TY - THES A1 - Kruse, Daniel T1 - Quantitative Analyse histologischer Aufnahmen der Haut T1 - Quantitative analysis of histological images of the skin N2 - Diese Arbeit hatte zum Ziel quantitative Analysen histologischer Aufnahmen der Haut nach unterschiedlichen Gesichtspunkten zu etablieren. Im ersten Abschnitt wurde die bildgestützte Quantifizierung der epidermalen Histomorphologie untersucht. Nach Sichtung und Beurteilung von 2145 hochauflösenden Fotografien HE-gefärbter Epidermis- und Vollhautmodellen jeglichen Zustands, wurde der BSGC-Score als Facettenklassifikation mit seinen insgesamt 40 Beurteilungskriterien aufgestellt. Die unterschiedlichen epidermalen Strata wurden mit Wichtungsfaktoren belegt. Die Bewertungskategorien sind mit einem Ampelsystem unterlegt. Eine Befundungsformel wurde aufgestellt. Weitere Bestandteile des BSGC-Scores sind eine Anleitung mit Bildbeilage sowie Dokumentationselemente. Die Anwendung erfolgte erfolgreich im Rahmen der Qualitätssicherung an Chargentests und zur Verlaufsbeurteilung eines In-vitro-Verbrennungsmodells aus humaner Epidermis durch Schneider et al. (2021) Der BSGC-Score dient als zügig durchführbares Evaluationstool zur Befundung von In-vitro-Epidermismodellen und nicht als diagnostisches Mittel. Der zweite Abschnitt beschäftigt sich mit der Vaskularisierung als Parameter der kutanen Wundheilung. Es wurden aSMA-IF-gefärbte Abbildungen porciner Verwundungsmodelle betrachtet und nach der Entfernung drüsiger Strukturen Gefäßanschnitte zu Beginn manuell ausgezählt. Hieraus wurden die nötigen Einstellungen für die Bildbearbeitungssoftware ImageJ ermittelt und die Abbildungen dieser anschließend zugeführt. Es erfolgte die automatisierte Quantifizierung elliptischer Formationen mit einer Größe ≥ 30 Pixel. Im nächsten Schritt wurden die Abbildungen in die Bereiche Wundrand, Wundgrund und Wundheilung unterteilt. In dem Bereich Wundheilung zeigte sich eine signifikant größere Revaskularisierung als in Wundgrund. Abschließend erfolgte der Vergleich sekundärer Wundauflagen. Der Vergleich der Quotienten Wundheilung/Wundgrund nicht-okklusiver und okklusiver Wundauflagen zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Neovaskularisierung. Die isolierte Betrachtung der Revaskularisierung als einzelner Prozess der Wundheilung kann nicht als generelles Kriterium für die Gesamtbeurteilung dienen. Hier findet die gewählte Methodik ihre Limitation. Zukünftige Anwendungsbereiche des BSGC-Scores sind die Ausweitung auf Vollhautmodelle und andere Verwundungsmodalitäten. Eine automatisierte und durch eine KI-gestützte Befundung ist ebenfalls aufgrund des zugrundeliegenden umfangreichen Datensatzes denkbar. Auch kann eine automatisierte softwaregestützte Quantifizierung der Vaskularisierung als überblickende und zügige Beurteilung der Wundheilung sinnvoll erscheinen. N2 - This work aimed to establish quantitative analyses of histological images of the skin according to different aspects. In the first section, image-based quantification of epidermal histomorphology was investigated. After reviewing and assessing 2145 high-resolution photographs of HE-stained epidermis and full-thickness skin models of any condition, the BSGC score was established as a facet classification with its total of 40 assessment criteria. Weighting factors were assigned to the different epidermal strata. The assessment categories are underlaid with a color system. A scoring formula was established. Further components of the BSGC score are a manual with picture supplement as well as documentation elements. It was successfully applied in the context of quality assurance on batch tests and for progression assessment of an in vitro human epidermis burn model by Schneider et al. (2021). The BSGC score serves as a rapidly feasible evaluation tool for the reporting of in vitro epidermis models and not as a diagnostic tool. The second section focuses on vascularization as a parameter of cutaneous wound healing. ASMA-IF-stained images of porcine wounding models were considered, and after removal of glandular structures, vascular formations were manually counted at baseline. From this, the necessary settings for the image processing software ImageJ were determined and the images were subsequently fed to it. Automated quantification of elliptical formations with a size ≥ 30 pixels was performed. In the next step, the images were divided into the areas of wound margin, wound bed and wound healing. The wound healing area showed significantly greater revascularization than wound bed. Finally, secondary wound dressings were compared. The comparison of the wound healing/wound bed quotients of non-occlusive and occlusive wound dressings showed no significant difference in neovascularization. The isolated consideration of revascularization as a single process of wound healing cannot serve as a general criterion for the overall assessment. This is where the chosen methodology finds its limitation. Future areas of application of the BSGC score include extension to full-thickness skin models and other wound modalities. Automated and AI-assisted scoring is also conceivable due to the extensive underlying data set. Automated software-assisted quantification of vascularization may also appear useful as an overview and expeditious assessment of wound healing. KW - Wundheilung KW - Vaskularisation KW - Epidermis KW - Vaskularisierung KW - Epidermismodell KW - In-vitro-Testsystem KW - BSGC KW - invitro KW - Haut Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352946 ER - TY - THES A1 - Kühnemundt, Johanna T1 - Defined microphysiologic 3D tumour models with aspects from the tumour microenvironment for the evaluation of cellular immunotherapies T1 - Definierte mikrophysiologische 3D-Tumormodelle mit Aspekten aus der Tumormikroumgebung zur Evaluierung von zellulären Immuntherapien N2 - Adoptive cellular immunotherapy with chimeric antigen receptor (CAR) T cells is highly effective in haematological malignancies. This success, however, has not been achieved in solid tumours so far. In contrast to hematologic malignancies, solid tumours include a hostile tumour microenvironment (TME), that poses additional challenges for curative effects and consistent therapeutic outcome. These challenges manifest in physical and immunological barriers that dampen efficacy of the CAR T cells. Preclinical testing of novel cellular immunotherapies is performed mainly in 2D cell culture and animal experiments. While 2D cell culture is an easy technique for efficacy analysis, animal studies reveal information about toxicity in vivo. However, 2D cell culture cannot fully reflect the complexity observed in vivo, because cells are cultured without anchorage to a matrix and only short-term periods are feasible. Animal studies provide a more complex tissue environment, but xenografts often lack human stroma and tumour inoculation occurs mostly ectopically. This emphasises the need for standardisable and scalable tumour models with incorporated TME-aspects, which enable preclinical testing with enhanced predictive value for the clinical outcome of immunotherapies. Therefore, microphysiologic 3D tumour models based on the biological SISmuc (Small Intestinal mucosa and Submucosa) matrix with preserved basement membrane were engaged and improved in this work to serve as a modular and versatile tumour model for efficacy testing of CAR T cells. In order to reflect a variety of cancer entities, TME-aspects, long-term stability and to enhance the read-out options they were further adapted to achieve scalable and standardisable defined microphysiologic 3D tumour models. In this work, novel culture modalities (semi-static, sandwich-culture) were characterised and established that led to an increased and organised tissue generation and long-term stability. Application of the SISmuc matrix was extended to sarcoma and melanoma models and serial bioluminescence intensity (BLI)-based in vivo imaging analysis was established in the microphysiologic 3D tumour models, which represents a time-efficient read-out method for quality evaluation of the models and treatment efficacy analysis, that is independent of the cell phenotype. Isolation of cancer-associated-fibroblasts (CAFs) from lung (tumour) tissue was demonstrated and CAF-implementation further led to stromal-enriched microphysiologic 3D tumour models with in vivo-comparable tissue-like architecture. Presence of CAFs was confirmed by CAF-associated markers (FAP, α-SMA, MMP-2/-9) and cytokines correlated with CAF phenotype, angiogenesis, invasion and immunomodulation. Additionally, an endothelial cell barrier was implemented for static and dynamic culture in a novel bioreactor set-up, which is of particular interest for the analysis of immune cell diapedesis. Studies in microphysiologic 3D Ewing’s sarcoma models indicated that sarcoma cells could be sensitised for GD2-targeting CAR T cells. After enhancing the scale of assessment of the microphysiologic 3D tumour models and improving them for CAR T cell testing, the tumour models were used to analyse their sensitivity towards differently designed receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) CAR T cells and to study the effects of the incorporated TME-aspects on the CAR T cell treatment respectively. ROR1 has been described as a suitable target for several malignancies including triple negative breast cancer (TNBC), as well as lung cancer. Therefore, microphysiologic 3D TNBC and lung cancer models were established. Analysis of ROR1 CAR T cells that differed in costimulation, spacer length and targeting domain, revealed, that the microphysiologic 3D tumour models are highly sensitive and can distinguish optimal from sub-optimal CAR design. Here, higher affinity of the targeting domain induced stronger anti-tumour efficacy and anti-tumour function depended on spacer length, respectively. Long-term treatment for 14 days with ROR1 CAR T cells was demonstrated in dynamic microphysiologic 3D lung tumour models, which did not result in complete tumour cell removal, whereas direct injection of CAR T cells into TNBC and lung tumour models represented an alternative route of application in addition to administration via the medium flow, as it induced strong anti-tumour response. Influence of the incorporated TME-aspects on ROR1 CAR T cell therapy represented by CAF-incorporation and/or TGF-β supplementation was analysed. Presence of TGF-β revealed that the specific TGF-β receptor inhibitor SD-208 improves ROR1 CAR T cell function, because it effectively abrogated immunosuppressive effects of TGF-β in TNBC models. Implementation of CAFs should provide a physical and immunological barrier towards ROR1 CAR T cells, which, however, was not confirmed, as ROR1 CAR T cell function was retained in the presence of CAFs in stromal-enriched microphysiologic 3D lung tumour models. The absence of an effect of CAF enrichment on CAR T cell efficacy suggests a missing component for the development of an immunosuppressive TME, even though immunomodulatory cytokines were detected in co-culture models. Finally, improved gene-edited ROR1 CAR T cells lacking exhaustion-associated genes (PD-1, TGF-β-receptor or both) were challenged by the combination of CAF-enrichment and TGF-β in microphysiologic 3D TNBC models. Results indicated that the absence of PD-1 and TGF-β receptor leads to improved CAR T cells, that induce strong tumour cell lysis, and are protected against the hostile TME. Collectively, the microphysiologic 3D tumour models presented in this work reflect aspects of the hostile TME of solid tumours, engage BLI-based analysis and provide long-term tissue homeostasis. Therefore, they present a defined, scalable, reproducible, standardisable and exportable model for translational research with enhanced predictive value for efficacy testing and candidate selection of cellular immunotherapy, as exemplified by ROR1 CAR T cells. N2 - Die adoptive Immuntherapie mit chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimierenden T-Zellen zeigt bei hämatologischen Krebsformen eine hohe Wirksamkeit. Bisher konnte dieser Erfolg für solide Tumore nicht erreicht werden. Im Gegensatz zu hämatologischen Krebsformen zeigen solide Tumore eine feindliche Tumormikroumgebung (TME), die zusätzliche Herausforderungen für die Erlangung kurativer Effekte und konsistenter Therapieergebnisse darstellen. Diese Herausforderungen äußern sich in physikalischen und immunologischen Barrieren, welche die Wirksamkeit der CAR-T-Zellen abschwächt. Zur präklinischen Testung neuartiger zellulärer Immuntherapien werden hauptsächlich 2D-Zellkulturen und Tierstudien durchgeführt. 2D-Zellkulturexperimente eignen sich vor allem für Wirksamkeitsanalysen, während Tierstudien Aufschluss über die Toxizität in-vivo geben können. Allerdings kann die 2D-Zellkultur die Komplexität der in-vivo Situation nicht vollständig widerspiegeln, da die Zellen ohne Verankerung an einer Matrix kultiviert werden und nur kurzfristige Zeiträume abgebildet werden können. Tierstudien bieten einen komplexeren Gewebekontext, wobei Xenografts aber oft das humane Stroma fehlt und die Tumorinokulation meist ektopisch erfolgt. Dies unterstreicht den Bedarf an standardisierbaren und skalierbaren Tumormodellen mit inkorporierten TME-Aspekten, die präklinische Testungen mit erhöhtem Vorhersagewert für den klinischen Erfolg von Immuntherapien ermöglichen. Daher wurden in dieser Arbeit mikrophysiologische 3D-Tumormodelle auf Basis der biologischen SISmuc (Small Intestinal mukosa und Submukosa)-Matrix mit erhaltener Basalmembran eingesetzt und verbessert, um als modulares und vielseitiges Tumormodell für die Wirksamkeitsprüfung von CAR T-Zellen zu dienen. Um eine Vielzahl von Krebsentitäten, TME-Aspekte und Langzeitstabilität abzubilden und um die Ausleseparamter zu verbessern, wurden die Tumormodelle weiter angepasst um skalierbare und standardisierbare definierte mikrophysiologische 3D Tumormodelle zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Kulturmodalitäten (semistatische Kultur, Sandwich-Kultur) charakterisiert und etabliert, die zu einer vermehrten und erhöhten Gewebebildung sowie Langzeitstabilität der Modelle führen. Die Anwendung der SISmuc-Matrix wurde auf Sarkom- und Melanom-Modelle erweitert und in den mikrophysiologischen 3D-Tumormodellen wurde ein serielles Biolumineszenz-Intensitäts (BLI)-basiertes In-vivo-Analyse-Verfahren etabliert, welches eine zeiteffiziente Methode für die Qualitätsbewertung der Modelle sowie die Analyse der Therapiewirksamkeit darstellt, welche unabhängig vom Zell-Phänotyp ist. Die Isolation von Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) aus Lungen-(Tumor) Gewebe wurde demonstriert und die CAF-Implementierung führte des Weiteren zu stromal-angereicherten mikrophysiologischen 3D-Tumormodellen mit in-vivo vergleichbarer gewebeähnlicher Architektur. CAFs wurden mit Hilfe von CAF-assoziierten Markern (FAP, α-SMA, MMP-2/-9) und einer Zytokinanalyse in den Modellen identifiziert. Diese bestätigte ebenfalls Zytokine, welche mit Angiogenese, Invasion und Immunmodulation assoziiert sind. Zusätzlich wurde eine Endothelzellbarriere sowohl in statischer als auch in der dynamischen Kultur implementiert, wofür ein neuer Bioreaktoraufbau verwendet wurde, welcher insbesondere für die Analyse der Immunzelldiapedesis interessant ist. Studien in mikrophysiologischen 3D-Ewing-Sarkom-Modellen zeigten, dass diese für GD2-spezifische CAR-T-Zellen sensibilisiert werden können. Nach der Erweiterung des Untersuchungsumfangs der mikrophysiologischen 3D-Tumormodelle und deren Verbesserung für die CAR-T-Zell-Testung wurden die Tumormodelle verwendet, um ihre Sensitivität gegenüber unterschiedlich designten Rezeptor-Tyrosinkinase-like Orphan-Rezeptor 1 (ROR1) -spezifischen CAR-T-Zellen zu analysieren. Des Weiteren wurden die Auswirkungen der eingebauten TME-Aspekte auf die CAR-T-Therapie untersucht. ROR1 wurde als geeignetes Ziel für verschiedene maligne Erkrankungen beschrieben, darunter auch triple-negtive-breast-cancer (TNBC) und Lungenkrebs. Daher wurden mikrophysiologische 3D-TNBC- und Lungenkrebs-Modelle für die Testungen aufgebaut. Die Analyse von ROR1-CAR-T-Zellen, die sich in Kostimulation, Spacerlänge und der Ziel-Domäne unterschieden, zeigte, dass die mikrophysiologischen 3D-Tumormodelle eine hohe Sensitivität zur Unterscheidung von suboptimal und optimal designten CARs aufweisen. Dabei induzierte eine Ziel-Domäne mit höherer Affinität eine stärkere Anti-Tumor-Wirkung. Zusätzlich war die Anti-Tumor-Funktion abhängig von der Spacerlänge. In dynamischen mikrophysiologischen 3D-Lungentumormodellen wurde eine Langzeitbehandlung über 14 Tage mit ROR1-CAR-T-Zellen realisiert, die jedoch nicht zu einer vollständigen Entfernung der Tumorzellen führte. Die direkte Injektion von CAR-T-Zellen in TNBC- und Lungentumormodellen induzierte eine starke Anti-Tumorantwort und stellt somit neben der Zugabe über den Medienstrom einen alternativen Applikationsweg dar. Des Weiteren wurde der Einfluss der inkorporierten TME-Aspekte auf die ROR1 CAR T-Zelltherapie untersucht, welche sich durch CAF-Inkorporation und/oder TGF-β-Supplementierung darstellten. Die Zugabe von TGF-β zeigte, dass der spezifische TGF-β-Rezeptor-Inhibitor SD-208 die Funktion der ROR1 CAR T-Zellen verbesserte, da er die immunsuppressiven Effekte von TGF-β in TNBC-Modellen effektiv aufhob. Die Implementierung von CAFs sollte eine physikalische und immunologische Barriere gegenüber ROR1 CAR T-Zellen darstellen, was sich jedoch nicht bestätigte, da die Funktion der ROR1 CAR T-Zellen in Anwesenheit von CAFs in stromal-angereicherten mikrophysiologischen 3D-Lungentumormodellen erhalten blieb. Das Fehlen eines Effekts der CAF-Anreicherung auf die CAR T-Zell-Effektivität deutet auf eine fehlende Komponente für die Entwicklung eines immunsuppressiven TME hin, obwohl immunmodulatorische Zytokine in Co-Kultur-Modellen nachgewiesen wurden. Schließlich wurden verbesserte gen-editierte ROR1-CAR-T-Zellen, denen erschöpfungsassoziierte Gene (PD-1, TGF-β-Rezeptor oder beide) fehlten, durch die Kombination von CAF-Anreicherung und TGF-β in mikrophysiologischen 3D-TNBC-Modellen herausgefordert. Die Ergebnisse zeigten, dass ROR1 CAR T Zellen ohne PD-1 und TGF-β-Rezeptor überlegen sind, eine starke Tumorzell-Lyse induzieren und vor der feindlichen TME geschützt sind. Zusammenfassend spiegeln die in dieser Arbeit vorgestellten mikrophysiologischen 3D-Tumormodelle Aspekte der feindlichen TME solider Tumore wider, ermöglichen BLI-basierte Analysen und bieten eine langfristige Gewebehomöostase. Daher stellen sie ein definiertes, skalierbares, reproduzierbares, standardisierbares und exportierbares Modell für die translationale Forschung mit erhöhtem Vorhersagewert dar. Sie können für die Wirksamkeitsprüfung sowie Kandidatenauswahl von zellulären Immuntherapie verwendet werden, was vor allem am Beispiel der ROR1 CAR T-Zellen gezeigt wurde. KW - CAR T cell KW - immunotherapy KW - 3D tumour model KW - solid tumour KW - tumour microenvironment KW - TNBC KW - lung cancer KW - tumour stroma KW - microphysiologic 3D tumour model KW - Immuntherapie KW - Lungenkrebs KW - Stroma KW - Tumormikroumgebung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-276674 ER - TY - THES A1 - Jihyoung, Choi T1 - Development of an Add-On Electrode for Non-Invasive Monitoring in Bioreactor Cultures and Medical Devices T1 - Entwicklung einer Zusatzelektrode für das nicht-invasive Monitoring von Bioreaktorkulturen und Medizinprodukten N2 - Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is a valuable technique analyzing electrochemical behavior of biological systems such as electrical characterization of cells and biomolecules, drug screening, and biomaterials in biomedical field. In EIS, an alternating current (AC) power signal is applied to the biological system, and the impedance of the system is measured over a range of frequencies. In vitro culture models of endothelial or epithelial barrier tissue can be achieved by culturing barrier tissue on scaffolds made with synthetic or biological materials that provide separate compartments (apical and basal sides), allowing for further studies on drug transport. EIS is a great candidate for non-invasive and real-time monitoring of the electrical properties that correlate with barrier integrity during the tissue modeling. Although commercially available transendothelial/transepithelial electrical resistance (TEER) measurement devices are widely used, their use is particularly common in static transwell culture. EIS is considered more suitable than TEER measurement devices in bioreactor cultures that involve dynamic fluid flow to obtain accurate and reliable measurements. Furthermore, while TEER measurement devices can only assess resistance at a single frequency, EIS measurements can capture both resistance and capacitance properties of cells, providing additional information about the cellular barrier's characteristics across various frequencies. Incorporating EIS into a bioreactor system requires the careful optimization of electrode integration within the bioreactor setup and measurement parameters to ensure accurate EIS measurements. Since bioreactors vary in size and design depending on the purpose of the study, most studies have reported using an electrode system specifically designed for a particular bioreactor. The aim of this work was to produce multi-applicable electrodes and established methods for automated non-invasive and real-time monitoring using the EIS technique in bioreactor cultures. Key to the electrode material, titanium nitride (TiN) coating was fabricated on different substrates (materials and shape) using physical vapor deposition (PVD) and housed in a polydimethylsiloxane (PDMS) structure to allow the electrodes to function as independent units. Various electrode designs were evaluated for double-layer capacitance and morphology using EIS and scanning electron microscopy (SEM), respectively. The TiN-coated tube electrode was identified as the optimal choice. Furthermore, EIS measurements were performed to examine the impact of influential parameters related to culture conditions on the TiN-coated electrode system. In order to demonstrate the versatility of the electrodes, these electrodes were then integrated into in different types of perfusion bioreactors for monitoring barrier cells. Blood-brain barrier (BBB) cells were cultured in the newly developed dynamic flow bioreactor, while human umblical vascular endothelial cells (HUVECs) and Caco-2 cells were cultured in the miniature hollow fiber bioreactor (HFBR). As a result, the TiN-coated tube electrode system enabled investigation of BBB barrier integrity in long-term bioreactor culture. While EIS measurement could not detect HUVECs electrical properties in miniature HFBR culture, there was the possibility of measuring the barrier integrity of Caco-2 cells, indicating potential usefulness for evaluating their barrier function. Following the bioreactor cultures, the application of the TiN-coated tube electrode was expanded to hemofiltration, based on the hypothesis that the EIS system may be used to monitor clotting or clogging phenomena in hemofiltration. The findings suggest that the EIS monitoring system can track changes in ion concentration of blood before and after hemofiltration in real-time, which may serve as an indicator of clogging of filter membranes. Overall, our research demonstrates the potential of TiN-coated tube electrodes for sensitive and versatile non-invasive monitoring in bioreactor cultures and medical devices. N2 - Die elektrochemische Impedanzspektroskopie (EIS) ist eine nützliche Methode, um das elektrochemische Verhalten von biologischen Systemen zu analysieren, wie z.B. die elektrische Charakterisierung von Zellen und Biomolekülen, Drug Screening und Biomaterialien im biomedizinischen Bereich. Für die EIS wird ein Wechselstrom an das biologische System angeschlossen und die Impedanz des Systems über einen Frequenzbereich gemessen. In vitro-Modelle von Gewebekulturen epithelialer Barrieren können mithilfe künstlicher oder biologischer Materialien, die über unterschiedliche Kompartimente (apikale und basolaterale Seite) verfügen, hergestellt werden und ermöglichen weitere Untersuchungen zum Transport von Arzneistoffen. Die EIS bietet dabei eine hervorragende Methode für das nicht-invasive Echtzeit-Monitoring der elektrischen Eigenschaften, die mit der Barriere-Integrität während der Gewebeentwicklung korreliert. Obwohl kommerziell erhältliche Geräte zur Messung des transendothelialen/transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) umfangreich verwendet werden, ist ihre Verwendung besonders bei statischen Transwell-Kulturen verbreitet. Durch die EIS kann im Gegensatz zur TEER-Messung für Bioreaktor-Kulturen, die einen dynamischen Medienfluss aufweisen, genauere und verlässliche Messungen erhalten werden. Zudem können EIS-Messungen anders als die TEER-Messung, die nur den Widerstand einer einzelnen Frequenz misst, gleichzeitig den elektrischen Widerstand und die Kapazität von Zellen erfassen und damit zusätzliche Informationen über die zellulären Barriereeigenschaften über verschiedene Frequenzen hinweg liefern. Der EIS-Einbau in ein Bioreaktor-System bedarf einer sorgfältigen Optimierung der Elektrodenintegration in das Bioreaktor-Setup und der Messparameter, um akkurate EIS-Messungen durchführen zu können. Da Bioreaktoren abhängig vom Untersuchungszweck in ihrer Größe und ihrem Design variieren, verwenden die meisten Studien speziell entwickelte Elektrodensysteme für einzelne Bioreaktoren. Das Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von vielseitig anwendbaren Elektroden und etablierten Methoden für das automatisierte nicht-invasive Echtzeit-Monitoring von Bioreaktor-Kulturen mithilfe der EIS. Entscheidend für das Elektrodenmaterial war die Titannitrid (TiN)-Beschichtung, die auf verschiedenen Substraten (Materialien und Formen) durch Physical Vapor Deposition (PVD) hergestellt und in einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Struktur untergebracht wurde, damit die Elektroden unabhängig voneinander arbeiten können. Verschiedene Elektrodendesigns wurden auf Doppelschicht-Kapazität mithilfe der EIS bzw. auf die Morphologie mit Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Die TiN-beschichteten Elektroden in Röhrenform erwiesen sich als optimal. Weiterhin wurden EIS-Messungen durchgeführt, um die Auswirkung von beeinflussenden Parametern auf die Kulturbedingungen durch das TiN-beschichtete Elektrodensystem zu untersuchen. Um die Vielseitigkeit der Elektroden aufzuzeigen, wurden diese anschließend zum Monitoring von Barriere-bildenden Zellen in unterschiedliche Perfusionsbioreaktoren integriert. Zellen der Blut-Hirn-Schranke (BHS) wurden im neu entwickelten dynamischen Flussreaktor kultiviert, wohingegen humane umbilikale vaskuläre Endothelzellen (HUVEC) und Caco-2-Zellen in Hohlfaserbioreaktoren (HFBR) in Miniaturform kultiviert wurden. Das TiN-beschichtete Röhrenelektrodensystem ermöglichte die Untersuchung der BHS-Barrieren-Integrität in einer Langzeit-Bioreaktorkultur. Während die EIS-Messung in der Miniaturform-HFBR-Kultur keine elektrischen Eigenschaften der HUVECs detektieren konnte, war es möglich, eine Barriere-Integrität der Caco-2-Zellen zu messen, die den potentiellen Nutzen für die Evaluierung deren Barrierefunktion aufzeigt. Nach den Bioreaktorkulturen wurde die Anwendung der TiN-beschichteten Röhrenelektrode auf die Hämofiltration erweitert, auf Grundlage der Hypothese, dass das EIS-System ein Gerinnen oder Verstopfen während der Hämofiltration überwachen könnte. Die Ergebnisse zeigen, dass das EIS-Monitoring-System Veränderungen in der Ionenkonzentration des Blutes vor und nach Hämofiltration in Echtzeit verfolgen kann, welches eventuell als Messgröße für ein Verstopfen der Filtermembranen genutzt werden kann. Insgesamt weisen TiN-beschichtete Röhrenelektroden unseren Forschungen zufolge ein großes Potential für ein empfindliches und vielfältiges nicht-invasives Monitoring von Bioreaktorkulturen und Medizingeräte auf. KW - Monitoring KW - Tissue Engineering KW - Electrode KW - Perfusion Bioreactor KW - Hemofiltration KW - Medizinprodukt KW - Electrochemical Impedance Spectroscopy Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-358232 ER - TY - THES A1 - Konrad, Johannes T1 - Biomechanische Eigenschaften eines biomaterialbasierten Kreuzbandkonstruktes in-vivo und in-vitro T1 - Biomechanical properties of a biomaterial-based cruciate ligament construct in-vivo and in-vitro N2 - Kreuzbandrupturen stellen nach wie vor eine Herausforderung in der klinischen Praxis hinsichtlich kurz- und langfristiger unerwünschter Nebenwirkungen dar (z.B. Reruptur und Arthrosebildung). In der vorliegenden Arbeit wird der entwickelte Ansatz eines Kollagen-I-basierten künstlichen Kreuzbandkonstruktes hinsichtlich der Reißfestigkeit, Lagerung, Verstärkungsmöglichkeit mittels Fiber-tape und langfristigen Arthroseentstehung untersucht mittels in-vitro und in-vivo Untersuchungen unter zur Hilfe nahme des Minipig Tiermodels. Die Ergebnisse zeigen keinen Einfluss der Lagerungstemperatur sowie des Lagerungszeitraums auf die Reißfestigkeit des Konstruktes, sowie eine mögliche initiale Verstärkung mittels Fibertape im Minipig. Darüber hinaus wurde mikroskopisch wie makroskopische Arthroseentstehung nachgewiesen. Das Ausmaß der Arthroseentstehung ist diesbezüglich mit einer Abweichung der Konstruktimplantation von der ursprünglichen Kreuzbandinsertion mittels MRT bestätigt worden. N2 - Cruciate ligament ruptures remain a challenge in clinical practice with regard to short- and long-term undesirable side effects (e.g. rerupture and osteoarthritis formation). In the present study, the developed approach of a collagen-I-based artificial cruciate ligament construct is investigated with regard to tear strength, storage, reinforcement possibility by means of fibre-tape and long-term arthrosis development by means of in vitro and in vivo investigations using the Minipig animal model. The results show no influence of the storage temperature and the storage period on the tensile strength of the construct, as well as a possible initial reinforcement by means of fibre-tape in the Minipig. Furthermore, both microscopic and macroscopic osteoarthritis was detected. The extent of osteoarthritis development was confirmed in this regard with a deviation of the construct implantation from the original cruciate ligament insertion by means of MRI. KW - Ligamentum cruciatum anterius KW - Osteoarthritis KW - ACL construct KW - Minipig KW - Kreuzbandersatz KW - Arthroseentstehung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235555 ER - TY - THES A1 - Kupczyk, Eva Katharina T1 - Charakterisierung von Zellen aus dem vorderen Kreuzband nach Vorderer- Kreuzband-Ruptur im Hinblick auf das Rupturalter T1 - Characterisation of cells isolated from the ruptured anterior cruciate ligament in regard to the time since rupture N2 - Die Vordere Kreuzband (VKB)-Ruptur ist eine häufige Verletzung, welche eine hohe individuelle und sozioökonomische Belastung verursacht. Eine etablierte Therapie ist die VKB-Plastik, problematisch sind jedoch die hohen Rerupturraten nach operativer Versorgung. In der Annahme, dass Mesenchymale Stammzellen (MSC) eine bedeutende Rolle für die Heilung spielen, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, ob ein Zusammenhang zwischen Zahl und Qualität der aus dem VKB isolierten MSC sowie der Latenz zwischen Ruptur und Rekonstruktion besteht und so ein optimaler Therapiezeitraum eingegrenzt werden kann. Zunächst erfolgte die Zellisolierung aus intraoperativ gewonnenen VKB-Biopsien. Je nach Latenz zwischen Ruptur und Operation wurden drei Gruppen (akute ≙ ≤ 30 d, subakute ≙ 31-90 d, verzögerte Rekonstruktion ≙ > 90 d) gebildet. Zum Nachweis von MSC wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Plastikadhärenz, eines multipotenten Differenzierungspotentials sowie eines spezifischen Oberflächenantigenmusters (CD73+, CD90+, CD105+, CD34-) untersucht. Zudem wurde ihr Einflusses auf die biomechanischen und histologischen Eigenschaften eines analysiert. Der Nachweis von MSC war in allen Gruppen möglich. Das Proliferationspotential war in Gruppe II am größten, ebenso der Anteil der MSC an allen Zellen. Er war 5,4% (4,6% - 6,3%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe I und 18,9% (18,2% - 19,6%, 95% CI; p < 0,001) höher als in Gruppe III. In den mit Zellen kultivierten Bandkonstrukten konnte im Gegensatz zu zellfreien Konstrukten humanes Kollagen I nachgewiesen werden. Die Stabilität nahm bei Kultivierung mit Zellen ab. Die Ergebnisse legen nahe, dass das Regenerationspotential bei subakuter VKB-Rekonstruktion (31-90 d) am höchsten ist. Potenziell ursächlich sind die Regeneration hemmende Entzündungsprozesse zu Beginn sowie degenerative Prozesse im längerfristigen Verlauf. Zudem konnte gezeigt werden, dass die isolierten Zellen die Eigenschaften eines Bandkonstruktes durch Bildung von Kollagen I und Reduktion der Stabilität im kurzfristigen Verlauf verändern und dementsprechend den Therapieerfolg beeinflussen könnten. Zur Verifizierung der Ergebnisse bedarf es weiterer Untersuchungen. N2 - A ruptured Anterior Cruciate Ligament (ACL) can significantly impact an individual’s health and cause great socioeconomic repercussions. Despite a well-established surgical treatment, the rate of secondary rupture remains high. Previous research has highlighted the important role of Mesenchymal Stem Cells (MSC) in ligament regeneration. This study sets out to analyse possible correlations between the quality and quantity of MSC and the time between rupture and repair, and thus defining the optimal time for surgery. Cells were isolated from ACL biopsies gained intraoperatively. Three groups (acute ≙ ≤ 30d, subacute ≙ 31-90d and delayed reconstruction ≙ > 90d) were defined based on the time from trauma to surgery. To prove the presence of MSC the cells were analysed for proliferative capacity, adherence to plastic, multilineage differentiation potential, as well as the presence of specific surface antigens (CD73+, CD90+, CD105+ and CD34-). The cells’ ability to support healing was assessed through biomechanical tests and histological analysis of ligament models created using isolated ACL cells and a rat collagen type I-based scaffold. Cells that fulfil MSC criteria were isolated in all three groups. In the subacute reconstruction group the proportion of cells which fulfilled the criteria was 5.4% (4,6% - 6,3%, 95% CI; p < 0,001) higher than in the acute reconstruction group and 18.9% (18,2% - 19,6%, 95% CI; p < 0,001) higher than in the delayed reconstruction group. Human collagen I could be isolated in ligament models cultivated using ACL cells. However, the stability of the ligament models decreased after cell cultivation. The results described above suggest that the potential for regeneration is highest in the subacute reconstruction group. This may be because the post traumatic inflammation slows regeneration, while degenerative processes set in in the weeks to months following the rupture. The fact that the presence of human collagen I in the ligament models was associated with decreased stability suggests that the concentration of MSC can affect the surgical outcome. More research into the subject is required to further explore these preliminary findings. KW - Ligamentum cruciatum anterius KW - Tissue Engineering KW - Zellkultur KW - Kollagen KW - Stammzelle KW - Mesenchymale Stammzellen KW - Vorderes Kreuzband KW - Anterior Cruciate Ligament KW - Mesenchymal Stem Cell KW - colllagen Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280568 ER - TY - THES A1 - Schmidt [geb. Schmid], Freia Florina T1 - Ein dreidimensionales kutanes Melanommodell für den Einsatz in der präklinischen Testung T1 - A three-dimensional cutaneous melanoma model for use in preclinical testing N2 - Das maligne Melanom nimmt als Tumorerkrankung mit hoher Metastasierungsrate und steigenden Inzidenzraten bei höchster Mortalität aller Hauttumoren eine zunehmende Bedeutung in der modernen Onkologie ein. Frühzeitige Diagnosemöglichkeiten und moderne Behandlungen konnten das Überleben der Patienten bereits erheblich verbessern. Jedoch besteht nach wie vor Bedarf an geeigneten Modellen, um die Melanomprogression vollständig zu verstehen und neue wirksame Therapien zu entwickeln. Hierfür werden häufig Tiermodelle verwendet, diese spiegeln jedoch nicht die menschliche Mikroumgebung wider. Zweidimensionalen Zellkulturen fehlen dagegen entscheidende Elemente der Tumormikroumgebung. Daher wurde in dieser Arbeit ein dreidimensionales epidermales Tumormodell des malignen Melanoms, welches aus primären humanen Keratinozyten und verschiedenen Melanomzelllinien besteht, entwickelt. Die eingesetzten Melanomzelllinien variieren in ihren Treibermutationen, wodurch das Modell in der Lage ist, Wirkstoffe zu untersuchen, die spezifisch auf diese Mutationen wirken. Mit Techniken des Tissue Engineerings konnte ein dreidimensionales Hautmodell aufgebaut werden, das alle charakteristischen Schichten der Epidermis aufweist und im Bereich des stratum basale Melanomcluster ausbildet. Diese reichen je nach Größe und Ausdehnung bis in suprabasale Epidermisschichten hinein. Die Tumor-Histopathologie, der Tumorstoffwechsel sowie tumorassoziierte Proteinsekretionen ließen sich im in vitro Modell nachweisen. Darüber hinaus konnte ein Protokoll entwickelt werden, mit dem einzelne Zellen aus den Modellen reisoliert werden können. Dies ermöglichte es, den Proliferationszustand innerhalb des jeweiligen Modells zu charakterisieren und die Wirkung von Antitumortherapien gezielt zu bewerten. Die Anwendbarkeit als Testsystem im Bereich der Tumortherapeutika wurde mit dem in der Klinik häufig verwendeten v-raf-Maus-Sarkom-Virus-Onkogen-Homolog B (BRAF)-Inhibitor Vemurafenib demonstriert. Der selektive BRAF-Inhibitor reduzierte erfolgreich das Tumorwachstum in den Modellen mit BRAF-mutierten Melanomzellen, was durch eine Verringerung der metabolischen Aktivität, der proliferierenden Zellen und des Glukoseverbrauchs gezeigt wurde. Für die Implementierung des Modells in die präklinische Therapieentwicklung wurde B-B-Dimethylacrylshikonin, ein vielversprechender Wirkstoffkandidat, welcher einen Zellzyklusarrest mit anschließender Apoptose bewirkt, im Modell getestet. Bei einer Anwendung der Modelle im Bereich der Testung topischer Behandlungen ist eine Barrierefunktion der Modelle notwendig, die der in vivo Situation nahe kommt. Die Barriereeigenschaften der Hautäquivalente wurden durch die Melanomzellen nachweislich nicht beeinflusst, sind aber im Vergleich zur in vivo Situation noch unzureichend. Eine signifikante Steigerung der Hautbarriere konnte durch die Bereitstellung von Lipiden und die Anregung hauteigener Regenerationsprozesse erreicht werden. Über den Nachweis des transepidermalen Wasserverlusts konnte eine Messmethode zur nicht-invasiven Bestimmung der Hautbarriere etabliert und über den Vergleich zur Impedanzspektroskopie validiert werden. Hierbei gelang es, erstmals die Korrelation der Hautmodelle zur in vivo Situation über ein solches Verfahren zu zeigen. Das entwickelte epidermale Modell konnte durch die Integration eines dermalen Anteils und einer Endothelzellschicht noch weiter an die komplexe Struktur und Physiologie der Haut angepasst werden um Untersuchungen, die mit der Metastierung und Invasion zusammenhängen, zu ermöglichen. Die artifizielle Dermis basiert auf einem Kollagen-Hydrogel mit primären Fibroblasten. Eine dezellularisierte Schweinedarmmatrix ließ sich zur Erweiterung des Modells um eine Endothelzellschicht nutzen. Dabei wanderten die primären Fibroblasten apikal in die natürliche Schweindarmmatrix ein, während die Endothelzellen basolateral eine geschlossene Schicht bildeten. Die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle sind in der Lage, die Vorhersagekraft der in vitro Modelle und die in vitro - in vivo Korrelation zu verbessern. Durch die Kombination des Melanommodells mit einer darauf abgestimmten Analytik wurde ein neuartiges Werkzeug für die präklinische Forschung zur Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen geschaffen. N2 - Malignant melanoma, as a tumor disease with a high metastasis rate and rising incidence rates with the highest mortality of all skin tumors, is assuming increasing importance in modern oncology. Early diagnosis and modern treatments significantly improved patient survival. There is still an unmet need for appropriate models to fully understand melanoma progression and to develop new effective therapies. Animal models are widely used but do not reflect the human microenvironment, while two-dimensional cell cultures lack crucial elements of this tumor microenvironment. Therefore, a three-dimensional epidermal tumor model of malignant melanoma consisting of primary human keratinocytes and various melanoma cell lines was developed in this work. The melanoma cell lines vary in their driver mutations, enabling the model to investigate compounds specifically designed to target one mutation. Tissue engineering techniques were used to generate a three-dimensional skin model that shows all characteristic layers of the epidermis and forms melanoma clusters in the stratum basale. Depending on size and extension, these extend into suprabasal epidermal layers. Tumor histopathology, tumor metabolism, and tumor-associated protein secretions could be demonstrated in the in vitro model. In addition, a protocol could be developed to reisolate single cells from the models. This made it possible to characterize the proliferation state within the respective model and to specifically evaluate the effect of antitumor therapies. Applicability as a test system in the field of tumor therapeutics was demonstrated with the v-raf mouse sarcoma virus oncogene homolog B (BRAF) inhibitor commonly used in the clinic. This selective BRAF inhibitor successfully reduced tumor growth in models with BRAF-mutated melanoma cells, indicated by a reduction in metabolic activity, proliferating cells, and glucose consumption. For the implementation of the model in preclinical development, B-B-dimethylacrylshikonin, a promising drug candidate, which induces cell cycle arrest followed by apoptosis, was tested in the model. An application of the models in the field of testing topical treatments requires a barrier function of the models close to the in vivo situation. The barrier properties of the skin equivalents were demonstrably not influenced by the melanoma cells, but are still insufficient compared to the in vivo situation. A significant increase in the skin barrier could be achieved by providing lipids and stimulating the skin's own regeneration processes. A measurement method for the non-invasive determination of the skin barrier was established by detection of transepidermal water loss and validated by comparison with impedance spectroscopy. For the first time, the correlation of the skin models to the in vivo situation was demonstrated by such a method. The developed epidermal model could be further adapted to the complex structure and physiology of the skin by integrating a dermal portion and an endothelial cell layer to allow studies related to metastasis and invasion. The artificial dermis is based on a collagen hydrogel with primary fibroblasts. A decellularized porcine intestinal matrix could be used to extend the model with an endothelial cell layer. Here, the primary fibroblasts migrated apically into the natural porcine intestinal matrix, while the endothelial cells formed a closed layer basolaterally. The tissue models developed in this work are able to improve the predictive power of the in vitro models and the in vitro - in vivo correlation. By combining the melanoma model with matched analytics, a novel tool for preclinical research for testing of pharmaceutical agents was established. KW - Tissue Engineering KW - Melanom KW - Hautmodell KW - Alternative zum Tierversuch Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329255 ER - TY - THES A1 - Alzheimer, Mona T1 - Development of tissue-engineered three-dimensional infection models to study pathogenesis of \(Campylobacter\) \(jejuni\) T1 - Entwicklung dreidimensionaler Infektionsmodelle basierend auf Gewebezüchtung zur Erforschung der Pathogenese von \(Campylobacter\) \(jejuni\) N2 - Infectious diseases caused by pathogenic microorganisms are one of the largest socioeconomic burdens today. Although infectious diseases have been studied for decades, in numerous cases, the precise mechanisms involved in the multifaceted interaction between pathogen and host continue to be elusive. Thus, it still remains a challenge for researchers worldwide to develop novel strategies to investigate the molecular context of infectious diseases in order to devise preventive or at least anti-infective measures. One of the major drawbacks in trying to obtain in-depth knowledge of how bacterial pathogens elicit disease is the lack of suitable infection models to authentically mimic the disease progression in humans. Numerous studies rely on animal models to emulate the complex temporal interactions between host and pathogen occurring in humans. While they have greatly contributed to shed light on these interactions, they require high maintenance costs, are afflicted with ethical drawbacks, and are not always predictive for the infection outcome in human patients. Alternatively, in-vitro two-dimensional (2D) cell culture systems have served for decades as representatives of human host environments to study infectious diseases. These cell line-based models have been essential in uncovering virulence-determining factors of diverse pathogens as well as host defense mechanisms upon infection. However, they lack the morphological and cellular complexity of intact human tissues, limiting the insights than can be gained from studying host-pathogen interactions in these systems. The focus of this thesis was to establish and innovate intestinal human cell culture models to obtain in-vitro reconstructed three-dimensional (3D) tissue that can faithfully mimic pathogenesis-determining processes of the zoonotic bacterium Campylobacter jejuni (C. jejuni). Generally employed for reconstructive medicine, the field of tissue engineering provides excellent tools to generate organ-specific cell culture models in vitro, realistically recapitulating the distinctive architecture of human tissues. The models employed in this thesis are based on decellularized extracellular matrix (ECM) scaffolds of porcine intestinal origin. Reseeded with intestinal human cells, application of dynamic culture conditions promoted the formation of a highly polarized mucosal epithelium maintained by functional tight and adherens junctions. While most other in-vitro infection systems are limited to a flat monolayer, the tissue models developed in this thesis can display the characteristic 3D villi and crypt structure of human small intestine. First, experimental conditions were established for infection of a previously developed, statically cultivated intestinal tissue model with C. jejuni. This included successful isolation of bacterial colony forming units (CFUs), measurement of epithelial barrier function, as well as immunohistochemical and histological staining techniques. In this way, it became possible to follow the number of viable bacteria during the infection process as well as their translocation over the polarized epithelium of the tissue model. Upon infection with C. jejuni, disruption of tight and adherens junctions could be observed via confocal microscopy and permeability measurements of the epithelial barrier. Moreover, C. jejuni wildtype-specific colonization and barrier disruption became apparent in addition to niche-dependent bacterial localization within the 3D microarchitecture of the tissue model. Pathogenesis-related phenotypes of C. jejuni mutant strains in the 3D host environment deviated from those obtained with conventional in-vitro 2D monolayers but mimicked observations made in vivo. Furthermore, a genome-wide screen of a C. jejuni mutant library revealed significant differences for bacterial factors required or dispensable for interactions with unpolarized host cells or the highly prismatic epithelium provided by the intestinal tissue model. Elucidating the role of several previously uncharacterized factors specifically important for efficient colonization of a 3D human environment, promises to be an intriguing task for future research. At the frontline of the defense against invading pathogens is the protective, viscoelastic mucus layer overlying mucosal surfaces along the human gastrointestinal tract (GIT). The development of a mucus-producing 3D tissue model in this thesis was a vital step towards gaining a deeper understanding of the interdependency between bacterial pathogens and host-site specific mucins. The presence of a mucus layer conferred C. jejuni wildtype-specific protection against epithelial barrier disruption by the pathogen and prevented a high bacterial burden during the course of infection. Moreover, results obtained in this thesis provide evidence in vitro that the characteristic corkscrew morphology of C. jejuni indeed grants a distinct advantage in colonizing mucous surfaces. Overall, the results obtained within this thesis highlight the strength of the tissue models to combine crucial features of native human intestine into accessible in-vitro infection models. Translation of these systems into infection research demonstrated their ability to expose in-vivo like infection outcomes. While displaying complex organotypic architecture and highly prismatic cellular morphology, these tissue models still represent an imperfect reflection of human tissue. Future advancements towards inclusion of human primary and immune cells will strive for even more comprehensive model systems exhibiting intricate multicellular networks of in-vivo tissue. Nevertheless, the work presented in this thesis emphasizes the necessity to investigate host-pathogen interactions in infection models authentically mimicking the natural host environment, as they remain among the most vital parts in understanding and counteracting infectious diseases. N2 - In der heutigen Zeit tragen insbesondere durch pathogene Mikroorganismen ausgelöste Infektionskrankheiten zur sozioökonomischen Belastung bei. Obwohl bereits jahrzehntelang an der Entstehung von Infektionskrankheiten geforscht wird, bleiben in zahlreichen Fällen die genauen Mechanismen, welche an den vielfältigen Interaktionen zwischen Pathogen und Wirt beteiligt sind, unbeschrieben. Gerade deshalb bleibt es für Wissenschaftler weltweit eine Herausforderung, neue Strategien zur Untersuchung des molekularen Kontexts von Infektionskrankheiten zu entwickeln, um präventive oder zumindest anti-infektive Maßnahmen ergreifen zu können. In den meisten Fällen ist jedoch das Fehlen geeigneter Infektionsmodelle, mit denen der Krankheitsverlauf im Menschen authentisch nachgestellt werden kann, eines der größten Hindernisse um detailliertes Wissen darüber gewinnen zu können wie bakterielle Pathogene die Krankheit auslösen. Zahlreiche Studien sind dabei auf Tiermodelle angewiesen, um die komplexen zeitlichen Abläufe zwischen Wirt und Pathogen im menschlichen Körper nachzuahmen. Während diese Modelle in hohem Maß dazu beigetragen haben, Aufschluss über diese Abläufe zu geben, sind sie doch sehr kostenintensiv, mit ethischen Bedenken behaftet und können nicht immer die Folgen einer Infektion im menschlichen Patienten vorhersagen. Seit Jahrzehnten werden daher alternativ in-vitro 2D Zellkultursysteme eingesetzt, um den Verlauf von Infektionskrankheiten zu erforschen, welche die Bedingungen im menschlichen Wirt wiederspiegeln sollen. Diese auf Zelllinien basierenden Modelle sind essentiell in der Entdeckung von Virulenzfaktoren diverser Pathogene, aber auch in der Aufklärung von wirtsspezifischen Abwehrmechanismen. Dennoch fehlt ihnen die morphologische und zelluläre Komplexität von intaktem menschlichen Gewebe. Dadurch sind die Erkenntnisse, die mit diesen Systemen über Infektionsverläufe gewonnen werden können, limitiert. Die vorgelegte Arbeit konzentriert sich auf die Etablierung und Weiterentwicklung intestinaler, humaner Zellkulturmodelle, um dreidimensionales Gewebe in vitro zu rekonstruieren mit dem Ziel, Pathogenese-beeinflussende Prozesse des zoonotischen Bakteriums C. jejuni nachzustellen. Das Fachgebiet der Gewebezüchtung wird üblicherweise für rekonstruktive Medizin eingesetzt und bietet exzellente Mittel zur in-vitro Herstellung organspezifischer Zellkulturmodelle, welche die unverkennbare Mikroarchitektur humanen Gewebes realistisch nachempfinden können. Die in dieser Arbeit verwendeten Modelle basieren auf einem extrazellulären Matrixgerüst, das aus der Dezellularisierung von Schweinedarm gewonnen wurde. Durch die Wiederbesiedelung mit human Kolonzellen und der Kultivierung unter dynamischen Bedingungen entwickelte sich ein hochpolarisiertes mucosales Epithel, das durch funktionale Zell-Zell-Kontakte (tight und adherens junctions) aufrechterhalten wird. Während andere in-vitro Infektionssysteme meist durch die Präsenz einer flachen Zellschicht limitiert werden, entwickelt das in dieser Arbeit eingeführte Gewebemodell die für den menschlichen Dünndarm charakteristische Architektur aus Villi und Krypten. Zunächst wurden experimentelle Bedingungen für die Infektion eines zuvor entwickelten, statisch kultivierten Dünndarmmodells mit C. jejuni etabliert. Dies beinhaltete die erfolgreiche Isolierung koloniebildender Einheiten, die Messung der epithelialen Barrierefunktion, sowie immunhistochemische und histologische Färbetechniken. Dadurch konnte die Anzahl der Bakterien sowie deren Translokalisierung über das polarisierte Epithel während des Infektionsprozesses nachvollzogen werden. Außerdem konnte die Beeinträchtigung von Zell-Zell-Kontakten durch konfokale Mikroskopie und Permeabilitätsmessungen der epithelialen Barriere beobachtet werden. Neben der Bestimmung der Kolonisierungsrate von C. jejuni Isolaten und der dadurch hervorgerufenen spezifischen Zerstörung der epithelialen Barriere konnten die Bakterien auch innerhalb der 3D Mikroarchitektur des Gewebemodells lokalisiert werden. Außerdem konnte im Rahmen der 3D Gewebeumgebung beobachtet werden, dass Pathogenese-relevante Phänotypen von C. jejuni Mutantenstämmen im Vergleich zu konventionellen in-vitro 2D Zellschichten abwichen, diese aber dafür mit den in-vivo gemachten Beobachtungen übereinstimmten. Darüber hinaus wies die genomweite Suche einer C. jejuni Mutantenbibliothek signifikante Unterschiede zwischen bakteriellen Faktoren, die für die Interaktion mit nicht polarisierten Wirtszellen oder dem hochprismatischen Epithel des Gewebemodells bedeutsam oder entbehrlich waren, auf. Die Aufklärung der Funktion einiger bisher nicht charakterisierter Faktoren, die zu einer effizienten Kolonisierung menschlichen Gewebes beitragen, verspricht eine faszinierende Aufgabe für die zukünftige Forschung zu werden. Die vorderste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene bildet die schützende, viskoelastische Mukusschicht, die mukosale Oberflächen entlang des menschlichen Gastrointestinaltrakts überzieht. Mit der Entwicklung eines mukusproduzierenden Gewebemodells in der hier vorgelegten Arbeit gelang ein entscheidender Schritt zur Erforschung der Wechselbeziehungen zwischen bakteriellen Pathogenen und wirtsspezifischen Muzinen. Während des Infektionsverlaufs wurde das unterliegende Epithel durch die Anwesenheit der Mukusschicht vor der Zerstörung durch die Mikroben geschützt und eine erhöhte bakterielle Belastung verhindert. Darüber hinaus liefern die Resultate dieser Arbeit einen in-vitro Nachweis für den bakteriellen Vorteil einer spiralförmigen Morphologie, um muköse Oberflächen zu besiedeln. Zusammenfassend unterstreicht diese Arbeit das Potential der hier entwickelten Gewebemodelle, entscheidende Eigenschaften des menschlichen Darms in einem leicht zugänglichen in-vitro Infektionsmodell zu vereinigen. Der Einsatz dieser Modelle im Rahmen der Infektionsforschung bewies deren Fähigkeit in-vivo beobachtete Infektionsverläufe widerzuspiegeln. Während diese Infektionsmodelle bereits organotypische Architektur und hochprismatische Zellmorphologie aufweisen, ist ihre Darstellung von menschlichem Gewebe noch nicht perfekt. Durch den Einsatz von humanen Primär- und Immunzellen wird es in Zukunft möglich sein, noch umfassendere Modellsysteme zu entwickeln, die komplexe multizelluläre Netzwerke von in-vivo Geweben aufweisen. Nichtsdestotrotz verdeutlicht die hier vorgelegte Arbeit wie wichtig es ist, die Interaktionen zwischen Wirt und Pathogen innerhalb von Infektionsmodellen zu erforschen, welche die natürliche Wirtsumgebung wiedergeben. Dies spielt eine entscheidende Rolle, um die Entstehung von Infektionskrankheiten nachvollziehen und ihnen entgegenwirken zu können. KW - Campylobacter jejuni KW - Tissue Engineering KW - Small RNA KW - 3D tissue model KW - Bacterial infection KW - 3D Gewebemodelle KW - Bakterielle Infektion KW - 3D cell culture KW - Infection models Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193440 ER - TY - THES A1 - Schliermann [geb. Stratmann], Anna Theresa T1 - The Role of FGF Receptor 2 in GDF5 mediated Signal Transduction T1 - Die Rolle des FGF Rezeptors 2 in GDF5-vermittelter Signaltransduktion N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are involved in various aspects of cell-cell communication in complex life forms. They act as morphogens, help differentiate different cell types from different progenitor cells in development, and are involved in many instances of intercellular communication, from forming a body axis to healing bone fractures, from sugar metabolism to angiogenesis. If the same protein or protein family carries out many functions, there is a demand to regulate and fine-tune their biological activities, and BMPs are highly regulated to generate cell- and context-dependent outcomes. Not all such instances can be explained yet. Growth/differentiation factor (GDF)5 (or BMP14) synergizes with BMP2 on chondrogenic ATDC5 cells, but antagonizes BMP2 on myoblastic C2C12 cells. Known regulators of BMP2/GDF5 signal transduction failed to explain this context-dependent difference, so a microarray was performed to identify new, cell-specific regulatory components. One identified candidate, the fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, was analyzed as a potential new co-receptor to BMP ligands such as GDF5: It was shown that FGFR2 directly binds BMP2, GDF5, and other BMP ligands in vitro, and FGFR2 was able to positively influence BMP2/GDF5-mediated signaling outcome in cell-based assays. This effect was independent of FGFR2s kinase activity, and independent of the downstream mediators SMAD1/5/8, p42/p44, Akt, and p38. The elevated colocalization of BMP receptor type IA and FGFR2 in the presence of BMP2 or GDF5 suggests a signaling complex containing both receptors, akin to other known co-receptors of BMP ligands such as repulsive guidance molecules. This unexpected direct interaction between FGF receptor and BMP ligands potentially opens a new category of BMP signal transduction regulation, as FGFR2 is the second receptor tyrosine kinase to be identified as BMP co-receptor, and more may follow. The integration of cell surface interactions between members of the FGF and BMP family especially may widen the knowledge of such cellular communication mechanisms which involve both growth factor families, including morphogen gradients and osteogenesis, and may in consequence help to improve treatment options in osteochodnral diseases. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) sind oft an interzellulärer Kommunikation beteiligt. Sie sind Morphogene, spielen eine Rolle in der Differenzierung von zahlreichen Zelltypen aus verschiedenen Vorgängerzellen während der Entwicklung, und sind an vielen weiteren Beispielen der Zell-Zell-Kommunikation beteiligt: von der Formation einer Körperachse bis hin zur Heilung von Knochenbrüchen, vom Zuckermetabolismus bis zur Angiogenese. Wann immer dasselbe Protein oder dieselbe Proteinfamilie so viele Funktionen erfüllt, bedarf es der Regulation und Feinabstimmung ihrer diversen biologischen Aktivitäten, und BMPs sind zu dem Erzielen zell- und kontextspezifischer Effekte in ihrer Wirkung entsprechend stark reguliert. Nicht in allen Fällen sind die Mechanismen solcher Regulation bisher bekannt. Growth/differentiation factor (GDF)5 (oder BMP14) agiert mit BMP2 auf den chondrogenen ATDC5 Zellen synergistisch, aber antagonisiert BMP2 auf den myoblastischen C2C12 Zellen. Diese kontextabhängige Diskrepanz konnte mithilfe der bekannten Regulatoren von BMP2/GDF5-mediierten Signalen nicht erklärt werden. Daher wurde ein Microarray durchgeführt, um neue, zellspezifische regulatorische Proteine zu identifizieren. Einer der identifizierten Kandidaten, fibroblast growth factor receptor (FGFR)2, wurde auf eine potentielle Funktion als neuer Korezeptor für BMP Liganden wie GDF5 analysiert: Es konnte gezeigt werden, dass FGFR2 BMP2, GDF5 und andere BMP Liganden in vitro direkt binden und die biologische Aktivität von BMP2 und GDF5 in Zellkultursystemen positiv beeinflussen konnte. Diese Beobachtungen waren unabhängig von der Kinaseaktivität des FGFR2, und unabhängig von den intrazellulären Mediatoren SMAD1/5/8, p42/p44, Akt und p38. Die erhöhte Kolokalisation von FGFR2 mit dem BMP Rezeptor IA in der Präsenz von BMP2 oder GDF5 weist darauf hin, dass der entsprechende Signalkomplex möglicherweise beide Rezeptoren gleichzeitig enthält; ähnlich, wie das für andere bekannte Korezeptoren von BMP Liganden wie etwa den repulsive guidance molecules der Fall ist. Die unerwartete direkte Interaktion von einem FGF Rezeptor mit BMP-Liganden ist möglicherweise nur ein Beispiel für einen generelleren Mechanismus. Tatsächlich ist FGFR2 bereits die zweite Rezeptortyrosinkinase, die als BMP-Korezeptor identifiziert wurde, und es ist möglich, dass es noch mehr gibt. Speziell im Bezug auf die FGF-BMP Interaktion bergen die hier dargestellten Ergebnisse Potential zu neuen Erkenntnissen. Die Proteinfamilien dieser beiden Wachstumsfaktoren sind häufiger an demselben zellulären Mechanismen beteiligt; etwa an der Entstehung von Morphogengradienten in der Entwicklung oder an der Osteogenese. Die Interaktion der FGF und BMP Proteinfamilien auf der Zelloberfläche könnte eine wertvolle Ergänzung zu der Untersuchung ihres Zusammenspiels im Zellinneren sein, und könnte in diesem Zusammenhang sogar langfristig die Behandlungsmöglichkeiten von osteochondralen Erkrankungen erweitern. KW - Molekularbiologie KW - FGF signaling KW - BMP signaling Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192889 ER - TY - THES A1 - Reuter, Christian Steffen T1 - Development of a tissue-engineered primary human skin infection model to study the pathogenesis of tsetse fly-transmitted African trypanosomes in mammalian skin T1 - Entwicklung eines primären humanen Hautinfektionsmodells basierend auf Gewebezüchtung zur Erforschung der Pathogenese von Tsetsefliegen-übertragenen Afrikanischen Trypanosomen in der Säugetierhaut N2 - Many arthropods such as mosquitoes, ticks, bugs, and flies are vectors for the transmission of pathogenic parasites, bacteria, and viruses. Among these, the unicellular parasite Trypanosoma brucei (T. brucei) causes human and animal African trypanosomiases and is transmitted to the vertebrate host by the tsetse fly. In the fly, the parasite goes through a complex developmental cycle in the alimentary tract and salivary glands ending with the cellular differentiation into the metacyclic life cycle stage. An infection in the mammalian host begins when the fly takes a bloodmeal, thereby depositing the metacyclic form into the dermal skin layer. Within the dermis, the cell cycle-arrested metacyclic forms are activated, re-enter the cell cycle, and differentiate into proliferative trypanosomes, prior to dissemination throughout the host. Although T. brucei has been studied for decades, very little is known about the early events in the skin prior to systemic dissemination. The precise timing and the mechanisms controlling differentiation of the parasite in the skin continue to be elusive, as does the characterization of the proliferative skin-residing trypanosomes. Understanding the first steps of an infection is crucial for developing novel strategies to prevent disease establishment and its progression. A major shortcoming in the study of human African trypanosomiasis is the lack of suitable infection models that authentically mimic disease progression. In addition, the production of infectious metacyclic parasites requires tsetse flies, which are challenging to keep. Thus, although animal models - typically murine - have produced many insights into the pathogenicity of trypanosomes in the mammalian host, they were usually infected by needle injection into the peritoneal cavity or tail vein, bypassing the skin as the first entry point. Furthermore, animal models are not always predictive for the infection outcome in human patients. In addition, the relatively small number of metacyclic parasites deposited by the tsetse flies makes them difficult to trace, isolate, and study in animal hosts. The focus of this thesis was to develop and validate a reconstructed human skin equivalent as an infection model to study the development of naturally-transmitted metacyclic parasites of T. brucei in mammalian skin. The first part of this work describes the development and characterization of a primary human skin equivalent with improved mechanical properties. To achieve this, a computer-assisted compression system was designed and established. This system allowed the improvement of the mechanical stability of twelve collagen-based dermal equivalents in parallel through plastic compression, as evaluated by rheology. The improved dermal equivalents provided the basis for the generation of the skin equivalents and reduced their contraction and weight loss during tissue formation, achieving a high degree of standardization and reproducibility. The skin equivalents were characterized using immunohistochemical and histological techniques and recapitulated key anatomical, cellular, and functional aspects of native human skin. Furthermore, their cellular heterogeneity was examined using single-cell RNA sequencing - an approach which led to the identification of a remarkable repertoire of extracellular matrix-associated genes expressed by different cell subpopulations in the artificial skin. In addition, experimental conditions were established to allow tsetse flies to naturally infect the skin equivalents with trypanosomes. In the second part of the project, the development of the trypanosomes in the artificial skin was investigated in detail. This included the establishment of methods to successfully isolate skin-dwelling trypanosomes to determine their protein synthesis rate, cell cycle and metabolic status, morphology, and transcriptome. Microscopy techniques to study trypanosome motility and migration in the skin were also optimized. Upon deposition in the artificial skin by feeding tsetse, the metacyclic parasites were rapidly activated and established a proliferative population within one day. This process was accompanied by: (I) reactivation of protein synthesis; (II) re-entry into the cell cycle; (III) change in morphology; (IV) increased motility. Furthermore, these observations were linked to potentially underlying developmental mechanisms by applying single-cell parasite RNA sequencing at five different timepoints post-infection. After the initial proliferative phase, the tsetse-transmitted trypanosomes appeared to enter a reversible quiescence program in the skin. These quiescent skin-residing trypanosomes were characterized by very slow replication, a strongly reduced metabolism, and a transcriptome markedly different from that of the deposited metacyclic forms and the early proliferative trypanosomes. By mimicking the migration from the skin to the bloodstream, the quiescent phenotype could be reversed and the parasites returned to an active proliferating state. Given that previous work has identified the skin as an anatomical reservoir for T. brucei during disease, it is reasonable to assume that the quiescence program is an authentic facet of the parasite's behavior in an infected host. In summary, this work demonstrates that primary human skin equivalents offer a new and promising way to study vector-borne parasites under close-to-natural conditions as an alternative to animal experimentation. By choosing the natural transmission route - the bite of an infected tsetse fly - the early events of trypanosome infection have been detailed with unprecedented resolution. In addition, the evidence here for a quiescent, skin-residing trypanosome population may explain the persistence of T. brucei in the skin of aparasitemic and asymptomatic individuals. This could play an important role in maintaining an infection over long time periods. N2 - Zahlreiche Arthropoden wie Stechmücken, Zecken, Wanzen und Fliegen sind Überträger für krankheitserregende Parasiten, Bakterien und Viren. Hierzu gehört der einzellige Parasit Trypanosoma brucei (T. brucei), welcher durch Tsetsefliegen übertragen wird und die Afrikanische Trypanosomiasis bei Menschen und Tieren verursacht. Der Entwicklungszyklus des Parasiten in der Fliege ist komplex und endet in der Speicheldrüse mit der Differenzierung in das metazyklische Lebensstadium. Diese metazyklischen Formen werden durch den Biss der blutsaugenden Tsetsefliege in die dermale Hautschicht des Säugetierwirts injiziert. Die zellzyklusarretierten metazyklischen Formen werden in der Dermis aktiviert und der Widereintritt in den Zellzyklus sowie die Differenzierung zu proliferativen Trypanosomen eingeleitet. Anschließend breitet sich der Parasit systemisch im Säugetierwirt aus. Obwohl T. brucei bereits seit Jahrzehnten erforscht wird, ist nur sehr wenig über das frühe Infektionsgeschehen in der Haut bekannt. Der genaue Zeitpunkt und die Mechanismen, die der Differenzierung des Parasiten in der Haut zugrunde liegen, sind unbekannt. Ebenso wurden die proliferativen Trypanosomen in der Haut bisher nur unzureichend charakterisiert. Das Verständnis über die ersten Schritte einer Infektion ist jedoch von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von neuen Strategien, die die Krankheitsentstehung und deren Fortschreiten verhindern sollen. Ein großes Hindernis bei der Erforschung der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis ist der Mangel an geeigneten Infektionsmodellen, die den Krankheitsverlauf authentisch nachbilden. Außerdem werden für die Erzeugung der infektiösen metazyklischen Parasiten Tsetsefliegen benötigt, die aufwändig zu züchten sind. Tiermodelle haben es ermöglicht - hauptsächlich Mäuse -, viele Erkenntnisse über die Pathogenese von Trypanosomen im Säugetierwirt zu erlangen. Allerdings wurden diese überwiegend durch Nadelinjektion in den Bauchraum oder die Kaudalvene infiziert, wodurch die Haut als erste Eintrittspforte umgangen wurde. Darüber hinaus lassen Tiermodelle nicht immer Rückschlüsse auf den Infektionsverlauf beim Menschen zu. Zusätzlich erschwert die geringe Anzahl von metazyklischen Parasiten, die von Tsetsefliegen injiziert werden, die Isolation, Nachweis und Untersuchung im tierischen Wirt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein rekonstruiertes menschliches Hautäquivalent zu entwickeln und als Infektionsmodell zu validieren, um die Entwicklung von natürlich übertragenen metazyklischen Parasiten von T. brucei in der Säugetierhaut zu untersuchen. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung eines primären menschlichen Hautäquivalents mit verbesserten mechanischen Eigenschaften. Zu diesem Zweck wurde ein computergesteuertes Kompressionssystem entworfen und hergestellt. Dieses System ermöglichte die gleichzeitige Verbesserung der mechanischen Stabilität von zwölf kollagenbasierten dermalen Äquivalenten durch plastische Kompression, die mittels Rheologie evaluiert wurden. Die verbesserten dermalen Äquivalente dienten als Fundament für die Erzeugung der Hautäquivalente und reduzierten deren Kontraktion und Gewichtsverlust während der Gewebebildung. Dadurch wurde ein hohes Maß an Standardisierung und Reproduzierbarkeit erreicht. Die Hautäquivalente wurden durch immunhistochemische und histologische Techniken charakterisiert und bildeten wichtige anatomische, zelluläre und funktionelle Aspekte der nativen menschlichen Haut nach. Des Weiteren wurde die zelluläre Heterogenität durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung untersucht. Mit dieser Technik wurde ein umfangreiches Spektrum an extrazellulären Matrix-assoziierten Genen identifiziert, die von verschiedenen Zellsubpopulationen in der künstlichen Haut exprimiert werden. Zusätzlich wurden experimentelle Bedingungen etabliert, damit Tsetsefliegen eingesetzt werden konnten, um die Hautäquivalente auf natürlichem Weg mit Trypanosomen zu infizieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Entwicklung der Trypanosomen in der künstlichen Haut im Detail untersucht. Dies umfasste die Etablierung von Methoden zur erfolgreichen Isolierung der Trypanosomen aus der Haut, um deren Proteinsyntheserate, Zellzyklus- und Stoffwechselstatus, sowie Morphologie und Transkriptom zu bestimmen. Zusätzlich wurden Mikroskopietechniken zur Untersuchung der Trypanosomenmotilität und migration in der Haut optimiert. Nach der Injektion in die künstliche Haut durch Tsetsefliegen wurden die metazyklischen Parasiten schnell aktiviert und etablierten innerhalb eines Tages eine proliferative Population. Dieser Entwicklungsprozess wurde begleitet von (I) einer Reaktivierung der Proteinsynthese, (II) einem Wiedereintritt in den Zellzyklus, (III) einer Veränderung der Morphologie und (IV) einer erhöhten Motilität. Des Weiteren wurden diese Beobachtungen mit potentiell zugrundeliegenden entwicklungsbiologischen Mechanismen in Verbindung gebracht, indem eine Einzelzell RNA-Sequenzierung der Trypanosomen zu fünf verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion durchgeführt wurde. Nach der ersten proliferativen Phase traten die Tsetse-übertragenen Trypanosomen in der Haut in ein reversibles Ruhestadium ein. Diese ruhenden Trypanosomen waren durch eine sehr langsame Zellteilung, einen stark reduzierten Stoffwechsel und ein Transkriptom gekennzeichnet, dass sich deutlich von dem der injizierten metazyklischen Formen und der ersten proliferativen Trypanosomen unterschied. Durch Nachahmung der Migration von der Haut in den Blutkreislauf konnte dieser Phänotyp reaktiviert werden und die Parasiten kehrten in einen aktiven, proliferierenden Zustand zurück. Unter Berücksichtigung, dass vorangegangene Forschungsarbeiten die Haut als anatomisches Reservoir für T. brucei während des Krankheitsverlaufs identifiziert haben, ist anzunehmen, dass das Ruheprogramm eine authentische Facette im Verhalten des Parasiten in einem infizierten Wirt darstellt. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, das primäre menschliche Hautäquivalente eine neue und vielversprechende Möglichkeit bieten, vektorübertragene Parasiten unter naturnahen Bedingungen als Alternative zu Tierversuchen zu untersuchen. Durch die Verwendung des natürlichen Infektionsweges - dem Biss einer infizierten Tsetsefliege -, konnten die frühen Prozesse einer Trypanosomen-Infektion mit noch nie dagewesener Detailtiefe nachvollzogen werden. Des Weiteren könnte der hier erbrachte Nachweis einer ruhenden, hautresidenten Trypanosomen-Population die Persistenz von T. brucei in der Haut von aparasitämischen und asymptomatischen Personen erklären. Dies könnte eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer Infektion über lange Zeiträume spielen. KW - Trypanosoma brucei KW - Tissue Engineering KW - Trypanosomiasis KW - 3D-Zellkultur KW - Transkriptomanalyse KW - developmental differentiation KW - skin equivalent KW - artificial human skin KW - single-cell RNA sequencing KW - quiescence Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251147 ER - TY - THES A1 - Fey, Christina T1 - Establishment of an intestinal tissue model for pre-clinical screenings T1 - Etablierung eines Darmgewebemodells für Präklinische Screenings N2 - The small intestine represents a strong barrier separating the lumen from blood circulation thereby playing a major role in the absorption and the transport of pharmacological agents prior to their arrival on the respective target site. In order to gain more knowledge about specialized uptake mechanisms and risk assessment for the patient after oral admission of drugs, intestinal in vitro models demonstrating a close similarity to the in vivo situation are needed. In the past, cell line-based in vitro models composed of Caco-2 cells cultured on synthetic cell carriers represented the “gold standard” in the field of intestinal tissue engineering. Expressive advantages of these models are a reproducible, cost-efficient and standardized model set up, but cell function can be negatively influenced by the low porosity or unwanted molecular adhesion effects of the artificial scaffold material. Natural extracellular matrices (ECM) such as the porcine decellularized small intestinal submucosa (SIS) are used as alternative to overcome some common drawbacks; however, the fabrication of these scaffolds is time- and cost-intensive, less well standardized and the 3Rs (replacement, reduction, refinement) principle is not entirely fulfilled. Nowadays, biopolymer-based scaffolds such as the bacterial nanocellulose (BNC) suggest an interesting option of novel intestinal tissue engineered models, as the BNC shows comparable features to the native ECM regarding fiber arrangement and hydrophilic properties. Furthermore, the BNC is of non-animal origin and the manufacturing process is faster as well as well standardized at low costs. In this context, the first part of this thesis analyzed the BNC as alternative scaffold to derive standardized and functional organ models in vitro. Therefore, Caco-2 cells were cultured on two versions of BNC with respect to their surface topography, the unmodified BNC as rather smooth surface and the surface-structured BNC presenting an aligned fiber arrangement. As controls, Caco-2 in vitro models were set up on PET and SIS matrices. In this study, the BNC-based models demonstrated organ-specific properties comprising typical cellular morphologies, a characteristic tight junction protein expression profile, representative ultrastructural features and the formation of a tight epithelial barrier together with a corresponding transport activity. In summary, these results validated the high quality of the BNC-based Caco-2 models under cost-efficient conditions and their suitability for pre-clinical research purposes. However, the full functional diversity of the human intestine cannot be presented by Caco-2 cells due to their tumorigenic background and their exclusive representation of mature enterocytes. Next to the scaffold used for the setup of in vitro models, the cellular unit mainly drives functional performance, which demonstrates the crucial importance of mimicking the cellular diversity of the small intestine in vitro. In this context, intestinal primary organoids are of high interest, as they show a close similarity to the native epithelium regarding their cellular diversity comprising enterocytes, goblet cells, enteroendocrine cells, paneth cells, transit amplifying cells and stem cells. In general, such primary organoids grow in a 3D Matrigel® based environment and a medium formulation supplemented with a variety of growth factors to maintain stemness, to inhibit differentiation and to stimulate cell migration supporting long term in vitro culture. Intestinal primary spheroid/organoid cultures were set up as Transwell®-like models on both BNC variants, which resulted in a fragmentary cell layer and thereby unfavorable properties of these scaffold materials under the applied circumstances. As the BNC manufacturing process is highly flexible, surface properties could be adapted in future studies to enable a good cell adherence and barrier formation for primary intestinal cells, too. However, the application of these organoid cultures in pre-clinical research represents an enormous challenge, as the in vitro culture is complex and additionally time- and cost-intensive. With regard to the high potential of primary intestinal spheroids/organoids and the necessity of a simplified but predictive model in pre-clinical research purposes, the second part of this thesis addressed the establishment of a primary-derived immortalized intestinal cell line, which enables a standardized and cost-efficient culture (including in 2D), while maintaining the cellular diversity of the organoid in vitro cultures. In this study, immortalization of murine and human intestinal primary organoids was induced by ectopic expression of a 10- (murine) or 12 component (human) pool of genes regulating stemness and the cell cycle, which was performed in cooperation with the InSCREENeX GmbH in a 2D- and 3D-based transduction strategy. In first line, the established cell lines (cell clones) were investigated for their cell culture prerequisites to grow under simplified and cost-efficient conditions. While murine cell clones grew on uncoated plastic in a medium formulation supplemented with EGF, Noggin, Y-27632 and 10% FCS, the human cell clones demonstrated the necessity of a Col I pre coating together with the need for a medium composition commonly used for primary human spheroid/organoid cultures. Furthermore, the preceding analyses resulted in only one human cell clone and three murine cell clones for ongoing characterization. Studies regarding the proliferative properties and the specific gene as well as protein expression profile of the remaining cell clones have shown, that it is likely that transient amplifying cells (TACs) were immortalized instead of the differentiated cell types localized in primary organoids, as 2D, 3D or Transwell®-based cultures resulted in slightly different gene expression profiles and in a dramatically reduced mRNA transcript level for the analyzed marker genes representative for the differentiated cell types of the native epithelium. Further, 3D cultures demonstrated the formation of spheroid-like structures; however without forming organoid-like structures due to prolonged culture, indicating that these cell populations have lost their ability to differentiate into specific intestinal cell types. The Transwell®-based models set up of each clone exhibit organ-specific properties comprising an epithelial-like morphology, a characteristic protein expression profile with an apical mucus-layer covering the villin-1 positive cell layer, thereby representing goblet cells and enterocytes, together with representative tight junction complexes indicating an integer epithelial barrier. The proof of a functional as well as tight epithelial barrier in TEER measurements and in vivo-like transport activities qualified the established cell clones as alternative cell sources for tissue engineered models representing the small intestine to some extent. Additionally, the easy handling and cell expansion under more cost-efficient conditions compared to primary organoid cultures favors the use of these newly generated cell clones in bioavailability studies. Altogether, this work demonstrated new components, structural and cellular, for the establishment of alternative in vitro models of the small intestinal epithelium, which could be used in pre-clinical screenings for reproducible drug delivery studies. N2 - Der Dünndarm bildet eine starke Barriere aus, welche das Lumen vom Blutkreislauf trennt, und dadurch maßgeblich an der Absorption und dem Transport von pharmakologischen Wirkstoffen beteiligt ist, bevor diese ihren Wirkort erreichen. Um ein detaillierteres Wissen über die speziellen Aufnahmemechanismen zu erlangen und zur Risikoabschätzung für den Patienten nach oraler Aufnahme dieser Medikamente, sind intestinale in vitro Modelle erforderlich, die eine große Ähnlichkeit mit der Situation in vivo aufweisen. In der Vergangenheit stellten Caco-2 Zelllinien-basierte in vitro Modelle, die auf synthetischen Trägerstrukturen aufgebaut sind, den „Goldstandard“ auf dem Gebiet der intestinalen Geweberekonstruktion dar. Bedeutende Vorteile dieser Modelle sind der reproduzierbare, kosteneffiziente und standardisierte Modellaufbau, jedoch können die zellulären Funktionen durch die geringe Porosität oder die unerwünschten molekularen Adhäsionseffekte des künstlichen Trägermaterials negativ beeinflusst werden. Um einige häufige Nachteile zu überwinden werden natürliche extrazelluläre Matrizen (ECM) wie die porzine dezellularisierte Dünndarm-submukosa (SIS) verwendet, jedoch ist die Herstellung dieser Trägerstrukturen zeit- und kostenintensiv, weniger gut standardisiert und entspricht nicht ganzheitlich dem 3R-Prinzip (Replace = Vermeiden, Reduce = Verringern, Refine = Verbessern). Heutzutage ermöglichen biopolymer-basierte Trägerstrukturen wie die bakterielle Nanozellulose (BNC) die Entwicklung von neuartigen intestinalen Gewebemodellen, da die BNC eine große Ähnlichkeit hinsichtlich der Faseranordnung und der hydrophilen Eigenschaften mit der nativen ECM aufweist. Darüber hinaus ist die BNC nicht tierischen Ursprungs und der Herstellungsprozess schneller, gut standardisiert als auch kostengünstig. In diesem Zusammenhang wurde im ersten Teil dieser Arbeit nachgewiesen, dass die BNC als alternative Trägerstruktur für standardisierte und funktionelle Organmodelle in vitro geeignet ist. Dafür wurden Caco-2 Zellen auf zwei Varianten der BNC kultiviert, die sich in ihrer Oberflächentopographie unterscheiden, wobei die nicht-modifizierte BNC eine glatte Oberfläche und die oberflächen-strukturierte BNC eine ausgerichtete Faseranordnung aufweist. Als Kontrollen dienten Caco 2 zellbasierte in vitro Modelle, die auf PET- oder SIS Matrizes aufgebaut wurden. In dieser Studie wiesen die BNC-basierten Modelle die wichtigsten organ-spezifischen Eigenschaften auf, darunter eine typische zelluläre Morphologie, ein charakteristisches Expressionsprofil der Tight Junction Proteine, repräsentative ultrastrukturelle Merkmale und die Bildung einer dichten epithelialen Barriere verbunden mit einer entsprechenden Transportaktivität. Zusammenfassend bestätigten diese Ergebnisse die hohe Qualität der BNC-basierten Caco-2 Modelle unter kosteneffizienten Herstellbedingungen und ihre Eignung für präklinische Forschungszwecke. Allerdings kann die volle Funktionsvielfalt des menschlichen Darms durch Caco-2 Zellen aufgrund ihres kanzerogenen Ursprungs und der exklusiven Repräsentanz von Enterozyten nicht abgebildet werden. Neben der Trägerstruktur die für den Aufbau der in vitro Modelle verwendet wird, trägt auch die zelluläre Einheit zur Etablierung von funktionalen Modellen bei, weshalb es von großer Bedeutung ist, die zelluläre Vielfalt des Dünndarms in diesen Modellen in vitro nachzuahmen. In diesem Zusammenhang sind die primären intestinalen Organoide, die sich hauptsächlich aus Enterozyten, Becherzellen, enteroendokrinen Zellen, Paneth Zellen, Vorläuferzellen und Stammzellen zusammensetzen, von großem Interesse, da die zelluläre Komponente eine große Ähnlichkeit zum nativen Epithel aufweist. Derartige primäre Organoide werden üblicherweise in einer 3D-Matrigel® Umgebung und einer speziellen Formulierung des Mediums, die mit einer Vielzahl an Wachstumsfaktoren ergänzt wird, um das Stammzellpotenzial zu erhalten, die Differenzierung zu hemmen, die Zellmigration zu stimulieren und somit eine langfristige in vitro-Kultivierung zu unterstützt. Intestinale primäre Sphäroid-/Organoidkulturen wurden auf beiden BNC Varianten als Transwell®-ähnliche Modelle aufgebaut. Dabei zeigte sich eine fragmentierte Zellschicht was darauf schließen lässt, dass die Matrix unter diesen Bedingungen für den Modellaufbau ungeeignet ist. Da der BNC-Herstellungsprozess sehr flexibel ist, könnten die Oberflächen-eigenschaften in zukünftigen Studien angepasst werden, um so eine gute Zelladhäsion auch für primäre Darmzellen zu ermöglichen. Die Anwendung dieser Organoid-basierten Kulturen stellt jedoch für die präklinische Forschung eine enorme Herausforderung dar, da die Kultivierung komplex und zudem sehr zeit- und kosten-intensiv ist. Im Hinblick auf das hohe Potenzial der primären intestinalen Sphäroide/Organoide und der Notwendigkeit eines vereinfachten aber prädiktiven Modells für präklinische Forschungs-zwecke, befasste sich der zweite Teil der Arbeit mit der Etablierung einer primären immortalisierten intestinalen Zelllinie, die eine standardisierte und kosteneffiziente Kultur ermöglicht, wobei die zelluläre Vielfalt der in vitro Organoid-Kulturen erhalten bleibt. In dieser Studie wurden primäre Organoide aus dem murinen und dem menschlichen Dünndarm durch die ektopische Expression eines 10- (murin) bzw. 12 Komponenten (human) Pools von Genen, welche im Hinblick auf die Regulation der Stammzellen und dem Zellzyklus bekannt sind, in Zusammenarbeit mit der InSCREENeX GmbH in einer 2D- und 3D-basierten Transduktionsstrategie immortalisiert. In erster Linie wurden die etablierten Zelllinien (Zellklone) auf ihren Bedarf an Wachstumsfaktoren für die Kultivierung unter vereinfachten und kosteneffizienten Bedingungen hin untersucht. Während die murinen Zellklone auf unbeschichteten Kunststoff in einer Mediumformulierung mit hEGF, mNoggin, Y-27632 und 10% FCS wuchsen, zeigten die humanen Zellklone eine Notwendigkeit für eine Col I-Vorbeschichtung zusammen mit einer Zusammensetzung des Mediums, wie sie üblicherweise für primäre humane Sphäroide/Organoide verwendet wird. Darüber hinaus führten diese vorangegangenen Analysen dazu, dass nur ein humaner Zellklon und drei murine Zellklone umfänglich charakterisiert wurden. Studien zu proliferativen Eigenschaften und spezifischen Gen- sowie Proteinexpressionsprofilen dieser Klone haben gezeigt, dass vermutlich Vorläuferzellen (TACs) anstelle der differenzierten Zelltypen der primären Organoide immortalisiert wurden, da die Kultivierung in 2D, 3D oder in Transwell®-basierten Modellen zu einem geringfügig veränderten Genexpressionsprofil im Vergleich untereinander und zudem zu einem stark reduzierten mRNA-Transkriptionswert für die analysierten Markergene, welche die differenzierten Zelltypen des nativen Epithels repräsentieren, die Folge war. Weiterhin zeigte die 3D-Kultivierung die Bildung von Sphäroid-ähnlichen Strukturen, jedoch keine Organoid-ähnlichen Strukturen unter verlängerten Kultur-bedingungen, was darauf hinweist, dass diese Zellpopulationen ihre Eigenschaft zur Differenzierung hin zu spezifischen intestinalen Zelltypen eingebüßt haben. Die Transwell®-basierten Modelle, welche für jeden Klon etabliert wurden, weisen zudem Organ-spezifische Eigenschaften auf, wie eine epitheliale Morphologie, ein charakteristisches Protein-expressionsprofil mit einer apikalen Schleimschicht, welche den Villin-1 positiven Zelllayer bedeckt und somit den Nachweis erbringt, dass die entstandenen immortalisierten Zellpopulationen zu einem gewissen Anteil aus Becherzellen und Enterozyten bestehen. Zudem konnten repräsentative Tight-Junction Komplexe, die auf eine dichte epitheliale Barriere hinweisen, in entsprechenden Proteinexpressionsprofilanalysen nachgewiesen werden. Der Nachweis einer sowohl dichten als auch funktionellen epithelialen Barriere konnte weitergehend durch TEER-Messungen und in vivo-ähnliche Transportmechanismen für die etablierten Zellklone qualifiziert werden, wodurch diese Zellen als alternative Zellquelle für in vitro Modelle des Dünndarms verwendet werden können. Darüber hinaus begünstigt die einfache Handhabung und Zellexpansion unter kostengünstigeren Bedingungen im Vergleich zu primären Organoidkulturen den Einsatz dieser neu-generierten Zellklone für Bioverfügbarkeits-Studien. Zusammenfassend zeigte diese Arbeit neue Komponenten, strukturelle und zelluläre, für die Etablierung alternativer in vitro-Modelle des Dünndarmepithels, die in präklinischen Screenings für reproduzierbare Studien hinsichtlich der Medikamententestung verwendet werden können. KW - Dünndarm KW - In vitro KW - Tissue Engineering KW - intestinal in vitro model KW - bacterial nanocellulose KW - primary-cell-derived immortalized cell line KW - in vitro Modelle KW - Bakterielle Nanocellulose KW - Primär-basierte immortalisierte Zelllinie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244107 ER -