TY - THES A1 - Liess [née Eller], Anna Katharina Luise T1 - Understanding the regulation of the ubiquitin-conjugating enzyme UBE2S T1 - Die Regulation des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S N2 - The ubiquitination of proteins serves as molecular signal to control an enormous number of physiological processes and its dysregulation is connected to human diseases like cancer. The versatility of this signal stems from the diverse ways by which ubiquitin can be attached to its targets. Thus, specificity and tight regulation of the ubiquitination are pivotal requirements of ubiquitin signaling. Ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) act at the heart of the ubiquitination cascade, transferring ubiquitin from a ubiquitin-activating enzyme (E1) to a ubiquitin ligase (E3) or substrate. When cooperating with a RING-type E3, ubiquitin-conjugating enzymes can determine linkage specificity in ubiquitin chain formation. Our understanding of the regulation of E2 activities is still limited at a structural level. The work described here identifies two regulation mechanisms in UBE2S, a cognate E2 of the human RING-type E3 anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C). UBE2S elongates ubiquitin chains on APC/C substrates in a Lys11 linkage-specific manner, thereby targeting these substrates for degradation and driving mitotic progression. In addition, UBE2S was found to have a role in DNA repair by enhancing non-homologous end-joining (NHEJ) and causing transcriptional arrest at DNA damage sites in homologous recombination (HR). Furthermore, UBE2S overexpression is a characteristic feature of many cancer types and is connected to poor prognosis and diminished response to therapy. The first regulatory mechanism uncovered in this thesis involves the intramolecular auto-ubiquitination of a particular lysine residue (Lys+5) close to the active site cysteine, presumably through conformational flexibility of the active site region. The Lys+5-linked ubiquitin molecule adopts a donor-like, ‘closed’ orientation towards UBE2S, thereby conferring auto-inhibition. Notably, Lys+5 is a major physiological ubiquitination site in ~25% of the human E2 enzymes, thus providing regulatory opportunities beyond UBE2S. Besides the active, monomeric state and the auto-inhibited state caused by auto-ubiquitination, I discovered that UBE2S can adopt a dimeric state. The latter also provides an auto-inhibited state, in which ubiquitin transfer is blocked via the obstruction of donor binding. UBE2S dimerization is promoted by its unique C-terminal extension, suppresses auto-ubiquitination and thereby the proteasomal degradation of UBE2S. Taken together, the data provided in this thesis illustrate the intricate ways by which UBE2S activity is fine-tuned and the notion that structurally diverse mechanisms have evolved to restrict the first step in the catalytic cycle of E2 enzymes. N2 - Die Ubiquitinierung von Proteinen fungiert als molekulares Signal zur Kontrolle einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wobei eine gestörte Regulation der Ubiquitinierung eng mit zahlreichen Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, verbunden ist. Aufgrund der verschiedenen Verknüpfungsmöglichkeiten von Ubiquitin, die das zelluläre Schicksal des Zielproteins bestimmen, sind Spezifität und stringente Regulation unabkömmliche Voraussetzungen im Ubiquitinierungsprozess. Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2s) fungieren in der Mitte der Ubiquitinierungskaskade. Sie übernehmen ein Ubiquitinmolekül vom Ubiquitin-aktivierenden Enzym (E1) und übertragen es auf eine Ubiquitin-Ligase (E3) oder direkt auf das Zielprotein. Arbeiten Ubiquitin-konjugierende Enzyme mit E3s des RING-Typus zusammen, so bestimmen E2s die Art der Verknüpfung. Die Regulation der Aktivität Ubiquitin-konjugierender Enzyme auf struktureller Ebene ist jedoch bisher nur bedingt verstanden. Die hier dargelegte Arbeit umfasst die Identifizierung zweier Regulationsmechanismen des Ubiquitin-konjugierenden Enzyms UBE2S. UBE2S arbeitet mit einem humanen E3 des RING-Typus‚ dem ‚Anaphase Promoting Complex/Cyclosome‘ (APC/C) zusammen und bildet Lys11-spezifische Ubiquitinketten auf Substraten des APC/Cs. Hierdurch werden die Substrate für den Abbau durch das Proteasom markiert, was das Fortschreiten der Mitose bedingt. Zusätzlich wird UBE2S eine Rolle in der DNS-Reparatur zugeschrieben. Hierbei verstärkt UBE2S die nicht-homologe Rekombination (NHEJ) und verhindert außerdem die Transkription an DNS-Bruchstellen, die durch Homologe Rekombination (HR) repariert werden. Die Überexpression von UBE2S ist ein Charakteristikum verschiedenster Krebsarten, vermindert den Erfolg herkömmlicher Krebstherapien, und führt somit zu schlechten Prognosen für betroffenen Patienten. Der erste hier beschriebene Regulationsmechanismus beinhaltet die intramolekulare Ubiquitinierung eines Lysins (Lys+5) nahe des katalytischen Cysteins, mutmaßlich durch strukturelle Flexibilität der Region des aktiven Zentrums. Das Lys+5-verknüpfte Ubiquitin nimmt eine Donorubiquitin-ähnliche Position auf UBE2S ein, wodurch UBE2S gehemmt wird. Da ein Lysin an der Position +5 in ~25% der humanen E2-Enzyme vorhanden und eine physiologische Ubiquitinierungsstelle ist, birgt dieser Mechanismus Regulationsmöglichkeiten über UBE2S hinaus. Zusätzlich zum aktiven monomeren Zustand und dem durch Autoubiquitinierung ausgelösten inhibierten Zustand, kann UBE2S auch als Dimer vorliegen. In diesem Zustand ist es ebenfalls inaktiv, da die Donorubiquitin-Bindestelle auf UBE2S durch ein zweites Molekül des E2s blockiert wird. Begünstigt wird die Dimerisierung durch die C-terminale Verlängerung von UBE2S und verhindert so deren Autoubiquitinierung, und folglich den proteasomalen Abbau von UBE2S. Es handelt sich hierbei somit um einen zweiten Regulationsmechanismus von UBE2S. Zusammenfassend veranschaulichen die in dieser Arbeit dargelegten Daten die komplexen Möglichkeiten, durch die die Aktivität von UBE2S reguliert werden kann, sowie die Erkenntnis, dass strukturell unterschiedliche Mechanismen existieren, um den ersten Schritt der von Ubiquitin-konjugierenden Enzymen katalysierten Reaktion zu hemmen. KW - E2 KW - Regulation KW - Ubiquitin KW - Mechanismus KW - UBE2S KW - structural mechanism KW - Ubiquitin-conjugating enzyme KW - regulation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204190 ER - TY - THES A1 - Kasaragod, Vikram Babu T1 - Biochemical and Structural Basis for the Moonlighting Function of Gephyrin T1 - Biochemische und Strukturelle Basis für die duale Funktionalität von Gephyrin N2 - Neurons are specialized cells dedicated to transmit the nerve impulses throughout the human body across specialized structures called synapses. At the synaptic terminals, a crosstalk between multiple macromolecules regulates the structure and function of the presynaptic nerve endings and the postsynaptic recipient sites. Gephyrin is the central organizer at inhibitory postsynaptic specializations and plays a crucial role in the organization of these structures by anchoring GABAA receptors (GABAAR) and glycine receptors (GlyR) to the postsynaptic membrane. This 93 kDa protein features an N-terminal G domain and a C-terminal E domain and the latter interacts directly with the intracellular loop between transmembrane helices 3 and 4 of certain subunits of the GlyRs and GABAARs. Biochemical and structural analyses have already provided valuable insights into the gephyrin-GlyR interaction. Interestingly, biochemical studies on the gephyrin-GABAAR interaction demonstrated that the GABAARs also depend on the same binding site as the GlyRs for the interaction with the gephyrin, but the molecular basis for this receptor specific interaction of gephyrin was still unknown. Co-crystal structures of GephE-GABAAR α3- derived peptides with supporting biochemical data presented in this study deciphered the receptor-specific interactions of gephyrin in atomic detail. In its moonlighting function, gephyrin also catalyzes the terminal step of the evolutionarily conserved molybdenum cofactor biosynthesis. Molybdenum, an essential transition element has to be complexed with a pterin-based cofactor resulting in the formation of the molybdenum cofactor (Moco). Moco is an essential component at the active site of all molybdenum-containing enzymes with the exception of nitrogenase. Mutations in enzymes involved in this pathway lead to a rare yet severe disease called Moco deficiency, which manifest itself in severe neurodevelopmental abnormalities and early childhood death. Moco biosynthesis follows a complex multistep pathway, where in the penultimate step, the N-terminal G domain of gephyrin activates the molybdopterin to form an adenylated molybdopterin intermediate. In the terminal step, this intermediate is then transferred to the C-terminal E domain of gephyrin, which catalyzes the metal insertion and deadenylation reaction to form active Moco. Previous biochemical and structural studies provided valuable insights into the penultimate step of the Moco biosynthesis but the terminal step remained elusive. Through the course of my dissertation, I crystallized the C-terminal E domain in the apo-form as well as in complex with ADP and AMP. These structures shed lightonto the deadenylation reaction and the formation of a ternary E-domain-ADP-Mo/W complex and thus provide structural insight into the metal insertion mechanism. Moreover, the structures also provided molecular insights into a mutation leading to Moco deficiency. Finally, ternary complexes of GephE, ADP and receptor-derived peptides provided first clues regarding the integration of gephyrin’s dual functionality. In summary, during the course of the dissertation I was able to derive high resolution structural insights into the interactions between gephyrin and GABAARs, which explain the receptor-specific interaction of gephyrin and, furthermore, these studies can be extended in the future to understand GABAAR subunit-specific interactions of gephyrin. Finally, the understanding of Moco biosynthesis shed light on the molecular basis of the fatal Moco deficiency. N2 - Neurone sind spezialisierte Zellen, die über die Synapsen Nervenimpulse im menschlichen Körper übertragen. An den synaptischen Enden reguliert ein Netzwerk aus einer Vielzahl von Makromolekülen die Struktur und die Funktion der präsynaptischen Nervenenden und der postsynaptischen Kontaktstellen. Gephyrin ist der Hauptorganisator an inhibitorischen, postsynaptischen Spezialisierungen und spielt durch die Verankerung von GABAA-Rezeptoren (GABAAR) und Glycinrezeptoren (GlyR) in der postsynaptischen Membran eine zentrale Rolle für den Aufbau dieser Strukturen. Dieses 93 kDa Protein enthält eine N-terminale G-Domäne (GephG) und eine C-terminale E-Domäne (GephE), wobei letztere direkt mit der intrazellulären unstrukturierten Region zwischen Transmembranhelices 3 und 4 bestimmter Untereinheiten der GlyR und GABAAR interagiert. Biochemische und strukturelle Analysen lieferten bereits wertvolle Erkenntnisse über die Gephyrin-GlyR Interaktion. Interessanterweise zeigten Versuche zur Gephyrin-GABAAR Interaktion, dass GABAARs die gleiche Bindungsstelle auf Gephyrin benutzen wie GlyRs, wobei die molekulare Basis für diese Interaktion nicht bekannt war. In dieser Arbeit zeige ich Co-Kristallstrukturen von GephE-GABAARα3 sowie unterstützende biochemische Daten, die die atomaren Details der rezeptorspezifischen Interaktionen von Gephyrin entschlüsseln. Als zweite Funktion katalysiert Gephyrin den terminalen Schritt der evolutionär konservierten Molybdän Cofaktor Biosynthese. Dabei muss das essentielle Übergangselement Molybdän mit einem Pterin-basierten Cofaktor komplexiert werden, um den Molybdän Cofaktor (Moco) zu bilden. Moco ist essentieller Bestandteil im aktiven Zentrum aller Molybdän-enthaltenden Enzyme mit Ausnahme der Nitrogenase. Mutationen in Enzymen, die in die Molybdän Cofaktor Biosynthese involviert sind, verursachen eine Moco Defizienz, eine seltene, jedoch schwere Erkrankung, die sich durch schwere neurologische Entwicklungsstörungen und Tod im frühen Kindesalter äußert. Die Moco Biosynthese folgt einem komplexen mehrstufigen Ablauf. Im vorletzten Schritt adenyliert GephG das Molybdopterin und ein Zwischenprodukt entsteht. Im letzten Schritt wird dieses Zwischenprodukt auf GephE übertragen, das die Insertion des Metalls und die Deadenylierungsreaktion katalysiert, wodurch der aktive Moco entsteht. Frühere biochemische und strukturelle Studien brachten wertvolle Erkenntnisse über den vorletzten Schritt der Moco Biosynthese, aber die Kenntnisse über den letzten Schritt blieben vage. Während meiner Dissertation kristallisierte ich GephE in der apo-Form sowie im Komplex mit ADP oder AMP. Diese Strukturen gaben Aufschluss über die Deadenylierungsreaktion und die Formation eines ternären GephE-ADP-Mo/W Komplexes und gewährten so einen strukturellen Einblick in den Mechanismus der Metallinsertion. Darüber hinaus ermöglichten die Strukturen eine Mutation, die zu Moco Mangel führt, auf molekularer Ebene zu verstehen. Schließlich lieferten ternäre Komplexe aus GephE, ADP und von Rezeptoren abgeleiteten Peptiden ersten Aufschluss bezüglich der Verflechtung von Gephyrins dualer Funktion. Zusammenfassend konnte ich während der Dissertation hochauflösende strukturelle Einblicke in den Komplex aus GephE und GABAAR α3 Untereineinheit gewinnen, die die rezeptorspezifische Interaktion von Gephyrin erklären. Weiterhin können diese Studien in der Zukunft ausgeweitet werden, um die GABAAR-untereinheitenspezifische Interaktion mit Gephyrin zu verstehen. Schließlich erlauben die Studien zur Moco Biosynthese die tödliche Moco Defizienz auf molekularer Ebene zu verstehen. KW - Gephyrin KW - Moco biosynthesis Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143077 ER - TY - THES A1 - Carstensen, Anne Carola T1 - Identification of novel N-MYC interacting proteins reveals N-MYC interaction with TFIIIC T1 - Identifizierung von neuen N-MYC interagierenden Proteinen offenbart N-MYC's Interaktion mit TFIIIC N2 - N-MYC is a member of the human MYC proto-oncogene family, which comprises three transcription factors (C-, N- and L-MYC) that function in multiple biological processes. Deregulated expression of MYC proteins is linked to tumour initiation, maintenance and progression. For example, a large fraction of neuroblastoma displays high N-MYC levels due to an amplification of the N-MYC encoding gene. MYCN-amplified neuroblastoma depend on high N-MYC protein levels, which are maintained by Aurora-A kinase. Aurora-A interaction with N-MYC interferes with degradation of N-MYC via the E3 ubiquitin ligase SCFFBXW7. However, the underlying mechanism of Aurora-A-mediated stabilisation of N-MYC remains to be elucidated. To identify novel N-MYC interacting proteins, which could be involved in N-MYC stabilisation by Aurora-A, a proteomic analysis of purified N-MYC protein complexes was conducted. Since two alanine mutations in MBI of N-MYC, T58A and S62A (N-MYC mut), disable Aurora-A-mediated stabilisation of N-MYC, N-MYC protein complexes from cells expressing either N-MYC wt or mut were analysed. Proteomic analysis revealed that N-MYC interacts with two deubiquitinating enzymes, USP7 and USP11, which catalyse the removal of ubiquitin chains from target proteins, preventing recognition by the proteasome and subsequent degradation. Although N-MYC interaction with USP7 and USP11 was confirmed in subsequent immunoprecipitation experiments, neither USP7, nor USP11 was shown to be involved in the regulation of N-MYC stability. Besides USP7/11, proteomic analyses identified numerous additional N-MYC interacting proteins that were not described to interact with MYC transcription factors previously. Interestingly, many of the identified N-MYC interaction partners displayed a preference for the interaction with N-MYC wt, suggesting a MBI-dependent interaction. Among these were several proteins, which are involved in three-dimensional organisation of chromatin domains and transcriptional elongation by POL II. Not only the interaction of N-MYC with proteins functioning in elongation, such as the DSIF component SPT5 and the PAF1C components CDC73 and CTR9, was validated in immunoprecipitation experiments, but also with the POL III transcription factor TFIIIC and topoisomerases TOP2A/B. ChIP-sequencing analysis of N-MYC and TFIIIC subunit 5 (TFIIIC5) revealed a large number of joint binding sites in POL II promoters and intergenic regions, which are characterised by the presence of a specific motif that is highly similar to the CTCF motif. Additionally, N-MYC was shown to interact with the ring-shaped cohesin complex that is known to bind to CTCF motifs and to assist the insulator protein CTCF. Importantly, individual ChIP experiments demonstrated that N-MYC, TFIIIC5 and cohesin subunit RAD21 occupy joint binding sites comprising a CTCF motif. Collectively, the results indicate that N-MYC functions in two biological processes that have not been linked to MYC biology previously. Furthermore, the identification of joint binding sites of N-MYC, TFIIIC and cohesin and the confirmation of their interaction with each other suggests a novel function of MYC transcription factors in three-dimensional organisation of chromatin. N2 - N-MYC ist ein Mitglied der humanen MYC proto-Onkogen Familie, welche drei Transkriptionsfaktoren umfasst (C-,N- und L-MYC), die in zahlreichen biologischen Prozessen fun-gieren. Deregulierte Expression der MYC Proteine ist mit Tumorinitiierung, -erhalt und -progression verbunden. Zum Beispiel zeigt ein großer Anteil an Neuroblastomen aufgrund einer Amplifizierung des N-MYC kodierenden Gens hohe N-MYC Level. MYCN-amplifizierte Neuroblastome hängen von den hohen N-MYC Protein Leveln ab, die durch die Aurora-A Kinase erhalten werden. Die Interaktion von Aurora-A mit N-MYC behindert den Abbau von N-MYC durch die E3 Ubiquitin Ligase SCFFBXW7. Allerdings muss der zugrunde liegende Mechanismus der Aurora-A vermittelten Stabilisierung von N-MYC noch aufgedeckt werden. Um neue N-MYC interagierende Proteine zu identifizieren, welche in der N-MYC Stabilisierung durch Aurora-A involviert sind, wurde eine Proteom Analyse der aufgereinigten N-MYC Proteinkomplexe durchgeführt. Da zwei Alanin-Mutationen in MBI von N-MYC, T58A und S62A (N-MYC mut), die Aurora-A vermittelte Stabilisierung von N-MYC verhindern, wurden N-MYC Protein-Komplexe von Zellen, die entweder N-MYC wt oder mut exprimieren analysiert. Die Proteom Analyse offenbarte, dass N-MYC mit zwei Deubiquitinierenden Enzymen, USP7 und USP11, interagiert, welche das Entfernen von Ubiquitinketten von Zielproteinen katalysieren und dadurch die Erkennung durch das Proteasom und den darauf folgenden Abbau verhindern. Obwohl die Interaktion von N-MYC mit USP7 und USP11 in darauf folgenden Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt wurde, konnnte weder für USP7, noch für USP11 gezeigt werden, dass es in die Regulierung der Stabilität von N-MYC involviert ist. Neben USP7/11 wurden in der Proteom Analyse zusätzlich zahlreiche mit N-MYC interagierende Proteine identifiziert, die zuvor noch nicht beschrieben wurden mit MYC Transkriptionsfaktoren zu interagieren. Interessanterweise zeigten viele der identifizierten N-MYC Interaktionspartner eine Präferenz für die Interaktion mit N-MYC wt, was eine MBI-abhängige Interaktion suggeriert. Unter diesen waren einige Proteine, die in die drei-dimensionale Organisation von Chromatindomänen und transkriptioneller Elongation durch POL II involviert sind. Nicht nur die Interaktion von N-MYC mit Proteinen, die in der Elongation agieren, wie die DSIF Komponente SPT5 und die PAF1C Komponenten CDC73 und CTR9, wurden in Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt, sondern auch mit dem POL III Transkriptionsfaktor TFIIIC und den Topoisomerasen TOP2A/B. Analyse von ChIP-Sequenzierungsexperimenten für N-MYC und TFIIIC Untereinheit 5 (TFIIIC5) offenbarte eine große Anzahl von gemeinsamen Bindungsstellen in POL II Promotoren und intergenen Regionen, welche durch das Vorkommen eines speziellen Motivs gekennzeichent waren, das dem CTCF Motiv sehr ähnlich ist. Zusätzlich wurde gezeigt, dass N-MYC mit dem ringförmigen Cohesin Komplex interagiert, der dafür bekannt ist an CTCF Motive zu binden und dem Insulator Protein CTCF zu assistieren. Entscheidender Weise zeigten individuelle ChIP Experimente, dass N-MYC, TFIIIC5 und die Cohesin Untereinheit RAD21 gemeinsame Bindungstellen haben, die ein CTCF Motiv enthalten. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass N-MYC in zwei biologischen Prozessen fungiert, die zuvor nicht mit der Biologie von MYC verbunden wurden. Zudem suggeriert die Identifizierung von gemeinsamen Bindungstellen von N-MYC, TFIIIC und Cohesin und die Bestätigung der Interaktion untereinander eine neue Funktion von MYC Transkriptionsfaktoren in der drei-dimensionalen Organisation von Chromatin. KW - Biologie KW - Transkriptionsfaktor KW - Onkogen KW - N-MYC KW - neuroblastoma KW - TFIIIC KW - Aurora-A KW - mass spectrometry KW - cohesin Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143658 ER - TY - THES A1 - Scheide-Nöth, Jan-Philipp T1 - Activation of the Interleukin-5 receptor and its inhibition by cyclic peptides T1 - Aktivierung des IL-5 Rezeptors und dessen Inhibierung durch zyklische Peptide N2 - The cytokine interleukin-5 (IL-5) is part of the TH2-mediated immune response. As a key regulator of eosinophilic granulocytes (eosinophils), IL-5 controls multiple aspects of eosinophil life. Eosinophils play a pathogenic role in the onset and progression of atopic diseases as well as hypereosinophilic syndrome (HES). Here, cytotoxic proteins and pro-inflammatory mediators stored in intracellular vesicles termed granula are released upon activation thereby causing local inflammation to fight the pathogen. However, if such inflammation persists, tissue damage and organ failure can occur. Due to the close relationship between eosinophils and IL-5 this cytokine has become a major pharmaceutical target for the treatment of atopic diseases or HES. As observed with other cytokines, IL-5 signals by assembling a heterodimeric receptor complex at the cell surface in a stepwise mechanism. In the first step IL-5 binds to its receptor IL-5Rα (CD125). This membrane-located complex then recruits the so-called common beta chain βc (CD131) into a ternary ligand receptor complex, which leads to activation of intracellular signaling cascades. Based on this mechanism various strategies targeting either IL-5 or IL-5Rα have been developed allowing to specifically abrogate IL-5 signaling. In addition to the classical approach of employing neutralizing antibodies against IL 5/IL-5Rα or antagonistic IL-5 variants, two groups comprising small 18 to 30mer peptides have been discovered, that bind to and block IL-5Rα from binding its activating ligand IL-5. Structure-function studies have provided detailed insights into the architecture and interaction of IL-5IL-5Rα and βc. However, structural information for the ternary IL-5 complex as well as IL-5 inhibiting peptides is still lacking. In this thesis three areas were investigated. Firstly, to obtain insights into the second receptor activation step, i.e. formation of the ternary ligand-receptor complex IL-5•IL-5Rα•βc, a high-yield production for the extracellular domain of βc was established to facilitate structure determination of the ternary ligand receptor assembly by either X-ray crystallography or cryo-electron microscopy. In a second project structure analysis of the ectodomain of IL-5Rα in its unbound conformation was attempted. Data on IL-5Rα in its ligand-free state would provide important information as to whether the wrench-like shaped ectodomain of IL-5Rα adopts a fixed preformed conformation or whether it is flexible to adapt to its ligand binding partner upon interaction. While crystallization of free IL-5Rα failed, as the crystals obtained did not diffract X rays to high resolution, functional analysis strongly points towards a selection fit binding mechanism for IL-5Rα instead of a rigid and fixed IL-5Rα structure. Hence IL-5 possibly binds to a partially open architecture, which then closes to the known wrench-like architecture. The latter is then stabilized by interactions within the D1-D2 interface resulting in the tight binding of IL-5. In a third project X-ray structure analysis of a complex of the IL-5 inhibitory peptide AF17121 bound to the ectodomain of IL-5Rα was performed. This novel structure shows how the small cyclic 18mer peptide tightly binds into the wrench-like cleft formed by domains D1 and D2 of IL-5Rα. Due to the partial overlap of its binding site at IL-5Rα with the epitope for IL-5 binding, the peptide blocks IL-5 from access to key residues for binding explaining how the small peptide can effectively compete with the rather large ligand IL-5. While AF17121 and IL-5 seemingly bind to the same site at IL-5Rα, functional studies however showed that recognition and binding of both ligands differ. With the structure for the peptide-receptor complex at hand, peptide design and engineering could be performed to generate AF17121 analogies with enhanced receptor affinity. Several promising positions in the peptide AF17121 could be identified, which could improve inhibition capacity and might serve as a starting point for AF17121-based peptidomimetics that can yield either superior peptide based IL-5 antagonists or small-molecule-based pharmacophores for future therapies of atopic diseases or the hypereosinophilic syndrome. N2 - Das Zytokin Interleukin-5 (IL-5) nimmt eine zentrale Rolle im Zellzyklus von eosinophlien Granulozyten (Eosinophile) ein, indem es beispielsweise die Differenzierung, Aktivierung und Apoptose dieser Zellen steuert. Als Immunantwort auf Pathogene kommt es zur Aktivierung von Eosinophilen. Dieses führt zur Freisetzung von in intrazellulären Vesikeln (Granula) gespeicherten zytotoxischen Proteinen und proinflammatorischen Mediatoren, wodurch lokale Entzündungen verursacht werden, um den Erreger zu bekämpfen. Fehlregulationen (übermäßige Produktion) von eosinophilen Granulozyten können zu Gewebeschäden und Organversagen führen, wenn diese über einen längeren Zeitraum bestehen, und sind insbesondere mit dem Ausbruch und Fortschreiten von atopischen Erkrankungen sowie dem Hypereosinophilen Syndrom (HES) assoziiert. IL-5 muss, um die Eosinophilen aktivieren zu können, an einen heterodimeren Transmembranrezeptor binden. Im ersten Schritt bindet IL-5 an seinen zytokin-spezifischen Rezeptor IL-5Rα (CD125). Dieser membrangebundene Komplex rekrutiert dann die sogenannte gemeinsame („common“) beta-Kette βc (CD131) in einen ternären Liganden Rezeptorkomplex, was zur Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden führt. Aufgrund dieser engen Beziehung zwischen Eosinophilen und IL-5 ist dieses Zytokin in den Fokus der pharmazeutischen Industrie für die Behandlung atopischer Erkrankungen oder HES gerückt. Bisherige Therapien basieren auf der Unterdrückung der Immunreaktion durch Corticosteroide, neutralisierende gegen IL 5/IL-5Rα gerichtete Antikörper oder antagonistische IL-5 Varianten. Eine alternative Therapiemöglichkeit stellen IL-5 inhibierende Peptide dar, welche an IL 5Rα binden und hierbei die Bindung des aktivierenden Liganden (IL-5) hemmen. Derzeit stehen Strukturen vom binären IL-5IL-5Rα Komplex und von βc im ungebundenen Zustand zur Verfügung. Zudem konnten wichtige Wechselwirkungen im binären Komplex identifiziert werden. Allerdings sind vom ternären IL-5 Komplex und den IL-5 inhibierenden Peptiden keinerlei Strukturdaten bekannt. Um im Rahmen dieser Arbeit Einblicke in den zweiten Rezeptoraktivierungsschritt, d.h. die Bildung des ternären Ligand-Rezeptor Komplexes IL-5•IL-5Rα•βc, zu erhalten, wurde ein Herstellungsverfahren für die extrazelluläre Domäne von βc etabliert. Zusammen mit den optimierten Reinigungsverfahren für IL-5 und IL 5Rα konnte hiermit eine gute Grundlage für zukünftige Strukturanalysen des ternären IL-5 Komplexes geschaffen werden. In einem zweiten Projekt wurde versucht, die Struktur der Ektodomäne von IL 5Rα in ihrem freien Zustand aufzuklären. Diese Strukturdaten würden wichtige Informationen darüber liefern, ob die bisher bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur der IL-5Rα Ektodomäne in einer rigiden, vorgebildeten Konformation vorliegt, oder ob die Architektur der Ektodomäne bei Bindung flexibel an ihren Liganden angepasst wird. Während die Kristallisation von IL-5Rα ohne einen Bindepartner fehlschlug, deuten neue Funktionsanalysen auf einen „selection fit binding mechanism“ für IL-5Rα hin. Der relativ große Ligand IL-5 bindet daher sehr wahrscheinlich an eine teilweise „offene“ Rezeptorkonformation, die erst nach Bindung die bekannte „Schraubenschlüssel“-Architektur annimmt. In einem dritten Projekt wurde eine Strukturanalyse des Komplexes des IL-5 inhibierenden AF17121 Peptids gebunden an die Ektodomäne von IL-5Rα durchgeführt. Anhand dieser neuen Struktur lässt sich erklären, wie das kleine zyklische 18mer Peptid effektiv mit dem wesentlich größeren Liganden IL-5 um die Bindung am Rezeptor konkurrieren kann. Aufgrund der Überlappung der Bindestellen von AF17121 und IL-5 am Rezeptor IL 5Rα blockiert das Peptid den Zugang von IL-5 an seinen Rezeptor. Obwohl AF17121 und IL-5 in einem ähnlich Strukturbereich in IL-5Rα binden, zeigen funktionelle Studien, dass sich Erkennung und Bindung beider Liganden unterscheiden. Mit der vorliegenden Struktur vom Peptid Rezeptor Komplex konnte ein strukturbasiertes Peptid-Design durchgeführt und so AF17121 Varianten mit verbesserter Rezeptorbindung erzeugt werden. Dabei wurden mehrere Positionen im Peptid AF17121 identifiziert, die dessen Inhibierungseigenschaften möglicherweise verbessern. Somit konnte ein weiterer Grundstein für die Entwicklung von effektiveren Peptid-basierten IL 5 Antagonisten oder sogar nicht-peptidischen Inhibitoren für zukünftige Therapieansätze gegen atopische Erkrankungen oder HES gelegt werden. KW - Interleukin 5 KW - Eosinophiler Granulozyt KW - atopic diseases KW - eosinophil KW - interleukin-5 signaling KW - peptide-based interleukin-5 inhibitor KW - peptide engineering KW - receptor KW - functional studies KW - structure analysis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182504 ER - TY - THES A1 - Sander, Bodo T1 - Structural and biochemical characterization of gephyrin and various gephyrin-ligand complexes T1 - Strukturelle und biochemische Charakterisierung von Gephyrin und verschiedenen Gephyrin-Liganden-Komplexen N2 - Efficient synaptic neurotransmission requires the exact apposition of presynaptic terminals and matching neurotransmitter receptor clusters on the postsynaptic side. The receptors are embedded in the postsynaptic density, which also contains scaffolding and regulatory proteins that ensure high local receptor concentrations. At inhibitory synapses the cytosolic scaffolding protein gephyrin assumes an essential organizing role within the postsynaptic density by the formation of self-oligomers which provide a high density of binding sites for certain -amino butyric acid type A (GABAA) and the large majority of glycine receptors (GlyR). Gephyrin contains two oligomerization domains: In isolation, the 20 kDa N-terminal G domain (GephG) and the 46 kDa E domain (GephE) trimerize and dimerize, respectively. In the full-length protein the domains are interconnected by a central ~150 amino acid linker, and only GephG trimerization is utilized, whereas GephE dimerization is prevented, thus suggesting the need for a trigger to release GephE autoinhibition, which would pave the way for the formation of higher oligomers and for efficient receptor clustering. The structural basis for this GephE autoinhibition has remained elusive so far, but the linker was reported to be sufficient for autoinhibition. This work dealt with the biochemical and structural characterization of apo-gephyrin and gephyrin in complexes with ligands which are known to promote the formation of synaptic gephyrin clusters (collybistin and neuroligin 2) and reorganize them (dynein light chain 1). For full-length gephyrin no structural information has been available so far. Atomic force microscopy (AFM) and small-angle X-ray scattering (SAXS) analyses described in this thesis disclosed that the gephyrin trimer forms a highly flexible assembly, which, due to the long linker, can switch between compact and extended conformational states in solution, with a preference for compact states. This partial compaction and potentially GephE autoinhibition are achieved by interactions of parts of the linker with the G and E domains, as suggested by circular dichroism spectroscopy. However, the linker on its own cannot account for GephE blockage, as size exclusion chromatography experiments coupled with multi angle light scattering detection (SEC-MALS) and SAXS analyses revealed that a gephyrin variant only encompassing the linker and GephE (GephLE) forms dimers and not monomers as suggested by an earlier study. The oligomeric state of GephLE and the observation that several gephyrin variants, in which linker segments of varying length were deleted, predominantly formed trimers, suggested the presence of a linker independent mechanism of GephE dimerization blockade. Taken together, the data indicated that linker-dependent and linker-independent mechanisms mediate gephyrin autoinhibition. In the second project gephyrin’s interaction with DYNLL1 (Dynein LC8 Light Chain 1) was characterized. DYNLL1 is a 25 kDa dimer incorporated into the dynein motor and provides two binding sites, each of which can accommodate an octapeptide derived from gephyrin’s linker region (referred to as GephDB). Originally, DYNLL1 was regarded as a cargo adaptor, linking gephyrin-GlyR complexes to the dynein motor, thus driving their retrograde transport and leading to a decrease of synaptic gephyrin-GlyR complexes. Building on these studies, this thesis assessed the cargo hypothesis as well as the so far unclear stoichiometry of the gephyrin-DYNLL1 complex. The cargo scenario would require ternary complex formation between gephyrin, DYNLL1 and the dynein intermediate chain (DIC) of the dynein motor. However, such a complex could not be detected by analytical size exclusion chromatography (aSEC) experiments – presumably because gephyrin and DIC competed for a common binding site in DYNLL1. This finding was consistent with a single DYNLL1 dimer capturing two linker segments of a single gephyrin trimer as suggested by a 26 kDa mass increase of the gephyrin species in the presence of DYNLL1 in SEC-MALS experiments. aSEC experiments at even higher concentrations (~20 µM gephyrin and ~80 µM DYNLL1) indicated that the affinity of GephDB was significantly impaired in the context of full-length gephyrin but also in a variant that bears only GephG and the first 39 residues of the linker (GephGL220). Presumably due to avidity effects two linkers stably associated with a single DYNLL1 dimer, whereas the third DYNLL1 binding motif remained predominantly unoccupied unless high concentrations of GephGL220 (50 µM) and DYNLL1 (200 µM) were used. These findings indicate that an interplay between GephG and the N-terminal linker segment mediates the attenuation of GephDB affinity towards DYNLL1 and that preventing DYNLL1 from the induction of higher gephyrin oligomers is either advantageous for DYNLL1-mediated reorganization of gephyrin-GlyR clusters or that DYNLL1 exerts possibly two (concentration-dependent) actions on gephyrin. The gephyrin-collybistin-neuroligin 2 complex was the subject of the third project. Previously, collybistin and gephyrin were observed to mutually trigger their translocation to the postsynaptic membrane, where the disordered cytoplasmic tail of the postsynaptic cell adhesion molecule NL2 (NL2cyt) causes the anchoring of collybistin 2 (CB2) by binding to its SH3 domain, thereby releasing SH3 domain mediated autoinhibiton of CB2 binding to the membrane phospholipid phosphatidylinositol-3-phosphate. Critical for this event is the binding of gephyrin to both CB2 and NL2, presumably via GephE. Following up on these previous studies biochemical data presented in this thesis confirm the formation of the ternary complex. Unexpectedly, analyses by means of native polyacrylamide gel electrophoresis pointed to: (1) The existence of a complex containing NL2cyt and CB2 lacking the SH3 domain and consequently an additional NL2 binding site in CB2. (2) Attenuated gephyrin-collybistin complex formation in the presence of the SH3 domain. (3) A requirement for high NL2cyt concentrations (> 30 µM) during the formation of the ternary complex. This might allow for the regulation by other factors such as additional binding partners or posttranslational modifications. Although of preliminary character, these results provide a starting point for future studies, which will hopefully elucidate the interplay between gephyrin, collybistin, NL2 and certain GABAA receptors. N2 - Eine effiziente synaptische Neurotransmission macht es erforderlich, dass sich presynaptische Nervenenden und die Schar (engl. Cluster) der dazugehörigen Neurotransmitterrezeptoren auf der postsynaptischen Seite exakt gegenüberliegen. Die Rezeptoren sind in der postsynaptischen Dichte eingebettet, die auch Gerüstproteine und regulatorische Proteine enthält, die hohe lokale Rezeptor-Konzentrationen gewährleisten. An inhibitorischen Synapsen übernimmt das cytosolische Gerüstprotein Gephyrin eine essentielle Rolle in der postsynaptischen Dichte durch die Bildung von Homo-Oligomeren, die für eine hohe Dichte an Bindungsstellen für bestimmte -Aminobuttersäure Typ A- (GABAA)- und die große Mehrheit der Glyzin-Rezeptoren (GlyR) sorgen. Gephyrin enthält zwei Oligomerisierungsdomänen: In isolierter Form bildet die N-terminale 20 kDa große G-Domäne (GephG) und die C-terminale 46 kDa große E-Domäne (GephE) Trimere beziehungsweise Dimere. Im Volllängenprotein sind die Domänen durch einen zentrale ~150 Aminosäure lange Region (auch Linker genannt) verknüpft, und nur von der GephG-Trimerisiung wird Gebrauch gemacht, wohingegen die GephE-Dimerisierung unterbunden ist, was nahelegt, dass ein Auslöser benötigt wird, der die Autoinhibierung von GephE aufhebt und dadurch den Weg zur Bildung höherer Oligomere ebnet. Die strukturelle Basis für die GephE- Autoinhibierung ist bislang nicht bekannt, aber eine veröffentlichte Studie kam zu dem Schluss, dass der Linker ausreicht, um die GephE-Dimerisierung zu inhibieren. Diese Arbeit beinhaltet die biochemische und strukturelle Charakterisierung von apo-Gephyrin und Gephyrin in Komplexen mit Liganden, von denen bekannt ist, dass sie entweder die Bildung von synaptischen Gephyrin-Selbstoligomeren begünstigen (Collybistin und Neuroligin 2) oder die Gephyrin-Selbstoligomere reorganisieren (Dynein leichte Kette 1). Für Volllängen-Gephyrin gab es bislang keine strukturellen Informationen. Rasterkraftmikroskopie (engl. AFM)- und Röntgenkleinwinkelbeugungs (engl. SAXS)-Analysen, die in dieser Arbeit beschrieben sind, deckten auf, dass das Gephyrin-Trimer eine hoch flexible Einheit ist, die – durch den langen Linker – zwischen kompakten und extendierten Zuständen hin- und herwechselt, mit einer leichten Präferenz für kompakte Zustände. Spektroskopische Messungen des zirkulären Dichroismus legten nahe, dass die partielle Kompaktierung und möglicherweise auch die GephE-Autoinhibition durch Interaktionen von Teilen des Linkers mit den G- und E-Domänen erreicht werden. Aber der Linker alleine kann nicht für die GephE-Blockade verantwortlich zeichnen, weil Größenausschluss-Chromatographie-Experimente gekoppelt mit Multiwinkel-Lichtstreudetektion (englische Abkürzung SEC-MALS) offenlegten, dass eine Gephyrin-Variante, die nur den Linker und GephE umfasst (GephLE), Dimere und keine Monomere ausbildet, wie in einer früheren Studie postuliert wurde. Der oligomere Zustand von GephLE und die Beobachtung, dass alle Gephyrin-Varianten, in denen Linker-Segmente verschiedener Länge deletiert wurden, überwiegend Trimere bildeten, legen nahe, dass ein Linker-unabhängiger Mechanismus für die GephE-Dimerisierungsblockade existiert. Zusammengenommen deuten die Daten darauf hin, dass Linker-abhängige und -unabhängige Mechanismen die GephE-Autoinhibtion vermitteln. Im zweiten Projekt wurde die Interaktion von Gephyrin mit DYNLL1 (Dynein LC8 Light Chain 1) charakterisiert. DYNLL1 is ein 25 kDa-Dimer, das im Dynein-Motor integriert ist, und bietet zwei Bindestellen, die beide ein von der Gephyrin-Linker-Region abgeleitetes Oktapeptid (im Weiteren GephDB) aufnehmen können. Ursprünglich wurde DYNLL1 als ein Ladungsadapter betrachtet, der Gephyrin-GlyR-Komplexe mit dem Dynein-Motor verknüpft und dadurch ihren retrograden Transport vorantreibt und somit zu einer Abnahme synaptischer Gephyrin-GlyR-Komplexe führt. Auf diesen Studien aufbauend, wurde in dieser Arbeit die Ladungsadapter-Hypothese analysiert ebenso wie die bislang unklare Stöchiometrie des Gephyrin-DYNLL1-Komplexes. Das Ladungsadapter-Szenario würde einen ternären Komplex aus Gephyrin, DYNLL1 und der mittleren Dynein-Kette (englische Abkürzung DIC) voraussetzen. Ein solcher Komplex konnte mittels analytischer Größenausschlusschromatographie (englische Abkürzung aSEC) nicht detektiert werden – vermutlich, weil Gephyrin und DIC um eine gemeinsame Bindungsstelle in DYNLL1 konkurrierten. Dieser Befund war konsistent mit einem Modell, in dem ein einzelnes DYNLL1-Dimer zwei Linker eines (einzelnen) Gephyrin-Trimers bindet, wie es auch durch eine 26 kDa-Massen-Zunahme der Gephyrin-Spezies in der Anwesenheit von DYNLL1 in SEC-MALS-Experimenten nahegelegt wurde. aSEC-Experimente auch bei hohen Konzentrationen (~20 µM Gephyrin und ~80 µM DYNLL1) deuteten darauf hin, dass die Affinität von GephDB im Kontext von Volllängen-Gephyrin signifikant beeinträchtigt war, aber auch bei einer Gephyrin-Variante, die nur GephG und die ersten 39 Reste des Linkers entielt (GephGL220). Voraussichtlich aufgrund von Aviditätseffekten banden zwei Linker stabil an ein einzelnes DYNLL1-Dimer, wohingegen das dritte DYNLL1-Bindungsmotiv unbesetzt blieb, so lange nicht hohe Konzentrationen an GephGL220 (50 µM) und DYNLL1 (200 µM) eingesetzt wurden. Diese Ergebnisse deuteten an, dass ein Zusammenspiel von GephG und dem N-terminalen Linker-Segment die Abschwächung der GephDB-Affinität zu DYNLL1 vermittelt und dass die Verhinderung der Induktion höherer Oligomere durch DYNLL1 entweder vorteilhaft für die Reorganization von Gephyrin-GlyR-Clustern ist oder dass DYNLL1 zwei (konzentrationsabhängige) Wirkungen auf Gephyrin ausübt. Der Gephyrin-Collybistin-Neuroligin 2-Komplex war Gegenstand des dritten Projektes. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde festgestellt, dass Collybistin und Gephyrin gegenseitig ihre Translokation zur postsynaptischen Membran einleiten, wo der ungeordnete, cytosolische Anteil des postsynaptischen Zelladhäsionsmembranmoleküls Neuroligin 2 (NL2cyt) die Verankerung von Collybistin 2 (CB2) durch das Binden an seine “src homology 3”-Domäne (SH3-Domäne) bewirkt und dadurch die SH3-Domänen-vermittelte Autoinhibition der CB2-Bindung an das Membran-Phospholipid Phosphatidylinositol-3-phosphat aufhebt. Entscheidend für dieses Ereignis ist, dass Gephyrin sowohl an CB als auch an NL2cyt bindet, vermutlich vermittelt durch GephE. In einer Fortsetzung dieser frühreren Studien bestätigen biochemische Daten in dieser Arbeit die Bildung des ternären Komplexes. Unerwarteterweise deuteten Analysen mittels nativer Polyacrylamidgelektrophorese auf: (1) Die Existenz eines Komplexes aus NL2cyt und CB2 ohne SH3-Domäne und damit auf eine zusätzliche NL2-Bindungsstelle in CB2. (2) Abgeschwächte Gephyrin-Collybistin-Komplexbildung in der Anwesenheit der SH3-Domäne. (3) Hohe NL2-Konzentrationen (>30 µM) als Voraussetzung für die Bildung des ternären Komplexes. Dies könnte die Regulation durch andere Faktoren wie zusätzliche Bindungspartner oder posttranslationale Modifikationen ermöglichen. Wenngleich die Ergebnisse von vorläufigem Charakter sind, stellen sie einen Startpunkt für künftige Arbeiten dar, welche hoffentlich das Zusammenspiel von Gephyrin, Collybistin, NL2 und bestimmten GABAA-Rezeptoren weiter aufklären werden. KW - Gephyrin KW - Dynein Light Chain KW - Neuroligin 2 KW - Collybistin KW - Small-angle X-ray Scattering KW - Structural Biology Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104212 ER - TY - THES A1 - Delto, Carolyn Francesca T1 - Structural and Biochemical Characterization of the GABA(A) Receptor Interacting Protein Muskelin T1 - Strukturelle und Biochemische Charakterisierung des GABA(A) Rezeptor interagierenden Proteins Muskelin N2 - In a study from 2011, the protein muskelin was described as a central coordinator of the retrograde transport of GABA(A) receptors in neurons. As muskelin governs the transport along actin filaments as well as microtubules, it might be the first representative of a novel class of regulators, which coordinate cargo transport across the borders of these two independent systems of transport paths and their associated motorproteins. To establish a basis for understanding the mode of operation of muskelin, the aim of this thesis was an in-depth biochemical and structural characterization of muskelin and its interaction with the GABA(A) receptor. One focus of the work was the analysis of the oligomerization of muskelin. As could be demonstrated, the oligomerization is based on two independent interactions mediated by different domains of the protein: a known interaction of the N-terminal discoidin domain with the C-terminal portion, termed head-to-tail interaction, and a dimerization of the LisH motif in muskelin that was so far neglected in the literature. For the detailed studies of both binding events, the solution of a crystal structure of a fragment of muskelin, comprising the Discoidin domain and the LisH motif, was an important basis. The fragment crystallized as a dimer, with dimerization being mediated solely by the LisH motif. Biochemical analysis corroborated that the LisH motif in muskelin serves as a dimerization element, and, moreover, showed that the C-terminal domain of the protein substantially stabilizes this dimerization. In addition, the crystal structure revealed the molecular composition of the surface of the head in the head-to-tail interaction, namely the discoidin domain. This information enabled to map the amino acids contributing to binding, which showed that the binding site of the head-to-tail interaction coincides with the generic ligand binding site of the discoidin domain. As part of the analyses, residues that are critical for LisH-dimerization and the head-to-tail binding, respectively, were identified, whose mutation specifically interfered with each of the interactions separately. These mutations allowed to investigate the interplay of these interactions during oligomerization. It could be shown that recombinant muskelin assembles into a tetramer to which both interactions, the LisH-dimerization and the head-to-tail binding, contribute independently. When one of the two interactions was disturbed, only a dimer mediated via the respective other interaction could be formed; when both interactions were disturbed, the protein was present as monomer. Furthermore, Frank Heisler in the group of Matthias Kneussel was able to show the drastic impact of an impaired LisH-dimerization on muskelin in cells using these mutations. Disturbing the LisH-dimerization led to a complete redistribution of the originally cytoplasmic muskelin to the nucleus which was accompanied by a severe impairment of its function during GABA(A) receptor transport. Following up on these results in an analysis of muskelin variants, for which alterations of the subcellular localization had been published earlier, the crucial influence of LisH-dimerization to the subcellular localization and thereby the role of muskelin in the cell was confirmed. The biochemical studies of the interaction of muskelin and the alpha1 subunit of the GABA(A) receptor demonstrated a direct binding with an affinity in the low micromolar range, which is mediated primarily by the kelch repeat domain in muskelin. For the binding site on the GABA(A) receptor, it was confirmed that the thirteen most C-terminal residues of the intracellular domain are critical for the binding of muskelin. In accordance with the strong conservation of these residues among the alpha subunits of the GABA(A) receptor, it could be shown that an interaction with muskelin in vitro is also possible for the alpha2 and alpha5 subunits. Based on the comparison of the binding sites between the homologous subunits, tentative conclusions can be drawn about the details of the binding, which may serve as a starting point for follow-up studies. This thesis thereby makes valuable contributions to the understanding of muskelin, in particular the significance of its oligomerization. It furthermore provides an experimental framework for future studies that address related topics, such as the characterization of other muskelin interaction partners, or the questions raised in this work. N2 - Das Protein Muskelin wurde in einer Studie aus dem Jahr 2011 als zentraler Koordinator des retrograden Transports von GABA(A)-Rezeptoren in Neuronen beschrieben. Da Muskelin den Transport des Rezeptors sowohl entlang von Aktinfilamenten als auch Mikrotubuli steuert, könnte es der erste bekannte Vertreter einer neuen Klasse von Regulatoren sein, die den Transport einer Fracht über die Grenzen dieser beiden unabhängigen Systeme von Transportwegen und der damit assoziierten Motorproteine hinweg koordinieren. Um Grundlagen für das Verständnis der Wirkungsweise von Muskelin zu schaffen, war das Ziel dieser Arbeit die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Muskelin und seiner Interaktion mit dem GABA(A)-Rezeptor. Ein Schwerpunkt der Arbeit lag dabei auf der Analyse der Oligomerisierung von Muskelin. Wie gezeigt werden konnte, beruht die Oligomerisierung auf zwei unabhängigen, von verschiedenen Domänen des Proteins vermittelten Bindungen: zum Einen auf einer bereits bekannten Wechselwirkung der N-terminalen Discoidin-Domäne und des C-terminalen Teils (anschaulich als Head-to-tail, englisch für Kopf-an-Schwanz, bezeichnet), zum Anderen auf einer in der Literatur bisher außer Acht gelassenen Dimerisierung des LisH-Motivs in Muskelin. Für die detaillierten Studien beider Bindungen lieferte die Aufklärung der Kristallstruktur eines Teilstücks von Muskelin, das die Discoidin-Domäne und das LisH-Motiv umfasst, eine wichtige Grundlage. Das Teilstück kristallisierte als Dimer, wobei die Dimerisierung ausschließlich über das LisH-Motiv vermittelt wurde. Die biochemischen Analysen bestätigten, dass das LisH-Motiv in Muskelin als Dimerisierungselement wirkt, und zeigten darüber hinaus, dass die C-terminale Domäne des Proteins diese Dimerisierung wesentlich stabilisiert. Zudem offenbarte die Kristallstruktur den molekularen Aufbau der Oberfläche des Kopfes in der Head-to-tail-Bindung, der Discoidin-Domäne. Die Kartierung der zur Bindung beitragenden Aminosäuren belegte, dass die Bindungsstelle der Head-to-tail-Interaktion mit der generischen Ligandenbindungsstelle der Discoidin-Domäne zusammenfällt. Als Teil der Analysen wurden zur LisH-Dimerisierung oder zur Head-to-tail-Bindung kritisch beitragende Aminosäurenseitenketten identifiziert, durch deren Mutationen Ispezifisch jeweils eine der beiden Interaktionen unterbunden werden konnte. Diese Mutationen ermöglichten es, das Zusammenspiel der Bindungen in der Oligomerisierung zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Muskelin ein Tetramer bildet, wozu beide Interaktionen, die LisH-Dimerisierung und die Head-to-tail-Bindung, unabhängig beitragen. Wurde jeweils eine der beiden Interaktionen durch Mutation gestört, konnte nur noch ein über die jeweils andere Interaktion vermitteltes Dimer gebildet werden, bei gleichzeitiger Störung beider Interaktionen lag das Protein als Monomer vor. Darüber hinaus konnte Frank Heisler in der Arbeitsgruppe von Matthias Kneussel mit Hilfe dieser Mutationen zeigen, dass eine Störung der LisH-Dimerisierung drastische Auswirkungen auf Muskelin in Zellen hat. Die Störung der LisH-Dimerisierung führte zu einer vollständigen Umverteilung des sonst im Zytoplasma lokalisierten Muskelins in den Kern, begleitet von einer starken Beeinträchtigung seiner Funktion im Transport des GABA(A)-Rezeptors. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurde durch Analysen der oligomeren Zustände von Muskelin-Varianten, für die in der Literatur eine veränderte Lokalisation beschrieben worden war, die entscheidende Bedeutung der LisH-Dimerisierung für die subzelluläre Verteilung und damit die Rolle von Muskelin in der Zelle bekräftigt. Die biochemischen Studien der Interaktion von Muskelin und der alpha1-Untereinheit des GABA(A)-Rezeptors demonstrierten eine direkte Bindung mit mikromolarer Affinität, die in Muskelin vorwiegend durch die Kelch-repeat-Domäne vermittelt wird. Für die Bindungsstelle auf Seite des GABA(A)-Rezeptors wurde bestätigt, dass die dreizehn C-terminalen Reste der intrazellulären Domäne entscheidend sind. In Übereinstimmung mit der starken Konservierung dieser Reste in verschiedenen alpha-Untereinheiten des GABA(A)-Rezeptors, konnte gezeigt werden, dass in vitro eine Bindung von Muskelin auch an die intrazelluläre Domäne der alpha2- und alpha5-Untereinheit möglich ist. Anhand des Vergleichs der Bindungsstelle zwischen den homologen Untereinheiten lassen sich erste Rückschlüsse auf die Details der Interaktion ziehen, die als Anknüpfungspunkt für kommende Studien dienen können. Diese Arbeit liefert damit wesentliche Beiträge zum Verständnis von Muskelin, insbesondere der Bedeutung seiner Oligomerisierung. Sie bietet zudem ein experimentelles Rahmenwerk für zukünftige Studien, die sich verwandten Themen, wie der Charakterisierung weiterer Interaktionen von Muskelin, oder den in dieser Arbeit aufgeworfenen Fragen widmen. KW - Oligomerisation KW - GABA-Rezeptor KW - Muskelin KW - Oligomerization KW - GABA(A) receptor KW - Interaction analysis KW - Strukturanalyse KW - Biochemie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115922 ER - TY - THES A1 - Ganesan, Jayavarshni T1 - The role of microRNA-378 in cardiac hypertrophy T1 - Untersuchungen zur Rolle der MikroRNA-378 bei kardialer Hypertrophie N2 - MicroRNAs are endogenous ≈22 nt long non coding RNA molecules that modulate gene expression at the post transcriptional level by targeting mRNAs for cleavage or translational repression. MicroRNA-mRNA interaction involves a contiguous and perfect pairing within complementary sites usually in the 3’ UTR of the target mRNA. Heart failure is associated with myocyte hypertrophy and death, due to compensatory pathological remodeling and minimal functional repair along with microRNA deregulation. In this study, we identified candidate microRNAs based on their expression strength in cardiomyocytes and by their ability to regulate hypertrophy. Expression profiling from early and late stages of heart failure showed several deregulated microRNAs. Of these microRNAs, miR-378 emerged as a potentially interesting microRNA that was highly expressed in the mouse heart and downregulated in the failing heart. Antihypertrophic activity of miR-378 was first observed by screening a synthetic miR library for morphologic effects on cardiomyocytes, and validated in vitro proving the tight control of hypertrophy by this miR. We combined bioinformatic target prediction analysis and microarray analysis to identify the targets of miR-378. These analyses suggested that factors of the MAP kinase pathway were enriched among miR-378 targets, namely MAPK1 itself (also termed ERK2), the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF1R), growth factor receptor bound protein 2 (GRB2) and kinase suppressor of ras 1 (KSR1). Regulation of these targets by miR-378 was then confirmed by mRNA and protein expression analysis. The use of luciferase reporter constructs with natural or mutated miR-378 binding sites further validated these four proteins as direct targets of miR-378. RNA interference with MAPK1 and the other three targets prevented the prohypertrophic effect of antimiR-378, suggesting that they functionally relate to miR-378. In vivo restoration of disease induced loss of miR-378 in a pressure overload mouse model of hypertrophy using adeno associated virus resulted in partial attenuation cardiac hypertrophy and significant improvement in cardiac function along with reduced expression of the four targets in heart. We conclude from these findings that miR-378 is an antihypertrophic microRNA in cardiomyocytes, and the main mechanism underlying this effect is the suppression of the MAP kinase-signaling pathway on four distinct levels. Restoration of disease-associated loss of miR-378 through cardiomyocyte-targeted AAV-miR-378 may prove as an effective therapeutic strategy in myocardial disease. N2 - MicroRNAs sind ca. 22 Nukleotide lange endogene, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die Expression von Genen posttranskriptionell regulieren, indem sie den Abbau der Ziel-mRNA herbeiführen oder deren Translation hemmen. Die Interaktion von microRNA und mRNA erfolgt durch perfekt komplementäre Bindung in der 3’-untranslatierten Region der Ziel-mRNA. Eine Deregulation der Expression verschiedener microRNAs lässt sich bei Herzinsuffizienz beobachten. Im insuffizienten Herzen laufen kompensatorische pathologische Remodellingprozesse ab und es kommt unter anderem zu Hypertrophie und Apoptose von Kardiomyozyten. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir Kandidaten-microRNAs nach folgenden Kriterien identifiziert: 1) Expr e s s ions s t ä rke in Ka rdiomyozyt en, 2) Fähigke i t zur Regul a t ion von Kardiomyozytenhypertrophie im Screening einer synthetischen microRNA-Bibliothek auf Kardiomyozytengröße und 3) Regulation ihrer Expression in frühem und späten Stadium eines murinen Herzinsuffizienzmodells. Aus den resultierenden Kandidaten-microRNAs wurde im folgenden miR-378 näher untersucht. MiR-378 war im gesunden Mausherz stark exprimiert. Die Expression nahm bei Herzinsuffizienz ab. Weiterhin hatte die Überexpression von miR-378 in neonatalen Kardiomyozyten einen antihypertrophen Effekt. Im Gegenzug führte die Expression von antimiR-378 zu einer verstärkten Hypertrophie. Zur Target-Suche wurden zum einen bioinformatische Vorhersage-Datenbanken verwendet und zum anderen ein Microarray durchgeführt. Diese Analysen zeigten eine Anreicherung von Faktoren des MAP-Kinase- Signalweges: Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1 (MAPK1, auch als ERK2 bezeichnet), Insulinähnlicher Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGF1R), Wachstumsfaktorbindeprotein 2 (GRB2) und Kinasesuppressor von Ras 1 (KSR1). Die Regulation dieser Targets durch miR-378 wurde durch Bestimmung der mRNA- und Proteinexpression nach Überexpression bzw. Inhibition von miR-378 bestätigt. Durch Luziferaseassays mit Reporterkonstrukten, die jeweils die exakten oder mutierte Bindungsstellen der vier Targets enthielten, konnte gezeigt werden, dass die mRNAs der vier Faktoren direkte Targets von miR-378 darstellen. Durch siRNA-mediierte Herabregulation der Zielproteine konnte der prohypertrophe Effekt von antimiR-378 inhibiert werden. Daraus lässt sich schließen, dass der Hypertrophie-Phänotyp direkt auf miR-378 zurückzuführen ist. Schließlich wurde der Effekt von miR-378 im murinen Herzinsuffizienzmodell (Konstriktion der Aorta, TAC) untersucht. TAC führte zu einer Abnahme der Expression von miR-378 im Herzen. Durch Adenoassoziierten Virus (AAV) vermittelte exogene Expression von miR-378 wurde das Expressionslevel des gesunden Herzens im TAC-Modell wiederhergestellt und die Expression der vier Targets herabgesetzt. Dies resultierte in weniger ausgeprägten Kardiomyozytenhypertrophie sowie in einer signifikanten Verbesserung der Herzfunktion. Aus diesen Daten schließen wir, dass miR-378 einen antihypertrophen Effekt auf Kardiomyozyten hat, der wesentlich durch die Suppression des MAP-Kinase-Signalweges an vier Angriffspunkten vermittelt wird. Die Wiederherstellung des “gesunden” Expressionsniveaus von miR-378 im kranken Herzen durch Kardiomyozyten-spezifische Expression mit AAV-miR-378 könnte eine Therapieoption bei Herzerkrankungen sein. KW - Hypertrophie KW - Herzinsuffizienz KW - miRNS KW - Herzmuskelzelle KW - Cardiomyocytes KW - Gene therapy KW - MicroRNA KW - Cardiac hypertrophy KW - Hypertrophy Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100918 ER - TY - THES A1 - Bothe, Sebastian Helmut T1 - Fragmentbasiertes Design von p97-Liganden: Identifizierung von Startstrukturen zur Entwicklung von Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren für die SHP-Bindestelle der AAA+ ATPase p97 T1 - Fragment-based design of p97-ligands: Identification of starting points for the development of protein-protein-interaction inhibitors targeting the SHP-binding site of the AAA+ ATPase p97 N2 - Die AAA+ ATPase p97 ist ein essenzielles Protein, das an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt ist und eine Schlüsselrolle in der Protein-Homöostase spielt. Die funktionale Diversität von p97 beruht auf der Interaktion zahlreicher unterschiedlicher Kofaktoren, die vorwiegend an die N-Domäne von p97 binden. Aufgrund seiner Bedeutung in der Regulierung diverser physiologischer und pathologischer Prozesse stellt p97 eine interessante Zielstruktur für die Entwicklung neuer Wirkstoffe dar, die insbesondere in der Krebstherapie von Bedeutung sein könnte. Bekannte p97-Inhibitoren greifen vor allem die ATPase-Funktion des Proteins an. Ein neuer pharmakologischer Ansatz stellt die Inhibierung der Kofaktorbindung an die N-Domäne dar. Ein solcher Protein-Protein-Interaktionsinhibitor wäre nicht nur von therapeutischem Interesse, sondern hätte auch einen besonderen Nutzen für die Entschlüsselung molekularer und zellulärer Funktionen von p97-Kofaktoren. In dieser Arbeit wurde ein fragmentbasierter Ansatz für die Identifizierung von chemischen Startstrukturen für die Entwicklung eines Protein-Protein- Interaktionsinhibitors verfolgt. Als Zielstruktur wurde die SHP-Bindestelle in der N-Domäne gewählt. Die Identifizierung von Liganden erfolgte sowohl durch computergestützte Methoden (insbesondere virtuelles Screening und Molekulardynamik-Simulationen) als auch experimentell durch biophysikalische Techniken (wie Biolayer-Interferometrie, Röntgenstrukturanalyse und ligandbasierte NMR-Techniken). Die Grundlage des computerbasierten Designs stellte eine Analyse der bekannten Kristallstrukturen der p97-Komplexe mit den SHP-Motiven der Kofaktoren UFD1 und Derlin-1 dar. Darüber hinaus dienten Molekulardynamik-Simulationen der Analyse der Wassereigenschaften innerhalb der SHP-Bindestelle. Darauf aufbauend wurden verschiedene Pharmakophormodelle entwickelt, die die Grundlage des im Anschluss durchgeführten virtuellen Screenings und Dockings bildeten. Anhand der Ergebnisse von Molekulardynamik-Simulationen wurden zehn Verbindungen für die experimentelle Validierung ausgewählt. Hiervon konnten zwei Fragmente in STD-NMR- und Biolayer-Interferometrie-Experimenten als Liganden bestätigt werden. In einem parallel durchgeführten biophysikalischen Fragmentscreening mittels Biolayer-Interferometrie wurden unter mehr als 650 Verbindungen 22 identifiziert, die an die N-Domäne binden. 15 dieser Fragmente wurden durch einen orthogonalen STD-NMR-Assay bestätigt. Fünf dieser Verbindungen zeigten Affinitäten mit KD-Werten kleiner 500μMund günstigen Ligandeffizienzen. Des Weiteren konnte die Bindungskinetik und Affinität des in der Literatur als p97-Inhibitor berichteten Naturstoffes Xanthohumol bestimmt und eine Bindung an die N-Domäne bestätigt werden. Zur Identifizierung möglicher Bindestellen dieser fünf Fragmente wurden mixed-solvent Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt. Diese ergaben, dass alle Verbindungen die SHP-Bindestelle in der N-Domäne adressieren. Die Regionen fielen mit hot spots der Kofaktorwechselwirkungen zusammen und stellen somit mögliche Ankerpunkte für die Weiterentwicklung dar. Für zwei Fragmente konnten die postulierten Bindestellen mittels Röntgenstrukturanalyse bzw. STD-NMR-Messungen an p97-Alanin-Mutanten bestätigt werden. Die erhaltene Röntgenstruktur ist die erste p97-Struktur, die ein gebundenes Fragment an der N-Domäne zeigt. N2 - The AAA+ATPase p97 is an essential protein involved in numerous cellular pro-cesses and plays a key role in multiple aspects of protein homeostasis. Its functio-nal diversity is mediated through the interaction with a large number of distinctcofactors binding to the N-domain of p97. Due to its significant role in regulatinga variety of physiological responses, p97 has emerged as a potential therapeu-tic target. A small molecule inhibiting the cofactor binding would be importantto dissect the molecular and cellular functions of p97 cofactors, thus helping tounravel their specific role in controlling p97 activity. Such compounds may alsoopen routes to new cancer therapies.In this work, a fragment-based approach was pursued for the identification ofchemical starting points for the development of a protein-protein interaction in-hibitor addressing the SHP binding site. Therefore, computer-assisted methods,such as virtual screenings and molecular dynamics simulations, as well as bio-physical techniques including biolayer interferometry, X-ray crystallography, andligand-based NMR techniques, were applied.The computer-based design started with an analysis of the known p97 crystalstructures in complex with the SHP motifs of cofactors UFD1 and Derlin-1. In ad-dition, molecular dynamics simulations were used to analyze the water proper-ties within the SHP binding site. Based on these results, pharmacophore modelswere developed and utilized in the subsequent virtual screening and dockingprocess. With the help of molecular dynamics simulations, ten compounds wereselected for experimental validation. Two of these were confirmed as ligands inSTD-NMR and biolayer interferometry experiments.In parallel, a biophysical fragment screening of over 650 compounds was perfor-med using the biolayer interferometry method. This led to the identification of22 compounds binding to the N-domain. Fifteen of these fragments were con-firmed in an orthogonal STD-NMR assay. Five compounds showed affinities withKDvalues below 500 μM and favourable ligand efficiencies for further optimiza-tion. Furthermore, the binding kinetics and affinity of xanthohumol, a naturalproduct reported in the literature as a p97 inhibitor, were determined and bin-ding to the N-domain was confirmed. xToidentify possible binding sites of these five fragments, mixed solvent mole-cular dynamics simulations were performed. These revealed that all compoundsaddress the SHP binding site in the N-domain. The regions coincide with hotspots of the cofactor binding and, thus, represent potential anchor points for aprotein-protein interaction inhibitor. For two fragments, the postulated bindingsites were confirmed by X-ray crystallography and STD-NMR measurements onp97 alanine mutants, respectively. The X-ray structure obtained is the first p97structure showing a fragment bound to the N-domain. KW - Arzneimitteldesign KW - Fragmentscreening KW - p97 KW - Biolayerinterferometrie KW - Protein-Protein-Interaktion KW - Kofaktorbindung KW - fragment screening KW - p97 KW - biolayerinterferometry KW - protein-protein-interaction KW - cofactorbinding KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Wirkstoffdesign Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239112 ER - TY - THES A1 - Trujillo Viera, Jonathan T1 - Protein kinase D2 drives chylomicron-mediate lipid transport in the intestine and promotes obesity T1 - Die Proteinkinase D2 treibt den Chylomicron-vermittelten Lipidtransport im Darm an und fördert Fettleibigkeit N2 - Obesity and associated metabolic syndrome are growing concerns in modern society due to the negative consequences for human health and well-being. Cardiovascular diseases and type 2 diabetes are only some of the pathologies associated to overweight. Among the main causes are decreased physical activity and food availability and composition. Diets with high content of fat are energy-dense and their overconsumption leads to an energy imbalance, which ultimately promotes energy storage as fat and obesity. Aberrant activation of signalling cascades and hormonal imbalances are characteristic of this disease and members of the Protein Kinase D (PKD) family have been found to be involved in several mechanisms mediating metabolic homeostasis. Therefore, we aimed to investigate the role of Protein Kinase D2 (PKD2) in the regulation of metabolism. Our investigation initiated with a mice model for global PKD2 inactivation, which allowed us to prove a direct involvement of this kinase in lipids homeostasis and obesity. Inactivation of PKD2 protected the mice from high-fat diet-induced obesity and improved their response to glucose, insulin and lipids. Furthermore, the results indicated that, even though there were no changes in energy intake or expenditure, inactivation of PKD2 limited the absorption of fat from the intestine and promoted energy excretion in feces. These results were verified in a mice model for specific deletion of intestinal PKD2. These mice not only displayed an improved metabolic fitness but also a healthier gut microbiome profile. In addition, we made use of a small-molecule inhibitor of PKD in order to prove that local inhibition of PKD2 in the intestine was sufficient to inhibit lipid absorption. The usage of the inhibitor not only protected the mice from obesity but also was efficient in avoiding additional body-weight gain after obesity was pre-established in mice. Mechanistically, we determined that PKD2 regulates lipids uptake in enterocytes by phosphorylation of Apolipoprotein A4 (APOA4) and regulation of chylomicron-mediated triglyceride absorption. PKD2 deletion or inactivation increased abundance of APOA4 and decreased the size of chylomicrons and therefore lipids absorption from the diet. Moreover, intestinal activation of PKD2 in human obese patients correlated with higher levels of triglycerides in circulation and a detrimental blood profile. In conclusion, we demonstrated that PKD2 is a key regulator of dietary fat absorption in murine and human context, and its inhibition might contribute to the treatment of obesity. N2 - Fettleibigkeit und das damit verbundene metabolische Syndrom stellt in der modernen Gesellschaft aufgrund der negativen Folgen für die menschliche Gesundheit und das Wohlbefinden ein zunehmendes Problem dar. Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Typ- 2-Diabetes sind nur einige der mit Übergewicht verbundenen Pathologien. Zu den Hauptursachen zählen eine verminderte körperliche Aktivität sowie die Verfügbarkeit und Zusammensetzung von Nahrungsmitteln. Diäten mit hohem Fettgehalt haben eine hohe Energiedichte und ihr übermäßiger Konsum führt zu einem Energieungleichgewicht, das letztendlich die Energiespeicherung als Fett und Fettleibigkeit fördert. Aberrante Aktivierung von Signalkaskaden und hormonelle Ungleichgewichte sind charakteristisch für diese Krankheit, und es wurde festgestellt, dass Mitglieder der Protein Kinase D (PKD) -Familie an mehreren Mechanismen der metabolischen Homöostase beteiligt sind. Daher zielten wir darauf ab die Rolle der Proteinkinase D2 (PKD2) bei der Regulation des Stoffwechsels zu untersuchen. Unsere Untersuchung begann mit einem Mäusemodell für die globale PKD2- Inaktivierung, welches es uns ermöglichte, eine direkte Beteiligung dieser Kinase an der Lipidhomöostase und Fettleibigkeit nachzuweisen. Die Inaktivierung von PKD2 schützte die Mäuse vor fettreicher diätbedingter Fettleibigkeit und verbesserte ihre Reaktion auf Glukose, Insulin und Lipide. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass die Inaktivierung von PKD2 die Absorption von Fett über den Darm begrenzte und die Energieausscheidung im Kot förderte, obwohl sich die Energieaufnahme oder der Energieverbrauch nicht änderten. Diese Ergebnisse wurden in einem Mäusemodell mit spezifischer Deletion von intestinaler PKD2 verifiziert. Diese Mäuse zeigten nicht nur eine verbesserte metabolische Fitness, sondern auch ein gesünderes Darmmikrobiomprofil. Zusätzlich verwendeten wir einen niedermolekularen PKD- Inhibitor, um zu beweisen, dass die lokale Hemmung von PKD2 im Darm ausreicht, um die Lipidabsorption zu hemmen. Die Verwendung des Inhibitors schützte die Mäuse nicht nur vor Fettleibigkeit, sondern verhinderte auch wirksam eine zusätzliche Gewichtszunahme, nachdem bei Mäusen bereits Fettleibigkeit festgestellt worden war. Mechanistisch haben wir festgestellt, dass PKD2 die Lipidaufnahme in Enterozyten durch Phosphorylierung von Apolipoprotein A4 (APOA4) und Regulation der Chylomicron-vermittelten Triglyceridabsorption reguliert. Die Deletion oder Inaktivierung von PKD2 erhöhte die Häufigkeit von APOA4 und verringerte die Größe der Chylomikronen und damit die Lipidabsorption aus der Nahrung. Darüber hinaus korrelierte die intestinale Aktivierung von PKD2 bei adipösen Patienten mit höheren Triglyceridspiegeln im Kreislauf und einem schädlichen Blutprofil. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass PKD2 ein Schlüsselregulator für die Aufnahme von Nahrungsfett im murinen und menschlichen Kontext ist und seine Hemmung zur Behandlung von Fettleibigkeit beitragen könnte KW - Chylomicrons KW - Übergewicht KW - Proteinkinase D KW - Darm KW - Protein Kinase D2 KW - Chylomicron KW - Obesity Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-265095 ER - TY - THES A1 - Diebold, Mathias T1 - Virtuelles Screening und Entwicklung selektiver Liganden des Aurora-A – MYCN Komplexes und computergestützte Methoden zur Analyse und Design von PROTACs T1 - Virtual screening and development of selective ligands for the Aurora-A - MYCN complex and computational methods for analysis and design of PROTACs N2 - Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein. Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden synthetisiert. Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays. Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein. Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt. Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden. Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht. N2 - The association of the oncogenic transcription factor MYCN with the Ser/Thr kinase Aurora-A prevents its degradation via the ubiquitin proteasome system by preventing the SCF FbxW7 complex from binding. The kinase adopts an active conformation when bound to MYCN, enabling kinase activity without prior phosphorylation on Thr288 or the presence of an activator like TPX2, and therefore at inappropriate times during the cell cycle. As high levels of MYCN have been shown to drive cancers like neuroblastoma, disrupting the complex formation is thought to be a viable development strategy for chemotherapeutics. Several small-molecule inhibitors of Aurora-A, like Alisertib (MLN8237), are able to induce a conformational change in the kinase, preventing the formation of the protein – protein complex and therefore promoting MYCN degradation. However, since Aurora-A has important roles during mitosis targeting only the complex could be a more promising approach than the systemic inhibition of the kinase. This project aimed to identify small molecules which selectively bind at the Aurora-A – MYCN interface and can be further optimized to induce targeted degradation via a PROTAC approach. Virtual screenings and molecular dynamics simulations were performed to identify commercially available compounds which should bind to a pocket formed only when the two proteins come together. Of a first set of ten potential binders, four showed binding to the Aurora-A – MYCN complex but not the individual proteins in STD-NMR experiments. Two of these hit molecules contained the same scaffold and were used as a starting point for optimization towards more potent ligands. In a fragment-based fashion, the scaffold was grown to achieve better affinity in-silico and provide linkage points for functionalization such as the attachment of E3 ligase ligands to create PROTACs. Nine of these second-generation compounds were then synthesized. In order to obtain quantitative binding data a covalently linked Aurora-A – MYCN construct was designed. Its structural and functional validity was shown in STD-NMR and BLI experiments with known Aurora-A inhibitors and in NMR-based ATPase assays. In addition, a crystal structure of the construct was solved, validating the designed structure. Quantitative measurements with the synthesized compounds revealed a positive hit (HD19S) with a ten-fold higher affinity to the covalently linked AuroraA – MYCN as compared to Aurora-A alone. Additionally, effects of PROTACs designed to degrade Aurora-A were studied in-silico. Interactions between Aurora-A, the E3-ligase Cereblon and small molecules were modelled and successfully used to explain the differences in activities observed with different PROTACs. The most active PROTAC also showed a high selectivity for Aurora-A over Aurora-B, even though the recognition unit (Alisertib) can bind both family members. Through energetic analysis of molecular dynamics simulations of the ternary complexes, these differences could be explained. Optimizations for a more efficient degradation of Aurora-A by the PROTACs were examined by changing the recognition unit and improving linkers. KW - Arzneimitteldesign KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Vernetzung KW - Wirkstoffdesign KW - PROTAC KW - Proteolysis-Targeting-Chimera KW - Aurora-A KW - MYCN KW - Aurora-A-MYCN-Komplex Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317594 ER - TY - THES A1 - Misra, Mohit T1 - Knowing then defeating: The Ubiquitin activating enzyme, a promising target for cancer therapy T1 - Erst verstehen, dann besiegen: Das Ubiquitin-aktivierende Enzym, ein vielversprechender Kandidat in der Krebstherapie N2 - Ubiquitin is a 76 amino acid long polypeptide, which is present throughout eukaryotes in a highly conserved fashion. Ubiquitin can modify proteins by becoming covalently attached to them. Eukaryotic cells employ ubiquitin to maintain and regulate fundamental cellular processes like protein degradation, the immune response and transcriptional and translational regulation. Transfer of ubiquitin to the substrate is achieved by the catalysis of three classes of enzymes namely E1, E2 and E3. Together these enzymes form a pyramidal hierarchy, where E1 stands at the apex and E3 enzymes form the base of the pathway. The ubiquitin activating enzyme 1 (UBA1) plays a major role in ubiquitylation being the ubiquitin-dedicated E1 enzyme. In addition, it is the only enzyme in this pathway to use ATP as an energy source to catalyze two important reactions. The products of these reactions, ubiquitin adenylate and ubiquitin thioester, are the essential intermediate states of ubiquitin, for being conjugated to the target protein. With the help of X-ray crystallography and biochemical approaches, snapshots of multiple catalytic states of UBA1, where it is bound to Mg-ATP, ubiquitin and the E2 Ubc13 as substrates could be captured. With the help of these high-resolution crystal structures, deeper insights into the enzymatic mechanism of UBA1 could be attained. The resulting insights into the catalytic cycle were further validated by biochemical assays. It could be shown that ATP acts as a molecular switch to induce the enzyme’s open conformation. Ubiquitin-binding to the enzyme leads to domain rotations, which facilitate the recruitment of a cognate E2 enzyme. The interdomain communication as well as the cross-talk with the substrates and the products fuel the enzymatic cycle of UBA1. Due to the proven efficacy of proteasome inhibitors for cancer treatment, which block degradation of proteins labeled with ubiquitin, enzymes participating in the ubiquitylation cascade have been targeted by researchers for the development of novel anti-cancer therapeutics. UBA1 inhibition has been shown to preferentially induce cell death in malignant cells, and it can also be used as a strategy to overcome resistance against proteasome inhibitors. MLN7243, an adenosyl sulfamate inhibitor developed by Millenium Pharmaceutical to specifically target UBA1, is currently in Phase-I clinical trials for the treatment of solid tumors. UBA1 could be crystallized in complex with three adenosyl sulfamate inhibitors covalently linked to ubiquitin, which are promising drug candidates for cancer therapy. The inhibitors employed, MLN7243, MLN4924 and ABPA3, show distinct specificities towards different E1 enzymes. With the help of crystal structures the specificity determinants of these inhibitors could be deciphered, which were further confirmed by inhibition assays as well as molecular dynamics simulations. Together these crystal structures provide a starting point for developing E1-specific inhibitors, which, besides their potential for medicinal purposes, are important tools to better understand the function of the ubiquitin system as well as the action of ubiquitin-like proteins. N2 - Ubiquitin ist ein 76 Aminosäuren langes Polypeptid, das in allen Eukaryoten vorkommt und hoch konserviert ist. Ubiquitin kann Proteine modifizieren indem es mittels einer kovalente Bindung an diese angeheftet wird. Eukaryotische Zellen nutzen Ubiquitin, um fundamentale zelluläre Prozesse wie den Proteinabbau, die Immunantwort sowie die Regulation der Transkription und Translation aufrecht zu erhalten. Der Transfer von Ubiquitin auf das Substrat wird durch die Katalyse von drei Enzymklassen E1, E2 und E3 erreicht. Zusammen bilden diese Enzyme eine pyramidale Hierarchie in der das E1 an der Spitze steht und die E3 Enzyme die Basis bilden. Das Ubiquitin-aktivierende Enzym 1 (UBA1) ist das E1 Enzym für Ubiquitin und spielt somit eine Hauptrolle in der Ubiquitinierung. Weiterhin ist es das einzige Enzym dieses Stoffwechselweges, das ATP als Energie nutzt, um zwei wichtige Reaktionen zu katalysieren. Die Produkte dieser Reaktionen, Ubiquitin-Adenylat und thioesterifiziertes Ubiquitin, sind die essentiellen Ubiquitinintermediate für die Konjugation an das Zielprotein. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse und biochemischer Ansätze konnten für UBA1 Momentaufnahmen multipler katalytischer Zustände erfasst werden, in denen es an die Substrate Mg-ATP, Ubiquitin und dem E2 Enzym Ubc13 gebunden vorliegt. Mit Hilfe dieser hochaufgelösten Kristallstrukturen konnten tiefere Einblicke in den enzymatischen Mechanismus des Enzyms erzielt werden. Die gesammelten Erkenntnisse zum katalytischen Zyklus wurden mittels biochemischer Methoden validiert. Es konnte gezeigt werden, dass ATP als molekularer Schalter fungiert, um das Enzym in seine offene Konformation zu überführen. Die Bindung von Bindung an das Enzym führt zur Rotation einzelner Domänen welche die Rekrutierung des E2 Enzymes erleichtern. Die Interdomänen-Interaktion sowie molekulare Wechselwirkungen mit den Substraten und Produkten treiben den enzymatischen Zyklus von UBA1 an. Die Einsatz von Proteasominhibitoren, die den Abbau von Ubiquitin-markierten Proteinen blockieren, in der Krebstherapie weckte das Interesse von Forschern Enzyme, die an der Ubiquitinierungs-Kaskade beteiligt sind, als neue therapeutische Ziele zur Bekämpfung von Krebserkrankungen zu erschließen. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibierung von UBA1 bevorzugt den Tod maligner Zellen induziert und als Strategie für die Überwindung der Resistenz von Proteasominhibitoren genutzt werden kann. MLN7243, ein Adenosyl-Sulfamat Inhibitor, der von Millenium Pharmaceuticals entwickelt wurde und spezifisch UBA1 angreift, befindet sich gegenwärtig in klinischen Studien der Phase I mit dem Ziel einer Behandlung von soliden Tumoren. UBA1 konnte im Komplex mit drei an Ubiquitin gekoppelten Adenosyl-Sulfamat Inhibitoren, die vielversprechende Wirkstoffe in der Krebstherapie sind, kristallisiert werden. Die Inhibitoren MLN7243, MLN4924 und ABPA3 besitzen unterschiedliche Spezifitäten für verschiedene E1 Enzyme. Mit Hilfe von Kristallstrukturen konnten Spezifitätsfaktoren dieser Inhibitoren entschlüsselt werden, die im Weiteren mittels Inhibierungstests und molekulardynamischer Simulationen bestätigt werden konnten. Diese Kristallstrukturen lieferten ein klareres Bild für die Entwicklung E1-spezifischer Inhibitoren mit deren Hilfe, neben ihrer potentiellen medizinischen Anwendung, ein besseres Verständnis des Ubiquitinsystems und Ubiquitin-ähnlicher kovalenter Verknüpfungen gewonnen werden kann. KW - Ubiquitin-aktivierende Enzym 1 KW - E1 inhibitoren KW - Ubiquitin activating eznyme 1 KW - E1 inhibitors KW - MLN7243 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167227 ER - TY - THES A1 - Imam, Nasir T1 - Molecular basis of collybistin conformational activation T1 - Molekulare Prinzipien der konformellen Aktivierung von Collybistin N2 - The nervous system relies on an orchestrated assembly of complex cellular entities called neurons, which are specifically committed to information management and transmission. Inter-neuronal communication takes place via synapses, membrane-membrane junctions which ensure efficient signal transfer. Synaptic neurotransmission involves release of presynaptic neurotransmitters and their reception by cognate receptors at postsynaptic terminals. Inhibitory neurotransmission is primarily mediated by the release of neurotransmitters GABA (γ-Aminobutyric acid) and glycine, which are precisely sensed by GABA type-A receptors (GABAARs) and glycine receptors (GlyRs), respectively. GABAAR assembly and maintenance is coordinated by various postsynaptic neuronal factors including the scaffolding protein gephyrin, the neuronal adaptor collybistin (CB) and cell adhesion proteins of the neuroligin (NL) family, specifically NL2 and NL4. At inhibitory postsynaptic specializations, gephyrin has been hypothesized to form extended structures underneath the plasma membrane, where its interaction with the receptors leads to their stabilization and impedes their lateral movement. Gephyrin mutations have been associated with various brain disorders, including autism, schizophrenia, Alzheimer’s disease, and epilepsy. Furthermore, gephyrin loss is lethal and causes mice to die within the first post-natal day. Gephyrin recruitment from intracellular deposits to postsynaptic membranes primarily relies on the adaptor protein CB. As a moonlighting protein, CB, a guanine nucleotide exchange factor (GEF), also catalyzes a nucleotide exchange reaction, thereby regenerating the GTP-bound state of the small GTPase Cdc42 from its GDP-bound form. The CB gene undergoes alternative splicing with the majority of CB splice variants featuring an N-terminal SH3 domain followed by tandem Dbl-homology (DH) and pleckstrin-homology (PH) domains. Previous studies demonstrated that the most widely expressed, SH3-domain containing splice variant (CB2SH3+) preferentially adopts a closed conformation, in which the N-terminally located SH3 domain forms intra-molecular interaction with the DH-PH domain tandem. Previous cell-based studies indicated that SH3 domain-encoding CB variants remain untargeted and colocalize with intracellular gephyrin deposits and hence require additional factors which interact with the SH3 domain, thus inducing an open or active conformation. The SH3 domain-deficient CB isoform (CB2SH3-), on the contrary, adopts an open conformation, which possess enhanced postsynaptic gephyrin-clustering and also effectively replenishes the GTP-bound small GTPase-Cdc42 from its GDP-bound state. Despite the fundamental role of CB as a neuronal adaptor protein maintaining the proper function of inhibitory GABAergic synapses, its interactions with the neuronal scaffolding protein gephyrin and other post synaptic neuronal factors remain poorly understood. Moreover, CB interaction studies with the small GTPase Cdc42 and TC10, a closely related member of Cdc42 subfamily, remains poorly characterized. Most importantly, the roles of the neuronal factors and small GTPases in CB conformational activation have not been elucidated. This PhD dissertation primarily focuses on delineating the molecular basis of the interactions between CB and postsynaptic neuronal factors. During the course of my PhD dissertation, I engineered a series of CB FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sensors to characterize the CB interaction with its binding partners along with outlining their role in CB conformational activation. Through the aid of these CB FRET sensors, I analyzed the gephyrin-CB interaction, which, due to technical limitations remained unaddressed for more than two decades (refer Chapter 2 for more details). Subsequently, I also unraveled the molecular basis of the interactions between CB and the neuronal cell adhesion factor neuroligin 2 (refer chapter 2) and the small GTPases Cdc42 and TC10 (refer chapter 3) and describe how these binding partners induce a conformational activation of CB. In summary, this PhD dissertation provides strong evidence of a closely knit CB communication network with gephyrin, neuroligin and the small GTPase TC10, wherein CB activation from closed/inactive to open/active states is effectively triggered by these ligands. N2 - Das Nervensystem ist eine komplexe Ansammlung zellulärer Einheiten, darunter sind die Neuronen, die speziell für die Verarbeitung und Übertragung von Informationen zuständig sind. Die Kommunikation zwischen Neuronen erfolgt über Synapsen, spezialisierte Membran-Membran-Kontakte, die eine effiziente Signalübertragung gewährleisten. Die synaptische Neurotransmission umfasst die präsynaptische Freisetzung von Neurotransmitters und deren Empfang durch entsprechende Rezeptoren in den Postsynapsen. Die inhibitorische Neurotransmission wird in erster Linie durch die Freisetzung der Neurotransmitter GABA (γ-Aminobuttersäure-Typ) und Glycin vermittelt, die von GABA-Typ-A-Rezeptor (GABAAR) bzw. Glycinrezeptoren (GlyR) präzise wahrgenommen werden. Der Aufbau und die Aufrechterhaltung von GABAAR Clustern wird durch verschiedene postsynaptische neuronale Faktoren koordiniert, darunter das Gerüstprotein Gephyrin, das neuronale Adaptorprotein Collybistin (CB) und Zelladhäsionsproteine der Neuroligin (NL)-Familie, insbesondere NL2 und NL4. Es wird angenommen, dass Gephyrin an hemmenden postsynaptischen Spezialisierungen ausgedehnte Strukturen unterhalb der Plasmamembran bildet, und durch Interaktion mit den Rezeptoren deren laterale Diffusion verhindert. Gephyrin-Mutationen wurden mit verschiedenen Hirnkrankheiten in Verbindung gebracht, darunter Autismus, Schizophrenie, Alzheimer und Epilepsie. Der Verlust von Gephyrin ist tödlich und führt dazu, dass Mäuse innerhalb des ersten postnatalen Tages sterben. Die Rekrutierung von Gephyrin aus intrazellulären Ablagerungen zu postsynaptischen Membranen hängt in erster Linie von CB ab. Als Moonlighting-Protein katalysiert CB, ein Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF), auch den Nukleotidaustausch und somit die Reaktivierung der kleinen GTPase Cdc42 . Das CB-Gen wird durch alternatives Spleißen modifiziert; die meisten CB-Spleißvarianten weisen eine N-terminale SH3-Domäne auf, gefolgt von Tandem aus einer Dbl-Homologie (DH)- und einer Pleckstrin-Homologie (PH)-Domäne. Frühere Studien zeigten, dass die am häufigsten exprimierte Spleißvariante, die eine SH3-Domäne enthält (CB2SH3+), vorzugsweise eine geschlossene Konformation annimmt, bei der die N-terminal gelegene SH3-Domäne eine intra-molekulare Interaktion mit dem DH-PH- Tandem eingeht. Zellbasierte Studien zeigten, dass CB-Varianten, die für die SH3-Domäne kodieren, sich innerhalb der Zelle nicht an spezifischen Orten anreichern und stattdessen mit intrazellulären Gephyrin-Ablagerungen kolokalisieren. Zusätzliche Faktoren werden benötigt, die mit der SH3-Domäne interagieren und so eine offene oder aktive Konformation hervorrufen. Die SH3-Domänen-defiziente CB-Isoform (CB2SH3-) hingegen nimmt eine offene Konformation an, die eine verstärkte postsynaptische Gephyrin-Anhäufung aufweist und die GTP-gebundene kleine GTPase Cdc42 aus ihrem GDP-gebundenen Zustand effektiv wieder regeneriert. Trotz der grundlegenden Rolle von CB als neuronales Adaptorprotein, das die ordnungsgemäße Funktion hemmender GABAerger Synapsen aufrechterhält, ist seine Interaktion mit dem neuronalen Gerüstprotein Gephyrin und anderen post-synaptischen neuronalen Faktoren nach wie vor unzureichend verstanden. Darüber hinaus sind die Interaktionsstudien von CB mit der kleinen GTPase Cdc42 und TC10, einem eng verwandten Mitglied der Cdc42-Unterfamilie, noch immer unzureichend charakterisiert. Somit war die Frage, ob diese neuronalen Faktoren sowie die kleinen GTPasen an der CB-Konformationsaktivierung beteiligt sind. Diese Dissertation konzentriert sich in erster Linie auf die Beschreibung der molekularen Grundlagen der Interaktion von CB mit postsynaptischen neuronalen Faktoren. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich eine Reihe von CB-FRET-Sensoren (Förster-Resonanz-Energie-Transfer) entwickelt, um die CB-Interaktion mit seinen Bindungspartnern zu charakterisieren und ihre Rolle bei der CB-Konformationsaktivierung zu beschreiben. Mit Hilfe der CB-FRET-Sensoren entschlüsselte ich das langjährige Rätsel der Gephyrin-CB-Interaktion, das aufgrund technischer Beschränkungen mehr als zwei Jahrzehnte lang ungelöst blieb (siehe Kapitel 2 für weitere Einzelheiten). In der Folge habe ich auch die molekularen Grundlagen der CB-Wechselwirkung und damit ihre konformelle Aktivierung durch den neuronalen Zelladhäsionsfaktor Neuroligin 2 (siehe Kapitel 2) und die kleinen GTPasen Cdc42 und TC10 (siehe Kapitel 3) analysiertt. Zusammengefasst liefert diese Dissertation starke Beweise für ein engmaschiges CB-Kommunikationsnetzwerk mit Gephyrin, Neuroligin und der kleinen GTPase TC10, in dem der CB-Konformationswechsel vom geschlossenen/inaktiven zum offenen/aktiven Zustand effektiv durch die Liganden ausgelöst wird. KW - Guanine nucleotide exchange factor (GEF) KW - Rho GTPasw KW - inhibitory postsynapse KW - Autoinhibition KW - conformational activation KW - collybistin KW - fluorescence resonance energy transfer (FRET) KW - gephyrin KW - neurologin-2 KW - time-correlated single photon counting (TCSPC) Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311458 ER - TY - THES A1 - Truongvan, Ngoc T1 - Understanding the dual specificity of UBA6 T1 - Einblick in die duale Spezifität von UBA6 N2 - Ubiquitylation is a protein post translational modification, in which ubiquitin is covalently attached to target protein substrates resulting in diverse cellular outcomes. Besides ubiquitin, various ubiquitin-like proteins including FAT10 exist, which are also conjugated to target proteins. The underlying modification mechanisms are conserved. In the initial step, ubiquitin or a ubiquitin-like protein is thioester-linked to a catalytic cysteine in the E1activating enzyme in an ATP-dependent manner. The respective protein modifier is then transferred to an E2 conjugating enzyme in a transthioesterification reaction. Finally, an E3 ubiquitin ligase E3 catalyzes the covalent attachment of the protein modifier to a substrate. In the case of ubiquitin, multiple ubiquitin molecules can be attached to a substrate in the form of either linear or branched polyubiquitin chains but also as single ubiquitin modifications. Depending on the nature of the ubiquitin chain, the substrates are destined to various cellular processes such as their targeted destruction by the proteasome but also non-degradative outcomes may occur. As stated above FAT10 is a ubiquitin-like protein modifier which typically targets proteins for proteasomal degradation. It consists of two ubiquitin-like domains and is mainly expressed in cells of the human immune system. The reported involvement of FAT10 modifications in cancers and other diseases has caught the attention of the scientific community as an inhibition of the FAT10ylation process may provide avenues for novel therapeutic approaches. UBA6 is the E1 activating enzyme that resides at the apex of the FAT10 proteasomal degradation pathway. UBA6 not only recognizes FAT10 but can also activate ubiquitin as efficiently as the ubiquitin specific E1 UBA1. The dual specificity of UBA6 may complicate the inhibition FAT10ylation since targeting the active site of UBA6 will also inhibit the UBA6-catalyzed ubiquitin activation. Therefore, it is important to understand the underlying principles for the dual specificity of UBA6 prior to the development of compounds interfering with FAT10ylation. In this thesis important novel insights into the structure and function of UBA6 were derived by X-ray crystallography and biochemical methods. The first crystal structure of UBA6 reveals the multidomain architecture of this enzyme in atomic detail. The enzyme is composed of a rigid core including its active and inactive adenylation domains as well as a 4 helix bundle. Overall, the molecule adopts a “Y” shape architecture with the core at the base and the first and second catalytic half domains forming one arm of the “Y” and the ubiquitin fold domain constituting the other arm. While UBA6 shares the same domain architecture as UBA1, substantial differences were revealed by the crystal structure. In particular, the first catalytic half domain undergoes a significant shift to a position more distal from the core. This rigid body movement is assumed to generate room to accommodate the second ubiquitin-like domain of FAT10. Differences are also observed in a hydrophobic platform between the core and the first catalytic half domain and the adenylation active site in the core, which together from the binding sites for ubiquitin and FAT10. Site directed mutagenesis of key residues in these areas altered the UBA6-catalyzed activation of ubiquitin and FAT10. UBA6 variants were generated with the goal of trying to block the activation of FAT10 while still maintaining that of ubiquitin activation, in order to fully explain the dual specificity of UBA6. However, none of these mutations could block the activation of FAT10, while some of these UBA6 variants blocked ubiquitin activation. Preliminary inhibition assays with a group of E1 inhibitors belonging to the adenosyl sulfamate family demonstrated potent inhibition of FAT10ylation for two compounds. The dual specificity of UBA6 hence needs to be further examined by biochemical and structural methods. In particular, the structure of a complex between UBA6 and ubiquitin or FAT10 would provide key insights for further biochemical studies, ultimately allowing the targeted inhibition of the FAT10ylation machinery. N2 - Der Prozess der Ubiquitinierung stellt eine posttranslationale Modifikation dar, bei der das kleine Protein Ubiquitin kovalent an ein Zielprotein angehängt wird, was zu verschiedenen zellulären Effekten führt. Neben Ubiquitin existieren verschiedene ubiquitinähnliche Proteine, wie z.B. FAT10, die an Zielproteine angehängt werden können. Die der Modifikation zugrunde liegenenden Mechanismen der Proteinmodifikation sind konserviert. Im ersten Schritt wird Ubiquitin oder das ubiquitinähnliche Protein in einer ATP-abhängigen Reaktion kovalent an das katalytische Cystein des aktivierenden Enzyms (E1) gebunden. Danach wird es durch Transthioestherifizierung an ein konjugierendes Enzym (E2) übertagen und schließlich durch eine Ligase (E3) kovalent an das Substrat gehängt. Ubiquitin kann entweder einzeln oder in Form linearer oder verzweigter Ketten an ein Substrat angehängt werden, was wiederum zu verschiedenen funktionalen Konsequenzen wie dem Abbau das Proteins durch das Proteasom führen kann. Wie schon erwähnt ist FAT10 ein ubiquitinähliches Protein, das üblicherweise Zielproteine für den Abbau durch das Proteasom markiert. Es besteht aus zwei ubiquitinähnlichen Domänen und wird im Menschen hauptsächlich in Zellen des Immunsystems exprimiert. Die Beteiligung von FAT10 an der Entstehung von Krebs and anderen Krankheiten hat die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft erregt, da Inhibition des ‚FAT10ylation‘ Prozesses einen neuen therapeutischen Ansatz zur Behandlung dieser Krankheiten darstellen könnte. UBA6 fungiert hierbei als E1 s Enzym, das am Anfang des FAT10-abhängigen proteasomalen Abbaus steht. UBA6 aktiviert neben FAT10 auch Ubiquitin mit ähnlicher Effizienz wie das ubiquitinspezifische E1 UBA1. Diese Bispezifität von UBA6 könnte die Inhibition der FAT10ylierung erschweren, da die Inhibition der katalytischen UBA6 Aktivität gleichzeitig UBA6-abhängige Ubiquitinaktivierung behindern würde. Daher ist für die zukünfitge Entwicklung FAT10-spezifischer UBA6 Inhibitoren ein grundlegendes Verständnis der UBA6 Bispezifität unerlässlich. In dieser Dissertation wurden wichtige, neue Einsichten in die Struktur und Funktion von UBA6 durch Röntgenkristallographie und biochemische Methoden gewonnen. Die erste Kristallstruktur von UBA6 zeigt die Multidomänenarchitektur des Enzyms bei atomarer Auflösung. Das Protein besteht aus einem starren Kern, der sowohl seine aktive als auch inaktive Adenylierungsdomäne sowie ein 4-Helix Bündel enthält. Das Molekül nimmt eine an ein Y erinnnernde Form ein, in der der Kern die Basis, die erste und zweite katalytischen Halbdomänen einen Arm und die ubiquitinähnliche gefaltete Domäne den zweiten Arm darstellen. Zwar ähneln sich der Domänenaufbau von UBA6 und UBA1, jedoch zeigte die Kristallstruktur bedeutende Unterschiede zwischen den beiden auf. Speziell die erste katalytische Halbdomäne ist in UBA6 im Vergleich zu UBA1weiter vom Enzymkern entfernt. Diese ‚Bewegung‘ erlaubt wahrscheinlich die Platzierung der zweiten UBL-Domäne von FAT10. Weitere Unterschiede konnten auch in der hydrophoben Oberfläche zwischen Kern, erster katalytischer Halbdomäne und dem aktiven Zentrum für die Adenylierung im Kern beobachtet werden, die zusammen die Bindestelle für Ubiquitin und FAT10 bilden. Durch ortsgerichtete Mutagenese von Schlüsselpositionen in dieser Region kontte die UBA6-katalysierte Aktivierung von entweder Ubiquitin oder FAT10 unterbunden werden. Um die Bispezifität von UBA6 zu entschlüsseln wurden UBA6 Varianten mit dem Ziel erzeugt, die Aktivierung von FAT10 unter Aufrechterhaltung der von Ubiquitin zu blockieren. Obwohl keine dieser Mutationen die FAT10-Aktivierung unterband, verhinderten einige jedoch die Aktivierung von Ubiquitin. Vorläufige Inhibitionsexperimente mit E1-Inhibitoren aus der Adenosylsulfamat Klasse zeigten starke Inhibition der FAT10ylierung durch zwei Verbindungen. Die Bispezifität von UBA6 bedarf weiterer strukturbiologischer und biochemischer Untersuchungen. Vor allem Kristallstrukturen von UBA6 in FAT10 und Ubiquitin-gebundener Form würden wichtige Erkenntnisse für weiteregehende biochemische Untersuchungen und schließlich die gezielte Unterdrückung der FAT10ylierungsmaschinerie liefern. KW - Ubiquitylation KW - FAT10ylation KW - UBA6 KW - UBE2Z Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244579 ER - TY - THES A1 - Pacios Michelena, Anabel T1 - Molecular insights into the complex formed by the actin cytoskeleton related protein VASP and the inhibitory postsynaptic scaffolding protein gephyrin T1 - Molekulare Einblicke in den Komplex, der durch das mit dem Aktin-Zytoskelett verwandte Protein VASP und Gephyrin, einem Gerüstprotein inhibitorischer postsynaptischer Strukturen, gebildet wird N2 - Gephyrin is a 93 kDa moonlighting protein, which is involved in the last two steps of the molybdenum cofactor (Moco) biosynthesis pathway while at the same time playing a central role in the anchoring, clustering and stabilization of glycine receptors (GlyRs) ... N2 - Gephyrin ist ein multifunktionales 93 kDa-Protein. Dieses Protein katalysiert die letzten beiden Schritte des Biosynthesewegs des Molybdän-Cofaktors (Moco). Gleichzeitig spielt es eine zentrale Rolle bei der Verankerung, Clusterbildung und Stabilisierung sowohl von Glycinrezeptoren (GlyRs) als auch von ... KW - gephyrin KW - vasp KW - Inhibitory-postsynapse KW - Actin cytoskeleton-related protein Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-213373 ER - TY - THES A1 - Zink, Christoph T1 - Biochemische und strukturbiologische Charakterisierung der Inhibition der Pyridoxal 5´-Phosphat Phosphatase durch 7,8-Dihydroxyflavon T1 - Biochemical and structural characterization of pyridoxal 5´-phosphate phosphatase inhibitor 7,8-dihydroxyflavone N2 - Die Pyridoxal-5‘-Phosphat Phosphatase (PDXP), auch bekannt als Chronophin (CIN), ist eine HAD-Phosphatase, die beim Menschen ubiquitär exprimiert wird und eine entscheidende Rolle im zellulären Vitamin-B6-Metabolismus einnimmt. PDXP ist in der Lage Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), die co-enzymatisch aktive Form von Vitamin B6, zu dephosphorylieren. In-vivo Studien mit Mäusen zeigten, dass die Abwesenheit von PDXP mit verbesserten kognitiven Leistungen und einem verringerten Wachstum von Hirntumoren assoziiert ist. Dies begründet die gezielte Suche nach einem pharmakologischen Inhibitor für PDXP. Ein Hochdurchsatz-Screen legte nahe, dass 7,8-Dihydroxyflavon (7,8-DHF) hierfür ein potenzieller Kandidat ist. Zahlreiche Studien beschreiben bereits vielfältige positive neurologische Effekte nach in-vivo Administration von 7,8-DHF, allerdings bleibt der genaue Wirkmechanismus umstritten und wird bis dato nicht mit PDXP in Zusammenhang gebracht. Ziel dieser Arbeit ist es, die Inhibition von PDXP durch 7,8-DHF näher zu charakterisieren und damit einen Beitrag zur Beantwortung der Frage zu leisten, ob PDXP an den 7,8-DHF-induzierten Effekten beteiligt ist. Hierzu wurde der Effekt von 7,8-DHF auf die enzymatische Aktivität von rekombinant hergestelltem, gereinigtem PDXP in in-vitro Phosphatase-Assays charakterisiert. Um die Selektivität von 7,8-DHF gegenüber PDXP zu untersuchen, wurden fünf weitere HAD-Phosphatasen getestet. Unter den analysierten Phosphatasen zeigte einzig die dem PDXP nah verwandte Phosphoglykolat Phosphatase (PGP) eine geringer ausgeprägte Sensitivität gegen 7,8-DHF. Ein Vergleich von 7,8-DHF mit sechs strukturell verwandten, hydroxylierten Flavonen zeigte, dass 7,8-DHF unter den getesteten Substanzen die höchste Potenz und Effektivität aufwies. Außerdem wurde eine Co-Kristallisation von PDXP mit 7,8-DHF durchgeführt, deren Struktur bis zu einer Auflösung von 2,0 Å verfeinert werden konnte. Die in der Kristallstruktur identifizierte Bindungsstelle von 7,8-DHF an PDXP wurde mittels verschiedener, neu generierter PDXP-Mutanten enzymkinetisch bestätigt. Zusammenfassend zeigen die hier beschriebenen Ergebnisse, dass 7,8-DHF ein direkter, selektiver und vorwiegend kompetitiver Inhibitor der PDXP-Aktivität ist, mit einer IC50 im submikromolaren Bereich. Die Ergebnisse dieser in-vitro Untersuchungen motivieren zu weiterer Forschung bezüglich der 7,8-DHF-vermittelten Inhibition der PDXP-Aktivität in Zellen, um die Frage beantworten zu können, ob PDXP auch in-vivo ein relevantes Target für 7,8-DHF darstellt. N2 - Pyridoxal 5'-phosphate phosphatase (PDXP, also known as chronophin, CIN), is a ubiquitously expressed HAD-phosphatase. PDXP is known to dephosphorylate pyridoxal-5'-phosphate (PLP), the biologically active form of vitamin B6 that is one of the most versatile cofactors found in nature. In-vivo studies revealed improved cognition and impaired glial tumor growth with mice absent of PDXP, and caused the search for a pharmacological inhibitor of PDXP. The result of a high-throughput screen suggested that 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) is a suitable candidate for this. Interestingly, numerous scientific studies highlighted diverse positive neurological effects after administration of 7,8-DHF to mice, however, the precise mode of action remains disputed, and at this date is unrelated to PDXP. The aim of this work is to characterize the inhibition of PDXP by 7,8-DHF. This approach is a first step to determine whether 7,8-DHF may indeed exert some of its neurological effects via PDXP inhibition. For this purpose, the effect of 7,8-DHF on the enzymatic activity of recombinantly expressed and purified PDXP was characterized in in-vitro phosphatase assays. To investigate the selectivity of 7,8-DHF on PDXP, five additional HAD phosphatases were tested. Among the phosphatases analyzed, only the phosphoglycolate phosphatase (PGP), closely related to PDXP, showed a less pronounced sensitivity to 7,8-DHF. A comparison of 7,8-DHF with six structurally related, hydroxylated flavones showed that 7,8-DHF had the highest potency and effectiveness among the substances tested. In addition, a co-crystallization of PDXP with 7,8-DHF was carried out. The resulting co-crystal structure could be resolved and refined to a resolution of 2.0 Å. The binding site of the ligand to the enzyme identified in the crystal structure was confirmed via activity-based assays using various newly generated PDXP mutants. In summary, the results described here show that 7,8-DHF is a direct, selective, and predominantly competitive inhibitor of PDXP activity with an IC50 in the submicromolar range. The results of these in-vitro studies motivate further research into the 7,8-DHF-mediated inhibition of PDXP activity in cells to be able to answer the question of whether PDXP is also a relevant target for 7,8-DHF in-vivo. KW - Pyridoxalphosphat KW - Pyridoxalphosphat Phosphatase KW - PDXP KW - 7,8-Dihydroxyflavon KW - 7,8-dihydroxyflavone KW - Chronophin KW - Pyridoxal phosphate phosphatase Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251511 ER -