TY  - THES
A1  - Bertlein, Sarah
T1  - Hydrogels as Biofunctional Coatings and Thiol-Ene Clickable Bioinks for Biofabrication
T1  - Hydrogele als biofunktionale Beschichtungen und Thiol-Ene-clickbare Biotinten für die Biofabrikation
N2  - Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von funktionalisierbaren Hydrogel Beschichtungen für Schmelz-elektrogeschriebene PCL Gerüste und von Bio-druckbaren Hydrogelen für die Biofabrikation.
Hydrogel Beschichtungen von Schmelz-elektrogeschriebenen Konstrukten ermöglichten die Kontrolle der Oberflächen-Hydrophilie und damit Zell-Material Interaktionsstudien in minimal Protein-adhäsiven Umgebungen. Zu diesem Zweck wurde ein hydrophiles sternförmiges vernetzbares Polymer verwendet und eine Optimierung der Beschichtungsbedingungen durchgeführt. Außerdem boten neu entwickelte photosensitive Konstrukte eine Zeit- und pH-unabhängige Biofunktionalisierung.
Bio-druckbare Hydrogele für die Biofabrikation basierten auf der Allyl-Funktionalisierung von Gelatine (GelAGE) und modifizierten Hyaluronsäure-Produkten, die das Hydrogel-Vernetzen mittels Thiol-En Click Chemie ermöglichen. Die Optimierung der GelAGE Hydrogel-Eigenschaften wurde durch eine detaillierte Analyse der Syntheseparameter, variierender En:SH Verhältnisse, unterschiedlicher Vernetzungsmoleküle und Photoinitiatoren erreicht. Die Homogenität der Thiol-En Netzwerke wurde mit denen der freien radikalischen Polymerisation verglichen und die Verwendbarkeit von GelAGE als Bio-Tinte für den Extrusions-basierten Bio-Druck wurde untersucht. Es wurde angenommen, dass reine Hyaluronsäure-basierte Bio-Tinten eine Beibehaltung der mechanischen und rheologischen Eigenschaften, der Zellviabilität und der Prozessierbarkeit ermöglichen trotz geringerem Polymer- und Thiol-Anteil der Hydrogele.
Hydrogel-Beschichtungen: Hoch definierte PCL Gerüste wurden mittels MEW hergestellt und anschließend mit sechs armigen sternförmigen vernetzbaren Polymeren (sP(EO-stat-PO)) beschichtet. Die Vernetzung wird durch die wässrig-induzierte Hydrolyse reaktiver Isocyanatgruppen (NCO) von sP(EO-stat-PO) bedingt. Diese Beschichtung erhöhte die Oberflächen-Hydrophilie und stellte eine Plattform für weitere Biofunktionalisierungen, in minimal Protein-adhäsiven Umgebungen, dar. Nicht nur das Beschichtungsprotokoll wurde hinsichtlich der sP(EO-stat-PO) Konzentrationen und der Beschichtungsdauern optimiert, sondern auch Vorbehandlungen der Gerüste wurden entwickelt. Diese waren essentiell um die finale Hydrophilie von sP(EO-stat-PO) beschichteten Gerüste so zu erhöhen, dass unspezifische Protein-Adhäsionen vollständig unterbunden wurden. Die sP(EO-stat-PO) Schichtdicke, von ungefähr 100 nm, ermöglicht
generell in vitro Studien nicht nur in Abhängigkeit der Gerüst-Biofunktionalisierung, sondern auch in Abhängigkeit der Gerüst-Architektur durchzuführen. Das Ausmaß der Hydrogel-Beschichtung wurde mittels einer indirekten Quantifizierung der NCO-Hydrolyse-Produkte ermittelt. Kenntnis über die NCO-Hydrolyse-Kinetik ermöglichte ein Gleichgewicht zwischen ausreichend beschichteten Gerüsten und der Präsenz der NCO-Gruppen herzustellen, welche für die anschließenden Biofunktionalisierungen genutzt wurden. Diese Zeit- und pH-abhängige Biofunktionalisierung war jedoch nur für kleine Biomoleküle möglich. Um diese Beschränkung zu umgehen und auch hochmolekulare Biomoleküle kovalent anzubinden, wurde ein anderer Reaktionsweg entwickelt. Dieser basierte auf der Photolyse von Diazirin-Gruppen und ermöglichte eine Zeit- und pH-unabhängige Biofunktionalisierung der Gerüste mit Streptavidin und Kollagen Typ I. Die Fibrillen bildende Eigenschaft von Kollagen wurde genutzt um auf den Gerüsten verschiedene Kollagen-Konformationen zu erhalten und eine erste in vitro Studie bestätigte die Anwendbarkeit für Zell-Material Interaktionsstudien.
Die hier entwickelten Gerüste könnten verwendet werden um tiefere Einblicke in die Grundlagen der zellulären Wahrnehmung zu erhalten. Insbesondere die Komplexität mit der Zellen z.B. Kollagen wahrnehmen bleibt weiterhin klärungsbedürftig. Hierfür könnten diverse Hierarchien von Kollagen-ähnlichen Konformationen an die Gerüste gebunden werden, z.B. Gelatine oder Kollagen-abgeleitete Peptidsequenzen. Dann könnte die Aktivierung der DDR-Rezeptoren in Abhängigkeit der Komplexität der angebundenen Substanzen bestimmt werden. Aufgrund der starken Streptavidin-Biotin Bindung könnten Streptavidin funktionalisierte Gerüste eine vielseitige Plattform für die Immobilisierung von jeglichen biotinylierten Molekülen darstellen.
Gelatine-basierte Bio-Tinten: Zuerst wurden die GelAGE-Produkte hinsichtlich der Molekulargewichts-Verteilung und der Integrität der Aminosäuren-Zusammensetzung synthetisiert. Eine detailliert Studie, mit variierenden molaren Edukt-Verhältnissen und Synthese-Zeitspannen, wurde durchgeführt und implizierte, dass der Gelatine Abbau am deutlichsten für stark alkalische Synthesebedingungen mit langen Reaktionszeiten war. Gelatine beinhaltet mehrere funktionalisierbare Gruppen und anhand diverser Model-Substanzen und Analysen wurde die vorrangige Amingruppen-Funktionalisierung ermittelt. Die Homogenität des GelAGE-Polymernetzwerkes, im Vergleich zu frei radikalisch polymerisierten GelMA-Hydrogelen, wurde bestätigt. Eine ausführliche
Analyse der Hydrogel-Zusammensetzungen mit variierenden funktionellen Gruppen Verhältnissen und UV- oder Vis-Licht induzierbaren Photoinitiatoren wurde durchgeführt. Die UV-Initiator Konzentration ist aufgrund der Zell-Toxizität und der potenziellen zellulären DNA-Beschädigung durch UV-Bestrahlung eingeschränkt. Das Zell-kompatiblere Vis-Initiator System hingegen ermöglichte, durch die kontrollierte Photoinitiator-Konzentration bei konstanten En:SH Verhältnissen und Polymeranteilen, die Einstellung der mechanischen Eigenschaften über eine große Spanne hinweg. Die Flexibilität der GelAGE Bio-Tinte für unterschiedliche additive Fertigungstechniken konnte, durch Ausnutzung des temperaturabhängigen Gelierungsverhaltens unterschiedlich stark degradierter GelAGE Produkte, für Stereolithographie und Extrusions-basiertem Druck bewiesen werden. Außerdem wurde die Viabilität zellbeladener GelAGE Konstrukte bewiesen, die mittels Extrusions-basiertem Bio-Druck erhalten wurden. Die Verwendung diverser multifunktioneller und makromolekularer Thiol-Vernetzungsmoleküle ermöglichte eine Verbesserung der mechanischen und rheologischen Eigenschaften und ebenso der Prozessierbarkeit. Verglichen mit dem kleinen bis-Thiol-funktionellen Vernetzungsmolekül waren geringere Thiol-Vernetzer-Konzentrationen notwendig um bessere mechanische Festigkeiten und physikochemische Eigenschaften der Hydrogele zu erhalten. Der Extrusions-basierte Bio-Druck unterschiedlicher eingekapselter Zellen verdeutlichte die Notwendigkeit der individuellen Optimierung von Zell-beladenen Hydrogel-Formulierungen.
Nicht nur die Zellviabilität von eingekapselten Zellen in Extrusions-basierten biogedruckten Konstrukten sollte bewertet werden, sondern auch andere Parameter wie die Zellmorphologie oder die Kollagen- oder Glykosaminoglykan-Produktion, da diese einige der essentiellen Voraussetzungen für die Verwendung in Knorpel Tissue Engineering Konzepten darstellen. Außerdem sollten diese Studien auf die stereolithographischen Ansätze erweitert werden und letztlich wäre die Flexibilität und Zellkompatibilität der Formulierungen mit makromolekularen Vernetzern von Interesse. Makromolekulare Vernetzer ermöglichten die Reduktion des Polymeranteils und des Thiol-Gehalts und können, insbesondere in Kombination mit dem Zell-kompatibleren Vis-Initiator-System, voraussichtlich zu einer gesteigerten Zellkompatibilität beitragen, was zu klären bleibt.
Hyaluronsäure-basierte Bio-Tinten: Unterschiedliche Hyaluronsäure-Produkte (HA) wurden synthetisiert, sodass diese En- (HAPA) oder Thiol-Funktionalitäten (LHASH)
beinhalteten, um reine HA Thiol-En vernetzte Hydrogele zu erhalten. In Abhängigkeit des Molekulargewichts der HA-Produkte, der Polymeranteile und des En:SH Verhältnisses, konnte eine große Spanne an mechanischen Festigkeiten abgedeckt werden. Aufgrund der hohen Viskosität war allerdings im Falle von hochmolekularen HA (HHAPA) Produkt-Lösungen (HHAPA + LHASH) die Handhabbarkeit auf 5.0 wt.-% beschränkt. Die Verwendung der gleichen HA Thiol-Komponenten (LHASH) ermöglichte Hybrid-Hydrogele, mit HA und GelAGE, mit reinen HA-Hydrogelen zu vergleichen. Obwohl der Polymeranteil von HHAPA + LHASH Hydrogelen signifikant geringer war, als im Vergleich zu Hybrid-Hydrogelen (GelAGE + LHASH), wurden für gleiche En:SH Verhältnisse ähnliche mechanische und physikochemische Eigenschaften reiner HA-Hydrogele bestimmt. Aufgrund der geringen Viskosität niedermolekularer HA Lösungen (LHAPA + LHASH) konnten diese nicht für den Extrusions-basierten Druck verwendet werden. Das nicht temperaturabhängige HHAPA + LHASH System hingegen konnte mit nur einem Viertel des Polymeranteils der Hybrid Formulierungen gedruckt werden. Im Vergleich zu der Hybrid Bio-Tinte wurde angenommen, dass das hoch viskose Verhalten von HHAPA + LHASH Lösungen, der geringere Polymeranteil, der geringere Druck für das Drucken und eine demzufolge geringere Scherspannung, maßgeblich zu der hohen Zellviabilität in Extrusions-basiert-biogedruckten Konstrukten beisteuerten.
Die niedrigmolekulare HA Formulierung (LHAPA + LHASH) konnte zwar nicht für den Extrusions-basierten Druck verwendet werden, allerdings besitzt dieses System Potential für andere additive Fertigungstechniken wie z.B. der Stereolithographie. Um dieses System weiterzuentwickeln wäre, analog zu dem GelAGE System, eine detailliertere Studie zu den Funktionen eingekapselter Zellen hilfreich. Außerdem sollte die Initiierung dieses Systems mit dem Vis-Initiator untersucht werden.
N2  - Aim of this thesis was the development of functionalizable hydrogel coatings for melt electrowritten PCL scaffolds and of bioprintable hydrogels for biofabrication.
Hydrogel coatings of melt electrowritten scaffolds enabled to control the surface hydrophilicity, thereby allowing cell-material interaction studies of biofunctionalized scaffolds in minimal protein adhesive environments. For this purpose, a hydrophilic star- shaped crosslinkable polymer was used and the coating conditions were optimized. Moreover, newly developed photosensitive scaffolds facilitated a time and pH independent biofunctionalization.
Bioprintable hydrogels for biofabrication were based on the allyl-functionalization of gelatin (GelAGE) and modified hyaluronic acid-products, to enable hydrogel crosslinking by means of the thiol-ene click chemistry. Optimization of GelAGE hydrogel properties was achieved through an in-depth analysis of the synthesis parameters, varying Ene:SH ratios, different crosslinking molecules and photoinitiators. Homogeneity of thiol-ene crosslinked networks was compared to free radical polymerized hydrogels and the applicability of GelAGE as bioink for extrusion-based bioprinting was investigated. Purely hyaluronic acid-based bioinks were hypothesized to maintain mechanical- and rheological properties, cell viabilities and the processability, upon further decreasing the overall hydrogel polymer and thiol content.

Hydrogel coatings: Highly structured PCL scaffolds were fabricated with MEW and subjected to coatings with six-armed star-shaped crosslinkable polymers (sP(EO-stat-PO)). Crosslinking results from the aqueous induced hydrolysis of reactive isocyanate groups (NCO) of sP(EO-stat-PO) and increased the surface hydrophilicity and provided a platform for biofunctionalizations in minimal protein adhesive environments. Not only the coating procedure was optimized with respect to sP(EO-stat-PO) concentrations and coating durations, instead scaffold pre-treatments were developed, which were fundamental to enhance the final hydrophilicity to completely avoid unspecific protein adsorption on sP(EO-stat-PO) coated scaffolds. The sP(EO-stat-PO) layer thickness of around 100 nm generally allows in vitro studies not only in dependence on the scaffold biofunctionalization but also on the scaffold architecture. The hydrogel coating extent was assessed via an indirect quantification of the NCO-hydrolysis products. Knowledge of NCO-hydrolysis kinetics enabled to achieve a balance of sufficiently coated scaffolds while maintaining the presence of NCO-groups that were exploited for subsequent biofunctionalizations. However, this time and pH dependent biofunctionalization was restricted to small biomolecules. In order to overcome this limitation and to couple high molecular weight biomolecules another reaction route was developed. This route was based on the photolysis of diazirine moieties and enabled a time and pH independent scaffold biofunctionalization with streptavidin and collagen type I. The fibril formation ability of collagen was used to obtain different collagen conformations on the scaffolds and a preliminary in vitro study demonstrated the applicability to investigate cell-material interactions.
The herein developed scaffolds could be applied to gain deeper insights into the fundamentals of cellular sensing. Especially the complexity by which cells sense e.g. collagen remain to be further elucidated. Therefore, different hierarchies of collagen-like conformations could be coupled to the scaffolds, e.g. gelatin or collagen-derived peptide sequences, and the activation of DDR receptors in dependence on the complexity of the coupled substances could be determined. Due to the strong streptavidin-biotin bond, streptavidin functionalized scaffolds could be applied as a versatile platform to allow immobilization of any biotinylated molecules.

Gelatin-based bioinks: First the GelAGE products were synthesized with respect to molecular weight distributions and amino acid composition integrity. A detailed study was conducted with varying molar ratios of reactants and synthesis durations and implied that gelatin degradation was most dominant for high alkaline synthesis conditions with long reaction times. Gelatin possesses multiple functionalizable groups and the predominant functionalization of amine groups was confirmed via different model substances and analyses. Polymer network homogeneity was proven for the GelAGE system compared to free radical polymerized hydrogels with GelMA. A detailed analysis of hydrogel compositions with varying functional group ratios and UV- or Vis-light photoinitiators was executed. The UV-initiator concentration is restricted due to cytotoxicity and potential cellular DNA damages upon UV-irradiation, whereas the more cytocompatible Vis- initiator system enabled mechanical stiffness tuning over a wide range by controlling the photoinitiator concentration at constant Ene:SH ratios and polymer weight percentages. Versatility of the GelAGE bioink for different AM techniques was proved by exploiting the thermo-gelling behavior of differently degraded GelAGE products for stereolithography and extrusion-based printing. Moreover, the viability of cell-laden GelAGE constructs was demonstrated for extrusion-based bioprinting. By applying different multifunctional thiol-macromolecular crosslinkers the mechanical and rheological properties improved concurrently to the processability. Importantly, lower thiol-crosslinker concentrations were required to yield superior mechanical strengths and physico-chemical properties of the hydrogels as compared to the small bis-thiol-crosslinker. Extrusion-based bioprinting with distinct encapsulated cells underlined the need for individual optimization of cell-laden hydrogel formulations.
Not only the viability of encapsulated cells in extrusion-based bioprinted constructs should be assessed, instead other parameters such as cell morphology or production of collagen or glycosaminoglycans should be considered as these represent some of the crucial prerequisites for cartilage Tissue Engineering applications. Moreover, these studies should be expanded to the stereolithographic approach and ultimately the versatility and cytocompatibility of formulations with macromolecular crosslinkers would be of interest. Macromolecular crosslinkers allowed reducing polymer weight percentages and amounts of thiol groups and are thus expected to contribute to increased cytocompatibility, especially in combination with the more cytocompatible Vis-initiator system, which remains to be elucidated.

Hyaluronic acid-based bioinks: Different molecular weight hyaluronic acid (HA) products were synthesized to bear ene- (HAPA) or thiol-functionalities (LHASH) to enable pure HA thiol-ene crosslinked hydrogels. Depending on the molecular weight of modified HA products, polymer weight percentages and Ene:SH ratios, a wide range of mechanical stiffness was covered. However, the manageability of high molecular weight HA (HHAPA) product solutions (HHAPA + LHASH) was restricted to 5.0 wt.-% as a consequence of the high viscosity. Based on the same HA thiol component (LHASH), hybrid hydrogels of HA with GelAGE were compared to pure HA hydrogels. Although the overall polymer weight percentage of HHAPA + LHASH hydrogels was significantly lowered compared to hybrid hydrogels (GelAGE + LHASH), similar mechanical and physico-chemical properties of pure HA hydrogels were determined with maintained Ene:SH ratios. Low viscous low molecular weight HA precursor solutions (LHAPA + LHASH) prevented the applicability for extrusion-based bioprinting, whereas the non-thermoresponsive HHAPA + LHASH system could be bioprinted with only one-fourth of the polymer content of hybrid formulations. The high viscous behavior of HHAPA + LHASH solutions, lower polymer weight percentages, decreased printing pressures and consequently declined shear stress during printing, were hypothesized to contribute to high cell viabilities in extrusion-based bioprinted constructs compared to the hybrid bioink.
The low molecular weight HA precursor formulation (LHAPA + LHASH) was not applicable for extrusion-based printing, but this system has potential for other AM techniques such as stereolithography. Similar to the GelAGE system a more detailed study on the functions of encapsulated cells would be useful to further develop this system. Moreover, the initiation with the Vis-initiator should be conducted.
KW  - Biomaterial
KW  - Bioink
KW  - hydrogel
KW  - biofabrication
KW  - Hydrogel
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174225
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pinzner, Florian
T1  - Vicinal and Double Chemoselective Biofunctionalization of Polyoxazolines
T1  - Vicinale und doppelt chemoselektive Biofunktionalisierung von Polyoxazolinen
N2  - In this work, a toolbox was provided to create three-component polymer conjugates with a defined architecture, designed to bear different biocomponents that can interact with larger biological systems in biomacromolecular recognition experiments. The target architecture is the attachment of two biomolecule ‘arms’ to the alpha telechelic end point of a polymer and fixating the conjugate to the gold surface of SAW and SPR sensor chips with the polymer’s other omega chain end. This specific design of a conjugate will be implemented by using a strategy to yield novel double alpha as well as omega telechelic functionalized POx and the success of all cascade reaction steps leading to the final conjugation product will be proven through affinity measurements between covalently bound mannose and ConA. All reactions were performed on a low molecular model level first and then transferred to telechelic and also side chain functionalized polymer systems.
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurden hydrophile Polymere und Biomakromoleküle chemoselektiv und vicinal miteinander an einer Bindungsstelle verknüpft. Die Kombination der Native Chemical Ligation (NCL) mit der Thiol–En-Reaktion stellte hierfür eine geeignete Methode dar. Ein Machbarkeitsbeweis wurde anhand einer niedermolekularen Modellreaktion erbracht und nachfolgend unter der Verwendung von Polyoxazolinen auf makromolekulare Polymersysteme übertragen. Die erfolgreiche Darstellung der Konjugate wurde durch biomakromolekulare Bindungsaffinitäts-Messungen zu dem Lektin ConA bestätigt.
KW  - Polyoxazoline
KW  - Polyoxazolines
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229758
ER  - 
TY  - THES
A1  - Maier, Jonathan
T1  - Biotinylierung und Drug-Target-Untersuchungen von Dioncochinon B sowie Entwicklung einer Syntheseroute zu 7,8'-gekuppelten Naphthylisochinolin-Alkaloiden
T1  - Biotinylation and Drug-Target Investigations of Dioncoquinone B and Development of a Synthetic Approach to 7,8'-coupled Naphthylisoquinoline Alkaloids
N2  - In Deutschland starben im Jahr 2016 knapp 6 000 Menschen an den Folgen des Multiplen Myeloms. Die Zahl der Todesopfer dieser Krebsart ist in den letzten 16 Jahren um ca. 20% gestiegen. Da das Multiple Myelom mit einem Durchschnittsalter von 73 Jahren bei Erstdiagnose zu den Erkrankungen des höheren Lebensalters zählt, ist der Anstieg der Inzidenz und Todesfälle am ehesten auf eine höhere Lebenserwartung der Menschen durch umfassende medizinische Versorgung zurückzuführen. Auch die Behandlungsmöglichkeiten des Multiplen Myeloms wurden in den letzten zwei Jahrzehnten kontinuierlich verbessert und bieten in Form von medikamentösen Therapien für alle Erkrankten und Knochenmarktransplantationen speziell für Patienten unter 70 Jahren die Chance auf eine Verlängerung der beschwerdefreien Krankheitsphase. Nach wie vor verläuft das Multiple Myelom jedoch tödlich, sodass die Erforschung und Entwicklung neuer potenter Wirkstoffe zur Verbesserung der Prognose oder zur vollständigen Heilung essentiell ist.
Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Biotinylierung von Dioncochinon B, einem natürlich vorkommenden Naphthochinon, erstmals isoliert aus Kallus-Kulturen von T. peltatum, das eine gute Aktivität (IC50 = 11 µM) gegen Zellen des Multiplen Myeloms aufweist. Der Affinitätsmarker Biotin sollte dabei über einen kurzen Linker an die 7- oder 8-Position des Naturstoffs angebracht werden. Nach der Etablierung einer geeigneten Syntheseroute sollten nanoLC-MS/MS-Analysen Aufschluss über mögliche Wirkstoff-Target-Interaktionen liefern. 
Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Synthese von 7,8'-gekuppelten Naphthylisochinolin-Alkaloiden im Allgemeinen und von Yaoundamin A und dessen M-Atropisomer im Speziellen untersucht. 
Die Naturstoffklasse der Naphthylisochinolin-Alkaloide ist neben ihrer strukturellen Vielfalt vor allem wegen ihrer Aktivitäten gegen eine Vielzahl an Erregern von Infektionskrankheiten, wie z. B. der Malaria, der Afrikanischen Schlafkrankheit oder der Leishmaniose interessant. Strukturell sind Naphthylisochinolin-Alkaloide unter anderem durch eine meist rotationsgehinderte Biaryl-Achse gekennzeichnet. Der synthetische Aufbau dieser Verbindungsachse zwischen Naphthalin- und Isochinolin-Baustein war in der Literatur bereits ausführlich behandelt worden. Da die Darstellung eines 7,8'-verknüpften Naphthyldihydroisochinolin-Alkaloids allerdings noch nie beschrieben worden war, war das Ziel dieser Arbeit die erste Totalsynthese eines Naturstoffs dieses Typs.
N2  - In Germany, nearly 6 000 people died as a result of the disease multiple myeloma in 2016. During the past 16 years, the number of deaths of this type of cancer has risen by about 20%. Since multiple myeloma, with an average age of 73 years at first diagnosis, is one of the diseases of older age, the increase in incidence and mortality is most likely due to an enhanced life expectancy of the people through comprehensive medical care. Multiple myeloma treatment options have also been improved continuously over the past two decades and offer the chance for prolonging the symptom-free disease phase in the form of drug therapies for all patients and bone marrow transplants especially for patients under the age of 70 years. However, multiple myeloma continues to be deadly, so the research and development of new potent drugs is essential for the improvement of prognosis or complete recovery.
The aim of this current work was the biotinylation of dioncoquinone B, a naturally occurring naphthoquinone, first isolated from callus cultures of T. peltatum, which exhibits a good activity against cells of multiple myeloma (IC50 = 11 µM). The affinity tag biotin was planned to be attached to the 7- or 8-position of the natural product using a short linker. Following the establishment of an appropriate synthetic route, subsequent nanoLC-MS/MS-analysis should yield possible drug-target interactions.
Furthermore, the synthesis of 7,8'-coupled naphthylisoquinoline alkaloids in general and of yaoundamine A and its M-atropisomer in particular was investigated. 
Besides its structural variety this class of natural products of naphthylisoquinoline alkaloids is especially known for its activities against a broad range of pathogens of infectious diseases, like e.g. malaria, African sleeping sickness or leishmaniosis. Among others, naphthylisoquinoline alkaloids are structurally characterized by a biaryl axis, which is often rotationally hindered. In the literature the synthetic approach to this axis between the naphthalene-portion and the isoquinoline moiety has already been dealt with extensively. However, since the synthesis of a 7,8'-coupled naphthyldihydroisoquinoline alkaloid had never been described before, the defined goal of this work was the first total synthesis of a natural product of this type.
KW  - Naphthochinone
KW  - Naphthylisochinolin-Alkaloide
KW  - Dioncochinon B
KW  - Yaoundamin A
KW  - Multiples Myelom
KW  - Malaria
KW  - Biotinylierung
KW  - Dioncoquinone B
KW  - Yaoundamine A
KW  - Multiple Myeloma
KW  - Malaria
KW  - Biotinylation
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187792
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TY  - THES
A1  - Gutmann, Marcus
T1  - Functionalization of cells, extracellular matrix components and proteins for therapeutic application
T1  - Funktionalisierung von Zellen, extrazellulären Matrixbestandteilen und Proteinen für die therapeutische Anwendung
N2  - Glycosylation is a biochemical process leading to the formation of glycoconjugates by linking glycans (carbohydrates) to proteins, lipids and various small molecules. The glycans are formed by one or more monosaccharides that are covalently attached, thus offering a broad variety depending on their composition, site of glycan linkage, length and ramification. This special nature provides an exceptional and fine tunable possibility in fields of information transfer, recognition, stability and pharmacokinetic. Due to their intra- and extracellular omnipresence, glycans fulfill an essential role in the regulation of different endogenous processes (e.g. hormone action, immune surveillance, inflammatory response) and act as a key element for maintenance of homeostasis. The strategy of metabolic glycoengineering enables the integration of structural similar but chemically modified monosaccharide building blocks into the natural given glycosylation pathways, thereby anchoring them in the carbohydrate architecture of de novo synthesized glycoconjugates. The available unnatural sugar molecules which are similar to endogenous sugar molecules show minimal perturbation in cell function and - based on their multitude functional groups - offer the potential of side directed coupling with a target substance/structure as well as the development of new biological properties. The chemical-enzymatic strategy of glycoengineering provides a valuable complement to genetic approaches.
This thesis primarily focuses on potential fields of application for glycoengineering and its further use in clinic and research. The last section of this work outlines a genetic approach, using special Escherichia coli systems, to integrate chemically tunable amino acids into the biosynthetic pathway of proteins, enabling specific and site-directed coupling with target substances. With the genetic information of the methanogen archaea, Methanosarcina barkeri, the E. coli. system is able to insert a further amino acid, the pyrrolysine, at the ribosomal site during translation of the protein. The natural stop-codon UAG (amber codon) is used for this newly obtained proteinogenic amino acid.

Chapter I describes two systems for the integration of chemically tunable monosaccharides and presents methods for characterizing these systems. Moreover, it gives a general overview of the structure as well as intended use of glycans and illustrates different glycosylation pathways. Furthermore, the strategy of metabolic glycoengineering is demonstrated. In this context, the structure of basic building blocks and the epimerization of monosaccharides during their metabolic fate are discussed.

Chapter II translates the concept of metabolic glycoengineering to the extracellular network produced by fibroblasts. The incorporation of chemically modified sugar components in the matrix provides an innovative, elegant and biocompatible method for site-directed coupling of target substances. Resident cells, which are involved in the de novo synthesis of matrices, as well as isolated matrices were characterized and compared to unmodified resident cells and matrices.  The natural capacity of the matrix can be extended by metabolic glycoengineering and enables the selective immobilization of a variety of therapeutic substances by combining enzymatic and bioorthogonal reaction strategies. This approach expands the natural ability of extracellular matrix (ECM), like the storage of specific growth factors and the recruitment of surface receptors along with synergistic effects of bound substances. By the selection of the cell type, the production of a wide range of different matrices is possible.

Chapter III focuses on the target-oriented modification of cell surface membranes of living fibroblast and human embryonic kidney cells. Chemically modified monosaccharides are inserted by means of metabolic glycoengineering and are then presented on the cell surface. These monosaccharides can later be covalently coupled, by “strain promoted azide-alkyne cycloaddition“ (SPAAC) and/or “copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“ (CuAAC), to the target substance. Due to the toxicity of the copper catalysator in the CuAAC, cytotoxicity analyses were conducted to determine the in vivo tolerable range for the use of CuAAC on living cell systems. Finally, the efficacy of both bioorthogonal reactions was compared.

Chapter IV outlines two versatile carrier – spacer – payload delivery systems based on an enzymatic cleavable linker, triggered by disease associated protease. In the selection of carrier systems (i) polyethylene glycol (PEG), a well-studied, Food and Drug Administration approved substance and very common tool to increase the pharmacokinetic properties of therapeutic agents, was chosen as a carrier for non-targeting systems and (ii) Revacept, a human glycoprotein VI antibody, was chosen as a carrier for targeting systems. The protease sensitive cleavable linker was genetically inserted into the N-terminal region of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) without jeopardizing protein activity. By exchanging the protease sensitive sequence or the therapeutic payload, both systems represent a promising and adaptable approach for establishing therapeutic systems with bioresponsive release, tailored to pre-existing conditions.

In summary, by site-specific functionalization of various delivery platforms, this thesis establishes an essential cornerstone for promising strategies advancing clinical application. The outlined platforms ensure high flexibility due to exchanging single or multiple elements of the system, individually tailoring them to the respective disease or target site.
N2  - Glykosylierung beschreibt einen auf biochemischen Reaktionen basierenden Prozess, welcher durch die Verknüpfung von Glykanen (Kohlenhydraten) mit Proteinen, Lipiden oder einer Vielzahl kleiner organischer Moleküle zur Bildung von Glykokonjugaten führt. Die Entstehung der Kohlenhydratketten erfolgt hierbei durch die kovalente Verknüpfung eines oder mehrerer verschiedener Einfachzucker, welche auf Grund unterschiedlicher Zusammensetzung der Bausteine, Verknüpfungsregion, Länge und Verzweigung eine hohe Diversität aufweisen. Diese Besonderheit ermöglicht eine außergewöhnliche Feinabstimmung im Bereich der Informationsübertragung, Erkennung, Stabilität und Pharmakokinetik. Aufgrund ihrer intra- und extrazellulären Omnipräsenz spielen Glykane zudem eine essentielle Rolle in der Regulierung verschiedenster körpereigener Prozesse (z.B. hormonelle Wirkung, Immunmodulation, Entzündungsreaktionen) und sind folglich ein zentraler Bestandteil bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Durch die Strategie des „Glycoengineering“ ist man in der Lage, strukturähnliche, aber chemisch modifizierte Zuckerbausteine in die natürlichen Glykosilierungswege einzubinden und diese somit in der Architektur der Kohlenstoffketten von neu-synthetisierten Glykokonjugaten zu verankern. Die hierfür zur Verfügung stehenden, unnatürlichen Zuckermoleküle führen auf Grund ihrer Ähnlichkeit zu körpereigenen Zuckern zu kaum relevanten Störungen der zellulären Funktion, bieten aber durch zahlreiche funktionelle Gruppen die Möglichkeit der gezielten Verknüpfung mit einer Zielsubstanz/-struktur und der Bildung neuer biologischer Eigenschaften. „Glycoengineering“ als chemisch-enzymatische Strategie bietet dabei eine wertvolle Ergänzung zu gentechnischen Ansätzen. 
Entsprechend beschäftigt sich diese Dissertation primär mit der Beschreibung potentieller Anwendungsgebiete des „Glycoengineering“ und dessen möglichen Einsatz in Klinik und Forschung. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt einen gentechnischen Ansatz, bei dem mit Hilfe von speziellen Escherichia coli Systemen chemisch modifizierbare Aminosäuren in den Biosyntheseweg von Proteinen eingebunden werden, wodurch anschließend eine spezifische und gerichtete Verknüpfung mit Zielsubstanzen ermöglicht wird. Hierbei benutzt das E. coli-System die genetische Information des methanbildenden Archaeas, Methanosarcina barkeri, mit der es in der Lage ist, eine weitere Aminosäure, das Pyrrolysin, bei der Translation eines Proteins am Ribosom einzufügen. Als Codon für diese neu gewonnene proteinogene Aminosäure fungiert das natürliche Stopp-Codon („amber codon“) UAG.

Kapitel I beschreibt zwei Systeme für den Einbau von chemisch modifizierten Zuckern und zeigt Methoden für die Charakterisierung dieser Systeme auf. Es gibt zudem eine allgemeine Übersicht über den Aufbau und die Verwendung von Glykanen und veranschaulicht verschiedene Glykosilierungswege. Des Weiteren wird auch die Strategie des „metabolic glycoengineering“ erläutert. Hierbei wird der Aufbau der dabei verwendeten Grundbausteine dargestellt und auf die Epimerisierung der Zucker während deren Metabolismus eingegangen.

Kapitel II überträgt das Konzept des „metabolic glycoengineering“ auf das extrazelluläre Netzwerk von Fibroblasten. Hierbei bietet der Einbau eines chemisch modifizierten Zuckerbausteins in die Matrix eine neue, elegante und biokompatible Möglichkeit der gezielten Verknüpfung von Zielsubstanzen. Die an der Neusynthese der Matrix beteiligten Bindegewebszellen sowie die isolierte Matrix wurden dabei im Vergleich zu nicht modifizierten Bindegewebszellen und Matrices charakterisiert. Durch den Aspekt des “metabolic glycoengineering” wird die natürliche Fähigkeit der Matrix erweitert und ermöglicht durch die Kombination verschiedener enzymatischer und bioorthogonal-chemischer Strategien die selektive Immobilisation einer Vielzahl von therapeutischen Substanzen. Dieser Ansatz erweitert das natürliche Spektrum der Extrazellulärmatrix (ECM), wie Bindung von spezifischen Wachstumsfaktoren, Rekrutierung von Oberflächenrezeptoren und damit einhergehend synergistische Effekte der gebundenen Stoffe. Durch die Auswahl des Zelltyps wird zudem ein breites Spektrum an verschiedenen Matrices ermöglicht.

Kapitel III befasst sich mit der Möglichkeit, die Zellmembran von lebenden Fibroblasten sowie menschliche embryonale Nierenzellen gezielt zu verändern. Durch „metabolic glycoengineering“ werden auch hier chemisch modifizierte Zuckerbausteine eingefügt, die dabei auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Anschließend können diese Zucker mittels „ringspannungs-geförderter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“strain promoted azide-alkyne cycloaddition“, SPAAC) und „Kupfer(I)-katalysierter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“, CuAAC) umgesetzt werden, was eine kovalente Verknüpfung mit einer Zielsubstanz ermöglicht. Aufgrund der Toxizität des Kupferkatalysators in der CuAAC wurde anhand von zytotoxischen Untersuchungen nach einem in vivo vertretbaren Bereich für diese Reaktion gesucht, um die CuAAC auch für lebende Systeme verwendbar zu machen. Zuletzt wurde die Effizienz dieser bioorthogonalen Reaktionen miteinander verglichen.

Kapitel IV beschreibt zwei vielseitig einsetzbare „carrier – spacer – payload“ Therapiesysteme (Träger-Verbindungsstück-Therapeutikum-Systeme), basierend auf einem Verbindungsstück (Linker), dessen Spaltung enzymatisch durch krankheitsspezifisch prävalente Proteasen ausgelöst wird. Bei der Auswahl der Trägersysteme wurde für das nicht-zielgerichtete System Polyethylenglycol (PEG) als Träger eingesetzt, eine gut untersuchte, „Food and Drug Administration“ zugelassene Substanz, welche als sehr gängiges Mittel zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften verwendet wird. Für das zielgerichtete System diente Revacept als Träger, ein humaner Glykoprotein VI-Antikörper. Der Protease-sensitive Linker wurde genetisch in der N-terminalen Region des Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 verankert, ohne dabei die Bioaktivität zu gefährden. Durch den Austausch der Protease-sensitiven Erkennungssequenz oder des Therapeutikums stellen beide Systeme einen vielversprechenden und anpassungsfähigen Ansatz für therapeutische Systeme dar, welche auf ein bereits bestehendes Erkrankungsbild genau zugeschnitten werden können.

Zusammengefasst setzt diese Arbeit durch eine spezifische Funktionalisierung von verschiedenen Therapiesysteme einen wichtigen Meilenstein für vielversprechende Strategien zur Verbesserung der klinischen Anwendbarkeit. Durch den Austausch einer oder mehrerer Komponenten des Systems gewährleisten die hier beschriebenen Therapiesysteme eine hohe Anpassungsfähigkeit, wodurch sie individuell auf die jeweilige Krankheit oder den jeweiligen Zielort angepasst werden können.
KW  - Glykosylierung
KW  - Extrazelluläre Matrix
KW  - Zelloberfläche
KW  - Antikörper
KW  - Fibroblastenwachstumsfaktor
KW  - Glycoengineering
KW  - Drug delivery platforms
KW  - Protease-sensitive release
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170602
ER  - 
TY  - THES
A1  - Letschert, Sebastian
T1  - Quantitative Analysis of Membrane Components using Super-Resolution Microscopy
T1  - Quantitative Analyse von Membrankomponenten mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie
N2  - The plasma membrane is one of the most thoroughly studied and at the same time most complex, diverse, and least understood cellular structures. Its function is determined by the molecular composition as well as the spatial arrangement of its components. Even after decades of extensive membrane research and the proposal of dozens of models and theories, the structural organization of plasma membranes remains largely unknown. Modern imaging tools such as super-resolution fluorescence microscopy are one of the most efficient techniques in life sciences and are widely used to study the spatial arrangement and quantitative behavior of biomolecules in fixed and living cells. In this work, direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) was used to investigate the structural distribution of mem-brane components with virtually molecular resolution. Key issues are different preparation and staining strategies for membrane imaging as well as localization-based quantitative analyses of membrane molecules.  
An essential precondition for the spatial and quantitative analysis of membrane components is the prevention of photoswitching artifacts in reconstructed localization microscopy images. Therefore, the impact of irradiation intensity, label density and photoswitching behavior on the distribution of plasma membrane and mitochondrial membrane proteins in dSTORM images was investigated. It is demonstrated that the combination of densely labeled plasma membranes and inappropriate photoswitching rates induces artificial membrane clusters. Moreover, inhomogeneous localization distributions induced by projections of three-dimensional membrane structures such as microvilli and vesicles are prone to generate artifacts in images of biological membranes. Alternative imaging techniques and ways to prevent artifacts in single-molecule localization microscopy are presented and extensively discussed.
Another central topic addresses the spatial organization of glycosylated components covering the cell membrane. It is shown that a bioorthogonal chemical reporter system consisting of modified monosaccharide precursors and organic fluorophores can be used for specific labeling of membrane-associated glycoproteins and –lipids. The distribution of glycans was visualized by dSTORM showing a homogeneous molecule distribution on different mammalian cell lines without the presence of clusters. An absolute number of around five million glycans per cell was estimated and the results show that the combination of metabolic labeling, click chemistry, and single-molecule localization microscopy can be efficiently used to study cell surface glycoconjugates.
In a third project, dSTORM was performed to investigate low-expressing receptors on cancer cells which can act as targets in personalized immunotherapy. Primary multiple myeloma cells derived from the bone marrow of several patients were analyzed for CD19 expression as potential target for chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells. Depending on the patient, 60–1,600 CD19 molecules per cell were quantified and functional in vitro tests demonstrate that the threshold for CD19 CAR T recognition is below 100 CD19 molecules per target cell. Results are compared with flow cytometry data, and the important roles of efficient labeling and appropriate control experiments are discussed.
N2  - Die Plasmamembran gehört zu den am meisten untersuchten, gleichzeitig aber auch zu den komplexesten, vielfältigsten und am wenigsten verstandenen biologischen Strukturen. Ihre Funktion wird nicht nur durch die molekulare Zusammensetzung bestimmt, sondern auch durch die räumliche Anordnung ihrer Bestandteile. Selbst nach Jahrzehnten intensiver Forschung und der Veröffentlichung dutzender Membranmodelle und Theorien bleibt die genaue strukturelle Organisation der Plasmamembran ein Rätsel. Moderne Bildgebungsverfahren wie etwa die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie gehören mittlerweile zu den effizientesten Techniken der Lebenswissenschaften und werden immer öfter verwendet, um die räumliche Anordnung als auch die Anzahl von Biomolekülen in fixierten und lebenden Zellen zu studieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die hochauflösende Mikroskopie-Methode dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) angewendet, um die räumliche Verteilung von Membranmolekülen mit annähernd molekularer Auflösung zu untersuchen. Schwerpunkte dieser Arbeit sind dabei verschiedene Präparations- und Färbemethoden für die mikroskopische Untersuchung von Zellmembranen sowie lokalisationsbasierte quantitative Analysemethoden von Membranmolekülen. 
Eine Voraussetzung für die räumliche als auch quantitative Analyse von Membranmolekülen ist die Vermeidung von Photoschalt-Artefakten in rekonstruierten Lokalisationsmikroskopie-Bildern. Um dies genauer zu demonstrieren, wurden die Auswirkungen von Anregungsintensität, Markierungsdichte und verändertem Photoschalten auf die räumliche Verteilung von Proteinen der Plasma- und Mitochondrienmembran in dSTORM-Bildern analysiert. Es wird gezeigt, dass eine dicht markierte Plasmamembran in Kombination mit ungeeigneten Photoschaltraten zu artifiziellen Clustern in der Membran führt. Es sind vor Allem oft die Projektionen dreidimensionaler Membranstrukturen wie etwa Mikrovilli und Vesikel dafür verantwortlich, dass lokale Unterschiede in der Lokalisationsdichte entstehen, wodurch unter Umständen Bildartefakte generiert werden können. Darüber hinaus werden alternative Mikroskopie-Methoden und Möglichkeiten, Artefakte in Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-Bildern zu verhindern, präsentiert und ausführlich diskutiert. 
Ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit ist die räumliche Anordnung von glykosylierten Membranmolekülen. Es wird demonstriert, wie ein bioorthogonales chemisches Reportersystem bestehend aus modifizierten Monosacchariden und organischen Fluorophoren für die spezifische Markierung von Membran-assoziierten Glykoproteinen und –lipiden eingesetzt werden kann. Mittels dSTORM wird gezeigt, dass die Verteilung von Glykanen in der Plasmamembran unterschiedlicher Zelllinien homogen und frei von Clustern ist. Des Weiteren zeigt eine quantitative Analyse, dass sich in etwa fünf Millionen Glykane auf einer einzigen Zelle befinden. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die Kombination aus metabolisch markierten Zielmolekülen, Click-Chemie und Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie effizient genutzt werden kann, um Glykokonjugate auf Zelloberflächen zu untersuchen. 
In einem dritten Projekt wurde dSTORM zur Untersuchung von Rezeptormolekülen auf Krebszellen verwendet. Die Expression dieser Oberflächenproteine ist so gering, dass sich nur wenige Moleküle auf einer Zelle befinden, die jedoch als Zielmoleküle in der personalisierten Immuntherapie dienen könnten. Dafür wurden primäre Tumorzellen aus dem Knochenmark von Patienten, die am Multiplen Myelom erkrankt sind, auf die Expression des CD19-Oberflächenproteins als potentielles Ziel für CAR-modifizierte T-Zellen (chimeric antigen receptor) untersucht. Es wird gezeigt, dass sich, abhängig vom untersuchten Patienten, auf einer Zelle 60 bis 1600 CD19-Moleküle befinden. Funktionale in-vitro-Experimente demonstrieren, dass weniger als 100 CD19 Moleküle ausreichen, um CD19-CAR-T-Zellen zu aktivieren. Diese Ergebnisse werden mit Durchflusszytometrie-Daten verglichen und die wichtige Rolle von Lebendzellfärbung und geeigneten Kontrollexperimenten wird diskutiert.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Quantifizierung
KW  - Polysaccharide
KW  - Immuntherapie
KW  - Antigen CD19
KW  - super-resolution fluorescence microscopy
KW  - dSTORM
KW  - click chemistry
KW  - plasma membrane organization
KW  - localization microscopy
KW  - artifacts
KW  - Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Plasmamembranorganisation
KW  - Click Chemie
KW  - Glykane
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162139
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kraus, Michael
T1  - The Conversion of Bifidobacterium adolescentis Sucrose Phosphorylase into a Polyphenol Transglucosidase via Structure-based Enzyme Engineering
T1  - Umwandlung einer Sacharose Phosphorylase in eine Polyphenol Transglukosidase durch strukturbasiertes Enzyme Engineering
N2  - The initial goal was the conversion of Bifidobacterium adolescentis Sucrose Phosphorylase (BaSP) into a polyphenol glucosidase by structure based enzyme engineering. BaSP was chosen because of its ability to utilize sucrose, an economically viable and sustainable donor substrate, and transfer the glucosyl moiety to various acceptor substrates. The introduction of aromatic residues into the active site was considered a viable way to render it more suitable for aromatic acceptor compounds by reducing its polarity and potentially introducing π-π-interactions with the polyphenols. An investigation of the active site revealed Gln345 as a suitable mutagenesis target. As a proof of concept BaSP Q345F was employed in the glycosylation of (+)-catechin, (-)-epicatechin and resveratrol. The variant was selective for the aromatic acceptor substrates and the glucose disaccharide side reaction was only observed after almost quantitative conversion of the aromatic substrates. A crystal structure of BaSP Q345F in complex with glucose was obtained and it displayed an unexpected shift of an entire domain by 3.3 Å. A crystal structure of BaSP D192N-Q345F, an inactive variant in complex with resveratrol-3-α-D-glucosid, the glucosylation product of resveratrol, synthesized by BaSP Q345F was solved. It proved that the domain shift is in fact responsible for the ability of the variant to glycosylate aromatic compounds. Simultaneously a ligand free crystal structure of BaSP Q345F disproved an induced fit effect as the cause of the domain shift. The missing link, a crystal structure of BaSP Q345F in the F-conformation is obtained. This does not feature the domain shift, but is in outstanding agreement with the wildtype structure. The domain shift is therefore not static but rather a step in a dynamic process. It is further conceivable that the domain shifted conformation of BaSP Q345F resembles the open conformation of the wild type and that an adjustment of a conformational equilibrium as a result of the Q345F point mutation is observed. An investigation into the background reaction, the formation of glucose-glucose disaccharides of BaSP Q345F and three further variants that addressed the same region (L341C, D316C-L341C and D316C-N340C) revealed the formation of nigerose by BaSP Q345F.
N2  - Saccharose Phosphorylase aus Bifidobacterium adolescentis (BaSP) sollte durch strukturbasiertes Enzym-Engineering in die Lage versetzt werden Polyphenole zu glukosylieren. In die katalytische Tasche sollten aromatische Seitenketten eingeführt werden um die Polarität an jene der gewünschten Akzeptorsubstrate anzupassen und eine weitere Stabilisierung durch π-π-Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat zu erlauben. BaSP Q345F war in der Lage die Zielsubstrate zu glukosylieren und behielt gleichzeitig ausreichen Aktivität bei. Die weitere Untersuchung dieses Enzyms ist in vier Studien beschrieben. Die Kristallstruktur einer inaktiven Variante, BaSP D192Q-Q345F in komplex mit dem Glukosylierungsprodukt Resveratrol-3-α-D-Glukosid wurde gelöst. Dadurch konnte gezeigt werden, dass einer Verschiebung einer Domäne für die Fähigkeit der Variante Glukose auf aromatische Substrate zu übertragen, verantwortlich ist. Die Orientierung des π-Systems von Resveratrol erlaubt weiterhin T-förmige π-π-Wechselwirkungen mit Phe156 und Phe345.Die detaillierte kinetische Untersuchung von BaSP Q345F mit acht Akzeptorsubstraten ergab eine starke Affinität der Variante zu den aromatischen Substraten (KM 0.08 bis 1.55 mM). Weitere Strukturdaten zeigen, dass die Verschiebung der Domäne Teil eines dynamischen Prozesses ist. Des weiteren ist die Q345F Variante in der Lage, den seltenen Zucker Nigerose zu synthetisisern.
KW  - enzyme engineering
KW  - sucrose phosphorylase
KW  - domain shift
KW  - resveratrol
KW  - quercetin
KW  - Phosphorylase
KW  - Glucosyltransferasen
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192477
ER  - 
TY  - THES
A1  - Weißenstein, Annike
T1  - Optische Chemosensoren aus Naphthalin- und Perylenbisimid-Farbstoffen
T1  - Optical Chemosensors from Naphthalene and Perylene Bisimide Dyes
N2  - Die Liste der interessanten nachzuweisenden Analyte ist lang. Deswegen besteht ein großer Bedarf zur Entwicklung neuer fluoreszierender und kolorimetrischer Chemosensoren. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Synthese und Charakterisierung neuer optischer bzw. fluoreszierender und kolorimetrischer Chemosensoren mit dem Fokus auf die beiden Substanzklassen der Naphthalinbisimide und Perylenbisimide.
Der erste Arbeitsschwerpunkt befasste sich mit wasserlöslichen Naphthalinbisimiden und ist in drei Unterkapitel aufgeteilt (Kapitel III – 1.1.-1.3., Abbildung 79). Im ersten Unterkapitel (Kapitel III – 1.1.) wurden die Synthesen und optischen Eigenschaften der am Kern Amino-substituierten NBIs 60a-h, mit Dicarbonsäureresten in Imid-Position und 61a-h, mit 2-Dimethylaminoethyl-Gruppen, in polaren Lösungsmitteln beschrieben. Die systematische Anbringung verschiedener Amino-Substituenten mit steigendem elektronenziehendem Charakter der Aminoreste diente der mechanistischen Aufklärung der optischen Eigenschaften. Eine vollständige Untersuchung der optischen Eigenschaften erfolgte in wässriger Pufferlösung bei pH 2.1 sowie in Methanol und Acetonitril. Der Einfluss der Imid-Substituenten auf die optischen Eigenschaften war wie zu erwarten gering. Die verschiedenen Kern-Substituenten verursachten hingegen eine hypsochrome Verschiebung der Absorptions- und Fluoreszenzmaxima mit steigendem elektronenziehendem Charakter der an der Aminogruppe angebrachten Reste. Ein unerwarteter Trend konnte im Fall der Fluoreszenzquantenausbeute beobachtet werden. In den protischen Lösungsmitteln Wasser und Methanol wurde eine lineare Abhängigkeit gegenüber der Hammett-σmeta-Konstante ermittelt. Mit steigendem elektronenziehendem Charakter der Kern-Amino-Substituenten erfuhr die Quantenausbeute einen Anstieg auf bis zu 39% in Wasser für NBI  60h, 61h und 45% in Methanol für 60h. Die Tatsache, dass in Acetonitril keine solche Abhängigkeit gegenüber der Hammett-Konstante beobachtet werden konnte legte eine intermolekulare Wasserstoffbrücken-Bindung im angeregten Zustand als konkurrierenden Prozess zur Fluoreszenz nahe. Dieser Prozess tritt zwischen den Lösungsmittel-Molekülen und der Akzeptorgruppe (Carbonyl-Sauerstoff) der NBIs, welcher einen strahlungslosen Relaxationsprozess bzw. Fluoreszenzlöschung zur Folge hat, auf. Der Einfluss dieses Prozesses lässt sich durch die Stärke des elektronenziehenden Amino-Substituentens steuern. Die NBIs 60a-h zeigten zudem in potentiometrischen Titrationen in Wasser eine pH-Unabhängigkeit der optischen Eigenschaften bezüglich des Imid-Substituentens. Dies macht die NBIs mit Dicarbonsäureresten für die Anwendung in biologischen Systemen im neutralen pH-Milieu oder als chemische Sensoren besonders geeignet. 
Aufgrund dieser interessanten Befunde wurde im zweiten Unterkapitel (Kapitel III – 1.2.) das dihalogenierte NBI 58 hinsichtlich der Sensoreigenschaften gegenüber primären, sekundären und tertiären Amin- bzw. Diamindampf sowie zur Frischekontrolle von Fleisch untersucht. Die Absorptions- und Fluoreszenz-spektroskopische Untersuchung des Dünnschichtfilms von NBI 58 zeigte die erfolgreiche, selektive Detektion von primären Aminen und Diaminen bzw. biogenen Aminen. Zum einen konnte mit bloßen Auge ein Farbumschlag von gelb nach rot und zum anderen Änderungen in den Absorptionsspektren wie die Entstehung einer neuen bathochrom verschobenen Bande im Dünnschichtfilm beobachtet werden. Die Erhöhung der Fluoreszenz wie auch die NMR-spektroskopische Untersuchung konnte hingegen ausschließlich in Lösung detektiert werden. Hiermit konnte die kovalente Wechselwirkung der Amin-Moleküle mit dem NBI 58 nachgewiesen werden. Trotz der erfolgreichen Detektion biogener Amindämpfe erwies sich NBI 58 aufgrund der zu geringen Reaktivität als ungeeigneter chemischer Sensor zur Frischekontrolle von Fleisch. 
Das dritte und letzte Unterkapitel (Kapitel III – 1.3.) dieses Abschnittes bestand in der Synthese monochlor-monoamino-substituierter NBIs am Kern (65a,b und 66) und der Wechselwirkungen dieser Farbstoffe mit DNS/RNS. Die NBIs 65a,b und 66 wiesen in der Imidstellung 3-Trimethylammoniumpropyl auf, um die Wasserlöslichkeit zu gewährleisten und die elektrostatische Wechselwirkung mit dem negativ geladenen Phosphatrückgrad der DNS/RNS zu bewirken. Am Kern wurden die Aminosäuren (S)-2,3-Diaminopropionsäure (L-Dap) (65a) und (S)-2,6-Diaminohexansäure (L-Lys) (65b) sowie 2-Trimethylammoniumethylamin (66) eingefügt. Die Untersuchungen mit Hilfe von thermischen Denaturierungsstudien zeigten mit allen NBIs eine deutliche Schmelzpunkterhöhung der DNS/RNS (ΔTm-Werte zwischen 17 und 35 °C), was die Bildung von NBI/Polynukleotid-Komplexen nahelegte. Diese Komplex-Bildung konnte erneut aufgrund enormer Fluoreszenzlöschung in fluorimetrischen Titrationsstudien bestätigt werden. Hier wurden Bindungskonstanten zwischen logK = 5.9 und 7.2 M-1 ermittelt, wobei NBI 65a und poly(dG-dC)2 der stärksten Bindungsaffinität und NBI 65a und poly(dA-dT)2 der schwächste zugeordnet werden konnte. Für NBI 66 wurde die zweithöchste Bindungsaffinität zu Polynukleotid ct-DNS (logK = 7.08 M-1) beobachtet, während dieser Farbstoff sowie 65a,b nur geringe Bindungskonstanten mit dem Polynukleotid polyA-polyU zeigten. Mit Hilfe der CD-spektroskopischen Messungen wurde der Bindungsmodus und die Unterschiede in den Bindungseigenschaften der Farbstoffe mit DNS/RNS ermittelt. Der Großteil aller NBI-Verbindungen interkalierte in einer parallelen Anordnung zwischen die Basenpaare der Polynukleotide. Für NBI 65a und poly(dG-dC)2 ließ sich jedoch eine perpendikulare Anordnung zu den Basenpaaren beobachten. ITC-Titrationsstudien komplettierten letztendlich die Untersuchungen zwischen NBIs und Polynukleotiden. Neben Interkalation als Bindungsmodus konnte zusätzlich aufgrund der relativ hohen Entropiewerte eine Wechselwirkung zwischen den Substituenten am Kern und den Phosphatgruppen in der kleinen Furche festgestellt werden. Zusammengefasst sind die sterischen Hinderungen der Amino-Substituenten und die Furcheneigenschaften von ds-DNS/RNS entscheidend.
Der zweite Arbeitsschwerpunkt ist ebenfalls in drei Unterkapitel (Kapitel III – 2.1.-2.3.) aufgeteilt und befasste sich mit der Synthese und den Sensoreigenschaften kernfunktionalisierter Perylenbisimide (Abbildung 80). Im ersten Abschnitt (Kapitel III – 2.1) wurde die Synthese und die optischen Eigenschaften in Lösung der am Kern einfach und zweifach Kronenether-funktionalisierten PBIs 77a,b und 71a,b untersucht. In Imidstellung waren alle PBIs mit 2-Trimethylammoniumethyl-Resten funktionalisiert, um eine Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln zu gewährleisten. Die Buchtpositionen wurden jeweils ein- bzw. zweifach mit den Kronenether-Einheiten 2-Hydroxymethyl-15-Krone-5 und 2-Hydroxymethyl-18-Krone-6 substituiert. Die anschließende Untersuchung der optischen Eigenschaften der PBIs zeigten bei einer Konzentration von 10-5 M in Acetonitril den monomeren Zustand und in Wasser die Ausbildung von H-Aggregaten. Die Fluoreszenzquantenausbeuten erfuhren in Acetonitril mit steigender Kronenether-Ringgröße eine Zunahme von 73% auf 81% für die PBIs 71a,b und eine vernachlässigbare geringe Zunahme von 49% auf 51% für die PBIs 77a,b. Die Abnahme der Quantenausbeute vom zweifach funktionalisierten zum einfach funktionalisierten PBI um ca. 30% ließ sich durch die stärker ausgeprägten strahlungslosen Relaxationsprozesse dieses flexibleren Moleküls im angeregten Zustand erklären. 
Im zweiten Unterkapitel (Kapitel III – 2.2.) wurden die Selbstassemblierungseigenschaften der synthetisierten PBIs 71a,b und 77a,b in Gegenwart verschiedener Metallionen (Na+, K+, Rb+, Mg2+, Ca2+ und Ba2+) untersucht. Hier konnte eine Abhängigkeit von der Größe des Kronenether-Rezeptors sowie von der Art der Metallionen gezeigt werden. Die Absorptions- und Fluoreszenz-spektroskopischen Studien der zweifach funktionalisierten PBIs 71a und 71b bei einer PBI-Konzentration von c = 10-5 M zeigten ausschließlich für das 15-Krone-5-Derivat 71a und Ba2+ eine erfolgreiche Ausbildung von PBI-Stapeln mit H-artiger exzitonischer Kopplung. Aufgrund dessen erfuhr das Absorptionsmaximum eine stetige Abnahme einhergehend mit einer hypsochromen Verschiebung und die Fluoreszenz eine vollständige Löschung. Zudem konnte eine 1:1-Stöchiometrie der PBI-Stapeln ermittelt werden. Die Anpassung der spektroskopischen Änderungen an die Hill-Gleichung bestätigte letztendlich die Bildung eines [2+2]-Sandwich- bzw. Dimer-Komplexes in einem positiv kooperativen Bindungsprozess, in dem mittels ITC eine enorme Stabilisierung der Ba2+-Komplexierung aufgrund der π-π-Wechselwirkung zwischen zwei PBI-Molekülen, beobachtet wurde. Die Durchführung der Titrationsexperimente bei einer höheren PBI-Konzentration (c = 10-4 M) zusammen mit DOSY-Experimenten versicherten auch in diesem Fall die Formation diskreter Dimerkomplexe. Das einfach funktionalisierte PBI 77a zeigte in der Anwesenheit von Ba2+ ähnliche optische Änderungen. Die nachfolgenden Untersuchungen bzw. Interpretationen bestätigten die Bildung eines [1+2]-Dimerkomplexes mit H-artiger exzitonischer Kopplung, welches aufgrund der flexibleren Komplexstruktur keine Stabilisierung der Ba2+-Komplexierung erfuhr.
Neben der Metallionen-Komplexierung war PBI 71b auch in der Lage, in einer 1:2-Stöchiometrie aromatische Aminosäuren und Dipeptide zu erkennen (Kapitel III – 2.3.), da hier sowohl die Ammoniumgruppen der Aminosäuren und Dipeptide mit den Kronenethereinheiten als auch die aromatischen Einheiten mit dem PBI-Kern wechselwirken können. Fluoreszenz-Titrationsexperimente zeigten, dass die Aminosäuren L-Tryptophan und L-Tyrosin, welche elektronenreiche aromatische Gruppen aufweisen, und Dipeptide, die diese Aminosäuren enthalten, die Fluoreszenz des PBIs stark löschen. Die Bindungskonstanten der Wirt-Gast-Komplexierung in Acetonitril konnten aufgrund eines statischen Löschungsprozesses aus den Fluoreszenztitrationsdaten bestimmt werden. Hier wurde beobachtet, dass die Bindungsstärke von der Größe und der elektronischen Natur der aromatischen Einheiten sowie von dem Abstand zwischen der Ammoniumgruppe und der aromatischen Einheit in Aminosäuren und Dipeptiden abhängt. Die stärkste Bindung konnte zwischen Ala-Trp und PBI 71b mit einem Wert von 3.1 x 105 M-1 beobachtet werden. NMR-Studien bestätigten ebenfalls die Wirt-Gast-Komplexierung, ließen jedoch offen, ob es zu der Bildung von zwei Diastereomeren aufgrund der eingeschränkten Umwandlung der Atrop-Enantiomere (P und M) des PBI 71b kommt oder zu der Bildung von vier Diastereomeren infolge des Chiralitätszentrums im Kronenether. 
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit Naphthalinbisimde und Perylenbisimide hinsichtlich ihrer Eignung als optische Chemosensoren untersucht. Die NBI-Derivate agierten aufgrund ihrer interessanten optischen Eigenschaften als chemische Sensoren selektiv für primären Amindampf und für die DNS/RNS-Wechselwirkung. Im Fall der PBI-Verbindungen wurden hervorragende fluorometrische Chemosensoren ermittelt, die Ba2+-Ionen und elektronenreiche aromatische Aminosäuren und Dipeptide in einer deutlichen Fluoreszenzlöschung detektieren können.
N2  - The list of interesting analytes to be detected is long, therefore there is a great need for the development of new simpler fluorescent and colorimetric chemosensors because of their high sensitivity and selectivity for visual discrimination. Thus, the aim of the present work was the synthesis and characterization of new optical respectively fluorescent and colorimetric chemosensors with the focus on the substance classes naphthalene bisimide and perylene bisimide.
The first focus of this work dealt with water-soluble naphthalene bisimides and is divided into three subchapters (Chapter III – 1.1.-1.3., Figure 1). In the first subchapter (Chapter III – 1.1.), the syntheses and optical properties of the amino-substituted NBIs 60a-h with dicarboxylic acid residues in the imide position and 61a-h with 2-dimethylaminoethyl groups, were described in polar solvents. The systematic attachment of various amine substituents with increasing electron-withdrawing character of the amino residues served the mechanistic elucidation of the optical properties. A complete examination of the optical properties was carried out in aqueous buffer solution at pH 2.1 as well as in methanol and acetonitrile. As expected, the influence of the imide substituents on the optical properties was not significant. However, the different core substituents caused a hypsochromic shift of the absorption and fluorescence maxima with increasing electron-withdrawing character of the amino residues. An unexpected trend could be observed with regard to fluorescence quantum yield. In protic solvents, like water and methanol, a linear dependence of the Hammett constants was determined. Thus, with increasing electron-withdrawing character of the core-amino substituents the quantum yield increased to 39% in water for NBI 60h, 61h and to 45% in Methanol for 60h. The fact that no linear dependence was observed with respect to Hammett σmeta constants in acetonitrile, suggested an excited-state intermolecular hydrogen bond as a competitive process to fluorescence. This process occurs between the solvent molecules and the acceptor group (carbonyl oxygen) of the NBIs, which results in a radiationless relaxation process or fluorescence quenching. The influence of this process can be controlled by the strength of the electron-withdrawing amino substituent. In addition, the NBIs 60a-h showed a pH-independence of the optical properties with respect to the imide substituent in potentiometric titrations in water. This characteristic makes NBIs with dicarboxylic acid residues in particular suitable for the use in biological systems in a neutral pH environment or as chemical sensors.
Because of these interesting results, the second subchapter (Chapter III - 1.2.) examined the dihalogenated NBI 58 with regard to sensing properties of primary, secondary and tertiary amine or diamine vapor as well as for freshness control of meat. The absorption and fluorescence spectroscopic studies of a thin film of NBI 58 successfully demonstrated the selective detection of primary amines and diamines respectively biogenic amines which is accompanied by absorption changes, such as the formation of a new bathochromic shifted band and the pronounced color change of the thin film can be observed by naked eye. The increase in fluorescence as well as the NMR spectroscopic investigation, however, could be determined only in solution. Hereby, the covalent interaction of the amine molecules with the NBI 58 could be proven. Despite the successful detection of biogenic amine vapors, NBI 58 proved to be an inappropriate chemical sensor for meat freshness control because of its low reactivity.
The last subchapter (Chapter III – 1.3.) of this section consisted of the synthesis of monoamino-core-substituted NBIs and the investigation of the interactions of these dyes with DNA/RNA. NBIs 65a,b and 66 were equipped with 3-trimethylammonium propyl residues in the imide position to ensure water solubility and to cause electrostatic interaction with the negatively charged phosphate backbone of the DNA/RNA. Furthermore, the amino acids (S)-2,3-diaminopropionic acid (L-Dap) (65a) and (S)-2,6-diaminohexanoic acid (L-Lys) (65b) and 2-trimethylammonium ethylamine (66) were introduced to the core of the NBIs. Thermal denaturation studies showed for all NBIs a clear increase of the melting temperature of the DNA/RNA (ΔTm values between 17 and 35 °C) which can be attributed to the formation of NBI/polynucleotide complexes. This complex formation could also be confirmed by fluorometric titration studies due to an enormous fluorescence quenching. Hence, binding constants between logK = 5.9 and 7.2 M-1 were determined, whereby NBI 65a and poly(dG-dC)2 showed the strongest binding affinity and NBI  65a and poly(dA-dT)2 the weakest. A high affinity towards polynucleotide ct-DNA (logK = 7.08 M-1) was observed for NBI 66, whereas this dye and as well as 65a,b showed only low binding constants with the polynucleotide polyA-polyU. CD spectroscopic measurements were performed to determine the binding mode and the differences in the binding properties of the dyes with DNA/RNA. The majority of all NBI compounds intercalated in a parallel fashion between the base pairs of the polynucleotides, but for NBI 65a and poly(dG-dC)2 a perpendicular alignment with regard to the base pairs was observed.Finally, ITC titration studies completed investigations on interactions between NBIs and polynucleotides. In addition to an intercalation mechanism, the interaction of the amino core-substituents with the phosphate groups in the minor groove could be determined, due to relatively high entropy values. In summary, the steric hindrance of the amine substituents at the core and the groove properties of ds-DNA/RNA are crucial.
The second focus of this work is also divided into three subsections (Chapter III – 2.1.-2.3.) and dealt with the synthesis and sensor properties of core-functionalized perylene bisimides (Figure 2). In the first section (Chapter III – 2.1.), the syntheses and optical properties of core-single and double crown ether functionalized PBIs 77a,b and 71a,b were investigated in solution. All PBIs were functionalized with 2-trimethylammoniumethyl residues at the imide position to ensure solubility in polar solvents. Bay positions were substituted once or twice with the crown ether units, 2-hydroxymethyl-15-crown-5 and 2-hydroxymethyl-18-crown-6. Subsequent investigation of the optical properties of the PBIs at a concentration of 10-5 M showed the monomeric state in acetonitrile and the formation of H-aggregates in water. Fluorescence quantum yields in acetonitrile increased with increasing ring size of the crown ethers from 73% to 81% for the PBIs 71a,b and a negligible small increase from 49% to 51% for the PBIs 77a,b. Decrease in quantum yield from the double functionalized to the single functionalized PBI by about 30% could be explained by the pronounced nonradiative relaxation processes of this flexible molecule in the excited state. 
In the second subchapter (Chapter III – 2.2.), the self-assembly properties of PBIs 71a,b and 77a,b were investigated in the presence of various metal ions (Na+, K+, Rb+, Mg2+, Ca2+, and Ba2+). Here, a dependence on the size of the crown ether receptor as well as on the type of metal ions could be shown. The absorption and fluorescence spectroscopic studies of the double functionalized PBIs 71a and 71b at a PBI concentration of c = 10-5 M showed successful formation of PBI stacks with H-type exciton coupling exclusively for the 15-crown-5 derivative 71a upon titration with Ba2+. Due to this, the absorption maximum experienced a decrease along with a hypsochromic shift and the fluorescence was completely quenched. In addition, a 1:1 stoichiometry of the PBI stacks could be determined. The fitting of the spectroscopic changes to the Hill equation finally confirmed the formation of a [2+2] sandwich complex in a positive cooperative binding process, in which an enormous stabilization of the Ba2+ complexation due to π-π interaction between two PBI molecules was observed by ITC experiments. Titration experiments at a higher PBI concentration (c = 10-4 M) revealed also in this case the formation of discrete dimer complexes which was further corroborated by DOSY experiments. The single functionalized PBI 77a showed similar optical changes in the presence of Ba2+. The subsequent studies or interpretations confirmed the formation of a [1+2] dimer complex with H-type exciton coupling, which did not undergo stabilization of Ba2+ complexation due to the more flexible complex structure.
In addition to metal ion complexation, PBI 71b is also able to recognize aromatic amino acids and dipeptides in a 1:2 stoichiometry (Chapter III – 2.3.). The ammonium groups of the amino acids and dipeptides were complexed by the crown ether units and consequently, the aromatic moieties interact with the PBI core. Fluorescence titration experiments have shown that amino acids L-tryptophan and L-tyrosine bearing electron-rich aromatic groups and dipeptides containing these amino acids strongly quench the fluorescence of the PBI receptor. The binding constants of host-guest complexation could be determined from the fluorescence titration data due to a static quenching process. Hence, it has been observed that the binding strength is dependent on the size and electronic nature of the aromatic units as well as on the distance between the ammonium group and the aromatic unit in amino acids and dipeptides. The strongest binding affinity was observed for Ala-Trp and PBI 71b with a value of 3.1 x 105 M-1. NMR studies also confirmed host-guest complexation, but revealed the formation of two diastereomers due to restricted conversion of the atropo-enantiomers (P and M) of PBI 71b or the formation of four diastereomers due to the chirality center in the crown ether.
In summary, in this work naphthalene bisimide and perylene bisimide were investigated for their suitability as optical chemosensors. Because of their interesting optical properties, the NBI derivatives acted as chemical sensors selectively for primary amine vapor and for interaction with DNA/RNA. In the case of PBI compounds, excellent fluorometric chemosensors have been determined that can detect Ba2+ ions and electron-rich aromatic amino acids and dipeptides resulting in a significant fluorescence quenching.
KW  - Chemischer Sensor
KW  - Supramolekulare Chemie
KW  - Chemical Sensor
KW  - Molecular Recognition
KW  - DNA
KW  - Supramolecular Chemistry
KW  - Naphthalinderivate
KW  - Perylenderivate
KW  - DNS
KW  - Molekulare Erkennung
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161990
ER  - 
TY  - THES
A1  - Miesler, Tobias Hans-Herbert
T1  - Development of diagnostic systems targeting the human tongue as a 24/7 available detector
T1  - Entwicklung von diagnostischen Systemen, welche die menschliche Zunge als 24/7 verfügbaren Detektor nutzen
N2  - To diagnose diseases correctly requires not only trained and skilled personnel, but also cost-intensive and complex equipment. Rapid tests can help with the initial evaluation, but result generation can also take up to several hours, depending on the test system. At this point, novel bioresponsive diagnostic systems are used, responding to the disease related shift of biological processes. They monitor changes in the biological environment and can react to them e.g. with the release of substances. This can be used in drug delivery formulations but can also help to diagnose diseases occurring in the oral cavity and inform patients of their state of health. The tongue is herein used as a 24/7 available detector.
In section I of this work, the foundation for the development of these diagnostic systems was laid. A suitable flavoring agent was found, which is stable, can be coupled to the N-terminus of peptides and has a strongly conceivable taste. For the optimization of the protease-sensitive linker (PSL), an analytical system was established (PICS assay), which determines protease-specific cleavable amino acid sequences. In order to replace the PMMA particles previously required, an acetyl protecting group was introduced N-terminally as it protects peptides and proteins in the human body from degradation by human aminopeptidase. The new synthesized flavor was examined with a NIH cell line for cytotoxicity and with an electronic tongue setup for its bitterness.
Section II deals with the structure of a system which detects severe inflammations in the oral cavity, e.g. PA. The established PICS assay was used to confirm the previously used PSL sequence in its application. Using solid phase peptide synthesis, 3 linkers were synthesized which respond to the elevated MMP concentrations present in inflammation. The resulting peptides were acetylated and coupled with HATU/DIPEA to the modified denatonium. Cutting experiments with MMPs over different concentration and time ranges confirmed the response of the diagnostic sensor to these enzymes. The obtained construct was examined for cell toxicity by WST assay. The masked bitterness of the sensors was confirmed by an electronic tongue setup.
To address non-human proteases (and thereby infections), section III focuses on the establishment of detection system of a cysteine protease SpeB expressed by Streptococcus pyogenes. The in-house expression of SpeB using E. coli cells was established for this purpose. An analysis of the SpeB cleavage sites was performed using a PICS assay setup. Four constructs with different PSL were synthesized analogous to section II. Cleavage experiments with the expressed and purified SpeB showed a response of two constructs to the protease. In addition, a system was established to quantify the concentration of SpeB in human saliva using western blot technique with subsequent quantification. 
In section IV a compound was synthesized which can now be coupled to a flavor. The final coupled construct is able to detect present NA activity specifically from influenza A and B. The market for existing influenza diagnostics was explored to determine the need for such a system. A neuraminic acid was modified in positions 4 and 7 and protected in such a way that subsequent coupling via the hydroxy-group in position 2 was selectively possible. 
In summary, this results in a diagnostic platform that can be used anywhere, by anyone and at any time. This represents a new dimension in the rapid diagnosis of inflammations and bacterial or viral infections.
N2  - Krankheiten korrekt zu diagnostizieren erfordert nicht nur geschultes und ausgebildetes Personal, sondern zudem auch kostenintensive und komplexe Geräte. Schnelltests helfen bei der ersten Auswertung, können aber je nach Testsystem dennoch bis zu einigen Stunden in Anspruch nehmen, bevor ein Ergebnis vorliegt. An dieser Stelle werden neuartige, , sogenannte bioresponsive diagnostische Systeme eingesetzt. Sie überwachen Ihre biologische Umgebung und können auf Veränderung dieser z.B. mit der Freisetzung von Substanzen reagieren. Durch das in dieser Arbeit entwickelte diagnostische System können Veränderungen im Mundraum erkannt und Patienten über ihren Gesundheitszustand in Kenntnis gesetzt werden. Hierbei wird die Zunge als 24/7 verfügbarer Detektor genutzt.
Im Abschnitt I wurde das Fundament zur Entwicklung dieser diagnostischen Systeme gelegt. Ein geeigneter Geschmacksstoff wurde gefunden, welcher stabil, koppelbar an Peptide und geschmacklich gut wahrnehmbar ist um ein positives Testresultat anzuzeigen. Für die Optimierung des Protease-sensitiven Linkers (PSL) wurde ein System etabliert (PICS-Assay), welches in der Lage ist eine Protease-spezifische Aminosäure-Schneidsequenz zu bestimmen. Um den im vorherigen System benötigten PMMA-Partikel zu ersetzen, wurde eine Acetylschutzgruppe am N-terminus eingeführt, welche die gleiche schützende Funktion wie ein solcher Partikel gegen den Abbau von Peptiden und Proteinen durch die körpereigene Aminopeptidase besitzt. Das gesamte Konstrukt wurde mit einer NIH-Zelllinie auf toxikologische Aspekte hin untersucht und die Maskierung des Geschmacks im ungeschnittenen Zustand mittels elektronischer Zunge überprüft.
Abschnitt II handelt vom Aufbau eines Systems, welches schwerwiegende Entzündungen im Mundraum, wie sie z.B. bei einer Parodontitis vorliegen detektiert. Der etablierte PICS-Assay wurde genutzt, die vorher verwendete PSL-Sequenz in ihrer Anwendung zu bestätigen. Mittels Festphasen-Peptidsynthese wurden drei Linker synthetisiert, welche auf die erhöhten MMP-Konzentrationen, welche bei Entzündungen vorliegen ansprechen. Die erhaltenen Peptide wurden acetyliert und mit HATU/DIPEA an das modifizierte Denatonium gekoppelt. Schneidversuche dieser Modelsysteme mit MMP‘s über verschiedene Konzentrations- und Zeitbereiche bestätigten das Ansprechen des diagnostischen Sensors auf diese Enzyme. Das erhaltene Konstrukt wurde mittels WST-Assay auf Zelltoxizität hin untersucht.
Um auch non-humane Proteasen, welche auf Infektionen hinweisen, adressieren zu können konzentriert sich Abschnitt III auf die Etablierung eines Nachweis-Systems der Cystein-Protease SpeB, welches von Streptococcus pyogenes exprimiert wird. Hierzu wurde die hauseigene Exprimierung von SpeB mittels E. Coli Zellen etabliert. Vom gewonnenen SpeB wurde eine Analyse der Schnittstelle mittels PICS-Assay durchgeführt. Vier Konstrukte mit verschiedenen PSL wurden analog zu Abschnitt II synthetisiert. Schneidversuche mit dem exprimierten SpeB zeigten ein Ansprechen von zwei Konstrukten auf die Protease. Zudem wurde ein System etabliert um mittels Western Blot die Konzentration von SpeB im menschlichen Speichel zu quantifizieren. 
Im Abschnitt IV wurde eine Verbindung synthetisiert, welche an einen Geschmacksstoff gekoppelt werden kann. Das gesamte diagnostische System ist im Stande Influenza-Viren nachzuweisen. Der Markt zur bestehenden Influenza Diagnostik wurde exploriert um die Notwendigkeit eines solchen Systems zu ermitteln. Eine Neuraminsäure wurde in Position 4 und 7 modifiziert und so geschützt, das nachfolgendes Koppeln über die Hydroxygruppe in Position 2 selektiv möglich wurde. 
Zusammengefasst ergibt sich eine diagnostische Plattform, welche überall, von jedem und jederzeit angewandt werden. Dies stellt eine neue Dimension der Schnelldiagnostik von Entzündungen und bakteriellen oder viralen Infektionen dar.
KW  - Diagnostik
KW  - Schnelltest
KW  - Sensoren
KW  - Zunge
KW  - Kaugummi
KW  - Point-of-Care-testing
KW  - Tongue
KW  - Chewing Gum
KW  - Sensors
KW  - Zunge
KW  - Kaugummi
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-214490
ER  - 
TY  - THES
A1  - Memmel, Elisabeth
T1  - Vom Glycochip zur lebenden Zelle - Studien zu Infektions- und Tumor-relevanten Kohlenhydrat-Erkennungsprozessen
T1  - From Glycochips to Living Cells - investigating carbohydrate recognition processes relevant for infections and tumor diseases
N2  - Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen sind häufig entscheidend beteiligt an verschiedenen einer Infektion oder malignen Erkrankung zugrunde liegenden molekularen Erkennungs-prozessen, die zu Adhäsion, Zell-Zell-Interaktion sowie Immunreaktion und -toleranz führen. Trotz der hohen Relevanz für Diagnostik und Therapie dieser Erkrankungen sind die betreffenden Strukturen und Mechanismen bisher nur ungenügend untersucht und verstanden. Ziel dieser stark interdisziplinär angelegten Arbeit war es daher, Methoden der Fachbereiche Chemie und Pharmazie, Biologie und Medizin, aber auch Physik zu kombinieren, um Kohlenhydraterkennungsprozesse im Detail zu untersuchen und auf dieser Basis strukturell neuartige diagnostische und therapeutische Anwendungen zu entwerfen.
Die hochkomplexe Zusammensetzung einer Zelloberfläche wurde zunächst auf ihren Glycan-anteil reduziert und stark vereinfacht auf der Oberfläche sogenannter Glycochips imitiert. Die verwendeten Systeme auf Basis einer Gold- bzw. Glasoberfläche ergänzen sich optimal in ihrer Eignung für komplementäre analytische Methoden wie Massenspektrometrie sowie quantifizierbare Fluoreszenzspektroskopie.
Der Übergang auf die lebende Zelloberfläche gelang mit Hilfe des Metabolic Glyco-engineering, das die kovalente Präsentation definierter Motive durch eine Cycloaddition zwischen zwei bioorthogonalen Reaktionspartnern (z.B. Azid und Alkin) ermöglicht.
Auf diese Weise wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Sauer (Universität Würzburg) zunächst die Dichte und Verteilung verschiedener Oberflächenglycane auf humanen Zellen mittels hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie (dSTORM) bestimmt. Diese Parameter zeigten im Modell des Glycochips einen entscheidenden Einfluss auf Bindungsereignisse und multivalente Erkennung und zählen auch auf natürlichen Zelloberflächen – in engem Zusammenhang mit der lateralen und temporalen Dynamik der Motive – zu den wichtigen Faktoren molekularer Erkennungsprozesse.
Die gezielte Modifikation zellulärer Oberflächenglycane eignet sich aber auch selbst als Methode zur Beeinflussung molekularer Wechselwirkungsprozesse. Dies wurde anhand des humanpathogenen Bakteriums S. aureus gezeigt, dessen Adhäsion auf Epithelzellen der Blasenwand durch Metabolic Glycoengineering partiell unterdrückt werden konnte.
In einem ergänzenden Projekt wurden zwei potentielle Metabolite eines konventionellen Antibiotikums – des Nitroxolins – mit bakteriostatischer sowie antiadhäsiver Wirksamkeit dargestellt. Diese dienten als Referenzsubstanzen zur Verifizierung der postulierten Struktur der Derivate, werden aber auch selbst auf ihr Wirkprofil hin untersucht. Gleichzeitig stehen sie zusammen mit der Grundverbindung zudem als Referenz für die Wirkstärke potentieller neu entwickelter Antiadhäsiva zur Verfügung.
N2  - Interactions between carbohydrates and proteins often are crucial factors in the molecular recognition processes of infectious diseases or cancer, leading to adhesion and cell cell interaction, as well as immune response and immune tolerance. Despite of their high pertinence for diagnostics and successful therapeutic treatment of those diseases, the structures and mechanisms involved are still insufficiently studied and poorly understood. So it was the aim of this strongly interdisciplinary oriented dissertation, to study carbohydrate recognition processes on molecular basis and in detail by combining methods from different scientific schools like chemistry and pharmacy, biology and medicine, as well as physics. Based on the achieved results innovative diagnostic and therapeutic applications should be proposed.
Initially the highly complex structural composition of a living cells’ surface was reduced to its’ glycan fraction and mimicked on the surface of so-called glycochips in a very simplified manner. Two systems, based on gold and glass surfaces respectively, were used due to their complementary applicability for different analytical methods like mass spectrometry and quantitative fluorescence spectroscopy.
The step forward towards living cell surfaces was achieved by metabolic glycoengineering, a method that enables the covalent installation of defined binding motifs by performing a cycloaddition between two bioorthogonal reaction partners (e.g. azide and alkyne).
In cooperation with the group of Prof. Dr. Markus Sauer (Universität Würzburg) this technique was used to determine the density and spatial distribution of different cell surface glycans on human cell lines with high resolution fluorescence microscopy (dSTORM). In the glycochip model these parameters exhibited a key value for binding processes and multivalent recognition. Even on native cell surfaces they are crucial factors of molecular recognition processes – closely related to the lateral and temporal dynamics of the structural motifs.
In addition the specific modification of cell surface glycans itself can be used to manipulate molecular interaction processes. This could be shown for the human pathogenic bacterium Staphylococcus aureus by significant reduction of its adhesion potential towards epithelial cells derived from the human bladder after metabolic glycoengineering.
Finally a supplementary project aimed to synthesize two prior postulated metabolites of the conventional antibiotic agent nitroxoline that shows bacteriostatic as well as antiadhesive effects. They were used as reference compounds to verify the postulated structure of the two derivatives and currently undergo further studies concerning their intrinsic mode of action. In addition to the parent molecule they also serve as reference compounds to estimate the potential of novel antiadhesives.
KW  - Microarray
KW  - Fluoreszenz
KW  - Adhäsion
KW  - MALDI-MS
KW  - Bioorganische Chemie
KW  - Kohlenhydrate
KW  - Glycochip
KW  - Galabiose
KW  - dSTORM
KW  - Nitroxolin
KW  - Metabolic Glycoengineering
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115825
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bertleff-Zieschang, Nadja Luisa
T1  - Galectin-1: A Synthetic and Biological Study of a Tumor Target
T1  - Galectin-1: Eine Synthetische und Biologische Studie eines Tumortargets
N2  - Galectin-1 (hGal-1) is overexpressed by numerous cancer types and previously conducted studies confirmed that the β-galactoside-binding protein mediates various molecular interactions associated with tumor growth, spread and survival. Upon interaction with carbohydrate-based binding epitopes of glycan structures on human cell surfaces galectin-1 induces proliferative, angiogenetic and migratory signals and modulates negative T cell regulation which essentially helps the tumor to evade the immune response. These findings attributed galectin-1 a pivotal role in tumor physiology and strongly suggest the protein as target for diagnostic and therapeutic applications.
Within the scope of this work a strategy was elaborated for designing tailor-made galectin-1 ligands by functionalizing selected hydroxyl groups of the natural binding partner N-acetyllactosamine (LacNAc) that are not involved in the sophisticated interplay between the disaccharide and the protein. Synthetic modifications intended to introduce chemical groups i) to address a potential binding site adjacent to the carbohydrate recognition domain (CRD) with extended hGal-1-ligand interactions, ii) to implement a tracer isotope for diagnostic detection and iii) to install a linker unit for immobilization on microarrays.
Resulting structures were investigated regarding their targeting ability towards galectin-1 by cocrystallization experiments, SPR and ITC studies. Potent binders were further probed for their diagnostic potential to trace elevated galectin-1 levels in microarray experiments and for an application in positron emission tomography (PET).
N2  - Galectin-1 (hGal-1) wird von zahlreichen Tumoren überexprimiert und frühere Studien bestätigten, dass das β-Galactosid-bindende Protein verschiedene molekulare Wechselwirkungen vermittelt, welche in direktem Zusammenhang mit Tumorwachstum, -ausbreitung und -überleben stehen. Durch die Wechselwirkung mit Kohlenhydrat-basierten Bindungsepitopen von Glykanstrukturen auf Zelloberflächen induziert Galectin-1 proliferative, angiogenetische und migratorische Signale und moduliert die negative Regulierung von T-Zellen, entscheidend für den Tumor, um der Immunantwort zu entkommen. Diese Beobachtungen schreiben Galectin-1 eine zentrale Rolle in der Tumorphysiologie zu, was dieses Protein zu einem attraktiven Target für diagnostische und therapeutische Anwendungen macht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Synthesestrategie für das Design maßgeschneiderter Galectin-1 Liganden entwickelt, wobei ausgewählte Hydroxylgruppen des natürlichen Bindungspartners N-Acetyllactosamin (LacNAc), welche nicht an dem hochkomplexen Zusammenspiel zwischen Protein und Disaccharid beteiligt sind, funktionalisiert wurden. Synthetische Modifikationen wurden mit der Absicht eingeführt i) eine potentielle Bindungstasche in Nachbarschaft der Kohlenhydraterkennungsdomäne (CRD) zu adressieren, ii) einen Isotopenmarker für die diagnostische Detektion zu implementieren und iii) eine Brückeneinheit zu integrieren, welche einer späteren Immobilisierung auf Mikroarrays dient. 
Resultierende Strukturen wurden mittels Kokristallisationsexperimenten, SPR- und ITC-Studien auf ihre Fähigkeit untersucht, Galectin-1 zu adressieren. Erfolgreich entwickelte Liganden wurden zudem auf ihr diagnostisches Potential getestet, erhöhte Galectin-1-Spiegel in Microarray-Experimenten zu detektieren und könnten zukünftig Einsatz in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) finden.
KW  - Organische Synthese
KW  - Galectine
KW  - Kohlenhydrate
KW  - Molekulare Erkennung
KW  - Click-Chemie
KW  - carbohydrate chemistry
KW  - protein crystallography
KW  - galectin-1
KW  - protein-ligand-interaction
KW  - N-acetyllactosamine
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101529
ER  -