TY - THES A1 - Kunze, Andrea Birgit T1 - Etablierung eines dreidimensionalen Tumormodells für das orale Plattenepithelkarzinom unter Einsatz von Tissue Engineering T1 - Establishment of a three-dimensional tumor model for oral squamous cell carcinoma using tissue engineering N2 - Gegenstand dieser Arbeit war die Etablierung eines dreidimensionalen in vitro Tumormodells, welches ein orales in vivo Plattenepithelkarzinom nachbilden sollte. Dabei standen Aufbau, Reproduzierbarkeit und Reliabilität an vorderster Stelle. Als Zellquelle sollten sowohl Tumorzellen aus den Zelllinien FaDu, HLaC79 und HLaC79 Clone 1 als auch primäre Zellen aus karzinogenem Primärgewebe dienen. Als Referenz wurden dabei stets Modelle aus primär isolierten Zellen herangezogen, die ein Äquivalent zur gesunden Mundschleimhaut bildeten. Während der Isolationsvorgang von pathologischen Zellen primärer Plattenepithelkarzinomen aus der Mundhöhle und dem Pharynx aufgrund zahlreicher Kontaminationen und Stagnationen des Zellwachstums keinen Erfolg erzielte und der Versuch eingestellt wurde, war es mit den Tumorzelllinien FaDu und HLaC79 möglich, dreidimensionale in vitro Tumormodelle herzustellen. Ihre Malignität wurde durch die besonderen histologischen Architekturstörungen wie die geringere Epitheldicke, das Fehlen einer Parakeratinisierung im Stratum corneum und die Invasion von Tumorzellen in die Submukosa verdeutlicht. Um einen eindeutigen Vergleich zu den Mukosaäquivalenten zu ziehen, fand eine Immunhistochemie mit unterschiedlichen Markern statt, die vor allem den gestörten Epithelaufbau des Tumormodells verdeutlichte. Als Maß für die Zell-Zell-Kontakte, die im Laufe der Kultivierung entstanden, diente der transepitheliale elektrische Widerstand. Die Behandlung der Tumorzellen und Tumormodelle mit dem klinisch bewährten Zytostatikum Paclitaxel und dem neuen Polyether-Antibiotikum Salinomycin erzielte vor allem in der zweidimensionalen Kultivierung große Erfolge. Hier wurde verdeutlicht, dass Paclitaxel toxisch auf die HLaC79 Tumorzellen wirkt, während die paclitaxelresistenten HLaC79 Clone 1 Tumorzellen immun gegen dieses Medikament sind. Salinomycin hingegen sorgte für eine Verringerung der Zellviabilität bei beiden Zelllinien. Die histologischen Untersuchungen nach der 24-stündigen Medikamentenapplikation mit Paclitaxel bei den Tumormodellen zeigten keine signifikanten Unterschiede, während der transepitheliale elektrische Widerstand stieg und auf eine verstärkte Barriere nach Paclitaxelgabe schließen ließ. N2 - The subject of this work was the establishment of a three-dimensional in vitro tumor model, which should simulate an oral in vivo squamous cell carcinoma. Structure, reproducibility and reliability were paramount. Both tumor cells from the FaDu, HLaC79 and HLaC79 Clone 1 cell lines and primary cells from carcinogenic primary tissue should serve as the cell source. Models from primary isolated cells, which are equivalent to healthy oral mucosa, were used as a reference. While the isolation process of pathological cells of primary squamous cell carcinomas from the oral cavity and the pharynx was unsuccessful due to numerous contamination and stagnation of cell growth, the FaDu and HLaC79 tumor cell lines made it possible to produce three-dimensional in vitro tumor models. Their malignancy was illustrated by the histological architectural disorders such as the reduced epithelial thickness, the lack of parakeratinization in the stratum corneum and the invasion of tumor cells into the submucosa. To make a clear comparison with the mucosa equivalents, an immunohistochemistry with different markers was carried out, which above all clarified the disturbed epithelial structure of the tumor model. The transepithelial electrical resistance was used as a measure of the cell-cell contacts that developed during cultivation. The treatment of tumor cells and tumor models with the clinically proven cytostatic agent paclitaxel and the new polyether antibiotic salinomycin achieved great success, especially in two-dimensional cultivation. It was made clear here that paclitaxel has a toxic effect on the HLaC79 tumor cells, while the paclitaxel-resistant HLaC79 clone 1 tumor cells are immune to this drug. Salinomycin, however, reduced the cell viability of both cell lines. The histological examinations after the 24-hour drug application with paclitaxel in the tumor models showed no significant differences, while the transepithelial electrical resistance increased and suggested a stronger barrier after paclitaxel administration. KW - Tissue Engineering KW - Plattenepithelcarcinom KW - Mundschleimhaut KW - in-vitro-Modell KW - Tumorzelllinien KW - in-vitro-Testsysteme KW - Paclitaxel KW - Salinomycin Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223356 ER - TY - THES A1 - Waltermann, Leopold-Maximilian Johannes T1 - Charakterisierung und Standardisierung eines in-vitro Modells der oralen Mukosa für die präklinische Forschung T1 - Characterization and standardization of an in-vitro oral mucosa model for preclinical research N2 - Bisherige per Tissue Engineering hergestellte Testsysteme der Mundschleimhaut basieren in der Regel auf allogenen und teils dysplastischen Keratinozyten. Dies schmälert die Aussagekraft der gewonnenen Ergebnisse hinsichtlich des Anspruchs, Nativgewebe bestmöglich nachzubilden. In der vorliegenden Arbeit sollte daher ein am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin entwickeltes Protokoll zur Herstellung dreidimensionaler epidermaler Oralmukosaäquivalente auf Basis autologer Keratinozyten auf seine Eigenschaften und Einsatzmöglichkeit als in-vitro Testsystem untersucht werden. Nach erfolgreicher Isolierung und Kultivierung im Monolayer konnten insgesamt 420 Modelle zu drei verschiedenen Zeitpunkten (Passagen) aufgebaut werden. Die Untersuchung von Histologie, Viabilität und Barrierefunktion mittels MTT, TEER und Natriumfluoresceinpermeabilität konnte einen suffizienten Aufbau von verhorntem, mehrschichtigen oralen Plattenepithel nachweisen. Gleichzeitig konnte eine Abnahme der Epithelqualität mit steigendem Keratinozytenalter festgestellt werden. Eine sich anschließende Untersuchung von 14 Cytokeratinen sowie Apoptosemarkern per effizienzkorrigierter und normalisierter RT-qPCR konnte die Überlegenheit der dreidimensionalen autologen Oralmukosaäquivalente gegenüber der zweidimensionalen Monolayerkultur auf Genebene zeigen. N2 - Current tissue-engineered oral mucosa test systems are usually based on allogenic, mostly dysplastic keratinocytes. Their ability to mimic native tissue sufficiently is therefore limited. Hence the aim of the present work was to examine the characteristics and possible applications of an autologous oral mucosa equivalent based on a protocol developed at the Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Following isolation and monolayer cultivation, 420 equivalents could successfully be built at three different time points. Histology as well as viability and barrier assays (MTT, TEER, sodium-fluoresceine-permeability) revealed sufficient stratification and cornification. Concomitantly, decreasing epithelium quality was associated with a prolongated previous monolayer cultivation. In addition, efficiency corrected and normalized RT-qPCR of 14 cytokeratins and apoptosis marker genes showed the superiority of three dimensional oral mucosa equivalents over two dimensional monolayers on gene level. KW - Tissue Engineering KW - Mundschleimhaut KW - Epithel KW - Real time quantitative PCR KW - Cytokeratine KW - Oralmukosa KW - Mukosamodell KW - Oralmukosamodell KW - RT-qPCR KW - Viabilität KW - oral mucosa model KW - viability Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-222032 ER - TY - THES A1 - Mildenberger, Michael T1 - Untersuchung von im Tissue-Engineering-Verfahren hergestellten Oral-Mukosa-Äquivalenten mittels RT-qPCR (reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction) T1 - Examination of tissue engineered oral mucosa equivalents by RT-qPCR (reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction) N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden Fibroblasten und Keratinozyten, welche in vitro auf unterschiedlichen Scaffolds sowohl gemeinsam als auch in Monokulturen gezüchtet wurden, mittels Real-time PCR auf ihre Genausschüttung untersucht, um festzustellen wie sich die Unterlage auf die Genausschüttung auswirkt. Hierzu wurden die Proben sowohl auf die Genexpressionsmarker für die Basallamina Kollagen IV, Laminin 1 und 5 als auch auf die Genexpressionsmarker für die frühe Differenzierung Keratin K13 und K14 untersucht. Als Referenzgen wurde β-Actin ausgewählt, da dieses Gen in den Vorversuchen mit zwei weiteren Referenzgenen die stabilste Expression gezeigt hatte. Die Genexpressionsanalyse zeigte, dass nur in den Kokulturen von Keratinozyten und Fibroblasten eine ausgewogene Genexpression stattfindet, da sich die Zellen darin beeinflussen und regulieren. N2 - Fibroblasts and keratinocytes were cultured in vitro on different scaffolds in monocultures and cocultures and examined by RT-qPCR for gene expression. Gene expression analysis was made for genes coding for basement Membrane collagen IV, laminin 1 and 5 and for early differentiation keratin K13 and K14. β-Actin was used as reference gene, because it showed in preliminary tests with two other reference genes most stable expression. Gene expression analysis showed only in cocultures of fibroblasts and keratinocytes balanced gene expression, because the two cell types affect and regulate each other. KW - Real time quantitative PCR KW - Tissue Engineering KW - Mundschleimhaut KW - Referenzgen Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155286 ER -