TY - THES A1 - Schürlein, Sebastian T1 - Entwicklung von Technologien zur Optimierung von Tissue Engineering Prozessen am Beispiel der Herstellung von kardialem Gewebe T1 - Development of technologies to optimize tissue engineering processes, documented on the example of the generation of cardiac tissue N2 - Kardiovaskuläre Erkrankungen, wie beispielsweise der Herzinfarkt, sind die häufigste Todesursache weltweit. Bei einem Herzinfarkt sterben Areale des Herzens aufgrund einer Unterversorgung mit Blut ab. Da das Herzmuskelgewebe ein sogenanntes terminal differenziertes Gewebe ist, kommt es zu keiner Regeneration des Gewebes, mit der Folge einer Herzinsuffizienz beziehungsweise dem Tod des Patienten. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit zu einer Herztransplantation stellt das Tissue Engineering dar. Mit Hilfe des Tissue Engineerings können dreidimensionale Gewebe aufgebaut und kultiviert werden, um auf diese Weise ein funktionelles Gewebe zu erhalten, durch welches das abgestorbene Gewebeareal des Herzens zukünftig auch ersetzt werden könnte. In der vorliegenden Arbeit wurden notwendige Technologien für den Aufbau von Geweben entwickelt sowie erste Versuche für die Erzeugung eines funktionellen Herzmuskelgewebes durchgeführt. Beim Aufbau von dreidimensionalen Geweben finden Trägerstrukturen Anwendung, die mit Zellen besiedelt werden. Solche Trägerstrukturen können aus biologischen oder synthetischen Polymeren hergestellt sein oder aus der extrazellulären Matrix eines dezellularisierten Gewebes bestehen. Für eine standardisierte Dezellularisierung von Geweben wurde eine computergesteuerte Pumpeneinheit, für die Herstellung von Nanofaserscaffolds eine Elektrospinninganlage entwickelt. Mit Hilfe der Dezellularisierungseinheit können komplexe Organe, wie ein Herz im Ganzen, reproduzierbar dezellularisiert werden. Untersuchungen der mittels Elektrospinning hergestellten Nanofaserscaffolds, welche als Alternative zu der dezellularisierten, natürlichen Matrix eingesetzt werden können, zeigten bei allen hergestellten Zusammensetzungen eine Orientierung der Zellen entlang der Fasern. Die Kultivierung von Zellmatrixkonstrukten erfolgt im Tissue Engineering häufig unter dynamischen Bedingungen. Hierfür wurde ein mobiler Stand Alone Inkubator mit der erforderlichen Peripherie für eine Kultur unter Perfusion des Gewebes entwickelt. Als Weiterentwicklung des Stand Alone Inkubators ist eine modulare Bioreaktorplattform, bestehend aus Wärmetauscher, Beutelpumpe und Gasaustauscher, aufgebaut worden. In dieses System kann über Standard Anschlüsse jegliche Art von Bioreaktor in das System eingebunden werden. Durch die Kompaktheit des Systems ist es möglich mehrere Ansätze parallel auf engem Raum durchzuführen. Die Funktion der Plattform, wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Gewebekultur einer nativen porzinen Karotis nachgewiesen. Für den Aufbau des kardialen Gewebes dient die small intestinal submucosa ohne Serosa (SISser) als Trägerstruktur. Der Aufbau des Gewebekonstrukts erfolgte in verschiedenen Ansätzen unter Einsatz verschiedener Zellarten. Native, aus Herzbiopsien generierte Cardiosphere derived cells (CDCs) verteilten sich gleichmäßige über die Oberfläche der Matrix, jedoch konnten immunhistologisch keine spezifischen kardialen Marker bei den artifiziellen Geweben nachgewiesen werden. Zellmatrixkonstrukte aus einer Mono Kultur von Kardiomyozyten, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) sowie einer Co Kultur dieser Kardiomyozyten mit mesenchymalen Stammzellen und Zellen aus einer Herzbiopsie zeigten nach wenigen Tagen in Kultur ein kontraktiles Verhalten. Immunhistologische Färbungen der beiden Gewebe bestätigten die Expression der spezifischen kardialen Marker, wie beispielsweise kardiales Troponin T, kardiales Troponin C und alpha Actinin. Die Kardiomyozyten der Mono Kultur sind jedoch nicht über die gesamte Matrixoberfläche verteilt, sondern bilden Aggregate. Bei der Co Kultur kann eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf der Matrix beobachtet werden. Der vielversprechendste Ansatz für den Aufbau eines Herzmuskelgewebes, welches als Implantat oder Testsystem eingesetzt werden kann, bildet nach den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, ein Konstrukt aus der SISser und der Co Kultur der Zellen. Allerdings muss die Zusammensetzung der Co Kultur sowie das Verhältnis der Zellzahlen optimiert werden. N2 - Cardiovascular diseases as myocardial infarction are the most frequent cause of death worldwide. During a myocardial infarction, areas of the heart are being damaged because of an insufficient nutrient supply. Heart tissue is a terminal differentiated tissue, this means that it can’t be regenerated by itself. The consequence of this characteristic is a heart insufficiency or the death of the patient. An alternative treatment to heart transplantation is promised by tissue engineering. By using the methods of tissue engineering, cells can be cultured on a scaffold to generate a mature tissue, which can be used to replace the damaged areas of the heart. In the present work systems for the generation of tissues have been developed and first experiments to build up a functional cardiac patch were performed. To generate three-dimensional tissues, scaffolds colonized with cells are necessary. These scaffolds can be produced with biological or synthetic polymers or even decellularized tissues can be used. A computer controlled decellularization platform was designed to ensure a standardized, reproducible decellularization of complex organs like hearts. Furthermore, an electrospinning device was developed for the production of nanofiber scaffolds. On such matrices, seeded cells grow along the fibers. Most cell-matrix-constructs are cultured under dynamic conditions in tissue engineering. A stand alone incubator system containing the required periphery to apply different culture conditions was developed. As further development a compact modular bioreactor platform consisting of a heat exchanger, a bag pump and a gas exchanger was established. All kinds of bioreactors can be enclosed to the system via standard Luer Lock Connectors. Due to the compactness of the system, it is possible to parallelize and run experiments easily on narrow space. The functionality of the platform was demonstrated by a tissue culture of a native porcine carotid artery. The small intestinal submucosa without serosa (SISser) was employed as matrix for the development of a functional cardiac patch. In different experiments diverse cell types were used to generate a cardiac construct. Cardiosphere derived cells (CDC) seeded on the SISser showed an equal distribution all over the surface of the matrix, but no expression of specific cardiac markers. Constructs consisting of a mono culture of induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes (CM iPS cells) or a co culture of CM iPS cells, mesenchymal stem cells and cells isolated form a heart biopsy showed a contraction of the whole matrix after a few days in culture. Furthermore, cardiac markers like cardiac troponin T, cardiac troponin C and alpha actinin could be observed by immunohistological staining. Regarding the morphology of the different tissues, the mono culture of the CM iPS cells formed agglomerates on the surface of the matrix whereas the co culture showed a well distribution of the cells all over the surface of the matrix. Consequently, the co culture on the SISser is the most promising approach for the development of a functional cardiac patch. However, the combination of cell types within the co culture and their ratio has to be optimized. KW - Tissue Engineering KW - Herzmuskel KW - Bioreaktorplattform KW - Elektrospinning KW - kardiales Tissue Engineering KW - kardiales Gewebe KW - bioreactor plattform KW - electrospinning KW - cardiac tissue engineering KW - Biomaterial KW - Gewebekultur Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142432 ER - TY - THES A1 - Klug, Alexander T1 - Biomechanische und zellbiologische Untersuchung zu augmentierten Biomaterial-basierten Kreuzbandkonstrukten T1 - Mechanical and cell-biological properties of crosslinked kollagen scaffolds for acl reconstruction N2 - Aktueller Goldstandard bei der Rekonstruktion des ACL des Menschen sind au-tologe Transplantate. Diese sind allerdings je nach Entnahmeort mit einer mehr oder weniger hohen Entnahmemorbidität und dem Risiko für Folgeerkrankungen verbunden. Um dies zu umgehen, wurde ein xenogenes Kollagenimplantat aus Kollagen-I-Fasern von Ratten entwickelt und das native Konstrukt bereits in einer Vorläuferstudie getestet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Kreuzbandkonstrukte mit Hilfe diverser Crosslinker modifiziert und hinsichtlich ihrer Biomechanik, Biokompatibilität und ihres in-vivo Verhaltens untersucht. Bewusst wurde dabei auf die Zellbesiedlung dieser Konstrukte verzichtet, da un-ter Berücksichtigung wirtschaftlicher Gesichtspunkte eines späteren humanen Einsatzes hierfür eine Arzneimittelzulassung notwendig gewesen wäre. Mit Hilfe der Crosslinker wurde versucht, die mechanische Stabilität sowie die Resistenz gegen kollagenabbauende Enzyme der Synovia zu erhöhen, um die Gefahr post-operativer Instabilitäten zu verringern. Dabei sollten Fragen bezüglich Immun-antwort, Biokompatibilität sowie Biodegradierbarkeit genau berücksichtigt wer-den. Als Crosslinker wurden für einen Vergleich in vitro neben 0,5 % Genipin auch 10 % HMDI sowie Glukose und EDC/NHS herangezogen. Dabei zeigten die Genipin-gecrosslinkten Einzelfasern die größte Reißfestigkeits-zunahme, wohingegen auf Minikonstruktbasis 10 % HMDI zu den höchsten UTS-Werten führte. Ebenso ließen sich bezüglich der Biokompatibilutät in vitro bei den Crosslinkern 0,5 % Genipin und 10 % HMDI Vorteile gegenüber den beiden an-deren erkennen. Schließlich erfolgte im Rahmen eines Tierversuchs an 16 Minipigs der Einbau von 0,5 % Genipin-gecrosslinkten Konstrukten als Kreuzbandersatz und an-schließend die biomechanische Testung sowie nach Paraffineinbettung auch eine durchlichtmikrokopische deskriptive Auswertung der Transplantate. Während nach 6 Wochen eine deutliche Reißfestigkeitsabnahme zu verzeichnen war, erreichte diese nach 6 Monaten wieder fast 60 % ihrer ursprünglichen UTS. Somit konnte ein Remodeling des eingesetzten Implantats angenommen wer-den. Dies bestätigte sich in der durchgeführten histologischen Untersuchung. Hier war das Implantat deutlich vaskularisiert, von zahlreichen Fibroblasten durchsetzt und wies eine synoviale Deckschicht auf. Allerdings scheint vor allem wegen der Schwäche der Konstrukte nach 6 Wochen sowie den vermutlich auf-grund des Crosslinkers auftretenden Reaktionserscheinungen innerhalb des Kniegelenks ein Einsatz im humanen Bereich zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht ausgereift. Dennoch lässt sich gerade anhand des stattfindenden Remodelings das große Potential kollagenbasierter Materialien für den Kreuzbandersatz erkennen. Eine weitere Optimierung des bestehenden Konstrukts sollte deshalb forciert werden. N2 - We developed an ACL-scaffold consisting of crosslinked preformed rat collagen fibres. In this study we examined the influence of several crosslinking substances on the mechanical and cell-biological properties of this scaffold in vitro as well as in vivo as part of a minipig model. The results were promising thus more studies have to be made before an use for humans can be recommended. KW - Tissue Engineering KW - Kreuzband Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142379 ER - TY - THES A1 - Schweinlin, Matthias Oliver T1 - Development of advanced human intestinal in vitro models T1 - Entwicklung von erweiterten humanen intestinalen in vitro Modellen N2 - The main function of the small intestine is the absorption of essential nutrients, water and vitamins. Moreover, it constitutes a barrier protecting us from toxic xenobiotics and pathogens. For a better understanding of these processes, the development of intestinal in vitro models is of great interest to the study of pharmacological and pathological issues such as transport mechanisms and barrier function. Depending on the scientific questions, models of different complexity can be applied. In vitro Transwell® systems based on a porous PET-membrane enable the standardized study of transport mechanisms across the intestinal barrier as well as the investigation of the influence of target substances on barrier integrity. However, this artificial setup reflects only limited aspects of the physiology of the native small intestine and can pose an additional physical barrier. Hence, the applications of this model for tissue engineering are limited. Previously, tissue models based on a biological decellularized scaffold derived from porcine gut tissue were demonstrated to be a good alternative to the commonly used Transwell® system. This study showed that preserved biological extracellular matrix components like collagen and elastin provide a natural environment for the epithelial cells, promoting cell adhesion and growth. Intestinal epithelial cells such as Caco-2 cultured on such a scaffold showed a confluent, tight monolayer on the apical surface. Additionally, myofibroblasts were able to migrate into the scaffold supporting intestinal barrier formation. In this thesis, dendritic cells were additionally introduced to this model mimicking an important component of the immune system. This co-culture model was then successfully proven to be suitable for the screening of particle formulations developed as delivery system for cancer antigens in peroral vaccination studies. In particular, nanoparticles based on PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA and Chitosan were tested. Uptake studies revealed only slight differences in the transcellular transport rate among the different particles. Dendritic cells were shown to phagocytose the particles after they have passed the intestinal barrier. The particles demonstrated to be an effective carrier system to transport peptides across the intestinal barrier and therefore present a useful tool for the development of novel drugs. Furthermore, to mimic the complex structure and physiology of the gut including the presence of multiple different cell types, the Caco-2 cell line was replaced by primary intestinal cells to set up a de novo tissue model. To that end, intestinal crypts including undifferentiated stem cells and progenitor cells were isolated from human small intestinal tissue samples (jejunum) and expanded in vitro in organoid cultures. Cells were cultured on the decellularized porcine gut matrix in co-culture with intestinal myofibroblasts. These novel tissue models were maintained under either static or dynamic conditions. Primary intestinal epithelial cells formed a confluent monolayer including the major differentiated cell types positive for mucin (goblet cells), villin (enterocytes), chromogranin A (enteroendocrine cells) and lysozyme (paneth cells). Electron microscopy images depicted essential functional units of an intact epithelium, such as microvilli and tight junctions. FITC-dextran permeability and TEER measurements were used to assess tightness of the cell layer. Models showed characteristic transport activity for several reference substances. Mechanical stimulation of the cells by a dynamic culture system had a great impact on barrier integrity and transporter activity resulting in a tighter barrier and a higher efflux transporter activity. In Summary, the use of primary human intestinal cells combined with a biological decellularized scaffold offers a new and promising way to setup more physiological intestinal in vitro models. Maintenance of primary intestinal stem cells with their proliferation and differentiation potential together with adjusted culture protocols might help further improve the models. In particular, dynamic culture systems and co culture models proofed to be a first crucial steps towards a more physiological model. Such tissue models might be useful to improve the predictive power of in vitro models and in vitro in vivo correlation (IVIVC) studies. Moreover, these tissue models will be useful tools in preclinical studies to test pharmaceutical substances, probiotic active organisms, human pathogenic germs and could even be used to build up patient-specific tissue model for personalized medicine. N2 - Die Hauptfunktion des Dünndarms besteht in der Aufnahme von lebenswichtigen Nährstoffen, Wasser und Vitaminen. Zudem stellt er eine Barriere dar, die uns vor toxischen Fremdstoffen und Pathogenen schützt. Um diese Prozesse besser zu verstehen, ist die Entwicklung neuer in vitro Modellen des Darms von großem Interesse um pharmakologische und pathologische Studien durchzuführen. Abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung können Modelle von unterschiedlicher Komplexität zur Anwendung kommen. In vitro Transwell® Systeme basierend auf einer porösen PET-Membran ermöglichen die Untersuchung von Transportmechanismen über die intestinal Barriere und den Einfluss von Wirkstoffen auf deren Integrität. Dieser künstliche Aufbau ähnelt jedoch nur eingeschränkt der Physiologie des Dünndarms und kann eine zusätzliche physikalische Barriere darstellen. Die Anwendungsmöglichkeiten dieses Modells im Tissue Engineering sind daher begrenzt. Gewebemodelle basierend auf einer dezellularisierten biologischen Matrix hergestellt aus Schweinedarmgewebe haben sich als gute Alternative zum herkömmlichen Transwell® System herausgestellt. Diese Studie zeigt, dass die erhaltenen Komponenten der biologischen Extrazellulärmatrix wie Kollagen und Elastin eine natürliche Umgebung für die Epithelzellen bieten und Zelladhäsion und Wachstum der Zellen fördern. Darmepithelzellen wie Caco-2 Zellen, welche auf einer solchen Matrix kultiviert wurden, bildeten einen konfluenten, dichten Monolayer auf der apikalen Oberfläche aus. Zusätzlich ermöglichte dieser Aufbau die Migration von Myofibroblasten in die Matrix, was die Bildung der intestinalen Barriere unterstützt. In dieser Doktorarbeit wurden zusätzlich dendritische Zellen als wichtige Komponente des adaptiven Immunsystems in das Modell integriert. Dieses Ko-Kultur Modell erwies sich als geeignet um partikuläre Formulierungen zu testen, welche als Transportsysteme für Tumorantigene entwickelt wurden. Es wurden Partikel basierend auf PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA und Chitosan untersucht. Aufnahmestudien ergaben nur geringfügige Unterschiede in den Transportraten zwischen den verschiedenen Partikeln. Es konnte ausserdem gezeigt werden, dass dendritische Zellen die Partikel phagozytieren, nachdem sie die intestinale Barriere überwunden haben. Die Partikel erwiesen sich als effektives Transportsystem um Peptide über die intestinale Barriere zu schleusen und stellen daher ein nützliches Werkzeug für die Entwicklung neuartiger Medikamente dar. Um die komplexe Struktur und Physiologie des Darms noch besser nachzustellen, wurde für den Aufbau des Modells die Caco-2 Zelllinie durch primäre Darmzellen ersetzt. Die Darmkrypten, welche undifferenzierte Stammzellen und Vorläuferzellen enthalten, wurden aus humanen Dünndarmgewebe, dem Jejunum, isoliert und in vitro expandiert. Die Zellen wurden zusammen mit Myofibroblasten auf der dezellularisierten Schweinedarmmatrix, unter statischen und dynamischen Bedingungen, kultiviert. Die primären Darmepithelzellen bildeten einen konfluenten Monolayer, welcher alle differenzierten intestinalen Zelltypen aufwies, gezeigt durch Zellen positiv für Mucin (Becherzellen), Villin (Enterozyten), Chromogranin A (enteroendokrine Zellen) und Lysozym (Paneth-Zellen). Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie ließen sich essentielle funktionelle Einheiten eines intakten Epithels darstellen, wie die Mikrovilli und Tight Junctions. Um die Dichtigkeit des Epithels zu überprüfen wurde mit FITC-Dextran die Permeabilität bestimmt und TEER-Messungen durchgeführt. Die Modelle zeigten einen charakteristischen Transport für mehrere Referenzsubstanzen. Mechanische Stimulation durch ein dynamisches Kultivierungssystem hatte einen starken Einfluss auf die Barriereintegrität und Transporteraktivität der Modelle, was sich in einer dichteren Barriere und erhöhten Efflux-Transporteraktivität widerspiegelte. Alles in allem bietet die Verwendung primärer intestinaler Zellen in Kombination mit einer dezellularisierten biologischen Matrix eine neue, vielversprechende Möglichkeit physiologischere in vitro Modelle des Darms aufzubauen. Der Erhalt intestinaler Stammzellen mit ihrem Proliferations- und Differenzierungspotential zusammen mit angepassten Protokollen könnte dabei helfen die Modelle weiter zu verbessern. Insbesondere die dynamische Kultivierung und die Ko-Kultur-Modelle erwiesen sich als entscheidender Schritt auf dem Weg zu physiologischeren Modellen. Solche Gewebemodelle könnten sich als nützlich erweisen, wenn es darum geht die Vorhersagekraft der in vitro Modelle, sowie die in vitro-in vivo Korrelation zu verbessern. Solche Gewebemodelle können ein nützliches Werkzeuge in der präklinischen Forschung für die Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen, probiotisch aktiven Organismen, sowie humaner pathogener Keime sein und sogar zum Aufbau personalisierter Modelle für die regenerative Medizin dienen. KW - Tissue Engineering KW - in vitro KW - Dünndarm KW - intestinal in vitro model KW - intestine Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142571 ER - TY - THES A1 - Schönwälder, Sina Maria Siglinde T1 - Entwicklung und Charakterisierung von Gelatine-basierten Hydrogelen und PLGA-basierten Janus-Partikeln T1 - Development and characterization of gelatin-based hydrogels and PLGA-based Janus particles N2 - Zusammenfassung In der Regenerativen Medizin sind polymerbasierte Biomaterialien von großer Bedeutung für die Entwicklung und Anwendung verbesserter bzw. neuer Therapien. Die Erforschung der Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien, welche als Implantate eingesetzt werden, ist eine grundlegende Voraussetzung für deren erfolgreichen Einsatz. Die Protein-Oberflächen- Interaktion geschieht initial, sobald ein Implantat mit Körperflüssigkeiten oder mit Gewebe in Kontakt kommt, und trägt maßgeblich zur direkten Wechselwirkung von Implantat und umgebenden Zellen bei. Dieser Prozess wird in der vorliegenden Arbeit an Gelatine untersucht. Daher bestand ein Ziel darin, stabile, nanometerdünne Gelatineoberflächen herzustellen und darauf die Adsorption von humanen Plasmaproteinen und bakteriellen Proteinen zu analysieren. Die Abscheidung der Gelatinefilme in variabler Schichtdicke auf zuvor mit PPX-Amin modifizierten Oberflächen wurde unter Verwendung eines Rotationsbeschichters durchgeführt. Um stabile Hydrogelfilme zu erhalten, wurden die Amingruppen der disaggregierten Gelatinefibrillen untereinander und mit denen der Amin-Modifizierung durch ein biokompatibles Diisocyanat quervernetzt. Dieser Prozess lieferte einen reproduzierbaren und chemisch stabilen Gelatinefilm, welcher durch die substratunabhängige Amin-Modifizierung kovalent auf unterschiedlichste Oberflächen aufgebracht werden konnte. Die durch den Herstellungsprozess präzise eingestellte Schichtdicke (Nano- bzw. Mikrometermaßstab) wurde mittels Ellipsometrie und Rasterkraftmikroskopie ermittelt. Die ebenso bestimmte Rauheit war unabhängig von der Schichtdicke sehr gering. Gelatinefilme, die auf funktionalisierte und strukturierte Proben aufgebracht wurden, konnten durch Elektronenmikroskopie dargestellt werden. Mit Hilfe der Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie wurden die Gelatinefilme im Hinblick auf ihre Stabilität chemisch charakterisiert. Zur Quantifizierung der Adsorption humaner Plasmaproteine (Einzelproteinlösungen) und komplexer Proteingemische aus steril filtrierten Kulturüberständen des humanpathogenen Bakteriums Pseudomonas aeruginosa wurde die Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung eingesetzt. Hiermit konnte nicht nur die adsorbierte Menge an Proteinen auf dem Gelatinehydrogel bzw. Referenzoberflächen (Gold, PPX-Amin, Titan), sondern auch die viskoelastischen Eigenschaften des adsorbierten Proteinfilms bestimmt werden. Allgemein adsorbierte auf dem Gelatinehydrogel eine geringere Proteinmasse im Vergleich zu den Referenzoberflächen. Circa ein Viertel der adsorbierten Proteine migrierte in die Poren des gequollenen Gels und veränderte dessen viskoelastische Eigenschaften. Durch anschließende MALDI-ToF/MS- und MS/MS-Analyse konnten die bakteriellen Proteine auf den untersuchten Oberflächen identifiziert und untereinander verglichen werden. Hierbei zeigten sich nur geringfügige Unterschiede in der Proteinzusammensetzung. Zudem wurde eine Sekundärionenmassenspektrometrie mit Flugzeitanalyse an reinen Gelatinefilmen und an mit humanen Plasmaproteinen beladenen Gelatinefilmen durchgeführt. Durch eine anschließende multivariante Datenanalyse konnte zwischen den untersuchten Proben eindeutig differenziert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Adsorption von unterschiedlichen Proteinen auf proteinbasierten Oberflächen markierungsfrei zu untersuchen und kann zur Aufklärung der in vivo-Situation beitragen. Darüber hinaus bietet dieser Untersuchungsansatz neue Perspektiven für die Gestaltung und das schnelle und effiziente Screening von unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen. Biomaterialien können jedoch nicht nur als Implantate oder Implantatbeschichtungen eingesetzt werden. Im Bereich des drug delivery und der Depotarzneimittel sind biologisch abbaubare Polymere, aufgrund ihrer variablen Eigenschaften, von großem Interesse. Die Behandlung von bakteriellen und fungalen Pneumonien stellt insbesondere bei Menschen mit Vorerkrankungen wie Cystische Fibrose oder primäre Ziliendyskinesie eine große Herausforderung dar. Oral oder intravenös applizierte Wirkstoffe erreichen die Erreger aufgrund der erhöhten Zähigkeit des Bronchialsekretes oft nicht in ausreichender Konzentration. Daher besteht ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit darin, mittels electrohydrodynamic cojetting mikrometergroße, inhalierbare, wirkstoffbeladene Partikel mit zwei Kompartimenten (Janus-Partikel) herzustellen und deren Eignung für die therapeutische Anwendung bei Lungeninfektionen zu untersuchen. Durch das in dieser Arbeit entwickelte Lösungsmittelsystem können Janus-Partikel aus biologisch abbaubaren Co-Polymeren der Polymilchsäure (Poly(lactid-co-glycolid), PLGA) hergestellt und mit verschiedenen Wirkstoffen beladen werden. Darunter befinden sich ein Antibiotikum (Aztreonam, AZT), ein Antimykotikum (Itraconazol, ICZ), ein Mukolytikum (Acetylcystein, ACC) und ein Antiphlogistikum (Ibuprofen, IBU). Die Freisetzung der eingelagerten Wirkstoffe, mit Ausnahme von ICZ, konnte unter physiologischen Bedingungen mittels Dialyse und anschließender Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden. Die Freisetzungsrate wird von der Kettenlänge des Polymers beeinflusst, wobei eine kürzere Kettenlänge zu einer schnelleren Freisetzung führt. Das in die Partikel eingelagerte Antimykotikum zeigte in vitro eine gute Wirksamkeit gegen Aspergillus nidulans. Durch das Einlagern von ICZ in die Partikel ist es möglich diesen schlecht wasserlöslichen Wirkstoff in eine für Patienten zugängliche und wirksame Applikationsform zu bringen. In Interaktion mit P. aeruginosa erzielten die mit Antibiotikum beladenen Partikel in vitro bessere Ergebnisse als der Wirkstoff in Lösung, was sich in einem in vivo-Infektionsmodell mit der Wachsmotte Galleria mellonella bestätigte. AZT-beladene Partikel hatten gegenüber einer identischen Wirkstoffmenge in Lösung eine 27,5% bessere Überlebensrate der Wachsmotten zur Folge. Des Weiteren hatten die Partikel keinen messbaren negativen Einfluss auf die Wachsmotten. Dreidimensionale Atemwegsschleimhautmodelle, hergestellt mit Methoden des Tissue Engineerings, bildeten die Basis für Untersuchungen der Partikel in Interaktion mit humanen Atemwegszellen. Die Untersuchung von Apoptose- und Entzündungsmarkern im Überstand der 3D-Modelle zeigte diesbezüglich keinen negativen Einfluss der Partikel auf die humanen Zellen. Diese gut charakterisierten und standardisierten in vitro-Testsysteme machen es möglich, Medikamentenuntersuchungen an menschlichen Zellen durchzuführen. Hinsichtlich der histologischen Architektur und funktionellen Eigenschaften der 3D-Modelle konnte eine hohe in vitro-/in vivo-Korrelation zu menschlichem Gewebe festgestellt werden. Humane Mucine auf den 3D-Modellen dienten zur Untersuchung der schleimlösenden Wirkung von ACC-beladenen Partikeln. Standen diese in räumlichem Kontakt zu den Mucinen, wurde deren Zähigkeit durch das freigesetzte ACC herabgesetzt, was qualitativ mittels histologischen Methoden bestätigt werden konnte. Die in dieser Arbeit entwickelten Herstellungsprotokolle dienen als Grundlage und können für die Synthese ähnlicher Systeme, basierend auf anderen Polymeren und Wirkstoffen, modifiziert werden. Gelatine und PLGA erwiesen sich als vielseitig einsetzbare Werkstoffe und bieten eine breite Anwendungsvielfalt in der Regenerativen Medizin, was die erzielten Resultate bekräftigen. N2 - In the field of regenerative medicine, polymer-based biomaterials are of great importance for the development and application of improved or new therapies. The research on the surface properties of biomaterials, which are used as implants, is essential for their successful use. The protein-surface interaction is the initial step and occurs when an implant comes into contact with bodily fluids or tissues and significantly increases direct interaction of the implant and the surrounding cells. This thesis investigates these processes on gelatin. Accordingly, one of the project’s major goals was to produce stable nanometer-thin gelatin surfaces and analyze the adsorption of human plasma and bacterial proteins. The deposition of gelatin films and the assortment of layer thicknesses on PPX-amine modified surfaces were carried out using a spin coater. To gain hydrogel films with reproducible properties, the amine groups of the disaggregated gelatin fibrils were cross- linked with each other and with those of the amine modification by a biocompatible diisocyanate. The result was a reproducible and chemically stable gelatin film, which could be applied to a wide variety of surfaces through the substrate-independent amine modification. The manufacturing process precisely adjusted the layer thickness to the nano- or micrometer scale which could be determined applying ellipsometry and atomic- force microscopy. The roughness was very low regardless of the layer thickness. Gelatin films applied to the functionalized and patterned samples could be visualized by electron microscopy. With the help of infrared reflection absorption spectroscopy, the gelatin films were chemically characterized in terms of stability. The adsorption of human plasma proteins (single protein solutions) as well as the complex protein mixtures of sterile filtered supernatants belonging to Pseudomonas aeruginosa, a human pathogenic bacterium, were quantified by quartz crystal microbalance with dissipation monitoring. Both the adsorbed amount of proteins on the gelatin hydrogel or reference surfaces (gold, PPX-amine, titanium) and the viscoelastic properties of the adsorbed protein film were determined. In general, there was less protein mass adsorbed on the gelatin hydrogel compared to the reference surfaces. About a quarter of the adsorbed proteins migrated into the pores of the swollen gel and changed its viscoelastic properties. Subsequent MALDI-ToF/MS and MS/MS analysis were used to identify and compare the adsorbed bacterial proteins on the investigated surfaces. Only slight differences were found in the adsorbed protein composition. A secondary ion mass spectrometry with time-of-flight analysis was performed on pure gelatin films and gelatin films loaded with human plasma proteins. By subsequent multivariate data analysis, it was possible to clearly differentiate between the examined samples. Not only does this approach enable us to screen the adsorption of different proteins on protein-based surfaces without labeling, but it also contributes to the elucidation of the in vivo-situation. ach provides new perspectives regarding the design and efficient screening of different protein compositions. ... KW - PLGA KW - Partikel KW - Gelatine KW - Polylactid-co-Glycolid KW - Hydrogel KW - Tissue Engineering Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142636 ER - TY - THES A1 - Appelt-Menzel, Antje T1 - Etablierung und Qualifizierung eines humanen Blut-Hirn-Schranken-Modells unter Verwendung von induziert pluripotenten und multipotenten Stammzellen T1 - Establishment and qualification of a human blood-brain barrier model by use of human induced pluripotent stemm cells an multipotent stem cells N2 - Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005). Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen. Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER) unter 150 · cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte von mehr als 1500 · cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann. Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren Bedingungen bereitzustellen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A) zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt. Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren, wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen. Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte von bis zu 2500 · cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für weiterführende Studien ausgewählt. Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin, Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt. Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten: Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt. Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten denkbar. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro- Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt. Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden. N2 - The blood-brain barrier (BBB) presents one of the tightest and most important barriers between the blood circulation and the central nervous system (CNS). The BBB consists of specialized endothelial cells, which line the cerebral capillaries and are connected through very dense tight junctions (TJs). Together with pericytes, astrocytes, neurons, microglial cells and the extracellular matrix of the basal membrane of the brain capillaries, they form a dynamic and complex regulatory system, the so-called neurovascular unit (Hawkins and Davis 2005). The main functions of the BBB can be divided into three subgroups, the physical-, metabolic- and transport-barrier (Neuhaus and Noe 2010). The BBB mainly serves to maintain the homeostasis of the CNS and for protection against neurotoxical substances and pathogens, such as bacteria and viruses. Moreover, the BBB ensures the supply of neurons with nutrients and regulatory substances. Furthermore, it is responsible for the efflux of CNS metabolism waste products. For the development of drugs applied for the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and Multiple Sclerosis or even brain tumors, the tightness of the BBB models towards substances and the high metabolic activity of the endothelial cells pose a problem. Numerous drugs cannot overcome the BBB in sufficient enough concentration to reach the target location or they are metabolized before transportation and thus become less effective. Moreover, defects of the BBB play a decisive role in the manipulation of the pathogenesis of numerous CNS diseases. Due to the high demand for test systems in basic and preclinical research of drug development and infection studies, a range of different BBB models have been developed. Besides the in silico, acellular in vitro and in vivo models, numerous cell-based BBB models have been developed. However, standardized models based on immortalized cell lines show only inhomogeneous TJ expression and possess low barrier integrity which is detected through transendothelial electrical resistance (TEER) below 150 · cm2 (Deli et al. 2005). In comparison, the TEER values in animal tests reached more than 1500 · cm2 at the BBB (Butt et al. 1990; Crone and Olesen 1982). The availability of human primary BBB cells is highly limited. Moreover, using human primary BBB cells is an extremely serious matter, not only in respect of ethical aspects. Human brain cells can, for instance, be isolated from biopsy or autopsy material obtained from patients suffering epilepsy or brain cancer. However, there is the risk that the isolated cells are altered due to disease, which may significantly change the features of the BBB models. An alternative to avoid such problems and to provide standardized human BBB models by the use of reproducible conditions, is the application of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). In this context, it has been successful to differentiate hiPSCs in vitro – under established and reproducible methods – into endothelial cells of the BBB (hiPS-ECs), neural stem cells (hiPS-NSCs) as well as astrocytes (hiPS-A) (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013; Reinhardt et al. 2013) and to use them for model establishment. The endothelial cells were examined for the existence and the functionality of endothelial-specific markers as well as specific transporters by protein- and gene-based methods. Within this work, the croypreservation of hiPS-EC progenitors was established. This will allow an increase of the spatial and temporal flexibility while working with the stem cell based models as well as the establishment of standardized cell banks. Furthermore, multipotent NSCs, isolated from fetal brain biopsies (fNSCs), were used as a control population for hiPSC-NSCs and for BBB modelling. In order to imitate the in vivo BBB in the best possible way and to optimize model characteristics, a set of ten different BBB models based on primary cells, hiPSCs and fNSCs was analyzed. Model establishment was done by the use of transwell systems. By the systematically analysis of the influence of the different neurovascular unit cell types on barrier integrity and on endothelial cell gene expression, the quadruple culture with pericytes, astrocytes and hiPS-NSCs was identified demonstrating the most physiological properties. Due to the significant increase of TEER results up to 2500 · cm2 as well as the at least 1.5-fold increase in gene expression of BBB relevant transporter and TJ markers compared to the mono-cultures, this model was selected for further studies. The presence of a complex in vivo-like TJ network, based on occludin, claudin 1, 3, 4 and 5 was detected by quantitative reale time PCR, Western blot analyses as well as on ultrastructural level by freeze fracture electron microscopy and transmission electron microscopy. Beside the limitation of the paracellular permeability, proven by the low permeation of FITC dextran (4 kDa and 40 kDa), fluorescein and Lucifer yellow, the BBB represents also a barrier for transcellular transported substances. A model evaluation, to assess the models qualification to be used for drug screenings, was proven by transport studies based on BBB relevant reference substances. The classification of the test substances was made analog their permeation rates: diazepam and caffeine are classified as fast, ibuprofen, celecoxib and diclofenac as medium, and loratadine and rhodamine 123 as slow permeating substances. Within our tests, this ranking based on literature data could be confirmed by using the quadruple-culture models, only caffeine was transported with a significantly decreased permeation coefficient compared to the mono-cultures. Furthermore, the implementation of the hiPSC technology allows the generation of a large quantity of human somatic cell types form only one single stem cell line and their provision for specific applications. Within this work it was shown, that by the use of an in-house constructed stirred tank bio-reactor, providing defined culture conditions, a reproducible expansion of hiPSCs was enabled. On this basis, a high throughput drug screening might be possible. The data presented within this work demonstrate the establishment of a stem cell based in vitro quadruple-model of the human BBB with in vivo-like characteristics. All minimal requirements for human BBB modeling, including the reproducibility of the results, adequate characterization with regard on the permeability of reference components, expression of BBB transporters as well as the robust and physiological morphology are fulfilled. The established BBB model can be used in pharmaceutical drug development. In preclinical research adequate qualified models are asked for toxicity and transport studies with new developed substances in order to allow a better in vitro-in vivo correlation of the results. Moreover, the model can be used to develop mechanisms to selectively overcome the barrier. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Stammzelle KW - Zelldifferenzierung KW - In vitro KW - Endothelzelle KW - induziert pluripotente Stammzelle KW - multipotente Stammzelle KW - in vitro Modell KW - Neurovaskuläre Einheit KW - Neurale Stammzellen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134646 ER - TY - THES A1 - Rosenbaum, Corinna T1 - The role of enteric glial cells under inflammatory conditions of the intestine T1 - Die Rolle von enterischen Gliazellen unter entzündlichen Bedingungen im Darm N2 - The enteric nervous system (ENS) innervates the gastrointestinal (GI) tract and controls central aspects of GI physiology including contractility of the intestinal musculature, glandular secretion and intestinal blood flow. The ENS is composed of neurons that conduct electrical signals and of enteric glial cells (EGCs). EGCs resemble central nervous system (CNS) astrocytes in their morphology and in the expression of shared markers such as the intermediate filament protein glial fibrillary acidic protein (GFAP). They are strategically located at the interface of ENS neurons and their effector cells to modulate intestinal motility, epithelial barrier stability and inflammatory processes. The specific contributions of EGCs to the maintenance of intestinal homeostasis are subject of current research. From a clinical point of view EGC involvement in pathophysiological processes such as intestinal inflammation is highly relevant. Like CNS astrocytes ECGs can acquire a reactive, tissue-protective phenotype in response to intestinal injury. In patients with chronic inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease and ulcerative colitis, alterations in the EGC network are well known, particularly a differential expression of GFAP, which is a hallmark of reactive gliosis in the CNS. With increasing recognition of the role of EGCs in intestinal health and disease comes the need to study the glial population in its complexity. The overall aim of this thesis was to comprehensively study EGCs with focus on the reactive GFAP-expressing subpopulation under inflammatory conditions in vivo and in vitro. In a first step, a novel in vivo rat model of acute systemic inflammation mimicking sepsis was employed to investigate rapidly occuring responses of EGCs to inflammation. This study revealed that within a short time frame of a few hours, EGCs responded to the inflammation with an upregulation of Gfap gene expression. This inflammation-induced upregulation was confined to the myenteric plexus and varied in intensity along the intestinal rostro-caudal axis. This highly responsive myenteric GFAP-expressing EGC population was further characterized in vivo andin vitro using a transgenic mouse model (hGFAP-eGFP mice). Primary purified murine GFAP-EGC cultures in vitro were established and it was assessed how the transcriptomic and proteomic profiles of these cells change upon inflammatory stimulation. Here, myenteric GFAP-EGCs were found to undergo a shift in gene expression profile that predominantly affects expression of genes associated with inflammatory responses. Further, a secretion of inflammatory mediators was validated on protein level. The GFAP+ subpopulation is hence an active participant in inflammatory pathophysiology. In an acute murine IBD model in vivo, GFAP-EGCs were found to express components of the major histocompatibility complex (MHC) class II in inflamed tissue, which also indicates a crosstalk of EGCs with the innate and the adaptive lamina propria immune system in acute inflammation. Taken together, this work advances our knowledge on EGC (patho-)physiology by identifying and characterizing an EGC subpopulation rapidly responsive to inflammation. This study further provides the transcriptomic profile of this population in vivo and in vitro, which can be used to identify targets for therapeutic intervention. Due to the modulating influence of EGCs on the intestinal microenvironment, the study further underlines the importance of integrating EGCs into in vitro test systems that aim to model intestinal tissues in vitro and presents an outlook on a potential strategy. N2 - Das enterische Nervensystem (ENS) innerviert den gastrointestinalen Trakt und kontrolliert zentrale Aspekte der gastrointetinalen Physiologie, wie die Kontraktilität der intestinalen Muskulatur, Sekretion und den intestinalen Blutfluss. Das ENS setzt sich aus elektrisch leitenden Neuronen und enterischen Gliazellen (EGZ) zusammen. EGZ ähneln Astrozyten des zentralen Nervensystems (ZNS) hinsichtlich ihrer Morphologie und der Expression gemeinsamer Marker wie dem Intermediärfilament Saures Gliafaserprotein (GFAP von engl. glial fibrillary acidic protein). EGZ sind strategisch an der Kontaktstelle zwischen ENS-Neuronen und deren Effektorzellen positioniert, um die intestinale Motilität, die epitheliale Barrierestabilität sowie inflammatorischen Prozesse zu modulieren. Die spezifische Beteiligung der EGZ an der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase wird gegenwärtig erforscht. Aus klinischer Sicht ist die Beteiligung von EGZ an pathophysiologischen Prozessen wie der intestinalen Entzündung besonders relevant. Wie ZNS-Astrozyten können EGZ bei intestinalen Schädigungen einen reaktiven, gewebe-protektiven Phänotyp annehmen. Bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (IBD, von engl. inflammatory bowel disease) wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sind Veränderungen im EGZ-Netzwerk bekannt, besonders eine veränderte Expression von GFAP, welches ein prominentes Kennzeichen der reaktiven Gliose im ZNS ist. Nachdem sich die Bedeutung der EGZ im gesunden und kranken Darm zunehmend herausgestellt hat, muss ein stärkerer Fokus auf die Erforschung der glialen Population gelegt werden. Die Zielsetzung dieser Arbeit war die umfassende Untersuchung der EGZ mit Fokus auf die reaktive GFAP-exprimierende Population unter entzündlichen Bedingungen in vivo und in vitro}. In einem ersten Schritt wurde ein neuartiges in vivo-Rattenmodell einer akuten systemischen Entzündung verwendet, um die schnell stattfindenden Veränderungen der EGZ unter entzündlichen Bedingungen zu untersuchen. Diese Studie ergab, dass innerhalb von wenigen Stunden EGZ mit einer Hochregulation der Gfap-Genexpression auf die Entzündung reagieren. Diese entzündungsinduzierte Hochregulation war lokal auf den myenterischen Plexus begrenzt und entlang der rostro-kaudalen Achse des Darms unterschiedlich stark ausgeprägt. Die responsive, GFAP-exprimierende myenterische EGZ-Population wurde daraufhin in vivo und in vitro charakterisiert unter Zuhilfenahme eines transgenen Mausmodells (hGFAP-eGFP-exprimierende Mäuse). Primäre, aufgereinigte GFAP-EGZ-Zellkulturen wurden etabliert und dahingehend untersucht, wie sich das transkriptomische und proteomische Profil der Population unter entzündlichen Bedingungen verändert. Hierbei wurde reproduzierbar eine Verschiebung des transkriptomischen Profils myenterischer GFAP-exprimierender EGZ gefunden. Die davon betroffenen Gene sind vorwiegend mit Immunantworten assoziiert. Weiterhin wurde die Sekretion solcher Immunmediatoren auf Proteinebene validiert. Die GFAP+ Subpopulation ist somit ein aktiver Modulator entzündlicher pathophysiologischer Prozesse. In einem akuten IBD-Mausmodell konnte weiterhin gezeigt werden, dass GFAP-EGZ verstärkt Komponenten des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II im entzündeten Gewebe exprimieren. Dies weist auf eine direkt Interaktion der EGZ mit dem Immunsystem in der Lamina propria hin. Insgesamt konnte mit dieser Arbeit das Wissen über die (Patho-)Physiologie von EGZ erweitert werden, indem eine schnell responsive EGZ-Subpopulation identifizert und charakterisiert wurde. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit das gesamte Transkriptomprofil der GFAP-Subpopulation in vivo und in vitro veröffentlicht, welches für weitere Studien zur Identifikation möglicher therapeutischer Anwendungen genutzt werden kann. Aufgrund des modulierenden Einflusses der EGZ auf die Darmphysiologie betont diese Studie die Notwendigkeit EGZs in in-vitro-Gewebemodelle des Darms zu integrieren und präsentiert einen Ausblick auf eine mögliche Strategie. KW - Darmwandnervensystem KW - Glia KW - in vitro KW - Sepsis KW - Enterische Glia Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-138946 ER -