TY  - THES
A1  - Bertlein, Sarah
T1  - Hydrogels as Biofunctional Coatings and Thiol-Ene Clickable Bioinks for Biofabrication
T1  - Hydrogele als biofunktionale Beschichtungen und Thiol-Ene-clickbare Biotinten für die Biofabrikation
N2  - Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von funktionalisierbaren Hydrogel Beschichtungen für Schmelz-elektrogeschriebene PCL Gerüste und von Bio-druckbaren Hydrogelen für die Biofabrikation.
Hydrogel Beschichtungen von Schmelz-elektrogeschriebenen Konstrukten ermöglichten die Kontrolle der Oberflächen-Hydrophilie und damit Zell-Material Interaktionsstudien in minimal Protein-adhäsiven Umgebungen. Zu diesem Zweck wurde ein hydrophiles sternförmiges vernetzbares Polymer verwendet und eine Optimierung der Beschichtungsbedingungen durchgeführt. Außerdem boten neu entwickelte photosensitive Konstrukte eine Zeit- und pH-unabhängige Biofunktionalisierung.
Bio-druckbare Hydrogele für die Biofabrikation basierten auf der Allyl-Funktionalisierung von Gelatine (GelAGE) und modifizierten Hyaluronsäure-Produkten, die das Hydrogel-Vernetzen mittels Thiol-En Click Chemie ermöglichen. Die Optimierung der GelAGE Hydrogel-Eigenschaften wurde durch eine detaillierte Analyse der Syntheseparameter, variierender En:SH Verhältnisse, unterschiedlicher Vernetzungsmoleküle und Photoinitiatoren erreicht. Die Homogenität der Thiol-En Netzwerke wurde mit denen der freien radikalischen Polymerisation verglichen und die Verwendbarkeit von GelAGE als Bio-Tinte für den Extrusions-basierten Bio-Druck wurde untersucht. Es wurde angenommen, dass reine Hyaluronsäure-basierte Bio-Tinten eine Beibehaltung der mechanischen und rheologischen Eigenschaften, der Zellviabilität und der Prozessierbarkeit ermöglichen trotz geringerem Polymer- und Thiol-Anteil der Hydrogele.
Hydrogel-Beschichtungen: Hoch definierte PCL Gerüste wurden mittels MEW hergestellt und anschließend mit sechs armigen sternförmigen vernetzbaren Polymeren (sP(EO-stat-PO)) beschichtet. Die Vernetzung wird durch die wässrig-induzierte Hydrolyse reaktiver Isocyanatgruppen (NCO) von sP(EO-stat-PO) bedingt. Diese Beschichtung erhöhte die Oberflächen-Hydrophilie und stellte eine Plattform für weitere Biofunktionalisierungen, in minimal Protein-adhäsiven Umgebungen, dar. Nicht nur das Beschichtungsprotokoll wurde hinsichtlich der sP(EO-stat-PO) Konzentrationen und der Beschichtungsdauern optimiert, sondern auch Vorbehandlungen der Gerüste wurden entwickelt. Diese waren essentiell um die finale Hydrophilie von sP(EO-stat-PO) beschichteten Gerüste so zu erhöhen, dass unspezifische Protein-Adhäsionen vollständig unterbunden wurden. Die sP(EO-stat-PO) Schichtdicke, von ungefähr 100 nm, ermöglicht
generell in vitro Studien nicht nur in Abhängigkeit der Gerüst-Biofunktionalisierung, sondern auch in Abhängigkeit der Gerüst-Architektur durchzuführen. Das Ausmaß der Hydrogel-Beschichtung wurde mittels einer indirekten Quantifizierung der NCO-Hydrolyse-Produkte ermittelt. Kenntnis über die NCO-Hydrolyse-Kinetik ermöglichte ein Gleichgewicht zwischen ausreichend beschichteten Gerüsten und der Präsenz der NCO-Gruppen herzustellen, welche für die anschließenden Biofunktionalisierungen genutzt wurden. Diese Zeit- und pH-abhängige Biofunktionalisierung war jedoch nur für kleine Biomoleküle möglich. Um diese Beschränkung zu umgehen und auch hochmolekulare Biomoleküle kovalent anzubinden, wurde ein anderer Reaktionsweg entwickelt. Dieser basierte auf der Photolyse von Diazirin-Gruppen und ermöglichte eine Zeit- und pH-unabhängige Biofunktionalisierung der Gerüste mit Streptavidin und Kollagen Typ I. Die Fibrillen bildende Eigenschaft von Kollagen wurde genutzt um auf den Gerüsten verschiedene Kollagen-Konformationen zu erhalten und eine erste in vitro Studie bestätigte die Anwendbarkeit für Zell-Material Interaktionsstudien.
Die hier entwickelten Gerüste könnten verwendet werden um tiefere Einblicke in die Grundlagen der zellulären Wahrnehmung zu erhalten. Insbesondere die Komplexität mit der Zellen z.B. Kollagen wahrnehmen bleibt weiterhin klärungsbedürftig. Hierfür könnten diverse Hierarchien von Kollagen-ähnlichen Konformationen an die Gerüste gebunden werden, z.B. Gelatine oder Kollagen-abgeleitete Peptidsequenzen. Dann könnte die Aktivierung der DDR-Rezeptoren in Abhängigkeit der Komplexität der angebundenen Substanzen bestimmt werden. Aufgrund der starken Streptavidin-Biotin Bindung könnten Streptavidin funktionalisierte Gerüste eine vielseitige Plattform für die Immobilisierung von jeglichen biotinylierten Molekülen darstellen.
Gelatine-basierte Bio-Tinten: Zuerst wurden die GelAGE-Produkte hinsichtlich der Molekulargewichts-Verteilung und der Integrität der Aminosäuren-Zusammensetzung synthetisiert. Eine detailliert Studie, mit variierenden molaren Edukt-Verhältnissen und Synthese-Zeitspannen, wurde durchgeführt und implizierte, dass der Gelatine Abbau am deutlichsten für stark alkalische Synthesebedingungen mit langen Reaktionszeiten war. Gelatine beinhaltet mehrere funktionalisierbare Gruppen und anhand diverser Model-Substanzen und Analysen wurde die vorrangige Amingruppen-Funktionalisierung ermittelt. Die Homogenität des GelAGE-Polymernetzwerkes, im Vergleich zu frei radikalisch polymerisierten GelMA-Hydrogelen, wurde bestätigt. Eine ausführliche
Analyse der Hydrogel-Zusammensetzungen mit variierenden funktionellen Gruppen Verhältnissen und UV- oder Vis-Licht induzierbaren Photoinitiatoren wurde durchgeführt. Die UV-Initiator Konzentration ist aufgrund der Zell-Toxizität und der potenziellen zellulären DNA-Beschädigung durch UV-Bestrahlung eingeschränkt. Das Zell-kompatiblere Vis-Initiator System hingegen ermöglichte, durch die kontrollierte Photoinitiator-Konzentration bei konstanten En:SH Verhältnissen und Polymeranteilen, die Einstellung der mechanischen Eigenschaften über eine große Spanne hinweg. Die Flexibilität der GelAGE Bio-Tinte für unterschiedliche additive Fertigungstechniken konnte, durch Ausnutzung des temperaturabhängigen Gelierungsverhaltens unterschiedlich stark degradierter GelAGE Produkte, für Stereolithographie und Extrusions-basiertem Druck bewiesen werden. Außerdem wurde die Viabilität zellbeladener GelAGE Konstrukte bewiesen, die mittels Extrusions-basiertem Bio-Druck erhalten wurden. Die Verwendung diverser multifunktioneller und makromolekularer Thiol-Vernetzungsmoleküle ermöglichte eine Verbesserung der mechanischen und rheologischen Eigenschaften und ebenso der Prozessierbarkeit. Verglichen mit dem kleinen bis-Thiol-funktionellen Vernetzungsmolekül waren geringere Thiol-Vernetzer-Konzentrationen notwendig um bessere mechanische Festigkeiten und physikochemische Eigenschaften der Hydrogele zu erhalten. Der Extrusions-basierte Bio-Druck unterschiedlicher eingekapselter Zellen verdeutlichte die Notwendigkeit der individuellen Optimierung von Zell-beladenen Hydrogel-Formulierungen.
Nicht nur die Zellviabilität von eingekapselten Zellen in Extrusions-basierten biogedruckten Konstrukten sollte bewertet werden, sondern auch andere Parameter wie die Zellmorphologie oder die Kollagen- oder Glykosaminoglykan-Produktion, da diese einige der essentiellen Voraussetzungen für die Verwendung in Knorpel Tissue Engineering Konzepten darstellen. Außerdem sollten diese Studien auf die stereolithographischen Ansätze erweitert werden und letztlich wäre die Flexibilität und Zellkompatibilität der Formulierungen mit makromolekularen Vernetzern von Interesse. Makromolekulare Vernetzer ermöglichten die Reduktion des Polymeranteils und des Thiol-Gehalts und können, insbesondere in Kombination mit dem Zell-kompatibleren Vis-Initiator-System, voraussichtlich zu einer gesteigerten Zellkompatibilität beitragen, was zu klären bleibt.
Hyaluronsäure-basierte Bio-Tinten: Unterschiedliche Hyaluronsäure-Produkte (HA) wurden synthetisiert, sodass diese En- (HAPA) oder Thiol-Funktionalitäten (LHASH)
beinhalteten, um reine HA Thiol-En vernetzte Hydrogele zu erhalten. In Abhängigkeit des Molekulargewichts der HA-Produkte, der Polymeranteile und des En:SH Verhältnisses, konnte eine große Spanne an mechanischen Festigkeiten abgedeckt werden. Aufgrund der hohen Viskosität war allerdings im Falle von hochmolekularen HA (HHAPA) Produkt-Lösungen (HHAPA + LHASH) die Handhabbarkeit auf 5.0 wt.-% beschränkt. Die Verwendung der gleichen HA Thiol-Komponenten (LHASH) ermöglichte Hybrid-Hydrogele, mit HA und GelAGE, mit reinen HA-Hydrogelen zu vergleichen. Obwohl der Polymeranteil von HHAPA + LHASH Hydrogelen signifikant geringer war, als im Vergleich zu Hybrid-Hydrogelen (GelAGE + LHASH), wurden für gleiche En:SH Verhältnisse ähnliche mechanische und physikochemische Eigenschaften reiner HA-Hydrogele bestimmt. Aufgrund der geringen Viskosität niedermolekularer HA Lösungen (LHAPA + LHASH) konnten diese nicht für den Extrusions-basierten Druck verwendet werden. Das nicht temperaturabhängige HHAPA + LHASH System hingegen konnte mit nur einem Viertel des Polymeranteils der Hybrid Formulierungen gedruckt werden. Im Vergleich zu der Hybrid Bio-Tinte wurde angenommen, dass das hoch viskose Verhalten von HHAPA + LHASH Lösungen, der geringere Polymeranteil, der geringere Druck für das Drucken und eine demzufolge geringere Scherspannung, maßgeblich zu der hohen Zellviabilität in Extrusions-basiert-biogedruckten Konstrukten beisteuerten.
Die niedrigmolekulare HA Formulierung (LHAPA + LHASH) konnte zwar nicht für den Extrusions-basierten Druck verwendet werden, allerdings besitzt dieses System Potential für andere additive Fertigungstechniken wie z.B. der Stereolithographie. Um dieses System weiterzuentwickeln wäre, analog zu dem GelAGE System, eine detailliertere Studie zu den Funktionen eingekapselter Zellen hilfreich. Außerdem sollte die Initiierung dieses Systems mit dem Vis-Initiator untersucht werden.
N2  - Aim of this thesis was the development of functionalizable hydrogel coatings for melt electrowritten PCL scaffolds and of bioprintable hydrogels for biofabrication.
Hydrogel coatings of melt electrowritten scaffolds enabled to control the surface hydrophilicity, thereby allowing cell-material interaction studies of biofunctionalized scaffolds in minimal protein adhesive environments. For this purpose, a hydrophilic star- shaped crosslinkable polymer was used and the coating conditions were optimized. Moreover, newly developed photosensitive scaffolds facilitated a time and pH independent biofunctionalization.
Bioprintable hydrogels for biofabrication were based on the allyl-functionalization of gelatin (GelAGE) and modified hyaluronic acid-products, to enable hydrogel crosslinking by means of the thiol-ene click chemistry. Optimization of GelAGE hydrogel properties was achieved through an in-depth analysis of the synthesis parameters, varying Ene:SH ratios, different crosslinking molecules and photoinitiators. Homogeneity of thiol-ene crosslinked networks was compared to free radical polymerized hydrogels and the applicability of GelAGE as bioink for extrusion-based bioprinting was investigated. Purely hyaluronic acid-based bioinks were hypothesized to maintain mechanical- and rheological properties, cell viabilities and the processability, upon further decreasing the overall hydrogel polymer and thiol content.

Hydrogel coatings: Highly structured PCL scaffolds were fabricated with MEW and subjected to coatings with six-armed star-shaped crosslinkable polymers (sP(EO-stat-PO)). Crosslinking results from the aqueous induced hydrolysis of reactive isocyanate groups (NCO) of sP(EO-stat-PO) and increased the surface hydrophilicity and provided a platform for biofunctionalizations in minimal protein adhesive environments. Not only the coating procedure was optimized with respect to sP(EO-stat-PO) concentrations and coating durations, instead scaffold pre-treatments were developed, which were fundamental to enhance the final hydrophilicity to completely avoid unspecific protein adsorption on sP(EO-stat-PO) coated scaffolds. The sP(EO-stat-PO) layer thickness of around 100 nm generally allows in vitro studies not only in dependence on the scaffold biofunctionalization but also on the scaffold architecture. The hydrogel coating extent was assessed via an indirect quantification of the NCO-hydrolysis products. Knowledge of NCO-hydrolysis kinetics enabled to achieve a balance of sufficiently coated scaffolds while maintaining the presence of NCO-groups that were exploited for subsequent biofunctionalizations. However, this time and pH dependent biofunctionalization was restricted to small biomolecules. In order to overcome this limitation and to couple high molecular weight biomolecules another reaction route was developed. This route was based on the photolysis of diazirine moieties and enabled a time and pH independent scaffold biofunctionalization with streptavidin and collagen type I. The fibril formation ability of collagen was used to obtain different collagen conformations on the scaffolds and a preliminary in vitro study demonstrated the applicability to investigate cell-material interactions.
The herein developed scaffolds could be applied to gain deeper insights into the fundamentals of cellular sensing. Especially the complexity by which cells sense e.g. collagen remain to be further elucidated. Therefore, different hierarchies of collagen-like conformations could be coupled to the scaffolds, e.g. gelatin or collagen-derived peptide sequences, and the activation of DDR receptors in dependence on the complexity of the coupled substances could be determined. Due to the strong streptavidin-biotin bond, streptavidin functionalized scaffolds could be applied as a versatile platform to allow immobilization of any biotinylated molecules.

Gelatin-based bioinks: First the GelAGE products were synthesized with respect to molecular weight distributions and amino acid composition integrity. A detailed study was conducted with varying molar ratios of reactants and synthesis durations and implied that gelatin degradation was most dominant for high alkaline synthesis conditions with long reaction times. Gelatin possesses multiple functionalizable groups and the predominant functionalization of amine groups was confirmed via different model substances and analyses. Polymer network homogeneity was proven for the GelAGE system compared to free radical polymerized hydrogels with GelMA. A detailed analysis of hydrogel compositions with varying functional group ratios and UV- or Vis-light photoinitiators was executed. The UV-initiator concentration is restricted due to cytotoxicity and potential cellular DNA damages upon UV-irradiation, whereas the more cytocompatible Vis- initiator system enabled mechanical stiffness tuning over a wide range by controlling the photoinitiator concentration at constant Ene:SH ratios and polymer weight percentages. Versatility of the GelAGE bioink for different AM techniques was proved by exploiting the thermo-gelling behavior of differently degraded GelAGE products for stereolithography and extrusion-based printing. Moreover, the viability of cell-laden GelAGE constructs was demonstrated for extrusion-based bioprinting. By applying different multifunctional thiol-macromolecular crosslinkers the mechanical and rheological properties improved concurrently to the processability. Importantly, lower thiol-crosslinker concentrations were required to yield superior mechanical strengths and physico-chemical properties of the hydrogels as compared to the small bis-thiol-crosslinker. Extrusion-based bioprinting with distinct encapsulated cells underlined the need for individual optimization of cell-laden hydrogel formulations.
Not only the viability of encapsulated cells in extrusion-based bioprinted constructs should be assessed, instead other parameters such as cell morphology or production of collagen or glycosaminoglycans should be considered as these represent some of the crucial prerequisites for cartilage Tissue Engineering applications. Moreover, these studies should be expanded to the stereolithographic approach and ultimately the versatility and cytocompatibility of formulations with macromolecular crosslinkers would be of interest. Macromolecular crosslinkers allowed reducing polymer weight percentages and amounts of thiol groups and are thus expected to contribute to increased cytocompatibility, especially in combination with the more cytocompatible Vis-initiator system, which remains to be elucidated.

Hyaluronic acid-based bioinks: Different molecular weight hyaluronic acid (HA) products were synthesized to bear ene- (HAPA) or thiol-functionalities (LHASH) to enable pure HA thiol-ene crosslinked hydrogels. Depending on the molecular weight of modified HA products, polymer weight percentages and Ene:SH ratios, a wide range of mechanical stiffness was covered. However, the manageability of high molecular weight HA (HHAPA) product solutions (HHAPA + LHASH) was restricted to 5.0 wt.-% as a consequence of the high viscosity. Based on the same HA thiol component (LHASH), hybrid hydrogels of HA with GelAGE were compared to pure HA hydrogels. Although the overall polymer weight percentage of HHAPA + LHASH hydrogels was significantly lowered compared to hybrid hydrogels (GelAGE + LHASH), similar mechanical and physico-chemical properties of pure HA hydrogels were determined with maintained Ene:SH ratios. Low viscous low molecular weight HA precursor solutions (LHAPA + LHASH) prevented the applicability for extrusion-based bioprinting, whereas the non-thermoresponsive HHAPA + LHASH system could be bioprinted with only one-fourth of the polymer content of hybrid formulations. The high viscous behavior of HHAPA + LHASH solutions, lower polymer weight percentages, decreased printing pressures and consequently declined shear stress during printing, were hypothesized to contribute to high cell viabilities in extrusion-based bioprinted constructs compared to the hybrid bioink.
The low molecular weight HA precursor formulation (LHAPA + LHASH) was not applicable for extrusion-based printing, but this system has potential for other AM techniques such as stereolithography. Similar to the GelAGE system a more detailed study on the functions of encapsulated cells would be useful to further develop this system. Moreover, the initiation with the Vis-initiator should be conducted.
KW  - Biomaterial
KW  - Bioink
KW  - hydrogel
KW  - biofabrication
KW  - Hydrogel
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174225
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TY  - THES
A1  - Pinzner, Florian
T1  - Vicinal and Double Chemoselective Biofunctionalization of Polyoxazolines
T1  - Vicinale und doppelt chemoselektive Biofunktionalisierung von Polyoxazolinen
N2  - In this work, a toolbox was provided to create three-component polymer conjugates with a defined architecture, designed to bear different biocomponents that can interact with larger biological systems in biomacromolecular recognition experiments. The target architecture is the attachment of two biomolecule ‘arms’ to the alpha telechelic end point of a polymer and fixating the conjugate to the gold surface of SAW and SPR sensor chips with the polymer’s other omega chain end. This specific design of a conjugate will be implemented by using a strategy to yield novel double alpha as well as omega telechelic functionalized POx and the success of all cascade reaction steps leading to the final conjugation product will be proven through affinity measurements between covalently bound mannose and ConA. All reactions were performed on a low molecular model level first and then transferred to telechelic and also side chain functionalized polymer systems.
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurden hydrophile Polymere und Biomakromoleküle chemoselektiv und vicinal miteinander an einer Bindungsstelle verknüpft. Die Kombination der Native Chemical Ligation (NCL) mit der Thiol–En-Reaktion stellte hierfür eine geeignete Methode dar. Ein Machbarkeitsbeweis wurde anhand einer niedermolekularen Modellreaktion erbracht und nachfolgend unter der Verwendung von Polyoxazolinen auf makromolekulare Polymersysteme übertragen. Die erfolgreiche Darstellung der Konjugate wurde durch biomakromolekulare Bindungsaffinitäts-Messungen zu dem Lektin ConA bestätigt.
KW  - Polyoxazoline
KW  - Polyoxazolines
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229758
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TY  - THES
A1  - Heilig, Philipp
T1  - Biomechanische Evaluation neuartiger Knochenersatzmaterialien zur Therapie der Tibiakopfimpressionsfraktur
T1  - Biomechanical evaluation of new bone substitutes for the therapy of tibial head depression fractures
N2  - Tibiakopfimpressionsfrakturen (AO 41-B2.2 – Schatzker III), welche aufgrund der demographischen Entwicklung in ihrer klinischen Relevanz zunehmen, erfordern zur bestmöglichen Frakturstabilisierung eine Schraubenosteosynthese sowie eine stabile metaphysäre Defektauffüllung mittels Knochenersatzmaterial, da anderenfalls ein sekundärer Repositionsverlust mit konsekutiver Gonarthrose droht. Die hierbei eingesetzten Kalziumphosphatzemente bringen klinische Probleme wie geringe mechanische Stabilität, fehlende Bohrbarkeit, welche eine unvollständige Defektauffüllung bedingt, ungewisse Resorption und unüberprüfte Herstellerangaben mit sich.
Diese Studie hatte daher zum Ziel, einen bohrbaren Kalziumphosphatzement und einen Magnesiumphosphatzement, welche als vielversprechende Alternativen aufgrund der klinischen Schwierigkeiten erscheinen, gegen Graftys® Quickset und ChronOS™ Inject biomechanisch einzuordnen und somit langfristig zu einer verbesserten Frakturversorgung beizutragen.
Der erste Teil der Studie bestand aus einer reinen Materialprüfung, in der mittels Zementquader Druckversuche und mittels Ausrisskörper Zugversuche durchgeführt wurden. Im zweiten Teil wurde ein Frakturmodell für Impressionsfrakturen an Kunstknochen benutzt, um die Zemente hierbei zur Defektauffüllung zu verwenden und alleine sowie in Kombination mit einer Osteosynthese in der Jail-Technik zu testen. Es erfolgte eine zyklische Belastung mit 3000 Zyklen zu je 250 N sowie anschließend eine Maximalkrafttestung (Load-To-Failure) mit Hilfe einer Materialprüfmaschine.
Der Magnesiumphosphatzement zeigte die signifikant höchste Kompressionsfestigkeit von 100,50 MPa ± 15,97 MPa und Ausrisskraft sowie im Verbund mit Knochen das geringste Displacement, höchste Maximalkraft und Steifigkeit. Kalziumphosphat bohrbar wies aufgrund seines pseudoplastischen Verhaltens eine geringe biomechanische Stabilität und ein hohes Displacement auf, konnte aber durch seine Bohrbarkeit gegenüber Graftys® Quickset bei Einsatz mit Schrauben einen Vorteil im Displacement erreichen und somit die Vorzüge eines bohrbaren Knochenzements aufzeigen. ChronOS™ zeigte nach Aushärtung im Wasserbad mit einer Kompressionsfestigkeit von 0,58 MPa ± 0,14 MPa eine niedrige biomechanische Stabilität und wurde daher nicht weiter untersucht. Da die Viskosität eines Zements neben anderen Faktoren für die Interdigitation mit den Spongiosahohlräumen im Knochen verantwortlich ist, lässt sich, sofern diese angemessen ist, Rückschlüsse von der Materialprüfung auf das Verhalten im Knochen ziehen.
Magnesiumphosphatzemente erscheinen aufgrund ihrer hohen biomechanischen Stabilität und vermutlich guten Resorptionsrate als vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Kalziumphosphatzementen und bedürfen daher einer weiteren Überprüfung im Tierversuch.
N2  - Bone substitutes are commonly used for filling up bone defects like in tibial head fractures. Different types of commercial bone substitutes are available, but comparable biomechanical studies especially analysing the substitute-bone interaction are missing. Thus, this study investigated the basic biomechanical characteristics of different bone substitutes, the bonesubstitute interface and the combination of substitute and screw osteosynthesis in a biomechanical fracture model for tibial head fractures (Schatzker III fractures). An in-house developed drillable apatite cement with HEMA-Hydrogel and an in-house developed magnesium phosphate cement were compared with two commercial cements, one brushite and one apatite cement, namely ChronOS™ Inject and Graftys® Quickset. In axial compression tests, the compressive strength and in screw pull-out tests, the pull-out strength were determined. In a tibial head fracture model, the bone substitutes were applied for filling up the bone defect, alone and in combination with a screw osteosynthesis. Displacement of the fracture fragment, maximum load and stiffness were calculated in cyclic and maximal axial loading tests. All tests were performed in the material testing machine Zwick Roell® Z020. The drillable apatite cement exhibited lower compressive strength (6.8±1.4 MPa) and screw pullout force (129±38 N) compared to its counterpart Graftys® (19.0±2.5 MPa, 295±39 N), but showed comparable displacement (~2 mm) and maximum load (3.5-3.8 kN) in the fracture model combined with the Jail-Technique. This may be due to the fact that the drillable cement allowed for drilling after replenishment and thus precise dispersion of the cement paste. The magnesium phosphate cement revealed a significant higher compressive strength (100.5±16.0 MPa), screw pull-out strength (1.7±0.2 kN) and a significant lower displacement (~1.5 mm) compared to the other bone substitutes. Probably due to its high intrinsic strength combined with a low viscosity to fill the complete defect. For the combination with screws, all bone substitutes revealed higher maximum loads and stiffness values. In conclusion, magnesium phosphate cement provided a high biomechanical stability in the pure material testing series and also in the substitute-bone interaction tests. Due to a low viscosity, the cement revealed a high integration in the spongiosa and a complete filling up of the bone defect around the placed screws. Moreover, a drillable bone substitute is favourable as the dispersion of the cement paste is not hindered by formerly placed screws. For tibial head fractures, only the combination of bone substitute and screw osteosynthesis provides under lower and maximal loading conditions an adequate stability.
KW  - Knochenzement
KW  - Knochenersatzmaterial
KW  - Bohrbarkeit
KW  - Tibiakopfbruch
KW  - Osteosynthese
KW  - bone substitute
KW  - drillable
KW  - struvite
KW  - tibial fracture
KW  - calcium phosphate cement
KW  - Tibiakopfimpressionsfraktur
KW  - Knochenzement
KW  - Magnesium Phosphat Zement
KW  - Kalzium Phosphat Zement
KW  - bohrbares Knochenersatzmaterial
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-171037
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TY  - THES
A1  - Meininger [geb. Christ], Susanne
T1  - Processing of calcium and magnesium phosphate cements for bone substitution
T1  - Verarbeitung von Calcium- und Magnesiumphosphatzementen als Knochenersatz
N2  - The main focus of this thesis was the processing of different calcium and magnesium phosphate cements together with an optimization of mechanical and biological properties. Therefore, different manufacturing techniques like 3D powder printing and centrifugally casting were employed for the fabrication of reinforced or biomedically improved implants.
One of the main problems during 3D powder printing is the low green strength of many materials, especially when they are only physically bonded and do not undergo a setting reaction. Such materials need post-treatments like sintering to exhibit their full mechanical performance. However, the green bodies have to be removed from the printer requiring a certain stability. With the help of fiber reinforcement, the green strength of printed gypsum samples could be increased by the addition of polymeric and glass fibers within the printing process. The results showed that fiber reinforcement during 3D powder printing is possible and opens up diverse opportunities to enhance the damage tolerance of green bodies as well as directly printed samples. The transfer to biomedically relevant materials like calcium and magnesium phosphate cements and biocompatible fibers would be the next step towards reinforced patient-specific implants.
In a second approach, centrifugally casting derived from construction industries was established for the fabrication of hollow bioceramic cylinders. The aim was the replacement of the diaphysis of long bones, which exhibit a tubular structure with a high density of cortical bone on the fringe. By centrifugation, cement slurries with and without additives could be fabricated to tubes. As a first establishment, the processing parameters regarding the material (e.g. cement composition) as well as the set-up (e.g. rotation times) had to be optimized for each system. In respect of mechanics, such tubes can keep up with 3D powder printed tubes, although the mechanical performance of 3D printed tubes is strongly dependent on printing directions. Additionally, some material compositions like dual setting systems cannot be fabricated by 3D powder printing. Therefore, a transfer of such techniques to centrifugally casting enabled the fabrication of tubular structures with an extremely high damage tolerance due to high deformation ability. A similar effect was achieved by fiber (mesh) addition, as already shown for 3D powder printing. Another possibility of centrifugally casting is the combination of different materials resulting in graded structures to adjust implant degradation or bone formation. This became especially apparent for the incorporation of the antibiotic vancomycin, which is used for the treatment of bacterial implant infections. A long-term release could be achieved by the entrapment of the drug between magnesium phosphate cement layers. Therefore, the release of the drug could be regulated by the degradation of the outer shell, which supports the release into an acidic bacterial environment. The centrifugally casting technique exhibited to be a versatile tool for numerous materials and applications including the fabrication of non-centrosymmetric patient-specific implants for the reconstruction of human long bones.
The third project aimed to manufacture strontium-substituted magnesium phosphate implants with improved biological behavior by 3D powder printing. As the promoting effect of strontium on bone formation and the inhibitory impact on bone resorption is already well investigated, the incorporation of strontium into a degradable magnesium phosphate cement promised a fast integration and replacement of the implant. Porous structures were obtained with a high pore interconnectivity that is favorable for cell invasion and bone ingrowth. Despite the porosity, the mechanical performance was comparable to pure magnesium phosphate cement with a high reliability of the printed samples as quantitatively determined by Weibull statistics. However, the biological testing was impeded by the high degradation rate and the relating ion release. The high release of phosphate ions into surrounding media and the detachment of cement particles from the surface inhibited osteoblast growth and activity. To distinguish those two effects, a direct and indirect cell seeding is always required for degradable materials. Furthermore, the high phosphate release compared to the strontium release has to be managed during degradation such that the adverse effect of phosphate ions does not overwhelm the bone promoting effect of the strontium ions.
The manufacturing techniques presented in this thesis together with the material property improvement offer a diverse tool box for the fabrication of patient-specific implants. This includes not just the individual implant shape but also the application like bone growth promotion, damage tolerance and local drug delivery. Therefore, this can act as the basis for further research on specific medical indications.
N2  - Der Fokus dieser Dissertation lag auf der Verarbeitung von Calcium- und Magnesiumphosphatzementen zusammen mit der Optimierung mechanischer und biologischer Eigenschaften. Dazu wurden verschiedene Produktionsverfahren wie beispielsweise der 3D Pulverdruck und der Schleuderguss verwendet, um mechanisch verstärkte oder biomedizinisch verbesserte Implantate herzustellen.
Eines der Hauptprobleme des 3D Pulverdrucks ist die geringe Festigkeit des Grünkörpers vieler Materialien, besonders wenn diese lediglich physikalisch gebunden sind und keine Abbindereaktion durchlaufen. Solche Materialien müssen nachbearbeitet werden, beispielsweise durch Sintern, um ihre volle mechanische Leistungsfähigkeit zu entfalten. Die Grünkörper müssen jedoch aus dem 3D Drucker entnommen werden können, was eine gewisse Stabilität erfordert. Mit Hilfe der Faserverstärkung konnte die Festigkeit von gedruckten Grünkörper aus Gips erhöht werden, indem Polymer- und Glasfasern innerhalb des Druckprozesses eingebracht wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass Faserverstärkung innerhalb des 3D Pulverdrucks möglich ist und dabei vielfältige Möglichkeiten eröffnet, um die Schadenstoleranz von Grünkörpern wie auch von direkt gedruckten Proben zu verbessern. Der nächste Schritt hin zu verstärkten, patientenspezifischen Implantaten wäre die Übertragung auf biomedizinisch relevante Materialien wie Calcium- und Magnesiumphosphatzemente und biokompatible Fasern.
In einem zweiten Ansatz wurde der aus dem Baugewerbe stammende Schleuderguss für die Herstellung hohler Zylinder aus Biokeramik etabliert. Das Ziel war es, die Diaphyse von Röhrenknochen zu ersetzen, die eine tubuläre Struktur mit einer hohen Dichte an kortikalem Knochen am Rand aufweist. Durch Zentrifugieren konnten Zementpasten mit und ohne Additive zu Röhren verarbeitet werden. Zunächst mussten dabei die Prozessparameter bezüglich Material (z.B. Zementzusammensetzung) ebenso wie bezüglich der Einstellungen (z.B. Rotationszeiten) für jedes System optimiert werden. Im Hinblick auf ihre mechanischen Eigenschaften können solche Röhren mit 3D pulvergedruckten Röhren mithalten, obwohl die mechanische Leistungsfähigkeit von 3D gedruckten Röhren stark von der Druckrichtung abhängt. Zusätzlich können einige Materialkombinationen wie dual-abbindende Systeme nicht mit 3D Pulverdruck verarbeitet werden. Daher ermöglicht eine Übertragung solcher Techniken auf den Schleuderguss die Fertigung tubulärer Strukturen mit extrem hoher Schadenstoleranz aufgrund hoher Verformbarkeit. Wie bereits für das 3D Pulverdrucken gezeigt, konnte ein ähnlicher Effekt durch die Zugabe von Fasern (Geweben) erzielt werden. Eine weitere Möglichkeit des Schleudergusses ist die Kombination verschiedener Materialien zu gradientenartigen Strukturen, um den Implantatabbau oder die Knochenbildung anzupassen. Dies war besonders wichtig für die Einbringung des Antibiotikums Vancomycin, das für die Behandlung bakterieller Implantatinfektionen eingesetzt wird. Eine Langzeitfreisetzung konnte durch den Einbau des Arzneistoffs zwischen Magnesiumphosphatschichten erreicht werden. Dadurch konnte die Freisetzung des Wirkstoffs durch den Abbau der äußeren Hülle geregelt werden, was die Freisetzung in das saure Milieu von Bakterien unterstützt. Der Schleuderguss erwies sich als vielseitiges Werkzeug für viele Materialien und Anwendungen, was die Herstellung von nicht-zentrosymmetrischen, patientenspezifischen Implantaten zur Rekonstruktion von menschlichem Röhrenknochen einschließt.
Das dritte Projekt zielte auf die Herstellung Strontium-substituierter Magnesiumphosphatimplantaten mittels 3D Pulverdruck mit verbessertem biologischen Verhalten ab. Da die unterstützende Wirkung von Strontium auf die Knochenbildung und die Hemmung des Knochenabbaus bereits eingehend untersucht sind, versprach die Einbringung von Strontium in den abbaubaren Magnesiumphosphatzement eine schnelle Integration und Ersatz des Implantats. Es konnten poröse Strukturen mit einer hohen Poreninterkonnektivität erhalten werden, was förderlich für die Einwanderung von Zellen und das Einwachsen von Knochen ist. Neben der Porosität waren auch die mechanischen Eigenschaften vergleichbar mit reinem Magnesiumphosphatzement mit einer hohen Verlässlichkeit der gedruckten Proben, was quantitativ durch eine Weibullstatistik bestimmt wurde. Die biologische Testung wurde allerdings durch die hohe Degradationsrate und der damit einhergehenden Ionenfreisetzung erschwert. Die hohe Freisetzung von Phosphationen in das umgebende Medium und die Ablösung von Zementpartikeln von der Oberfläche verhinderten das Wachstum und Aktivität der Osteoblasten. Um diese beiden Effekte voneinander unterscheiden zu können, war eine direkte und indirekte Zellbesiedelung der abbaubaren Materialien notwendig. Des Weiteren muss die hohe Phosphatfreisetzung im Vergleich zur Strontiumfreisetzung während des Abbaus derart gesteuert werden, dass die negativen Effekte der Phosphationen nicht die Förderung des Knochenaufbaus durch Strontiumionen überwiegen.
Die in dieser Dissertation dargestellten Fertigungstechniken zusammen mit der Verbesserung der Materialeigenschaften bieten eine vielfältige Palette zur Herstellung patientenspezifischer Implantate. Dies beinhaltet nicht nur eine individuelle Implantatgeometrie, sondern auch eine Verbesserung der Schadenstoleranz, die Förderung des Knochenwachstums sowie eine lokale Wirkstofffreisetzung. Daher kann diese Arbeit als Grundlage für weitere Forschung im Bereich spezifischer, medizinischer Indikationen dienen.
KW  - Calciumphosphate
KW  - Knochenzemente
KW  - 3D powder printing
KW  - Schleuderguss
KW  - Knochenersatz
KW  - centrifugally casting
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169126
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TY  - THES
A1  - Schwab, Andrea
T1  - Development of an osteochondral cartilage defect model
T1  - Entwicklung eines osteochondralen Knorpeldefektmodells
N2  - The limited intrinsic self-healing capability of articular cartilage requires treatment of
cartilage defects. Material assisted and cell based therapies are in clinical practice but
tend to result in formation of mechanical inferior fibro-cartilage in long term follow up. If
a lesion has not been properly restored degenerative diseases are diagnosed as late sequela
causing pain and loss in morbidity. Complex three dimensional tissue models mimicking
physiological situation allow investigation of cartilage metabolism and mechanisms involved
in repair. A standardized and reproducible model cultured under controllable conditions
ex vivo to maintain tissue properties is of relevance for comparable studies.
Topic of this thesis was the establishment of an cartilage defect model that allows for
testing novel biomaterials and investigate the effect of defined defect depths on formation
of repair tissue.
In part I an ex vivo osteochondral defect model was established based on isolation of
porcine osteochondral explants (OCE) from medial condyles, 8 mm in diameter and 5 mm
in height. Full thickness cartilage defects with 1 mm to 4 mm in diameter were created
to define ex vivo cartilage critical size after 28 days culture with custom developed static
culture device. In part II of this thesis hydrogel materials, namely collagen I isolated from
rat tail, commercially available fibrin glue, matrix-metalloproteinase clevable poly(ethylene
glycol) polymerized with heparin (starPEGh), methacrylated poly(N-(2-hydroxypropyl)
methacrylamide mono-dilactate-poly(ethylene glycol) triblock copolymer/methacrylated
hyaluronic acid (MP/HA), thiol functionalized HA/allyl functionalized poly(glycidol)
(P(AGE/G)-HA-SH), were tested cell free and chondrocyte loaded (20 mio/ml) as implant
in 4 mm cartilage defects to investigate cartilage regeneration. Reproducible chondral
defects, 8 mm in diameter and 1 mm in height, were generated with an artificial tissue
cutter (ARTcut®) to investigate effect of defect depth on defect regeneration in part III.
In all approaches OCE were analyzed by Safranin-O staining to visualize proteoglycans
in cartilage and/or hydrogels. Immuno-histological and -fluorescent stainings (aggrecan,
collagen II, VI and X, proCollagen I, SOX9, RUNX2), gene expression analysis (aggrecan,
collagen II and X, SOX9, RUNX2) of chondrocyte loaded hydrogels (part II) and proteoglycan
and DNA content (Part I & II) were performed for detailed analysis of cartilage
regeneration.
Part I: The development of custom made static culture device, consisting of inserts in which OCE is fixed and deep well plate, allowed tissue specific media supply without
supplementation of TGF � . Critical size diameter was defined to be 4 mm.
Part II: Biomaterials revealed differences in cartilage regeneration. Collagen I and fibrin
glue showed presence of cells migrated from OCE into cell free hydrogels with indication
of fibrous tissue formation by presence of proCollagen I. In chondrocyte loaded study
cartilage matrix proteins aggrecan, collagen II and VI and transcription factor SOX9 were
detected after ex vivo culture throughout the two natural hydrogels collagen I and fibrin
glue whereas markers were localized in pericellular matrix in starPEGh. Weak stainings resulted
for MP/HA and P(AGE/G)-HA-SH in some cell clusters. Gene expression data and
proteoglycan quantification supported histological findings with tendency of hypertrophy
indicated by upregulation of collagen X and RunX2 in MP/HA and P(AGE/G)-HA-SH.
Part III: In life-dead stainings recruitment of cells from OCE into empty or cell free
collagen I treated chondral defects was seen.
Separated and tissue specific media supply is critical to maintain ECM composition in
cartilage. Presence of OCE stimulates cartilage matrix synthesis in chondrocyte loaded
collagen I hydrogel and reduces hypertrophy compared to free swelling conditions and
pellet cultures. Differences in cartilage repair tissue formation resulted in preference of
natural derived polymers compared to synthetic based materials. The ex vivo cartilage
defect model represents a platform for testing novel hydrogels as cartilage materials, but
also to investigate the effect of cell seeding densities, cell gradients, cell co-cultures on
defect regeneration dependent on defect depth. The separated media compartments allow
for systematic analysis of pharmaceutics, media components or inflammatory cytokines on
bone and cartilage metabolism and matrix stability.
N2  - Aufgrund der geringen Selbsheilungsfähigkeit von artikulären Knorpel erfordern Knorpeldefekte
eine orthopädische Behandlung. Bislang konnte mit material- oder zellbasierenden
Behandlungsstrategien keine funktionelle Regeneration von Knorpeldefekten erreicht werden.
In Langzeitstudien zeigt sich vermehrt die Bildung von mechanisch instabilem fibrosen
Knorpel. Als Spätfolge nicht vollständig verheilter Knorpeldefekte wird die degenerative
Erkrankung Osteoarthrose diagnostiziert. 3-dimensionale Gewebemodelle, die die
physiologischen Gegebenheiten nachahmen erlauben einen Einblick in die Mechanismen
während der Defektheilung. Dem subchondralen Knochen kommt eine kritische Rolle in der
Regeneration nach Mikrofrakturierung zu, weshalb ein Knorpelmodell auf osteochondralen
Gewebe basieren sollte.
Thema der Arbeit war es ein standardisiertes Knorpeldefektmodell zu etablieren, das die
Testung neuer Hydrogelformulierungen sowohl zellfrei als auch zellbeladen hinsichtlich
deren Regenerationspotential ermöglicht und den Einfluss der Knorpeldefekttiefe auf die
Regeneration zu analysieren.
Teil I der Arbeit umfasste die Etablierung des ex vivo osteochondralen Defektmodells,
basierend auf der Isolation von porcinen osteochondralen Explantaten (OCE) mit eine
Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 5 mm aus der medialen Kondyle. Full
thickness Knorpeldefekte mit einem Durchmesser zwischen 1 mm und 4 mm wurden
induziert, um den kritischen Defektdurchmesser nach 28 Tagen Kultur in einer neuartigen
statischen Kulturplatte zu definieren. In Teil II stand die Testung von Hydrogelen aus
Kollagen I isoliert aus Rattenschwänzen, kommerziell erhältlicher Firbrinkleber, Matrix-
Metalloproteinase clevable poly(Ethylen Glycol) polymerisiert mit Heparin (starPEGh),
methacrylates poly(N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid mono-dilactate-poly(Ethylene Glycol)
triblock copolymer/methacrylated Hyaluronsäure (MP/HA), thiol functionalisiertes
HA/allyl functionalisiertes poly(Glycidol) (P(AGE/G)-HA-SH) als zellfreies oder mit
20 Mio/ml Chondrozyten beladenes Implantat im Knorpeldefekt mit einem Durchmesser
von 4 mm im Fokus. Ein automatisiertes Verfahren zur Wundsetzung (ARTcut®) erlaubte
in Teil III der Thesis das Kreieren von reproduzierbaren chondralen Defekten mit 4 mm
Durchmesser und 1 mm Tiefe in das OCE Modell , um den Einfluss der Defekttiefe auf
die Knorpelregeneration zu analysieren.
Das Knorpelgewebe des OCE und/oder Hydrogele wurde in allen Experimenten mittels
Safranin-O auf Proteoglykangehalt untersucht. Immunhistologische und -fluoreszenzfärbung knorpelspezifischer Marker, Genexpressionsanalysen der Chondrozyten beladenen Hydrogele
(Teil II) und Quantifizierung der Proteoglykane und des DNA Gehalts (Teil I & II)
folgten nach ex vivo Kultur.
Teil I: Die neu entwickelten statischen Kulturkammern setzen sich aus Inserts, in denen das
OCE fixiert ist, und einer 6 Well–Platte zusammen. Dadurch wird eine Gewebespezifische
Medienversorung mit Knorpelmedium ohne TGF �  in den Inserts und Knochenmedium
in der Vertiefung der Wellplatte ermöglicht. Die kritische Defektgröße im ex vivo Modell
wurde mit 4 mm festgesetzt. Teil II: Biomaterialien als Implantate im Knorpeldefekt
zeigten ein materialabhängiges Regenerationspotential. Die Einwanderung von Zellen aus
dem OCE in zellfreie Hydrogele resultierte in der Lebend-Tot Färbung bei Kollagen I
und Fibrinkleber mit der Tendenz der Synthese von fibrösem Knorpel. Die Chondorzyten
beladenen Hydrogele aus Kollagen I und Fibrinkleber zeigten eine homogene Positivfärbung
für die hyalinen Proteine Aggrekan, Collagen II und X und des Knorpeltranskriptionsfaktors
SOX9, wohingegen die Färbung bei starPEGh lokal in der perizellulären Region
lokalisiert war. Die weiteren Materialien MP/HA und P(AGE/G)-HA-SH wiesen eine
schwache Positivfärbung an einzelnen Zellclustern auf. Die Genexpressionsanalyse und
die Quantifizeirung der Proteoglykane bestätigten die histologischen Ergebnisse mit der
Tendenz der Hypertrophie, belegt durch Hochregulierung von Kollagen X und RunX2, bei
Chondrozyten eingebettet in MP/HA und P(AGE/G)-HA-SH. Teil III: In der Lebend-Tot
Färbung konnte die Einwanderung von Zellen aus dem Knorpel des OCE in den Leerdefekt
und zellfreies Kollagen I Hydrogel nachgewisen werden.
Separierte und Gewebe spezifische Medienversorgung erwieß sich als kritischer Faktor
zur Aufrechterhaltung der Knorpel ECM. Die Anwesenheit des OCE stimuliert Knorpelmatrixsynthese,
die für das in vitro kultivierte Chondrozyten beladene Kollagen I
nachweislich geringer vorhanden war. Außerdem war die Produktion des hypertrophen
Markers Kollagen X im Implantat im OCE weniger stark ausgeprägt als in der in vitro Kultur.
Die Unterschiede der Knorpelregeneration deutet auf die Bevorzugung von natürlichen
Polymeren gegenüber den synthetisch basierten Hydrogelen hin. Das ex vivo Knorpeldefektmodell
stellt eine Platform zur Testung neuer Hydrogelmaterialien als Knorpelimplantate
dar. Weiterhin kann das Modell zur Analyse von Zellbesiedelungsstrategien als auch
für Zell-Ko-Kulturen im Hinblick auf die Defektregeneration herangezogen werden. Die
getrennten Medienreservoire ermöglichen weiterhin die systematische Analyse von Medienkomponenten
oder entzündlichen Zytokinen auf die Vitalität und Stabilität von Knochen
und Knorpelgewebe.
KW  - Hyaliner Knorpel
KW  - hyaline cartilage
KW  - Test system
KW  - cartilage regeneration
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155617
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zipplies, Theresa Leonora
T1  - Fluoreszenzmarkierte Nanogele auf Poly(glycidol)-Basis - Herstellung, Charakterisierung und deren Interaktion in vitro
T1  - Fluorescent Poly(glycidol)-based Nanogels - Synthesis, characterization and their interactions in vitro
N2  - Ziel dieser Arbeit war die Herstellung fluoreszent markierter Präpolymere sowie deren Optimierung, die kontrollierte und reproduzierbare Synthese von redox-sensitiven und nicht redox-sensitiven NG mit und ohne Fluoreszenzmarkierung in einem durchschnittlichen Partikelgrößenbereich von 150 – 300 nm und mit einer Konzentration > 10*10 Partikel/ml, die Charakterisierung der NG, ihre Untersuchung bezüglich ihrer Stabilität und des Assoziationsverhaltens zu BSA sowie die Erlangung von Erkenntnissen bezüglich des Aufnahmemechanismus der NG in Abhängigkeit vom Transportpeptid Tat.

Abschließend kann zusammenfassend gesagt werden:

1. Das große Potential von PG-basierten NG für biologische bzw. medizinische Einsatzgebiete konnte weiter untermauert werden.
2. Das mit Cy5-Alkin markierte PG PG-SH-Cy5 erscheint aufgrund des relativ hohen erreichten Markierungsgrades bei der Herstellung als aussichtsreichster Kandidat für weitere Untersuchungen. Diese Umsetzung besitzt noch Optimierungspotentiale bezüglich einer Verringerung des Polymerverlusts bei der Aufarbeitung, des erreichbaren Markierungsgrades und der Markierungsausbeute. Möglichkeiten, dies zu erreichen, wurden diskutiert.
3. Klare Aussagen über den Einfluss des esterhaltigen bzw. esterfreien Ausgangspolymers PG-SH auf die Konzentration und die Partikelgröße konnten aufgrund einer nicht ausreichenden Datenlage nicht getroffen werden. 
4. Die esterhaltigen PG-SH-Moleküle erscheinen aufgrund ihrer Labilität gegenüber Hydrolyse für die NP-Synthese weniger geeignet (geringere Stabilität).
5. Die Charakterisierung der aus den markierten und unmarkierten Ausgangspolymeren hergestellten NG, welche teilweise zusätzlich mit dem Transportpeptid Tat funktionalisiert wurden, erfolgte mittels NTA und zeigt für die meisten Spezies relativ schmale, gut definierte, monomodale Größenverteilungen mit einem Maximum um 100-200 nm im Bereich von ca. 40 – max.  400 nm mit Partikelkonzentrationen im Bereich von 1010 - 1011 Partikeln/ml. 
6. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass der untersuchte, von PG-SH abgeleitete NP-Typ (z. B. NG_3, redox-sensitiv unmarkiert) aufgrund seiner Einheitlichkeit, Partikelgröße und der Reproduzierbarkeit der Herstellung als gut geeignet für den geplanten Einsatz in biologischen Systemen erscheint. Von den weiter derivatisierten NG erscheinen die folgenden aufgrund der oben geschilderten Kriterien als besonders geeignet für den geplanten Einsatz in biologischen Systemen und weiterer Untersuchungen wert: NG680_(TAT)_1-4 (redox-sensitiv, markiert), NGCy5_(TAT)_1 (redox-sensitiv, markiert), NG_MA_2 (nicht redox-sensitiv, unmarkiert), NGCy7_MA_1 (nicht redox-sensitiv, markiert). Aufgrund des relativ hohen erreichbaren Markierungsgrades bei der Markierung der Ausgangspolymere erscheinen die mit Cy5-markierten Verbindungen als besonders vorteilhaft.
7. Die esterfreien, redox-sensitiven NP erwiesen sich bei 14-tägiger Lagerung unter physiologischen Bedingungen als stabil. Ihre Konzentration nahm über 14 Tage um ca. 60 % vom Ausgangswert ab. Gleichzeitig nahm der Teilchendurchmesser während des Beobachtungszeitraums um ca. 25 % zu. Die Abnahme der Teilchenzahl ist - zumindest teilweise - durch eine Vergrößerung des mittleren Teilchendurchmessers und mögliche Adsorptionseffekte an die Gefäßwände des Versuchsaufbaus zu erklären.
8. Die Konzentration der esterfreien, nicht redox-sensitiven NP verringert sich bei 14-tägiger Inkubation unter physiologischen Bedingungen deutlich auf ca. 10 % des Ausgangswerts. Der mittlere Durchmesser der Partikel bleibt innerhalb des Untersuchungszeitraums innerhalb der Fehlergrenzen konstant. Die starke Abnahme der Partikelkonzentration ist wahrscheinlich auf die Hydrolyse des verwendeten esterhaltigen Crosslinkers PEGDA zurückzuführen. Desweiteren sind Adsorptionsphänomene an Oberflächen des Versuchsaufbaus nicht auszuschließen. Insgesamt hervorzuheben ist die wesentlich höhere Stabiliät der redox-sensitiven NP unter den Versuchsbedingungen. Diese Substanzklasse sollte daher weiter verfolgt werden.
9. Es wurde gezeigt, dass sowohl die NG, die das Aufnahmeprotein Tat enthalten, als auch die NG ohne Tat mit Fluoreszenz-markiertem BSA (8,3 µg/ml) wechselwirken und zusammen mit diesem bei der Zentrifugation abgeschieden werden. Über die Art der Wechselwirkung kann keine Aussage getroffen werden.
10. Durch in vitro Zellaufnahmeuntersuchungen an Hela-Zellen konnte gezeigt werden, dass die mit Tat funktionalisierten, redox-sensitiven, Fluoreszenz-markierten NP von den Zellen aufgenommen werden. Die Aufnahme erfolgt über eine deutlich erkennbare Vesikelbildung, die an der Plasmamembran verstärkt beobachtet werden kann. Im Gegensatz hierzu konnte bei den nicht mit Tat funktionalisierten NP keine vergleichbare in vitro Zellaufnahme beobachtet werden.

Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen insgesamt das große Potential der von Thiol-funktionalisierten PG abgeleiteten NG für die medizinische Forschung und zukünftige Anwendungen in der Diagnostik und Therapie. Es wird eine Reihe von Ansatzpunkten aufgezeigt, auf deren Basis weitere vertiefende Untersuchungen zur Charakterisierung und Optimierung sowie zu zukünftigen nutzbringenden Anwendungen vorgenommen werden sollten.
N2  - Summary:

Fluorescent Poly(glycidol)-based Nanogels - Synthesis, characterization and their interactions in vitro
KW  - Nanoparticles
KW  - Pharmaceutics
KW  - Nanopartikelcharakterisierung
KW  - Nanohydrogel
KW  - Polyglycidol
KW  - Nanoparticle Tracking Analysis
KW  - Fluoreszenzmarkierung
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162645
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hochleitner, Gernot
T1  - Advancing melt electrospinning writing for fabrication of biomimetic structures
T1  - Entwicklung des Melt Electrospinning Writing zur Erzeugung biomimetischer Strukturen
N2  - In order to mimic the extracellular matrix for tissue engineering, recent research approaches often involve 3D printing or electrospinning of fibres to scaffolds as cell carrier material. Within this thesis, a micron fibre printing process, called melt electrospinning writing (MEW), combining both additive manufacturing and electrospinning, has been investigated and improved. Thus, a unique device was developed for accurate process control and manufacturing of high quality constructs. Thereby, different studies could be conducted in order to understand the electrohydrodynamic printing behaviour of different medically relevant thermoplastics as well as to characterise the influence of MEW on the resulting scaffold performance.
For reproducible scaffold printing, a commonly occurring processing instability was investigated and defined as pulsing, or in extreme cases as long beading. Here, processing analysis could be performed with the aim to overcome those instabilities and prevent the resulting manufacturing issues. Two different biocompatible polymers were utilised for this study: poly(ε-caprolactone) (PCL) as the only material available for MEW until then and poly(2-ethyl-2-oxazoline) for the first time. A hypothesis including the dependency of pulsing regarding involved mass flows regulated by the feeding pressure and the electrical field strength could be presented. Further, a guide via fibre diameter quantification was established to assess and accomplish high quality printing of scaffolds for subsequent research tasks.
By following a combined approach including small sized spinnerets, small flow rates and high field strengths, PCL fibres with submicron-sized fibre diameters (fØ = 817 ± 165 nm) were deposited to defined scaffolds. The resulting material characteristics could be investigated regarding molecular orientation and morphological aspects. Thereby, an alignment and isotropic crystallinity was observed that can be attributed to the distinct acceleration of the solidifying jet in the electrical field and by the collector uptake. Resulting submicron fibres formed accurate but mechanically sensitive structures requiring further preparation for a suitable use in cell biology. To overcome this handling issue, a coating procedure, by using hydrophilic and cross-linkable star-shaped molecules for preparing fibre adhesive but cell repellent collector surfaces, was used.
Printing PCL fibre patterns below the critical translation speed (CTS) revealed the opportunity to manufacture sinusoidal shaped fibres analogously to those observed using purely viscous fluids falling on a moving belt. No significant influence of the high voltage field during MEW processing could be observed on the buckling phenomenon. A study on the sinusoidal geometry revealed increasing peak-to-peak values and decreasing wavelengths as a function of decreasing collector speeds sc between CTS > sc ≥ 2/3 CTS independent of feeding pressures. Resulting scaffolds printed at 100 %, 90 %, 80 % and 70 % of CTS exhibited significantly different tensile properties, foremost regarding Young’s moduli (E = 42 ± 7 MPa to 173 ± 22 MPa at 1 – 3 % strain). As known from literature, a changed morphology and mechanical environment can impact cell performance substantially leading to a new opportunity of tailoring TE scaffolds.
Further, poly(L-lactide-co-ε-caprolactone-co-acryloyl carbonate) as well as poly(ε-caprolactone-co-acryloyl carbonate) (PCLAC) copolymers could be used for MEW printing. Those exhibit the opportunity for UV-initiated radical cross-linking in a post-processing step leading to significantly increased mechanical characteristics. Here, single fibres of the polymer composed of 90 mol.% CL and 10 mol.% AC showed a considerable maximum tensile strength of σmax = 53 ± 16 MPa. Furthermore, sinusoidal meanders made of PCLAC yielded a specific tensile stress-strain characteristic mimicking the qualitative behaviour of tendons or ligaments. Cell viability by L929 murine fibroblasts and live/dead staining with human mesenchymal stem cells revealed a promising biomaterial behaviour pointing out MEW printed PCLAC scaffolds as promising choice for medical repair of load-bearing soft tissue.
Indeed, one apparent drawback, the small throughput similar to other AM methods, may still prevent MEW’s industrial application yet. However, ongoing research focusses on enlargement of manufacturing speed with the clear perspective of relevant improvement. Thereby, the utilisation of large spinneret sizes may enable printing of high volume rates, while downsizing the resulting fibre diameter via electrical field and mechanical stretching by the collector uptake. Using this approach, limitations of FDM by small nozzle sizes could be overcome. Thinking visionary, such printing devices could be placed in hospitals for patient-specific printing-on-demand therapies one day. Taking the evolved high deposition precision combined with the unique small fibre diameter sizes into account, technical processing of high performance membranes, filters or functional surface finishes also stands to reason.
N2  - Um biomimetische extrazelluläre Matrices für das Tissue Engineering herzustellen, bedienen sich aktuelle Forschungsansätze oftmals der Produktion von Faser-Konstrukten durch additive Fertigung oder Elektrospinn-Verfahren. Das sogenannte Melt Electrospinning Writing (MEW) kombiniert Vorteile beider Techniken und weist dadurch ein hohes Applikationspotential auf. Daher bestand das Ziel der vorliegenden Arbeit in der Weiterentwicklung und Erforschung des MEW. Für diesen Zweck wurde eine neuartige Forschungsanlage konzipiert und gebaut, welche mit einzigartiger Verfahrenspräzision und Prozesskontrolle die Fertigung von hochqualitativen Konstrukten ermöglichte. Auf Basis dessen konnten die durchgeführten Studien das Verständnis des elektrohydrodynamischen Druckvorgangs und der untersuchten Prozessparameter vertiefen und letztendlich zur Ausweitung des Verfahrens auf neue medizinisch relevante Thermoplaste beitragen.
Um eine reproduzierbare Herstellung von Scaffolds zu ermöglichen, wurde eine häufig auftretende Prozessinstabilität erforscht und als pulsing, oder in stark ausgeprägten Fällen als long beading, klassifiziert. Durch Prozessanalyse konnte zudem eine Methode zur Vermeidung dieser Instabilität entwickelt werden. Dafür wurden zwei unterschiedliche biokompatible Polymere verwendet: Poly(ε-Caprolacton) (PCL) als bis dahin einziger verfügbarer MEW Werkstoff, sowie erstmalig Poly(2-Ethyl-2-Oxazolin). Die aufgestellte Hypothese umfasst eine universelle Abhängigkeit der pulsing Instabilität zu involvierten Massenströmen, welche durch Anpassung des angelegten Prozessdruckes und der elektrischen Feldstärke reguliert werden kann. Um ein optimales Prozessergebnis für nachfolgende Forschungsarbeiten zu erzielen, wurde zusätzlich ein Leitfaden zur quantitativen Bewertung des Grades der Instabilität bereitgestellt.
Durch Kombination kleiner Spinndüsen, kleiner Schmelze-Flussraten und hoher elektrischen Feldstärken, konnten erstmalig PCL Fasern mit sub-mikron Durchmessern (fØ = 817 ± 165 nm) zu präzisen Scaffolds verarbeitet werden. Diese wurden anschließend durch materialwissenschaftliche Analytik charakterisiert. Dabei wurde eine molekulare Vorzugsorientierung und isotrope Kristallausrichtung entlang der Faser beobachtet, welche durch den hohen Verstreckungsgrad des erstarrenden Polymerstrahls erklärt werden konnte. Resultierende sub-mikron Fasern konnten zwar für einen akkuraten Druckvorgang verwendet werden, jedoch erwiesen sich die Strukturen als instabil und daher nicht geeignet für die Handhabung bei Zellkulturstudien. Aus diesem Grund wurde ein Beschichtungsansatz mittels hydrophilen und vernetzbaren Sternmolekülen für Substratflächen herangezogen. Während solche modifizierten Oberflächen bekanntermaßen Zelladhäsion verhindern, konnten gedruckte sub-mikron Scaffolds auf der Oberfläche haften und so für biologische Studien verwendet werden.
Durch das gezielte Ablegen von Fasern unterhalb der kritischen Translationsgeschwindigkeit (CTS) des Kollektors, konnten sinusförmige Faserstrukturen erzeugt werden. Analog zu rein viskosen Fluiden, welche durch ein bewegliches Band aufgesammelt werden, schien dieser Vorgang dem sogenannten buckling zu unterliegen und daher phänomenologisch nicht oder nur geringfügig vom elektrischen Feld abhängig zu sein. Zudem konnte eine durchgeführte Studie die direkte Abhängigkeit der Fasergeometrie mit der Kollektorbewegung belegen. Unabhängig vom Prozessdruck, führte eine verminderte Kollektorgeschwindigkeit sc in den Grenzen CTS > sc ≥ 2/3 CTS zu erhöhten Amplituden bzw. Spitze-zu-Spitze Werten und verkürzten Wellenlängen. Durch das kontrollierte Ablegen der Fasern bei Geschwindigkeiten von 100 %, 90 % 80 % und 70 % CTS konnten zudem Scaffolds mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften hergestellt werden. Speziell der Zugmodul wurde dadurch etwa um eine halbe Größenordnung moduliert (Es = 42 ± 7 MPa bis 173 ± 22 MPa bei 1 – 3 % Dehnung). Dies ist in Kombination mit der Strukturierung für maßgeschneiderte TE Scaffolds von großem Interesse, da zelluläre Systeme sensibel auf ihre Umgebung reagieren können. 
Des Weiteren wurden Poly(L-Lactid-co-ε-Caprolacton-co-Acryloylcarbonat) und Poly(ε-Caprolacton-co-Acryloylcarbonat) (PCLAC) Copolymere hinsichtlich deren MEW Verarbeitbarkeit untersucht. Solche Kunststoffe können nach dem Druckvorgang mit UV-Strahlung radikalisch vernetzt werden und dadurch deutlich erhöhte mechanische Eigenschaften ausbilden. Für Fasern aus 90 mol.% CL und 10 mol.% AC wurden beispielsweise maximale Zugfestigkeiten von σmax = 53 ± 16 MPa ermittelt. MEW gedruckte sinusförmige Faserstrukturen aus PCLAC wiesen darüber hinaus ein biomimetisches Spannungs-Dehnung-Verhalten auf, vergleichbar zu Sehnen- und Ligamentgewebe. Eine Untersuchung der Zellviabilität von L929 murinen Fibroblasten im Eluattest, sowie eine lebend/tot-Färbung von humanen mesenchymalen Stammzellen auf den Scaffolds, ergab vielversprechende Resultate und damit ein relevantes Anwendungspotential solcher Strukturen als Implantat.
Neben genannten Vorteilen, weist MEW als Verfahren bislang allerdings geringe Produktionsgeschwindigkeiten auf. Diese sind daher in den Fokus aktueller Forschungsvorhaben gerückt. Einen Ansatz hierfür bieten Spinndüsen mit hohem Innendurchmesser und erhöhter Austragsrate, wobei die optimierte elektrische Feldstärke, sowie ein Verstrecken durch die Kollektorbewegung, zu den erwünschten dünnen Fasern führen können. Dadurch kann die abwärtslimitierte Düsengröße des FDM Verfahrens überwunden werden. Visionär gedacht, könnte eine solche Anlage direkt in Krankenhäusern zur Fertigung von patienten- und defektspezifischen Implantaten eingesetzt werden. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Präzision, zusammen mit dem Drucken von Mikro-Fasern, einen technischen Einsatz zur Herstellung von Membranen, Filtern oder funktionalen Oberflächenbeschichtungen.
KW  - scaffold
KW  - polymer
KW  - 3D printing
KW  - additive manufacturing
KW  - melt electrospinning
KW  - melt electrowriting
KW  - tissue engineering
KW  - polymer processing
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162197
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmitz, Tobias
T1  - Functional coatings by physical vapor deposition (PVD) for biomedical applications
T1  - Funktionelle Schichten hergestellt durch physikalische Gasphasenabescheidung für biomedizinische Anwendungen
N2  - Metals are the most used materials for implant devices, especially in orthopedics, but despite their long history of application issues such as material failure through wear and corrosion remain unsolved leading to a certain number of revision surgeries. Apart from the problems associated with insufficient material properties, another serious issue is an implant associated infection due to the formation of a biofilm on the surface of the material after implantation. Thus, improvements in implant technology are demanded, especially since there is a projected rise of implants needed in the future. Surface modification methods such as physical vapour deposition (PVD), oxygen diffusion hardening and electrochemical anodization have shown to be efficient methods to improve the surfaces of metallic bulk materials regarding biomedical issues. This thesis was focused on the development of functional PVD coatings that are suitable for further treatment with surface modification techniques originally developed for bulk metals. The aim was to precisely adjust the surface properties of the implant according to the targeted application to prevent possible failure mechanisms such as coating delamination, wear or the occurrence of post-operative infections.

Initially,  tantalum layers with approx 5 µm thickness were deposited at elevated substrate temperatures on cp Ti by RF magnetron sputtering. Due to the high affinity of tantalum to oxygen, these coatings are known to provide a self healing capacity since the rapid oxide formation is known to close surface cracks. Here, the work aimed to reduce the abrupt change of mechanical properties between the hard and brittle coating and the ductile substrate by creating an oxygen diffusion zone.  It was found that the hardness and adhesion could be significantly increased when the coatings were treated afterwards by oxygen diffusion hardening in a two step process. Firstly, the surface was oxidized at a pressure of 6.7•10-3 mbar at 350   450 °C, followed by 1-2 h annealing in oxygen-free atmosphere at the same temperature leading to a diffusion of oxygen atoms into deeper parts of the substrate as proved by X-ray diffraction (XRD) analysis. The hereby caused mechanical stress in the crystal lattice led to an increase in Vickers hardness of the Ta layers from 570 HV to over 900 HV. Investigations into the adhesion of oxygen diffusion treated samples by Rockwell measurements demonstrated an increase of critical force for coating delamination from 12 N for untreated samples up to 25 N for diffusion treated samples.

In a second approach, the development of modular targets aimed to produce functional coatings by metallic doping of titanium with biologically active agents. This was demonstrated by the fabrication of antimicrobial Ti(Ag) coatings using a single magnetron sputtering source equipped with a titanium target containing implemented silver modules under variation of bias voltage and substrate temperature. The deposition of both Ti and Ag was confirmed by X-ray diffraction and a clear correlation between the applied sputtering parameters and the silver content of the coatings was demonstrated by ICP-MS and EDX. Surface-sensitive XPS measurements revealed that higher substrate temperatures led to an accumulation of Ag in the near-surface region, while the application of a bias voltage had the opposite effect. SEM and AFM microscopy revealed that substrate heating during film deposition supported the formation of even and dense surface layers with small roughness values, which could even be enforced by applying a substrate bias voltage. Additional elution measurements using ICP-MS showed that the release kinetics depended on the amount of silver located at the film surface and hence could be tailored by variation of the sputter parameters.

In a final step, the applied Ti and Ti(Ag) coatings deposited on cp Ti, stainless steel (316L) and glass substrates were subsequently nanostructured using a self-ordering process induced by electrochemical anodization in aqueous fluoride containing electrolytes. SEM analysis showed that nanotube arrays could be grown from the Ti and Ti(Ag) coatings deposited at elevated temperatures on any substrate, whereby no influence of the substrate on nanotube morphology could be observed. EDX measurements indicated that the anodization process led to the selective etching of Ti from Ti(Ag) coating. Further experiments on coatings deposited on glass surfaces revealed that moderate substrate temperatures during deposition resulting in smooth Ti layers as determined by AFM measurements, are favorable for the generation of highly ordered nanotube arrays. Such arrays exhibited superhydrophilic behavior as proved by contact angle measurements. XRD analysis revealed that the nanostructured coatings were amorphous after anodization but could be crystallized to anatase structure by thermal treatment at temperatures of 450°C.
N2  - Metalle sind die am häufigsten verwendeten Werkstoffe für orthopädische Skelettimplantate, wobei trotz der langjährigen Anwendungserfahrung immer noch Probleme wie Verschleiß und Korrosion zum Materialversagen führen können und damit eine Revisionsoperation notwendig machen. Abgesehen von solchen materialbedingten Problemen, sind implantatassoziierte Infektionen aufgrund der Bildung eines Biofilms auf der Werkstoffoberfläche nach der Implantation ebenfalls klinisch von hoher Relevanz. Somit sind Verbesserungen in der Implantattechnologie notwendig, zumal ein Anstieg der Anzahl von eingebrachten Implantaten in der Zukunft prognostiziert wird. Oberflächenmodifizierungsverfahren, wie die physikalische Dampfphasenabscheidung (PVD), Sauerstoffdiffusionshärtung und elektrochemische Anodisierung sind dabei effiziente Methoden, um die Oberflächeneigenschaften von metallischen Werkstoffen für biomedizinische Anwendungen einzustellen. Diese Arbeit ist dabei auf die Entwicklung funktioneller PVD-Beschichtungen gerichtet, wobei deren weiterführende Modifikation mit ursprünglich für Volumenwerkstoffe entwickelten Verfahren erfolgt. Ziel war es, hierdurch die Eigenschaften der Implantatoberflächen noch anwendungsgezielter einzustellen, um möglichen Versagensmechanismen wie Schichtdelamination, Verschleiß oder das Auftreten einer post-operativen Infektion vorbeugen zu können. 

Zunächst wurden -Tantalschichten mit ca. 5 µm Dicke bei erhöhten Substrattemperaturen auf cp-Titan durch RF-Magnetron-Sputtern abgeschieden. Aufgrund der hohen Affinität von Tantal zu Sauerstoff ist für diese Beschichtungen ein Selbstheilungsmechanismus bekannt, da die schnelle Oxidbildung Oberflächenrisse schließt. Hier hatte die Arbeit es zum Ziel, die abrupte Änderung der mechanischen Eigenschaften zwischen der harten und spröden Beschichtung und dem duktilen Substrat durch die Erzeugung einer Sauerstoffdiffusionszone zu reduzieren. Es wurde gezeigt, dass die Härte und Adhäsion der Schichten durch ein zweistufiges Sauerstoffdiffusionshärten deutlich erhöht werden konnte. Hierzu wurde zunächst die Oberfläche bei einem Druck von 6,7*10-3 mbar bei 350-450 °C oxidiert. Ein nachfolgendes Anlassen in sauerstofffreier Atmosphäre bei gleicher Temperatur für 1-2 h führte dann zu einer Diffusion von Sauerstoffatomen in tiefere Bereiche des metallischen Substrats wie durch Röntgenbeugung (XRD) gezeigt werden konnte. Die hierdurch verursachte mechanische Spannung im Kristallgitter führte zu einem Anstieg der Vickers-Härte der Tantal-Schichten von 570 HV auf 900 HV. Untersuchungen zur Haftung der Sauerstoffdiffusions-behandelten Proben anhand von Rockwell Messungen zeigten einen Anstieg der zur Delamination der Beschichtung notwendigen kritischen Kraft von 12 N für unbehandelte Proben auf bis zu 25 N für die diffusionsgeglühten Proben.

Ein zweiter Ansatz war auf die Entwicklung modularer Targets zur Erzeugung funktioneller Titanbeschichtungen mit Dotierungen aus biologisch aktiven Metallionen gerichtet. Dies wurde durch die Herstellung von antimikrobiellen Ti(Ag) Beschichtungen über eine einzelne Titan-Magnetronsputterquelle mit implementierten Silbermodulen unter Variation der Vorspannung und Substrattemperatur erreicht. Die Abscheidung von sowohl Ti und Ag wurde durch Röntgenbeugung gezeigt und es konnte eine valide Korrelation zwischen den angewandten Sputter-Parametern und dem Silbergehalt der Beschichtungen durch ICP-MS und EDX-Messungen bestätigt werden. Oberflächenempfindliche XPS-Messungen zeigten, dass höhere Substrattemperaturen zu einer Anreicherung von Ag im oberflächennahen Bereich, während das Anlegen einer Vorspannung den gegenteiligen Effekt hatte. REM und AFM-mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Aufheizung des Substrats während der Schichtabscheidung die Bildung glatter und dichter Schichten mit geringer Rauhtiefe unterstützt, was durch Anlegen einer Vorspannung nochmals verstärkt werden konnte. Zusätzliche Freisetzungsstudien durch ICP-MS ergaben, dass die Freisetzungskinetik abhängig war von der Menge an Silber im oberflächennahen Bereich und somit über die Variation der Beschichtungsparameter eingestellt werden kann. 

In einem letzten Schritt wurden auf cp Ti, Edelstahl (316L) und Glassubstrate abgeschiedene Ti und Ti(Ag) Beschichtungen durch eine nachgeschaltete, elektrochemische Anodisierung in einem wässrigen fluoridhaltigen Elektrolyten nanostrukturiert. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass hierdurch nanotubuläre Arrays aus den Beschichtungen bei erhöhter Temperatur unabhängig von der Art des Substrats erhalten werden konnten, wobei kein Einfluss des Substrattyps auf die Morphologie der Nanostrukturen beobachtet werden konnte. 
EDX-Messungen zeigten, dass die Anodisierung zu einer selektiven Ätzung von Titan in Ti(Ag) Beschichtung führte. Weitere Versuche an Schichtsystemen auf Glasoberflächen ergaben, dass glatte Ti-Schichten durch moderate Substrattemperaturen während der Abscheidung entstanden, und diese sich vorteilhaft auf die Erzeugung hochgeordneter nanotubulärer Arrays auswirkte. Derartige Arrays zeigten in Kontaktwinkelmessungen ein superhydrophiles Verhalten. Röntgendiffraktometrische Analysen ergaben eine initial nach der Anodisierung amorphe Struktur der nanostrukturierten Beschichtungen, wobei durch eine thermische Behandlung bei Temperaturen von 450 °C die Bildung einer Anatas-Struktur beobachtet wurde.
KW  - PVD-Verfahren
KW  - Tantal
KW  - Nanoröhre
KW  - PVD coatings
KW  - Oxygen diffusion hardening
KW  - Ti(Ag) coatings
KW  - Nanotubular coatings
KW  - PVD Beschichtung
KW  - Sauerstoffdiffusionshärtung
KW  - Ti(Ag) Beschichtungen
KW  - Nanotubuläre Beschichtungen
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144825
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gerken, Valentin
T1  - Vergleichende Untersuchung zum Verhalten von autogenen Ossikeln, Ionomerzement- sowie Titanimplantaten im menschlichen Mittelohr (eine 15-Jahres-Bilanz)
T1  - Long-term results of type III tympanoplasty with autogenous incus transplantation, Titanium and Ionomercement ossicular replacement prosthesis
N2  - Ziel der Arbeit ist es, verschiedene Knochenersatzmaterialien der Tympanoplastik Typ 3
(autogenes Gewebe, Titan, Ionomerzement) bezüglich ihres Langzeitverhaltens im Mittelohr zu vergleichen. Es werden zwischen dem 21.12.1995 und dem 30.04.2011 in der Hals-Nasen-Ohrenklinik des Städtischen Klinikums Solingen operierte Patienten nachuntersucht. Insgesamt handelt es sich um 957 mit einer Tympanoplastik Typ III versorgte Patienten, die in diesem Zeitraum insgesamt 1093mal operiert worden sind. 676mal ist die Kette mit einer Titanprothese rekonstruiert worden, davon 301mal mit einer PORP und 375mal mit einer TORP (davon 21 bei intakter Stapessuprastruktur). Zu Beginn des Beobachtungszeitraums sind 56 Ionomerzement-prothesen eingesetzt worden, so dass 40 Ionomerzement-PORP und 16 Ionomerzement-TORP mit berücksichtigt worden sind. In 19 Fällen sind „sonstige“ Methoden (z.B. Knorpelüberhöhung des Steigbügels) zur Gehörknöchelchenkettenrekonstruktion gewählt worden. 
Die Untersuchung zeigt, dass zur Kettenrekonstruktion eine Transposition autogener Ossikel angestrebt werden sollte. Stehen diese nicht zur Verfügung, empfiehlt sich die Verwendung von Titan-Prothesen. Aufgrund ihres hervorragenden In-Situ-Verhaltens sowie der nachgewiesen guten audiologischen Resultate sind sie derzeit das Mittel der Wahl.
N2  - Retrospective clinical study of patients undergoing type III tympanoplasty between December 1995 and April 2011. A computerized otologic database was used to obtain the necessary data. The indications for tympanoplasty are mainly chronic ear pathologies, such as cholesteatoma, atelectasis and chronic mesotympanic otitis media. A total of 1093 type III tympanoplasty procedures were included in the present study. Hearing results were reported using a four-frequency (500, 1000, 2000, 4000 Hz) pure-tone average air-bone gap (PTA-ABG). Beside the PTA-ABG the in-situ-performance was researched. Summarizing the transplantation of autogenous incus achieves the best audiologic result. Is the medical application of the autogenous incus not possible, Titanium ossicular replacement prosthesis should be used.
KW  - Mittelohrplastik
KW  - Tympanoplastik Typ 3
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141480
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kwok, Chee Keong
T1  - Scaling up production of reprogrammed cells for biomedical applications
T1  - Skalierung der Produktion von reprogrammierten Zellen für biomedizinische Anwendungen
N2  - Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been recognised as a virtually unlimited source of stem cells that can be generated in a patient-specific manner. Due to these cells’ potential to give rise to all differentiated cell types of the human body, they have been widely used to derive differentiated cells for drug screening and disease modelling purposes. iPSCs also garner much interest as they can potentially serve as a source for cell replacement therapy. Towards the realisation of these biomedical applications, this thesis aims to address challenges that are associated with scale-up, safety and biofabrication.

Firstly, the manufacture of a high number of human iPSCs (hiPSCs) will require standardised procedures for scale-up and the development of a flexible bioprocessing method, since standard adherent hiPSC culture exhibits limited scalability and is labour-intensive. While the quantity of cells that are required for cell therapy depends largely on the tissue and defect that these replacing cells are meant to correct, an estimate of 1 × 10^9 has been suggested to be sufficient for several indications, including myocardial infarction and islet replacement for diabetes. Here, the development of an integrated, microcarrier-free workflow to transition standard adherent hiPSC culture (6-well plates) to scalable stirred suspension culture in bioreactors (1 L working volume, 2.4 L maximum working volume) is presented. The two-phase bioprocess lasts 14 days and generates hiPSC aggregates measuring 198 ± 58 μm in diameter on the harvesting day, yielding close to 2 × 10^9 cells. hiPSCs can be maintained in stirred suspension for at least 7 weeks with weekly passaging, while exhibiting pluripotency-associated markers TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4, OCT4, and SOX2. These cells retain their ability to differentiate into cells of all the three germ layers in vitro, exemplified by cells positive for AFP, SMA, or TUBB3. Additionally, they maintain a stable karyotype and continue to respond to specification cues, demonstrated by directed differentiation into beating cardiomyocyte-like cells. Therefore, the aim of manufacturing high hiPSC quantities was met using a state-of-the-art scalable suspension bioreactor platform.

Secondly, multipotent stem cells such as induced neural stem cells (iNSCs) may represent a safer source of renewable cells compared to pluripotent stem cells. However, pre-conditioning of stem cells prior to transplantation is a delicate issue to ensure not only proper function in the host but also safety. Here, iNSCs which are normally maintained in the presence of factors such as hLIF, CHIR99021, and SB431542 were cultured in basal medium for distinct periods of time. This wash-out procedure results in lower proliferation while maintaining key neural stem cell marker PAX6, suggesting a transient pre-differentiated state. Such pre-treatment may aid transplantation studies to suppress tumourigenesis through transplanted cells, an approach that is being evaluated using a mouse model of experimental focal demyelination and autoimmune encephalomyelitis. 

Thirdly, biomedical applications of stem cells can benefit from recent advancements in biofabrication, where cells can be arranged in customisable topographical layouts. Employing a 3DDiscovery bioprinter, a bioink consisting of hiPSCs in gelatin-alginate was extruded into disc-shaped moulds or printed in a cross-hatch infill pattern and cross-linked with calcium ions. In both discs and printed patterns, hiPSCs recovered from these bioprints showed viability of around 70% even after 4 days of culture when loaded into gelatin-alginate solution in aggregate form. They maintained pluripotency-associated markers TRA-1-60 and SSEA-4 and continued to proliferate after re-plating. As further proof-of-principle, printed hiPSC 3D constructs were subjected to targeted neuronal differentiation, developing typical neurite outgrowth and resulting in a widespread network of cells throughout and within the topology of the printed matrix. Staining against TUBB3 confirmed neuronal identity of the differentiated cellular progeny. In conclusion, these data demonstrate that hiPSCs not only survive the 3D-printing process but were able to differentiate along the printed topology in cellular networks.
N2  - Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSZ) stellen eine praktisch unbegrenzte Stammzellquelle dar, welche patientenspezifisch erzeugt werden kann. Da diese Zellen das Potenzial haben, alle differenzierten Zelltypen des menschlichen Körpers hervorzubringen, werden sie für die Herstellung differenzierter Zellen für Arzneimitteltests und für die Krankheitsmodellierung verwendet. Sie erfahren auch großes Interesse, weil sie als Zellquelle in der Zellersatztherapie Anwendung finden könnten. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit drei zentralen Herausforderungen, die im Rahmen der biomedizinischen Anwendung von iPSZ auftreten.

Die Herstellung einer großen Zahl von humanen iPSZ (hiPSZ) erfordert die Entwicklung standardisierter Verfahren für die Skalierung, welche durch die Entwicklung einer flexiblen Bioprozessmethode realisiert werden kann. Bisher wird die Skalierbarkeit durch eine standardmäßig adhärente Zellkultur und den damit verbundenen hohen Arbeitsaufwand begrenzt. Die Menge an Zellen, die für die Zelltherapie benötigt wird, hängt stark vom Gewebetyp ab, welcher von den ersetzenden Zellen korrigiert werden soll. Berechnungen legen nahe, dass eine Anzahl 1 × 10^9 Zellen für eine Vielzahl von Indikationen ausreicht – einschließlich Myokardinfarkt und Inselzelltransplantation für Diabetes. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein integrierter Arbeitsablauf zur skalierbaren Zellsuspensionskultur von hiPSZ ohne Verwendung von microcarrier entwickelt, um die standardmäßig adhärente Kultur (6-Well-Platten) in Bioreaktoren (1 L Arbeitsvolumen, 2,4 L maximales Arbeitsvolumen) zu überführen. Der zweiphasige Produktionsprozess dauert 14 Tage und erzeugt hiPSZ-Aggregate mit einem finalen Durchmesser von 198 ± 58 μm, der annähernd 2 × 10^9 Zellen beinhaltet. hiPSZ können mindestens 7 Wochen lang in einer gerührten Zellsuspension bei wöchentlichem Passagieren gehalten werden, wobei sie Pluripotenz-assoziierte Marker wie TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4, OCT4 und SOX2 beibehalten. Die Zellen behalten weiterhin ihre Fähigkeit, sich in vitro in Zellen mit AFP-, SMA- oder TUBB3-Immunoreaktivität und damit in Zellen aller drei Keimblätter zu differenzieren. Darüber hinaus halten sie einen stabilen Karyotyp aufrecht und reagieren auf gezielt eingesetzte externe Differenzierungsstimuli, wie durch eine gezielte Differenzierung in schlagende Kardiomyozyten-ähnliche Zellen demonstriert werden konnte. Somit wurde das Ziel, eine großen Anzahl hiPSCs herzustellen, mit einer hochmodernen, skalierbaren Suspensionsbioreaktorplattform erreicht.

Multipotente Stammzellen wie induzierte neurale Stammzellen (iNSZ) gelten verglichen mit iPSZ als sicherere Zellquelle für Ersatztherapien. Die Vorkonditionierung von Stammzellen vor der Transplantation ist jedoch ein heikles Thema, da sowohl die einwandfreie Funktion im Wirtsgewebe als auch Sicherheit gewährleistet werden müssen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden iNSZ, die normalerweise im Kulturmedium mit Faktoren wie hLIF, CHIR99021 und SB431542 gehalten werden, für eine definierte Zeitspanne in basalem Medium kultiviert. Die Vorbehandlung führt zu einer geringeren Proliferation, jedoch unter Erhalt der Expression des wichtigen neuralen Stammzellmarkers PAX6, was auf einen transienten vordifferenzierten Zustand hindeutet. Eine solche Vorbehandlung könnte bei zukünftigen Transplantationsstudien angewandt werden, um die Tumorentstehung durch transplantierte Zellen zu unterdrücken.  Dieser Ansatz wird in Zukunft mit einem Mausmodell der experimentellen fokalen Demyelinisierung und der autoimmunen Enzephalomyelitis untersucht. 

Schließlich kann die Zellersatztherapie von den jüngsten Fortschritten in der Biofabrikation profitieren, bei der die Zellen durch das Drucken in anpassbare topographische Profile angeordnet werden können. Mit einem 3DDiscovery Biodrucker wurde eine Biotinte bestehend aus Gelatine-Alginat und hiPSZ in scheibenförmig extrudiert oder in einem Kreuzschraffurmuster gedruckt und mittels Kalziumionen-Zugabe vernetzt. Gedruckte hiPSZ zeigten auch nach 4 Tagen Kultivierung eine Lebensfähigkeit von etwa 70 % und weiterhin das Auftreten der Pluripotenz-assoziierten Marker TRA-1-60 und SSEA-4. Zudem konnten sie sich anschließend mit standardmäßig adhärenter Zellkultur weiter vermehren. Zudem konnte gezeigt werden, dass die gedruckten Konstrukte einer gezielten neuronalen Differenzierung unterzogen werden können, die zu einem typischen Neuritenauswuchs und zu einer weitreichenden interzellulären Vernetzung durch und innerhalb der Topologie der gedruckten Matrix führte. Die Färbung gegen TUBB3 bestätigte die neuronale Identität der differenzierten Zellen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass bei Verwendung des in dieser Studie erarbeiteten Protokolls hiPSZ nicht nur den 3D-Druckprozess überleben, sondern auch entlang der gedruckten 3D Topologie in Netzwerke Neurone differenzieren können.
KW  - scale-up
KW  - suspension culture
KW  - biomedical applications
KW  - bioprocessing
KW  - human induced pluripotent stem cells
KW  - Bioprozessmethode
KW  - humanen induzierte pluripotente Stammzellen
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191865
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wiesbeck, Christina
T1  - Fabrication and characterization of NCO-sP(EO-stat-PO)- crosslinked and functionalized electrospun gelatin scaffolds for tissue engineering applications
T1  - Herstellung und Charakterisierung von elektrogesponnenen Nanofasern aus Gelatine und NCO-sP(EO-stat-PO) für Tissue Engineering Anwendungen
N2  - In Tissue Engineering, scaffolds composed of natural polymers often show a distinct lack in stability. The natural polymer gelatin is highly fragile under physiological conditions, nevertheless displaying a broad variety of favorable properties. The aim of this study was to fabricate electrospun gelatin nanofibers, in situ functionalized and stabilized during the spinning process with highly reactive star polymer NCO-sP(EO-stat-PO) (“sPEG”). A spinning protocol for homogenous, non-beaded, 500 to 1000 nm thick nanofibers from different ratios of gelatin and sPEG was successfully established. Fibers were subsequently characterized and tested with SEM imaging, tensile tests, water incubation, FTIR, EDX, and cell culture. It was shown that adding sPEG during the spinning process leads to an increase in visible fiber crosslinking, mechanical stability, and stability in water. The nanofibers were further shown to be biocompatible in cell culture with RAW 264.7 macrophages.
N2  - Tissue Engineering Scaffolds aus natürlichen Polymeren zeigen häufig mangelnde Stabilität, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Das natürliche Polymer Gelatine besitzt einige sehr vorteilhafte Eigenschaften für die Anwendung bei der Produktion künstlicher Körpergewebe. Beim Einsatz im menschlichen Organismus ist die Gelatine durch ihre Wasserlöslichkeit höchst fragil. Das Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von Nanofaser-Scaffolds aus Gelatine mittels Elektrospinning und deren in situ Stabilisierung durch das Sternpolymer NCO-sP(EO-stat-PO) („sPEG“). Zunächst wurde ein Spinningprotokoll zur Fabrikation homogener, glatter, 500 bis 1000 nm dicker Nanofasern in verschiedenen Verhältnissen von Gelatine und sPEG erarbeitet. Mittels REM Bildgebung, Zugversuchen, Wasserinkubationsversuchen, FTIR, EDX und Zellkultur wurden die Fasern untersucht und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von sPEG während des Spinningprozesses zu einer sichtbaren Quervernetzung der Fasern, sowie zu einem Anstieg der mechanischen Festigkeit und der Wasserstabilität führt. Des Weiteren wurde die Biokompatibilität der Nanofasern in der Zellkultur mit RAW 264.7 Makrophagen belegt.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Electrospinning
KW  - Gelatine
KW  - Polyethylenglykole
KW  - NCO-sP(EO-stat-PO)
KW  - sPEG
KW  - starPEG
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190988
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wistlich, Laura
T1  - NCO-sP(EO-stat-PO) as functional additive for biomaterials’ development
T1  - NCO-sP(EO-stat-PO) als funktionale Additive für die Entwicklung von Biomaterialien
N2  - The aim of this thesis was the application of the functional prepolymer NCO-sP(EO-stat-PO) for the development of new biomaterials. First, the influence of the star-shaped polymers on the mechanical properties of biocements and bone adhesives was investigated. 3-armed star-shaped macromers were used as an additive for a mineral bone cement, and the influence on the mechanical properties was studied. Additionally, a previously developed bone adhesive was examined regarding cytocompatibility. The second topic was the examination of novel functionalization steps which were performed on the surface of electrospun fibers modified with NCO-sP(EO-stat-PO). This established method of functionalizing electrospun meshes was advanced regarding the modification with proteins which was then demonstrated in a biological application. Two different kinds of antibodies were immobilized on the fiber surface in a consecutive manner and the influence of these proteins on the cell behavior was investigated. The final topic involved the quantification of surface-bound peptide sequences. By functionalization of the peptides with the UV-reactive molecule 2-mercaptopyridine it was possible to quantify this compound via UV measurements by cleavage of disulfide bridges and indirectly draw conclusions about the number of immobilized peptides.
In the field of mineral biocements and bone adhesives, NCO-sP(EO-stat-PO) was able to influence the setting behavior and mechanical performance of mineral bone cements based on calcium phosphate chemistry. The addition of NCO-sP(EO-stat-PO) resulted in a pseudo-ductile fracture behavior due to the formation of a hydrogel network in the cement, which was then mineralized by nanosized hydroxyapatite crystals following cement setting. Accordingly, a commercially available aluminum silicate cement from civil engineering could be modified.
In addition, it could be shown that the use of NCO-sP(EO-stat-PO) is beneficial for adjusting specific material properties of bone adhesives. Here, the crosslinking behavior of the prepolymer in an aqueous medium was exploited to form an interpenetrating network (IPN) together with a photochemically curing poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDMA) matrix. This could be used for the development of a bone adhesive with an improved adhesion to bone in a wet environment. The developed bone adhesive was further investigated in terms of possible influences of the initiator systems. In addition, the material system was tested for cytocompatibility by using different cell lines.
Moreover, the preparation of electrospun fiber meshes via solution electrospinning consisting of poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) as a backbone polymer and NCO-sP(EO-stat-PO) as functional additive is an established method for the application of the meshes as a replacement of the native extracellular matrix (ECM). In general, these fibers reveal diameters in the nanometer range, are protein and cell repellent due to the hydrophilic properties of the prepolymer and show a specific biofunctionalization by immobilization of peptide sequences. Here, the isocyanate groups presented on the fiber surface after electrospinning were used to carry out various functionalization steps, while retaining the properties of protein and cell repellency. The modification of the electrospun fibers involved the immobilization of analogs or antagonists of tumor necrosis factor (TNF) and the indirect detection of these by interaction with a light-producing enzyme. Here, a multimodal modification of the fiber surface with RGD to mediate cell adhesion and two different antibodies could be achieved. After culturing the cell line HT1080, the pro- or anti-inflammatory response of cells could be detected by IL-8 specific ELISA measurements.
Furthermore, the quantification of molecules on the surface of electrospun fibers was investigated. It was tested whether the detection by means of super-resolution microscopy would be possible. Therefore, experiments were performed with short amino acid sequences such as RGD for quantification by fluorescence microscopy. Based on earlier results, in which a UV-spectrometrically active molecule was used to detect the quantification of RGD, it was shown that short peptides can also be quantified in a small scale on flat functional substrates (2D) such as NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogel coatings, and modified electrospun fibers produced from PLGA and NCO-sP(EO-stat-PO) (3D). In addition, a collagen sequence was used to prove that a successful quantification can be carried out as well for longer peptide chains.
These studies have revealed that NCO-sP(EO-stat-PO) can serve as a functional additive for many applications and should be considered for further studies on the development of novel biomaterials. The rapid crosslinking reaction, the resulting hydrogel formation and the biocompatibility are to be mentioned as positive properties, which makes the prepolymer interesting for future applications.
N2  - Ziel der Arbeit war die Anwendung der funktionalen Präpolymere NCO-sP(EO-stat-PO) für die Entwicklung von neuen Biomaterialien. Als erstes wurde untersucht, welchen Einfluss die sternförmigen Polymere auf die mechanischen Eigenschaften von Biozementen und Knochenadhäsiven haben. Beispielsweise wurden 3-armige Macromere als Additive für einen mineralischen Knochenzement verwendet und dessen mechanische Eigenschaften untersucht. Außerdem wurde ein kürzlich entwickelter NCO-sP(EO-stat-PO) haltiger Knochenklebers auf Zytokompatibilität getestet. Ein zweites Kapitel beinhaltete die Modifikation von elektrogesponnenen Polymerfasern mit NCO-sP(EO-stat-PO) basierend auf einer etablierten Methode. Es wurde untersucht, welche weiteren Funktionalisierungen auf solchen Oberflächen vorgenommen werden können. Diese Modifizierungsschritte wurden in einer biologischen Anwendung demonstriert, indem verschiedene Antikörper aufeinanderfolgend auf der Faseroberfläche gebunden wurden. Der Einfluss dieser Proteine auf das Verhalten von Zellen auf diesen Oberflächen wurde untersucht. Als letztes wurde die Quantifizierung von oberflächengebundenen Peptidsequenzen demonstriert. Mittels Funktionalisierung der Peptide mit dem UV-reaktiven Molekül 2-Mercaptopyridin konnte durch Spaltung von Disulfidbrücken diese Verbindung UV-metrisch quantifiziert und indirekt Rückschlüsse auf die Anzahl der immobilisierten Peptide gezogen werden.
Durch den Zusatz von NCO-sP(EO-stat-PO) konnten das Abbindeverhalten und die mechanischen Eigenschaften von mineralischen Calciumphosphat-Knochenzementen moduliert werden. Der Zusatz von 3-armigem, sternförmigem NCO-sP(EO-stat-PO) führte dabei zu einem pseudoduktilen Bruchverhalten durch Bildung eines Hydrogelnetzwerks im Zement, das anschließend durch die Zementreaktion mit nanoskaligem Hydroxylapatit mineralisiert wurde.
Im Bereich mineralischer Knochenzemente und Adhäsive konnte gezeigt werden, dass NCO-sP(EO-stat-PO) zur Einstellung der Eigenschaften verwendet werden kann. Hierbei wurde dessen Quervernetzungsverhalten im wässrigen Medium ausgenutzt, um mit einer photochemisch härtenden Polyethylenglykoldimethakrylat (PEGDMA) Matrix interpenetrierende Netzwerke (IPNs) zu bilden. Diese konnten für die Entwicklung eines Knochenklebers mit verbesserter Haftung auf Knochen im feuchten Milieu genutzt werden. Das kürzlich entwickelte Knochenadhäsiv wurde im Hinblick auf den Einfluss des Initiatorsystems untersucht. Außerdem wurde die Zytokompatibilität des Materials anhand verschiedener Zelltypen getestet.
Die Herstellung von elektrogesponnenen Faservliesen mittels Solution Electrospinning aus Polylactid-co-Glycolid (PLGA) als Gerüst-bildendem Polymer und NCO-sP(EO-stat-PO) als funktionalem Additiv ist eine etablierte Methode, um diese Vliese zur Nachbildung nativer Extrazellulär-Matrix anzuwenden. Die Fasern weisen einen Durchmesser im Nanometer-Bereich auf, sind proteinabweisend durch die hydrophilen Eigenschaften des Präpolymers und können durch Immobilisierung von Peptidsequenzen spezifisch biofunktionalisiert werden. Hierbei wurden die Isocyanate auf der Faseroberfläche genutzt, um verschiedenste Funktionalisierungsschritte unter Beibehaltung der protein- und zellabweisenden Eigenschaften auszuführen. Die Modifizierung der elektrogesponnenen Fasern beinhaltete die Immobilisierung von Analoga oder Antagonisten des Tumornekrosefaktors (TNF) sowie den indirekten Nachweis über eine Lichtreaktion. Hierbei konnte eine multimodale Modifizierung der Faseroberfläche mit RGD-Sequenzen zur Vermittlung der Zelladhäsion und zwei verschiedenen Antikörpern erreicht werden. Nach Kultivierung der Zelllinie HT1080 konnte die pro- oder antiinflammatorische Antwort der Zellen mittels IL-8 spezifischem ELISA nachgewiesen werden.
Eine weitere Fragestellung war der Quantifizierung von Molekülen auf der Oberfläche von elektrogesponnen Fasern gewidmet. Es wurde getestet, ob ein Nachweis mittels hochauflösender Mikroskopie möglich ist. Hierzu wurden RGD-Sequenzen zur fluoreszenzmikroskopischen Quantifizierung verwendet. Basierend auf früheren Ergebnissen, bei denen für die Quantifizierung von RGD ein UV-aktives Molekül genutzt wurde, konnte gezeigt werden, dass sich kurze Peptide auch im kleinen Maßstab auf flachen Substraten (2D) wie Hydrogel-Beschichtungen aus NCO-sP(EO-stat-PO) als auch auf elektrogesponnenen Fasern aus PLGA und NCO-sP(EO-stat-PO) (3D) quantifizieren lassen. Außerdem wurde eine Kollagen-Sequenz als längere Peptidkette herangezogen, um auch hier eine erfolgreiche Quantifizierung zu beweisen.
Es konnte gezeigt werden, dass NCO-sP(EO-stat-PO) als funktionales Additiv für viele Anwendungen dienen kann und für weitere Untersuchungen zur Entwicklung von Biomaterialien berücksichtigt werden sollte. Die schnelle Quervernetzungsreaktion, die resultierende Hydrogelbildung und die Biokompatibilität sind als positive Eigenschaften zu nennen, die das Präpolymer für zukünftige Anwendungen interessant macht.
KW  - Sternpolymere
KW  - Funktionalisierung <Chemie>
KW  - Isocyanate
KW  - surface functionalization
KW  - biomaterials
KW  - chemical crosslinking
KW  - bioceramics
KW  - electrospun fibers
KW  - Oberflächenfunktionalisierung
KW  - funktionale Präpolymere
KW  - Modifikation von Biokeramiken
KW  - Funktionalisierung von elektrogesponnenen Fasern
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178365
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schäfer [geb. Stichler], Simone
T1  - Thiol-ene Cross-linked Poly(glycidol) / Hyaluronic Acid Based Hydrogels for 3D Bioprinting
T1  - Thilo-En vernetzte Hydrogele basierend auf Poly(glyzidolen) und Hyaluronsäure für das 3D-Biodrucken
N2  - The aim of the work was the development of thiol-ene cross-linked hydrogels based on functionalized poly(glycidol)s (PG) and hyaluronic acid (HA) for extrusion based 3D bioprinting. Additionally, the functionalization of the synthesized PG with peptides and the suitability of these polymers for physically cross-linked gels were investigated, in a proof of principle study in order to demonstrate the versatile use of PG polymers in hydrogel development.
First, the precursor polymers of the different hydrogel systems were synthesized. For thiol-ene cross-linked hydogels, linear allyl-functionalized PG (P(AGE-co-G)) and three different thiol-(SH-)functionalized polymers, ester-containing PG-SH (PG SHec), ester-free PG-SH (PG-SHef) and HA-SH were synthesized and analysed, The degree of functionalization of these polymers was adjustable. 
For physically cross-linked hydrogels, peptide-functionalized PG (P(peptide-co-G)),  was synthesized through polymer analogue thiol-ene modification of P(AGE-co-G).
Subsequently, thiol-ene cross-linked hydrogels were prepared with the synthesized thiol- and allyl-functionalized polymers. Depending on the origin of the used polymers, two different systems were obtained: on the one hand synthetic hydrogels consisting of PG-SHec/ef and P(AGE-co-G) and on the other hand hybrid gels, consisting of HA-SH and P(AGE-co-G). In synthetic gels, the degradability of the gels was determined by the applied PG-SH. The use of PG-SHec resulted in hydrolytically degradable hydrogels, whereas the cross-linking with PG-SHef resulted in non-degradable gels.
The physical properties of these different hydrogel systems were determined by swelling, mechanical and diffusion studies and subsequently compared among each other. In swelling studies the differences of degradable and non-degradable synthetic hydrogels as well as the differences of synthetic compared to hybrid hydrogels were demonstrated.
Next, the stiffness and the swelling ratios (SR) of the established hydrogel systems were examined in dependency of different parameters, such as incubation time, polymer concentration and UV irradiation. In general, these measurements revealed the same trends for synthetic and hybrid hydrogels: an increased polymer concentration as well as prolonged UV irradiation led to an increased network density. Moreover, it was demonstrated that the incorporation of additional non-bound HMW HA hampered the hydrogel cross-linking resulting in gels with decreased stiffness and increased SR. This effect was strongly dependent on the amount of additional HMW HA.

The diffusion of different molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) through hybrid hydrogels (with/without HMW HA) gave information about the mesh size of these gels. The smallest FITC-dextran (4 kDa) completely diffused through both hydrogel systems within the first week, whereas only 55 % of 40 kDa and 5-10 % HMW FITC-dextrans (500 kDa and 2 MDa) could diffuse through the networks.
The applicability of synthetic and hybrid hydrogels for cartilage regeneration purpose was investigated through by biological examinations. It was proven that both gels support the survival of embedded human mesenchymal stromal cells (hMSCs) (21/28 d in vitro culture), however, the chondrogenic differentiation was significantly improved in hybrid hydrogels compared to synthetic gels. The addition of non-bound HMW HA resulted in a slightly less distinct chondrogenesis.
Lastly the printability of the established hydrogel systems was examined. Therefore, the viscoelastic properties of the hydrogel solutions were adjusted by incorporation of non-bound HMW HA. Both systems could be successfully printed with high resolution and high shape fidelity. 
The introduction of the double printing approach with reinforcing PCL allowed printing of hydrogel solutions with lower viscosities. As a consequence, the amount of additional HMW HA necessary for printing could be reduced allowing successful printing of hybrid hydrogel solutions with embedded cells. It was demonstrated that the integrated cells survived the printing process with high viability measured after 21 d. Moreover, by this reinforcing technique, robust hydrogel-containing constructs were fabricated.
In addition to thiol-ene cross-linked hydrogels, hydrogel cross-linking via ionic interactions was investigated with a hybrid hydrogel based on HMW HA and peptide-functionalized PG. Rheological measurements revealed an increase in the viscosity of a 2 wt.% HMW HA solution by the addition of peptide-functionalized PG. The increase in viscosity could be attributed to the ionic interactions between the positively charge PG and the negatively charge HMW HA. 
In conclusion, throughout this thesis thiol-ene chemistry and PG were introduced as promising cross-linking reaction and polymer precursor for the field of biofabrication. Furthermore, the differences of hybrid and synthetic hydrogels as well as chemically and physically cross-linked hydrogels were demonstrated.
Moreover, the double printing approach was demonstrated to be a promising tool for the fabrication of robust hydrogel-containing constructs. It opens the possibility of printing hydrogels that were not printable yet, due to too low viscosities.
N2  - Ziel der Arbeit war die Entwicklung von Thiol-En-vernetzten Hydrogelen basierend auf funktionalisierten Poly(glyzidolen) (PG) und Hyaluronsäure (HA) für das extrusionsbasierte 3D-Biodrucken. Um die vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten von PG-Polymeren für die Hydrogelentwicklung zu zeigen, wurde darüber hinaus, in einer Proof-of-Principle-Studie, PG mit Peptiden funktionalisiert und die Eignung dieser Polymere für die Herstellung von physikalisch vernetzten Gelen untersucht.
Zunächst wurden die Vorläuferpolymere für die verschiedenen Hydrogelsysteme synthetisiert. Für die Thiol-En-vernetzten Hydrogele wurde lineares Allyl-funktionalisiertes PG (P(AGE-co-G)) und drei verschiedene Thiol-(SH )funktionalisierte Polymere, Ester haltiges PG-SH (PG-SHec), Ester freies PG SH (PG-SHef) und HA-SH synthetisiert und analysiert. Dabei war der Funktionalisierungsgrad dieser Polymere einstellbar. 
Für physikalisch vernetzte Hydrogele wurde Peptid-funktionalisierte PGs (P(Peptid co-G)) mittels polymeranaloger Thiol-En-Modifikation von P(AGE-co-G) synthetisiert. 
Anschließend wurden Thiol-En-vernetzte Hydrogele auf Basis der synthetisierten Thiol- und Allyl-funktionalisierten Polymeren hergestellt. Je nach Ursprung der verwendeten Polymere wurden zwei verschiedene Systeme erhalten: einerseits synthetische Hydrogele bestehend aus PG-SHec/ef und P(AGE-co-G) und andererseits hybride Gele, bestehend aus HA-SH und P(AGE-co-G). Bei den synthetischen Gelen wurde die Abbaubarkeit der Gele durch das verwendete PG-SH bestimmt. Die Verwendung von PG-SHec resultierte in hydrolytisch abbaubaren Hydrogelen, während die Vernetzung mit PG-SHef zu nicht abbaubaren Gelen führte. 
Die physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Hydrogelsysteme wurden mittels Quell-, mechanischen und Diffusionsexperimenten bestimmt und anschließend miteinander verglichen. Die Quellungsstudien zeigten die Unterschiede von abbaubaren und nicht abbaubaren synthetischen Hydrogelen, sowie die Unterschiede von synthetischen gegenüber hybriden Hydrogelen. 
Als nächstes wurden die Steifigkeit und das Quellverhältnis (SR) der etablierten Hydrogelsysteme in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern wie Inkubationszeit, Polymerkonzentration und UV-Bestrahlung untersucht. Im Allgemeinen zeigten diese Messungen für synthetische und hybride Hydrogele die gleichen Trends: eine erhöhte Polymerkonzentration sowie eine verlängerte UV-Bestrahlung führten zu einer erhöhten Netzwerkdichte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Einbringen zusätzlicher, nicht gebundener HMW HA die Hydrogelvernetzung behinderte, was zu Gelen mit verringerter Steifigkeit und erhöhtem SR führte. Dieser Effekt war stark abhängig von der Menge an zusätzlich eingebrachter HMW HA.

Die Diffusion von Fluorescein-Isothiocyanat-Dextran (FITC-Dextran) mit unterschiedlichem Molekulargewichten durch hybride Hydrogele (mit/ohne HMW HA) lieferte Informationen über die Maschengröße dieser Gele. Das kleinste FITC-Dextran (4 kDa) diffundierte innerhalb der ersten Woche vollständig durch beide Hydrogelsysteme, während nur 55 % der 40 kDa und 5-10 % HMW FITC-Dextrane (500 kDa und 2 MDa) durch die Netzwerke diffundieren konnten.
Die Anwendbarkeit von synthetischen und hybriden Hydrogelen für Knorpelregenerationszwecke wurde durch biologische Experimente untersucht. Es wurde bewiesen, dass beide Gele das Überleben von eingebetteten humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) unterstützen (21/28 d in vitro Kultur), jedoch war die chondrogene Differenzierung in hybriden Hydrogelen im Vergleich zu synthetischen Gelen signifikant verbessert. Die Zugabe von nicht gebundenem HMW HA führte zu einer etwas weniger ausgeprägten Chondrogenese.
Zuletzt wurde die Druckbarkeit der etablierten Hydrogelsysteme untersucht. Dafür wurden die viskoelastischen Eigenschaften der Hydrogellösungen durch das Einbringen von nicht gebundener HMW HA eingestellt. Beide Systeme konnten erfolgreich mit hoher Auflösung und hoher Formgenauigkeit gedruckt werden. 
Die Einführung des Doppeldruck-Konzeptes mit verstärkendem PCL ermöglichte das Drucken von Hydrogellösungen mit niedrigeren Viskositäten. Infolgedessen konnte die für den Druck notwendige Menge an HMW HA reduziert und hybride Hydrogellösungen mit eingebetteten Zellen erfolgreich gedruckt werden. Es wurde gezeigt, dass die integrierten Zellen den Druckprozess mit hoher Vitalität überlebten (gemessen nach 21 d). Darüber hinaus wurden mit dieser Verstärkungstechnik robuste Hydrogel-enthaltende Konstrukte hergestellt.
Zusätzlich zu den Thiol-En-vernetzten Hydrogelen wurde die Hydrogelvernetzung mittels elektrostatischen Wechselwirkungen mit einem hybriden Gel auf der Basis von HMW HA und Peptid-funktionalisiertem PG untersucht. Rheologische Messungen ergaben eine Erhöhung der Viskosität einer 2 wt.% HMW HA Lösungen durch die Zugabe von Peptid-funktionalisiertem PG. Der Viskositätsanstieg konnte auf die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem positiv geladenen PG und der negativ geladenen HMW HA zurückgeführt werden. 
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Thiol-En-Chemie und PG als vielversprechende Vernetzungsreaktion bzw. Polymervorstufe für die Biofabrikation eingeführt. Des Weiteren wurden die Unterschiede von hybriden und synthetischen Hydrogelen sowie von chemisch und physikalisch vernetzten Hydrogelen aufgezeigt.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Doppeldruck-Konzept eine vielversprechende Methode für die Herstellung von robusten Hydrogel-enthaltenden Konstrukten ist. Es eröffnet die Möglichkeit, Hydrogele zu drucken, die aufgrund zu geringer Viskositäten bis jetzt nicht druckbar waren.
KW  - Hyaluronsäure
KW  - thiol-ene
KW  - Hyaluronic Acid
KW  - poly(glycidol)
KW  - hydrogels
KW  - Hydrogel
KW  - Glycidol
KW  - 3D-Druck
KW  - 3D printing
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174713
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jüngst, Tomasz
T1  - Establishing and Improving Methods for Biofabrication
T1  - Etablierung und Verbesserung von Methoden für die Biofabrikation
N2  - Die Biofabrikation ist ein junges und sehr dynamisches Forschungsgebiet mit viel Potential. Dieses Potential spiegelt sich unter anderem in den ambitionierten Zielen wieder, die man sich hier gesetzt hat. Wissenschaftler in diesem Gebiet wollen eines Tages beispielsweise funktionale menschliche Gewebe nachbilden, die aus patienteneigenen Zellen bestehen. Diese Gewebe sollen entweder für die Testung neuer Arzneimittel und Therapien oder sogar als Implantate einsetzt werden. Der Schlüssel zum Erfolg soll hier die Verwendung automatisierter Prozesse in Verbindung mit innovativen Materialien sein, die es ermöglichen, die Hierarchie und Funktion des zu ersetzenden natürlichen Gewebes nachbilden. Obwohl in den letzten Jahren große Fortschritte gemacht worden sind, gibt es immer noch Hürden, die überwunden werden müssen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die derzeit eingeschränkte Auswahl kompatibler Materialien für die Biofabrikation zu erweitern und bereits etablierte Verfahren wie den extrusionsbasierten Biodruck noch besser verstehen zu lernen. Auch neue Verfahren, wie etwa das Melt Electrospinning Writing (MEW) sollten etabliert werden.
In Kapitel 3 dieser Arbeit wurde das MEW dazu verwendet, tubuläre Strukturen zu fertigen, die sich aus Polymerfasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nur etwa 12 μm zusammensetzen. Die mit Hilfe von Druckluft in Verbindung mit einer hohen elektrischen Spannung aus einer Nadelspitze austretende Polymerschmelze wurde hierbei auf zylinderförmigen Kollektoren mit Durchmessern zwischen 0.5 und 4.8mm gesammelt. Auf diese Weise wurden röhrenförmige Faserkonstrukte generiert. Das Hauptaugenmerk lag auf dem Einfluss des Durchmessers, der Rotations- und Translationsbewegung des Kollektors auf die Morphologie der Faserkonstrukte. Hierzu wurden die Fasern erst auf unbewegten Kollektoren mit unterschiedlichen Durchmessern gesammelt und die entstehenden Muster analysiert. Es zeigte sich, dass das Fasermuster mit zunehmendem Durchmesser des Kollektors mehr den symmetrischen Konstrukten mit runder Grundfläche glich, die auch von flachen Kollektoren bekannt sind. Je kleiner der Kollektordurchmesser wurde, desto ovaler wurde die Grundfläche der Muster, was den Einfluss der Krümmung deutlich machte. In weiteren Experimenten wurden die zylindrischen Kollektoren mit Geschwindigkeiten von 4,2 bis 42 Umdrehungen pro Minute um ihre Längsachse gedreht. Die von flachen Kollektoren bekannten Übergänge der Fasermorphologie konnten auch für runde Kollektoren bestätigt werden. So änderte sich die Morphologie mit zunehmender Geschwindigkeit der Oberfläche von einer achterförmigen Gestalt über eine sinusförmige Ausrichtung der Fasern hin zu einer geraden Linie. Der Einfluss des Kollektordurchmessers wurde auch hier deutlich, da sich etwa die Amplitude der bei Rotationsgeschwindigkeiten im Bereich sinusförmiger Ausrichtung abgelegten Fasern mit abnehmendem Radius erhöhte. Im nächsten Schritt wurde neben der Rotation der Kollektoren auch eine Translation induziert. Durch geeignete Kombination von Rotation und Translation konnten Konstrukte mit definiertem Wickelwinkel hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Wiedergabe des vorher kalkulierten Winkels unter Verwendung von Oberflächengeschwindigkeiten, die nahe am Übergang zur geraden Faserausrichtung waren, am besten war. Im Rahmen dieser Arbeit konnten Winkel zwischen 5 und 60° mit hoher Präzision wiedergegeben werden. Im Falle von sich wiederholenden Mustern konnte auch in Bezug auf die Stapelbarkeit der Fasern aufeinander eine hohe Präzision erreicht werden. 
Kapitel 4 dieser Arbeit befasste sich mit dem extrusionsbasierten 3D-Druck. Das etabliere Verfahren wurde auf eine bisher wenig untersuchte Materialzusammensetzung von Nanopartikeln-beladenen Hydrogeltinten ausgeweitet. Die Tinte bestand aus einer Kombination von funktionalisierten Polyglyzidolen und einer unmodifizierten langkettingen Hyaluronsäure. Dieser wurden mesoporöse Silika-Nanopartikel mit unterschiedlicher Ladung zugesetzt und deren Freisetzung aus gedruckten Konstrukten mit einstellbarer Geometrien untersucht. Da die Hyaluronsäure selbst negativ geladen ist, wurde erwartet und auch gezeigt, dass aminofunktionalisierte Partikel mit positiver Ladung langsamer freigesetzt werden als carboxylfunktionalisierte Partikel mit negativer Ladung. Interessanterweise änderten die Partikel nicht die rheologischen Eigenschaften der Tinte und es konnten Hydrogele, die mit positiv geladenen Partikeln beladen waren, bei den gleichen Druckparametern verdruckt werden, wie Hydrogele, die mit negativ geladenen Partikeln beladen waren. Die guten Druckeigenschaften der Tinten ermöglichten die präzise Fertigung von Konstrukten mit einer Größe von 12x12x3mm^3, also von Konstrukten mit bis zu 16 aufeinanderfolgenden Lagen. Die Strangdurchmesser betrugen hierbei 627±31μm und die Verteilung der Partikel innerhalb der Stränge war sehr homogen. Zudem konnten auch Strukturen gedruckt werden, bei denen beide Tintenarten, mit positiven und mit negativen Partikeln beladene Hydrogele, in einem Konstrukt kombiniert wurden. Hierbei zeigte sich, dass die Freisetzung der Partikel, die über 6 Wochen hinweg untersucht wurde, auch stark von der Geometrie der zwei-Komponenten-Konstrukte abhing. Insbesondere die Auswirkung des direkten Kontakts zwischen den Komponenten innerhalb eines Konstruktes war hier sehr deutlich. Wurden die Stränge über Kreuz aufeinander abgelegt und hatten direkten Kontakt an den Kreuzungspunkten, konnte beobachtet werden, dass die positiv geladenen Partikel aus ihrem System in das mit den negativ geladenen Partikeln wanderten. Wurden die Stränge ohne direkten Kontakt parallel nebeneinander abgelegt, wurden die positiv geladenen Partikel in umgebendes Medium freigesetzt, konnten aber selbst nach 6 Wochen nicht in den Strängen mit den negativ geladenen Partikeln nachgewiesen werden. Dies verdeutlicht, dass Geometrie und Ladung der Partikel einen Einfluss auf die Freisetzung der Partikel hatten und sich die Freisetzung der Partikel durch eine geschickte Kombination beider Parameter steuern lässt.
In Kapitel 5 dieser Arbeit wurde eine neue Materialklasse als Biotinte für den extrusionsbasierten Biodruck untersucht. Bei dem Material handelte es sich um Hydrogele auf Basis rekombinanter Spinnenseidenproteine. Diese konnten ab einer Proteinkonzentration von 3 %Gew./Vol. ohne die Verwendung von Verdickungsmittel oder anderen Additiven und auch ohne eine nachträgliche Vernetzung verdruckt werden. Sowohl Hydrogele auf Basis des rekombinanten Proteins eADF4(C16) als auch eine mit einer RGD-Sequenz versehene Modifikation (eADF4(C16)-RGD) konnten mit einer hohen Formtreue verdruckt werden. Die RGD-Sequenz zeigte einen positiven Effekt auf das Anhaften von humanen Fibroblasten, die auf gedruckte Konstrukte ausgesät wurden. Zudem konnten mit Hilfe der Hydrogele auch zellbeladene Konstrukte gefertigt werden. Hierzu wurden die Hydrogele mit einer Zellsuspension so vermengt, dass eine finale Konzentration von 1,2 Millionen Zellen/ml erreicht wurde. Die beladenen Gele wurden verdruckt und es konnte eine Überlebensrate von 70,1±7,6% nachgewiesen werden. Das in diesem Kapitel etablierte Materialsystem ermöglichte zum ersten Mal das Verdrucken lebender Zellen in einer neuen Klasse von Tinten, die weder die Beimengung von Verdickungsmittel noch einen zusätzlichen Nachhärtungsschritt für die Herstellung zellbeladener stabiler Konstrukte benötigt.
N2  - Biofabrication is an advancing new research field that might, one day, lead to complex products like tissue replacements or tissue analogues for drug testing. Although great progress was made during the last years, there are still major hurdles like new types of materials and advanced processing techniques. The main focus of this thesis was to help overcoming this hurdles by challenging and improving existing fabrication processes like extrusion-based bioprinting but also by developing new techniques. Furthermore, this thesis assisted in designing and processing materials from novel building blocks like recombinant spider silk proteins or inks loaded with charged nanoparticles.
A novel 3D printing technique called Melt Electrospinning Writing (MEW) was used in Chapter 3 to create tubular constructs from thin polymer fibers (roughly 12 μm in diameter) by collecting the fibers onto rotating and translating cylinders. The main focus was put on the influence of the collector diameter and its rotation and translation on the morphology of the constructs generated by this approach. In a first step, the collector was not moving and the pattern generated by these settings was analyzed. It could be shown that the diameter of the stationary collectors had a big impact on the morphology of the constructs. The bigger the diameter of the mandrel (smallest collector diameters 0.5 mm, biggest 4.8 mm) got, the more the shape of the generated footprint converged into a circular one known from flat collectors. In a second set of experiments the mandrels were only rotated. Increasing the rotational velocity from 4.2 to 42.0 rpm transformed the morphology of the constructs from a figure-of-eight pattern to a sinusoidal and ultimately to a straight fiber morphology. It was possible to prove that the transformation of the pattern was comparable to what was known from increasing the speed using flat collectors and that at a critical speed, the so called critical translation speed, straight fibers would appear that were precisely stacking on top of each other. By combining rotation and translation of the mandrel, it was possible to print tubular constructs with defined winding angles. Using collections speeds close to the critical translation speed enabled higher control of fiber positioning and it was possible to generate precisely stacked constructs with winding angles between 5 and 60°.
In Chapter 4 a different approach was followed. It was based on extrusion-based bioprinting in combination with a hydrogel ink system. The ink was loaded with nanoparticles and the nanoparticle release was analyzed. In other words, two systems, a printable polyglycidol/hyaluronic acid ink and mesoporous silica nanoparticles (MSN), were combined to analyze charge driven release mechanism that could be fine-tuned using bioprinting. Thorough rheological evaluations proved that the charged nanoparticles, both negatively charged MSN-COOH and positively charged MSN-NH2, did not alter the shear thinning properties of the ink that revealed a negative base charge due to hyaluronic acid as one of its main components. Furthermore, it could be shown that the particles did also not have a negative effect on the recovery properties of the material after exposure to high shear. During printing, the observations made via rheological testing were supported by the fact that all materials could be printed at the same settings of the bioprinter. Using theses inks, it was possible to make constructs as big as 12x12x3 mm3 composed of 16 layers. The fiber diameters produced were about 627±31 μm and two-component constructs could be realized utilizing the two hydrogel print heads of the printer to fabricate one hybrid construct. The particle distribution within those constructs was homogeneous, both from a microscopic and a macroscopic point of view. Particle release from printed constructs was tracked over 6 weeks and revealed that the print geometry had an influence on the particle release. Printed in a geometry with direct contact between the strands containing different MSN, the positively charged particles quickly migrated into the strand previously containing only negatively charged MSN-COOH. The MSN-COOH seemed to be rather released into the surrounding liquid and also after 6 weeks no MSN-COOH signal could be detected in the strand previously only containing MSN-NH2. In case of a geometry without direct contact between the strands, the migration of the positively charged nanoparticles into the MSN-COOH containing strand was strongly delayed. This proved that the architecture of the printed construct can be used to fine-tune the particle release from nanoparticle containing printable hydrogel ink systems.
Chapter 5 discusses an approach using hydrogel inks based on recombinant spider silk proteins processed via extrusion-based bioprinting. The ink could be applied for printing at protein concentrations of 3 % w/v without the addition of thickeners or any post process crosslinking. Both, the recombinant protein eADF4(C16) and a modification introducing a RGD-sequence to the protein (eADF4(C16)-RGD), could be printed revealing a very good print fidelity. The RGD modification had positive effect on the adhesion of cells seeded onto printed constructs. Furthermore, human fibroblasts encapsulated in the ink at concentrations of 1.2 million cells per mL did not alter the print fidelity and did not interfere with the crosslinking mechanism of the ink. This enabled printing cell laden constructs with a cell survival rate of 70.1±7.6 %. Although the cell survival rate needs to be improved in further trials, the approach shown is one of the first leading towards the shift of the window of biofabrication because it is based on a new material that does not need potentially harmful post-process crosslinking and allows the direct encapsulation of cells staying viable throughout the print process.
KW  - 3D-Druck
KW  - Elektrospinnen
KW  - 3D Bioprinting
KW  - Melt Electrowriting
KW  - Biofabrication
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173444
ER  - 
TY  - THES
A1  - Feineis, Susanne
T1  - Thioether-poly(glycidol) as multifunctional coating system for gold nanoparticles
T1  - Thioether-Poly(glycidol) als multifunktionales Beschichtungssystem für Gold-Nanopartikel
N2  - The aim of this thesis was the development of a multifunctional coating system for AuNPs based on thioether polymers, providing both excellent colloidal stability and a variable possibility to introduce functionalities for biological applications.
First, two thioether-polymer systems were synthesised as a systematic investigation into colloidal stabilisation efficacy. Besides commonly used monovalent poly(ethylene glycol) (PEG-SR), its structural analogue linear poly(glycidol) (PG-SR) bearing multiple statistically distributed thioether moieties along the backbone was synthesised. Additionally, respective thiol analogues (PEG-SH and PG-SH) were produced and applied as reference. 
Successive modification of varyingly large AuNPs with aforementioned thiol- and thioether-polymers was performed via ligand exchange reaction on citrate stabilised AuNPs. An increased stabilisation efficacy of both thioether-polymers against biological and physiological conditions, as well as against freeze-drying compared to thiol analogues was determined. 
Based on the excellent colloidal stabilisation efficacy and multi-functionalisability of thioether-PG, a plethora of functional groups, such as charged groups, hydrophilic/hydrophobic chains, as well as bio-active moieties namely diazirine and biotin was introduced to the AuNP surface. Moreover, the generic and covalent binding of diazirine-modified PG-SR with biomolecules including peptides and proteins was thoroughly demonstrated. 
Lastly, diverse applicability and bioactivity of aforementioned modified particles in various studies was displayed, once more verifying the introduction of functionalities. On the one hand the electrostatic interaction of charged AuNPs with hydrogels based on hyaluronic acid was applied to tune the release kinetics of particles from three-dimensional scaffolds. On the other hand the strong complexation of siRNA onto two positively charged AuNPs was proven. The amount of siRNA payload was tuneable by varying the surface charge, ionic strength of the surrounding medium and the N/P ratio. Moreover, the biological activity and selectivity of the biotin-streptavidin conjugation was verified with respectively functionalised particles in controlled agglomeration test and in laser-triggered cell elimination experiments. In the latter, streptavidin-functionalised AuNPs resulted in excellent depletion of biotinylated cells whereas unfunctionalised control particles failed, excluding unspecific binding of these particles to the cell surface.
N2  - Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines multifunktionalen Beschichtungssystems für Gold Nanopartikel (AuNP) basierend auf Thioether-Polymeren, das sowohl eine hervorragende kolloidale Stabilität aufweist, als auch eine variable Einbringung von Funktionalitäten für biologische Anwendungen ermöglicht.
Um eine Systematik der Untersuchung von kolloidaler Stabilisierungseffizienz zu gewährleisten, wurden zwei Thioether-Polymersysteme synthetisiert. Diese basierten auf dem gebräuchlichen monovalenten Polyethylenglykol (PEG-SR) und dessen Strukturanalog Polyglycidol (PG-SR), das mehrere statistisch verteilte Thioethergruppen an seinem Rückgrat trägt. Zusätzlich wurden entsprechende Thiol-Polymere hergestellt (PEG-SH and PG-SH) und als Referenz eingesetzt. 
Die anschließende Modifikation von unterschiedlich großen AuNP mit zuvor erwähnten Thiol- und Thioether-Polymeren wurde über eine Liganden-Austausch-Reaktion auf Citrat-stabilisierten AuNP durchgeführt. 
Für beide Thioether-Polymere wurde eine höhere Stabilisierungseffizienz, insbesondere gegen biologische und physiologische Bedingungen, als auch gegen Gefriertrocknung im Vergleich zu entsprechenden Thiol-Analogen in einer systematischen Studie mit unterschiedlich großen AuNP festgestellt. 
Basierend auf der exzellenten kolloidalen Stabilisierungseffizienz und der multi-Funktionalisierbarkeit von Thioether-PG, wurde eine Vielzahl an funktioneller Einheiten, wie geladenen Gruppen, hydrophilen/hydrophoben Ketten und bioaktive Einheiten wie Diazirin und Biotin auf die AuNP Oberfläche eingebracht. Des Weiteren wurde die generische und kovalente Bindung zwischen Diazirin-modifiziertem PG-SR und Biomolekülen, wie Peptiden und Proteinen ausführlich aufgezeigt. 
Zuletzt, wurde die vielfältige Anwendungsmöglichkeit und Bioaktivität der zuvor erwähnten modifizierten Partikel in diversen Studien dargestellt, wodurch nochmals die erfolgreiche Einbringung der Funktionalitäten verifiziert wurde. Zum einen wurde hierbei die elektrostatische Wechselwirkung zwischen geladenen AuNP und Hydrogelen, die auf Hyaluronsäure basierten genutzt, um die Freisetzungskinetik der Partikel aus den drei-dimensionalen Gerüsten zu steuern. Zum anderen wurde die starke Komplexierung von siRNA an zwei unterschiedlich stark positiv geladene AuNP nachgewiesen. Die Menge an komplexierter siRNA konnte über Variation der Oberflächenladung, der Ionenstärke des umgebenden Mediums und des N/P Verhältnisses eingestellt werden. Zudem wurde die biologische Aktivität und Selektivität der Biotin-Streptavidin Konjugation mittels entsprechend funktionalisierter AuNP in kontrollierten Agglomerationstests und in ausführlichen Laser-induzierten Zelleliminationsstudien nachgewiesen. In letzteren Studien riefen Streptavidin-funktionalisierte AuNP exzellente Depletion von biotinylierten-Zellen hervor, wohingegen unfunktionalisierte Kontrollpartikel versagten, was eine unspezifische Bindung dieser Partikel an die Zelloberfläche ausschloss.
KW  - Nanopartikel
KW  - Gold-Nanoparticles
KW  - Thioether-Poly(glycidol)
KW  - Colloidal Stability
KW  - Multifunctionalisability
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172902
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stuckensen, Kai
T1  - Fabrication of hierarchical cell carrier matrices for tissue regeneration by directional solidification
T1  - Herstellung hierarchischer Zellträger-Matrices zur Geweberegeneration mittels gerichteter Erstarrung
N2  - The key hypothesis of this work represented the question, if mimicking the zonal composition and structural porosity of musculoskeletal tissues influences invading cells positively and leads to advantageous results for tissue engineering. Conventional approaches in tissue engineering are limited in producing monolithic “scaffolds” that provide locally variating biological key signals and pore architectures, imitating the alignment of collagenous fibres in bone and cartilage tissues, respectively. In order to fill this gap in available tissue engineering strategies, a new fabrication technique was evolved for the production of scaffolds to validate the hypothesis.

Therefore, a new solidification based platform procedure was developed. This process comprises the directional solidification of multiple flowable precursors that are “cryostructured” to prepare a controlled anisotropic pore structure. Porous scaffolds are attained through ice crystal removal by lyophilisation. Optionally, electrostatic spinning of polymers may be applied to provide an external mesh on top or around the scaffolds. A consolidation step generates monolithic matrices from multi zonal structures. To serve as matrix for tissue engineering approaches or direct implantation as medical device, the scaffold is sterilized.	
An Adjustable Cryostructuring Device (ACD) was successively developed; individual parts were conceptualized by computer aided design (CAD) and assembled. During optimisation, a significant performance improvement of the ACDs accessible external temperature gradient was achieved, from (1.3 ± 0.1) K/mm to (9.0 ± 0.1) K/mm. Additionally, four different configurations of the device were made available that enabled the directional solidification of collagenous precursors in a highly controlled manner with various sample sizes and shapes.
By using alginate as a model substance the process was systematically evaluated. Cryostructuring diagraphs were analysed yielding solidification parameters, which were associated to pore sizes and alignments that were determined by image processing. Thereby, a precise control over pore size and alignment through electrical regulation of the ACD could be demonstrated.

To obtain tissue mimetic scaffolds for the musculoskeletal system, collagens and calcium phosphates had to be prepared to serve as raw materials. Extraction and purification protocols were established to generate collagen I and collagen II, while the calcium phosphates brushite and hydroxyapatite were produced by precipitation reactions.	
Besides the successive augmentation of the ACD also an optimization of the processing steps was crucial. Firstly, the concentrations and the individual behaviour of respective precursor components had to be screened. Together with the insights gained by videographic examination of solidifying collagen solutions, essential knowledge was gained that facilitated the production of more complex scaffolds. Phenomena of ice crystal growth during cryostructuring were discussed. By evolutionary steps, a cryostructuring of multi-layered precursors with consecutive anisotropic pores could be achieved and successfully transferred from alginate to collagenous precursors. Finally, very smooth interfaces that were hardly detectable by scanning electron microscopy (SEM) could be attained. For the used collagenous systems, a dependency relation between adjustable processing parameters and different resulting solidification morphologies was created.	
Dehydrothermal-, diisocyanate-, and carbodiimide- based cross linking methods were evaluated, whereby the “zero length” cross linking by carbodiimide was found to be most suitable. Afterwards, a formulation for the cross linking solution was elaborated, which generated favourable outcomes by application inside a reduced pressure apparatus. As a consequence, a pore collapse during wet chemical cross linking could be avoided.	
Complex monolithic scaffolds featuring continuous pores were fabricated that mimicked structure and respective composition of different areas of native tissues by the presence of biochemical key stimulants. At first, three types of bone scaffolds were produced from collagen I and hydroxyapatite with appropriate sizes to fit critical sized defects in rat femurs. They either featured an isotropic or anisotropic porosity and partly also contained glycosaminoglycans (GAGs). Furthermore, meniscus scaffolds were prepared by processing two precursors with biomimetic contents of collagen I, collagen II and GAGs. Here, the pore structures were created under boundary conditions, which allowed an ice crystal growth that was nearly orthogonal to the external temperature gradient. Thereby, the preferential alignment of collagen fibres in the natural meniscus tissue could be mimicked. Those scaffolds owned appropriate sizes for cell culture in well plates or even an authentic meniscus shape and size. Finally, osteochondral scaffolds, sized to either fit well plates or perfusion reactors for cell culture, were fabricated to mimic the composition of subchondral bone and different cartilage zones. Collagen I and the resorbable calcium phosphate brushite were used for the subchondral zone, whereas the cartilage zones were composed out of collagen I, collagen II and tissue mimetic contents of GAGs. The pore structure corresponded to the one that is dominating the volume of natural osteochondral tissue.	
Energy dispersive X-ray spectroscopy (EDX) and SEM were used to analyse the composition and pore structure of the individual scaffold zones, respectively. The cross section pore diameters were determined to (65 ± 25) µm, (88 ± 35) µm and(93 ± 42) µm for the anisotropic, the isotropic and GAG containing isotropic bone scaffolds. Furthermore, the meniscus scaffolds showed pore diameters of (93 ± 21) µm in the inner meniscus zone and (248 ± 63) µm inside the outer meniscus zone. Pore sizes of (82 ± 25) µm, (83 ± 29) µm and (85 ± 39) µm were present inside the subchondral, the lower chondral and the upper chondral zone of osteochondral scaffolds. Depending on the fabrication parameters, the respective scaffold zones were also found to feature a specific micro- and nanostructure at their inner surfaces.	
Degradation studies were carried out under physiological conditions and resulted in a mean mass loss of (0.52 ± 0.13) %, (1.56 ± 0.10) % and (0.80 ± 0.10) % per day for bone, meniscus and osteochondral scaffolds, respectively. Rheological measurements were used to determine the viscosity changes upon cooling of different precursors. Micro computer tomography (µ-CT) investigations were applied to characterize the 3D microstructure of osteochondral scaffolds. To obtain an osteochondral scaffold with four zones of tissue mimetic microstructure alignment, a poly (D, L-lactide-co-glycolide) mesh was deposited on the upper chondral zone by electrostatic spinning. In case of the bone scaffolds, the retention / release capacity of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) was evaluated by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Due to the high presence of attractive BMP binding sites, only less than 0.1 % of the initially loaded cytokine was released. The suitability of combining the cryostructuring process with 3D powder printed calcium phosphate substrates was evaluated with osteochondral scaffolds, but did not appear to yield more preferable results than the non-combined approach.	
A new custom build confined compression setup was elaborated together with a suitable evaluation procedure for the mechanical characterisation under physiological conditions. For bone and cartilage scaffolds, apparent elastic moduli of (37.6 ± 6.9) kPa and (3.14 ± 0.85) kPa were measured. A similar behaviour of the scaffolds to natural cartilage and bone tissue was demonstrated in terms of elastic energy storage. Under physiological frequencies, less than 1.0 % and 0.8 % of the exerted energy was lost for bone and cartilage scaffolds, respectively. With average relaxation times of (0.613 ± 0.040) sec and (0.815 ± 0.077) sec, measured for the cartilage and bone scaffolds, they respond four orders of magnitude faster than the native tissues. Additionally, all kinds of produced scaffolds were able to withstand cyclic compression at un-physiological frequencies as high as 20 Hz without a loss in structural integrity.

With the presented new method, scaffolds could be fabricated whose extent in mimicking of native tissues exceeded the one of scaffolds producible by state of the art methods. This allowed a testing of the key hypothesis: The biological evaluation of an anisotropic pore structure in vivo revealed a higher functionality of immigrated cells and led finally to advantageous healing outcomes. Moreover, the mimicking of local compositions in combination with a consecutive anisotropic porosity that approaches native tissue structures could be demonstrated to induce zone specific matrix remodelling in stem cells in vitro. Additionally, clues for a zone specific chondrogenic stem cell differentiation were attained without the supplementation of growth factors.	
Thereby, the hypothesis that an increased approximation of the hierarchically compositional and structurally anisotropic properties of musculoskeletal tissues would lead to an improved cellular response and a better healing quality, could be confirmed. With a special focus on cell free in situ tissue engineering approaches, the insights gained within this thesis may be directly transferred to clinical regenerative therapies.
N2  - Die Schlüsselhypothese dieser Arbeit bestand darin zu überprüfen, ob eine Nachahmung der zonalen Zusammensetzungen und Porenstruktur muskulo-skelettaler Gewebe einwandernde Zellen beeinflusst und zu vorteilhafteren Ergebnissen im Tissue Engineering führt. Obwohl bereits zahlreiche konventionelle Ansätze existieren, so sind diese in ihrem Vermögen spezielle Zellträgermatrices („Scaffolds“) herzustellen limitiert. Insbesondere können dabei lokal variierende biologische Schlüsselreize nicht mit einer Porenstruktur, welche die Ausrichtung der Kollagenfasern in Knochen- und Knorpelgeweben imitiert, kombiniert werden. Um diese Lücke in den verfügbaren Tissue Engineering Strategien zu schließen, wurde ein neues Verfahren entwickelt. Dieses erlaubte die Herstellung monolithischer Scaffolds, welche eine Validierung der Hypothese ermöglichten.
Das neue Plattform-Verfahren basiert auf der gerichteten Erstarrung mehrerer fließfähiger Vorstufen, um somit eine kontrollierte anisotrope Porenstruktur vorzubereiten. Ein Entfernen der erstarrten Lösungsmittel durch Lyophilisation führt zu porösen Scaffolds. Optional besteht die Möglichkeit, Polymere mittels elektrostatischem Verspinnen als umhüllendes Vlies zu inkorporieren. Nach einem Vernetzungsschritt resultieren monolithische Matrices, bestehend aus mehreren Zonen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen. Vor einer Verwendung als Tissue Engineering Matrix oder implantierbares Medizinprodukt erfolgt eine Sterilisation. Hierfür wurde ein “Adjustable Cryostructuring Device“ (ACD) entwickelt, einzelne Bauteile mit Computer Aided Design entworfen und zu einer Apparatur montiert. Die Optimierung der Anlage ermöglichte eine signifikante Erhöhung des verfügbaren externen Temperaturgradienten von (1.3 ± 0.1) K/mm auf (9.0 ± 0.1) K/mm. Außerdem erlauben vier unterschiedliche Konfigurationen des ACD die gerichtete Erstarrung von kollagenen Vorstufen in einer besonders kontrollierten Art und Weise bei einer Vielzahl an Probengrößen und Formen.	
Die systematische Evaluation des Prozesses erfolgte mit Alginat als Modell-Substanz. Aus den zeitlichen Verläufen der Gefrierstrukturierung resultierten Erstarrungsparameter, die mittels Bildverarbeitung den entstandenen Porengrößen und -ausrichtungen zugeordnet wurden. Dies demonstrierte eine präzise Kontrolle der Ergebnisse durch elektrische Ansteuerung der ACD.
Zur Erzeugung von Rohmaterialien war eine Etablierung von Extraktions- und Aufreinigungsprotokollen für Kollagen I und Kollagen II notwendig, während eine Herstellung der Calciumphosphate Bruschit und Hydroxylapatit mittels Präzipitations-Reaktionen verlief. Neben der sukzessiven Verbesserung des ACD, stellte auch die Optimierung einzelner Prozessschritte wichtige Aspekte dar. Die Untersuchung und Diskussion des Verhaltens einzelner Vorstufenkomponenten sowie der Erstarrungs-phänomene von Kollagenlösungen führte zu einem Verständnis welches die Produktion von komplexeren Scaffolds zuließ. Somit war es auch möglich eine Abhängigkeitsrelation der einstellbaren Prozessparameter zu den resultierenden Erstarrungsmorphologien der verwendeten Kollagensysteme abzuleiten.	
Die Gefrierstrukturierung von mehreren Lagen unterschiedlicher Vorstufen konnte erfolgreich von Alginat- auf Kollagenvorstufen transferiert werden. Nach einer Optimierung der jeweiligen Grenzflächenübergänge, waren diese selbst mittels Rasterelektronenmikroskopie kaum noch zu erkennen. Eine Evaluierung von dehydrothermal-, diisocyanat- und carbodiimid- basierten Quervernetzungs-methoden zeigte die vorteilhaftesten Ergebnisse für die Vernetzung durch Carbodiimide. Zusätzlich wurde eine Zusammensetzung der Vernetzungslösung ermittelt, welche beim Einsatz in einer Unterdruckapparatur einen Porenstrukturkollaps durch nasschemische Vernetzung vermeidet.	
Eine erweiterte Kontrolle der Gefrierprozesse erlaubte es Struktur und Zusammensetzung verschiedener Zonen nativer Gewebe durch eine monolithische Zellträgermatrix mit durchgängiger Porenstruktur und biochemischen Schlüsselreizen nachzuahmen. Zuerst wurden drei Arten von Knochenscaffolds aus Kollagen I und Hydroxylapatit hergestellt, die Defekten kritischer Größe in Rattenoberschenkel-knochen entsprachen. Diese zeichneten sich durch eine isotrope oder eine anisotrope Porenstruktur aus und enthielten teilweise Glycosaminoglycane (GAGs). Weiterhin erfolgte die Produktion von Meniskusscaffolds aus zwei Vorstufen mit biomimetischen Anteilen an Kollagen I, Kollagen II und GAGs. Dabei verlief die Gefrierstrukturierung unter Grenzbedingungen, welche ein nahezu senkrechtes Eiskristallwachstum zu dem äußeren Temperaturgradienten erlaubten. Somit konnte der bevorzugte Verlauf von Kollagenfasern in nativem Meniskusgewebe nachgeahmt werden. Die Scaffolds waren entweder passend für „Well Plates“ der Zellkultur bemaßt oder besaßen sogar Form und Größe von authentischen Menisken.

Zuletzt wurden osteochondrale Scaffolds hergestellt, deren Zusammensetzung den jeweiligen Bereichen von Subchondralzone und verschiedenen Gelenkknorpelzonen entsprach. Kollagen I und die bioresorbierbare Calciumphosphatphase Bruschit fanden Verwendung in der Subchondralzone, während die Knorpelzonen aus Kollagen I, Kollagen II und entsprechenden biomimetischen Anteilen an GAGs bestanden. Außerdem bildete die Scaffoldporenstruktur die Volumendominierende in natürlichem Osteochondralgewebe nach, wobei die Dimensionierungen der Scaffolds Well Plates oder Perfusionsreaktoren der Zellkultur angepasst waren.	
Mittels energiedispersiver Röntgenspektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie erfolgte die Analyse von Zusammensetzung und Porenstruktur der jeweiligen Scaffoldzonen. Die Größe der Porenquerschnitte betrug (65 ± 25) µm, (88 ± 35) µm und (93 ± 42) µm für die anisotropen, die isotropen und die GAG-haltigen isotropen Knochenscaffolds. Die Meniskusscaffolds besaßen Porendurchmesser von 
(93 ± 21) µm in der inneren Meniskuszone und (248 ± 63) µm innerhalb der äußeren Meniskuszone. Im Falle der osteochondralen Scaffolds wurden Porengrößen von 
(82 ± 25) µm, (83 ± 29) µm und (85 ± 39) µm in der subchondralen, der unteren chondralen und der oberen chondralen Zone gemessen. In Abhängigkeit von den Prozessparametern zeigten die inneren Oberflächen der jeweiligen Scaffoldzonen eine spezifische Mikro- und Nanostruktur.	
Eine Prüfung des Degradationsverhaltens unter physiologischen Bedingungen ergab einen mittleren Massenverlust von (0.52 ± 0.13) %, (1.56 ± 0.10) % und 
(0.80 ± 0.10) % pro Tag für die Knochen-, Meniskus- und osteochondralen Scaffolds. Die Untersuchung der Viskositätsveränderungen während der Abkühlung unterschiedlicher Vorstufen geschah mit rheologischen Messungen. Weiterhin wurde die 3D Mikrostruktur von osteochondralen Matrices mit Mikro Computer Tomographie charakterisiert. Um einen osteochondralen Scaffold mit vier Zonen gewebeähnlich ausgerichteter Mikrostruktur zu erhalten, konnte die Scaffoldoberfläche durch ein elektroversponnenes Poly (D, L-Lactid-co-Glycolid) Vlies modifiziert werden.	
Ein „enzyme linked immunosorbent assay“ (ELISA) diente zur Evaluation des Rückhalte- bzw. Freisetzungsverhaltens von „bone morphogenetic protein 2“ 
(BMP-2) in Knochenscaffolds. Bedingt durch die hohe Präsenz von attraktiven BMP Bindungsstellen betrug die freigesetzte Menge des initial beladenen Zytokins nur weniger als 0.1 %.	

Die Eignung einer Kombination des Gefrierstrukturierungsprozesses mit 3D gedruckten Calciumphosphatsubstraten wurde anhand von osteochondralen Scaffolds überprüft, aber zeigte keine vorteilhafteren Resultate als die nicht kombinierte Vorgehensweise.	
Für die mechanische Charakterisierung unter physiologischen Bedingungen konnte ein neues Test-Setup mitsamt Auswertungsverfahren entwickelt werden. Die gemessenen Elastizitätsmoduln betrugen (37.6 ± 6.9) kPa für Knochen- und (3.14 ± 0.85) kPa für Knorpelscaffolds. Da unter physiologischen Frequenzen nur weniger als 1.0 % der eingebrachten Energie verloren ging, entsprach die Fähigkeit der Zellträgermatrices zur elastischen Energiespeicherung dem von natürlichem Knochen- und Knorpelgewebe. Bei mittleren Relaxationszeiten von (0.613 ± 0.040) sec und (0.815 ± 0.077) sec für Knorpel- und Knochenscaffolds reagieren diese vier Größenordnungen schneller als die nativen Gewebe. Außerdem waren alle produzierten Matrices dazu in der Lage zyklischen Kompressionen bei unphysiologisch hohen Frequenzen von 20 Hz zu wiederstehen, ohne an struktureller Integrität zu verlieren.
Mit dem vorgestellten neuen Verfahren konnten Scaffolds hergestellt werden, deren Ausmaß in der Nachahmung nativer Gewebe mit etablierten Methoden nicht erreichbar war und welche eine Überprüfung der Schlüsselhypothese erlaubten: Die biologische Evaluation einer anisotropen Porenstruktur in vivo zeigte eine höhere Funktionalität eingewanderter Zellen, was zu vorteilhafteren Heilungsergebnissen führte. Darüber hinaus demonstrierte eine Imitation der lokalen Zusammensetzungen in Kombination mit einer durchgängigen anisotropen Porenstruktur, welche an diejenige in nativen Geweben angenähert ist, eine Induktion von zonenspezifischer Matrixremodellierung von Stammzellen in vitro. Außerdem waren Hinweise auf eine zonale chondrogene Stammzelldifferenzierung ohne eine gesonderte Zugabe von Wachstumsfaktoren zu beobachten. 	
Somit konnte die Hypothese, dass eine verbesserte Nachahmung der hierarchischen Zusammensetzung und anisotroper Struktur von muskuloskelettalen Geweben zu einer optimierten zellulären Reaktion und somit einer besseren Heilungsqualität führt, bestätigt werden. Mit einem speziellen Fokus auf zellfreies in situ Tissue Engineering, könnten die Erkenntnisse dieser Arbeit direkt für klinische Therapien eingesetzt werden.
KW  - directional solidification
KW  - collagen
KW  - cartilage
KW  - bone
KW  - scaffold
KW  - Tissue Engineering
KW  - Knochen
KW  - Knorpel
KW  - Gerichtete Erstarrung
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145510
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmitz, Michael
T1  - Functional hydrophilic polymers for chemoselective coupling
T1  - Funktionale, hydrophile Polymere für die chemoselektive Kopplung
N2  - Chemoselective poly(oxazolines) (POx) and poly[(oligo ethylene glycol) acrylates] were synthesized. An initiator was produced for the preparation of poly(oxazoline)s capable of participating in click chemistry reactions which allows the functionalization of the polymer at the α terminus which was confirmed by 1H NMR spectroscopy. The initiator was used for the polymerization of hydrophilic 2 methyl 2 oxazoline (MeOx), whereby chemoselective, alkyne functionalized polymers could be prepared for Cu-catalyzed azide–alkyne cycloaddition. The desired molecular weight could be achieved through the living, ring opening cationic polymerization and was confirmed by 1H NMR, SEC and MALDI ToF measurements. Polymers were terminated with piperidine if no further functionalization was needed, or with an ester derivate for enabling amine attachment in a subsequent step. In addition, polymers were functionalized by termination with NaN3 in order to provide the counterpart to the azide–alkyne reaction. IR spectroscopy was suitable for the azide detection. The coupling of polymers showed the reactivity and could be confirmed by SEC, 1H NMR and IR spectroscopy.
The composition of cysteine functionalized POx was completed by thiol–ene chemistry. Since the commercially available iso 2 propyl 2 oxazoline is not available for the cationic polymerization, 2 butenyl  and 2 decenyl 2 oxazoline (ButenOx and DecenOx) were first prepared. The synthesis of both copolymers, based on MeOx could be confirmed by 1H NMR as well as with SEC, whereby narrow distributions with dispersities of 1.06 could be achieved. The cysteine functionalization of the copolymers was enabled by the creation of a thiazolidine component which could be synthesized by acetal  and formyl protection of cysteine and subsequent functionalization with a thiol. The component enabled the reaction with a polymer by thiol–ene reaction which was started by the addition of dimethoxyphenyl-acetophenone and was catalyzed by irradiation with UV light. Both copolymers, with a shorter (polymers with BuenOx) and longer (polymers with DecenOx) hydrophobic sidechain could be functionalized. 1H NMR spectroscopic analysis showed a quantitative reaction with the thiazolidine derivate. After deprotection by acidic workup the desired, cysteine functionalized polymer could be isolated. Quantification of cysteine functions was ensured by a modified TNBSA assay, whereby the thiols were first oxidized in order to confirm an independent measurement of amine functions. Both, the TNBSA assay as well as the NMR measurement showed the desired number of cysteine residues.
The cytotoxicity of functionalized polymers with different compositions was tested by a luminescent cell viability assay (LCVA). Both, the amount of cysteine functions (5–10%) in the copolymers as well as the length of the hydrophobic side chain were varied. All polymers did not show cytotoxicity up to concentrations of 10 mg∙mL-1. The cell activity and cell numbers only decreased below 50% and 20% respectively, when copolymers with 5% cysteine and longer sidechains were measured, which was attributed to a contamination of the sample itself. The cooperation partner performed Native Chemical Ligation (NCL) with model peptides and purified the products by HPLC. A sterically non demanding peptide was synthesized, consisting of an aromatic amino acid and four glycine units. The aromatic unit was used for the quantification of the polymer–peptide conjugate in the 1H NMR spectroscopy. A polymer having five cysteine side chains has been fully implemented by NCL to a conjugate of one polymer with five peptides. A sterically more demanding peptide was additionally used and MALDI ToF measurements confirmed the successful conjugation. 
Furthermore the cysteine functionalized polymer was used for nanogel synthesis.  The thiol of the cysteine function was oxidized in an inverse mini-emulsion by H2O2, resulting in nanogels (~500 nm) which could be confirmed by SEM, AFM, DLS and NTA measurements. 
Besides POx, oligo (ethylene glycol)acrylates (OEGA) were polymerized; by copolymerization with the reactive pentafluorophenyl acrylate (PFPA) reactive and amphiphilic polymers were obtained. The synthesis of PFPA could be confirmed spectroscopically by 1H , 19F NMR, and by FT IR. Copolymers were synthesized by RAFT polymerization with narrow dispersities. Functionalization with an amine functionalized thiazolidine led to a hydrophilic cysteine functionalized polymer after acidic deprotection. Apart from this polymer, a thioester functionalization was successfully performed by reaction of the active polymer with a cyclic amine functionalized thioester which does not release a toxic by product (such as the resulting thiol) during NCL and thus features a very high potential to replace former thioester.
N2  - Als hydrophile Polymere wurden chemoselektive Poly(oxazoline) (POx) und Poly(oligoethylenglykol)acrylate synthetisiert. Für die Darstellung von „klickfähigen“ Poly(oxazolinen) wurde ein Initiator synthetisiert, welcher eine Funktionalisierung des Polymers am α Terminus ermöglicht. Die erfolgreiche Darstellung wurde mittels 1H NMR Spektroskopie bewiesen. Der Initiator wurde für die Polymerisation von hydrophilem 2 Methyl 2 oxazoline (MeOx) eingesetzt, wodurch chemoselektive, Alkin funktionalisierte Polymere dargestellt werden konnten. Die gewünschten Molmassen konnten durch die lebende, Polymerisation erreicht werden und durch 1H NMR, GPC  und MALDI Messungen bewiesen werden. Die Terminierung der Polymere erfolgte durch Abbruch mit Piperidin oder durch Abbruch mit einem Ester Derivat, um die Anbindung mit Aminen zu ermöglichen. Außerdem wurden Polymere durch die Terminierung mit NaN3 funktionalisiert, um das Pendant zur Azid–Alkin¬-Cycloaddition liefern zu können. Die IR-Spektroskopie eignete sich hierbei für die Azid-Detektion. Die Kopplung beider Polymere, zum Nachweis der Reaktivität, konnte durch die GPC, 1H NMR und IR Spektroskopie bestätigt werden. 
Die Darstellung von Cystein funktionalisierten POx konnte durch Thiol–en Chemie realisiert werden. Dazu wurde ein Copolymer mit Allylseitenketten synthetisiert. Da das kommerziell erhältliche iso-Propyloxazoline nicht für die kationische Polymerisation zur Verfügung steht, wurden Butenyl  und Decenyloxazolin (ButenOx und DecenOx) synthetisiert. Die Darstellung des Copolymers, basierend auf MeOx, konnte mit 1H NMR und der GPC bestätigt werden. Enge Verteilungen bis zu einer Disperistät von 1.06 wurden erreicht. Die Cysteinfunktionalisierung der Copolymere wurde durch die Synthese eines Thiazolidinbausteins ermöglicht. Dieser konnte durch Acetal- und Formylschützung von Cystein und anschließender Funktionalisierung mit einem Thiol dargestellt werden. Der Baustein ermöglichte die Umsetzung des Polymers mit dem geschützten Cysteinderivat. Diese wurde durch Zugabe von Dimethoxyphenyl-acetophenon gestartet und durch Bestrahlung mit UV-Licht katalysiert. Sowohl Copolymere mit einer kürzeren (Einsatz von ButenOx) und langen (Einsatz von DecenOx) hydrophoben Seitenkette konnten mittels Thiol–en Chemie funktionalisiert werden. 1H NMR spektroskopische Analysen zeigten eine quantitative Umsetzung mit dem Thiazolidinderivat. Nach Entschützung konnte das gewünschte, Cystein funktionalisierte Polymer isoliert werden. Die Quantifizierung der Cysteinfunktionen wurde durch einen modifizierten TNBSA assay gewährleistet, wobei die Thiole des Cysteins zunächst oxidiert wurden, damit diese keinen Einfluss auf die Messung haben konnten. Sowohl der TNBSA assay als auch die NMR-spektroskopische Messmethode zeigte die gewünschten Anzahlen von Cysteinresten.
Die funktionalisierten Polymere wurden mit unterschiedlichen Zusammensetzungen auf Zelltoxizität geprüft. Der Anteil an Cysteinfunktionen (5 10%) und die Länge der hydrophoben Seitenkette wurden variiert. Alle Polymere waren bis zu einer Konzentration von 10 mg∙mL-1 nicht toxisch. Die Zellaktivität und Zellzahl sank nur beim Copolymer mit 5% Cystein und langer Seitenkette unter einen Wert von 50% bzw. 20%, was auf eine Verunreinigung der Probe zurückgeführt wurde. Der Kooperationspartner führte die Native Chemische Ligation (NCL) mit verschiedenen Modellpeptiden durch und reinigte die Produkte mittels HPLC. Es wurden sterisch unanspruchsvolle Peptide synthetisiert, die aus einer aromatischen Aminosäure und vier Glycineinheiten bestanden. Der Aromat konnte in der 1H NMR Spektroskopie für die Quantifizierung der Polymer–Peptid Konjugate genutzt werden. Ein Polymer mit fünf Cysteinseitenketten wurde vollständig mittels NCL zu einem Konjugat aus einem Polymer mit fünf Peptiden umgesetzt. Ein sterisch anspruchsvolleres Peptid wurde im Nachhinein verwendet, wobei MALDI-ToF Messungen die Konjugation bestätigten. Das cysteinfunktionaliserte Polymer wurde außerdem für die Nanogelsynthese verwendet. Hierbei wurde das Thiol der Cysteinfunktion mittels H2O2 in einer inversen Miniemulsion oxidiert, woraus Nanogele resultierten, die mittels REM, AFM, DLS und NTA bestätigt werden konnten. 
Neben POx wurden Copolymere aus (Oligoehtylenglykol)acrylate und Pentafluorophenylacrylat synthetisiert und reaktive amphiphile Polymere erhalten. Die Darstellung von Pentafluorophenylacrylat konnte durch 1H  und 19F NMR als auch durch FT IR spektroskopisch bestätigt werden. Copolymere wurden mittels RAFT Polymerisation mit engen Dispersitäten und den gewünschten Molmassen synthetisiert. Die Funktionalisierung mit einem aminfunktionalisierten Thiazolidin führte nach saurer Entschützung zu einem hydrophilen cysteinfunktionalisierten Polymer. Neben dieser Komponente konnte eine Thioesterfunktionalisierung durch Reaktion mit einem cyclischen aminfunktionalisierten Thiolacton erfolgreich durchgeführt werden.
KW  - Konjugate
KW  - Functional hydrophilic polymers
KW  - chemoselective
KW  - native chemical ligation
KW  - Polyoxazoline
KW  - Polymer-peptide-conjugate
KW  - Polyoxazoline
KW  - hydrophilic polymers
KW  - chemosensitivity
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145629
ER  - 
TY  - THES
A1  - Liebscher [geb. Blöhbaum], Julia
T1  - Side chain functional poly(2-oxazoline)s for biomedical applications
T1  - Seitenkettenfunktionalisierte Poly(2-oxazoline) für biomedizinische Anwendungen
N2  - The aim of the thesis was to develop water soluble poly(2-oxazoline) (POx) copolymers with new side group functionalities, which can be used for the formation of hydrogels in biomedical applications and for the development of peptide-polymer conjugates. 
First, random copolymers of the monomer MeOx or EtOx with ButEnOx and EtOx with DecEnOx were synthesized and characterized. The vinyl functionality brought into the copolymer by the monomers ButEnOx and DecEnOx would later serve for post-polymerization functionalization. The synthesized copolymers were further functionalized with thiols via post-polymerization functionalization using a newly developed synthesis protocol or with a protected catechol molecule for hydrogel formation. For the formation of peptide-polymer conjugates, a cyclic thioester, namely thiolactone acrylamide and an azlactone precursor, whose synthesis was newly developed, were attached to the side chain of P(EtOx-co-ButEnOx) copolymers. 
The application of the functionalized thiol copolymers as hydrogels using thiol-ene chemistry for cross-linking was demonstrated. The swelling behavior and mechanical properties were characterized. The hydrophilicity of the network as well as the cross-linking density strongly influenced the swelling behavior and the mechanical strength of the hydrogels. All hydrogels showed good cell viability results. 
The hydrogel networks based on MeOx and EtOx were loaded with two dyes, fluorescein and methylene blue. It was observed that the uptake of the more hydrophilic dye fluorescein depended more on the ability of the hydrogel to swell. In contrast, the uptake of the more hydrophobic dye methylene blue was less dependent on the swelling degree, but much more on the hydrophilicity of the network.
For the potential application as cartilage glue, (biohybrid) hydrogels were synthesized based on the catechol-functionalized copolymers, with and without additional fibrinogen, using sodium periodate as the oxidizing agent. The system allowed for degradation due to the incorporated ester linkages at the cross-linking points. The swelling behavior as well as the mechanical properties were characterized. As expected, hydrogels with higher degrees of cross-linking showed less swelling and higher elastic modulus. The addition of fibrinogen however increased the elasticity of the network, which can be favorable for the intended application as a cartilage glue. Biological evaluation clearly demonstrated the advantage of degradable ester links in the hydrogel network, where chondrocytes were able to bridge the artificial gap in contrast to hydrogels without any ester motifs.
Lastly, different ways to form peptide-polymer conjugates were presented. Peptides were attached with the thiol of the terminal cysteine group to the vinyl side chain of P(EtOx-co-ButEnOx) copolymers by radical thiol-ene chemistry. Another approach was to use a cyclic thioester, thiolactone, or an azlactone functionality to bind a model peptide via native chemical ligation. The two latter named strategies to bind peptides to POx side chains are especially interesting as one and in the case of thiolactone two free thiols are still present at the binding site after the reaction, which can, for example, be used for further thiol-ene cross-linking to form POx hydrogels.
In summary, side functional poly(oxazoline) copolymers show great potential for numerous biomedical applications. The various side chain functionalities can be introduced by an appropriate monomer or by post-polymerization functionalization, as demonstrated. By their multi-functionality, hydrogel characteristics, such as cross-linking degree and mechanical strength, can be fine-tuned and adjusted depending on the application in the human body. In addition, the presented chemoselective and orthogonal reaction strategies can be used in the future to synthesize polymer conjugates, which can, for example, be used in drug delivery or in tissue regeneration.
N2  - Das Ziel der Arbeit war es, wasserlösliche Poly(2-oxazolin) (POx) Copolymere mit neuen Seitenkettenfunktionalitäten zu entwickeln, welche zur Synthese von Hydrogelen für biomedizinische Anwendungen und zur Entwicklung von Peptid-Polymer Konjugaten genutzt werden können. 
Zunächst wurden Copolymere aus den Monomeren MeOx oder EtOx mit ButEnOx und EtOx mit DecEnOx synthetisiert und anschließend charakterisiert. Die Monomere wurden statistisch miteinander copolymerisiert, indem sie zusammen zum Start der Reaktion in das Reaktionsgefäß gegeben wurden. Die Vinyl Funktionalität, die durch die Monomere ButEnOx und DecEnOx eingebracht wurde, kann später zur nachträglichen Funktionalisierung am Polymer verwendet werden. Die synthetisierten Copolymere wurden weiterhin mit Thiolen oder mit funktionellen Catecholgruppen ausgestattet, um Hydrogele herzustellen. 
Um Peptid-Polymer Konjugate zu bilden, wurden zyklische Thioester, genauer Thiolacton acrylamid und ein Azlacton Präkursor, dessen Synthese neu entwickelt wurde, an die Seitenkette von P(EtOx-co-ButEnOx) Copolymere angebunden. 
Im Folgenden wurde die Anwendung der thiol funktionalisierten Copolymere als Hydrogele, welche mittels radikalischer Thiol-ene Chemie vernetzt wurden, präsentiert. Das Quellverhalten und die mechanischen Eigenschaften wurden analysiert. Sowohl die Hydrophilie des Netzwerkes als auch die Vernetzungsdichte beeinflusste das Quellverhalten und die mechanische Festigkeit stark. Alle Hydrogele zeigten gute Zellverträglichkeit. Die Hydrogele basierend auf MeOx und EtOx wurden außerdem mit den Farbstoffen Fluorescein und Methylenblau beladen. Es wurde beobachtet, dass von den beiden Farbstoffen die Aufnahme des hydrophileren Farbstoffs Fluorescein stärker vom Quellungsgrad des Hydrogels abhing. Hingegen war die Aufnahme des hydrophoberen Farbstoffs Methylenblau weniger davon abhängig wie sehr das Hydrogel quellen konnte, sondern stärker von der Hydrophilie des Hydrogel-Netzwerkes. Um die potenzielle Anwendung als Knorpelkleber zu testen, wurden (biohybrid) Hydrogele basierend auf Catechol-funktionalisiertem Copolymeren mit und ohne zusätzliches Fibrinogen und dem Oxidationsmittel Natriumperiodat hergestellt. Das System war durch die eingebauten Ester Vernetzungspunkte abbaubar. Das Quellverhalten und die mechanischen Eigenschaften wurden charakterisiert. Wie zu erwarten, zeigten Hydrogele mit stärkerer Vernetzung eine geringe Quellung und einen höheren elastischen Modulus. Die Zugabe von Fibrinogen jedoch erhöhte die Elastizität des Netzwerkes, welches förderlich für die avisierte Anwendung als Knorpelkleber sein kann. Die biologische Auswertung zeigte, dass die Ester-haltigen, abbaubaren Vernetzungspunkte von großem Vorteil sind. Die Chondrozyten konnten ohne Probleme den Defektspalt überbrücken, was nicht möglich war, sobald keine Ester Funktionalitäten im Hydrogel eingebunden waren. 
Zuletzt wurden verschiedene Möglichkeiten Peptid-Polymer Konjugate zu synthetisieren präsentiert. Zum einen wurden Peptide mit der Thiolgruppe des endständigen Cysteins an die Vinyl Seitenkette der P(EtOx-co-ButEnOx) Copolymere mittels radikalischer Thiol-en Chemie angebunden. Des Weiteren wurde ein zyklischer Thioester, das Thiolacton, und eine Azlacton Funktionalität verwendet, um ein Modell Peptid mittels nativer chemischer Ligation zu binden. Die zwei zuletzt genannten Strategien, um Peptide an Polymere zu binden, sind besonders interessant, da hier ein beziehungsweise im Fall der Thiolacton Funktionalität zwei freie Thiole an der Bindungsstelle nach der Reaktion entstehen. Diese könnten genutzt werden, um zum Beispiel über Thiol-en Chemie Peptid-haltige Hydrogele herzustellen.
Zusammenfassend zeigen seitenkettenfunktionale Poly(oxazolin) Copolymere ein großes Potenzial für biomedizinische Anwendungen. Die vielen verschiedenen Seitenkettenfunktionalitäten können durch das passende Monomer oder durch Post-Polymerisationsfunktionalisierung eingebracht werden, wie in dieser Arbeit gezeigt. Durch ihre Multifunktionalität können Hydrogel Charakteristika, wie der Vernetzungsgrad und die mechanische Festigkeit, fein eingestellt und angepasst werden, je nach Anwendungsbereich im menschlichen Körper. Die entwickelten chemoselektiven und orthogonalen Reaktionswege können in der Zukunft genutzt werden, um Polymer Konjugate zu synthetisieren, welche zum Beispiel für das Drug Delivery oder im Bereich der Geweberegneration zum Einsatz kommen.
KW  - Polymere
KW  - Ringöffnungspolymerisation
KW  - Hydrogel
KW  - hydrogel
KW  - poly(2-oxazoline)s
KW  - ring-opening polymerization
KW  - polymer-peptide-conjugate
KW  - thiol-ene
KW  - Dihydrooxazole
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203960
ER  - 
TY  - THES
A1  - Tylek, Tina
T1  - Establishment of a Co-culture System of human Macrophages and hMSCs to Evaluate the Immunomodulatory Properties of Biomaterials
T1  - Etablierung eines Co-Kultur-Systems von humanen Makrophagen und hMSCs zur Bewertung der Immunmodulatorischen Eigenschaften von Biomaterialien
N2  - The outcome of the innate immune response to biomaterials mainly determines whether the material will be incorporated in the body to fulfill its desired function or, when it gets encapsulated, will be rejected in the worst case. Macrophages are key players in this process, and their polarization state with either pro- (M1), anti-inflammatory (M2), or intermediate characteristics is crucial for deciding on the biomaterial’s fate. While a transient initial pro-inflammatory state is helpful, a prolonged inflammation deteriorates the proper healing and subsequent regeneration. Therefore, biomaterial-based polarization may aid in driving macrophages in the desired direction. However, the in vivo process is highly complex, and a mono-culture of macrophages in vitro displays only one part of the cellular system, but, to this date, there is a lack of established co-cultures to assess the immune response to biomaterials. Thus, this thesis aimed to establish a functional co-culture system of human macrophages and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to improve the assessment of the immune response to biomaterials in vitro. Together with macrophages, hMSCs are involved in tissue regeneration and inflammatory reactions and can modulate the immune response. In particular, endogenously derived hMSCs considerably contribute to the successful engrafting of biomaterials. This thesis focused on poly(ε-caprolactone) (PCL) fiber-based scaffolds produced by the technique of melt electrowriting (MEW) as biomaterial constructs. Via this fabrication technique, uniform, precisely ordered scaffolds varying in geometry and pore size have been created in-house.
To determine the impact of scaffold geometries and pore sizes on macrophages, mono-cultures incubated on scaffolds were conducted. As a pre-requisite to achieve a functional co-culture system on scaffolds, setups for direct and indirect systems in 2D have initially been established. These setups were analyzed for the capability of cell-cell communication. In parallel, a co-culture medium suitable for both cell types was defined, prior to the establishment of a step-by-step procedure for the co-cultivation of human macrophages and hMSCs on fiber-based scaffolds. 

Regarding the scaffold morphologies tested within this thesis to improve M2-like polarization, box-shaped scaffolds outperformed triangular-, round- or disordered-shaped ones. Upon further investigation of scaffolds with box-shaped pores and precise inter-fiber spacing from 100 µm down to only 40 µm, decreasing pore sizes facilitated primary human macrophage elongation accompanied by their differentiation towards the M2 type, which was most pronounced for the smallest pore size of 40 µm. To the best of my knowledge, this was the first time that the elongation of human macrophages in a 3D environment has been correlated to their M2-like polarization. Thus, these results may set the stage for the design, the assessment, and the selection of new biomaterials, which can positively affect the tissue regeneration.

The cell communication of both cell types, detected via mitochondria exchange in direct and indirect co-cultures systems, took place in both directions, i.e., from hMSCs to macrophages and vice versa. Thereby, in direct co-culture, tunneling nanotubes enabled the transfer from one cell type to the respective other, while in indirect co-culture, a non-directional transfer through extracellular vesicles (EVs) released into the medium seemed likely. Moreover, the phagocytic activity of macrophages after 2D co-cultivation and hence immunomodulation by hMSCs increased with the highest phagocytic rate after 48 h being most pronounced in direct co-cultivation. 

As the commonly used serum supplements for macrophages and hMSCs, i.e., human serum (hS) and fetal calf serum (FCS), respectively, failed to support the respective other cell type during prolonged cultivation, these sera were replaced by human platelet lysate (hPL), which has been proven to be the optimal supplement for the co-cultivation of human macrophages with hMSCs within this thesis. Thereby, the phenotype of both cell types, the distribution of both cell populations, the phagocytic activity of macrophages, and the gene expression profiles were maintained and comparable to the respective standard mono-culture conditions. This was even true when hPL was applied without the anticoagulant heparin in all cultures with macrophages, and therefore, heparin was omitted for further experiments comprising hPL and macrophages.

Accordingly, a step-by-step operating procedure for the co-cultivation on fiber-based scaffolds has been established comprising the setup for 3D cultivation as well as the description of methods for the analysis of phenotypical and molecular changes upon contact with the biomaterial. The evaluation of the macrophage response depending on the cultivation with or without hMSCs and either on scaffolds or on plastic surfaces has been successfully achieved and confirmed the functionality of the suggested procedures. 

In conclusion, the functional co-culture system of human macrophages and hMSCs established here can now be employed to assess biomaterials in terms of the immune response in a more in vivo-related way. Moreover, specifically designed scaffolds used within the present thesis showed auspicious design criteria positively influencing the macrophage polarization towards the anti-inflammatory, pro-healing type and might be adaptable to other biomaterials in future approaches.
Hence, follow-up experiments should focus on the evaluation of the co-culture outcome on promising scaffolds, and the suggested operating procedures should be adjusted to further kinds of biomaterials, such as cements or hydrogels.
N2  - Der Verlauf der angeborene Immunantwort auf Biomaterialien bestimmt maßgebend, ob das Material vom Körper angenommen wird, um so seine gewünschte Funktion zu erfüllen, oder ob es zur Einkapselung und im schlimmsten Fall zur Abstoßung kommt. Makrophagen spielen in diesem Prozess eine Schlüsselrolle, und ihr Polarisationszustand, entweder pro (M1), antiinflammatorisch (M2) oder ein dazwischenliegender Subtyp, ist dabei von entscheidender Bedeutung. Während ein vorübergehender proinflammatorischer Anfangszustand hilfreich ist, verschlechtert eine anhaltende Entzündung eine zeitnahe Heilung und die anschließende Regeneration. Daher könnte eine durch Biomaterialien beeinflusste Polarisation hilfreich sein, um die Makrophagen in die gewünschte Richtung zu lenken. Die in vivo Reaktion ist jedoch äußerst komplex und die Kultivierung von Makrophagen in vitro stellt nur einen Teil des Prozesses dar. An etablierten Co-Kultursystem zur Untersuchung der immunmodulierenden Eigenschaften von Biomaterialien mangelt es jedoch. Daher war es Ziel dieser Arbeit ein funktionelles Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) zu etablieren um die in vitro Bewertung der Immunantwort nach Kontakt mit Biomaterialien zu verbessern. Von Interesse sind hMSCs hierbei, da sie zusammen mit Makrophagen an der Geweberegeneration und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Zudem weisen MSCs immunmodulierende Eigenschaften in Hinblick auf Makrophagen auf und sind aktiv am Verlauf der Fremdkörperreaktion nach der Transplantation von Biomaterial beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Poly(ε-caprolactone) (PCL)-Scaffolds auf Faserbasis als Biomaterialkonstrukte verwendet, welche mit der Technik des Melt Electrowriting (MEW) hergestellt wurden. Mit dieser Technik kann sowohl die Form der Scaffolds als auch die Porengröße variiert werden. 
Um Unterschiede der Scaffoldgeometrien und Porengrößen in Hinblick auf die Makrophagenreaktion zu untersuchen, wurden zunächst Versuche mit Makrophagen-Monokulturen durchgeführt. Zur Etablierung eines funktionellen Co-Kultursystem, wurde zu Beginn ein Aufbau für ein direktes und indirektes System in 2D erstellt. Dieser Aufbau wurde anschließend auf die Möglichkeit der Zell-Zell-Kommunikation darin analysiert. Weiterhin wurde ein, für beide Zelltypen, geeignetes Kulturmedium definiert, gefolgt von der Etablierung eines Protokoll für die Co-Kultivierung beider Zelltypen auf faserbasierten Scaffolds.

Im Bezug zu dieser Arbeit wurden Scaffolds mit unterschiedlicher Geometrie mittels der Technik des Melt Electrowriting hergestellt um die Veränderung der Makrophagenpolarisation zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine verstärkte M2-Polarisation auf Scaffolds mit einer kastenförmigen Morphologie, verglichen mit dreieckigen, runden oder ungeordnet-strukturierten Scaffolds. Die weitere Untersuchung von Scaffolds mit kastenförmigen Poren und präzisen Faserabständen von 100 µm bis zu 40 µm zeigte das kleinere Porengrößen die Elongation primärer menschlicher Makrophagen förderten. Begleitet wurde die verstärkte Elongation mit einer gesteigerten Polarisation in Richtung des M2 Typs. Dieser Effekt war nach Kultivierung von Makrophagen auf Scaffolds mit 40 µm Poren am stärksten ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit erstmals eine länglichen Morphologie humaner Makrophagen mit einer Polarisierung in den M2 Typ korreliert werden. Diese Ergebnisse könnten daher für das Design neuer Biomaterialien, welche sich positiv auf die Geweberegeneration auswirken sollen, von Bedeutung sein.

Die Zellkommunikation beider Zelltypen, welche über Mitochondrienaustausch im direkten und indirekten Co-Kultur-System nachgewiesen wurde, fand sowohl ausgehend von Makrophagen als auch von hMSCs statt. Dabei ermöglichten „Tunneling Nanotubes“ in der direkten Co-Kultur den Transfer von Mitochondrien von einem Zelltyp zum jeweils anderen, während in der indirekter Co-Kultur ein ungerichteter Transfer durch in das Medium freigesetzte extrazelluläre Vesikel (EVs) stattfand. Darüber hinaus wurde die phagozytotische Aktivität von Makrophagen nach Co-Kultivierung untersucht, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von hMSCs nachzuweisen, wobei die höchste phagozytotische Aktivität nach 48 stündiger Co-Kultivierung festgestellt wurde. 

Da die üblicherweise verwendeten Serumzusätze für Makrophagen (humanes Serum (hS)) und hMSCs (fötales Kälberserum (FCS)) bei längerer Kultivierung den jeweils anderen Zelltyp nicht unterstützen konnten, wurden diese Seren durch humanes Thrombozytenlysat (hPL) ersetzt. Dieses erwies sich im Rahmen dieser Arbeit als optimale Ergänzung für die gemeinsame Kultivierung beider Zelltypen in der Co-Kultur. Dabei wurden der Phänotyp und die Populationsverteilung beider Zelltypen, sowie die phagozytotische Aktivität und die Veränderung des Genexpressionsprofils von Makrophagen untersucht und mit den jeweiligen Standard-Monokulturbedingungen verglichen. Des Weiteren konnte gezeigt werde, dass eine Zugabe von Heparin in Zellkulturen mit Makrophagen und hPL nicht nötig ist. Daher wurde auf den Zusatz von Heparin für alle weitere Experimente, die hPL und Makrophagen umfassten, verzichtet. 

Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll für die Co-Kultivierung auf MEW Scaffolds erstellt. Neben der Etablierung eines Setups für die 3D-Kultivierung wurden sowohl Protokolle zur Bewertung phänotypischer als auch molekularer Veränderungen entwickelt. Durch Feststellung von Unterschieden in der Makrophagenreaktion in Abhängigkeit zu der Kultivierung mit / ohne hMSCs und entweder auf Scaffolds oder Plastik-Kulturschalen konnte die Funktionalität der Protokolle nachgewiesen werden.

Mit dem in dieser Arbeit etabliertem funktionellen Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und hMSCs können zukünftig Biomaterialien mit einem stärkeren in vivo -Bezug in Hinblick auf die Immunantwort bewertet werden. Darüber hinaus deuten Ergebnisse auf speziell konstruierte MEW-Scaffolds ein vielversprechendes Designkriterium für neu entwickelte Biomaterialien an, wobei die Polarisation der Makrophagen in Richtung des entzündungshemmenden, heilungsfördernden Typens durch eine gesteuerte Morphologieänderung beeinflusst werden kann.
An diese Arbeit anschließende Experimente sollten sich auf die Untersuchung vielversprechender Scaffolds mittels Co-Kultivierung sowie auf die Anpassung der etablierten Protokolle an andere Biomaterialgruppen, wie beispielsweiße für Zemente oder Hydrogele, konzentrieren.
KW  - Makrophage
KW  - Biomaterial
KW  - Co-culture system
KW  - Mesenchymal stromal cells
KW  - Macrophages
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203570
ER  - 
TY  - THES
A1  - Blum, Carina
T1  - A first step to an integral biointerface design for the early phase of regeneration
T1  - Ein erster Schritt zur Etablierung eines integralen biologischen Grenzflächendesigns für die frühe Phase der Regeneration
N2  - The implantation of any foreign material into the body automatically starts an immune reaction that serves as the first, mandatory step to regenerate tissue. The course of this initial immune reaction decides on the fate of the implant: either the biomaterial will be integrated into the host tissue to subsequently fulfill its intended function (e.g., tissue regeneration), or it will be repelled by fibrous encapsulation that determines the implant failure. Especially neutrophils and macrophages play major roles during this inflammatory response and hence mainly decide on the biomaterial's fate. For clinically relevant tissue engineering approaches, biomaterials may be designed in shape and morphology as well as in their surface functionality to improve the healing outcome, but also to trigger stem cell responses during the subsequent tissue regeneration phase. 
The main focus of this thesis was to unravel the influence of scaffold characteristics, including scaffold morphology and surface functionality, on primary human innate immune cells (neutrophils and macrophages) and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to assess their in vitro immune response and tissue regeneration capacity, respectively. The fiber-based constructs were produced either via melt electrowriting (MEW), when the precise control over scaffold morphology was required, or via solution electrospinning (ES), when the scaffold design could be neglected. All the fiber-based scaffolds used throughout this thesis were composed of the polymer poly(ε caprolactone) (PCL).
A novel strategy to model and alleviate the first direct cell contact of the immune system with a peptide-bioactived fibrous material was presented in chapter 3 by treating the material with human neutrophil elastase (HNE) to imitate the neutrophil attack. The main focus of this study was put on the effect of HNE towards an RGDS-based peptide that was immobilized on the surface of a fibrous material to improve subsequent L929 cell adhesion. The elastase efficiently degraded the peptide-functionality, as evidenced by a decreased L929 cell adhesion, since the peptide integrated a specific HNE-cleavage site (AAPV-motif). A sacrificial hydrogel coating based on primary oxidized hyaluronic acid (proxHA), which dissolved within a few days after the neutrophil attack, provided an optimal protection of the peptide-bioactivated fibrous mesh, i.e, the hydrogel alleviated the neutrophil attack and largely ensured the biomaterial's integrity. Thus, according to these results, a means to protect the biomaterial is required to overcome the neutrophil attack.
Chapter 4 was based on the advancement of melt electrowriting (MEW) to improve the printing resolution of MEW scaffolds in terms of minimal inter-fiber distances and a concomitant high stacking precision. Initially, to gain a better MEW understanding, the influence of several parameters, including spinneret diameter, applied pressure, and collector velocity on mechanical properties, crystallinity, fiber diameter and fiber surface morphology was analyzed. Afterward, innovative MEW designs (e.g., box-, triangle-, round , and wall-shaped scaffolds) have been established by pushing the printing parameters to their physical limits. Further, the inter-fiber distance within a standardized box-structured scaffold was successfully reduced to 40 µm, while simultaneously a high stacking precision was maintained. In collaboration with a co-worker of my department (Tina Tylek, who performed all cell-based experiments in this study), these novel MEW scaffolds have been proven to facilitate human monocyte-derived macrophage polarization towards the regenerative M2 type in an elongation-driven manner with a more pronounced effect with decreasing pore sizes. 
Finally, a pro-adipogenic platform for hMSCs was developed in chapter 5 using MEW scaffolds with immobilized, complex ECM proteins (e.g., human decellularized adipose tissue (DAT), laminin (LN), and fibronectin (FN)) to test for the adipogenic differentiation potential in vitro. Within this thesis, a special short-term adipogenic induction regime enabled to more thoroughly assess the intrinsic pro-adipogenic capacity of the composite biomaterials and prevented any possible masking by the commonly used long-term application of adipogenic differentiation reagents. The scaffolds with incorporated DAT consistently showed the highest adipogenic outcome and hence provided an adipo-inductive microenvironment for hMSCs, which holds great promise for applications in soft tissue regeneration.
Future studies should combine all three addressed projects in a more in vivo-related manner, comprising a co-cultivation setup of neutrophils, macrophages, and MSCs. The MEW-scaffold, particularly due to its ability to combine surface functionality and adjustable morphology, has been proven to be a successful approach for wound healing and paves the way for subsequent tissue regeneration.
N2  - Die Implantation eines Biomaterials löst stets eine Immunreaktion im Körper aus, die den ersten zwingenden Schritt zur Geweberegeneration darstellt. Der Verlauf dieser anfänglichen Immunreaktion entscheidet über das Schicksal des Implantats: Entweder wird das Biomaterial in das Wirtsgewebe integriert, um anschließend seine vorgesehene Funktion (z.B. Geweberegeneration) zu erfüllen, oder aber es findet eine Abstoßungsreaktion durch Einkapselung des Implantats statt. Insbesondere Neutrophile und Makrophagen spielen für die Immunantwort eine wichtige Rolle und entscheiden daher hauptsächlich über das Schicksal des Biomaterials. Für klinisch relevante Ansätze der Gewebezüchtung können Biomaterialien sowohl in ihrer Morphologie als auch in ihrer Oberflächenfunktionalität so gestaltet werden, dass sie zum einen die Wundheilung verbessern, zum anderen auch Stammzellreaktionen während der anschließenden Geweberegenerationsphase auslösen.
Der Fokus dieser Doktorarbeit lag auf der Beurteilung des Einflusses von Morphologie und Oberflächenfunktionalität fasriger Scaffolds auf die frühe Phase der Geweberegeneration. Insbesondere wurde die in vitro-Immunantwort von primären humanen Immunzellen (Neutrophile und Makrophagen) sowie die Geweberegenerationskapazität von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) untersucht. Die hierfür verwendeten faserbasierten Poly(ε-Caprolacton) (PCL) Scaffolds wurden entweder mittels Solution Electrospinning (ES) oder Melt Electrowriting (MEW) hergestellt. Während ES eine zufällig orientierte Faserablage zur Folge hat, erlaubt MEW eine präzise Kontrolle der Scaffold-Morphologie. 
Zunächst wurde eine neue Strategie zur Nachahmung und Abmilderung des ersten direkten Zellkontakts während der Immunreaktion vorgestellt. Dabei wurde die Interaktion zwischen Neutrophilen mit einem Peptid-bioaktivierten Fasermaterial untersucht (Kapitel 3), wobei der sog. Neutrophilen-Angriff mittels des Enzyms Neutrophilen Elastase (HNE) nachgeahmt wurde. Das an der Faseroberfläche immobilisierte CGGGAAPVGGRGDS-Peptid verfügte über eine spezifische HNE-Schnittstelle (AAPV-Motiv), an welcher die Elastase das Peptid effizient degradieren konnte. Das Degradationsverhalten des Enzyms wurde anschließend über L929 Zelladhärenz analysiert, welche über das RGDS-Motiv im Peptid vermittelt wurde. Im Rahmen der Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass der Neutrophilen-Angriff und die damit einhergehende Verringerung des RGDS-Motivs zu einer reduzierten Zelladhärenz führte. Die Einbettung des Scaffolds in ein Hydrogel auf der Basis von Aldehyd-haltiger Hyaluronsäure (proxHA) bot während des Neutrophilen-Angriffs einen optimalen Schutz der Peptidfunktionalität. Um diese wiederum anschließend für Adhäsionsversuche verfügbar zu machen, konnte das Hydrogelsystem derartig eingestellt werden, dass sich dieses innerhalb weniger Tage auflöste. Auf diese Weise konnte das Hydrogel den Neutrophilen-Angriff abmildern und so die Integrität des Biomaterials weitestgehend gewährleisten.
Kapitel 4 behandelt die Präzisierung der Faserablage, insbesondere die Verringerung des Faserabstands, während des MEW-Prozesses. Zunächst wurde der Einfluss verschiedener Parameter (Spinndüsendurchmesser, angelegter Luftdruck und Kollektorgeschwindigkeit) auf die mechanischen Eigenschaften, die Kristallinität, den Faserdurchmesser und die Faseroberflächenmorphologie analysiert. Durch Optimierung der Druckparameter konnten innovative MEW-Designs (u.a. mit runder Porengeometrie) gedruckt werden. Der Abstand zwischen den Fasern in einem Scaffold mit standardisierter kastenförmiger Porengeometrie wurde erfolgreich auf 40 µm reduziert, während gleichzeitig eine hohe Stapelpräzision gewährleistet wurde. In Zusammenarbeit mit einer Kollegin am Lehrstuhl (Tina Tylek, die alle zellbasierten Experimente in dieser Studie durchführte) wurde nachgewiesen, dass diese innovativen MEW-Scaffolds die Polarisierung menschlicher Makrophagen in Richtung des regenerativen M2-Typs förderten. Die Makrophagen-Polarisierung ging einher mit einer Zellelongation, wobei dieser Effekt verstärkt für kleinere Porengrößen auftrat.
Abschließend stand die Untersuchung der pro-adipogenen Wirkung von faserfunktionalisierten MEW-Scaffolds im Fokus (Kapitel 5), welche mit ECM-Proteinen, wie beispielsweise dezellularisiertes Fettgewebe (DAT), beschichtet wurden. Das pro-adipogene Potential dieser Materialien wurde mit Hilfe einer adipogenen Kurzzeitinduktion näher analysiert, da eine Langzeitapplikation der Differenzierungsreagenzien diesen Effekt überdeckte. Die Scaffolds mit der DAT-Beschichtung zeigten durchweg die höchste adipogene Differenzierung und boten somit für Stammzellen eine adipo-induzierende Mikroumgebung, weshalb sie für die Anwendung in der Weichgeweberegeneration sehr vielversprechend sind.
An diese Arbeit anschließende Experimente sollten alle drei Projekte in einem Co-Kulturansatz von Neutrophilen, Makrophagen und MSCs kombinieren, um so einen stärkeren in vivo-Bezug herzustellen. Hierfür erweist sich das MEW-Scaffold insbesondere durch seine Kombinationsfähigkeit der Oberflächenfunktionalität und Morphologie als Ansatz für einen erfolgreichen Wundheilungsprozess und ebnet damit den Weg für eine bestmögliche Geweberegeneration.
KW  - Scaffold <Tissue Engineering>
KW  - Biomaterial
KW  - tissue regeneration
KW  - melt electrowriting
KW  - Scaffold
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212117
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rödel, Michaela
T1  - Development of Dual Setting Cement Systems as Composite Biomaterials with Ductile Properties
T1  - Entwicklung dual härtender Zemente als Komposit-Biomaterialien mit duktilen Eigenschaften
N2  - Synthetic bone replacement materials have their application in non-load bearing defects with the function of (re-)construction or substitution of bone. This tissue itself represents a biological composite material based on mineralized collagen fibrils and combines the mechanical strength of the mineral with the ductility of the organic matrix. By mimicking these outstanding properties with polymer-cement-composites, an imitation of bone is feasible. A promising approach for such replacement materials are dual setting systems, which are generated by dissolution-precipitation reaction with cement setting in parallel to polymerization and gelation of the organic phase forming a coherent hydrogel network. Hereby, the high brittleness of the pure inorganic network was shifted to a more ductile and elastic behavior.
The aim of this thesis was focused on the development of different dual setting systems to modify pure calcium phosphate cements’ (CPCs’) mechanical performance by incorporation of a hydrogel matrix. 

A dual setting system based on hydroxyapatite (HA) and cross-linked 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) via radical polymerization was advanced by homogenous incorporation of a degradable cross-linker composed of poly(ethylene glycol) (PEG) as well as poly(lactic acid) (PLA) with reactive terminal methacrylate functionalities (PEG-PLLA-DMA). By integration of this high molecular weight structure in the HEMA-hydrogel network, a significant increase in energy absorption (toughness) under 4-point bending testing was observed. An addition of only 10 wt% hydrogel precursor (referred to the liquid phase) resulted in a duplication of stress over a period of 8 days. Additionally, the calculated elasticity was positively affected and up to six times higher compared to pure HA. With a constantly applied force during compressive strength testing, a deformation and thus strain levels of about 10 % were reached immediately after preparation. 

For higher degradability, the system was modified in a second approach regarding organic as well as inorganic phase. The latter component was changed by brushite forming cement that is resorbable in vivo due to solubility processes. This CPC was combined with a hydrogel based on PEG-PLLA-DMA and other dimethacrylated PEGs with different molecular weights and concentrations. Hereby, new reaction conditions were created including a shift to acidic conditions. On this ground, the challenge was to find a new radical initiator system. Suitable candidates were ascorbic acid and hydrogen peroxide. that started the polymerization and successful gelation in this environment. These highly flexible dual set composites showed a very high ductility with an overall low strength compared to HA-based models. After removal of the applied force during compressive strength testing, a complete shape recovery was observed for the samples containing the highest polymeric amount (50 wt%) of PEG-PLLA-DMA.
Regarding phase distribution in the constructs, a homogenously incorporated hydrogel network was demonstrated in a decalcifying study with ethylenediaminetetraacetic acid. Intact, coherent hydrogels remained after dissolution of the inorganic phase via calcium ion complexation. 

In a third approach, the synthetic hydrogel matrix of the previously described system was replaced by the natural biopolymer gelatin. Simultaneously to brushite formation, physical as well as chemical cross-linking by the compound genipin was performed in the dual setting materials. Thanks to the incorporation of gelatin, elasticity increased significantly, in which concentrations up to 10.0 w/v% resulted in a certain cohesion of samples after compressive strength testing. They did not dissociate in little pieces but remained intact cuboid specimens though having cracks or fissures. Furthermore, the drug release of two active pharmaceutical ingredients (vancomycin and rifampicin) was investigated over a time frame of 5 weeks. The release exponent was determined according to Korsmeyer-Peppas with n = 0.5 which corresponds to the drug liberation model of Higuchi. A sustained release was observed for the antibiotic vancomycin encapsulated in composites with a gelatin concentration of 10.0 w/v% and a powder-to-liquid ratio of 2.5 g/mL. 

With respect to these developments of different dual setting systems, three novel approaches were successfully established by polymerization of monomers and cross-linking of precursors forming an incorporated, homogenous hydrogel matrix in a calcium phosphate network. All studies showed an essential transfer of mechanical performance in direction of flexibility and bendability.
N2  - Synthetische Knochenersatzmaterialien finden ihre Anwendung im Bereich nicht lasttragender Defekte zum Wiederaufbau und Ersatz von defekter oder verlorener Knochensubstanz. Diese stellt aufgrund ihres Aufbaus aus mineralisierten Kollagen-Fibrillen selbst ein biologisches Komposit-Material dar, welches die mechanische Festigkeit des Minerals mit der Duktilität der organischen Matrix kombiniert. Eine Nachahmung dieser herausragenden Eigenschaften des Knochens wird im Sinne eines Ersatzmaterials durch geeignete Polymer-Zement-Komposite ermöglicht. Ein vielversprechender Ansatz für solche Komposite sind hierbei dual härtende Systeme, bei denen die Lösungs-Fällungs-Reaktion der Zementbildung parallel zur Polymerisation oder Gelierung der organischen Phase zu einem kohärenten Hydrogelnetzwerk abläuft. Die hohe Sprödigkeit und Bruchanfälligkeit rein anorganischer Netzwerke sollte dabei durch die Integration elastischer Polymerkomponenten hin zu mehr Flexibilität und Elastizität modifiziert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene dual härtende Hybrid-Materialien entwickelt, um etablierte Calciumphosphatzemente durch Einbringen von zusätzlicher Hydrogel-Matrizes bezüglich ihrer mechanischen Eigenschaften zu modifizieren. 

In ein dual härtendes System aus Hydroxylapatit (HA) und radikalisch vernetztem 2-Hydroxyethlymethacrylat (HEMA), wurde ein abbaubarer Cross-linker aus Polyethylenglykol (PEG) und Polymilchsäure (PLA)-Einheiten homogen inkorporiert, der mittels einer Reaktion der terminalen Methacrylatfunktionen (PEG-PLLA-DMA) zur Ausbildung der Vernetzungen führte und mittels PLLA hydrolytisch labile Esterbindungen ins System integrierte. Durch Einbringen dieser hochmolekularen Polymere in das engmaschige HEMA-Hydrogelnetzwerk kam es zu einer signifikanten Erhöhung der Energieaufnahme des Konstruktes unter 4-Punkt-Biegebelastung im Vergleich zum bereits etablierten System. Durch Zusatz von 10 Gew% hochmolekularem Hydrogel Präkursor (bezogen auf die flüssige Phase) konnte über einen Zeitraum von acht Tagen ein zweifach höherer Bruchwiderstand erhalten werden, verbunden mit einer bis zu sechsfach höheren Elastizität gegenüber reinem HA Zement. 

Zur Steigerung der Bioabbaubarkeit wurde in einem zweiten Ansatz durch Austausch der anorganischen Komponente mit einem in vivo leichter resorbierbaren Bruschit Zement das dual härtende System modifiziert. Dabei wurden dimethacrylierte PEGs verschiedener Molekulargewichte in unterschiedlichen Konzentrationen mit dem Zementpulver kombiniert. Die Reaktionsbedingungen im sauren Milieu erforderten den Austausch des radikalischen Initiator-Systems, wobei sich eine Kombination aus Ascorbinsäure und Wasserstoffperoxid als geeignet erwies. Die so erhaltenen dual härtenden Komposite zeigten eine sehr hohe Duktilität und Flexibilität bei insgesamt niedriger Festigkeit im Vergleich zu HA-basierenden Systemen. So fand im Druckversuch eine vollständige Relaxation zu den Ausgangsabmessungen des Prüfkörpers bei einem hohen Polymeranteil an PEG-PLLA-DMA (50 Gew%) statt.
Die homogene Verteilung der inkorporierten Polymerphase wurde mittels Decalcifizierung durch Ethylendiamintetraessigsäure bewiesen. Hierbei wurden durchgängige Hydrogele nach Herauslösen der anorganischen Phase durch Komplexierung von Calcium-Ionen erhalten. 

Abschließend wurde die auf synthetischen Polymeren basierende Hydrogel-Matrix durch das natürliche Biopolymer Gelatine ersetzt. Neben der Bruschit-bildenden Zement-Reaktion wurde das Polymernetzwerk sowohl durch eine physikalische Gelierung als auch eine chemische Vernetzung mit Genipin stabilisiert. Durch die zusätzliche organische Phase wurden die Eigenschaften des Zementes hinsichtlich Elastizität erhöht, wobei bei einer Gelatine-Konzentration von 10,0 Gew% eine erneute Kohäsion der Prüfkörper nach mechanischer Druckbelastung beobachtet werden konnte. Diese zerfielen nicht in einzelne Teile, sondern wurden trotz Auftreten von Rissen als weitestgehend intakte Quader zusammengehalten. Weiterhin wurde die Wirkstoff-Freisetzung zweier antibiotisch aktiver Substanzen (Vancomycin und Rifampicin) über einen Zeitraum von fünf Wochen untersucht. Mittels Bestimmung des Freisetzungsexponenten nach Korsmeyer-Peppas konnte eine verzögerte Wirkstoffliberation für das Antibiotikum Vancomycin gemäß Wurzel-t-Kinetik (Higuchi-Modell) mit n = 0,5 für ein Pulverflüssigkeitsverhältnis von 2,5 g/mL bei einer Gelatinekonzentration von 10,0 Gew% erhalten werden. 

Im Hinblick auf die Entwicklung verschiedener Formulierungen als dual härtende Systeme wurden in der vorliegenden Arbeit drei Varianten etabliert, die durch Polymerisation von Monomeren beziehungsweise Hydrogel-Präkursoren zu einer inkorporierten, homogenen Hydrogel-Matrix im Calciumphosphatnetzwerk führten. Bei allen Ansätzen wurde ein wesentlicher Transfer der mechanischen Eigenschaften in Richtung Flexibilität und Biegsamkeit erzielt.
KW  - Calciumphosphate
KW  - Knochenzement
KW  - Hydrogel
KW  - Dual setting system
KW  - Ceramic polymer composite
KW  - Calciumphosphatzemente
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182776
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wittmann, Katharina
T1  - Adipose Tissue Engineering - Development of Volume-Stable 3-Dimensional Constructs and Approaches Towards Effective Vascularization
T1  - Tissue Engineering von Fettgewebe - Generierung volumenstabiler 3-dimensionaler Fettgewebe-Konstrukte und Entwicklung effektiver Vaskularisierungsstrategien
N2  - Adipose tissue defects and related pathologies still represent major challenges in reconstructive surgery. Based on to the paradigm ‘replace with alike’, adipose tissue is considered the ideal substitute material for damaged soft tissue [1-3]. Yet the transfer of autologous fat, particularly larger volumes, is confined by deficient and unpredictable long term results, as well as considerable operative morbidity at the donor and recipient site [4-6], calling for innovative treatment options to improve patient care. 
With the aim to achieve complete regeneration of soft tissue defects, adipose tissue engineering holds great promise to provide functional, biologically active adipose tissue equivalents. Here, especially long-term maintenance of volume and shape, as well as sufficient vascularization of engineered adipose tissue represent critical and unresolved challenges [7-9]. For adipose tissue engineering approaches to be successful, it is thus essential to generate constructs that retain their initial volume in vivo, as well as to ensure their rapid vascularization to support cell survival and differentiation for full tissue regeneration [9,10]. Therefore, it was the ultimate goal of this thesis to develop volume-stable 3D adipose tissue constructs and to identify applicable strategies for sufficient vascularization of engineered constructs. The feasibility of the investigated approaches was verified by translation from in vitro to in vivo as a critical step for the advancement of potential regenerative therapies.

For the development of volume-stable constructs, the combination of two biomaterials with complementary properties was successfully implemented. In contrast to previous approaches in the field using mainly non-degradable solid structures for mechanical protection of developing adipose tissue [11-13], the combination of a cell-instructive hydrogel component with a biodegradable porous support structure of adequate texture was shown advantageous for the generation of volume-stable adipose tissue. Specifically, stable fibrin hydrogels previously developed in our group [14] served as cell carrier and supported the adipogenic development of adipose-derived stem cells (ASCs) as reflected by lipid accumulation and leptin secretion. Stable fibrin gels were thereby shown to be equally supportive of adipogenesis compared to commercial TissuCol hydrogels in vitro. Using ASCs as a safe source of autologous cells [15,16] added substantial practicability to the approach. To enhance the mechanical strength of the engineered constructs, porous biodegradable poly(ε caprolactone)-based polyurethane (PU) scaffolds were introduced as support structures and shown to exhibit adequately sized pores to host adipocytes as well as interconnectivity to allow coherent tissue formation and vascularization. Low wettability and impaired cell attachment indicated that PU scaffolds alone were insufficient in retaining cells within the pores, yet cytocompatibility and differentiation of ASCs were adequately demonstrated, rendering the PU scaffolds suitable as support structures for the generation of stable fibrin/PU composite constructs (Chapter 3). 
Volume-stable adipose tissue constructs were generated by seeding the pre-established stable fibrin/PU composites with ASCs. Investigation of size and weight in vitro revealed that composite constructs featured enhanced stability relative to stable fibrin gels alone. Comparing stable fibrin gels and TissuCol as hydrogel components, it was found that TissuCol gels were less resilient to degradation and contraction. Composite constructs were fully characterized, showing good cell viability of ASCs and strong adipogenic development as indicated by functional analysis via histological Oil Red O staining of lipid vacuoles, qRT-PCR analysis of prominent adipogenic markers (PPARγ, C/EBPα, GLUT4, aP2) and quantification of leptin secretion. In a pilot study in vivo, investigating the suitability of the constructs for transplantation, stable fibrin/PU composites provided with a vascular pedicle gave rise to areas of well-vascularized adipose tissue, contrasted by insufficient capillary formation and adipogenesis in constructs implanted without pedicle. The biomaterial combination of stable fibrin gels and porous biodegradable PU scaffolds was thereby shown highly suitable for the generation of volume-stable adipose tissue constructs in vivo, and in addition, the effectiveness of immediate vascularization upon implantation to support adipose tissue formation was demonstrated (Chapter 4).

Further pursuing the objective to investigate adequate vascularization strategies for engineered adipose tissue, hypoxic preconditioning was conducted as a possible approach for in vitro prevascularization. In 2D culture experiments, analysis on the cellular level illustrated that the adipogenic potential of ASCs was reduced under hypoxic conditions when applied in the differentiation phase, irrespective of the oxygen tension encountered by the cells during expansion. Hypoxic treatment of ASCs in 3D constructs prepared from stable fibrin gels similarly resulted in reduced adipogenesis, whereas endothelial CD31 expression as well as enhanced leptin and vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion indicated that hypoxic treatment indeed resulted in a pro-angiogenic response of ASCs. Especially the observed profound regulation of leptin production by hypoxia and the dual role of leptin as adipokine and angiogenic modulator were considered an interesting connection advocating further study. Having confirmed the hypothesis that hypoxia may generate a pro-angiogenic milieu inside ASC-seeded constructs, faster vessel ingrowth and improved vascularization as well as an enhanced tolerance of hypoxia-treated ASCs towards ischemic conditions upon implanatation may be expected, but remain to be verified in rodent models in vivo (Chapter 5).

Having previously been utilized for bone and cartilage engineering [17-19], as well as for revascularization and wound healing applications [20-22], stromal-vascular fraction (SVF) cells were investigated as a novel cell source for adipose tissue engineering. Providing cells with adipogenic differentiation as well as vascularization potential, the SVF was applied with the specific aim to promote adipogenesis and vascularization in engineered constructs in vivo. With only basic in vitro investigations by Lin et al. addressing the SVF for adipose repair to date [23], the present work thoroughly investigated SVF cells for adipose tissue construct generation in vitro, and in particular, pioneered the application of these cells for adipose tissue engineering in vivo.
Initial in vitro experiments compared SVF- and ASC-seeded stable fibrin constructs in different medium compositions employing preadipocyte (PGM-2) and endothelial cell culture medium (EGM-2). It was found that a 1:1 mixture of PGM-2 and EGM-2, as previously established for co-culture models of adipogenesis [24], efficiently maintained cells with adipogenic and endothelial potential in SVF-seeded constructs in short and long-term culture setups. Observations on the cellular level were supported by analysis of mRNA expression of characteristic adipogenic and endothelial markers. In preparation of the evaluation of SVF-seeded constructs under in vivo conditions, a whole mount staining (WMS) method, facilitating the 3D visualization of adipocytes and blood vessels, was successfully established and optimized using native adipose tissue as template (Chapter 6). 
In a subcutaneous nude mouse model, SVF cells were, for the first time in vivo, elucidated for their potential to support the functional assembly of vascularized adipose tissue. Investigating the effect of adipogenic precultivation of SVF-seeded stable fibrin constructs in vitro prior to implantation on the in vivo outcome, hormonal induction was shown beneficial in terms of adipocyte development, whereas a strong vascularization potential was observed when no adipogenic inducers were added. Via histological analysis, it was proven that the developed structures were of human origin and derived from the implanted cells. Applying SVF cells without precultivation in vitro but comparing two different fibrin carriers, namely stable fibrin and TissuCol gels, revealed that TissuCol profoundly supported adipose formation by SVF cells in vivo. This was contrasted by only minor SVF cell development and a strong reduction of cell numbers in stable fibrin gels implanted without precultivation. Histomorphometric analysis of adipocytes and capillary structures was conducted to verify the qualitative results, concluding that particularly SVF cells in TissuCol were highly suited for adipose regeneration in vivo. Employing the established WMS technique, the close interaction of mature adipocytes and blood vessels in TissuCol constructs was impressively shown and via species-specific human vimentin staining, the expected strong involvement of implanted SVF cells in the formation of coherent adipose tissue was confirmed (Chapter 7). 

With the development of biodegradable volume-stable adipose tissue constructs, the application of ASCs and SVF cells as two promising cell sources for functional adipose regeneration, as well as the thorough evaluation of strategies for construct vascularization in vitro and in vivo, this thesis provides valuable solutions to current challenges in adipose tissue engineering. The presented findings further open up new perspectives for innovative treatments to cure soft tissue defects and serve as a basis for directed approaches towards the generation of clinically applicable soft tissue substitutes.
N2  - In der rekonstruktiven Chirurgie besteht ein ständig wachsender Bedarf an geeigneten Implantaten, um Weichteildefekte nach Tumorresektionen, Traumata, oder aufgrund von kongenitalen Missbildungen adäquat ersetzen zu können [1]. Hierbei stellt körpereigenes Fettgewebe als Weichteilersatz das ideale Substitutionsmaterial dar [2-4]. Derzeit angewandte Wiederherstellungsmethoden verwenden frei transplantierbare und gestielte Lappenplastiken aus autologem Fettgewebe oder greifen auf künstliche Kollagen- und Silikonimplantate zurück [5]. Diese Ansätze sind jedoch zum Teil mit gravierenden Nachteilen behaftet, wie Absorption und Nekrotisierung bei transplantiertem körpereigenem Fettgewebe, sowie Fremdkörperreaktionen und fibrotischen Verkapselungen bei Kollagen und Silikon. Insbesondere die Versorgung großvolumiger Defekte ist mit komplexen chirurgischen Eingriffen verbunden und geht häufig mit Komplikationen wie Infektionen, Narbenbildung und Volumenverlust, sowie Defiziten an der Hebe- und Empfängerstelle einher [1,5-8]. Es besteht daher ein großer Bedarf an innovativen Methoden und der Entwicklung neuer Materialien, die einen dauerhaften körpereigenen Weichteilersatz ermöglichen. 
Das interdisziplinäre Feld des Tissue Engineerings von Fettgewebe zielt auf die Entwicklung neuer Ansätze zur Regeneration von Weichteildefekten und der Bereitstellung von biologisch äquivalentem Gewebeersatz, vor allem für die Rekonstruktion großvolumiger Defekte. Verringerte Volumenstabilität und unzureichende Blutgefäßversorgung stellen jedoch auch bei durch Tissue Engineering hergestelltem Gewebe zentrale Limitationen dar [5,8,9]. Für die erfolgreiche Substitution von Weichteildefekten mit Methoden des Tissue Engineerings ist es daher essenziell, Gewebekonstrukte mit ausreichender Volumenstabilität bereitzustellen, um auch nach Implantation in vivo langfristig zu bestehen, sowie eine adäquate Blutgefäßversorgung zu gewährleisten, um Zellüberleben und Differenzierung für eine vollständige Geweberegeneration zu garantieren [5,10]. 
Folglich war es Ziel dieser Arbeit, volumenstabile Fettgewebekonstrukte zu entwickeln und neue Strategien zur Vaskularisierung der generierten Konstrukte zu evaluieren. Als wichtiger Schritt in Bezug auf eine potenzielle klinische Anwendbarkeit wurden außerdem vielversprechende In-vitro-Ansätze auf den In-vivo-Kontext in etablierten Mausmodellen übertragen.
Für die Entwicklung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte wurde die Kombination zweier Biomaterialien mit komplementären Eigenschaften verfolgt. So wurden für die Konstruktherstellung Fibrinhydrogele als Zellträger mit hochporösen bioabbaubaren Scaffolds als mechanische Schutzstrukturen kombiniert. Im Gegensatz zu bisherigen Ansätzen zur Verbesserung der Volumenstabilität, in denen hauptsächlich nicht abbaubare, rigide Gerüst- oder Hohlkörperstrukturen zum mechanischen Schutz des entstehenden Gewebes appliziert wurden [11-13], wurden hier ausschließlich bioabbaubare und Gewebe kompatible Materialien verwendet. Dabei konnte auf bereits zuvor entwickelte stabile Fibringele [14] zurückgegriffen werden, die in dieser Arbeit erstmals für das Fettgewebe Engineering als Zellträger für mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells; ASCs) verwendet wurden. Mittels sich ergänzender Analysemethoden auf zellulärer (Oil Red O-Färbung) und molekularer Ebene (Leptin Sekretion; ELISA) konnte erfolgreich die adipogene Differenzierung der in den Fibringelen inkorporierten ASCs nachgewiesen werden. Im Vergleich zu kommerziell erhältlichem Fibrin (TissuCol, Baxter) zeigten ASCs in den stabilen Fibringelen eine mit TissuCol vergleichbare, gute adipogene Differenzierbarkeit. Durch die Verwendung von ASCs als sichere und autologe Zellquelle [15,16] für die Konstruktherstellung wurde zudem die potenzielle klinische Anwendbarkeit der generierten Zell-Biomaterial-Konstrukte erhöht.
Zur Verbesserung der Volumenstabilität wurden bioabbaubare Poly(ε caprolacton)-basierte Polyurethan-Scaffolds als zusätzliche Gerüststruktur evaluiert. Aufgrund ihrer hohen Porosität und Interkonnektivität stellten sich die Scaffolds als besonders geeignet für die Differenzierung von Adipozyten sowie für die Generierung von kohärentem Fettgewebe heraus. Bei direkter Besiedelung mit ASCs wiesen die PU-Scaffolds zwar eine geringe Zelladhäsion und inhomogene Zellverteilung auf, die adipogene Differenzierung der Zellen war jedoch nicht beeinträchtigt. Daraufhin wurde die Generierung von Fibrin/PU Kompositkonstrukten durch Kombination der PU-Scaffolds mit den zuvor untersuchten stabilen Fibringelen angestrebt (Kapitel 3).
Durch Zusammenführung der stabilen Fibringele als Zellträger für ASCs mit den PU Scaffolds als zusätzlicher Gerüststruktur konnten in folgenden Arbeiten erfolgreich homogene und mechanisch stabile Fettgewebekonstrukte hergestellt werden. Die detaillierte Evaluation von Größe und Gewicht zeigte, dass in den Kompositkonstrukten durch die zusätzliche poröse PU-Scaffoldstruktur eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu den stabilen Fibringelen als alleinigem Zellträger erreicht werden konnte. Der Vergleich der stabilen Fibringele mit TissuCol als Hydrogelkomponente zeigte, dass TissuCol-Gele unter In vitro Kulturbedingungen stärker kontrahierten und schneller abgebaut wurden. Die in den Kompositkonstrukten inkorporierten ASCs zeigten gute Viabilität sowie deutliche adipogene Differenzierung auf histologischer (Oil Red O-Färbung) als auch auf molekularer Ebene (qRT-PCR; ELISA). In einer In-vivo-Pilotstudie wurden die Kompositkonstrukte auf ihre Transplantierbarkeit hin überprüft und durch mikrochirurgische Insertion eines Durchflussgefäßes bei der Implantation unmittelbar vaskularisiert. In stabilen Fibrin/PU Konstrukten mit integriertem Gefäßstiel wurde so die Entwicklung von vaskularisiertem Fettgewebe im Vergleich zu ungestielten Konstrukten entschieden verbessert. Mittels der erfolgreichen In-vivo-Implantation der Kompositkonstrukte konnte die Anwendbarkeit der Biomaterialkombination aus stabilem Fibrin und porösen PU Scaffolds für die Generierung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte demonstriert und gleichzeitig der positive Effekt einer direkten Vaskularisierung durch Integration eines Gefäßstiels gezeigt werden (Kapitel 4).

Im Rahmen der weiteren Evaluation potenzieller Vaskularisierungsstrategien wurden im Anschluss Ansätze zur Prävaskularisierung in vitro untersucht. Hierbei stellte die hypoxische Vorkultur von mittels Tissue Engineering generierten Fettgewebekonstrukten einen möglichen Ansatz zur Schaffung eines pro-angiogenen, vaskularisierungsfördernden Milieus innerhalb der Konstrukte dar. Ebenso von Interesse waren in diesem Zusammenhang die Auswirkungen von Hypoxie auf die adipogene Differenzierung von ASCs. 
Erste Versuche im 2D-Kulturformat mit ASCs zeigten, dass das adipogene Potenzial der Zellen unter Hypoxie in der Differenzierungsphase stark vermindert war, wobei der während der Expansionsphase der Zellen bestehende Sauerstoffpartialdruck keinen Einfluss auf die Fettentwicklung hatte. Auch in 3D-Konstrukten basierend auf stabilen Fibringelen konnte eine verringerte adipogene Differenzierung von ASCs unter hypoxischer Kultur nachgewiesen werden, dabei wurden im Gegenzug endotheliale Marker (CD31) und pro angiogene Wachstumsfaktoren, wie z.B. vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), aber auch das Adipokin Leptin, stark hochreguliert. Insbesondere die deutliche Veränderung der Leptinsekretion unter hypoxischen Kulturbedingungen und die duale Rolle von Leptin als adipogener und pro-angiogener Faktor ergeben interessante Perspektiven für weiterführende Untersuchungen. Basierend auf den gezeigten Ergebnissen konnte insgesamt bestätigt werden, dass die hypoxische Vorkultur in vitro zur Entstehung eines pro angiogenen und potenziell vaskularisierungsfördernden Milieus beitragen kann. Es gilt nun in Folgestudien das Potenzial der hypoxischen Vorkultur zur Verbesserung der Vaskularisierung in vivo, sowie eine erhöhte Toleranz der implantierten Zellen gegenüber hypoxischen Bedingungen nach der Implantation in etablierten In-vivo-Mausmodellen zu verifizieren (Kapitel 5).

Ein weiterer Ansatz zur Generierung von vaskularisiertem Fettgewebe in vitro und in vivo wurde durch den Einsatz der stromalen-vaskulären Fraktion (SVF) als neue Zellquelle für das Fettgewebe-Engineering verfolgt. Bisher wurde die SVF hauptsächlich für das Tissue Engineering von Knochen- und Knorpelgewebe [17-19] oder für Vaskularisierungs- und Wundheilungsansätze [20-22] untersucht. In der SVF enthalten sind sowohl Fettvorläuferzellen als auch Endothelzellen, Perizyten, Fibroblasten und Immunzellen [8]. Durch Verwendung dieses heterogenen Zellgemisches sollte die simultane Entwicklung von Fettzellen und vaskulären Strukturen erreicht werden, und damit eine schnellere und effizientere Fettgewebeentwicklung in vivo. Da sich bisher nur eine In-vitro-Studie explizit dem Tissue Engineering von Fettgewebe mit SVF-Zellen widmet [23], wurden in dieser Arbeit SVF-besiedelte Fettgewebekonstrukte basierend auf Fibringelen als Zellträger zunächst umfassend in vitro charakterisiert und erstmals die Fettgewebeentwicklung der Zellen im Mausmodell in vivo untersucht.
In vorbereitenden In-vitro-Arbeiten wurden SVF-besiedelte stabile Fibringele mit den bisher verwendeten ASC-basierten Konstrukten verglichen. Dabei wurde zunächst die adipogene und endotheliale Differenzierbarkeit der SVF in unterschiedlichen Zellkulturmedien untersucht. Eine 1:1-Mischung aus Präadipozytenmedium (PGM-2) und Endothelzellmedium (EGM-2), die zuvor schon für Kokulturexperimente von ASCs und Endothelzellen verwendet worden war [24], stellte sich als besonders geeignet für die Kurz- und Langzeitkultur der SVF in stabilen Fibringelen heraus. Umfassende histologische Untersuchungen zeigten, dass mit Hilfe dieser Medienkomposition insbesondere das adipogene und endotheliale Differenzierungspotenzial der verschiedenen Zelltypen in der SVF innerhalb der generierten 3D-Konstrukte erhalten werden kann. Die auf zellulärer Ebene gewonnenen Erkenntnisse konnten mittels qRT-PCR-Analyse von adipogenen und endothelialen Markern (PPARγ, aP2, CD31) auf mRNA-Ebene bestätigt werden. Um in Zukunft die In-vivo-Untersuchung der generierten Fettgewebekonstrukte zu erleichtern, sowie eine strukturelle Analyse des Gewebeverbands und insbesondere die Interaktion von Adipozyten und Blutgefäßen zu ermöglichen, wurde zusätzlich eine 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining), zunächst unter Verwendung von nativem humanem Fettgewebe, etabliert (Kapitel 6).
In einer anschließenden umfassenden Studie in immundefizienten Nacktmäusen (NMRI Foxn1nu/Foxn1nu) wurden SVF-Zellen zum ersten Mal in vivo für das Engineering von vaskularisiertem Fettgewebe untersucht. Hierbei wurden sowohl der Effekt der In vitro Vorkultur der SVF-basierten Konstrukte als auch der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebeentwicklung in vivo evaluiert. Die adipogene Vorkultur der SVF-besiedelten Konstrukte in vitro über einen Zeitraum von 7 Tagen vor Implantation wirkte sich positiv auf die Fettdifferenzierung in vivo aus, wohingegen die Vorkultur unter nicht-induzierten Bedingungen ohne adipogene Induktion verstärkt zur Bildung von vaskulären Strukturen führte. Durch Spezies-spezifische Färbung gegen humanes Vimentin konnte gezeigt werden, dass die beobachteten Strukturen humanen Ursprungs waren und daher von den implantierten SVF-Zellen stammten. 
Der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebebildung in vivo wurde durch Besiedelung stabiler Fibringele und TissuCol-Gele mit SVF-Zellen verglichen. Die Konstrukte wurden ohne In-vitro-Vorkultur direkt nach der Herstellung implantiert. Hier zeigte sich in stabilen Fibringelen nach 4 Wochen in vivo keine nennenswerte Gewebeentwicklung, wobei auch der Anteil an humanen Zellen innerhalb der Konstrukte zum Zeitpunkt der Explantation stark verringert war. Im Gegensatz dazu konnte in TissuCol-Gelen die Entwicklung von kohärentem und maturem Fettgewebe nachgewiesen werden von dem große Teile humanen Ursprungs waren. Die histologischen Ergebnisse wurden mittels histomorphometrischer Quantifizierung von Adipozyten und Blutgefäßstrukturen verifiziert, wodurch das herausragende Potenzial der SVF für das Fettgewebe-Engineering in vivo nochmals verdeutlicht wurde. Unter Verwendung der zuvor etablierten 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining) konnten anschließend Adipozyten und Blutgefäße innerhalb des entstandenen kohärenten Gewebeverbands in TissuCol-Gelen visualisiert werden. Mit Hilfe einer humanspezifischen Färbung in 3D konnte zusätzlich die weitreichende Beteiligung der implantierten SVF Zellen bei der Gewebeentwicklung nachgewiesen werden (Kapitel 7).

Die in der Dissertation entwickelten bioabbaubaren volumenstabilen Fettgewebekonstrukte, die Untersuchung von ASCs und SVF-Zellen als vielversprechende regenerative Zellquellen für die Generierung funktioneller Konstrukte, sowie die Evaluation unterschiedlicher Vaskularisierungsstrategien in vitro und in vivo leisten einen wichtigen Beitrag zu neuen und innovativen Ansätzen im Bereich des Tissue Engineerings von Fettgewebe. Die Ergebnisse stellen eine Grundlage für die zielgerichtete Entwicklung regenerativer Implantate dar und eröffnen neue Perspektiven für die Generierung klinisch anwendbarer Fettgewebekonstrukte als Weichteilersatz.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Fettgewebe
KW  - Tissue Engineering
KW  - Adipose Tissue
KW  - Vascularization
KW  - Fibrin
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107196
ER  - 
TY  - THES
A1  - Spatz, Kerstin
T1  - Mechanische und rheologische Eigenschaften von Calciumphosphat-Zementen
T1  - Mechanical and rheological properties of calcium phosphate cements
N2  - Zur Erhöhung der mechanischen Stabilität mineralischer Knochenzemente aus Calciumorthophosphaten (CPC) wurde in einem TTCP/DCPA-System das Zementedukt TTCP mit verschiedenen biokompatiblen Oxiden (SiO2, TiO2, ZrO2) während des Herstellungsprozesses dotiert. Dies führte zur Bildung von Calciummetallaten und einer Herabsetzung der Löslichkeit der TTCP-Komponente des Zements. Gegenüber einem oxidfreien Zement konnte die Druckfestigkeit von 65 MPa auf 80 MPa (SiO2) bzw. 100 MPa (TiO2) gesteigert werden. 

In einem zweiten Ansatz zur Verbesserung der Injizierbarkeit wurden die Wechselwirkungen der Partikeloberflächen mit der flüssigen Zementphase betrachtet. Durch biokompatible Additive sollte eine repulsive elektrostatische Wechselwirkung eingestellt werden, um Partikelagglomerate effektiv zu dispergieren und eine verflüssigende Wirkung zu erreichen. Die Injizierbarkeit eines TTCP/DCPA-Zements durch eine Kanüle mit 800 µm Durchmesser konnte durch die Verwendung von 500 mM tri-Natriumzitrat-Lösung aufgrund einer deutlichen Herabsetzung der Viskosität der Zementpaste signifikant gesteigert werden (>95%, P/L 3,3/1, Kraftaufwand 20 N).

Abschließend wurde der Einfluss der Partikelgrößenverteilung auf die Festigkeit und Injizierbarkeit einer auf monomodaler Partikelgrößenverteilung basierten Zementmatrix untersucht. Hierzu wurden einem mechanisch aktivierten a-TCP-System unreaktive, feinkörnige Füllstoffpopulationen (TiO2, CaHPO4, CaCO3) zugesetzt und systematisch deren Effekt in Verbindung mit einer Partikelaufladung durch tri-Natriumzitrat auf die rheologischen und mechanischen Eigenschaften untersucht.

Erst die Kombination einer bimodalen Partikelgrößenverteilung mit tri-Natriumzitrat-Lösung führte zu einer starken Erniedrigung der Viskosität, damit zur nahezu vollständigen Injizierbarkeit der Zemente und einer teilweise signifikanten Steigerung der mechanischen Festigkeiten (z.B. 72 MPa reiner a-TCP-Zement auf 142 MPa mit Zusatz von CaHPO4).
N2  - An improvement of the mechanical strength of calcium phosphate bone cements in combination with a lower cement paste viscosity for better injectability was investigated.
A first approach to improve the mechanical stability consisted in adding several biocompatible oxides (SiO2, TiO2, ZrO2) during the fabrication process of tetracalcium phosphate (TTCP). The formation of calcium metallates led to a decrease of the solubility of the oxide doped tetracalcium phosphates. The cements based on tetracalcium phosphates mixed with SiO2 and TiO2 exhibit a significant increase of the compressive strengths (65 MPa of pure cement up to 80 MPa (SiO2) and 100 MPa (TiO2)). 

A second approach to decrease the viscosity of CPC pastes considered the interactions between the particle surfaces and the liquid cement phase. To disperse agglomerates and improve the injection properties of CPC, biocompatible components were added to the liquid phase. As a result the injection properties of the TTCP/DCPA cement improved significantly. The use of 500 mM trisodium citrate solution as liquid phase changed the viscosity of the cement paste to a point, where complete injectability (> 95%) through an 800 mm diameter hypodermic needle could be achieved at low loads (20 N).

In order to transfer the results of a multi-constituent cement to a single reactive component cement, different fine-particle-sized fillers were added to mechanically activated, monomodal α-tricalcium phosphate (α-TCP) cement. The inert fillers dicalcium phosphate anhydrous (DCPA), titanium dioxide (TiO2) and calcium carbonate (CC) were added to the α-TCP-matrix in different concentrations.  For an effective ionic modification a 500 mM trisodium citrate solution was used as liquid phase as in the aforementioned TTCP/DCPA cement system. 

Only the combination of a bimodal particle size distribution and trisodium citrate solution led to a nearly complete injectability and a significantly increase of the mechanical stability of CPC.
KW  - Biomaterial
KW  - Knochenzement
KW  - Calciumphosphate
KW  - Implantatwerkstoff
KW  - Rheologie
KW  - Calciumphosphat
KW  - calcium phosphate
KW  - injectability
KW  - zetapotential
KW  - mechanical properties
KW  - tricalcium phosphate
KW  - Rheologie
KW  - Zetapotential
KW  - mechanische Eigenschaften
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124860
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kuhlmann, Matthias
T1  - Sulfur-functional polymers for biomedical applications
T1  - Schwefel-funktionale Polymere für biomedizinische Anwendungen
N2  - Aim of this thesis was to combine the versatility of sulfur-chemistry, regarding redox-sensitivity as well as chemo- and site-specific conjugation, with multifunctionality of poly(glycidol)s as an alternative to poly(ethylene glycol). 
First the homo- and copolymerizations of EEGE and AGE were performed with respect to molar-mass distribution and reaction kinetics. A detailed study was given, varying the polymerization parameters such as DP, counter ion, solvent and monomer influence. It can be concluded that in general the rates for all polymerizations are higher using K+, in contrast to Cs+, as counter ion for the active alkoxide species. Unfortunately, K+ as counter ion commonly leads to a reduced control over polymer dispersity. In this thesis it was shown that the broad molar-mass distributions might be reduced by adding the monomer in a step-wise manner. In experiments with a syringe pump, for continuously adding the monomer, a significant reduction of the dispersities could be found using K+ as counter ion. 
In analogy to the oxyanionic polymerization of epoxides, the polymerization of episulfides via a thioanionic mechanism with various DPs was successful with thiols/DBU as initiator. In most experiments bimodality could be observed due to the dimerization, caused by oxidation processes by introduced oxygen during synthesis. Reducing this was successful by modifying the degassing procedure, e.g. repeated degassing cycles after each step, i.e. initiation, monomer addition and quenching. Unfortunately, it was not always possible to completely avoid the dimerization due to oxidation. Thiophenol, butanethiol, mercaptoethanol and dithiothreitol were used as thiol initiators, all being capable to initiate the polymerization. With the prediction and the narrow molar-mass distributions, the living character of the polymerization is therefore indicated. 
Homo- and copolymers of poly(glycidol) were used to functionalize these polymers with side-chains bearing amines, thiols, carboxylic acids and cysteines. The cysteine side-chains were obtained using a newly synthesized thiol-functional thiazolidine. For this, cysteine was protected using a condensation reaction with acetone yielding a dimethyl-substituted thiazolidine. Protection of the ring-amine was obtained via a mixed-anhydride route using formic acid and acetic anhydride. The carboxylic acid of 2,2-dimethylthiazolidine-4-carboxylic acid was activated with CDI and cysteamine attached. The obtained crystalline mercaptothiazolidine was subjected to thiol-ene click chemistry with allyl-functional poly(glycidol). A systematic comparison of thermal- versus photo-initiation showed a much higher yield and reaction rate for the UV-light mediated thiol-ene synthesis with DMPA as photo-initiator. Hydrolysis of the protected thiazolidine-functionalities was obtained upon heating the samples for 5 d at 70 °C in 0.1 M HCl. Dialysis against acetic acid lead to cysteine-functional poly(glycidol)s, storable as the acetate salt even under non-inert atmosphere. An oxidative TNBSA assay was developed to quantify the cysteine-content without the influence of the thiol-functionality. A cooperation partner coupled C-terminal thioester peptides with the cysteine-functional poly(glycidol)s and showed the good accessibility and reactivity of the cysteines along the backbone. SDS-PAGE, HPLC and MALDI-ToF measurements confirmed the successful coupling.
N2  - Ziel der Arbeit war es die Vielseitigkeit der Schwefelchemie, hinsichtlich der Redoxsensitivität und chemo- und seitenspezifischer Konjugation, mit der Funktionalisierbarkeit von Poly(glycidol)en, als multifunktionale PEG-Alternative zu kombinieren. 
Zunächst wurden die Homo- und Copolymerisationen von EEGE und AGE hinsichtlich der Molmassenverteilung und der Reaktionskinetik untersucht. Durch die Variation der Polymerisationsparameter, wie angestrebter Polymerisationsgrad, Gegenion, Lösungsmittel und Monomer, wurde der Einfluss dieser untersucht. Allgemein konnte gezeigt werden, dass die Polymerisationen schneller ablaufen, wenn K+, im Gegensatz zu Cs+, als Gegenion zum aktiven Alkoxidkettenende verwendet wird. Nachteilig bei der Verwendung von K+ als Gegenion ist der Kontrollverlust der Polymerisation, welcher mit einer Erhöhung  der Dispersität einhergeht. Es konnte gezeigt werden, dass die Breite der Molmassenverteilung durch die Geschwindigkeit der Monomerzugabe kontrolliert werden kann. Tatsächlich konnte die Dispersität durch die Verwendung einer Spritzenpumpe verbessert werden, da das Monomer mit einer konstanten angepassten Flussrate hinzugefügt wurde. 
Analog zur oxyanionischen Polymerisation von Epoxiden, war die Polymerisation von Episulfiden mittels thioanionischer Polymerisation ebenfalls möglich. Hierzu wurden verschiedene Polymerisationsgrade von EETGE und ATGE angestrebt und mittels Thiol/DBU als Initiator auch erreicht. In den meisten Fällen war jedoch eine Dimerisierung der Polymere zu beobachten, welche durch die Oxidation der aktiven Thiolatspezies verursacht wurde. Eine Möglichkeit zur Dimerisierungsunterdrückung war die wiederholte Durchführung von Entgasungszyklen nach jedem Arbeitsschritt, z.B. nach Zugabe des Initiators, des Monomers oder nach dem Quenchen. Trotz dieses experimentellen Aufwandes konnte nicht immer ein vollständiger Ausschluss der Dimerisierung erreicht werden. Thiophenol, Butanthiol, Mercaptoethanol und Dithiothreitol wurden als Thiolinitiatoren (in Kombination mit DBU) verwendet und waren alle in der Lage die Polymerisation zu starten. Die Kontrolle des Polymerisationsgrades und die enge Molmassenverteilung der Polymere verdeutlichen, dass die thioanionische Polymerisation ebenfalls lebend verläuft. 
Glycidol Homo- und Copolymere wurden verwendet und die Seitenketten mit Amin-, Thiol-, Carbonsäure- und Cysteingruppen funktionalisiert. Die Cysteinseitenketten wurden durch ein neues thiolfunktionales Thiazolidin erhalten. Ausgehend von Cystein und Aceton wurde zunächst das Dimethyl-substituierte Thiazolidin erhalten, welches daraufhin am Ring-Amin mit Essigsäureanhydrid und Ameisensäure formyliert wurde. Die Carbonsäurefunktion des Thiazolidins wurde mittels CDI aktiviert und anschließend mit Cysteamin umgesetzt. Hierbei bildete sich das niedermolekulare kristalline thiolfunktionale Thiazolidin, welches mittels Thiol-En-Click Chemie an allyl-funktionales Poly(glycidol) geknüpft werden konnte. Eine systematische Untersuchungen der thermischen und UV-induzierten Thiol-En-Click Chemie zeigte, dass wesentlich höhere Umsätze und Geschwindigkeiten bei der photoinduzierten Reaktion erhalten werden. Mittels 0.1 M HCl konnte bei 70 °C innerhalb von 5 d die Hydrolyse der Thiazolidine im Anschluss erreicht werden. Nach der anschließenden Dialyse der Polymere gegen 0.1 M Essigsäure wurde erfolgreich das Acetatsalz der cysteine-funktionalen Poly(glycidol)e erhalten. Diese waren hinsichtlich der Thioloxidation unter atmosphärischen Bedingungen stabil. Ein oxidativer TNSBA-Assay wurde entwickelt, um die Menge der Cysteine zu quantifizieren und gleichzeitig den störenden Einfluss der Thiole zu unterbinden. Ein Kooperationspartner setzte die cysteinfunktionalisierten Poly(glycidol)e mit C-terminalen Thioestern um und konnte die gute Zugänglichkeit und Aktivität der Cysteine entlang des Polymerrückgrats nachweisen. SDS-PAGE, HPLC und MALDI-ToF Messungen bestätigten die erfolgreiche Konjugation im Anschluss.
KW  - Polymer
KW  - Thiol-Ene-Click-Chemie
KW  - Cystein
KW  - Organische Sulfide
KW  - Native Chemical Ligation
KW  - Polyglycidol
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119832
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heise, Kathrin Leonie
T1  - Charakterisierung eines 3D-Mikrotumormodells zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Interaktionen
T1  - Characterization of a 3D microtumor model for the investigation of tumor-stroma interactions
N2  - Tumorzellen, Stromazellen, Extrazellulärmatrix (EZM) und lösliche Faktoren in der Tumormikroumgebung beeinflussen und verstärken sich gegenseitig in der Ausbildung eines malignen Phänotyps. Sowohl die fibrotische EZM als auch eine kleine Subpopulation von pluripotenten Tumorstammzellen sind bekanntermaßen für die Steigerung der Tumoraggressivität verantwortlich. Inwiefern diese beiden unabhängigen Faktoren im Kontext von Brustkrebs miteinander in Beziehung stehen, ist jedoch bis heute unklar.
Um untersuchen zu können, welchen Beitrag Tumorzellen, Stromazellen, EZM und lösliche Faktoren einzeln und im Zusammenspiel zur Malignität eines Tumors leisten, ist die Entwicklung geeigneter in-vitro-Modelle unabdingbar. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, ein 3D-Mikrotumormodell zu generieren, in dem eine Analyse dieser genannten Faktoren stattfinden könnte. An diesem Modell wurden darüber hinaus erste Untersuchungen von im Tumorkontext bekannten EZM-Proteinen durchgeführt. Um die dreidimensionale Anordnung von Tumorzellen und ihrer Gewebeumgebung adäquat wiedergeben zu können, beinhalteten die 3D-Tumorsphäroide sowohl Brustkrebszellen (MDA-MB-231) als auch Stromazellen (hASCs).
Die EZM als wichtiger Bestandteil der (Tumor-) Mikroumgebung sollte übersichtshalber durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung und detaillierter durch immunhistochemische Analyse nach zwei verschiedenen Kulturzeitpunkten charakterisiert werden, um EZM-Veränderungen im zeitlichen Verlauf darzustellen. Im Fokus der Analyse standen die beiden wichtigsten profibrotischen EZM-Proteine Fibronektin und Kollagen I, die maßgeblich an der Pathogenese von Brustkrebs beteiligt sind. Zudem wurde das Vorkommen des Myofibroblastenmarkers α-SMA untersucht.
An den Sphäroiden einer Kontrollgruppe, die lediglich hASCs beinhaltete, sollte vergleichend eine Analyse der genannten EZM-Proteine sowie α-SMA durchgeführt werden. Um schließlich den Einfluss der von Tumorzellen sezernierten löslichen Faktoren in der Tumormikroumgebung herauszustellen, wurden Sphäroide aus hASCs in tumorkonditioniertem Medium gezüchtet und darin ebenfalls Matrixproteine und α-SMA untersucht. 
Abschließend erfolgte eine Korrelation der EZM-Analyse mit dem Vorhandensein von Tumorstammzellen in den 3D-Tumorsphäroiden. Dafür wurden die Tumorstammzellen mithilfe eines GFP-basierten Reporters für den Stammzellmarker NANOG (NANOG-GFP-Reporterzelllinie) in mikroskopischen Aufnahmen der 3D-Tumorsphäroide nachgewiesen und im Kontext mit der EZM lokalisiert.
N2  - Tumor cells, stromal cells, extracellular matrix (ECM), and soluble factors in the tumor microenvironment interact and potentiate mutually in the evolution of the malignant phenotype. Both fibrotic ECM as well as a small subpopulation of pluripotent tumor stem cells are well-known to enhance tumor aggressiveness. To what extend these independent factors interact with each other in the context of breast cancer is, however, unknown.
In order to investigate in what ways tumor cells, stromal cells, ECM, and soluble factors enhance malignancy individually or in combination it is necessary to establish suitable in vitro models. Thus, the objective of this work was to generate a 3D microtumor model that could allow an analysis of these factors. Furthermore, initial investigations were made on those ECM proteins that are known for their significant role in tumors. To capture and reflect the three-dimensional structure of tumor cells and their microenvironment adequately the 3D tumor spheroids were produced from both breast cancer cells (MDA-MB-231) and from stromal cells (hASCs).
The ECM being a pivotal component of the (tumor-) microenvironment was characterized by haematoxylin and eosin staining and more detailed by immunohistochemical analysis after two different culturing periods to outline the ECM alterations in the course of time. The focus was on the two most important profibrotic ECM proteins, fibronectin and collagen I, which are substantially involved in the pathogenesis of breast cancer. Furthermore, we evaluated the occurrence of the myofibroblastic marker α-SMA.
With the help of spheroids of a control group containing solely hASCs we processed a comparative analysis of the above-mentioned ECM proteins as well as α-SMA. In order to expose the influence of soluble factors secreted by tumor cells in the tumor microenvironment we furthermore produced spheroids in tumor conditioned medium and again analyzed the matrix proteins and α-SMA.
Finally, we investigated the correlation of ECM analysis with the occurrence of tumor stem cells in our 3D tumor spheroids. With the help of a GFP-based reporter cell line for the stem cell marker NANOG, we detected tumor stem cells and observed them being co-localized with ECM proteins in microscopic images.
KW  - Brustkrebs
KW  - Tumormicroenvironment
KW  - Tumorstammzellen
KW  - in-vitro-Modell
KW  - Mikrotumormodell
KW  - Extrazellulärmatrix
KW  - Co-Kultur
KW  - NANOG
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-215347
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ryma, Matthias
T1  - Exploiting the Thermoresponsive Properties of Poly(2-oxazoline)s for Biofabrication
T1  - Anwendung der Thermoresponsivität von Poly(2-oxazolin) für die Biofabrikation
N2  - In this thesis, non-modified POx, namely PnPrOx and PcycloPrOx, with an LCST in the physiological range between 20 and 37°C have been utilized as materials for three different biofabrication approaches. Their thermoresponsive behavior and processability were exploited to establish an easy-to-apply coating for cell sheet engineering, a novel method to create biomimetic scaffolds based on aligned fibrils via Melt Electrowriting (MEW) and the application of melt electrowritten sacrificial scaffolds for microchannel creation for hydrogels. 
Chapter 3 describes the establishment of a thermoresponsive coating for tissue culture plates. Here, PnPrOx was simply dissolved in water and dried in well plates and petri dishes in an oven. PnPrOx adsorbed to the surface, and the addition of warm media generated a cell culture compatible coating. It was shown that different cell types were able to attach and proliferate. After confluency, temperature reduction led to the detachment of cell sheets. Compared to standard procedures for surface coating, the thermoresponsive polymer is not bound covalently to the surface and therefore does not require specialized equipment and chemical knowledge. However, it should be noted that the detachment of the cell layer requires the dissolution of the PnPrOx-coating, leading to possible polymer contamination. Although it is only a small amount of polymer dissolved in the media, the detached cell sheets need to be washed by media exchange for further processing if required. ...
N2  - In dieser Dissertation wurden die unmodifizierten Poly(2-oxazoline) PnPrOx und PcycloProx, welche eine LCST im physiologischen Bereich zwischen 20 und 37°C aufweisen, für drei verschiedene Biofabrikationsansätze verwendet. Deren Thermoresponsivität und Prozessierbarkeit wurde genutzt, um ein simples Beschichten von Oberflächen für Cell Sheet Engineering, eine neue Methode zur Herstellung biomimetischer Gerüststrukturen basierend auf der Generierung von Fibrillenbündeln via Melt Electrowriting und die Anwendung als Opferstrukturen zur Generierung von Mikrokanälen in Hydrogelen zu etablieren.
KW  - Thermoresponsive Polymere
KW  - Dihydrooxazole
KW  - 3D-Druck
KW  - Melt Electrowriting
KW  - Biofabrikation
KW  - Poly(2-oxazoline)
KW  - Cell Sheet Engineering
KW  - Vaskularisation
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-247462
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bleuel, Gabriel
T1  - Entwicklung und Validierung eines quantitativen Verfahrens zur Beurteilung der Viabilität von entsprechend der GMP-Richtlinien hergestellter Knorpelimplantate für das Knie
T1  - Development and validation of a quantitative assay for a viability test of cultivated knee cartilage implants
N2  - Due to the reversing age pyramid in Germany, more and more people are already suffering from joint cartilage damage. But not only age, but also accidents and sports injuries and being overweight can lead to irreversible cartilage defects. Although there are various treatment options, the previous methods cannot be considered a permanent cure. As part of the international research project BIO-CHIP, a promising treatment method with novel drugs was to be investigated.
The patient's own cartilage cells from the nose serve as the starting material for the drug, a manufactured cartilage implant. These are isolated, multiplied and ultimately cultivated on a matrix to form a cartilage implant. In addition to toxicological and biological safety tests, an essential prerequisite for the approval of the implant is the assessment of the viability. This was previously carried out on the basis of histology from the pathology department.
The aim of the present work was the development and validation of a standardized and objective viability test for the chondrocytes within the cartilage matrix. For this, the LDH was used as a marker for irreversibly damaged cells. The LDH concentration could be measured with the CyQuant LDH assay by measuring the absorption. It could be proven that LDH has the required stability and detectability in the medium. With the help of the lysis, of cultivated mini-cartilage implants, the maximum achievable LDH concentrations could be determined. A calibration curve was generated using these concentrations. This serves to assess the viability of future measured absorptions of the supernatant medium.
The developed method does not require any invasive interventions on the implant and is characterized by its simple implementation, since only the protrusion has to be measured. The validation of the method certified a high level of robustness, linearity, accuracy and precision.
N2  - Aufgrund der sich umkehrenden Alterspyramide in Deutschland leiden bereits jetzt immer mehr Menschen an Gelenkknorpelschäden. Doch nicht nur das Alter, sondern auch Unfälle und Sportverletzungen und Übergewicht können zu irreversiblen Knorpeldefekten führen. Obwohl es diverse Behandlungsmöglichkeiten gibt, können die bisherige Methoden nicht als dauerhafte Heilung betrachtet werden. Im Rahmen des internationalen Forschungsprojektes BIO-CHIP sollte eine vielsprechende Behandlungsmethode mit neuartigen Arzneimitteln untersucht werden.
Als Ausgangsmaterial des Arzneimittels, ein hergestelltes Knorpelimplantat, dienen patienteneigene Knorpelzellen aus der Nase. Diese werden isoliert, vermehrt und letztlich auf einer Matrix zu einem Knorpelimplantat kultiviert. Wesentliche Voraussetzung für die Implantatfreigabe stellt neben toxikologischen und biologischen Unbedenklichkeitstests die Beurteilung der Viabilität dar. Diese wurde bisher anhand von Histologieschnitten von der Pathologie durchgeführt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung eines standardisierten und objektiven Viabilitätstests für die Chondrozyten innerhalb der Knorpelmatrix. Hierfür wurde die LDH als Marker für irreversibel geschädigte Zellen verwendet. Die LDH Konzentration konnte mit dem CyQuant LDH-Assay durch die Messung der Absorption gemessen werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass LDH die erforderliche Stabilität und Nachweisbarkeit im Medium besitzt. Mithilfe der Lyse, analog zum Herstellungsprozess, gezüchteter Mini-Knorpelimplantate, konnten die maximal erreichbaren LDH Konzentrationen ermittelt werden. Mithilfe dieser Konzentrationen wurde eine Eichkurve generiert. Diese dient als Beurteilung der Viabilität zukünftig gemessener Absorptionen des Überstandmediums.
Das entwickelte Verfahren erfordert keine invasiven Eingriffe am Implantat und zeichnet sich durch eine einfache Durchführung aus, da nur der Überstand gemessen werden muss. Die durchgeführte Validierung der Methode bescheinigte eine hohe Robustheit, Linearität, Genauigkeit und Präzision.
KW  - Hyaliner Knorpel
KW  - Lactatdehydrogenase
KW  - Kniegelenk
KW  - Zellkultur
KW  - Entwicklung
KW  - development
KW  - Validierung
KW  - LDH-assay
KW  - Knorpelimplantate
KW  - validation
KW  - cartilage
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242481
ER  - 
TY  - THES
A1  - Geppert, Thomas
T1  - Systematische Analyse der Sichtbarkeit von Regionalanästhesienadeln mittels Ultraschall - eine in vitro Studie
T1  - Systemic analysis of visibility of needles for regional anesthesia by ultrasound - an in vitro study
N2  - In einigen Punkten konnte diese Arbeit die Ergebnisse früherer Studien bestätigen.
Einstellungs- und Nadelmodi (wenn auch mit unterschiedlicher Ausprägung)
haben einen Einfluss auf die verbesserte Sichtbarkeit der Regionalanästhesienadeln
im Ultraschall. Damit diese sonographisch besser erkannt werden, sollten sie
in einem flacheren Winkel (30-45°) eingestochen werden. Größere Nadellumina
haben einen Vorteil in der Sichtbarkeit im Ultraschall. Auch konnte gezeigt werden,
dass der Nadelschliff einen Einfluss darauf hat, wie gut die Anästhesiekanülenspitze
sonographisch gesehen wird. Allein die (in der Arbeit untersuchten) Nadelbeschichtungs-
Arten brachten keinen wesentlichen Effekt für die verbesserte
Erkennbarkeit.
Es war jedoch auffallend, dass die subjektiven und objektiven Resultate in einem
relativ hohen Maße nicht übereinstimmten. Gründe dafür sehe ich v.a. im gewählten
Verfahren der objektiven Untersuchung (mit der Bildbearbeitungssoftware
muss die region of interest zielgenauer erfasst werden, um störende Umgebungseinflüsse
auszuschließen).
Echogene Nadeloberflächen (auch wenn diese nicht Gegenstand der vorliegenden
Untersuchung waren), weisen eine verbesserte Ultraschall-Reflexion auf. Sie
werden dazu beitragen, dass die sichere Anwendung der USRA weiter zunimmt.
Verbesserte Sonographiegeräte, zusätzliche Hilfsmittel (GPS-Unterstützung) und
neueste Nadelentwicklungen versprechen einen wichtigen Fortschritt auf dem
Gebiet der ultraschallunterstützten Regionalanästhesie (USRA). Diese Weiterentwicklungen
werden der USRA den Stellenwert als Gold-Standard in der
Regionalanästhesie sichern.
N2  - Selected needle-specific elements and setting-specific elements were rated regarding their significance for visibility in ultrasound. Needle-specific elements were needle-coating (Nanoline, uncoated), needle gauge (from 17 up to 24 gauge) and the type of needle tip (Facette, 15°, Sprotte, Tuohy).  
Setting-specific elements were the depth of insertion (1 cm, 3 cm, 5 cm), the insertion angle (30°, 45° and 60°), the ultrasound frequenzy (5 MHz, 7,5 MHz, 10 MHz) and also the position of the needle opening in relation to the ultrasound beam (0° and 180°). 
The mobile ultrasound device used in this study was Titan(R) from SonoSite Inc. using a linear transducer (10-5 MHz). 
The generated pictures (in-plane) were analysed in a picture software (PhotoImpact(R) 12 SE - Ulead).
KW  - Regionalanästhesie
KW  - Ultraschall
KW  - USRA
KW  - Ultraschallphantom
KW  - Ultraschallsichtbarkeit von Regionalanästhesienadeln
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137529
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rossi, Angela Francesca
T1  - Development of functionalized electrospun fibers as biomimetic artificial basement membranes
T1  - Entwicklung funktionalisierter elektrogesponnener Fasern als biomimetische künstliche Basalmembranen
N2  - The basement membrane separates the epithelium from the stroma of any given barrier tissue and is essential in regulating cellular behavior, as mechanical barrier and as structural support. It further plays an important role for new tissue formation, homeostasis, and pathological processes, such as diabetes or cancer. Breakdown of the basement membrane is believed to be essential for tumor invasion and metastasization. Since the basement membrane is crucial for many body functions, the development of artificial basement membranes is indispensable for the ultimate formation of engineered functional tissue, however, challenging due to their complex structure. 
Electrospinning enables the production of fibers in the nano- or microscale range with morphological similarities to the randomly orientated collagen and elastic fibers in the basement membrane. However, electrospun fibers often lack the functional similarity to guide cells and maintain tissue-specific functions. Hence, their possible applications as matrix structure for tissue engineering are limited. 
Herein, the potential of polyester meshes, modified with six armed star-shaped pre-polymers and cell-adhesion-mediating peptides, was evaluated to act as functional isotropic and bipolar artificial basement membranes. Thereby, the meshes were shown to be biocompatible and stable including under dynamic conditions, and the degradation profile to correlate with the rate of new tissue formation. The different peptide sequences did not influence the morphology and integrity of the fibers. The modified membranes exhibited protein-repellent properties over 12 months, indicating the long-term stability of the cross-linked star-polymer surfaces.
Cell culture experiments with primary fibroblasts and a human keratinocyte cell line (HaCaT) revealed that cell adhesion and growth strongly depends on the peptide sequences and their combinations employed. HaCaT cells grew to confluence on membranes modified with a combination of laminin/collagen type IV derived binding sequences and with a combination of fibronectin/laminin/collagen type IV derived peptide sequences. Fibroblasts strongly adhered to the fibronectin derived binding sequence and to membranes containing a combination of fibronectin/laminin/collagen type IV derived peptide sequences. The adhesion and growth of fibroblasts and HaCaT cells were significantly reduced on membranes modified with laminin, as well as collagen IV derived peptide sequences. HaCaT cells and fibroblasts barely adhered onto meshes without peptide sequences. 
Co-culture experiments at the air-liquid interface with fibroblasts and HaCaT cells confirmed the possibility of creating biocompatible, biofunctional and biomimetic isotropic and bipolar basement membranes, based on the functionalized fibers. HaCaT cells grew in several layers, differentiating towards the surface and expressing cytokeratin 10 in the suprabasal and cytokeratin 14 in the basal layers. Migration of fibroblasts into the electrospun membrane was shown by vimentin staining. Moreover, specific staining against laminin type V, collagen type I, III, IV and fibronectin illustrated that cells started to remodel the electrospun membrane and produced new extracellular matrix proteins following the adhesion to the synthetic surface structures. 
The culturing of primary human skin keratinocytes proved to be difficult on electrospun fibers. Cells attached to the membrane, but failed to form a multilayered, well-stratified, and keratinized epidermal layer. Changing the fiber composition and fixation methods did not promote tissue development. Further investigations of the membrane demonstrated the tremendous influence of the pore size of the membrane on epithelial formation. Furthermore, primary keratinocytes reacted more sensitive to pH changes in the medium than HaCaT cells did.
Since primary keratinocytes did not adequately develop on the functionalized meshes, polycarbonate membranes were used instead of electrospun meshes to establish oral mucosa models. The tissue-engineered models represented important features of native human oral mucosa. They consisted of a multilayered epithelium with stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, and stratum corneum. The models formed a physical barrier and the expression of characteristic cell markers was comparable with that in native human oral mucosa. The results from the ET-50 assay and the irritation study reflected the reproducibility of the tissue equivalents. 
Altogether, electrospinning enables the production of fibers with structural similarity to the basement membrane. Incorporating extracellular matrix components to mimic the functional composition offers a safe and promising way to modify the fibers so that they can be used for different tissue engineering applications. The resultant biomimetic membranes that can be functionalized with binding sequences derived from widely varying proteins can be used as a toolbox to study the influence of isotropic and bipolar basement membranes on tissue formation and matrix remodeling systematically, with regards to the biochemical composition and the influence and importance of mono- and co-culture. The oral mucosa models may be useful for toxicity and permeation studies, to monitor the irritation potential of oral health care products and biomaterials or as a disease model.
N2  - Die Basalmembran trennt das Epithel vom Stroma eines jeden Wandgewebes und ist entscheidend bei der Regulierung des Zellverhaltens, als mechanische Barriere, und als strukturelle Unterstützung. Darüber hinaus spielt sie eine wichtige Rolle sowohl bei der Neubildung von Gewebe und der Homöostase, als auch bei pathologischen Prozessen, wie Diabetes mellitus oder Krebs. Es wird angenommen, dass die Überquerung der Basalmembran eine entscheidende Rolle bei der Tumorinvasion und Metastasierung spielt. Wegen der großen Bedeutung der Membran für eine Vielzahl an Körperfunktionen, ist die Entwicklung von strukturierten und funktionalen künstlichen Basalmembranen für den Aufbau von im Labor entwickeltem funktionalem Gewebe unerlässlich; nichtsdestotrotz stellt  die Herstellung aufgrund der komplexen Struktur eine Herausforderung dar. 
Das elektrostatische Verspinnen ermöglicht es, Fasern im Nano  oder Mikrometer Maßstab mit morphologischen Ähnlichkeiten zu den zufällig orientierten Kollagen  und elastischen Fasern in der Basalmembran herzustellen. Allerdings fehlt den elektrogesponnenen Fasern häufig die funktionale Ähnlichkeit um die Zellbewegung innerhalb des Gewebes zu regulieren und gewebespezifische Funktionen aufrecht zu erhalten. Daher sind ihre Anwendungsmöglichkeiten als Membranen für das Tissue Engineering begrenzt.
In dieser Arbeit wurde das Potential eines Polyestergerüsts beurteilt, das mit einem sechsarmigen sternförmigen Additiv und Zelladhäsion vermittelnden Peptiden modifiziert worden war, als isotrope und bipolare künstliche Basalmembran. Zunächst wurden die Materialeigenschaften der Faservliese untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Vliese biokompatibel, und auch unter dynamischen Bedingungen stabil sind. Zudem korrelierte der Abbau der Vliese mit dem Aufbau von neuem Gewebe. Die Modifizierung der Faseroberfläche mit Peptidsequenzen beeinflusste nicht die Morphologie und die Integrität der Fasern. Die funktionalisierten Gerüste zeigten proteinabweisende Eigenschaften über 12 Monate, was die langfristige Stabilität der quervernetzten Stern Polymer Oberflächen bestätigte. 
Zellkulturversuche mit primären Fibroblasten und einer humanen Keratinozyten Zelllinie (HaCaT) ergaben, dass die Zelladhäsion und das Wachstum stark von den Peptidsequenzen und deren Kombinationen abhängig sind. HaCaT Zellen wuchsen zur Konfluenz auf Vliesen, die mit einer Kombination aus Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Peptidsequenzen und mit einer Kombination aus Fibronektin/Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Peptidsequenzen funktionalisiert worden waren. Fibroblasten dagegen adhärierten und proliferierten stark auf Vliesen, die mit Fibronektin, und einer Kombination aus Fibronektin/Laminin/Kollagen Typ IV stammenden Bindungssequenzen modifiziert worden waren. Die Adhäsion und das Wachstum von Fibroblasten und HaCaT Zellen waren dagegen auf mit Laminin sowie mit Kollagen Typ IV funktionalisierten Membranen deutlich geringer. Fibroblasten und HaCaT Zellen adhärierten kaum auf Vliesen ohne Peptidsequenzen. 
Ko Kultur Versuche an der Luft Flüssigkeits Grenzfläche mit Fibroblasten und HaCaT Zellen bestätigten, dass es möglich ist, basierend auf funktionalisierten Fasern, biokompatible, biofunktionale und biomimetische isotrope und anisotrope Basalmembranen aufzubauen. HaCaT Zellen wuchsen mehrschichtig, differenzierten und polarisierten, dies wurde belegt durch den Nachweis von Zytokeratin 14 in den basalen und Zytokeratin 10 in den oberen Schichten des Epithels. Die Vimentin Färbung zeigte, dass die Fibroblasten in das Vlies einwandern. Durch spezifische Färbung von Laminin V, Kollagen I, III, IV und Fibronektin konnte gezeigt werden, dass die Zellen beginnen das Vlies umzubauen und extrazelluläre Matrix Proteine zu produzieren. 
Die Kultivierung von primären Keratinozyten, sowohl aus der humanen Haut als auch aus der humanen Mundschleimhaut, erwies sich als komplex auf elektrogesponnenen Fasern. Die Zellen adhärierten auf der Membran, bildeten aber weder mit noch ohne Fibroblasten ein mehrschichtiges, verhorntes Epithel aus. Die Anpassung der Faserzusammensetzung und der Fixierungsmethoden begünstigte die Entwicklung des Epithels nicht. Weiterführende experimentelle Studien belegten, dass der Porendurchmesser des Vlieses eine wichtige Rolle für die Entwicklung des Epithels spielt und dass primäre Keratinozyten stärker auf pH Veränderungen reagieren als HaCaT Zellen. 
Da die funktionalisierten Fasern sich nicht als geeignete Struktur für primäre Keratinozyten erwiesen, wurden Polycarbonat Membranen anstelle von elektrogesponnenen Strukturen als Träger für den Aufbau von Mundschleimhautmodellen verwendet. Die Modelle zeigten wichtige Eigenschaften der nativen Mundschleimhaut. Es bildete sich ein mehrschichtiges, polarisiertes Epithel aus basalen Zellen, einer Stachelzellschicht, Körnerzellschicht und Hornschicht. Die Modelle entwickelten eine physikalische Barriere und exprimierten Zellmarker ähnlich der nativen Mundschleimhaut. Die Ergebnisse des ET 50 Assays und der Irritationsstudie legten dar, dass die Modelle reproduzierbar hergestellt werden können.
Das elektrostatische Spinnen ermöglicht es, fibrilläre Strukturen, die der Basalmembran sehr ähnlich sind, herzustellen. Die Funktionalisierung der Fasern mit Zelladhäsionssignalen stellt eine vielversprechende Möglichkeit dar, diese Fasern so zu modifizieren, dass sie als Basalmembranen für verschiedene Anwendungen des Tissue Engineerings geeignet sind. Die biomimetischen Membranen können mit Bindungssequenzen von sehr unterschiedlichen Proteinen modifiziert werden. Darüber hinaus können sie genutzt werden, den Einfluss von isotropen und anisotropen Basalmembranen auf die Gewebebildung und den Matrixumbau systematisch in Bezug auf die biochemische Zusammensetzung und den Einfluss sowie die Bedeutung von Mono  und Ko Kultur zu untersuchen. Die Mundschleimhautmodelle können für toxikologische Untersuchungen, Permeationsstudien, sowie als Krankheitsmodelle eingesetzt werden. Außerdem können sie verwendet werden, um das Irritationspotenzial von Mundhygieneprodukten und Biomaterialien einzuschätzen.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Basalmembran
KW  - Skin
KW  - Basement membrane
KW  - Bipolar
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137618
N1  - die Online-Version weicht insofern von der gedruckten Fassung ab als im Appendix die Arbeitsanweisungen aus dem Labor fehlen (diese dürfen nicht im WWW veröffentllicht sein)
ER  - 
TY  - THES
A1  - Keßler, Martina
T1  - Biodegradable solvent cast films and solution electrospun meshes for the prevention of postsurgical adhesions
T1  - Bioabbaubare aus der Lösung gegossene Filme und elektrogesponnenen Vliese zur Prävention von Gewebeadhäsionen
N2  - Intraperitoneal adhesions are fibrous bands that connect tissues in the peritoneal cavity that are usually separated. These adhesions form as a consequence of trauma, inflammation or surgical interventions and often result in severe consequences such as chronic pain, small bowel obstructions or female infertility.
The aim of this thesis was to develop a synthetic barrier device for adhesion prevention made of modified poly(lactide) [PLA]. Solid PLA films (SurgiWrap®) are already successfully in clinical use due to the good biocompatibility and the biodegradability of the material resulting in non-toxic degradation products since lactic acid is naturally part of the metabolic circles of the human body. Considering the brittleness and stiffness of the films, the long degradation time of several months as well as the need for suturing, there is potential for optimization. Through a copolymerization with the hydrophilic poly(ethylene glycol) [PEG], a reduction of the degradation time was intendend. Moreover, the copolymerization should also lead to an improvement of the mechanical properties of the films since PEG acts as plasticizer for PLA. Linear PLA-PEG-PLA triblock copolymers as well as star-shaped PEG-PLA copolymers were synthesized via standard ring opening polymerization to tailor the barrier properties. Besides solid films, solution electrospun meshes from PLA and the synthesized PEG-PLA copolymers were investigated for a potential application as well. Since suturing of a barrier additionally induces adhesion formation, alginate coated membranes were prepared in order to achieve self-adhesiveness. With the intention to reduce infections and consequently inflammation, electrospun meshes and solvent cast films were loaded with the antibacterial drug triclosan and drug release as well as antibacterial efficacy was investigated. 
Mechanical tests confirmed that through the variation of the PEG content and branching the mechanical properties can be tailored and are in good accordance with the glass transition temperatures [Tg] of the polymers. Consequently, potentially adequate mechanical properties for surgical handling as well as for the performance within the patient’s body were successfully achieved. Degradation studies revealed that the degradation time was significantly shorter for PEG-PLA membranes than for PLA films and with an appropriate PEG content could be adjusted to the intended time frame. Cell adhesion and viability tests confirmed the non-toxicity of the clinically used PLA films as well as of PEG-PLA films and meshes. With a bioadhesion test the benefit of an alginate coated side towards the pure PLA film concerning self-adhesiveness was successfully demonstrated. Moreover, optical evaluations and a T-peel test of different alginate coated PLA films showed that the cohesion between the chemically different layers was distinctly enhanced by the use of an appropriate PEG-PLA mesh as intermediate cohesion promoting layer. In in vitro release studies with triclosan loaded films a higher release was determined for PEG-PLA than for PLA films. In agar diffusion tests a higher and longer inhibition of staphylococcus aureus growth was observed confirming the release results. Moreover, drug loaded meshes (especially drug loaded after electrospinning) showed enhanced and elongated bacterial inhibition in comparison to films.
N2  - Intraperitoneale Adhäsionen sind fibröse Bänder, die Gewebe in der Peritonealhöhle miteinander verbinden, die normalerweise voneinander getrennt sind. Diese Adhäsionen entstehen als Folge von Trauma, Entzündung  oder chirurgischen Eingriffen und bringen oft schwerwiegende Folgen mit sich wie chronische Schmerzen, Dünndarmobstruktionen oder Unfruchtbarkeit bei Frauen.
Ziel dieser Arbeit war es, synthetische Barrieren aus modifiziertem Poly(laktid) [PLA] für die Adhäsionsprävention zu entwickeln. PLA-Filme (SurgiWrap®) werden bereits erfolgreich klinisch eingesetzt aufgrund der guten Biokompatibilität und der Bioabbaubarkeit des Materials mit seinen ungiftigen Abbauprodukten, da Milchsäure natürlicher Bestandteil der metabolischen Zyklen im menschlichen Körper ist. Betrachtet man jedoch die Sprödigkeit und Steifigkeit der Filme, die lange Abbauzeit von mehreren Monaten sowie die Notwendigkeit des Annähens, erkennt man noch Verbesserungspotential. Durch eine Copolymerisation mit hydrophilem Poly(ethylen glykol) [PEG] wurde eine Reduktion der Abbauzeit angestrebt. Zusätzlich sollte die Copolymerisation zu einer Verbesserung der mechanischen Eigenschaften der Filme führen, da PEG als Weichmacher von PLA dient. Lineare PLA-PEG-PLA-Triblock-Copolymere sowie sternförmige PEG-PLA-Copolymere wurden über eine Standard-Ringöffnungspolymerisation synthetisiert um die Barriereeigenschaften maßzuschneidern. Neben massiven Filmen wurden aus der Lösung elektrogesponnene Vliese aus PLA und den synthetisierten PEG-PLA-Copolymeren für eine potentielle Anwendung untersucht. Da das Annähen einer Barriere zusätzlich Adhäsionsbildung hervorruft, wurden mit Alginat beschichtete Membranen hergestellt um eine Selbsthaftung zu erreichen. Mit der Intention, Infektionen und damit Entzündungen zu reduzieren, wurden elektrogesponnene Vliese und aus der Lösung gegossene Filme mit dem antibakteriellen Arzneistoff Triclosan beladen und die Freisetzung sowie die antibakterielle Wirksamkeit untersucht. 
Mechanische Tests bestätigten, dass mit der Variation von PEG-Gehalt und Verzweigung die mechanischen Eigenschaften zugeschnitten werden können und gut mit den Glasübergangstemperaturen der Polymere in Einklang stehen. Folglich konnten potentiell passende mechanische Eigenschaften für die chirurgische Handhabung sowie für das Verhalten im Körper des Patienten erfolgreich erreicht werden. Abbaustudien zeigten, dass die Abbauzeit von PEG-PLA-Membranen signifikant kürzer war als von PLA-Filmen und mit geeignetem PEG-Gehalt erfolgreich auf den erzielten Zeitraum hin angepasst werden konnte. Zelladhäsion und Zellviabilitätstests bestätigten die Ungiftigkeit der klinisch eingesetzten PLA-Filme sowie der PEG-PLA-Filme und –Vliese. Mit einem Bioadhäsionstest konnte der Nutzen einer Alginatbeschichtung gegenüber einem reinen PLA-Film bezüglich einer Selbsthaftung erfolgreich gezeigt werden. Außerdem ergaben visuelle Begutachtungen und ein T-Peeltest von verschiedenen mit Alginat beschichteten PLA-Filmen, dass die Kohäsion zwischen den chemisch unterschiedlichen Schichten durch den Einsatz eines geeigneten PEG-PLA-Vlieses als kohäsionsfördernde Zwischenschicht deutlich verstärkt wurde. In in vitro Freisetzungsstudien mit Triclosan-beladenen Filmen wurde eine höhere Freisetzung für PEG-PLA- als für PLA-Filme bestimmt. In Agardiffusionstests wurde eine höhere und längere Wachstumshemmung von Staphylococcus aureus beobachtet, was die Freisetzungsergebnisse bestätigt. Weiterhin zeigten Arzneistoff-beladene Vliese (insbesondere mit Arzneistoffbeladung nach dem Elektrospinning) eine verstärkte und verlängerte bakterielle Inhibition im Vergleich zu Filmen.
KW  - Polymere
KW  - Biologischer Abbau
KW  - Polyethylenglykole
KW  - postsurgical adhesion
KW  - biodegradable polymer
KW  - Polymilchsäure
KW  - Adhäsion
KW  - polylactid
KW  - polyethylenglykole
KW  - Blockcopolymere
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-129358
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jahn, Christoph Hans
T1  - In vitro Untersuchung von 3D-pulvergedruckten Monetit-Strukturen
T1  - Cytocompatibility of three-dimensional powder printed monetite structures
N2  - Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Zytokompatibilität von im 3D-Pulverdruckverfahren hergestellten Zellkulturträgern aus Dicalciumphosphat Anhydrat (CaHPO4, Monetit) in vitro zu untersuchen. Dieses Material lässt sich der Substanzklasse der Calciumphosphate zuordnen, welche aufgrund ihrer chemischen Ähnlichkeit zur mineralischen Phase des Knochens einen hohen Stellenwert als Knochenersatzmaterial besitzen.
Die Trägerstrukturen wurden mittels CAD-CAM Technologie im 3D-Pulverdruckverfahren fabriziert. Dabei wurde auf ein entsprechend adaptiertes Zementsystem zurückgegriffen, bestehend aus Tricalciumphosphatpulver und Phosphorsäure. Die primär aus Dicalciumphosphat Dihydrat (Bruschit) bestehenden Konstrukte wurden anschließend durch Autoklavieren hydrothermal in Monetit umgewandelt.
Die Kombination einer bei Raumtemperatur ablaufenden Zementabbindereaktion mit einem generativen Fertigungsverfahren wie dem Pulverdruck ermöglichte die Herstellung monolithischer Formkörper ohne thermische Verfestigung (Sinterung). Daher kann eine im Vergleich zu gesinterten Formkörpern gute thermodynamische Löslichkeit und somit gute Biodegradierbarkeit erwartet werden.
Zur Evaluierung der Zytokompatibilität des pulvergedruckten Materials wurde nach Besiedlung mit osteoblastären Zellen deren Proliferations- und Differenzierungsverhalten in vitro untersucht. Die Zellviabilität, die Aktivität der Alkalischen Phosphatase sowie die Konzentration von Osteocalcin dienten als Parameter. Weiterhin wurden die Konzentration freier Elektrolyte und der pH-Wert im Nährmedium zur Evaluierung der Löslichkeit der Träger in vitro herangezogen. Anhand licht- und rasterelektronenmikroskopischer Aufnahmen erfolgte eine qualitativ-morphologische Einschätzung des Zellwachstums.
Die Untersuchungen zeigen eine gute Zytokompatibilität des Trägermaterials aus Monetit. Die im Vergleich zu den Positiv-Kontrollen etwas erniedrigten Werte lassen sich durch die im Nährmedium festgestellten Elektrolytverschiebungen erklären, welche durch die thermodynamische Löslichkeit von Monetit zustande kommen. Diese Problematik der Zellkultur als geschlossenem System sollte jedoch in vivo bei stetigem Flüssigkeits- und Metabolitenaustausch keine Rolle spielen. Die Ergebnisse liefern einen Beitrag zur Erarbeitung neuartiger Knochenzemente, insbesondere aus Monetit. Klinisch interessant erscheint die verfahrensbedingte Möglichkeit, die Anforderungen nach guter Degradierbarkeit, präoperativer Fabrizierung und individueller Formgebung (z.B. passend zu einem individuellen Defekt) miteinander kombinieren zu können.
N2  - The aim of this study was the in vitro examination of the cytocompatibility of dicalcium phosphate anhydrate (CaHPO4, monetit) cell culture carriers  (alternativ: media) that are produced via 3D powder printing. Monetit is a calcium phosphate, a substance group, which, due to its chemical resemblance to the mineral phase of bone, is considered an important bone replacement material. 
The carrier structures were fabricated via CAD-CAM technology using 3D powder printing. We utilized an appropriately adapted cement system consisting of tricalcium phosphate powder and phosphoric acid. We subsequently hydrothermally transformed these carrier structures, which primarily consisted of dicalcium phosphate dihydrate (bruschit), into monetit by autoclaving. 
The combination of a cement setting reaction, taking place at room temperature, with a generative production method like powder printing enabled the production of monolithic molds lacking thermal solidification (sintering). We therefore expect good thermodynamic solubility and thus good biodegradability in comparison to sintered molds.
In order to evaluate the cytocompatibility of this powder printed material we examined the proliferation and differentiation behavior of osteoblastic cell populations on the mold in vitro. Parameters were cell viability, the activity of alkaline phosphatase and the concentration of osteocalcin. Furthermore, we used the concentration of free electrolytes and the pH-value of the nutrient solution in order to evaluate the solubility of the carriers in vitro. Using light optical and scanning electron microscopic images, we undertook a quantitative morphological assessment of cell growth.
Our examinations prove good cytocompatibility of the monetit carrier material. The rates/levels (werte) were slightly lowered when compared to positive controls, which can be attributed to electrolyte shifts within the nutrient solution, caused by the thermodynamic solubility of monetit. However the problems resulting from this closed system of cell cultures is not expected to be relevant in vivo where a constant exchange of fluids and metabolites is present. The results constitute a contribution for the development of new bone cements, in particular those consisting of monetit. The possibility of combining the requirements of good degradability, preoperative production and individualized shape (e.g. fitted to an individual defect), afforded by monetit’s mode of production appears to be of clinical interest.
KW  - Calciumphosphate
KW  - Monetit
KW  - 3D-Pulverdruck
KW  - Calciumphosphate
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113557
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TY  - THES
A1  - Kohm, Fabian
T1  - Untersuchung des Wachstumsverhaltens neuronaler Zellen auf strukturierten Halbleiteroberflächen als Werkstoff zukünftiger Elektrodenträger auditorischer Implantate
T1  - Growth behavior of neuronal cells on structured semiconductor surfaces as a material of future electrode carriers of auditory implants
N2  - Die Therapie von Patienten mit fortgeschrittener sensorineuraler Schwerhörigkeit oder Taubheit mit auditorischen Implantaten ist heute Standard in der medizinischen Versorgung. Durch direkte elektrische Stimulation der noch vorhanden auditorischen Neurone wird versucht, die physiologische Informationsübertragung entlang der Hörbahn künstlich nachzubilden. Strukturierte Halbleiterelektrodenträger aus Silizium stellen dabei eine mögliche Alternative zu den herkömmlichen Kabelbündel-Elektrodenträgern heutiger Implantate dar. Durch die Möglichkeit der Abstandsverringerung zwischen Stimulationselektroden und Nervenfasern sowie durch die Möglichkeit der Erhöhung der Anzahl an Stimulationselektroden könnte die Leistungsfähigkeit heutiger Implantate verbessert werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Wachstumsverhalten corticaler neuronaler Vorläuferzellen der Maus auf strukturierten Siliziumhalbleitern zu untersuchen und das Wachstumsverhalten näher zu charakterisieren. Zwei unterschiedliche Oberflä-chenstrukturen wurden durch den Einsatz der Elektronenstrahllithografie auf Silizi-umwafern erzeugt. Zylinder auf der Oberfläche der Halbleiter wurden als Modellstruktur gewählt, um eine erhöhte Anzahl an Elektrodenkontakten zu simulieren und die neuronale Interaktion mit diesen zu untersuchen. Daneben wurden Furchen auf Siliziumoberflächen verwendet, um die Wachstumsrichtung der neuronalen Zellen zu beeinflussen.
Die durchgeführten Untersuchungen konnten zeigen, dass strukturierte Halbleiter-elektrodenträger in zukünftigen auditorischen Implantaten grundsätzlich eine Alternative zu den Kabelbündel-Elektrodenträgern heutiger Implantate sein könnten. Durch den Einsatz der Elektronenstrahllithografie konnten Siliziumwafer mit präziser Oberflächenstrukturierung hergestellt werden und deren Biokompatibilität durch Kultivierung neuronaler Zellen gezeigt werden. Die Geometrie der eingeätzten Oberflächenstruktur hatte dabei entscheidenden Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Zellen. Während durch Furchen die Orientierung der Neurone gezielt beeinflusst werden konnte und die Neuritenlängen mit zunehmender Ätztiefe abnahmen, konnten derartige Effekte bei den untersuchten Zylindern nicht beobachtet werden.
Die durchgeführten rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen gaben Auf-schluss über die Interaktion der Neurite mit der Oberflächenstruktur. Auf vertikalen Wachstumsstress reagierten die kortikalen neuronalen Vorläuferzellen unabhängig von der Oberflächenstruktur mit der Ausbildung von neuronalen Brücken. Der Modus der Brückenbildung war bei beiden Strukturen dabei gleich, jedoch wurden unterschiedliche Verankerungspunkte an der Siliziumoberfläche beobachtet. Darüber hinaus konnte durch Echtzeituntersuchungen an lebenden Zellen gezeigt werden, dass diese während des Wachstums ihre Lage verändern konnten und somit nicht dauerhaft mit der Oberfläche verbunden waren.
Die Ergebnisse zeigen, dass die beiden untersuchten Oberflächenstrukturen grundsätzlich für den Einsatz auf zukünftigen Halbleiterelektrodenträgern geeignet sind, jedoch noch weiterführende Untersuchungen nötig sind, um diese weiter zu optimieren.
N2  - The treatment of patients with advanced sensorineural hearing loss or deafness with auditory implants is standard in health care today. Structured silicon semiconductors could be an alternative to the conventional wire-bundle-electrodes of today's implants. The possibility of reducing the distance between stimulation electrodes and nerve fibers as well as the possibility of increasing the number of stimulation electrodes could improve the performance of today's implants.
Aim of the present study was to investigate the growth behavior of cortical neuronal precursor cells of the mouse on structured silicon semiconductors and to characterize the growth behavior. Two different surface structures were created on silicon semiconductors through the use of electron beam lithography. Cylinders on the surface of the semiconductors were chosen as model structure for an increased number of electrode contacts. In addition, grooves on Silicon surfaces were used to influence the direction of the axonal outgrowth.
The investigations showed that structured semiconductors basically could be an alternative to the cable-bundle-electrodes of today's implants. The geometry of the surface structure had decisive influence on the growth behavior of cells. While the orientation of the neurons could be influenced by grooves and the axon lengths with etching depth declined, such effects were not observed at the cylinders.
Investigations on the scanning electron microscope showed the interaction of the axons with the surface structure. The neuronal precursor cells responded to vertical growth stress regardless of the surface structure with the formation of neural bridges. The mode of bridging was basically equal on both surfaces, but different anchor points on the silicon surface were observed. In real time studies on living cells the dynamic of neuronal growth was investigated. The Observation shoes, that neurons could change their position during growth and that they were not permanently connected to the surface.
The results shows that the two observed semiconductor surfaces are generally suitable for the use in auditory implants. Further investigations should follow to optimize the surface structures for future implants.
KW  - Hirnstammimplantat
KW  - Strukturierte Siliziumoberflächen
KW  - neuronale Brückenbildung
KW  - neuronale Vorläuferzelle
KW  - Cochleaimplantat
KW  - Topographic guidance
KW  - Neuronale Leitung
KW  - patterned semiconductor substrates
KW  - neurite bridging
KW  - neuronal precursor cell
KW  - cochlear implant
KW  - auditory brainstem implant
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104439
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fetsch, Corinna
T1  - Polypeptoide - Synthese und Charakterisierung
T1  - Polypeptoids - Synthesis and characterization
N2  - Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der bisher relativ unbekannten Polymerklasse der Polypeptoide, die hinsichtlich ihrer Verwendung als Biomaterial näher untersucht werden sollte. Hierbei war die Untersuchung des Polymerisationssystems ein wesentlicher Schwerpunkt. Dies beinhaltete zum einen die Synthesen verschiedener Monomere sowie deren Polymerisationskinetiken und zum anderen Studien über die Stabilität des aktiven Kettenendes. Um mehr über die Polypeptoide zu erfahren, wurden die erhaltenen Homopolymere nach der Strukturanalyse hinsichtlich ihrer physikochemischen Eigen-schaften untersucht. Im Anschluss erfolgte die Synthese von (amphiphilen) Blockco-polypeptoiden, die sich in wässrigen Lösungen zu definierten Morphologien zusammen-lagern. Die resultierenden Morphologien, sowohl mizellare als auch vesikuläre Strukturen, wurden mit verschiedenen Methoden, wie z. B. der Pyren-Fluoreszenz-Spektroskpie und der dynamischen Lichtstreuung, untersucht. Erste Erkenntnisse über die Biokompatibilität der Polypeptoide sollte die Bestimmung der Zellviabilität in verschiedenen Polymerlösungen liefern.
Die verschiedenen Studien über die Polypeptoide zeigten, dass diese Polymerklasse über eine besonders lebende Polymerisation synthetisiert werden kann. Dabei resultieren Produkte, die sich durch eine Poisson-Verteilung und eine hohe Endgruppengenauigkeit auszeichnen. Zusätzlich bestehen Polypeptoide aus einem abbaubaren Rückgrat und, im Vergleich zu den Polypeptiden, besitzen sie eine erhöhte proteolytische Stabilität. Amphiphile Blockcopolypeptoide sind zudem in der Lage, sich in Lösung zu verschiedenen Morphologien anzuordnen. Durch die Variierung der Seitenkette und des f kann sowohl die Selbstorganisation als auch das Mikroumfeld der Aggregate abgestimmt werden. Darüber hinaus können die amphiphile Blockcopolymere, die sich zu Mizellen anordnen, hydrophobe Substanzen solubilisieren.
Polypeptoide liefern all die nötige chemische Vielseitigkeit und potentielle Biokompatibilität, um bestehende sowie neuartige Probleme in biomedizinischen Anwendungen zu bewältigen. Zukünftige in vivo und in vitro Test werden das Potential, aber auch die Grenzen dieser neuen Polymerklasse als Biomaterial zeigen.
N2  - The present work focused on the synthesis and characterization of the relatively unknown polymer class polypeptoids and their potential as a biomaterial. In detail, the syntheses of different monomers and their polymerization kinetics as well as studies on the stability of the active chain end were investigated. Furthermore, the physicochemical properties with respect to the polymer structure were analyzed by a series of homo- and block copolymers. The self-assembly of amphiphilic block copolypeptoids in aqueous solution resulted in micellar as well as vesicular structures, which were studied meticulously by various methods such as pyrene fluorescence spectroscopy and dynamic light scattering. First results about the biocompatibility of the polypeptoids was gained by cell viability assay. 
The various studies on the polypeptoids showed that this polymer class is accessible through an extraordinary living polymerization. The obtained products are characterized by a Poisson distribution and a high end-group fidelity. Additionally, polypeptoids consist of a degradable backbone and feature enhanced proteolytic stability in contrast to polypeptides. Moreover, amphiphilic block copolypeptoids are able to assemble in aqueous solution into different morphologies. By variation of the side chain and f the self-assembly as well as the microenvironment of the aggregates can be fine-tuned. In addition, amphiphilic block copolymers which formed micelles are able to solubilize hydrophobic compounds.
In summary, the polypeptoids provide all the chemical versatility and potentially biocompatibility necessary to overcome existing as well as novel problems in biomedical applications. Future in vivo and in vitro tests will show the potential, but also limits of this new polymer class as a biomaterial.
KW  - Polymerisation
KW  - Lichtstreuung
KW  - Selbstorganisation
KW  - Ringöffnungspolymerisation
KW  - Polypeptoid
KW  - self-assembly
KW  - light scattering
KW  - N-Carboxyanhydride
KW  - ring-opening polymerization
KW  - Peptoide
KW  - Biomaterial
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109157
ER  - 
TY  - THES
A1  - Liebetrau, Dominik
T1  - Inzidenz von Narbenhernien nach xiphopubischer Laparotomie beim Aortenaneurysma im Vergleich zu benignen kolorektalen Eingriffen: Eine retrospektive Matched Control Kohorten-Studie
T1  - Incidence of incisional hernia after xiphopubic laparotomy during aortic aneurysm compared to benign colorectal surgery: a retrospective matched control cohort study
N2  - Hintergrund: Narbenhernien stellen nach Operationen ein unerwünschtes Ereignis dar. Dabei werden in der Literatur verschiedene Theorien zur Entstehung diskutiert. Sowohl beim Aortenaneurysma als auch bei der Narbenhernie soll das Kollagen ein entscheidender Faktor in der Entstehung. Historisch wird von ausgegangen  das Patienten mit einem Aortenaneurysma auch ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Narbenhernie haben. Aus diesem Grund vergleichen wir die Inzidenzrate zwischen Patienten mit Aortenaneurysmen und Patienten mit einem kolorektalen Eingriff um Risikofaktoren zu identifizieren. 

Methoden: Diese Studie ist eine retrospektive „Matched Control“ Kohorten-Studie. Es wurden alle Patienten eingeschlossen die sich zwischen dem 01.01.2006 und dem 31.12.2008 an der chirurgischen Universitätsklinik Würzburg  an einem Aortenaneurysma oder einem kolorektalen Eingriff unterzogen haben. 

Ergebnisse: In unserer Studie konnten wir eine Gesamtinzidenzrate von  17,2% nachweisen. In der Gruppe der Aortenaneurysmen bestand eine Inzidenzrate von 13,9%, in der Gruppe der Kolorektalen Eingriffe von 25,9%. Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen bezüglich der Inzidenzrate von Narbenhernien

Schlussfolgerung: Es besteht kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Vergleichsgruppen. In der Gruppe der Aortenaneurysmen war die Inzidenzrate sogar geringer.
N2  - Background: Incisional hernias represent after surgeries an adverse event dar. Various theories on the development are discussed in the literature. Both the aortic aneurysm as well as the hernia , the collagen is a crucial factor in the development . Historically sumed that patients with aortic aneurysms have an increased risk for developing a hernia . For this reason, we compare the incidence rate between patients with aortic aneurysms and patients with colorectal intervention to identify risk factors. Methods: This study is a retrospective " Matched Control" cohort study. It all patients were included who 01.01.2006 and 31.12.2008 subjected between the Surgical University Clinic Würzburg on a aortic aneurysm or colorectal surgery. Results: In our study , we demonstrated an overall incidence rate of 17.2%. In the group of aortic aneurysms was an incidence rate of 13.9 % , in the group of colorectal surgery of 25.9 %. There was no significant difference between the two groups regarding the incidence of incisional hernias Conclusion: There is no significant difference between the two comparison groups. In the group of aortic aneurysms , the incidence rate was even lower.
KW  - Narbenhernie
KW  - incisional hernia
KW  - Aortenaneurysma
KW  - kolorektal
KW  - Bauchdeckenverschluss
KW  - Risikofaktoren
KW  - aortic aneurysm
KW  - colorectal abdominal closure
KW  - riskfaktors
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98061
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TY  - THES
A1  - Wenninger, Florian
T1  - Modifikation von Titanoberflächen mittels elektrochemischer Abscheidung von Magnesiumphosphaten
N2  - In der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die experimentellen Parameter für eine erfolgreiche elektrochemische Abscheidung sowohl von Struvit (MgNH4PO4 • 6H2O) als auch Newberyit (MgHPO4 • 3H2O) auf durch Sandstrahlen aufgeraute Titanproben zu ermitteln. Welche der beiden Phasen auf den Titanoberflächen abgeschieden wurde, hing dabei hauptsächlich von der jeweiligen Elektrolytzusammensetzung ab. Bei der Elektrodeposition selbst erwiesen sich eine Elektrolyttemperatur von 50 °C und Stromdichten von etwa 79 – 105 mA/cm2 als optimal, um geschlossene Schichten von hinreichender Dicke reproduzierbar herzustellen. Es zeigte sich, dass die für die jeweiligen Abscheidungsprodukte optimierten Parameter (79 mA/cm2 für Struvit und 105,3 mA/cm2 für Newberyit) zu deutlich unterschiedlichen Massenabscheidungen (4,4 mg/cm2 für Struvit und 0,6 mg/cm2 für Newberyit bei einer Beschichtungsdauer von 15 min) führten. Das Monohydrat Dittmarit (MgNH4PO4 • H2O) ließ sich nicht direkt abscheiden, konnte aber durch Dampfsterilisation von zuvor erzeugten Struvitschichten in einem Autoklaven erzeugt werden.
Um das Verhalten der Oberflächenmodifikationen in einer in-vivo-Umgebung zu simulieren, wurden die Beschichtungen für eine maximale Dauer von 14 Tagen in Simulated Body Fluid (SBF), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) und in fötalem Kälberserum (FCS) eingelagert. In bestimmten Zeitabständen wurden eingelagerte Proben ihrem Medium entnommen, getrocknet und die Schichten mit Hilfe der Röntgendiffraktometrie und der Rasterelektronen-mikroskopie hinsichtlich ihrer kristallographischen und morphologischen Eigenschaften charakterisiert. Dabei zeigten die drei Magnesiumphosphate jeweils unterschiedliches Degradationsverhalten in den verschiedenen Einlagerungsmedien. Struvit wandelte sich nach 14 Tagen in DMEM teilweise, in FCS größtenteils und in SBF vollständig zu Bobierrit (Mg3(PO4)2 • 8H2O) um. Ein ähnliches Verhalten zeigte sich bei Dittmarit, allerdings kam es hier in allen Medien zur Bildung einer weiteren Phase (Tri-Magnesium-Di-Phosphat-5-Hydrat, Mg3(PO4)2 • 5H2O), in FCS bildete sich zusätzlich noch Di-Magnesiumphosphathydroxid-4-Hydrat (Mg2PO4OH • 4H2O). Die Newberyit-Schichten hingegen zeigten keinerlei Phasenumwandlungen, lösten sich aber in den Einlagerungsversuchen teilweise auf.
Diese Ergebnisse zeigen, dass elektrochemisch erzeugte Beschichtungen auf Magnesiumphosphatbasis durchaus vielversprechend im Hinblick auf die funktionelle Modifikation metallischer Implantatoberflächen sind. Neben den literaturbekannten positiven Eigenschaften der Magnesiumphosphate (gute Zytokompatibilität, hohe Löslichkeit und mechanische Festigkeit) ist für zukünftige Forschungen vor allem das in dieser Arbeit untersuchte Degradationsverhalten von Interesse. Die in fast allen untersuchten Kombinationen aus Schichtmodifikation und Einlagerungsmedium auftretenden Phasenumwandlungen weisen auf durch die physiologische Umgebung hervorgerufene Resorptionsprozesse hin, die wiederum in vivo die Osteointegration des Implantats unterstützen könnten.
Ein weiterer Aspekt zukünftiger Untersuchungen ist die mögliche Beladung der biokompatiblen Schichten mit bioaktiven Substanzen (antibakterielle oder osteointegrative Wirkstoffe sowie Metallionen zur Unterstützung bzw. Steuerung biologischer Prozesse im implantatnahen Bereich). Hier könnten die unterschiedlichen Degradationsmechanismen der verschiedenen untersuchten Magnesiumphosphat-Modifikationen die Grundlage für kontrollierte und maßgeschneiderte Freisetzungskinetiken liefern.
KW  - Magnesiumphosphate
KW  - Titan
KW  - Galvanische Abscheidung
KW  - Struvit
KW  - Degradation
KW  - elektrochemische Abscheidung
KW  - electrochemical deposition
KW  - titanium
KW  - magnesium phosphate
KW  - struvite
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85557
ER  - 
TY  - THES
A1  - Meininger, Markus
T1  - Calcium hydroxide as antibacterial implant coating
T1  - Calciumhydroxid als antibaterielle Implantatbeschichtung
N2  - In modern medicine hip and knee joint replacement are common surgical procedures. However, about 11 % of hip implants and about 7 % of knee implants need re-operations. The comparison of implant registers revealed two major indications for re-operations: aseptic loosening and implant infections, that both severely impact the patients’ health and are an economic burden for the health care system. To address these problems, a calcium hydroxide coating on titanium was investigated in this thesis. Calcium hydroxide is a well-known antibacterial agent and used with success in dentistry. The coatings were applied with electrochemically assisted deposition, a versatile tool that combines easiness of process with the ability to coat complex geometries homogeneously. The pH-gradient during coating was investigated and showed the surface confinement of the coating process. Surface pre-treatment altered the surface morphology and chemistry of the titanium substrates and was shown to affect the morphology of the calcium hydroxide coatings. The influence of the coating parameters stirring speed and current pulsing were examined in various configurations and combinations and could also affect the surface morphology. A change in surface morphology results in a changed adhesion and behavior of cells and bacteria. Thus, the parameters surface pre-treatment, stirring speed and current pulsing presented a toolset for tailoring cellular response and antibacterial properties. Microbiological tests with S. aureus and S. epidermidis were performed to test the time-dependent antibacterial activity of the calcium hydroxide coatings. A reduction of both strains could be achieved for 13 h, which makes calcium hydroxide a promising antibacterial coating. To give insight into biofilm growth, a protocol for biofilm staining was investigated on titanium disks with S. aureus and S. epidermidis. Biofilm growth could be detected after 5 days of bacterial incubation, which was much earlier than the 3 weeks that are currently assumed in medical treatment. Thus, it should be considered to treat infections as if a biofilm were present from day 5 on. The ephemeral antibacterial properties of calcium hydroxide were further enhanced and prolonged with the addition of silver and copper ions. Both ionic modifications significantly enhanced the bactericidal potential. The copper modification showed higher antibacterial effects than the silver modification and had a higher cytocompatibility which was comparable to the pure calcium hydroxide coating. Thus, copper ions are an auspicious option to enhance the antibacterial properties. Calcium hydroxide coatings presented in this thesis have promising antibacterial properties and can easily be applied to complex geometries, thus they are a step in fighting aseptic loosening and implant infections.
N2  - Der Fortschritt in der modernen Medizin ist so weit, dass Hüft- und Kniegelenkersatz mit Implantaten heutzutage Standardoperationen sind. Allerdings kommt es in circa 11 % des Hüftgelenkersatzes und 7 % des Kniegelenkersatzes zu nicht zufriedenstellenden Ergebnissen und Revisionen sind nötig. Der Vergleich von Implantationsregistern zeigte zwei Hauptindikatoren für Revisionen: aseptische Lockerung und Implantatinfektionen, welche die Gesundheit der Patienten stark beeinträchtigen und eine wirtschaftliche Belastung für das Gesundheitssystem darstellen. Um diese Probleme anzugehen, wurde Calciumhydroxid auf Titan als Beschichtung aufge- bracht und in dieser Arbeit untersucht. Calciumhydroxid ist ein bekanntes antibakterielles Material und wird erfolgreich in der Zahnheilkunde eingesetzt. Die Beschichtungen wurden mit elektrochemisch gestützter Abscheidung aufgebracht, da diese Methode einen einfachen Prozess mit der Möglichkeit vereint, komplexe Geometrien homogen zu beschichten. In dieser Arbeit wurde der pH-Gradient während der Beschichtung untersucht und zeig- te die Beschränkung des Beschichtungsprozesses auf die direkte Oberfläche der Probe. Eine Vorbehandlung der Titansubstrate veränderte die Morphologie und die Chemie der Oberflä- chen und dadurch auch die Morphologie der Calciumhydroxidbeschichtung. Der Einfluss der Beschichtungsparameter Rührgeschwindigkeit und Pulsen des Stroms wurden in zahlreichen Konfigurationen und Kombinationen getestet und konnte ebenfalls die Oberflächenmorphologie verändern. Die Oberflächenmorphologie wiederum beeinflusst die Adhäsion und das Verhalten von Zellen und Bakterien. Deshalb sind die Parameter Oberflächenvorbehandlung, Rührge- schwindigkeit und Pulsen des Stroms ein Instrument für das Einstellen einer angepassten Zellantwort und der antibakteriellen Eigenschaften. Mikrobiologische Tests mit S. aureus und S. epidermidis wurden unternommen, um die Zeitabhängigkeit der antibakteriellen Aktivität auf Calciumhydroxidbeschichtungen zu bestimmen. Eine Reduktion beider Stämme konnte nach 13 h erreicht werden, was Calciumhydroxid zu einer erfolgversprechenden antibakteriellen Beschichtung macht. Um einen Einblick in das Wachstum von Biofilmen zu geben, wurde ein Protokoll zur Biofilm- Färbung auf Titanplättchen mit S. aureus und S. epidermidis entwickelt. Biofilm-Wachstum konnte nach 5 Tagen Bakterien-Inkubation detektiert werden, was sehr viel früher war als die 3 Wochen, die aktuell bei der Behandlung von Implantatinfektionen angenommen werden. Folglich muss schon nach 5 Tagen darüber nachgedacht werden, Behandlungsmethoden gegen einen Biofilm anzuwenden. Die kurzzeitigen antibakteriellen Eigenschaften von Calciumhydroxid konnten durch den Zusatz von Silber- und Kupferionen weiter verbessert und verlängert werden. Beide Ionen erhöhten die antibakterielle Wirkung signifikant. Die Kupfermodifikation zeigte dabei einen größeren antibakteriellen Effekt als die Silbermodifikation und war gleichzeitig besser zell- verträglich. Die Zytokompatibilität der Kupfermodifikation lag auf dem Niveau der reinen Calciumhydroxidbeschichtungen. Deshalb sind Kupferionen eine vielversprechende Möglichkeit für eine weitere Verbesserung der antibakteriellen Eigenschaften. Die in dieser Arbeit vorgestellten Calciumhydroxidbeschichtungen haben ein großes Potential als antibakterielle Oberflächen und können sehr leicht auch auf komplizierte Geometrien aufgebracht werden. Deshalb können sie ein entscheidender Baustein bei der Vermeidung von aseptischer Lockerung und Implantatinfektionen sein.
KW  - Calciumhydroxid
KW  - Implantat
KW  - Beschichtung
KW  - antibakteriell
KW  - antibacterial
KW  - implant
KW  - coating
KW  - calciumhydroxide
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261122
ER  - 
TY  - THES
A1  - Scheurer, Mario Joachim Johannes
T1  - Inhibitoren des NF-kappaB pathways zur in vitro Blockade der Inflammation und proapoptotischen Sensitivierung des oralen Plattenepithelkarzinoms für den prospektiven Einsatz in der Tumortherapie
T1  - Inhibitors of the NF-kappaB pathway for in vitro blockade of inflammation and proapoptotic sensitization of oral squamous cell carcinoma for prospective use in tumor therapy
N2  - Entzündliche Prozesse stellen einen zentralen Aspekt der Karzinogenese dar und können sowohl zur Induktion als auch zum Progress von Tumoren beitragen. Der NF-kB-Signalweg ist einer der wichtigsten Signaltransduktionswege der In- flammation und Tumorpromotion, was ihn zur plausiblen Zielstruktur für die pros- pektive klinische Tumortherapie machen könnte. In der vorliegenden Arbeit wur- den die Eigenschaften von vier unterschiedlich targetierenden NF-kB-pathway- Inhibitoren – Cortisol, MLN4924, QNZ und TPCA1 – auf die Inflammation, Zell- proliferation und proapoptotische Sensitivierung am in vitro Modell des HNSCC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifische Auswahl des Inhi- bitors bzw. seines targets entscheidend für den wirkungsvollen Einsatz dieser Wirkstoffgruppe in der antiproliferativen Therapie des HNSCC zu sein scheint. Beispielsweise vermittelte MLN4924 die Freisetzung von IL-8. Cortisol bewirkte die Resistenz der FasL-induzierten Apoptose von HNSCC-Zellen. QNZ wirkte in einigen Zelllinien antiproliferativ und sensitivierend für den FasL-induzierten Zell- tod, beeinflusste jedoch in diesem Zusammenhang kontraproduktiv die IL-8-Sek- retion. Dies disqualifizierte diese Wirkstoffe für die Anwendung in der Therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Dahingegen qualifizierte sich TPCA-1 aufgrund folgen- der Eigenschaften als geeigneter Wirkstoff für den prospektiven klinischen Ein- satz: 
1) TPCA-1 wirkte antiproliferativ,
2) hemmte die TNF-a-induzierte Inflammation,
3) regulierte die IL-8-Expression herab,
4) wirkte sensitivierend für den TNF-a-induzierten Zelltod,
5) interferierte kaum mit der FasL-vermittelten Apoptose und 6) induzierte Apoptose.
N2  - Inflammatory processes represent a central aspect of carcinogenesis and may contribute to both tumour induction and progression. The NF-kB signalling pathway is one of the most important signal transduction pathways in inflammation and tumour promotion, which could make it a plausible target for prospective clinical tumour therapy. In the present study, the properties of four different targeting NF-kB pathway inhibitors - cortisol, MLN4924, QNZ and TPCA1 - on inflammation, cell proliferation and proapoptotic sensitivity were investigated in an in vitro model of HNSCC. It was shown that the specific selection of the inhi- bitor or its target seems to be crucial for the effective use of this group of drugs in the antiproliferative therapy of HNSCC. For example, MLN4924 mediated the release of IL-8, and cortisol induced the resistance of FasL-induced apoptosis of HNSCC cells. QNZ had an antiproliferative effect in some cell lines and was sensitive to FasL-induced cell death, but counteracted IL-8 secretion in this context. This disqualified these agents for use in the therapy of head and neck tumours. In contrast, TPCA-1 qualified as a suitable agent for prospective clinical use due to the following properties:
1) TPCA-1 had an antiproliferative effect,
2) inhibited TNF-a-induced inflammation,
3) down-regulated IL-8 expression,
4) was sensitive to TNF-a-induced cell death,
5) hardly interfered with FasL-mediated apoptosis, and 6) induced apoptosis.
KW  - Plattenepithelcarcinom
KW  - Nuklearfaktor Kappa B
KW  - Targeted therapy
KW  - Apoptose
KW  - Entzündung
KW  - HNSCC
KW  - NfkappaB
KW  - Targetierung
KW  - Apoptose
KW  - Inflammation
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-271521
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TY  - THES
A1  - Shan, Junwen
T1  - Tailoring Hyaluronic Acid and Gelatin for Bioprinting
T1  - Modifikation von Hyaluronsäure und Gelatine für die Anwendung im Biodruck
N2  - In the field of biofabrication, biopolymer-based hydrogels are often used as bulk materials with defined structures or as bioinks. Despite their excellent biocompatibility, biopolymers need chemical modification to fulfill mechanical stability.
In this thesis, the primary alcohol of hyaluronic acid was oxidized using TEMPO/TCC oxidation to generate aldehyde groups without ring-opening mechanism of glycol cleavage using sodium periodate. For crosslinking reaction of the aldehyde groups, adipic acid dihydrazide was used as bivalent crosslinker for Schiff Base chemistry. This hydrogel system with fast and reversible crosslinking mechanism was used successfully as bulk hydrogel for chondrogenic differentiation with human mesenchymal stem cells (hMSC). 
Gelatin was modified with pentenoic acid for crosslinking reaction via light controllable thiol-ene reaction, using thiolated 4-arm sPEG as multivalent crosslinker. Due to preservation of the thermo responsive property of gelatin by avoiding chain degradation during modification reaction, this gelatin-based hydrogel system was successfully processed via 3D printing with low polymer concentration. Good cell viability was achieved using hMSC in various concentrations after 3D bioprinting and chondrogenic differentiation showed promising results.
N2  - Im Bereich der Biofabrikation werden Hydrogele auf Biopolymerbasis häufig als Bulkmaterial mit definierten Strukturen oder als Biotinten verwendet. Obwohl Biopolymere eine hervorragende Biokompatibilität aufweisen, müssen sie jedoch chemisch modifiziert werden, um gewisse mechanische Stabilität für den Einsatz in der Biofabrikation zu erreichen. In dieser Arbeit wurde der primäre Alkohol der Hyaluronsäure mit Hilfe der TEMPO/TCC-Oxidation oxidiert, um Aldehydgruppen zu generieren. Dabei findet kein Ringöffnungsmechanismus statt, wie er bei der Glykolspaltung mit Natriumperiodat vorkommt. Für die Vernetzungsreaktion der Aldehydgruppen wurde Adipinsäuredihydrazid als bivalenter Vernetzer für die Bildung der Schiffschen Base verwendet. Dieses Hydrogelsystem mit schnellem und reversiblem Vernetzungsmechanismus wurde erfolgreich als Bulkhydrogel für die chondrogene Differenzierung mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) erfolgreich eingesetzt. Als Mikrogele könnte das System in künftigen Forschungsarbeiten auf seine Verdruckbarkeit getestet werden.
Gelatine wurde mit Pentensäure modifiziert, um die Vernetzungsreaktion über eine lichtkontrollierbare Thiol-En-Reaktion durchzuführen, bei der thioliertes 4-armiges sPEG als multivalenter Vernetzer verwendet wurde. Da die thermoresponsive Eigenschaft der Gelatine erhalten blieb, indem der Kettenabbau während der Modifizierungsreaktion vermieden wurde, konnte dieses Hydrogelsystem auf Gelatinebasis erfolgreich im 3D-Druck mit niedriger Polymerkonzentration verarbeitet werden. Mit hMSC in verschiedenen Konzentrationen wurde nach dem 3D-Biodruck eine gute Zellviabilität erreicht und die chondrogene Differenzierung zeigte vielversprechende Ergebnisse.
KW  - Hydrogel
KW  - Biomaterial
KW  - Biofabrication of hydrogels
KW  - Biomaterial
KW  - Chemical modification of biopolymers
KW  - Chondrogenic differentiation
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298256
ER  - 
TY  - THES
A1  - Böhm, Christoph
T1  - Thermal Stability of the Polyesters PCL and PLGA during Melt Electrowriting
T1  - Thermische Stabilität der Polyester PCL und PLGA während des Melt Electrowriting Prozesses
N2  - The focus of this thesis was to investigate how PCL and PLGA react to the heat exposure that comes with the MEW process over a defined timespan.
To assess the thermal stability of PCL during MEW over 25 d, an automated collection of fibers has been used to determine the CTS on each day of heating for three different temperatures. PCL is exceptionally stable over 25 d at 75 °C, whereas for 85 °C and 95 °C a slight upward trend during the last 10 d could be observed, which is an indication for thermal degradation. Same trend could be observed for diameter of fibers produced at a fixed collector speed. For all temperatures, CTS during the first 5 d decreased due to inhomogeneities of the melt. Physical analysis of the fibers by XRD and mechanical testing showed no significant changes.
To investigate the chemical details of the thermal durability, PCL was artificially aged over 25 d at 75 °C, 85 °C and 95 °C. Data from GPC analysis and rheology revealed that PCL is degrading steadily at all three temperatures. Combined with GC-MS analysis, two different mechanisms for degradation could be observed: random chain scission and unzipping. Additional GPC experiment using a mixture of PCL and a fluorescence labelled PCL showed that PCL was undergoing ester interchange reactions, which could explain its thermal stability.
PLGA was established successfully as material for MEW. GPC results revealed that PLGA degraded heavily in the one-hour preheating period. To reduce the processing temperature, ATEC was blended with PLGA in three mixtures. This slowed down degradation and a processing window of 6 h could be established. Mechanical testing with fibers produced with PLGA and all three blends was performed. PLGA was very brittle, whereas the blends showed an elastic behavior. This could be explained by ester interchange reactions that formed a loosely crosslinked network with ATEC.
N2  - Ziel dieser Arbeit war, die Veränderung von PCL und PLGA während des MEW-Verfahrens bei bestimmten Temperaturen über einen definierten Zeitraum zu untersuchen.
Für die Bewertung der thermischen Stabilität von PCL während des MEW-Prozesses über 25 d wurden Fasern in einem vorgegebenen Druckmuster gesammelt, um täglich die CTS für drei verschiedene Temperaturen zu bestimmen. Allgemein war PCL bei 75 °C über 25 d thermisch stabil. Allerdings nahm die CTS bei allen Temperaturen während der ersten 5 d aufgrund von Inhomogenitäten der Schmelze ab. Bei 85 °C und 95 °C wurde in den letzten 10 d ein leichter Anstieg der CTS beobachtet, was auf thermische Degradation hinweist. Dieser Anstieg war ebenfalls im Durchmesser der Fasern zu beobachten, die mit konstanter Kollektorgeschwindigkeit hergestellt wurden. Die physikalische Untersuchung der Fasern mittels XRD und mechanischer Tests ergab keine signifikanten Veränderungen.
Um die Chemie der thermischen Beständigkeit zu untersuchen, wurde PCL über 25 d bei 75 °C, 85 °C und 95 °C künstlich gealtert. GPC- und rheologische Analysen zeigten, dass PCL bei allen Temperaturen stetig abbaut. Mit der GC-MS-Analyse konnten zwei Abbaumechanismen beobachtet werden: zufällige Kettenspaltung und Unzipping. GPC-Messungen mit einer Mischung aus PCL und einem fluoreszenzmarkierten PCL zeigten, dass es zu Esteraustauschreaktionen kommt, welche die thermische Stabilität erklären.
PLGA wurde erfolgreich als Material für MEW etabliert. Die GPC-Daten zeigten, dass PLGA während der einstündigen Aufheizphase stark abgebaut wurde. Um die Verarbeitungstemperatur zu senken, wurden drei Mischungen mit verschiedenen Verhältnissen von PLGA und ATEC hergestellt. Dadurch verlangsamte sich der Abbau, wodurch ein Verarbeitungsfenster von 6 h erreicht wurde. Mechanische Tests zeigten für PLGA ein sprödes, für die Mischungen ein elastisches Verhalten. Dies kann durch Esteraustauschreaktionen mit ATEC erklärt werden, durch die ein Polymernetzwerk entstehen könnte.
KW  - Degradation
KW  - Polylactid-co-Glycolid
KW  - Polycaprolacton
KW  - Additive Fertigung
KW  - polycaprolactone
KW  - poly(lactic-co-glycolic acid)
KW  - additive manufacturing
KW  - degradation
KW  - Rapid Prototyping <Fertigung>
KW  - PCL
KW  - PLGA
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-306139
ER  - 
TY  - THES
A1  - Smolan, Willi
T1  - Linear Multifunctional PEG-Alternatives for Bioconjugation and Hydrogel Formation
T1  - Lineare Multifunktionelle PEG-Alternativen für Biokonjugation und Hydrogelbildung
N2  - The objective of this thesis was the synthesis and characterisation of two linear multifunctional PEG-alternatives for bioconjugation and hydrogel formation: i) Hydrophilic acrylate based copolymers containing peptide binding units and ii) hydrophilic polyether based copolymers containing different functional groups for a physical crosslinking. 
In section 3.1 the successful synthesis of water soluble and linear acrylate based polymers containing oligo(ethylene glycol) methyl ether acrylate with either linear thioester functional 2-hydroxyethyl acrylate, thiolactone acrylamide, or vinyl azlactone via the living radical polymerisation technique Reversible Addition Fragmentation Chain Transfer (RAFT) and via free-radical polymerisation is described. The obtained polymers were characterized via GPC, 1H NMR, IR and RAMAN spectroscopy.
The RAFT end group was found to be difficult to remove from these short polymer chains and accordingly underwent the undesired side reaction aminolysis with the peptide during the conjugation studies. Besides that, polymers without RAFT end groups did not show any binding of the peptide at the thioester groups, which can be improved in future by using higher reactant concentrations and higher amount of binding units at the polymer. Polymers containing the highly reactive azlactone group showed a peptide binding of 19 %, but unfortunately this function also underwent spontaneous hydrolysis before the peptide could even be bound. In all cases, oligo(ethylene glycol) methyl ether acrylate was used with a relatively high molecular weight (Mn = 480 Da) was used, which eventually was efficiently shielding the introduced binding units from the added peptide. In future, a shorter monomer with Mn = 300 Da or less or hydrophilic N,N’-dialkyl acrylamide based polymers with less steric hindrance could be used to improve this bioconjugation system. Additionally, the amount of monomers containing peptide binding units in the polymer can be increased and have an additional spacer to achieve higher loading efficiency.
The water soluble, linear and short polyether based polymers, so called polyglycidols, were successfully synthesized and modified as described in section 3.2. The obtained polymers were characterized using GPC, 1H NMR, 31P{1H} NMR, IR, and RAMAN spectroscopy. The allyl groups which were present up to 20 % were used for radical induced thiol-ene chemistry for the introduction of functional groups intended for the formation of the physically crosslinking hydrogels. For the positively charged polymers, first a chloride group had to be introduced for the subsequent nucleophilic substitution with the imidazolium compound. There, degrees of modifications were found in the range 40-97 % due to the repulsion forces of the charges, decreased concentration of active chloride groups, and limiting solution concentrations of the polymer for this reaction. For the negatively charged polymers, first a protected phosphonamide moiety was introduced with a deprotection step afterwards showing 100 % conversion for all reactions. Preliminary hydrogel tests did not show a formation of a three-dimensional network of the polymer chains which was attributed to the short backbone length of the used polymers, but the gained knowledge about the synthetic routes for the modification of the polymer was successfully transferred to longer linear polyglycidols. The same applies to the introduction of electron rich and electron poor compounds showing π-π stacking interactions by UV-vis spectroscopy. 
Finally, long linear polyglycidyl ethers were synthesised successfully up to molecular weights of Mn ~ 30 kDa in section 3.3, which was also proven by GPC, 1H NMR, IR and RAMAN spectroscopy. This applies to the homopolymerisation of ethoxyethyl glycidyl ether, allyl glycidyl ether and their copolymerisation with an amount of the allyl compound ~ 10 %. Attempts for higher molecular weights up to 100 kDa showed an uncontrolled polymerisation behaviour and eventually can be improved in future by choosing a lower initiation temperature. Also, the allyl side groups were modified via radical induced thiol-ene chemistry to obtain positively charged functionalities via imidazolium moieties (85 %) and negatively charged functionalities via phosphonamide moieties (100 %) with quantitative degree of modifications. Hydrogel tests have still shown a remaining solution by using long linear polyglycidols carrying negative charges with long/short linear polyglycidols carrying positive charges. The addition of calcium chloride led to a precipitate of the polymer instead of a three-dimensional network formation representing a too high concentration of ions and therefore shielding water molecules with prevention from dissolving the polymer. These systems can be improved by tuning the polymers structure like longer polymer chains, longer spacer between polymer backbone and charge, and higher amount of functional groups. 
The objective of the thesis was partly reached containing detailed investigated synthetic routes for the design and characterisation of functional polymers which could be used in future with improvements for bioconjugation and hydrogel formation tests.
N2  - Das Ziel dieser Arbeit war es zwei lineare multifunktionale PEG-Alternativen für die Bioconjugation und Hydrogelbildung herzustellen und zu charakterisieren: i) Wasserlösliche Acrylat-basierte Copolymere mit Peptidbindungseinheiten und ii) wasserlösliche Polyether-basierte Copolymere mit verschiedenen funktionalen Gruppen für eine physikalische Vernetzung. 
In Abschnitt 3.1 wurde die erfolgreiche Synthese von wasserlöslichen und linearen Acrylat-basierten Polymeren, die Oligo(ethylen glycol) methyl ether acrylat mit jeweils 2-Hydroxyethyl acrylate modifiziert mit linearem Thioester, Thiolactonacrylamid und Vinylazlacton enthielten, mittels der lebenden Polymerisationstechnik Reversible Additions-Fragmentierungs Kettenübertragung (RAFT) und mittels freier radikalischer Polymerisation durch GPC, 1H NMR, IR und RAMAN Spektroskopie bewiesen. Es erwies sich als schwer die RAFT-Endgruppe von den kurzen Polymerketten zu entfernen und führte zur Nebenreaktion Aminolyse mit dem Peptid während des Konjugationsprozesses. Außerdem zeigten Polymere ohne RAFT-Endgruppen keine Peptidbindung an den Thioestergruppen, was durch höhere Konzentration der Reaktanten und größeren Anteil an Peptidbindungseinheiten am Polymer in Zukunft verbessert werden könnte. Polymere mit Azlaktongruppen zeigten eine Bindung von 19 %, wobei dies eine sehr reaktive Gruppe ist und vor der Peptidbindung noch hydrolysieren kann. In allen Fällen wurde Oligo(ethylen glycol) methyl ether acrylat mit Mn = 480 Da verwendet, welches die Peptidbindungsstellen abschirmen kann. Daher können in Zukunft Monomere mit Mn = 300 Da oder N,N’-Dialkylacrylamid-basierte Monomere mit weniger sterischer Hinderung für dieses System verwendet werden. Zusätzlich kann der Anteil an Monomeren mit Peptidbindungseinheiten im Polymer und zusätzlicher Seitenkette erhöht werden, um höhere Bindungseffektivitäten zu erreichen. 
Die erfolgreiche Synthese und Modifikation von wasserlöslichen, linearen und kurzen Polyether-basierten Polymeren, sogenannten Polyglycidolen, konnte in Abschnitt 3.2 mittels GPC, 1H NMR, 31P{1H} NMR, IR und RAMAN Spektroskopie bewiesen werden. Die Allylgruppe, die bis zu 20 % vorhanden war, wurde für die radikalisch induzierte Thiol-En Chemie zur Einführung von funktionellen Gruppen verwendet. Für die positiv geladenen Polymere, wurde zuerst eine Chloridgruppe generiert, die anschließend für die nukleophile Substitution mit einer Imidazolkomponente verwendet wurde. Dabei wurden Substitutionsgrade von 40-97 % gefunden, was an den Abstoßungskräften der Ladungen, verringerter Konzentration der aktiven Chloridgruppen und der begrenzten Löslichkeitskonzentration bei dieser Reaktion liegt. Für die negativ geladenen Polymere wurde zuerst eine geschützte Phosphonamidgruppe eingeführt, die anschließend entschützt wurde und bei allen Reaktionen einen Umsatz von 100 % zeigte. Vorläufige Hydrogeltests zeigten keine Bildung eines dreidimensionales Netzwerks der Polymerketten aber es wurden Erkenntnisse über die synthetischen Routen für die Modifikation der Polymere für den Transfer auf lange lineare Polyglycidole gewonnen. Das gleiche gilt für die Einführung von elektronreichen und elektronarmen Komponenten, die eine π-π Stapelwechselwirkung mittels UV-vis Spektroskopie zeigte. 
Letztlich wurden lange lineare Polyglycidole bis zu Molmassen von Mn ~ 30 kDa erfolgreich in Abschnitt 3.3 hergestellt und mittels GPC, 1H NMR, IR and RAMAN Spektroskopie bewiesen. Dies gilt für die Homopolymerisation von Ethoxyethyl glycidyl ether, Ally glycidyl ether und deren Copolymerisation mit einem Anteil der Allylkomponente von ~ 10 %. Versuche um höhere Molekulargewichte bis zu 100 kDa zeigten ein unkontrolliertes Polymerisationsverhalten, welches durch eine niedrigere Initiierungstemperatur weiter verbessert werden kann. Ebenso wurden die Allylseitengruppen mittels radikalisch induzierter Thiol-En Chemie modifiziert, um positivgeladene Funktionalitäten durch Imidazolgruppen (85 %) und negativgeladene Funktionalitäten durch Phosphonamidgruppen (100 %) in quantitativen Umsätzen einzuführen. Hydrogeltests von langen linearen Polyglycidolen, die negativ geladene Gruppen haben, mit langen/kurzen linearen Polyglycidolen, die positiv geladene Gruppen haben, haben eine verbleibende Lösung gezeigt. Die Zugabe von Calciumchlorid führte zum Ausfall des Polymers anstatt zu einem dreidimensionalen Netzwerk repräsentiert durch eine zu hohe Ionenkonzentration. Dies führte zu einer Abschirmung der Wassermoleküle vom Polymer und verhinderte, dies aufzulösen. Das System kann verbessert werden, indem die Polymerstruktur variiert wird, z.B. durch längere Polymerketten, größere Abstände zwischen Polymerhauptkette und Ladung und einen größeren Anteil an funktionellen Gruppen.
Das Ziel der Arbeit wurde teilweise erreicht, welches detailliert untersuchte Syntheserouten für das Design und die Charakterisierung von funktionellen Polymeren beinhaltet, welche in Zukunft mit Verbesserungen für Bioconjuations- und Hydrogelformulierungstests verwendet werden können.
KW  - Wasserlösliche Polymere
KW  - Ringöffnungspolymerisation
KW  - Hydrogel
KW  - polyglycidol
KW  - RAFT
KW  - polymer-peptide-conjugate
KW  - ring opening polymerisation
KW  - thiol-ene
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-278734
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weigl, Franziska
T1  - Correlation of FluidFM® Technology and Fluorescence Microscopy for the Visualization of Cellular Detachment Steps
T1  - Korrelation der FluidFM® Technologie und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von zellulären Ablöseschritten
N2  - This thesis aimed the development of a correlated device which combines FluidFM® with Fluorescence Microscopy (FL) (FL-FluidFM®) and enables the simultaneous quantification of adhesion forces and fluorescent visualization of mature cells. The implementation of a PIFOC was crucial to achieve a high-resolution as well as a stable but dynamic focus level. The functionality of SCFS after hardware modification was verified by comparing two force-curves, both showing the typical force progression and measured with the optimized and conventional hardware, respectively. Then, the integration of FL was examined by detaching fluorescently labeled REF52 cells. The fluorescence illumination of the cytoskeleton showed the expected characteristic force profile and no evidence of interference effects. Afterwards a corresponding correlative data analysis was addressed including manual force step fitting, the identification of visualized cellular unbinding, and a time-dependent correlation. This procedure revealed a link between the area of cytoskeletal unbinding and force-jumps. This was followed by a comparison of the detachment characteristics of intercellular connected HUVECs and individual REF52 cells. HUVECs showed maximum detachment forces in the same order of magnitude as the ones of single REF52 cells. This contrasted with the expected strong cohesiveness of endothelial cells and indicated a lack of cell-cell contact formation. The latter was confirmed by a comparison of HUVECs, primary HBMVECs, and immortalized EA.hy926 cells fluorescently labeled for two marker proteins of intercellular junctions. This unveiled that both the previous cultivation duration and the cell type have a major impact on the development of intercellular junctions. In summary, the correlative FL FluidFM® represents a powerful novel approach, which enables a truly contemporaneous performance and, thus, has the potential to reveal new insights into the mechanobiological properties of cell adhesion.
N2  - Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines korrelierten Gerätes, das FluidFM® mit Fluoreszenzmikroskopie (FL) kombiniert (FL-FluidFM®) und die gleichzeitige Quantifizierung von Adhäsionskräften und Fluoreszenzvisualisierung ausgereifter Zellen ermöglicht. Die Implementierung eines PIFOC war entscheidend, um eine hohe Auflösung sowie ein stabiles, aber dynamisches Fokusniveau zu erreichen. Die Funktionalität der SCFS nach der Hardwaremodifikation wurde durch den Vergleich zweier Kraftkurven verifiziert, die beide den typischen Kraftverlauf zeigten und jeweils mit der optimierten bzw. konventionellen Hardware gemessen wurden. Anschließend wurde die Integration von FL durch das Ablösen fluoreszenzmarkierter REF52-Zellen untersucht. Unter Fluoreszenzbeleuchtung des Zytoskeletts zeigte sich das erwartete charakteristische Kraftprofil und kein Hinweis auf Störeffekte. Anschließend wurde eine entsprechende korrelative Datenanalyse durchgeführt, die eine manuelle Kraftstufenanpassung, die Identifizierung der visualisierten zellulären Ablösung und eine zeitabhängige Korrelation umfasste. Dieses Verfahren ergab einen Zusammenhang zwischen dem Bereich der Zytoskelett-Ablösung und den Kraftsprüngen. Es folgte ein Vergleich der Ablösungseigenschaften von interzellulär verbundenen HUVECs und einzelnen REF52-Zellen. HUVECs zeigten maximale Ablösekräfte in der gleichen Größenordnung wie die von einzelnen REF52-Zellen.
Dies stand im Gegensatz zu der erwarteten starken Kohäsion von Endothelzellen und deutete auf eine fehlende Zell-Zell-Kontaktbildung hin. Letzteres wurde durch einen Vergleich von HUVECs, primären HBMVECs und immortalisierten EA.hy926-Zellen bestätigt, die für zwei Markerproteine für interzelluläre Verbindungen fluoreszierend markiert wurden. Dabei zeigte sich, dass sowohl die vorherige Kultivierungsdauer als auch der Zelltyp einen großen Einfluss auf die Entwicklung von interzellulären Verbindungen haben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das korrelative FL-FluidFM® einen leistungsstarken neuen Ansatz darstellt, der eine korrelative Durchführung ermöglicht und somit das Potenzial hat, neue Erkenntnisse über die mechanobiologischen Eigenschaften der Zelladhäsion zu liefern
KW  - Correlative microscopy
KW  - FluidFM
KW  - Fluorescence Microscopy
KW  - Cell adhesion
KW  - Korrelative Mikroskopie
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298763
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seifert, Annika Kristina
T1  - Unidirectional freezing of soft and hard matter for biomedical applications
T1  - Unidirektionales Gefrieren von weichen und harten Materialien für biomedizinische Anwendungen
N2  - A multitude of human tissues, such as bones, tendons, or muscles, are characterized by a hierarchical and highly ordered structure. In many cases, the loss of these tissues requires reconstruction using biocompatible replacement materials. In the field of bone replacement, the pore structure of the material has a crucial influence. Anisotropic porosity would have the advantage of facilitating the ingrowth of cells and newly formed blood vessels as well as the transport of nutrients.
In this thesis, scaffolds with a highly ordered and anisotropic pore structure were fabricated using unidirectional freezing. 
Systematic investigations were carried out on biopolymer solutions (alginate and chitosan) to gain a deeper understanding of the freeze-structuring process. The knowledge gained was then applied to the development of anisotropically structured bone substitute materials. Here, the previously existing material platform for anisotropically structured calcium phosphates was extended to low-temperature phases such as calcium deficient hydroxyapatite (CDHA) or the secondary phosphates monetite and brushite. 
After the implantation of a biomaterial, the inevitably triggered initial immune response plays a key role in the success of a graft, with immune cells such as neutrophils or macrophages being of particular importance. In this thesis, the influence of anisotropically structured alpha-TCP and CDHA scaffolds as well as their unstructured references on human monocytes/macrophages was investigated. Macrophages produced extracellular traps (ETs) due to mineral nanoparticles formed by the binding of phosphate and calcium ions to human platelet lysate. In particular, incubation of alpha-TCP samples in lysate containing cell culture medium resulted in pronounced particle formation and enhanced release of ETs.
N2  - Eine Vielzahl menschlicher Gewebe, wie beispielsweise Knochen, Sehnen oder Muskeln, ist durch eine hierarchische und zum Teil hochgradig geordnete Struktur gekennzeichnet. Der beispielsweise durch Unfälle oder Krankheiten bedingte Verlust dieser Gewebe erfordert in vielen Fällen eine Rekonstruktion mit biokompatiblen Ersatzmaterialien. Neben der chemischen Zusammensetzung spielt deren Architektur eine wichtige Rolle für die Geweberegeneration und schließlich den Heilungserfolg des Implantats. Auch im Bereich des Knochenersatzes hat die Porenstruktur des Materials hierauf einen zentralen Einfluss, wobei der Einsatz von Materialien mit anisotroper Porosität neben der strukturellen Nachahmung des Gewebes den Vorteil hätte, dass das Einwachsen von Zellen und neu gebildeten Blutgefäßen sowie der Nährstofftransport erleichtert würden.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden anisotrop poröse Scaffolds mit einer hochgradig geordneten Porenstruktur mit Hilfe der Gefrierstrukturierung hergestellt. Hierfür wurde eine in früheren Arbeiten entwickelte Anlage verwendet, um einen definierten Temperaturgradienten in der Probe zur gerichteten Erstarrung zu erzeugen.  Der Kern des Systems besteht aus zwei übereinander angeordneten Peltier-Elemente (PEs), zwischen denen sich die Probenlösung befindet. Durch die Variation der PE-Temperaturen kann das Eiskristallwachstum und schließlich die Porenstruktur innerhalb des Biomaterials gezielt beeinflusst und an die Anforderungen einer gewünschten Anwendung angepasst werden.
Das Ziel dieser Arbeit war, ein tieferes Verständnis des Gefrierstrukturierungsprozesses zu erlangen und die gewonnenen Erkenntnisse auf die Entwicklung anisotrop poröser Knochenersatzmaterialien zu übertragen. Hierfür wurden in Kapitel 3 zunächst systematische Untersuchungen an Biopolymerlösungen (Alginat und Chitosan) durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass neben dem äußeren Temperaturgradienten auch die Temperaturen der PEs, die Kühlrate sowie Materialeigenschaften wie das Molekulargewicht, die Konzentration und die Viskosität der Lösung die Porenstruktur beeinflussen. Die Temperatur des Gesamtsystems bestimmte sowohl die Kühlrate als auch die Porendurchmesser, so dass höhere Kühlraten zu kleineren Poren führten. Die Porenorientierung konnte hingegen durch den externen Temperaturgradienten beeinflusst werden, wobei die Poren mit steigendem Gradienten zunehmend senkrecht zur Probenoberfläche orientiert ausgerichtet waren. Bestimmte Parameterkonstellationen, wie beispielsweise eine Temperatur der unteren Kühlfläche unterhalb von  60 °C kombiniert mit einer geringen Temperatur des oberen PE sowie eine hohe Viskosität (über 5 Pas nahe 0 °C) der Vorlösung führten allerdings dazu, dass die Porenausrichtung nicht mehr kontrollierbar war.
Auf Basis von Kapitel 4 konnte die bis dato für anisotrop strukturierte Calciumphosphate existierende Materialplattform auf Niedrigtemperaturphasen wie calciumarmen Hydroxylapatit (CDHA) oder die sekundären Phosphate Monetit und Bruschit erweitert werden. Hierfür wurde gesintertes oder ungesintertes -Tricalciumphosphat (-TCP) mit anisotroper Porenstruktur durch hydrothermale Behandlung oder Inkubation in Phosphorsäure in die oben genannten Phasen umgewandelt. Durch die hydrothermale Behandlung konnte sowohl bei ungesinterten als auch bei gesinterten -TCP-Proben eine Phasenumwandlung in CDHA erzielt werden. Die Inkubation in Phosphorsäure führte zu einer Umwandlung in Monetit und Bruschit. Durch die hydrothermale Behandlung für 72 h bei 175 °C erhöhte sich die Porosität der ungesinterten Proben geringfügig von 85 % auf 88 %, während bei den gesinterten Proben ein Anstieg von 75 % auf 88 % zu beobachten war. Darüber hinaus ging eine Phasenumwandlung in CDHA durch die Bildung von feinen Kristallnadeln und -plättchen mit einer Vergrößerung der spezifischen Oberfläche einher. Hinsichtlich der mechanischen Eigenschaften war besonders bemerkenswert, dass die Druckfestigkeit der ungesinterten Proben durch die Phasenumwandlung in Monetit signifikant von (0.76  0.11) auf (5.29  0.94) MPa erhöht wurde.
In Kapitel 5 wurde der Einfluss von anisotrop porösen -TCP und CDHA Scaffolds sowie unstrukturierten und aus den gleichen Calciumphosphatphasen bestehenden Referenzproben auf humane Monozyten/Makrophagen untersucht. Nach der Implantation eines Biomaterials spielt die unweigerlich ausgelöste erste Immunreaktion eine Schlüsselrolle für den Erfolg eines Transplantats, wobei Immunzellen wie Neutrophile oder Makrophagen eine entscheidende Rolle spielen. Makrophagen können zur Immobilisierung und zum Abtöten von Mikroorganismen extrazelluläre Fasern (ETs) produzieren. Während in früheren Arbeiten nachgewiesen werden konnte, dass Neutrophile als Reaktion auf Biomaterialien ETs produzieren können, wurde dieser Mechanismus für Makrophagen erstmals in der vorliegenden Doktorarbeit gezeigt. Die ET-Freisetzung wurde von mineralischen Nanopartikeln ausgelöst, welche durch die Bindung von Phosphat- und Calciumionen an menschliches Thrombozytenlysat gebildet wurden. Insbesondere die Inkubation von  TCP Proben in lysathaltigem Zellkulturmedium führte zu einer ausgeprägten Partikelformierung und schließlich zu einer verstärkten Bildung von ETs. Dies ging mit einer erhöhten Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen im Vergleich zu CDHA einher. 
An diese Arbeit anschließende Experimente könnten beispielsweise die Wiederholung von systematischen Studien, wie sie in Kapitel 3 für Biopolymere vorgestellt wurden, mit synthetischen Polymeren wie Polyvinylalkohol (PVA) umfassen. PVA ist ein für den Einsatz als Kryoprotektor vielversprechendes Material, dessen Verwendung für die Kryokonservierung von biologischen Materialien zwingend notwendig ist. Darüber hinaus wäre die Durchführung von in vivo Experimenten erforderlich, um die starke Freisetzung von ETs durch Makrophagen als Reaktion auf strukturierte -TCP Scaffolds sowie die geringere Expression auf CDHA Scaffolds eingehender zu analysieren.
KW  - Freezing
KW  - Morphology
KW  - Unidirectional Freezing
KW  - Anisotropic structures
KW  - Calcium phosphate-based biomaterials
KW  - Macrophage extracellular traps
KW  - Gefrierstrukturierung
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-277281
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nadolinski, Annemarie
T1  - Einfluss des extrusionsbasierten 3D-Drucks von Einzelzellen und Sphäroiden in Alginat-Gelatine-Hydrogelen auf die chondrogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stromazellen
T1  - Impact of extrusion-based 3D printing of single cells and spheroids in alginate-gelatin hydrogels on chondrogenic differentiation of human mesenchymal stromal cells
N2  - Knorpeldefekte gelten in der Medizin als besonders schwierig zu beheben, da das avaskuläre und aneurale hyaline Knorpelgewebe nur über sehr begrenzte Selbstheilungskräfte verfügt. Die Entwicklung neuer klinischer Therapien für eine erfolgreiche Regeneration bis hin zum vollständigen Ersatz von beschädigtem oder erkranktem Knorpel stellt daher das Ziel umfangreicher Forschung dar. Darüber hinaus zeichnet sich Knorpel durch eine organisierte, zonale Zell-Matrix-Verteilung und -Dichte aus, die möglichst naturgetreu nachgebildet werden muss, um einen adäquaten Gelenkknorpelersatz zu schaffen. Das dreidimensionale Bioprinting von humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) in Hydrogelen ist hierbei ein vielversprechender Ansatz. Es sind jedoch umfangreiche Studien erforderlich, um herauszufinden, wie 3D-Stammzellkonstrukte mit unterschiedlichen Zelldichten und Zell-Zell-Wechselwirkungen in einer gedruckten Hydrogel Matrix interagieren. Deshalb wurde in dieser Arbeit untersucht, ob die mesenchymalen Stromazellen in Form von Einzelzellen oder Sphäroiden durch das Extrusionsdruckverfahren in ihrer Proliferationsfähigkeit und ihrem chondrogenen Differenzierungspotential beeinträchtigt werden. 
Hierfür wurden in dieser Arbeit sowohl das Zellüberleben als auch Proliferations- und Differenzierungsmarker in gedruckten und nicht gedruckten Proben mit Einzelzellkonzentrationen von 2-20 Millionen Zellen sowie bei Sphäroiden mit ca 4000 Zellen/Sphäroid untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das extrusionsbasierte Druckverfahren keine negativen Auswirkungen auf die Überlebensfähigkeit und die Proliferation der hMSCs hat. Zum Nachweis der chondrogenen Differenzierung wurden mehrere Experimente durchgeführt. Durch die Expression von Typ-II-Kollagen und Aggrecan sowie durch die Quantifizierung von GAG welches zu einem großen Teil in der ECM von Knorpelgewebe zu finden ist, konnte bestätigt werden, dass die mesenchymalen Stromazellen durch den Druckprozess ihr chondrogenes Differenzierungspotential nicht einbüßen. Die beim 3D-Bioprinting auftretenden Scherkräfte scheinen die in-vitro Chondrogenese sogar ohne chemische Stimulation durch TGF-β1 anzustoßen. Außerdem zeigten die Sphäroidgruppen ein höheres chondrogenes Differenzierungspotential als die Einzelzellgruppen. 
Um dies im Zusammenhang mit dem 3D Extrusionsdruckverfahren zu bestätigen, erscheint es sinnvoll, weitere Versuche mit noch höheren Zellkonzentrationen in Form von Sphäroiden durchzuführen. Zusammenfassend zeigte sich in dieser Arbeit, dass das extrusionsbasierte Druckverfahren in Alginat/Gelatine Hydrogelen keine Zellschädigung verursacht und weder die chondrogene Differenzierung von Einzelzellen noch von Sphäroiden beeinträchtigt.
N2  - Cartilage defects are considered particularly difficult to repair in medicine, since avascular and aneural hyaline cartilage tissue has only very limited self-healing capabilities. The development of new clinical therapies for successful regeneration to complete replacement of damaged or diseased cartilage therefore represents the goal of extensive research. In addition, cartilage is characterized by an organized, zonal cell-matrix distribution and density that must be replicated as closely as possible to nature in order to create an adequate articular cartilage replacement. Three-dimensional bioprinting of human mesenchymal stromal cells (hMSCs) in hydrogels is a promising approach in this regard. However, extensive studies are needed to determine how 3D stem cell constructs interact with different cell densities and cell-cell interactions in a printed hydrogel matrix. Therefore, this work investigated whether the mesenchymal stromal cells in the form of single cells or spheroids are affected in their proliferative capacity and chondrogenic differentiation potential by the extrusion printing process. 
For this purpose, cell survival as well as proliferation and differentiation markers were investigated in this work in printed and non-printed samples with single cell concentrations of 2-20 million cells and in spheroids with approximately 4000 cells/spheroid. It was shown that the extrusion-based printing process had no negative effects on the survival and proliferation of hMSCs. Several experiments were performed to demonstrate chondrogenic differentiation. By expressing type II collagen and aggrecan and quantifying GAG which is largely found in the ECM of cartilage tissue, it was confirmed that the mesenchymal stromal cells do not lose their chondrogenic differentiation potential by the printing process. The shear forces involved in 3D bioprinting appear to trigger in vitro chondrogenesis even without chemical stimulation by TGF-β1. In addition, the spheroid groups showed a higher chondrogenic differentiation potential than the single cell groups. 
To confirm this in the context of the 3D extrusion printing process, it seems reasonable to perform further experiments with even higher cell concentrations in the form of spheroids. In summary, this work showed that the extrusion-based printing process in alginate/gelatin hydrogels does not cause cell damage and does not affect the chondrogenic differentiation of either single cells or spheroids.
KW  - Tissue Engineering
KW  - Bioprinting
KW  - Mesenchymale Stromazellen
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280472
ER  - 
TY  - THES
A1  - Brückner [geb. Christel], Theresa
T1  - Novel application forms and setting mechanisms of mineral bone cements
T1  - Neuartige Anwendungsformen und Abbindemechanismen mineralischer Knochenzemente
N2  - Calcium phosphate cements (CPC) represent valuable synthetic bone grafts, as they are self-setting, biocompatible, osteoconductive and in their composition similar to the inorganic phase of human bone. Due to their long shelf-life, neutral setting and since water is sufficient for setting, hydroxyapatite (HA) forming cements are processed in different paste formulations. Those comprise dual setting, Ca2+ binding and premixed cement systems. With dual setting formulations, both dissolution and precipitation of the cement raw powder occur simultaneously to the polymerization of water-soluble monomers to form a hydrogel. Chelating agents are able to form complexes with Ca2+ released from the raw powder. Premixed systems mostly contain the raw powder of the cement and a non-aqueous binder liquid which delays the setting reaction until application in the moist physiological environment. In the present work, two of those reaction mechanisms allowed the development of HA based cement applications.
Drillable cements are of high clinical interest, as the quality of screw and plate osteosynthesis techniques can be improved by cement augmentation. A drillable, dual setting composite from HA and a poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogel was analyzed with respect to the influence of monomer content and powder-to-liquid ratio on setting kinetics and mechanical outcome. While the conversion to HA and crystal growth were constantly confined with increased monomer amount, a minimum concentration of 50 % was required to see impressive ameliorations including a low bending modulus and high fracture energy at improved bending strength. Increasing the liquid amount enabled injection of the paste as well as drilling after 10 min of pre-setting.
While classic bone wax formulations have drawbacks such as infection, inflammation, hindered osteogenesis and a lack of biodegradability, the as-presented premixed formulation is believed to exhibit outmatching properties. It consisted of HA raw powders and a non-aqueous, but water-miscible carrier liquid from poly(ethylene glycol) (PEG). The bone wax was proved to be cohesive and malleable, it withstood blood pressure conditions and among deposition in an aqueous environment, PEG was exchanged such that porous, nanocrystalline HA was formed. Incorporation of a model antibiotic proved the suitability of the novel bone wax formulation for drug release purposes.
Prefabricated laminates from premixed carbonated apatite forming cement and poly(ε-caprolactone) fiber mats with defined pore architecture were presented as a potential approach for the treatment of 2-dimensional, curved cranial defects. They are flexible until application and were produced in a layer-by-layer approach from both components such that the polymer scaffold prevents the cement from flowing. It was demonstrated that solution electrospinning with a patterned collector for the fabrication of perforated fiber mats was suitable, as high fiber volume contents in combination with an appropriate interface enabled the successful fabrication of mechanically reinforced laminates. Mild immersion of the scaffolds under alkaline conditions additionally improved the interphase followed by an increase in bending-strength.
Since few years, magnesium phosphate cements (MPC) have attracted increasing attention for bone replacement. Compared to CPC, MPC exhibit a higher degradation potential and high early strength and they release biologically valuable Mg2+. However, common systems offer some challenges while using them in non-classic cement formulations such as the need for foreign ion supply, the potential acidity of the reaction or the fast setting kinetics. Here, it was possible to develop a chelate-setting MPC paste with a broad spectrum of potential applications.
The general mechanism of the novel setting principle was tested in a proof-of-principle manner. The cement paste consisted of farringtonite with differently concentrated phytic acid solution for chelate formation with Mg2+ from the raw powder. Adjusting the phytic acid content and adding a magnesium oxide as setting regulator to compensate its retarding effect resulted in drillable formulations. Additionally, there is a strong clinical demand for well working bone adhesives especially in a moist environment. Mostly the existing formulations are non-biodegradable.  Ex vivo adhesion of the above presented MPC under wet conditions on bone demonstrated over a course of 7 d shear strengths of 0.8 MPa. Further, the hardened cement specimens showed a mass loss of 2 wt.% within 24 d in an aqueous environment and released about 0.17 mg/g of osteogenic Mg2+ per day. Together with the demonstrated cytocompatibility towards human fetal osteoblasts, this cement system showed promising characteristics in terms of degradable biocements with special application purposes.
N2  - Calciumphosphatzemente (CPC) stellen ein bedeutsames Knochenersatzmaterial dar, da sie selbstabbindend, biokompatibel, osteokonduktiv und der anorganischen Komponente humanen Knochens ähnlich sind. Durch ihre Lagerstabilität, neutrale Abbindereaktion und da Wasser zum Abbinden ausreicht, werden Hydroxylapatit (HA) bildende Zemente in dual abbindenden, Ca2+ chelatisierenden und vorgefertigten Zementen, verarbeitet. Bei dual abbindenden Formulierungen findet die Lösungs-Fällungs-Reaktion zeitgleich zur Polymerisation wasserlöslicher Monomere zu einem Hydrogel statt. Chelatbildner können mit aus dem Rohpulver freigesetzten Ca2+ Komplexe bilden. Vorgefertigte Zemente enthalten eine nicht-wässrige Trägerflüssigkeit, welche die Abbindereaktion bis zur Anwendung des Zements im feuchten Milieu verzögert. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei dieser Reaktionsmechanismen zur Entwicklung HA basierter Anwendungsformen eingesetzt.
Bohrbare Zemente sind von klinischem Interesse, da die Qualität einer Schrauben- oder Plattenosteosynthese durch Augmentation mit Zement verbessert werden kann. Bei einem bohrbaren, dual abbindenden Komposit aus HA und einem Poly-2-Hydroxyethylmethacrylat Hydrogel wurde der Einfluss des Monomergehalts und des Pulver-zu-Flüssigkeits-Verhältnisses auf die Abbindekinetik und mechanischen Eigenschaften untersucht. Während die Umwandlung zu HA und das Kristallwachstum mit zunehmendem Monomergehalt reduziert wurden, war eine minimale Konzentration von 50 % nötig, um signifikante Verbesserungen des Bruchverhaltens im Sinne eines niedrigen Biegemoduls und einer hohen Bruchenergie bei gesteigerter Biegefestigkeit nachzuweisen. Wurde der Flüssigkeitsgehalt erhöht, so konnte die Paste injiziert und nach 10 min des Abbindens gebohrt werden.
Während klassische Knochenwachsformulierungen Infektionen, Entzündungen, gehinderte Knochenneubildung und mangelhafte Bioabbaubarkeit vorweisen, zeigt die hier dargestellte Formulierung überlegene Eigenschaften. Sie bestand aus HA-Rohpulvern und einer nicht-wässrigen, mit Wasser mischbaren Trägermasse aus Polyethylenglycol (PEG). Es wurde gezeigt, dass das Wachs kohäsiv und knetbar ist und Blutdruckbedingungen standhält. Bei Kontakt mit einer wässrigen Phase wurde das PEG diffusiv mit Wasser ausgetauscht, so dass ein poröser, nanokristalliner HA präzipitierte. Die Einbettung eines Modell-Antibiotikums bestätigte zudem die Eignung des neuartigen Wachses als Wirkstoffdepot.
Als eine mögliche Behandlung von 2-dimensionalen, gekrümmten Defekten der Schädeldecke wurden präfabrizierte Laminate aus lagerstabiler, Carbonatapatit bildender Zementpaste und Polycaprolakton-Fasermatten mit definierter Porenarchitektur vorgestellt. Diese sind bis zu ihrer Anwendung flexibel und wurden durch einen schichtweisen Aufbau aus beiden Komponenten erzeugt, so dass der Polymerscaffold den Zement am Zerfließen hindert. Es wurde gezeigt, dass die Herstellung makroporöser Fasermatten durch Elektrospinnen aus der Lösung mittels eines perforierten Kollektors geeignet war, da der hohe Faservolumengehalt und angemessene Grenzflächeneigenschaften die erfolgreiche Herstellung mechanisch verstärkter Laminate ermöglichte. Bei milder Behandlung der Scaffolds mit alkalischer Lösung wurden die Grenzflächeneigenschaften weiter verbessert, was zu einer Steigerung der Biegefestigkeit führte.
Seit einigen Jahren geht der Trend der Knochenzementforschung immer stärker in Richtung von Magnesiumphosphatzementen (MPC), da diese verglichen mit CPC ein erhöhtes Degradationspotential, eine hohe initiale Festigkeit, sowie die Freisetzung biologisch wertvoller Mg2+ aufweisen. Jedoch stellen gängige Systeme hohe Anforderungen bei der Verwendung in nicht-klassischen Zementen wie z.B. der Bedarf an Fremdionen und die saure sowie schnelle Abbindereaktion. Dennoch war es möglich, einen chelatisierenden MPC zu entwickeln, welcher ein breites Spektrum an möglichen Anwendungsformen bot.
In einer Machbarkeitsstudie wurde untersucht, ob das Abbindeprinzip funktioniert. Die Paste bestand aus Farringtonit und unterschiedlich konzentrierter Phytinsäure. Diese sollte mit freigesetzten Mg2+ komplexieren. Durch Anpassung der Phytinsäurekonzentration und Zugabe von Magnesiumoxid als Abbindemodulator wurden bohrbare Formulierungen erhalten. Neben der Bohrbarkeit sind auch adhäsive Eigenschaften der Zemente im feuchten Milieu von klinischem Interesse, wobei kommerziell erhältliche Systeme meist nicht bioabbaubar sind. Daher wurde die ex vivo Klebehaftung dieses MPC nach 7 d unter nassen Bedingungen auf Knochen analysiert, wobei sich eine Abscherfestigkeit von 0.8 MPa ergab. Des Weiteren zeigten diese Zemente einen Masseverlust von 2 Gew.% innerhalb von 24 d in wässriger Umgebung, sowie die Freisetzung von 0.17 mg/g an osteogenen Mg2+ pro Tag. Zusammen mit der bestätigten Zytokompatibilität bezüglich humaner fetaler Osteoblasten ist dieses System vielversprechend für die Anwendung als abbaubarer Biozement für unterschiedliche klinische Zwecke.
KW  - Knochenzement
KW  - Calciumphosphat
KW  - Magnesiumphosphate
KW  - Verbundwerkstoff
KW  - Chelatbildner
KW  - dual setting
KW  - dual abbindend
KW  - premixed
KW  - präfabriziert
KW  - bone wax
KW  - Knochenwachs
KW  - drillable
KW  - bohrbar
KW  - bone adhesive
KW  - Knochenkleber
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157045
ER  - 
TY  - THES
A1  - Thelen, David
T1  - Erstellung eines genregulatorischen Netzwerkes zur Simulation der Entstehung von Zahnhartsubstanz
T1  - Construction of a gene regulatory network to simulate the formation of dental hard tissue
N2  - In this dissertation, the author describes the creation of a basic bioinformatic model of human enamel maturation. Supported by the interactions found in the KEGG Pathway database, we were able to establish a gene regulatory network (GRN) that focuses primarily on the signal transduction pathways apoptosis, cell cycle, hedgehog signaling pathway, MAP kinase pathway, mTOR signaling pathway, Notch signaling pathway, TGF-β signaling pathway and Wnt signaling pathway. We extended this through further verified interactions and implicated the tooth-specific genes AMELX, AMELY, AMBN, ENAM and DSPP.  In the subsequent simulation of the network by the simulation tool Jimena, six stable states could be identified. These are examined in more detail and juxtaposed with results of a GEO dataset. The long-term goal is to draw conclusions about the odontogenesis of humans through consistent optimization of the bioinformatics network.
N2  - In dieser Dissertation beschreibt der Autor die Erstellung eines grundlegenden bioinformatischen Modelles der menschlichen Zahnschmelzreifung. Mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank wurde ein genregulatorisches Netzwerk (GRN) erstellt, welches maßgeblich auf den Signaltransduktionswegen Apoptose, Zellzyklus, Hedgehog-Signalweg, MAP-Kinase-Weg, mTOR-Signalweg Notch-Signalweg Signalweg, TGF-β-Signalweg und Wnt-Signalweg basiert. Im Weiteren wurde dieses Netzwerk durch zahlreiche verifizierte Wechselwirkungen erweitert und die zahnspezifischen Gene AMELX, AMELY, AMBN, ENAM und DSPP implementiert. In der anschließenden Simulation des Netzwerks mit dem Simulations-Tool Jimena konnten sechs stabile Zustände identifiziert werden. Diese wurden genauer untersucht und den Erkenntnissen eines GEO-Datensatzes gegenübergestellt. Langfristiges Ziel ist es, durch konsequente Optimierung des bioinformatischen Netzwerks Rückschlüsse auf die Odontogenese des Menschen zu ziehen.
KW  - Universität Würzburg. Lehrstuhl für Bioinformatik
KW  - Boolesches Netz
KW  - Zahnentwicklung
KW  - Amelogenese
KW  - Genregulation
KW  - genregulatorisches Netzwerk
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204068
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jannasch, Maren Annika
T1  - In vitro Fremdkörpermodellsysteme zur Vorhersage von biomaterialinduzierten Immunreaktionen
T1  - In vitro foreign body model systems for prediction of immune reactions to biomaterials
N2  - Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden.
Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden. 
Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist.
N2  - The implantation of a medical product into the human body induces an immune reaction, which may lead to its fibrous encapsulation. Macrophages in direct contact to the surface sense the foreign body and translate the signal in the secretion of multiple soluble mediators. This generated inflammatory milieu modulates the healing reaction, may induce the accumulation of fibroblasts and lead in the wound microenvironment to an increased matrix synthesis rate. A dense fibrous capsule surrounding a medical product is able to impair the replacement of body structures, the support of physiological body functions as well as the efficiency of a medical therapy. To identify potential biomaterial candidates with optimal characteristics an evidence-based decision making process is necessary and furthermore affords the support by appropriate test procedures. 
To study local effects after implantation of biomaterials, the complexity of the foreign body reaction justifies the application of animal models as gold standard. The integration of in vitro test procedures into standardized test strategies often fails by the availability of validated, reliable and reproducible methods. According to that there is no standardized test procedure, which resembles the three-dimensional tissue structures during a foreign body reaction and is suited for longer contact phases in between blood components and biomaterials. In vitro tests are often more cost and time efficient and show as well by applying human cells a high transferability on human beings. Additionally the preference to in vitro test procedures addresses the “reduction” aspect of the Russel and Burch’s (1959) 3R-principles “replace-ment, reduction and refinement” to a conscious and reasoned use of animal models in science. Aim of this research project was the development of human in vitro model systems, which resemble the contact to blood components and the reaction of the surrounding soft tissue following implantation of a biomaterial. Reference materials, whose tissue integration after implantation in animals or humans is described, were applied for the developed model systems as validation criterion. The accumulation of cells and the synthesis of extracellular matrix in the surrounding wound are relevant sub processes during a foreign body reaction. In an indirect cell-based model system the influence of the cell-mediated conditioning initiated by the material-induced and macrophage-mediated liberation of soluble mediators was shown on both sub processes the aligned migration of fibroblasts as well as the remodeling of a three-dimensional tissue model. Additionally, the cytokine secretion profile by material-adherent macrophages was characterized under different test conditions such as the contamination with LPS, the surface treatment with human plasma and the presence of IL-4. The following comparative statistical modelling allowed a transformation of the generated complex multi-factorial data matrix to a biomaterial ranking. The here developed test procedure was suitable for the validation of in vitro test conditions as well as the evaluation of the reference biomaterials. Last, by the combination of different cells and matrix structures the complex three-dimensional structure of the extracellular matrix in a wound was biomimetically reconstructed. Those novel three-dimensional foreign body models enabled the testing of biomaterials over longer test phases and might be applied in following studies to investigate dynamic processes. Summarizing in this research project three different test strategies were developed, which (I) enable the evaluation of sub processes, (II) support the identification of reliable test conditions and (III) biomimetically reconstruct a wound tissue. Most important is, that a three-dimensional tissue model was biomimetically developed, which showed a reliable discriminatory capacity in between biomaterials.
KW  - Biomaterial
KW  - Zellkultur
KW  - In vitro
KW  - Fremdkörpermodell
KW  - Gewebemodell
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162893
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TY  - THES
A1  - Weigel, Tobias Maximilian
T1  - Entwicklung von 3D-Herzschrittmacher-Elektroden auf Basis von Kohlenstoffnanofasern
T1  - Development of 3D pacemaker electrodes based on carbon nano fibers
N2  - Herzschrittmachersysteme sind eine weitverbreitete Möglichkeit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu behandeln. Wegen der natürlichen Reaktion des Immunsystems auf Fremdkörper, erfolgt aber eine fortschreitende Verkapselung der Herzschrittmacherelektrode. Die Folge ist eine ansteigende Verminderung der Stimulationseffizienz durch Erhöhung der Anregungsschwelle. Die Integration der Elektrode in das Gewebe ist dabei mangelhaft und wird bestimmt durch Implantateigenschaften wie Größe, Flexibilität und Dimensionalität. Um die Integration zu verbessern, stellen dreidimensionale (3D) bzw. gewebeartige Elektroden eine Alternative zu den derzeit verwendeten planaren Metallelektroden dar. Zur Entwicklung einer leitfähigen, 3D und faserförmigen Elektrode wurden in dieser Arbeit Kohlenstoff-Nanofaser-Scaffolds über Elektrospinnen hergestellt. Durch die Modifikation des Fasergerüstes mit Natriumchlorid (NaCl) während der Scaffoldherstellung, konnte das Fasernetzwerk aufgelockert und Poren generiert werden. Die Kohlenstofffaser-Elektroden zeigten einen effizienten Energieübertrag, welcher vergleichbar mit heutigen Titannitrid (TiN) -Elektroden ist. Die Auflockerung des Fasergewebes hatte eine verbesserte Flexibilität des Faserscaffolds zu Folge. Neben der Flexibilität, konnte auch die Infiltration von Zellen in das poröse Faserscaffold erheblich verbessert werden. Dabei konnten Fibroblasten durch das gesamte Scaffold migrieren. Die Kompatibilität mit kardialen Zellen, die Grundvoraussetzung von Herzschrittmacherelektroden, wurde in vitro nachgewiesen. Durch die Kombination aus dem 3D-Elektrodengerüst mit einer Co-Kultur aus humanen Kardiomyozyten, mesenchymalen Stammzellen und Fibroblasten, erfolgte eine Einbettung der Elektrode in funktionelles kardiales Gewebe. Dadurch konnte ein lebender Gewebe-Elektroden-Hybrid generiert werden, welcher möglicherweise die Elektrode vor Immunzellen in vivo abschirmen kann. Eine Zusammenführung der hybriden Elektrode mit einen Tissue-Engineerten humanen kardialen Patch in vitro, führte zu Bildung einer nahtlosen Elektronik-Gewebe-Schnittstelle. Die fusionierte Einheit wurde abschließend auf ihre mechanische Belastbarkeit getestet und konnte über einen Elektroden-Anschluss elektrisch stimuliert werden.
N2  - The application of pacemaker systems is a widespread treatment of cardiovascular diseases. The inflammatory interaction of the immune system and the implant results in the formation of a fibrous capsule around the pacemaker’s electrode. The consequence is a progressing reduction of the stimulation efficiency by an increased excitation threshold. The primary cause of the encapsulation is the deficient integration of the electrode into the cardiac tissue, which is induces by the incompatible implant properties like size, flexibility and dimensionality. To improve the electrode’s integration, the application of three dimensional and tissue imitating electrodes represent an improvement of currently implanted planar electrodes. To develop a conductive and fibrous 3D-electrode, carbon nanofiber scaffolds were generated by electrospinning. By modifying the fiber network with NaCl during the scaffold preparation, the mesh openings could be loosened and pores generated. An efficient energy transfer of the resulting carbon fiber electrodes was demonstrated and is comparable to today's TiN electrodes. The loosening of the fiber network resulted in improved flexibility of the scaffold. In addition to the flexibility, the infiltration of cells into the porous fiber scaffold could be significantly enhanced. Thereby, fibroblasts were enabled to migrate through the entire scaffold. For application as a pacemaker electrode, the compatibility of the tissue electrode with cardiac cells in vitro was demonstrated. The combination of the 3D electrode Scaffold with a co-culture of human cardiomyocytes, mesenchymal stem cells and fibroblasts led to a partially embedded electrode in functional cardiac tissue. As a result, a living tissue-electrode hybrid could be generated which could possibly shield the electrode from immune cells in vivo. Implantation of the hybrid electrode into a tissue engineered human heart patch in vitro resulted in a seamless electronic tissue interface. This fused unit was conclusively tested for its functionality, like mechanical stability and the electrical stimulation of the patch by the in grown hybrid electrode.
KW  - Herzschrittmacher
KW  - Elektrode
KW  - Kohlenstoff
KW  - Nanofaser
KW  - 3D-Elektrode
KW  - electrode scaffold
KW  - Zell-Migration
KW  - Stimulation
KW  - Kohlenstofffaser
KW  - Elektrospinnen
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176362
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TY  - THES
A1  - Maier, Alexander
T1  - Analyse der Expression osteogener Markerproteine in humanen mesenchymalen Stromazellen nach Kultur auf elektrogesponnenen Scaffolds
T1  - Analysis of the expression of osteogenic marker proteins in human mesenchymal stromal cells after culture on electrospun scaffolds
N2  - Es wurde die Expression der osteogenen Markerproteine Alkalische Phosphatase, Bone Sialoprotein, Kollagen Typ I und Osteopontin von humanen mesenchymalen Stromazellen nach Kultur auf elektrogesponnenen Scaffolds analysiert. Die Scaffolds wurden mittels der Melt electrospinning writing Methode erstellt und unterschieden sich in ihrer Maschenweite. Anhand weiterer Kontrollversuche auf Monolayern wurde ein möglicher Einfluss der Geometrie auf die Proteinexpression untersucht.
N2  - The Expression of the marker proteins alkaline phosphatase, bone sialoprotein, collagen type I and osteopontin of human mesenchymal stromal cells after culture on electrospun scaffolds was analyzed. The scaffolds were made by the melt electrospinning writing method and differed in their mesh size. Further control experiments on monolayers were used to investigate the possible influence of the scaffolds´ geometry on the expression of the proteins.
KW  - Scaffold
KW  - mesenchymale Stromazellen
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184687
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TY  - THES
A1  - Oliveira Alves Pereira, Ana Rita
T1  - Modelling of Mesenchymal Stromal Cells Interactions within the Skeletal Niche
T1  - Modellierung der Interaktionen von Mesenchymalen Stromazellen in der skelettalen Nische
N2  - Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) are a rare subpopulation of cells first identified in bone marrow with the potential to proliferate in plastic-adherent colonies and to generate de novo bone marrow stroma and its environment upon serial transplantation to heterotopic anatomical sites. Given their multipotency and self renewal competence, MSCs are prime prospective candidates for most modern musculoskeletal-tissue engineering and regenerative medicine approaches. Still, their envisioned therapeutic use is being questioned with concerns regarding their definition, characterization and integrative functions in vivo. It is well established that microenvironmental cues such as the extracellular matrix (ECM)-chemistry, the mechanical environment and local cellular and/or paracrine interactions critically control MSCs behavior. Yet, most of the scientific knowledge regarding the biology and therapeutic effect of MSCs originates from mechanistic in vitro studies where microenvironmental cues are hardly addressed. Therefore, manifestable changes in cell proliferation behavior and multilineage differentiation potential might be triggered that eventually compromise the translation of results to clinics. This thesis aims to address the complexity of MSCs interactions within the skeletal niche microenvironment in order to provide alternative methods to bypass the current MSCs in vitro culture limitations. Firstly, the influence of ECM-chemistry on MSCs behavior in vitro was explored by means of decellularized human bone models here established. Basal or osteogenic tailored cell-derived decellularized 2D matrices (dECM), proved to be suitable culture substrates for MSCs expansion by providing close-to-native cell-ECM interactions. Moreover, quantified morphological shape changes suggested a material osteo supportive potential, further functionally validated by observable spontaneous mineralization of MSCs. Aiming to identify novel intrinsic ECM regulatory features specific to the skeletal niche, 3D decellularized human trabecular bone scaffolds (dBone) were additionally developed and comprehensively characterized. Remarkably, the MSCs cultured on dBone scaffolds exhibit upregulation of genes associated with stemness as well as niche-related protein expression advocating for the conservation of the naïve MSCs phenotype. vi On the other hand, the effect of biomimetic mineralization on MSCs osteogenic lineage differentiation potential was further addressed by hydroxyapatite functionalization of type-I collagen in presence of magnesium. Mineralized scaffolds exhibited higher cell viability and a clear trend of osteogenic genes upregulation comparing with non-mineralized scaffolds. Lastly, in order to mimic the complexity of the native MSCs environment, a dynamic culture system was applied to the 3D decellularized bone constructs, previously studied in single static conditions. Mechanical stimuli generated by (1) continuous perfusion of cell culture medium at 1.7 mL/min and (2) compressive stress from 10% uniaxial load at 1 Hz, resulted in an improved cell repopulation within the scaffold and boosting of de novo ECM production. The stress-induced gene expression pattern suggested early MSCs commitment towards the osteogenic lineage mediated by integrin matrix adhesion, therefore further corroborating the recapitulation of a reliable in vitro bone niche model in dBone scaffolds. To conclude, the here developed in vitro models provide a progressive increased biomimicking complexity through which significant insights regarding MSC interactions with microenvironmental features in the skeletal niche can be obtained, thus surely paving the way for a better understanding of the role of MSCs in bone homeostasis and regeneration.
N2  - Mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSZ) sind eine seltene Subpopulation von Zellen, die erstmals im Knochenmark identifiziert wurden und die das Potenzial haben, sich in plastikadhärenten Kolonien zu vermehren und bei serieller Transplantation an heterotopen anatomischen Stellen de novo das Knochenmarkstroma und seine Umgebung zu bilden. Aufgrund ihrer Multipotenz und ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung sind MSZ erstklassige Kandidaten für moderne Ansätze des muskuloskelettalem Gewebe-Engineering und der regenerativen Medizin. Dennoch wird ihr therapeutischer Einsatz aufgrund von Bedenken hinsichtlich ihrer Definition, Charakterisierung und in vivo Integration in Frage gestellt.
	Es ist hinlänglich bekannt, dass die Mikroumgebung wie die Komposition der extrazellulären Matrix (EZM), die mechanische Umgebung und die lokalen zellulären und/oder parakrinen Interaktionen das Verhalten der MSZ entscheidend beeinflussen. Die meisten wissenschaftlichen Erkenntnisse über die Biologie und die therapeutische Wirkung von MSZ stammen jedoch aus mechanistischen In-vitro-Studien, in denen Faktoren aus der naiven Mikroumgebung von MSZ kaum berücksichtigt wurden. Dies kann zu offensichtlichen Veränderungen des Zellproliferationsverhaltens und des Differenzierungspotenzials der Zellen führen, was die Übertragung der Ergebnisse in die klinische Praxis beeinträchtigt. 
Diese Arbeit zielt darauf ab, die Komplexität der Interaktionen von MSZ in der Mikroumgebung der skelettalen Nische zu untersuchen, um Methoden zur Umgehung der derzeitigen Limitationen bei der In-vitro-Kultur von MSZ zu etablieren.
	Zunächst wurde der Einfluss der EZM auf das Verhalten von MSZ in vitro mit Hilfe von dezellularisierten menschlichen Knochenmodellen untersucht. Basale oder dezellularisierte 2D-Matrizen (dECM) osteogen differenzierter Zellen erwiesen sich als geeignete Zellkultursubstrate für die MSZ-Expansion, da sie nahezu native Zell-EZM-Interaktionen ermöglichen. Darüber hinaus deutet die quantifizierten morphologischen Formveränderungen in MSZ auf ein osteoinduktives Potenzial des Materials hin, was durch eine beobachtete spontane Mineralisierung der MSZ funktionell bestätigt wurde. Mit dem Ziel, neue intrinsische EZM-Faktoren zu identifizieren, die für die skelettale Nische spezifisch sind, wurden zusätzlich dezellularisierte 3D-Gerüste aus menschlichem trabekulärem Knochen (dBone) entwickelt und umfassend charakterisiert. Bemerkenswerterweise zeigen die auf dBone-Gerüsten kultivierten MSZ eine Hochregulierung von typischen Stammzell-assoziierten Genen, sowie die Expression von charakteristischen Nischenproteinen, was für die Erhaltung des Phänotyps naiver MSZ spricht.
	Andererseits wurde die Auswirkung einer biomimetischen Mineralisierung auf das osteogene Potenzial von MSZ durch Hydroxyapatit-Funktionalisierung von Typ-I-Kollagen Trägermaterialien in Gegenwart von Magnesium untersucht. Mineralisierte Gerüste zeigten eine höhere Zellviabilität und einen klaren Trend zur Hochregulierung osteogener Gene im Vergleich zu nicht-mineralisierten Gerüsten. 
	Um die Komplexität der nativen MSZ-Umgebung zu imitieren, wurde schließlich ein dynamisches Kultursystem auf die dezellularisierten 3D-Knochenkonstrukte angewandt, die zuvor unter statischen Bedingungen untersucht worden waren. Mechanische Stimuli, die durch (1) kontinuierliche Perfusion des Zellkulturmediums bei 1,7 ml/min und (2) Druckbelastung durch eine einachsige Last von 10 % bei 1 Hz erzeugt wurden, führten nachweislich zu einer verbesserten Zellrepopulation innerhalb des Gerüsts und zu einer Steigerung der de novo EZM-Produktion. Das stressinduzierte Genexpressionsmuster deutet darauf hin, dass es schon früh durch Integrin-Matrix-Adhäsion zu einer Festlegung der MSZ auf die osteogene Linie kommt, was die Rekapitulation eines Zuverlässigen in vitro-Knochennischenmodells in dBone-Konstrukten weiter bestätigt.
	Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier entwickelten in vitro-Modelle eine zunehmende Komplexität der zellulären Mikroumgebung darstellen, durch die wichtige Erkenntnisse über die Interaktionen von MSZ mit der Mikroumgebung in der Knochennische gewonnen werden können, was sicherlich den Weg für ein besseres Verständnis der Rolle von MSZ in der Knochenhomöostase und -regeneration ebnet.
KW  - Stem Cells
KW  - In vitro models
KW  - Bone regeneration
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266603
ER  - 
TY  - THES
A1  - Horvat-Csóti [geb. Horvat], Sonja
T1  - Development of Nanocarriers for Treatment and Diagnostics of Aspergillosis
T1  - Entwicklung von Nanoträgern für die Behandlung und Diagnose von Aspergillosis
N2  - This thesis aimed to evaluate the possibility to use nanoparticles as antifungal drug carriers as well as their potential application in screening and diagnostics of invasive aspergillosis. The interaction of nanogels, superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIOs) and gold nanoparticles (GNP) with fungal-specific polysaccharides, cells and biofilms was investigated. 

Firstly, it was evaluated how the charge of nanogels influence their interaction with fungal cells. Linear poly(glycidol)s (pG) and poly(2-methyl-2-oxazoline) (pMOx) polymers were synthesized and further functionalized with thiol groups for preparation of redox responsive nanogels. Results showed that negatively charged nanogels were internalized by the fungi to a much greater extent than positively charged ones. 
Furthermore, it was investigated how amphiphilicity of polymers used for preparation of nanogels influences nanogel-fungi interaction. It was concluded that nanogels prepared from polymers with degree of functionalization of 10% had the strongest interaction, regardless the length of the alkyl chain. Moreover, amphotericin B-loaded nanogels had a higher antifungal effect and lower toxicity towards mammalian cells than the free drug. In addition, inverse nanoprecipitation of thiol functionalized pGs was shown to be successful for preparation of nanogels with narrow size distribution. 

It was also demonstrated that crosslinking of the polymeric coating in hydrogel-like network with thiol functionalized pGs improved the SPIOs imaging performance. 

Finally, it was investigated whether GNPs could be used as model particles for the assessment of targeting to fungi. Fc dectin-1 was conjugated covalently to GNPs decorated with pGs, and binding affinity towards β-glucans was tested by surface plasmon resonance. 

In summary, this thesis demonstrated evidence for the potential of pG nanogels and pG coated nanoparticles for antifungal therapy and diagnostics of fungal infections caused by A. fumigatus.
N2  - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Evaluation der Eignung von Nanopartikeln für das Screening, die Diagnose und als Wirkstofftransportsysteme für die Behandlung von invasiver Aspergillose. Hierzu wurde die Interaktion von Nanogelen, superparamagnetischen Eisenoxid Nanopartikeln (SPIO) und Gold Nanopartikeln (GNP) mit pilz-spezifischen Polysacchariden, dem Pilz Aspergillus fumigatus sowie Pilz-Biofilmen untersucht. ...
KW  - Therapeutisches System
KW  - Nanogels
KW  - Aspergillosis
KW  - Iron Oxide Nanoparticles
KW  - Dectin-1
KW  - Poly(glycidol)s
KW  - Aspergillose
KW  - Nanopartikel
KW  - Wirkstoff-Träger-System
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238218
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TY  - THES
A1  - Schamel [geb. Geffers], Martha
T1  - Novel dual setting approaches for mechanically reinforced mineral biocements
T1  - Neue dualhärtende Ansätze für die mechanische Verstärkung von mineralischen Biozementen
N2  - Calcium phosphate biocements are inherently brittle materials due to their ceramic nature. Hence, currently applied cement formulations are only indicated for non-load bearing application sites. An approach to reduce cement brittleness is based on the use of cement – polymer composites, which combine the flexibility of a polymeric phase with the hardness and compression strength of a cement matrix. Here, a relatively new strategy is the use of “dual-setting” cements, in which the polymeric phase is simultaneously build up from monomers or prepolymers during cement setting. This approach largely maintains basic properties of the fresh paste such as rheology or setting time. Previous works on such dual setting cements were dealing with a radical polymerization reaction to create the polymeric network. This type of reaction requires the addition of a suitable initiator system (e.g. a tertiary amine in conjunction with ammonium peroxosulfate), which are often cytotoxic and may interfere with the cement setting conditions. The current thesis dealt with alternative strategies, in which the cross-linking and gelation of the second (polymeric or inorganic) cement phase is initiated by the chemical conditions of the setting reaction such that no additional initiator has to be added to the cement paste. 
In a first approach a six armed star molecule functionalized with isocyanate groups as reactive termini (NCO–sP(EO-stat-PO)) was used to build up a hydrogel matrix, which was then subsequently mineralized with hydroxyapatite nanocrystals following the hydrolysis of incorporated -tricalcium phosphate particles. The stimulus to initiate hydrogel cross-linking are water molecules, which subsequently hydrolyzed isocyanate groups to amines, which then cross-linked with unreacted isocyanate to form urea-bonds. Here, it was possible to show the advantages features of a dual setting system in comparison to the simple combination of hydrogels with unreactive filler particles. By the formation of the cement matrix within the hydrogel a strength improvement by the factor of 30 could be observed. Furthermore, by applying a dual setting system higher mineral concentrations are realizable. The mechanical properties such as elasticity, compression strength and E-modulus of a composite with 30 wt% NCO–sP(EO-stat-PO) were found to be similar to the properties of cancellous bone.

With the motivation to develop a dual setting and resorbable cement, a brushite (CaHPO4·2H2O) forming cement was modified with a second inorganic silica based precursor. The latter was obtained by pre-hydrolysing tetraethyl orthosilicate (TEOS) under acidic conditions. This silica precursor was mixed with a cement powder composed of ß-tricalcium phosphate and monocalcium phosphate, whereas cement setting occurred by a dissolution–precipitation process to form a matrix of brushite. Simultaneously, the increase of the pH during setting from initially 1-2 to values > 4 initiated the condensation reaction of the hydrolysed TEOS. This resulted in an interpenetrating phase composite material in which the micropores of the cement were filled with the nanoporous silica gel. This resulted in a higher density and a compressive strength of 24 MPa, which is approximately 5-10 times higher than the CPC reference at the same powder to liquid ratio. The microporous character of the composites also altered the release of vancomycin as a model drug, whereby in contrast to the quantitative release from the CPC reference, approx. 25 % of the immobilised drug remained in the composite matrix. It was also observed, that a variation of the TEOS content in the composite enabled a control over cement phase composition to form either brushite, anhydrous monetite or a biphasic mixture of both. Cytocompatibility tests revealed that composites with the highest silicate content showed an increased cell proliferation compared to the silica-free brushite reference. Proliferation was found to be similar to a hydroxyapatite reference with a significant higher activity per cell. Mechanistically, the improved biological response could not be attributed to the released silicate ions, but to a decreased release of phosphate and adsorption of magnesium ions from the cell culture medium.
Finally, an investigated dual setting cement system was based on the combination of a brushite forming cement powder with an aqueous silk fibroin solution. Here, changes of both ion concentration and pH during cement setting were shown to build up an interpenetrating fibroin – brushite composite with combined properties of the elastic polymer and the rigid cement. Mechanistically, the low pH of the cement paste (2) as well as the free Ca2+ ions during setting resulted in a conformation change of the dissolved fibroin from random coil to ß-sheet structure. This leads to a rapid gelation and contraction of the fibroin phase with a self-densifying effect on the cement paste. The set composites showed typical ductile fracture behavior under dry testing conditions and a high elasticity under wet conditions with a mechanical strength nearly an order of magnitude higher than the fibroin free cement reference. Cell number and activity against MG63 cells were strongly increased on silk fibroin cement composite surfaces at later time points, which could be again attributed to a decreased ion release and adsorption compared to the fibroin free cements. This in turn slowed down the in vitro degradation of the CPC phase in such composites.
N2  - Calciumphosphat-Knochenzemente sind auf Grund ihrer keramischen Struktur inhärent spröde Werkstoffe, weswegen sie gegenwärtig nur für nicht-kraftbelastete Anwendungsbereiche verwendet werden. Ein Ansatz zur Verringerung des spröden Verhaltens basiert auf der Verwendung von Zement – Polymer Kompositen, welche die Flexibilität der Polymerphase mit der hohen Härte und Druckfestigkeit des Zements vereinen. Eine relativ neue Strategie sind dabei sogenannte dual-härtende Zemente, in denen die Polymerphase aus Monomeren bzw. Präpolymeren simultan zur Abbindereaktion des Zements aufgebaut wird. Dieser Ansatz ist insofern vorteilhaft, als dass die grundlegenden Eigenschaften der Zementpaste, wie etwa deren Rheologie oder Abbindedauer, hierbei weitgehend erhalten bleiben. In frühere Arbeiten zu dual-härtenden Knochenzementen wurden die Monomere radikalisch vernetzt. Die dabei notwendigen Initiatorsysteme (z.B. tertiäres Amin und Ammoniumperoxosulfat) sind jedoch zytotoxisch und können zudem mit der Zementreaktion nachteilig interferieren. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich deshalb mit alternativen Lösungstrategien, bei denen die Vernetzung der sekundären (organischen oder anorganischen) Zementphase durch die Reaktionsbedingungen der Zementpaste initiiert wird, sodass kein zusätzlicher Initiator der Paste zugesetzt werden muss. 
In einem ersten Ansatz wurden Isocanat-modifizierte, sternförmige Präpolymere (NCO–sP(EO-stat-PO)) zum Aufbau der Hydrogelmatrix durch Hydrolyse von zugesetzten α-Tricalciumphosphat Partikeln schrittweise mit Hydroxylapatit Nanokristalliten mineralisiert. Die Vernetzung des Hydrogels in der Paste wurde durch Wasser stimuliert, wobei in einem zunächst Isocyanatgruppen zu Aminen hydrolysiert wurden, die anschließend mit weiterem Isocyanat zu Urethanbindungen reagierten. Hier konnte der Vorteil von dualhärtenden Systemen im Vergleich zu Hydrogelen, denen nichtreaktive Partikel untergemischt werden, gezeigt werden. Durch den Aufbau der Zementmatrix im Hydrogel ergab sich eine um den Faktor 30 erhöhte Festigkeit. Zusätzlich ermöglicht diese Vorgehensweise den Einsatz von erhöhten Mineralgehalten. Die mechanischen Eigenschaften der Komposite mit 30 Gew.% NCO–sP(EO-stat-PO) wie Elastizität, Druckfestigkeit und E-Modul waren dabei vergleichbar mit den Eigenschaften von spongiösem Knochen.
Mit dem Ziel einen dualhärtenden, resorbierbaren Zement zu entwickeln, wurde ein Bruschit (CaHPO4·2H2O) bildender Zement mit einer zweiten anorganischen Matrix aus einem silikatischen Precursor modifiziert. Letzterer wurde durch Hydrolyse von Tetraethylorthosilikat (TEOS) unter sauren Bedingungen hergestellt. Das so erhaltene Silicasol wurde anschließend mit dem Zementpulver aus β-Tricalciumphosphat und primärem Calcium-bis-dihydrogenphosphat gemischt, wodurch die Zementreaktion zu Bruschit durch einen Lösungs – Fällungsmechanismus gestartet wurde. Der zeitgleich einsetzende Anstieg des pH-Werts von initial 1-2 auf Werte im Bereich von >4 führt dabei zur Kondensation des Silicasols. Resultat waren interpenetrierende Netzwerke, wobei die Mikroporen der Bruschitzementmatrix mit dem nanoporösem Silicagel gefüllt sind. Dadurch ergibt sich eine höhere Dichte der Zementmatrix und eine mit 24 MPa um den Faktor 5-10 höhere Druckfestigkeit der Komposite gegenüber der Referenz bei gleich bleibendem Pulver-Flüssigkeits-Verhältnis. Der nanoporöse Charakter des Komposites beeinflusst die Freisetzung von Vancomycin als Modellwirkstoff, wobei im Gegensatz zur silicafreien Referenz ca. 25% des Wirkstoffs in der Matrix verblieben. Die Variation des TEOS Gehalts ermöglichte zeitgleich die gezielte Beeinflussung der Zusammensetzung der mineralischen Zementphase mit Bildung von Bruschit, dessen Anhydrid Monetit oder Mischungen aus beiden Verbindungen. Zytokompatibilitätstests an den Kompositen zeigten, dass die höchsten Silicagehalte zu einer verbesserten Proliferation von Zellen auf den Oberflächen gegenüber der silicafreien Referenz führten. Das Zellwachstum war vergleichbar mit einer Referenz aus Hydroxylapatit, wobei deutlich höhere Aktivitäten pro Zelle gemessen wurden. Mechanistisch konnte die verbesserte Zytokompatibilität nicht der Freisetzung von Silikationen zugeordnet werden, vielmehr war eine verminderte Freisetzung von Phosphat und eine geringere Tendenz zur Adsorption von Magnesiumionen aus dem Zellkulturmedium der Grund.
Ein abschließender Ansatz bestand aus der Kombination aus einem Bruschit-bildenden Zement und einer wässrigen Seidenfibroin-Lösung. Hier erfolgte der Aufbau der interpenetrierenden Bruschit – Fibroin Netzwerke über den sauren pH-Wert sowie den Anstieg der Ionenkonzentration im System durch die ablaufende Zementreaktion. Somit werden die Eigenschaften des elastischen Polymers und der festen Zementphase erfolgreich kombiniert. Mechanistisch führt dabei der initial saure pH Wert (2) und die während der Reaktion vorhandenen freien Ca2+ Ionen zu einer Konformationsänderung des gelösten Fibroins von eine Zufallsstruktur hin zur β-Faltblattstruktur. Dies führt zur schnellen Gelierung und Kontraktion der Fibroinphase, einhergehend mit einer Selbstverdichtung der gesamten Paste. Die abgebundenen Komposite zeigten typischerweise duktile Brucheigenschaften im trockenen Zustand und eine hohe Elastizität unter wässrigen Testbedingungen, wobei sich um eine Größenordnung höhere Festigkeiten gegenüber der fibroinfreien Referenz ergaben. Zellzahl und Aktivität von MG63 Zellen waren auf den Seidenfibroin-Zementkompositen bei späteren Messzeitpunkten deutlich erhöht, was ebenfalls auf eine geringere Ionenfreisetzung bzw. -adsorption aus dem Medium rückgeführt werden kann. Zeitgleich konnte hierdurch die in vitro Degradation der Zementphase in solchen Kompositen verringert werden.
KW  - Calciumphosphate
KW  - Knochenzement
KW  - mechanical reinforcement
KW  - dual setting system
KW  - ceramic polymer composite
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154946
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hochrein, Thomas
T1  - Terahertz-Spektroskopie: Systementwicklung und Einsatz in der Polymeranalytik
T1  - Terahertz Spectroscopy: System Development and Employment in Polymer Analysis
N2  - Die zeitaufgelöste Terahertz-Spektroskopie erzielte in den letzten 20 Jahren erhebliche Entwicklungsfortschritte. Aber auch davor haben bereits Untersuchungen der dielektrischen Eigenschaften in diesem Spektralbereich mit herkömmlichen Spektrometern unter anderen Termini stattgefunden. Viele Anwendungsfelder der Terahertz-Zeitbereichsspektroskopie sind noch unzureichend erforscht, weshalb in dieser Arbeit der Einsatz in der Polymeranalytik und primär an Polyamiden näher untersucht wird. Außerdem weist die Terahertz-Systemtechnik für kohärente Messungen noch erhebliche Verbesserungspotenziale auf.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher das neue Verfahren Optical Sampling by Laser Cavity Tuning (OSCAT) entwickelt. Es ermöglicht auf elegante Weise eine variable Zeitverzögerung von Pulsfolgen, wie sie in Terahertz-Zeitbereichsspektrometern erforderlich ist. Dabei wird die Möglichkeit veränderbarer Repetitionsrate bei Ultrakurzpulslasern genutzt. Die Vorteile des OSCAT-Verfahrens, wie z. B. Skalierbarkeit, Robustheit, großer Messbereich und Messgeschwindigkeit, sowie die Funktion werden in dieser Arbeit sowohl theoretisch als auch experimentell vorgestellt und diskutiert.

Erste Terahertz-Messungen an polymeren Schmelzen demonstrieren potenzielle Anwendungsgebiete für Terahertz-Spektrometer. Der Rezepturanteil und Zerstörungsgrad eingebrachter Füllstoffe kann sehr gut über den Brechungsindex bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen außerdem ein stark temperaturabhängiges Verhalten polarer und unpolarer Polymere. Neben der Auswirkung der temperaturinduzierten Dichteänderung auf den Brechungsindex konnte insbesondere bei Polyamiden ein starker Anstieg der Absorption mit zunehmender Temperatur nachgewiesen werden.

Deshalb wurden die Absolutwerte des Brechungsindex und Absorptionskoeffizienten im niederfrequenten Terahertz-Spektralbereich tiefergehend untersucht. Es zeigte sich, dass der Brechungsindex polarer Polymere aus einem polaren und unpolaren Anteil besteht. Der unpolare Anteil wird primär durch die Material- bzw. Amidgruppendichte bestimmt. Der polare Anteil wird durch das inter- und intramolekulare Schwingungsverhalten bzw. dessen resultierenden Absorptionsbanden beeinflusst.

Diese Schwingungsmoden wurden daher mittels breitbandiger Spektroskopie in abgeschwächter Totalreflexion (ATR) an unterschiedlichen Polyamiden aufgenommen. Simulationsrechnungen mit Lorentz-Oszillatoren zeigen, wie bedeutsam eine kritische Diskussion absoluter Absorptionswerte aus solchen ATR-Messungen ist. Die ermittelten Ursachen sind Änderungen des Brechungsindex der Probe infolge von Temperaturänderung sowie Dispersion durch Schwingungsmoden – auch weit abseits des Bandenmaximums.

Die gemessenen Schwingungsmoden wurden anhand quantenmechanischer ab-inito Berechnungen der Molekülketten und -cluster analysiert und mit Literaturangaben abgeglichen. Verschiedene Schwingungen konnten hierbei im Terahertz-Spektralbereich bei unterschiedlichen {\alpha}- und {\gamma}-Polyamiden ausgemacht werden. Sie erweisen sich als sehr komplex und erstrecken sich meist über die gesamte Molekülkette. Schwingungen einzelner Atome oder Gruppen sind meist mit umfangreichen Ausgleichsbewegungen des Molekülrückgrats gekoppelt. Insbesondere phononenartige Schwingungen konnten hierbei im Vergleich zu bisherigen Publikationen sehr präzise beschrieben werden.
N2  - Terahertz spectroscopy has achieved considerable progress over the past 20 years, although prior investigations of the dielectric properties have already taken place with conventional spectrometers under other terms in this spectral regime. Many fields of application or terahertz time-domain spectroscopy are still insufficiently investigated. Therefore, here the use in polymer analysis and primarily on polyamides is examined in detail.

In addition, terahertz system technology with coherent detection still has considerable potential for improvements. Therefore, the new method Optical Sampling by Laser Cavity Tuning (OSCAT) was developed within this work. It allows a smart variable time delay of pulse sequences as required in terahertz time-domain spectroscopy. The possibility of tunable repetition rates in ultra-short pulsed lasers is used. The advantages of the OSCAT method, such as scalability, robustness, large measuring range and measuring speed as well as the function, are presented and discussed in this work both theoretically and experimentally.

First terahertz measurements on polymer melts demonstrate potential applications for terahertz spectrometers. The recipe content and degree of destruction of fillers can be determined very well by the refractive index. The results also show a strong temperature-dependent behavior of polar and nonpolar polymers. In addition to the effect of the temperature-induced density change on the refractive index, a strong increase in the absorption with increasing temperature could be detected, especially on polyamides.

Hence, the absolute values of refractive index and absorption coefficient in the low-frequency terahertz spectral range were investigated in more detail. It appears that the refractive index of polar polymers consists of a polar and non-polar part. The non-polar part is primarily determined by the material and amide group density, respectively. The polar part is influenced by inter- and intramolecular oscillations and its resulting absorption bands.

Broadband spectroscopy in attenuated total reflection arrangement (ATR) allowed the resolution of these oscillation modes on different polyamides. Simulation calculations with Lorentz oscillators show the importance of a critical discussion of absolute absorption values from such ATR measurements due to changes in refractive index of the sample as a result of temperature changes as well as dispersion by means of oscillation modes – even far away from the band maximum.

The measured vibrational modes were analyzed by quantum mechanical ab-initio calculations of molecular chains or clusters and compared with literature data. Various oscillations were identified in the terahertz spectral range for different {\alpha}- and {\gamma}-polyamides. They are found to be very complex and extend over the entire molecular chain. Vibrations of individual atoms or groups are usually coupled with extensive compensatory motions of the molecule backbone. In particular, phonon-like vibrations could be described very precisely in comparison to previous publications.
N2  - Die Terahertz-Technologie erschließt permanent neue Forschungsbereiche und wird auch vermehrt im kommerziellen Bereich eingesetzt. Diese Entwicklung wird in eigenen Analysen dargestellt. Als Kernaspekte dieses Buchs werden technologische Verbesserungen für gepulste Terahertz-Systeme und der spektroskopische Einsatz für die Polymeranalytik vorgestellt. Einen besonderen Stellenwert nehmen dabei Untersuchungen an Polymermischungen im Schmelzezustand während der Prozessierung ein. Bemerkenswert ist hierbei das temperaturabhängige Verhalten von verschiedensten Polyamiden. Die Änderung der optischen und spektroskopischen Eigenschaften und die Einflussfaktoren werden tiefergehend betrachtet. Dabei werden verschiedene klassische und neuere Experimentalmethoden, Modellierungen und quantenchemische Simulationsmethoden eingesetzt, um insbesondere die intermolekularen Wechselwirkungen aufzuklären.
KW  - FIR-Spektroskopie
KW  - Polymer
KW  - Terahertz
KW  - Terahertz
KW  - Spektroskopie
KW  - Polyamid
KW  - Spectroscopy
KW  - Polyamide
KW  - Polymer
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163473
SN  - 978-3-95826-090-0 (Print)
SN  - 978-3-95826-091-7 (Online)
N1  - Parallel erschienen als Druckausgabe in Würzburg University Press, ISBN 978-3-95826-090-0, 34,90 Euro.
PB  - Würzburg University Press
CY  - Würzburg
ET  - 1. Auflage
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TY  - THES
A1  - Strulik, Jonas
T1  - Aufbau, Charakterisierung und Validierung eines in vitro Zellkulturmodells des pankreatischen Adenokarzinoms
T1  - Structure, characterisation and validation of an in vitro cell culture model of pancreatic adenocarcinoma
N2  - Da in den letzten Jahrzehnten nur geringfügige Verbesserungen der Überlebensraten bei an einem Pankreaskarzinom erkrankten Patienten erzielt wurden, besteht ein dringender klinischer Bedarf für die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien. Dreidimensionale in vitro Modelle sind für das Screening und die Validierung von Therapeutika essenziell.

In der vorliegenden Arbeit konnte mittels der Methoden des Tissue Engineerings ein biolumineszenzbasiertes dreidimensionales in vitro Testsystem des pankreatischen Karzinoms aufgebaut und charakterisiert werden. Für die Detektion von LumineszenzIntensitäten wurde die pankreatische Krebszelllinie PANC-1 zuvor mit firefly luciferase (FLUC) transduziert. PANC-1 FLUC Zellen wurden auf porziner Pankreasmatrix (PanMa) und Dünndarmmatrix (SISser) kultiviert, um den Einfluss unterschiedlicher Matrizen auf das Verhalten der Zellen im Tumormodell zu untersuchen. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit die PANC-1 FLUC mit einem Standardtherapeutikum der Pankreaskarzinomtherapie, Gemcitabin, behandelt und die Wirkung mittels biolumineszenbasierter Bildgebung detektiert.

Es konnte gezeigt werden, dass die Lumineszenz-Intensität von PANC-1 FLUC Zellen einer bestimmten Zellzahl durch biolumineszenzbasierte Messverfahren zugeordnet werden kann. Weiter wurde nachgewiesen, dass die Extrazellulärmatrix einen Einfluss auf die Expression tumorspezifischer Marker hat und PANC-1 FLUC Zellen ein unterschiedlich invasives Wachstum auf organspezifischen Matrizen aufweisen. Die Wirkung von Gemcitabin auf die Tumorzellen kann durch das hier vorgestellte biolumineszenzbasierte Messverfahren detektiert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse sind die Grundlage für die weitere Validierung eines biolumineszenzbasierten dreidimemsionalen in vitro Testystems des pankreatischen Karzinoms für die präklinische Erforschung neuartiger Therapiestrategien.
N2  - With only modest improvements in survival rates in pancreatic cancer patients over the past decades, there is an urgent clinical need for the development of effective therapeutic strategies. Three-dimensional in vitro models are essential for screening and validation of therapeutics.

In the present work, a bioluminescence-based three-dimensional in vitro test system of pancreatic carcinoma was constructed and characterised using tissue engineering methods. For the detection of luminescence intensities, the pancreatic cancer cell line PANC-1 was previously transduced with firefly luciferase (FLUC). PANC-1 FLUC cells were cultured on porcine pancreatic matrix (PanMa) and small intestine matrix (SISser) to investigate the influence of different matrices on the behaviour of the cells in the tumour model. Furthermore, in this work, the PANC-1 FLUC were treated with a standard therapeutic agent of pancreatic cancer therapy, gemcitabine, and the effect was detected using bioluminescence-based imaging.

It was shown that the luminescence intensity of PANC-1 FLUC cells can be assigned to a specific cell number by bioluminescence-based measurement techniques. Furthermore, it was demonstrated that the extracellular matrix has an influence on the expression of tumour-specific markers and that PANC-1 FLUC cells show different invasive growth on organ-specific matrices. The effect of gemcitabine on tumour cells can be detected by the bioluminescence-based measurement method presented here. The results presented in this work are the basis for further validation of a bioluminescence-based three-dimensional in vitro test system of pancreatic carcinoma for preclinical research into novel therapeutic strategies.
KW  - Zellkulturmodell
KW  - Adenokarzinom
KW  - Pankreaskarzinom
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244963
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TY  - THES
A1  - Haker, Felix
T1  - Entwicklung eines in vitro Ansatzes zur Testung von Biofilm-Nachweismethoden und Antibiotikawirksamkeit
T1  - Development of an in vitro approach for testing biofilm detection methods and antibiotic effectiveness
N2  - Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung von aus Patientenisolaten gewonnenen S. aureus Kulturen und deren Biofilmbildung auf implantatähnlichen Titan-Oberflächen. Ziel war es, den zeitlichen Ablauf bakterieller periprothetischer Infektionen über einen Zeitraum von 21 Tagen zu beschreiben und besser zu verstehen. Dazu sollte überprüft werden, ob ein fluoreszenzspektrometrisch ausgewertetes LIVE/DEAD Assay eine zusätzliche Aussage zum Status der im Biofilm befindlichen Zellen liefern kann. Zudem wurde die Biofilmentwicklung anhand etablierter fluoreszenzspektrometrischer Methoden (Concanavalin-A-Markierung extrazellulärer Polymerer Substanzen, DNA-Markierung mit Hoechst 33342) untersucht. Es konnte ein reproduzierbarer Verlauf der Entwicklung des Biofilms, sowie der DNA-Menge aufgezeigt werden. Das LIVE/DEAD Assay lieferte keine signifikanten Ergebnisse in Bezug auf das Verhältnis lebender zu toter S. aureus Zellen im Biofilm.
Weiter wurde die Angreifbarkeit des frühen, am Titan adhärenten Biofilms (Alter 1-5 Tage) durch das in der Orthopädie gängig eingesetzte Antibiotikum Gentamicin untersucht. Die Wirksamkeit konnte zu jedem getesteten Zeitpunkt der ersten fünf Tage durch Anzucht von Kolonien bestätigt werden. Auch wurde die Wirksamkeit über das LIVE/DEAD Assay überprüft, jedoch konnten hier keine aussagekräftigen Daten gewonnen werden, die diese Methode zur Überprüfung der Antibiotikawirksamkeit empfehlen könnten.
N2  - This thesis deals with the investigation of S. aureus cultures obtained from patient isolates and their biofilm formation on implant-like titanium surfaces. The aim was to describe and better understand the chronological sequence of bacterial periprosthetic infections over a period of 21 days. For this purpose, it should be checked whether a LIVE/DEAD assay evaluated by fluorescence spectrometry can provide additional information on the status of the cells in the biofilm. In addition, the development of biofilms was investigated using established fluorescence spectrometric methods (Concanavalin-A labelling of extracellular polymer substances, DNA labelling with Hoechst 33342). A reproducible course of the development of the biofilm and the amount of DNA could be shown. The LIVE/DEAD assay did not provide any significant results with regarding the ratio of live to dead S. aureus cells in the biofilm.
The vulnerability of the early biofilm adhering to titanium (age 1-5 days) was also examined by using the antibiotic gentamicin, which is commonly used in orthopedics. By cultivating colonies it could be shown, that the antibiotic was effective at every tested time during the first five days. The effectiveness was also checked using the LIVE / DEAD assay, but no meaningful data could be obtained here that could recommend this method for checking the effectiveness of antibiotics against adherent Biofilms.
KW  - Biofilm
KW  - Endoprothese
KW  - periprothetische Infektion
KW  - periprosthetic infection
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250703
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TY  - THES
A1  - Radakovic, Dejan
T1  - Development of a Dialysis Graft Based on Tissue Engineering Methods
T1  - Entwicklung einer Dialysegraft basierend auf Tissue Engineering-Methoden
N2  - Despite advancements of modern medicine, the number of patients with the the end-stage kidney disease keeps growing, and surgical procedures to establish and maintain a vascular access for hemodialysis are rising accordingly. Surgical access of choice remains autogenous arteriovenous fistula, whereas approach “fistula first at all costs” leads to failure in certain subgroups of patients. Modern synthetic vascular grafts fail to deliver long-term results comparable with AV fistula. With all that in mind, this work has an aim of developing a new alternative vascular graft, which can be used for hemodialysis access using the methods of TE, especially electrospinning technique. It is hypothesized that electrospun scaffold, made of PCL and collagen type I may assemble mechanical properties similar to native blood vessels. Seeding such electrospun scaffolds with human microvascular endothelial cells (hmvECs) and preconditioning with shear stress and continuous flow might achieve sufficient endothelial lining being able to resist acute thrombosis. One further topic considered on-site infections, which represents one of the most spread complications of dialysis therapy due to continuous needle punctures. The main hypothesis was that during electrospinning process, polymers can be blended with antibiotics with the aim of producing scaffolds with antimicrobial properties, which could lead to reducing the risk of on-site infection on one side, while not affecting the cell viability.
N2  - Trotz der Fortschritte in der modernen Medizin wächst die Zahl der Patienten mit Nierenerkrankungen im Endstadium weiter, und die chirurgischen Verfahren zur Herstellung und Aufrechterhaltung eines Gefäßzugangs für die Hämodialyse nehmen entsprechend zu. Der chirurgische Zugang der Wahl bleibt eine autogene arteriovenöse Fistel, während der Ansatz „Fistel zuerst um jeden Preis“ bei bestimmten Untergruppen von Patienten zum Versagen führt. Moderne synthetische Gefäßtransplantate liefern keine mit AV-Fisteln vergleichbaren Langzeitergebnisse. Vor diesem Hintergrund zielt diese Arbeit darauf ab, ein neues alternatives Gefäßtransplantat zu entwickeln, das für den Zugang zur Hämodialyse unter Verwendung der TE-Methoden, insbesondere der Elektrospinntechnik, verwendet werden kann. Es wird angenommen, dass ein elektrogesponnenes Gerüst aus PCL und Kollagen Typ I ähnliche mechanische Eigenschaften wie native Blutgefäße aufweisen kann. Die Besiedelung solcher elektrogesponnener Gerüste mit menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen (hmvECs) und das Vorkonditionieren mit Scherbeanspruchung und kontinuierlichem Fluss könnte eine ausreichende Endothelialisierung erreichen, um eine akute Thrombose vermeiden zu können. Ein weiteres Thema waren lokale Infektionen, die eine der am weitesten verbreiteten Komplikationen der Dialysetherapie aufgrund kontinuierlicher Nadelstiche darstellen. Die Haupthypothese war, dass Polymere während des Elektrospinnprozesses mit Antibiotika gemischt werden können, um Gerüste mit antimikrobiellen Eigenschaften herzustellen, die dazu führen können, dass das Risiko einer Infektion vor Ort auf einer Seite verringert wird, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen.
KW  - Elektrospinnen
KW  - Tissue Engineering
KW  - Electrospinning
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208492
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TY  - THES
A1  - Lübtow, Michael M.
T1  - Structure-property relationships in poly(2-oxazoline)/poly(2-oxazine) based drug formulations
T1  - Struktur-Eigenschafts-Beziehungen in Poly(2-oxazolin)/Poly(2-oxazin) basierten Wirkstoffformulierungen
N2  - According to estimates, more than 40% of all new chemical entities developed in pharmaceutical industry are practically insoluble in water. Naturally, the demand for excipients which increase the water solubility and thus, the bioavailability of such hydrophobic drugs is enormous. Poly(2-oxazoline)s (POx) are currently intensively discussed as highly versatile class of biomaterials. Although selected POx based micellar drug formulations exhibit extraordinarily high drug loadings > 50 wt.% enabling high anti-tumor efficacies in vivo, the formulation of other hydrophobic compounds has failed. This casts doubt on the general understanding in which a hydrophobic active pharmaceutical ingredient is dissolved rather unspecifically in the hydrophobic core of the micelles following the fundamental concept of “like dissolves like”. Therefore, a closer look at the interactions between all components within a formulation becomes increasingly important. To do so, a large vehicle platform was synthesized, loaded with various hydrophobic drugs of different structure, and the formulations subsequently characterized with conventional and less conventional techniques. The obtained in-depth insights helped to develop a more thorough understanding about the interaction of polymer and incorporated API finally revealing morphologies deviating from a classical core/shell structure. During these studies, the scarcely investigated polymer class of poly(2-oxazine)s (POzi) was found as promising drug-delivery vehicle for hydrophobic drugs. Apart from this fundamental research, the anti-tumor efficacy of the two APIs curcumin and atorvastatin has been studied in more detail. To increase the scope of POx and POzi based formulations designed for intravenous administration, a curcumin loaded hydrogel was developed as injectable drug-depot.
N2  - Schätzungen zufolge sind mehr als 40% aller „new chemical entities“, welche in der pharmazeutischen Industrie entwickelt werden, wasserunlöslich. Aus diesem Grund ist der Bedarf an Zusatzstoffen, welche die Wasserlöslichkeit und dadurch die Bioverfügbarkeit erhöhen, enorm. Poly(2-oxazolin)e (POx) werden derzeitig intensiv als vielseitig einsetzbare Biomaterialien untersucht. Obwohl bestimmte POx basierte, mizellare Wirkstoffformulierungen außergewöhnlich hohe Beladungskapazitäten > 50 Gew.% aufwiesen und dadurch ausgeprägte anti-Tumor Effektivität  in vivo ermöglichten, schlug die Formulierung anderer hydrophober Stoffe fehl. Dies lässt Zweifel an dem altbewährten Konzept aufkommen, in welchem hydrophobe Arzneistoffe mehr oder weniger unspezifisch im hydrophoben Kern einer Mizelle gelöst werden. Aus diesem Grund ist ein genauerer Blick auf die Interaktionen zwischen allen Bestandteilen einer Formulierung vonnöten. Deshalb wurde eine große Polymerplattform synthetisiert, mit verschiedenen hydrophoben Wirkstoffen unterschiedlicher Struktur beladen und die Formulierungen im Anschluss mit herkömmlichen und weniger herkömmlichen Methoden charakterisiert. Die daraus erhaltenen Einblicke ermöglichten es ein umfassenderes Verständnis über die Interaktionen von Polymer und Wirkstoff zu entwickeln. Innerhalb dieser Studien wurden Aggregate charakterisiert, welche von einer klassischen Kern/Schale Morphologie abwichen. Des Weiteren konnte die kaum erforschte Polymerklasse der Poly(2-oxazin)e (POzi) als vielversprechende Wirkstoffträgerplattform für hydrophobe Wirkstoffe charakterisiert werden. Von dieser Grundlagenforschung abgesehen, wurde die anti-Tumor Effektivität von Curcumin und Atorvastatin Nanoformulierungen untersucht. Um den Anwendungsbereich der POx und POzi basierten Wirkstoffformulierungen, welche für intravenöse Verabreichung entwickelt wurden, zu erweitern, wurde ein Curcumin beladenes Hydrogel als injizierbares Wirkstoffdepot entwickelt.
KW  - Polymere
KW  - Nanomedizin
KW  - Wirkstoff-Träger-System
KW  - Ringöffnungspolymerisation
KW  - Hydrogel
KW  - Drug-Polymer Interactions
KW  - Poly(2-oxazoline)
KW  - Poly(2-oxazine)
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193387
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seidenspinner, Amelie Maria
T1  - Entwicklung einer biofunktionalen Beschichtung für mit Silber dotierte Titandioxid-Nanopartikel
T1  - Development of a biofunctional coating for silver doped titanium dioxide nanoparticles as potential anticancer agents
N2  - Ziel dieser Arbeit war es, eine erfolgreiche Beschichtung der verschiedenen TiO2 Nanopartikel mit aufsteigendem Silberanteil herzustellen, um eine ausgeprägte Stabilisierung und Biokompatibilität der Partikel zu erreichen. Anschließend wurde ihre Wirkung gegenüber gesunden Zellen und Tumorzellen anhand von Zellversuchen untersucht. 
Zunächst mussten die TiO2 Aggregate nach ihrer Redispergierung in Wasser, Toluol oder Tris Base gespalten werden, damit anschließend eine kontrollierte Beschichtung einzelner Nanopartikel durchgeführt werden konnte. Der Einfluss von Ultraschall in Form einer zweiminütigen Ultraschalltipbehandlung lieferte hierbei die niedrigsten Partikelgrößen in der DLS-Messung. 
Die Beschichtungen wurden mit APTES, Dopamin und PEG-SH unter Einfluss von unterschiedlichen Ultraschalltipzeiten, Konzentrationen, Temperaturen, pH-Werten, Salzen sowie verschiedenen Magnetrührtechniken und Waschprozessen entwickelt. Durch die Charakterisierungsmethoden via dynamischer Lichtstreuung, Zetapotentialmessung, Infrarotspektroskopie, REM und STEM wurde jede Beschichtung analysiert und auf diese Weise ihre optimale Herstellungsmethode erarbeitet. 
Schlussendlich wurde der Einfluss unbeschichteter sowie mit APTES, PDA und PEG-SH beschichteter TiO2 Nanopartikel mit steigendem Silberanteil anhand gesunder Zellen und Tumorzellen in vitro untersucht. Die Zellen wurden für 24 h mit den Partikeln inkubiert und anschließend mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Generell wurde nur eine geringfügige Auswirkung der Partikel auf die Zellen beobachtet. Die in der Literatur beworbene Aussage, dass silberdotierte TiO2 in der Lage sind, entartete Zellen zu töten, während gesunde Zellen ausgespart werden, konnte nicht bestätigt werden. Dennoch besaßen einige Faktoren einen Einfluss auf die Vitalität und Zellzahl. So spielte der steigende Silberanteil bei den Zellen eine Rolle, die einen Effekt auf die TiO2 Nanopartikel zeigten. Mit steigendem Ag-Anteil sanken Zellzahl und Vitalität stärker. Auch eine ansteigende Konzentration der beschichteten Partikel wirkte sich positiv auf das Absinken der Zellzahl aus. Besonders die adhärent wachsende Tumorzelllinie Panc02 zeigte sich sensibel gegenüber den beschichteten und unbeschichteten Partikeln. Die Beschichtung, welche die größte Auswirkung auf die Zellzahl- und Vitalitätsminderung der Zellen hatte, war eindeutig die PDA-Beschichtung.
N2  - The aim of this work was to produce a successful coating of the various TiO2 nanoparticles with an increasing proportion of silver in order to achieve a pronounced stabilization and biocompatibility of the particles. Subsequently, their effects on healthy cells and tumor cells were examined using cell experiments.
First, the TiO2 aggregates had to be cleaved after they were redispersed in water, toluene or Tris base so that a controlled coating of individual nanoparticles could then be carried out. The influence of ultrasound in the form of a two-minute ultrasound tip treatment provided the lowest particle sizes in the DLS measurement.
The coatings were developed with APTES, dopamine and PEG-SH under the influence of different ultrasonic tip times, concentrations, temperatures, pH values, salts as well as various magnetic stirring techniques and washing processes. With the characterization methods via dynamic light scattering, zeta potential measurement, infrared spectroscopy, SEM and STEM, each coating was analyzed and in this way the optimal manufacturing method was developed.
Finally, the influence of uncoated and APTES, PDA and PEG-SH coated TiO2 nanoparticles with increasing silver content was examined in vitro using healthy cells and tumor cells. The cells were incubated with the particles for 24 h and then characterized by flow cytometry.
In general, only a minor effect of the particles on the cells was observed. The statement advertised in the literature that silver doped TiO2 is able to kill degenerate cells while sparing healthy cells could not be confirmed.
However, some factors had an impact on vitality and cell count. The increasing proportion of silver in the cells played a role, which had an effect on the TiO2 nanoparticles. The cell count and vitality decreased more with increasing Ag content.
An increasing concentration of the coated particles also had a positive effect on the decrease in the number of cells. In particular, the adherently growing tumor cell line Panc02 was sensitive to the coated and uncoated particles. The coating that had the greatest impact on cell count and vitality loss was clearly the PDA coating.
KW  - Titandioxid
KW  - Nanopartikel
KW  - Beschichtung
KW  - Beschichtung von Titandioxid-Nanopartikeln
KW  - Vereinzelung von Partikeln
KW  - Silberdotierung
KW  - biofunctional coating
KW  - silver doped titanium dioxide nanoparticles
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205100
ER  - 
TY  - THES
A1  - Holzmeister, Ib
T1  - Branched silica precursors as additives for mineral bone cements
T1  - Verzweigte Silica-Vorläufer als Additive für mineralische Knochenzemente
N2  - Mineral biocements are brittle materials, which usually results in catastrophic failure during mechanical loading. Here, previous works demonstrated the feasibility of reducing brittleness by a dual-setting approach, in which a silica sol was simultaneously gelled during the setting of a brushite forming cement. The current thesis aimed at further improving this concept by both using a novel silicate based cement matrix for an enhanced bonding between cement and silica matrix as well as multifunctional silica precursors to increase the network density of the gel. Due to its well-known biocompatibility and osteogenic regeneration capacity, baghdadite was chosen as mineral component of such composites. This required in a first approach the conversion of baghdadite ceramics into self-setting cement formulations. This was investigated initially by using baghdadite as reactive filler in a brushite forming cement (Chapter 4). Here, the ß-TCP component in a equimolar mixture of ß-TCP and acidic monocalcium phosphate anhydrous was subsequently replaced by baghdadite at various concentrations (0, 5, 10, 20, 30, 50, and 100 wt%) to study the influence on physicochemical cement properties such as mechanical performance, radiopacity, phase composition and microstructure. X-ray diffraction profiles demonstrated the dissolution of baghdadite during the cement reaction without affecting the crystal structure of the precipitated brushite phase. In addition, EDX analysis showed that calcium is homogeneously distributed in the cement matrix, while zirconium and silicon form cluster-like aggregates ranging in size from a few micrometers to more than 50 µm. X-ray images and µ-CT analyses indicate improved X-ray visibility with increased incorporation of baghdadite in brushite cement, with an aluminum equivalent thickness nearly doubling at a baghdadite content of 50 wt%. At the same time, the compressive strength of brushite cement increased from 12.9 ± 3.1 MPa to 21.1 ± 4.1 MPa at a baghdadite content of 10 wt%. Cell culture medium conditioned with powdered brushite cement approached physiological pH values when increasing amounts of baghdadite were added to the cement (pH = 6.47 for pure brushite, pH = 7.02 for brushite with 20 wt% baghdadite substitution). Baghdadite substitution also affected the ion content in the culture medium and thus the proliferation activity of primary human osteoblasts in vitro. The results demonstrated for the first time the suitability of baghdadite as a reactive cement additive for improving the radiopacity, mechanical performance, and cytocompatibility of brushite cements.
A second approach (Chapter 5) aimed to produce single component baghdadite cements by an increase of baghdadite solubility to initiate a self-setting cement reaction. For this, the material was mechanically activated by longer grinding times of up to 24h leading to both a decrease in particle and crystallite size as well as a partial amorphization of baghdadite. Baghdadite cements were formed by adding water at a powder to liquid ratio of 2.0 g/ml. Maximum compressive strengths were determined to be ~2 MPa after 3 days of setting for a 24-hour ground material. Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) measurements showed an incongruent dissolution profile of the set cements, with preferential dissolution of calcium and only minor release of zirconium ions. Cement formation occurs under alkaline conditions, with the unground raw powder resulting in a pH of 11.9 during setting, while prolonged grinding increases the pH to about 12.3.
Finally, mechanically activated baghdadite cements were combined with inorganic silica networks (Chapter 6) to create dual-setting cements with a further improvement of mechanical performance. While a modification of the cement pastes with a TEOS derived sol was already thought to improve strength, it was hypothesized that using multi-arm silica precursors can further enhance their mechanical performance due to a higher network density. In addition, this should also reduce pore size of both gels and cement and hence will be able to adjust the release kinetics of incorporated drugs. For this, multi-armed silica precursors were synthesized by the reaction of various multivalent alcohols (ethylene glycol, glycerine, pentaerythrit) with an isocyanate modified silica precursor. After hydrolysis under acidic conditions, the sols were mixed with baghdadite cement powders in order to allow a simultaneous gel formation and cement setting. Since the silica monomers have a high degree of linkage sites, this resulted in a branched network that interpenetrated with the growing cement crystals. In addition to minor changes in the crystalline phase composition as determined by X-ray diffraction, the novel composites exhibited improved mechanical properties with up to 20 times higher compressive strength and further benefit from an about 50% lower overall porosity than the reference pure baghdadite cement. In addition, the initial burst release of the model drug vancomycin was completely inhibited by the added silica matrix. This observation was verified by testing for the antimicrobial activity with Staphylococcus aureus by measuring the inhibition zones of selected samples after 24 h and 48 h, whereas the antimicrobial effectiveness of a constant vancomycin release could be demonstrated.
The current thesis clearly demonstrated the high potential of baghdadite as a cement formulation for medical application. The initially poor mechanical properties of such cements can be overcome by special processing techniques or by combination with silica networks. The achieved mechanical performance is > 10 MPa and hence suitable for bone replacement under non-load bearing conditions. The high intrinsic radiopacity as well as the alkaline pH during setting may open the way ahead to further dental applications, e.g. as root canal sealers or filler in dental composites. Here, the high pH is thought to lead to antimicrobial properties of such materials similar to commonly applied calcium hydroxide or calcium silicates, however combined with an intrinsic radiopacity for X-ray imaging. This would simplify such formulations to single component materials which are less susceptible to demixing processes during transport, storage or processing.
N2  - Mineralische Biozemente sind spröde Materialien, die bei mechanischer Belastung in der Regel ein katastrophales Versagen zeigen. In früheren Arbeiten konnte die Sprödigkeit durch einen dual-härtenden Materialansatz verringert werden, bei dem ein dem Zement zugesetztes Kieselsol während des Aushärtens eines Bruschit-bildenden Zements simultan geliert und so die Matrix verstärkt. Die vorliegende Arbeit zielte darauf ab, dieses Konzept weiter zu verbessern, indem sowohl eine neuartige Zementmatrix auf Silikatbasis für eine verbesserte Bindung zwischen Zement und Kieselsäurematrix als auch multifunktionale Kieselsäure Precursoren zur Erhöhung der Netzwerkdichte des Gels verwendet wurden. Aufgrund der nachgewiesenen Biokompatibilität und osteogenen Regenerationsfähigkeit wurde Baghdadit als mineralischer Bestandteil solcher Komposite gewählt. Dies erforderte in einem ersten Ansatz die Umwandlung von Baghdadit-Keramik in selbsthärtende Zementformulierungen. Dies wurde zunächst durch die Verwendung von Baghdadit als reaktiver Füllstoff in einem Bruschit-bildenden Zement untersucht (Kapitel 4). Dabei wurde die β-TCP-Komponente in einem äquimolaren Gemisch aus β-TCP und saurem Monocalciumphosphat sukzessive durch Baghdadit in verschiedenen Konzentrationen (0, 5, 10, 20, 30, 50 und 100 Gew.-%) ersetzt, um den Einfluss auf die physikalisch-chemischen Zementeigenschaften, wie mechanische Festigkeit, Röntgenopazität, Phasenzusammensetzung und Mikrostruktur zu untersuchen. Röntgenbeugungsprofile zeigten die Auflösung von Baghdadit während der Zementreaktion, ohne die Kristallstruktur der ausgefällten Bruschitphase zu beeinträchtigen. Darüber hinaus zeigte die EDX-Analyse, dass Calcium homogen in der Zementmatrix verteilt ist, während Zirkon und Silizium clusterartige Aggregate mit einer Größe von einigen Mikrometern bis zu mehr als 50 µm bilden. Röntgenbilder und µ-CT-Analysen zeigen eine verbesserte Röntgensichtbarkeit bei erhöhtem Baghdadit-Anteil im Bruschit-Zement, wobei sich die Aluminium-Äquivalentdicke bei einem Baghdadit-Gehalt von 50 Gew.-% nahezu verdoppelt. Gleichzeitig stieg die Druckfestigkeit von Bruschitzement von 12,9 ± 3,1 MPa auf 21,1 ± 4,1 MPa bei einem Baghdaditgehalt von 10 Gew.-%. Zellkulturmedium, das mit pulverförmigem Bruschitzement konditioniert wurde, näherte sich physiologischen pH-Werten an, wenn dem Zement steigende Mengen an Baghdadit zugesetzt wurden (pH = 6,47 für reinen Bruschitzement, pH = 7,02 für Bruschitzement mit 20 Gew.-% Baghdadit-Substitution). Die Baghdadit-Substitution wirkte sich auch auf den Ionengehalt im Kulturmedium und damit auf die Proliferationsaktivität von primären menschlichen Osteoblasten in vitro aus. Die Ergebnisse zeigten zum ersten Mal die Eignung von Baghdadit als reaktives Zementadditiv zur Verbesserung der Röntgenopazität, der mechanischen Eigenschaften und der Zytokompatibilität von Bruschitzementen.
Ein zweiter Ansatz (Kapitel 5) zielte auf die Herstellung einkomponentiger Baghdadit-Zemente durch eine Erhöhung der Baghdadit-Löslichkeit ab, um eine Zementreaktion zu initiieren. Dazu wurde das Material durch längere Mahlung von bis zu 24 Stunden mechanisch aktiviert, was sowohl zu einer Abnahme der Partikel- und Kristallitgröße, als auch zu einer teilweisen Amorphisierung von Baghdadit führte. Baghdadit-Zemente wurden durch Zugabe von Wasser bei einem Verhältnis von Pulver zu Flüssigkeit von 2,0 g/ml erhalten. Die maximalen Druckfestigkeiten wurden mit ~2 MPa nach 3 Tagen Aushärtung für ein 24 Stunden gemahlenes Material ermittelt. Massenspektrometrische Messungen mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) ergaben ein inkongruentes Auflösungsprofil der abgebundenen Zemente mit einer bevorzugten Auflösung von Calcium und einer nur geringen Freisetzung von Zirkonium-Ionen. Die Zementbildung erfolgt unter alkalischen Bedingungen, wobei das ungemahlene Rohpulver während des Abbindens einen pH-Wert von 11.9 aufweist, während ein längeres Mahlen den pH-Wert auf etwa 12.3 erhöht.
Abschließend wurden mechanisch aktivierte Baghdadit-Zemente mit anorganischen Silica-Netzwerken kombiniert (Kapitel 6), um dual härtende Zemente mit einer weiteren Verbesserung der mechanischen Eigenschaften zu erhalten. Während eine Modifikation der Zementpasten mit einem TEOS-abgeleiteten Sol bereits die Festigkeit verbessern sollte, wurde angenommen, dass die Verwendung von mehrarmigen Kieselsäure-Precursoren die mechanische Festigkeit aufgrund einer höheren Netzwerkdichte weiter verbessern kann. Darüber hinaus sollte sich auch die Porengröße von Gelen und Zement verringern, so dass die Freisetzungskinetik von inkorporierten Wirkstoffen angepasst werden kann. Zu diesem Zweck wurden mehrarmige Kieselsäure-Precursoren durch die Reaktion verschiedener mehrwertiger Alkohole (Ethylenglykol, Glycerin, Pentaerythrit) mit einem isocyanatmodifizierten Kieselsäure-Precursor synthetisiert. Nach der Hydrolyse unter sauren Bedingungen wurden die Sole mit Baghdadit-Zementpulvern gemischt, um eine gleichzeitige Gelbildung und Zementabbindung zu ermöglichen. Da die Kieselsäuremonomere einen hohen Grad an Verknüpfungsstellen aufweisen, führte dies zu einem verzweigten Netzwerk, das die ausfallenden Zementkristalle durchdrang. Neben geringfügigen Veränderungen in der Zusammensetzung der durch Röntgenbeugung bestimmten kristallinen Phasen, wiesen die neuartigen Komposite verbesserte mechanische Eigenschaften mit einer bis zu 20-fach höheren Druckfestigkeit auf und profitierten außerdem von einer um etwa 50 % geringeren Gesamtporosität als der reine Baghdadit-Referenzzement. Darüber hinaus wurde die anfängliche starke Freisetzung („burst release“) des Modellwirkstoffs Vancomycin durch die zugesetzte Silica-Matrix vollständig gehemmt. Diese Beobachtung wurde durch Prüfung der antimikrobiellen Aktivität mit Staphylococcus aureus durch Messung des Hemmhofs im Agar-Diffusionstest ausgewählter Proben nach 24 h und 48 h verifiziert, wobei die antimikrobielle Wirksamkeit einer konstanten Vancomycin-Freisetzung nachgewiesen werden konnte.
Die vorliegende Arbeit zeigte deutlich das hohe Potenzial von Baghdadit Zementformulierungen für medizinische Anwendungen. Die anfänglich schlechten mechanischen Eigenschaften solcher Zemente können durch spezielle Verarbeitungstechniken oder durch die Kombination mit Silicanetzwerken überwunden werden. Die erzielten mechanischen Eigenschaften liegen bei > 10 MPa und die Materialien eignen sich daher für den Knochenersatz unter nicht-lasttragenden Bedingungen. Die hohe intrinsische Röntgenopazität sowie der alkalische pH-Wert während der Aushärtung könnten den Weg für weitere dentale Anwendungen öffnen, z. B. als Wurzelkanal-Zemente oder Füllstoff in Dentalkompositen. Hier ist davon auszugehen, dass der hohe pH-Wert zu antimikrobiellen Eigenschaften solcher Materialien führt, ähnlich wie bei den üblicherweise verwendeten Calciumhydroxiden oder Calciumsilikaten, jedoch in Kombination mit einer intrinsischen Röntgenopazität. Dies würde solche Formulierungen zu einkomponentigen Systemen vereinfachen, die weniger anfällig für Entmischungsprozesse während Transport, Lagerung oder Verarbeitung sind.
KW  - Zement
KW  - Sol-gel
KW  - Baghdadite
KW  - Cement
KW  - Silica precursor
KW  - Dual-setting
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-275044
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weichhold, Jan Lukas
T1  - Injectable calcium phosphate-based bone replacement cements
T1  - Injizierbare calciumphosphat-basierte Knochenersatzzemente
N2  - The human body has very good self-healing capabilities for numerous different injuries to a variety of different tissues. This includes the main human mechanical framework, the skeleton. The skeleton is limited in its healing without additional aid by medicine mostly by the defect size. When the defect reaches a size above 2.5 cm the regeneration of the defect ends up faulty. Here is where implants, defect fillers and other support approaches developed in medicine can help the body to heal the big defect still successfully.
Usually sturdy implants (auto-/allo-/xenogenic) are implanted in the defect to bridge the distance, but for auto- and allogenic implants a suitable donor site must be found and for all sources the implant needs to be shaped into the defect specific site to ensure a perfect fit, the best support and good healing. This shaping is very time consuming and prone to error, already in the planning phase. The use of a material that is moldable and sets in the desired shape shortly after applying negates these disadvantages. Cementitious materials offer exactly this property by being in a pasty stage after the powder and liquid components have been mixed and the subsequently hardening to a solid implant. These properties also enable the extrusion, and therefore may also enable the injection, of the cement via a syringe in a minimal invasive approach.
To enable a good injection of the cement modifications are necessary. This work aimed to modify commonly used calcium phosphate-based cement systems based on α-TCP (apatitic) and β-TCP (brushitic). These have been modified with sodium phytate and phytic acid, respectively. Additionally, the α-TCP system has been modified with sodium pyrophosphate, in a second study, to create a storable aqueous paste that can be activated once needed with a highly concentrated sodium orthophosphate solution.
The powder phase of the α-TCP cement system consisted of nine parts α-TCP and one part CDHA. These were prepared to have different particle sizes and therefore enable a better powder flowability through the bimodal size distribution. α-TCP had a main particle size of 20 μm and CDHA of 2.6 μm. The modification with sodium phytate led to an adsorption of phytate ions on the surface of the α-TCP particles, where they started to form complexes with the Ca2+ ions in the solution. This adsorption had two effects. The first was to make the calcium ions unavailable, preventing supersaturation and ultimately the precipitation of CDHA what would lead to the cement hardening. The second was the increase of the absolute value of the surface charge, zeta potential, of the powder in the cement paste. Here a decrease from +3 mV to -40 mV could be measured. A strong value for the zeta potential leads to a higher repulsion of similarly charged particles and therefore prevents powder agglomeration and clogging on the nozzle during injection. These two modifications (bimodal particles size distribution and phytic acid) lead to a significant increase in the paste injectability. The unmodified paste was injectable for 30 % only, where all modified pastes were practically fully injectable ~90 % (the residual paste remained in the nozzle, while the syringe plunger already reached the end of the syringe).
A very similar observation could be made for the β-TCP system. This system was modified with phytic acid. The zeta potential was decreased even stronger from -10 ± 1.5 mV to -71.5 ± 12 mV. The adsorption of the phytate ions and subsequent formation of chelate complexes with the newly dissolved Ca2+ ions also showed a retarding effect in the cements setting reaction. Where the unmodified cement was not measurable in the rheometer, as the reaction was faster than the measurement setup (~1.5 min), the modified cements showed a transition through the gel point between 3-6 min. This means the pastes stayed between 2 and 4 times longer viscous than without the modification. Like with the first cement system also here the effects of the phytate addition showed its beneficial influence in the injectability measurement. The unmodified cement was not injectable at all, due to the same issue already encountered at the rheology measurements, but all modified pastes were fully injectable for at least 5 min (lowest phytate concentration) and at least 10 min (all other concentrations) after the mixing of powder and liquid.
The main goal of the last modification with sodium pyrophosphate was to create a paste that was stable in aqueous environment without setting until the activation takes place, but it should still show good injectability as this was the desired way of application after activation. Like before also the zeta potential changed after the addition of pyrophosphate. It could be lowered from -22 ± 2mV down to -61 to -68 ± 4mV (depending on the pyrophosphate concentration). The pastes were stored in airtight containers at room temperature and checked for their phase composition over 14 days. The unmodified paste showed a beginning phase conversion to hydroxyapatite between 7 and 14 days. All other pastes were still stable and unreacted. The pastes were activated with a high concentrated (30 wt%) sodium orthophosphate solution. After the activation the pastes were checked for their injectability and showed an increase from -57 ± 11% for the unmodified paste to -89 ± 3% (practically fully injectable as described earlier) for the best modified paste (PP005).
It can be concluded that the goal of enabling full injection of conventional calcium phosphate bone cement systems was reached. Additional work produced a storage stable paste that still ensures full injectability. Subsequent work already used the storable paste and modified it with hyaluronic acid to create an ink for 3D extrusion printing. The first two cement systems have also already been investigated in cell culture for their influence on osteoblasts and osteoclasts. The next steps would have to go more into the direction of translation. Figuring out what properties still need to be checked and where the modification needs adjustment to enable a clinical use of the presented systems.
N2  - Der menschliche Körper verfügt über sehr gute Selbstheilungsfähigkeiten für zahlreiche verschiedene Verletzungen in unterschiedlichen Geweben. Dazu gehört auch das wichtigste mechanische Gerüst des Menschen, das Skelett. Das Skelett ist in seiner Heilung ohne zusätzliche Hilfe durch die Medizin vor allem durch die Defektgröße begrenzt. Erreicht der Defekt eine Größe von mehr als 2,5 cm, ist die Regeneration des Defekts nicht mehr gewährleistet. Hier können Implantate, Defektfüller und andere in der Medizin entwickelte Unterstützungsansätze dem Körper helfen, den großen Defekt noch erfolgreich zu heilen.
In der Regel werden stabile Implantate (auto-/allo-/xenogen) in den Defekt eingesetzt, um den Abstand zu überbrücken. Für auto- und allogene Implantate muss jedoch eine geeignete Spenderstelle gefunden werden, und für alle Quellen muss das Implantat in die defektspezifische Stelle geformt werden, um eine perfekte Passform, den besten Halt und eine gute Heilung zu gewährleisten. Diese Formgebung ist sehr zeitaufwendig und fehleranfällig, schon in der Planungsphase. Die Verwendung eines Materials, das formbar ist und kurz nach dem Auftragen in der gewünschten Form aushärtet, negiert diese Nachteile. Zementartige Materialien bieten genau diese Eigenschaft, indem sie sich nach dem Vermischen von Pulver und flüssigen Komponenten in einem pastösen Stadium befinden und anschließend zu einem festen Implantat aushärten. Diese Eigenschaften ermöglichen auch die Extrusion und damit möglicherweise auch die Injektion des Zements über eine Spritze in einem minimalinvasiven Verfahren.
Um eine gute Injektion des Zements zu ermöglichen, sind Modifikationen erforderlich. Ziel dieser Arbeit war es, die gängigen Zementsysteme auf Kalziumphosphatbasis zu modifizieren, die auf α-TCP (apatitisch) und β-TCP (brushitisch) basieren. Diese wurden mit Natriumphytat bzw. Phytinsäure modifiziert. Zusätzlich wurde das α-TCP-System in einer zweiten Studie mit Natriumpyrophosphat modifiziert, um eine lagerfähige wasserbasierte Paste zu schaffen, die bei Bedarf mit einer hochkonzentrierten Natriumorthophosphatlösung aktiviert werden kann.
Die Pulverphase des α-TCP-Zementsystems bestand aus neun Teilen α-TCP und einem Teil CDHA. Diese wurden so aufbereitet, dass sie unterschiedliche Partikelgrößen aufweisen und somit eine bessere Fließfähigkeit des Pulvers durch die bimodale Größenverteilung ermöglichen. α-TCP hatte eine Hauptpartikelgröße von 20 μm und CDHA von 2,6 μm. Die Modifizierung mit Natriumphytat führte zu einer Adsorption von Phytat-Ionen an der Oberfläche der α-TCP-Partikel, wo sie Komplexe mit den Ca2+-Ionen in der Lösung zu bilden begannen. Diese Adsorption hatte zwei Auswirkungen. Die erste bestand darin, dass die Calciumionen nicht mehr verfügbar waren, wodurch die Übersättigung und letztlich die Ausfällung von CDHA verhindert wurde, was zur Erhärtung des Zements geführt hätte. Der zweite Effekt war die Erhöhung des Betrags der Oberflächenladung, des Zetapotenzials, des Pulvers in der Zementpaste. Hier konnte eine Abnahme von +3 mV auf -40 mV gemessen werden. Ein hoher Wert für das Zetapotenzial führt zu einer stärkeren Abstoßung ähnlich geladener Teilchen und verhindert somit die Agglomeration des Pulvers und das Verstopfen der Kanüle während der Injektion. Diese beiden Modifikationen (bimodale Partikelgrößenverteilung und Phytinsäure) führen zu einer deutlichen Verbesserung der Injektionsfähigkeit der Paste. Die unmodifizierte Paste war nur zu 30 % injizierbar, während alle modifizierten Pasten praktisch vollständig injizierbar waren ~90 %(die Restpaste blieb in der Kanüle, während der Spritzenkolben bereits das Ende der Spritze erreichte).
Eine sehr ähnliche Beobachtung konnte für das β-TCP-System gemacht werden. Dieses System wurde mit Phytinsäure modifiziert. Das Zetapotenzial sank noch stärker von -10 ± 1,5 mV auf -71,5 ± 12mV. Die Adsorption der Phytat-Ionen und die anschließende Bildung von Chelatkomplexen mit den neu gelösten Ca2+-Ionen zeigten ebenfalls eine verzögernde Wirkung bei der Abbindereaktion des Zements. Während der unmodifizierte Zement im Rheometer nicht messbar war, da die Reaktion schneller verlief als der Messaufbau (~1,5 min), zeigten die modifizierten Zemente einen Übergang durch den Gelpunkt zwischen 3-6 min. Dies bedeutet, dass die Pasten zwischen 2 und 4 mal länger viskos blieben als ohne die Modifikation. Wie beim ersten Zementsystem zeigte sich auch hier der positive Einfluss des Phytatzusatzes bei der Messung der Injektionsfähigkeit. Der unmodifizierte Zement war überhaupt nicht injizierbar,
was auf das gleiche Problem zurückzuführen ist, das bereits bei den rheologischen Messungen aufgetreten ist, aber alle modifizierten Pasten waren mindestens 5 min (niedrigste Phytatkonzentration) und mindestens 10 min (alle anderen Konzentrationen) nach dem Mischen von Pulver und Flüssigkeit vollständig injizierbar.
Das Hauptziel der letzten Modifikation mit Natriumpyrophosphat bestand darin, eine Paste zu schaffen, die in wässriger Umgebung stabil ist und bis zur Aktivierung nicht aushärtet, die aber dennoch eine gute Injektionsfähigkeit aufweisen sollte, da dies die gewünschte Art der Anwendung nach der Aktivierung war. Wie zuvor änderte sich auch das Zetapotenzial nach der Zugabe von Pyrophosphat. Es konnte von -22 ± 2mV auf -61 bis -68 ± 4mV (abhängig von der Pyrophosphatkonzentration) gesenkt werden. Die Pasten wurden in luftdichten Behältern bei Raumtemperatur gelagert und über 14 Tage auf ihre Phasenzusammensetzung untersucht. Die unmodifizierte Paste zeigte zwischen 7 und 14 Tagen eine beginnende Phasenumwandlung in Hydroxyapatit. Alle anderen Pasten waren noch stabil und nicht umgewandelt. Die Pasten wurden mit einer hochkonzentrierten (30 Gew.-%) Natriumorthophosphatlösung aktiviert. Nach der Aktivierung wurden die Pasten auf ihre Injektionsfähigkeit geprüft und zeigten einen Anstieg von -57 ± 11 % für die unmodifizierte Paste auf -89 ± 3 % (praktisch vollständig injizierbar, wie zuvor beschrieben) für die beste modifizierte Paste (PP005).
Daraus lässt sich schließen, dass das Ziel, die vollständige Injektion herkömmlicher Kalziumphosphat-Knochenzementsysteme zu ermöglichen, erreicht wurde. Weitere Arbeiten führten zu einer lagerstabilen Paste, die dennoch eine vollständige Injektionsfähigkeit gewährleistet. In nachfolgenden Arbeiten wurde die lagerfähige Paste bereits verwendet und mit Hyaluronsäure modifiziert, um eine Tinte für den 3D-Extrusionsdruck herzustellen. Die ersten beiden Zementsysteme wurden auch bereits in Zellkulturen auf ihren Einfluss auf Osteoblasten und Osteoklasten untersucht. Die nächsten Schritte müssten mehr in Richtung Translation gehen. Es gilt herauszufinden, welche Eigenschaften noch überprüft werden müssen und wo die Modifikation angepasst werden muss, um einen klinischen Einsatz der vorgestellten Systeme zu ermöglichen.
KW  - Calciumphosphat
KW  - Cement
KW  - Knochenersatz
KW  - Zement
KW  - Injectability
KW  - Bone-replacement
KW  - IP6
KW  - Modification
KW  - Rheology
KW  - Setting Control
KW  - Calcium Phosphate
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326616
ER  - 
TY  - THES
A1  - Späth [geb. Lutz], Johanna
T1  - Oberflächenfunktionalisierte Gold- und Silbernanopartikel auf Basis von Thioether-Poly(glycidol) für potenzielle biomedizinische Anwendungen - Auswirkungen auf Stabilität, Proteinkoronabildung und Biodistribution
T1  - Surface-Functionalized Gold and Silver Nanoparticles Based on Thioether-Poly(glycidol) for Potential Biomedical Application – Impact on Stability, Protein Corona Formation and Biodistribution
N2  - Based on previous results showing that thioether modification of gold nanoparticles (AuNPs), especially coating with a multivalent system, yielded in excellent colloidal stability, the first aim of this thesis was to prove whether functionalization of silver nanoparticles (AgNPs) with thioether also has a comparable or even enhanced stabilization efficacy compared with the gold standard of coating with thiols and, particularly, whether the multivalency of polymers leads to stable AgNPs conjugates. Herein, AgNPs coated with mono- and multivalent thiol- and thioether polymers were prepared to systematically investigate the adsorption kinetics onto the silver surface as well as the colloidal stability after exposure to different conditions relevant for biomedical application. Although the thioether-polymers showed a slower immobilization onto AgNPs, same or mostly even better stabilization was exhibited than for the thiol analogs.

As multivalent thioether-poly(glycidol) (PG) is already proven as a promising candidate for AuNP modification and stabilization, the second aim of this thesis was to examine the stealth behavior of thioether-PG, side-chain functionalized with various hydrophobic (alkyl and cholesteryl) units, to gain a deeper understanding of AuNP surface functionalization in terms of protein adsorption and their subsequent cellular uptake by human monocyte-derived macrophages. For this purpose, citrate-stabilized AuNPs were modified with the amphiphilic polymers by ligand exchange reaction, followed by incubation in human serum. The various surface amphiphilicities affected protein adsorption to a certain extent, with less hydrophobic particle layers leading to a more inhibited protein binding. Especially AuNPs functionalized with PG carrying the longest alkyl chain showed differences in the protein corona composition compared to the other polymer-coated NPs. In addition, PGylation, and especially prior serum incubation, of the NPs exhibited reduced macrophage internalization.

As the use of mammals for in vivo experiments faces various challenges including increasing regulatory hurdles and costs, the third aim of this thesis was to validate larvae of the domestic silkworm Bombyx mori as an alternative invertebrate model for preliminary in vivo research, using AuNPs with various surface chemistry (one PEG-based modification and three PG-coatings with slightly hydrophobic functionalization, as well as positively and negatively charges) for studying their biodistribution and elimination. 6 h and 24 h after intra-hemolymph injection the Au content in different organ compartments was measured with ICP-MS, showing that positively charged particles appeared to be eliminated most rapidly through the midgut, while AuNPs modified with PEG, alkyl-functionalized PG and negatively charged PG exhibited long-term bioavailability in the silkworm body.
N2  - Basierend auf früheren Ergebnissen, die zeigten, dass die Thioether-Modifikation von Gold-Nanopartikeln (AuNPs), insbesondere die Beschichtung mit einem multivalenten System, zu einer hervorragenden kolloidalen Stabilität führt, war das erste Ziel dieser Arbeit zu nachzuweisen, ob die Funktionalisierung von Silber-Nanopartikeln (AgNPs) mit Thioether-Polymeren ebenfalls eine vergleichbare oder sogar verbesserte Stabilisierungseffizienz im Vergleich zur Beschichtung mit Thiolen aufweist und ob insbesondere die Multivalenz der Polymere zu stabilen AgNP-Konjugaten führt. Es wurden AgNPs hergestellt, die mit mono- und multivalenten Thiol- und Thioether-Polymeren beschichtet waren, um die Adsorptionskinetik an der Silberoberfläche sowie die kolloidale Stabilität nach Einwirkung verschiedener, für biomedizinische Anwendungen relevanter Bedingungen systematisch zu untersuchen. Obwohl die Thioether-Polymere eine langsamere Immobilisierung auf AgNPs zeigten, war die Stabilisierung gleich oder meist sogar besser als bei den Thiol-Analoga.

Nachdem sich multivalentes Thioether-Poly(glycidol) (PG) bereits als vielversprechender Kandidat für die Modifizierung und Stabilisierung von AuNP erwiesen hat, bestand das zweite Ziel dieser Arbeit darin, das „Stealth“-Verhalten von PG, das mit verschiedenen hydrophoben (Alkyl- und Cholesteryl-) Einheiten funktionalisiert wurde, zu untersuchen. Dadurch sollte ein besseres Verständnis der AuNP-Oberflächenfunktionalisierung im Hinblick auf die Proteinadsorption und die anschließende zelluläre Aufnahme durch menschliche Makrophagen erlangt werden. Zu diesem Zweck wurden Citrat-stabilisierte AuNPs mit den amphiphilen Polymeren durch Ligandenaustauschreaktion modifiziert und anschließend in menschlichem Serum inkubiert. Die verschiedenen Oberflächen-Amphiphilizitäten beeinflussten die Proteinadsorption in gewissem Maße, wobei weniger hydrophobe Partikelschichten zu einer reduzierteren Proteinanreicherung führten. Insbesondere AuNPs, die mit PG mit der längsten Alkylkette funktionalisiert waren, zeigten Unterschiede in der Zusammensetzung der Proteinkorona im Vergleich zu den anderen polymerbeschichteten Partikeln. Darüber hinaus führte die PGylierung und insbesondere die vorherige Seruminkubation der NPs zu einer geringeren Internalisierung durch Makrophagen.

Da die Verwendung von Säugetieren für In-vivo-Experimente mit verschiedenen Herausforderungen verbunden ist, wie zum Beispiel zunehmende regulatorische Hürden und Kosten, bestand das dritte Ziel dieser Arbeit darin, Larven der heimischen Seidenraupe Bombyx mori als alternatives wirbelloses Tiermodell für erste In-vivo-Forschungen zu prüfen, wobei AuNPs mit unterschiedlicher Oberflächenchemie (eine PEG-basierte Modifikation und drei PG-Beschichtungen mit leicht hydrophober Funktionalisierung sowie positiven und negativen Ladungen) zur Untersuchung ihrer Biodistribution und Eliminierung verwendet wurden. 6 Stunden und 24 Stunden nach der Injektion in die Hämolymphe wurde der Au-Gehalt in verschiedenen Organen mit ICP-MS gemessen. Unter allen getesteten AuNPs schienen positiv geladene Partikel am schnellsten durch den Mitteldarm eliminiert zu werden, während mit PEG, alkylfunktionalisiertem PG und negativ geladenem PG modifizierte AuNPs eine langfristige Bioverfügbarkeit im Seidenraupenkörper aufwiesen.
KW  - Nanopartikel
KW  - Gold- und Silbernanopartikel
KW  - Thioether-Poly(glycidol)-Beschichtung
KW  - Colloidal stability
KW  - Protein corona
KW  - Biodistribution
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-350662
ER  - 
TY  - THES
A1  - Nadernezhad, Ali
T1  - Engineering approaches in biofabrication of vascularized structures
T1  - Ingenieurtechnische Ansätze in der Biofabrikation vaskularisierter Strukturen
N2  - Biofabrication technologies must address numerous parameters and conditions to reconstruct tissue complexity in vitro. A critical challenge is vascularization, especially for large constructs exceeding diffusion limits. This requires the creation of artificial vascular structures, a task demanding the convergence and integration of multiple engineering approaches. This doctoral dissertation aims to achieve two primary objectives: firstly, to implement and refine engineering methods for creating artificial microvascular structures using Melt Electrowriting (MEW)-assisted sacrificial templating, and secondly, to deepen the understanding of the critical factors influencing the printability of bioink formulations in 3D extrusion bioprinting.

In the first part of this dissertation, two innovative sacrificial templating techniques using MEW are explored. Utilizing a carbohydrate glass as a fugitive material, a pioneering advancement in the processing of sugars with MEW with a resolution under 100 microns was made. Furthermore, by introducing the “print-and-fuse” strategy as a groundbreaking method, biomimetic branching microchannels embedded in hydrogel matrices were fabricated, which can then be endothelialized to mirror in vivo vascular conditions.

The second part of the dissertation explores extrusion bioprinting. By introducing a simple binary bioink formulation, the correlation between physical properties and printability was showcased. In the next step, employing state-of-the-art machine-learning approaches revealed a deeper understanding of the correlations between bioink properties and printability in an extended library of hydrogel formulations.

This dissertation offers in-depth insights into two key biofabrication technologies. Future work could merge these into hybrid methods for the fabrication of vascularized constructs, combining MEW's precision with fine-tuned bioink properties in automated extrusion bioprinting.
N2  - Biofabrikationstechnologien müssen zahlreiche Parameter und Bedingungen berücksichtigen, um die Komplexität von Gewebe in vitro zu rekonstruieren. Eine entscheidende Herausforderung ist die Vaskularisierung, insbesondere bei großen Konstrukten, die die Diffusionsgrenzen überschreiten. Dies erfordert die Schaffung künstlicher Gefäßstrukturen, eine Aufgabe, die die Konvergenz und Integration verschiedener technischer Ansätze erfordert. Mit dieser Dissertation sollen zwei Hauptziele erreicht werden: erstens die Implementierung und Verfeinerung technischer Methoden zur Herstellung künstlicher mikrovaskulärer Strukturen mit Hilfe des "Melt Electrowriting" (MEW) und zweitens die Vertiefung des Verständnisses der kritischen Faktoren, die die Druckbarkeit von Biotintenformulierungen beim 3D-Extrusions-Bioprinting beeinflussen.

Im ersten Teil dieser Dissertation werden zwei innovative Opferschablonentechniken unter Verwendung von MEW erforscht. Unter Verwendung eines Kohlenhydratglases als flüchtiges Material wurde ein bahnbrechender Fortschritt bei der Verarbeitung von Zuckern mit MEW mit einer Auflösung von unter 100 Mikrometern erzielt. Darüber hinaus wurden durch die Einführung der "Print-and-Fuse"-Strategie als bahnbrechende Methode biomimetische, verzweigte Mikrokanäle hergestellt, die in Hydrogelmatrizen eingebettet sind und anschließend endothelialisiert werden können, um die vaskulären Bedingungen in vivo wiederzugeben.

Der zweite Teil der Dissertation befasst sich mit dem Extrusions-Bioprinting. Durch die Einführung einer einfachen binären Biotintenformulierung wurde die Korrelation zwischen physikalischen Eigenschaften und Druckbarkeit aufgezeigt. Im nächsten Schritt wurde durch den Einsatz modernster Methoden des maschinellen Lernens ein tieferes Verständnis für die Zusammenhänge zwischen den Eigenschaften der Biotinte und der Druckbarkeit in einer erweiterten Bibliothek von Hydrogelformulierungen gewonnen.

Diese Dissertation bietet tiefe Einblicke in zwei Schlüsseltechnologien der Biofabrikation. Zukünftige Arbeiten könnten diese zu hybriden Methoden für die Herstellung vaskularisierter Konstrukte zusammenführen und dabei die Präzision von MEW mit fein abgestimmten Biotinteneigenschaften im automatisierten Extrusionsbioprinting kombinieren.
KW  - 3D-Druck
KW  - Rheologie
KW  - Maschinelles Lernen
KW  - Bioinks
KW  - Hyrogels
KW  - Valscularization
KW  - Melt Electrowriting
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345892
ER  -