ENPP1, AnkH, PHOSPHO1) in the Phosphate Metabolism in vitro N2 - Die Enzyme TNSALP (Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase), ENPP1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 1) und ANKH (Ankylosis, progressive human homolog) bilden zusammen eine zentrale Regulierungseinheit für den Pyrophosphat (PPi)-Stoffwechsel der Zelle [1, 2]. Störungen dieses genau geregelten Prozesses resultieren in schwerwiegenden Erkrankungen, wie z.B. bei der Hypophosphatasie [3]. Dieser meist autosomal rezessiv vererbten Erkrankung liegt eine durch genetische Mutationen beeinträchtigte Funktion der TNSALP zugrunde, wodurch sich die PPi- Konzentration im Microenvironment der Zelle erhöht. Diese kann im Knochengewebe zu schweren Mineralisierungsstörungen führen [1, 2]. Andere Krankheiten, mit erniedrigten PPi- Konzentrationen, werden mit pathologischen Verkalkungen in verschiedensten Geweben in Verbindung gebracht [4, 5]. Diese gehen unter anderem auf genetische Defekte von ENPP1 zurück[4]. Auch der Mevalonat-Pathway trägt zur Komposition des Microenvironments bezüglich der Homöostase von Phosphaten bei [6, 7]. Hier bestehen auch medizinisch relevante Einflussmöglichkeiten, zum Beispiel durch Bisphosphonate, bei der sogenannten Volkskrankheit Osteoporose. In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen einer PPi-Belastung auf die in vitro Mineralisierung von Mesenchymalen Stammzellen untersucht, wobei Modulatoren der Enzymaktivität für ALP und ENPP1 und der Aktivität des PPi-Kanals ANKH sowie des Mevalonatstoffwechsels zum Einsatz kamen (PPi, Pyridoxalphosphat (PLP), Probenecid, Vitamin D, PPADS (Pyridoxalphosphat-6-azophenyl-2‘,4‘-disulfid Säure) und ß-γmeATP (ß-γ Methylentriphosphat)). Die Resultate zeigen, dass die Modulation der PPi-Konzentration bei der osteogenen Differenzierung von hMSCs in vitro keine eindeutigen Effekte bewirkt. Geringe Änderungen des Genexpressionsmusters sind letztlich nicht auszuschliessen, blieben jedoch aufgrund der hohen Spendervariabilität durch eine erhöhte Anzahl von Experimenten zu beweisen. Diese Arbeit zeigt insgesamt eine unerwartet geringe Auswirkung einer exogenen und endogenen Modulation der PPi-Konzentration sowohl mit Blick auf die rein physikalischen Phänomene der Mineralisierung, als auch mit Blick auf die untersuchte Genregulation der wichtigsten beteiligten Proteine, was möglicherweise die hohe Kompensationskapazität der Systeme unter physiologischen Bedingungen reflektiert. Untersuchungen auf proteomischer Ebene, besonders mit Blick auf die Prozessierung von Polypeptiden mit Mineralisierungs-modulierender Wirkung würden möglicherweise genaueren Einblick vermitteln. Eine genauere Untersuchung der Einflüsse von ENPP1 erscheint für die Zukunft vielversprechend. Allerdings treten hier, besonders auch durch die verwendeten Hemmstoffe der ENPP1, die Phänomene der Vernetzung des Stoffwechsels der Phosphate (inklusive ATP und seiner Metabolite) mit dem Purinergen Signalling deutlich zutage. Diese Vernetzung generiert durch ihre Komplexität sowohl klinisch als auch zellbiologisch/biochemisch erhebliche Interpretationsprobleme, die zukünftige Arbeiten auflösen müssen. Dabei sollte besondere Aufmerksamkeit auf zwei für HPP-PatientInnen klinisch in Zukunft potentiell bedeutsame Ergebnisse gelegt werden, die möglicherweise ungünstigen Auswirkungen einer Therapie mit Probenecid auf die ALPL Expression und die Steigerung der ALPL Expression unter Hemmstoffen des Enzyms ENPP1. 1. Dympna Harmey, L.H., Sonoko Narisawa, Kirsten A. Johnson, Robert Terkeltaub, José Luis Millán, Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphate and osteopontin by Akp2, Enpp1 and Ank. American Journal of Pathology, 2003. 164, No. 4: p. 1199-1209. 2. Manisha C Yadav, A.M.S.S., Sonoko Narisawa, Carmen Huesa, Marc D McKee, Colin Farquharson, José Luis Millán, Loss of Skeletal Mineralization by the Simultaneous Ablation of PHOSPHO1 and Alkaline Phosphatase Function: A Unified Model of the Mechanisms od Initiation of Skeletal Calcification. Journal of Bone and Mineral Research, 2011. 26, No2: p. 286-297. 3. Beck, C., Hypophosphatasia. Klin Padiatr, 2009: p. 219-226. 4. Harmey, D.e.a., Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphate and Osteopontin by Akp2, Enpp1, and Ank. American Journal of Pathology, 2004. 164: p. 1199-1209. 5. Peter Nürnberg, H.T., David Chandler et all, Heterozygous mutations in ANKH, the human ortholog of the mouse progressive ankylosis gene, result in craniometaphyseal dysplasia. Nature Genetics, May 2001. 28: p. 37-41. 6. Löffler, P., Heinrich, ed. Biochemie & Pathobiochemie. Vol. 8. 2007, Springer Verlag. 7. Joseph L. Goldstein, M.S.B., Regulation of the mevalonate Pathway. Nature Genetics, 1990. 343: p. 425-430. N2 - Together, the enzymes TNSALP (Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase), ENPP1 (Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 1) and ANKH (Ankylosis, progressive human homolog) form a central regulation entity for the cellular metabolism of pyrophosphate (PPi)[1, 2]. Dysregulation of these coordinated processes result in severe diseases, such as Hypophosphatasia (HPP) [3]. This condition is caused by an autosomal recessive inheritance pattern, which restricts the function of TNSALP, thus resulting in an increased concentration of PPi in the micro-environment of the cell. This can lead to severe disruption of skeletal mineralization [1, 2]. Other diseases with low PPi concentrations are associated with the pathological calcification of different tissues [1, 5] and can be traced back to genetic defects of ENPP1 [1]. The mevalonate pathway contributes to the composition of the micro-environment and hence to the homeostasis of phosphates [6, 7]. This constitutes a medically relevant possibility of influence, for example through bisphosphonates as a treatment for widespread diseases like Osteoporosis. This study analyzed the impact of a PPi exposure on the in vitro mineralization of human mesenchymal stem cells (hMSCs) in the process of osteogenic differentiation. For this purpose, we used enzymatic activity modulators for ALP, ENPP1 as well as for ANKH and the Mevalonate pathway (PPi, Pyridoxalphosphate, Probenecid, Vitamine D, PPADS (Pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2‘,4‘-disulfid acid) and ß-γmeATP (ß-γ Methylentriphosphate)). The results show no clear effects due to the modulation of the PPi concentration during osteogenic differentiation of hMSCs in vitro. Minor changes in genetic expression patterns cannot be ruled out due to an elevated variability among the donor cells, said discrepancy would have to be consolidated through an increased number of experiments. Altogether, this study shows unexpectedly low impacts of exogenic an endogenic modulation of the PPi concentration, in regards to the physical effects of mineralization as well as the genetic regulation of the key proteins involved. This could be a reflection of the compensation capacity of these mechanisms under physiological circumstances. In order to provide indepth insight into this matter, further examination on a proteomic level would be necessary, especially with an outlook onto the processing of polypeptides with mineralization-modulating effects. A promising strategy for future studies seems to be a further investigation of the effects of ENPP1. However, this approach will be confronted, especially due to inhibitors of ENPP1, with the complex networking of the phosphate metabolism (included ATP and his metabolites) with purinerg signaling. Due to its complexity, this interconnectedness generates considerable interpretation issues on a clinical as well as a cell biological level, which would have to be investigated further in future studies. The focus here should be put on two results of potential clinical significance for HPP-patients, namely the unfavorable effects on the ALPL-expression of a Probenecid therapy as well as the increased expression of ALPL during ENPP1 inhibition. 1. Dympna Harmey, L.H., Sonoko Narisawa, Kirsten A. Johnson, Robert Terkeltaub, José Luis Millán, Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphate and osteopontin by Akp2, Enpp1 and Ank. American Journal of Pathology, 2003. 164, No. 4: p. 1199-1209. 2. Manisha C Yadav, A.M.S.S., Sonoko Narisawa, Carmen Huesa, Marc D McKee, Colin Farquharson, José Luis Millán, Loss of Skeletal Mineralization by the Simultaneous Ablation of PHOSPHO1 and Alkaline Phosphatase Function: A Unified Model of the Mechanisms od Initiation of Skeletal Calcification. Journal of Bone and Mineral Research, 2011. 26, No2: p. 286-297. 3. Beck, C., Hypophosphatasia. Klin Padiatr, 2009: p. 219-226. 4. Harmey, D.e.a., Concerted Regulation of Inorganic Pyrophosphate and Osteopontin by Akp2, Enpp1, and Ank. American Journal of Pathology, 2004. 164: p. 1199-1209. 5. Peter Nürnberg, H.T., David Chandler et all, Heterozygous mutations in ANKH, the human ortholog of the mouse progressive ankylosis gene, result in craniometaphyseal dysplasia. Nature Genetics, May 2001. 28: p. 37-41. 6. Löffler, P., Heinrich, ed. Biochemie & Pathobiochemie. Vol. 8. 2007, Springer Verlag. 7. Joseph L. Goldstein, M.S.B., Regulation of the mevalonate Pathway. Nature Genetics, 1990. 343: p. 425-430. KW - Hypophosphatasie KW - Hypophosphatasia Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238529 ER - TY - THES A1 - Molinaro, Johannes-Nils T1 - Interaktion zwischen 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 und Retinsäure vermittelter Signaltransduktion in humanen mesenchymalen Stammzellen T1 - Interaction between 1,25-dihydroxy-vitamin D3 und retinoic acid mediated signal transduction in human mesenchymal stem cells N2 - Die Arbeit stellt mögliche Einflüsse durch 1,25- Dihydroxy-Vitamin D3 (1,25-VitD3) und Retinsäure (RA) in humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) sowohl während der adipogenen und osteogenen Differenzierung als auch während der Kurzzeit- und Langzeitstimulation auf das Mikromilieu dar. Die Stimulation mit 1,25-VitD3 und RA verlangsamt das Wachstumsverhalten und verändert die Zellmorphologie von hMSC. Effekte auf die Genexpression werden auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR dargestellt. Der Phänotyp als auch teilweise die Genexpression der osteogenen und adipogenen Differenzierung wird durch 1,25-VitD3 induziert und durch RA inhibiert. Zudem wird sowohl die „Mikromilieu-Zusammensetzung“ als auch das „Transkriptionssignal“ von 1,25-VitD3 und RA gegenseitig beeinflusst. N2 - The paper reports about possible effects of 1,25-dihydroxy-vitamin D3 (1,25-VitD3) und retinoic acid (RA) in human mesenchymal stem cells (hMSC) during adipogenic and osteogenic differentiation as well as effects on the microenvironment during a short and long time stimulation. Stimulation with 1,25-VitD3 and RA slows down the growth rate and alters cell morphology of hMSC. Effects on gene expression are shown at the mRNA level by means of RT-PCR. The phenotype and partly the gene expression of adipogenic and osteogenic differentiation are stimulated by 1,25-VitD3 and are inhibited by RA. In addition, both the “microenvironment composition” and the “transcription signal” of 1,25-VitD3 and RA are mutually influenced. KW - Vitamin D KW - Retinsäure KW - Vitamin D3 KW - all-trans-Retinsäure KW - 9-cis-Retinsäure KW - humane mesenchymle Stammzellen KW - osteogene Differenzierung KW - adipogene Differenzierung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249838 ER - TY - THES A1 - Kramer, Lisa Sophie T1 - Charakterisierung des Einflusses von Estrogenrezeptoren auf mechanoresponsive Reporter T1 - Characterization of the influence of estrogen receptors according to mechanoresponsive reporter N2 - Osteoporose wird definiert als erworbene, generalisierte Skeletterkrankung, die durch eine verminderte Knochenfestigkeit und einen pathologischen Knochenverlust charakterisiert wird. Durch die Störung der Mikroarchitektur kommt es zu strukturellen und funktionellen Defiziten im Sinne von Fragilitätsfrakturen. Mechanische Stimulation erhält die Gewebemasse und stimuliert deren kontinuierliche Anpassung. Östrogene spielen bei der Entwicklung, dem Wachstum und der Regeneration des Knochens eine bedeutende Rolle und wirken über Bindung an die Östrogenrezeptoren ER und ER in bestimmten Zielgeweben. Östrogenrezeptoren sind unverändert sehr geeignete Targets für die Entwicklung von Medikamenten im Rahmen der Osteoporosetherapie wie z.B. die selektiven Östrogen-Rezeptor-Modulatoren (SERMs). Die molekulare Klärung der Einflüsse von ER und ER ist unverändert von großer klinischer Bedeutung. Die Herstellung stabiler Zelllinien mit Überexpression von Reportergenkonstrukten und Rezeptoren kann dabei hilfreich sein. In dieser Arbeit wurde eine stabile Zelllinie mit Überexpression von ERβ etabliert, die unterschiedliche Wirkung von ER und ER wurden analysiert und die Effekte von zyklischer Dehnung auf Reportergenexpression unter der Kontrolle von mechanosensitiven responsiven Elementen wurden charakterisiert. N2 - Osteoporosis is defined as an acquired, generalized skeletal disorder which is characterized by reduced bone stability and pathological bone loss. A disorder of the microarchitecture leads to structural and functional deficiencies in the form of fragility fractures. Mechanical strain sustains tissue and stimulates its continuous adaptation. Estrogen plays an important role in the development, growth and regeneration of bones and works by binding to the estrogen receptors ERα und ERβ in certain target tissues. Estrogen receptors continue to be significant targets in the development of pharmaceuticals for osteoporosis therapy as for example selective estrogen receptor modulators (SERMs). The clarification of the influence of ERα and ERβ on a molecular level continue to be of great clinical significance. The creation of stable cell lines with overexpression of reporter gene constructs and receptors can be helpful in this. In this thesis a stable cell line with overexpression of ERβ was established, different effects of ERα und ERβ were analyzed and the effects of mechanical strain on reporter gene constructs under controlled mechanosensitive response elements were characterized. KW - Östrogene KW - Mechanorezeptor KW - Osteoporose KW - Östrogenrezeptor KW - osteoporosis KW - Mechanotransduktion KW - mechanoresponsive Elemente KW - estrogen receptor KW - mechanotransduction KW - mechanoresponsive elements Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-222709 ER -