TY - THES A1 - Arnold, Eva T1 - Bedeutung von Desmoglein 2 und Desmoglein 3 für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten T1 - Importance of desmoglein 2 and desmoglein 3 for intercellular adhesion in keratinocytes N2 - Desmogleine (Dsg1-4) sind transmembranäre Adhäsionsproteine aus der Gruppe der desmosomalen Cadherine, die Zell-Zell-Kontakte zwischen benachbarten Keratinozyten der Epidermis in und außerhalb von Desmosomen vermitteln. Eine durch Autoantikörper induzierte Störung dieser Haftstrukturen (hauptsächlich Dsg1 und Dsg3) resultiert im klinischen Bild der Pemphigus-Erkrankung. Dieses ist makroskopisch durch eine Blasenbildung der Haut gekennzeichnet. Auf zellulärer und molekularbiologischer Ebene lassen sich im Falle von Pemphigus vulgaris (PV) eine Retraktion des Zytoskeletts, eine Reduzierung der Dsg3-Proteinmenge und eine Aktivierung verschiedener Signalwege u.a. der p38MAPK nachweisen. PV eignet sich daher als Modellerkrankung zur Untersuchung der Bedeutung desmosomaler Cadherine für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten. Durch zahlreiche Studien wurde die wichtige Funktion von Dsg3 als Adhäsionsprotein bestätigt und eine Beteiligung an der Modulation zahlreicher Signalwege, die in Zusammenhang mit der Pemphigus-Pathogenese stehen, untersucht. Im Gegensatz dazu konnte bisher keine spezifische Funktion des desmosomalen Cadherins Dsg2 in der Epidermis identifiziert werden. Dsg2 kommt als einziges Desmoglein in allen Geweben vor, die Desmosomen enthalten, und ist auch an den Zell-Zell-Kontakten im Myokard und Darmepithel vorhanden, wo kein Dsg1 und Dsg3 exprimiert werden. Hier nimmt Dsg2 eine wichtige Rolle als Adhäsionsmolekül und als Regulator interzellulärer Prozesse ein. In dieser Arbeit wurde daher vergleichend die Bedeutung von Dsg2 und Dsg3 für die interzelluläre Adhäsion in Keratinozyten im Hinblick auf ihre Funktion als Adhäsionsmolekül und als Rezeptormolekül, speziell im p38MAPK-Signalweg, untersucht. Wesentliche Unterschiede zeigten sich zunächst in der Lokalisation beider Proteine. Während sich die in der Literatur beschriebene Lokalisation von Dsg3 im Stratum basale und spinosum der Epidermis bestätigte, konnte Dsg2 nur am Haarfollikel nachgewiesen werden. In differenzierten HaCaT-Zellen, einer Keratinozyten-Zelllinie war Dsg2 eher punktförmig und Dsg3 nahezu linear an der Zellmembran lokalisiert. Dementsprechend ließ sich Dsg2 nach Triton-vermittelter Zellfraktionierung in ähnlicher Verteilung zwischen der Zytoskelett-gebunden und -ungebundenen Fraktion nachweisen wie Desmoplakin, das an der Zellemembran ausschließlich in Desmosomen vorkommt. Durch Dsg-spezifische Antikörper, deren inhibitorische Eigenschaft in zellfreien AFM-Studien nachgewiesen wurde, konnte nur eine Inhibierung der Dsg3- und nicht der Dsg2-vermittelten Adhäsion in HaCaT-Zellen erzielt werden. Im Gegensatz dazu induzierte derselbe Dsg2-spezifische Antikörper einen signifikanten Haftungsverlust in einer Darmepithelzelllinie. Die mittels siRNA induzierte Reduzierung der Dsg2-Proteinmenge führte jedoch nur unter erhöhter mechanischer Belastung der Zellen zu einem Adhäsionsverlust. Die simultane Modulation der Funktion von Dsg2 und Dsg3 mittels siRNA bzw. der Inkubation Dsg2-depletierter Zellen mit AK23, einem inhibitorischen Dsg3-spezifischen Antikörper, resultierte in einem drastischen, teilweise p38MAPK-abhängigen, Adhäsionsverlust. Dieser Befund lieferte erste Hinweise auf eine kompensatorische Funktion von Dsg2 bei eingeschränkter Dsg3-vermittelter Haftung in Keratinozyten. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Verteilung von Dsg2 an der Zellemembran Dsg3-depletierter HaCaT-Zellen untersucht. Der Verlust von Dsg3 resultierte hierbei in einer Zunahme und Linearisierung der Dsg2-Membranfärbung, was die Hypothese einer kompensatorischen Funktion im Falle einer Beeinträchtigung der Dsg3-Funktion bekräftigt. Um die Funktion von Dsg2 unter dieser Bedingung gezielter zu untersuchen, wurde das transgene Dsg3-Mausmodell eingesetzt und primäre Keratinozyten aus neonatalen Dsg3-defizienten und nicht-Dsg3-defizienten Geschwistertieren isoliert. Entsprechend der vorhergehenden Befunde zeigten die Dsg3-defizienten Zellen eine deutliche Zunahme der Dsg2-Membranlokalisation sowie zusätzlich eine erhöhte DSG2-mRNA-Expression, allerdings bei unveränderten Dsg2-Proteinmengen. Weiterhin wurde die Funktion von Dsg2 und Dsg3 als Modulator des p38MAPK-Signalweges näher untersucht. Der für Dsg3 identifizierte Komplex mit der phosphorylierten Form der p38MAPK (p-p38MAPK) konnte für Dsg2 nicht nachgewiesen werden. Ebenso führte eine Reduzierung der Dsg2-Proteinmenge, im Gegensatz zur Reduzierung der Dsg3-Proteinmenge, nicht zur Aktivierung der p38MAPK und einer Retraktion des Zytoskeletts. Der direkte Zusammenhang zwischen einem Dsg3-Funktionsverlust und der p38MAPK-Aktivität ließ sich dadurch bestätigen, dass sowohl die Keratinretraktion als auch der Haftungsverlust nach Dsg3-Depletion durch den Einsatz eines p38MAPK-spezifischen Inhibitors partiell inhibierbar waren. Auch in primären Keratinozyten mit vollständiger Dsg3-Defizienz verbesserte eine p38MAPK-Inhibierung die Zelladhäsion. Ebenso wurde in Dsg3-defizienten Zellen im Vergleich zu Zellen mit endogener Dsg3-Expression eine deutliche Lokalisation der p-p38MAPK an der Zellmembran nachgewiesen, was darauf schließen lässt, dass möglicherweise in Abwesenheit von Dsg3 andere Membranproteine an der Regulation dieses Signalweges beteiligt sind. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine bisher nicht beschriebene Funktion von Dsg2 als Kompensationspartner für Dsg3 in Keratinozyten identifiziert und die Rolle von Dsg3 als Modulator des p38MAPK-Signalweges näher charakterisiert. N2 - Desmogleins (Dsg1-4) are transmembrane adhesion proteins and members of the protein family of desmosomal cadherins which mediate cell-cell adhesion of adjacent keratinocytes inside and outside of desmosomes. Autoantibody-induced loss of binding of these proteins (mainly Dsg1 and Dsg3) results in the phenotype of Pemphigus vulgaris (PV). The patients suffer from erosions and lesions in skin and mucous membranes. Hallmarks of the disease on cellular level are the retraction of the keratin intermediate filaments, a depletion of Dsg3 and a modulation of several signaling pathways, e.g. p38MAPK. PV is therefore an important disease model to study the role of desmosomal cadherins for intercellular adhesion in keratinocytes. Numerous research groups confirmed the importance of Dsg3 as an adhesion protein and furthermore investigated a contribution of Dsg3 to signaling pathways in PV pathogenesis. In contrast, up to now no specific function for the desmosomal cadherin Dsg2 has been identified in the epidermis. Dsg2 is the only desmoglein isoform that is ubiquitously expressed in all desmosome-containing tissues and can also be identified in the cell-cell contacts of the myocardium and the intestinal epithelium in which Dsg1 and Dsg3 are absent. In both tissues, Dsg2 plays an important role as adhesion protein or regulator of intracellular processes. Therefore, in the present study the relevance of the two desmosomal cadherins Dsg2 and Dsg3 for intercellular adhesion was compared and their roles as modulators of the p38MAPK pathway were studied. Basic differences were identified in the localization of both proteins: Dsg2 was restricted to keratinocytes in the hair follicle in adult human skin, whereas Dsg3 was located in the basal and the suprabasal layers of the epidermis. In differentiated HaCaT cells, an immortalized keratinocyte cell line Dsg2 localization appeared to be punctuated along the cell membrane whereas Dsg3 showed a linear distribution. Accordingly, Dsg2 was predominantly detectable in the cytoskeleton-anchored, desmosome-containing protein pool after Triton-X-100-mediated cell fractionation predominantly. Using Dsg-specific antibodies which were proven to be inhibitory in cell-free studies by atomic-force microscopy, loss of cell cohesion was detectable after targeting of Dsg3 only. In contrast, the same Dsg2-specific antibody induced a significant loss of cell-cell cohesion in an intestinal epithelial cell line. Interestingly, the siRNA-mediated reduction of Dsg2-protein levels induced a loss of cell cohesion under conditions of increased shear only. The simultaneous modulation of Dsg2 and Dsg3 by siRNA or by incubation of Dsg2-depleted cells with AK23, a pathogenic Dsg3-specific antibody, led to a drastic and partially p38MAPK-dependent loss of cell-cell adhesion. This indicated a compensatory role of Dsg2 under impaired Dsg3-function in keratinocytes. Therefore, in further studies the distribution of Dsg2 after transfection with Dsg3-specific siRNA was investigated. Indeed, Dsg3-depleted keratinocytes demonstrated a pronounced and linearized distribution of Dsg2 along the cell membrane which corroborated the hypothesis of Dsg2 compensating for Dsg3 under conditions of reduced Dsg3-binding properties. To further investigate the function of Dsg2 under conditions of complete loss of Dsg3, primary murine keratinocyte were isolated from Dsg3-knockout mice and their wild-type littermates. According to the results of the cell-culture model, Dsg3-deficient primary keratinocytes showed a prominent membrane localization of Dsg2 and increased levels of DSG2-mRNA but not of Dsg2-protein. Next, the function of Dsg2 and Dsg3 as modulators in the p38MAPK signaling pathway was investigated. The recently identified complex of Dsg3 with phosphorylated-p38MAPK (p-p38MAPK) was not detectable after Dsg2 immunoprecipitation. According to this, depletion of Dsg2 in contrast to Dsg3 did not result in activation of p38MAPK and p38MAPK-dependent keratin retraction. The protective effect of p38MAPK inhibition on both loss of cell-cell adhesion as well as keratin retraction after Dsg3-depletion confirmed the direct relation between loss of Dsg3-function and p38MAPK activation. Similarly, in primary murine keratinocytes lacking Dsg3, inhibition of p38MAPK was effective to improve cell adhesion. In these cells a more pronounced membrane localization of p-p38MAPK was detectable. This indicates that other membrane proteins play a role as regulators of this signaling molecule under conditions of Dsg3-deficiency. In summary, the results of this work identify a novel function for Dsg2 as compensation partner for Dsg3 and further characterize the role of Dsg2 and Dsg3 as modulators of the p38MAPK signaling pathway in keratinocytes. KW - Desmogleine KW - Pemphigus KW - Zellkontakt KW - Keratinozyt KW - Desmoglein 2 KW - Desmoglein 3 KW - p38MAPK Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109267 ER - TY - THES A1 - Vielmuth, Franziska T1 - Die Rolle von cAMP bei Pemphigus vulgaris T1 - The role of cAMP in pemphigus vulgaris N2 - Desmosomen sind Zell-Zell-Kontakte, die eine starke interzelluläre Haftung vermitteln. Sie sind daher besonders wichtig für die Integrität von Geweben wie der Haut, die laufend einer starken mechanischen Beanspruchung ausgesetzt sind. Pemphigus vulgaris ist eine Autoimmundermatose, die zur Ausbildung schlaffer Blasen durch Spaltbildung in der Epidermis führt. Als ursächlich dafür wurden Autoantikörper gegen die desmosomalen Cadherine Dsg1 und 3 herausgestellt, die in Desmosomen vorkommen. cAMP ist ein wichtiger Botenstoff des Zellstoffwechsels und an der Regulierung und Modulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt, darunter auch die Stabilisierung der Endothelbarriere über Stärkung der Haftung eines klassischen Cadherins, nämlich VE-Cadherin. In Anknüpfung an die vorliegenden Daten aus Pemphigus- und Endothelforschung beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle von cAMP bei Pemphigus vulgaris. Es wurde in Keratinozytenkultur sowie im neonatalen Pemphigus-Mausmodell untersucht, ob die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Spiegel einen Einfluss auf PV-IgG-induzierte morphologische und funktionelle Veränderungen hat. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels konnte sowohl in vitro als auch in vivo als protektiv herausgestellt werden. In Keratinozytenkultur konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels durch Forskolin/Rolipram oder Isoproterenol in der Lage war, die PV-IgG-induzierten morphologischen Veränderungen, die Dsg3-Depletion, sowie den Adhäsionsverlust zu blockieren. Weiterhin konnte die Blasenbildung in vivo durch cAMP-Erhöhung vollständig verhindert werden. Im Anschluss wurde untersucht, ob die Inkubation mit PV-IgGs einen Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Spiegel in vitro hat. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zellen mit einer Erhöhung der cAMP-Spiegel reagieren, wenn auch in einem geringeren Ausmaß als durch die eingesetzten Mediatoren. Somit kann cAMP als Rettungsmechanismus der Zellen angesehen werden und es wurde daraufhin der Einfluss von cAMP auf die Regeneration von Keratinozyten nach PV-IgG-Inkubation untersucht. Dieser Prozess konnte durch eine cAMP-Erhöhung verbessert werden und erwies sich als partiell abhängig von PKA. Schlussendlich konnte nachgewiesen werden, dass cAMP in vitro wie in vivo über die Blockade der p38MAPK-Aktivierung protektiv wirkt. Zusammenfassend konnte so ein neuer Einblick in die zelluläre Antwort von Keratinozyten auf Pemphigus-Autoantikörperbindung gewonnen werden. Dieser könnte auch im Hinblick auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien bei Pemphigus vulgaris wichtig sein. N2 - Desmosomes are cell-cell-contacts which provide strong intercellular adhesion. They are most abundant and important in tissues which are continuously exposed to mechanical stress such as the epidermis of the skin. Pemphigus vulgaris (PV) is a severe autoimmune blistering disease characterized by intraepidermal cleavage leading to flaccid blisters of the skin. These phenomena are caused by autoantibodies against the desmosomal adhesion molecules desmoglein (Dsg) 1 and 3. Cyclic adenosine-monophosphat (cAMP) is an important second messenger in various signaling pathways and takes part in regulation and modulation of distinct cellular processes. For instance, cAMP is capable to stabilize the endothelial barrier by increasing adhesion of another cadherin-type adhesion molecule referred to as vascular endothelial cadherin (VE-cadherin). Therefore, based on the knowledge from pemphigus and endothelial barrier research, the scope of the present dissertation is to clarify the role of cAMP in pemphigus vulgaris pathogenesis. Investigations in keratinocyte cell cultures and in a neonatal pemphigus mouse model were carried out to analyze the effect of an increased intracellular cAMP level on desmosomal adhesion. The data demonstrated that increased cAMP-levels are protective against the pathogenic effects of autoantibodies from PV patients (PV-IgG) in vitro and in vivo. In cultured keratinocytes the increase of intracellular cAMP mediated by application of either forskolin/rolipram or isoproterenol was capable to block PV-IgG-induced morphological changes as well as Dsg3-depletion and loss of cell cohesion. Further, development of flaccid blisters and intraepidermal cleavage formation was abolished in vivo. Since cAMP signaling in vitro as well as in vivo was effective to prevent autoantibody-induced p38MAPK activation, which is a central mechanism in pemphigus pathogenesis, it can be concluded that the signaling function of desmogleins was modulated by this approach. Next, we examined whether incubation with PV-IgG affected intracellular cAMP levels in vitro. Interestingly, we found that keratinocytes responded to PV-IgG incubation with an increase in cAMP levels, albeit to a smaller extend compared to the applied mediators. These data indicate that increase of cAMP may serve as a cellular rescue mechanism to enhance intercellular cohesion. Finally, the effect of cAMP on spontaneous regeneration of cell cohesion after PV-IgG incubation was examined. Here, it was observed that regeneration was improved by increase of cAMP and was at least partially PKA-dependent. In summary, this work provides new insights into the cellular responses of keratinocytes to the binding of pemphigus autoantibodies. This may be important especially with respect to development of new therapeutic approaches in pemphigus vulgaris. KW - Pemphigus KW - Cyclo-AMP KW - Autoimmundermatose KW - Keratinozyten KW - neonatales Pemphigus-Maus-Modell KW - Signalwege Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107757 ER - TY - THES A1 - Peter, Dominik T1 - Reorganisation der Zellkontakte der Endothelbarriere bei der Stabilisierung durch cAMP und Rac1 T1 - Reorganization of Intercellular Junctions in Stabilization of Endothelial Barrier Functions by cAMP and Rac1 N2 - Zwischen Blutkompartiment und umliegenden Interstitium besteht eine Barriere, die durch eine einzelne Schicht aus Endothelzellen gebildet wird. Essentiell für diese Barriere, deren Funktion in der Begrenzung des Austausches von Flüssigkeit und gelösten Stoffen liegt, sind interzelluläre Junktionen, welche die Endothelzellen miteinander verbinden. Durch eine gestörte Funktion und Regulation der Endothelbarriere entstehen beim Menschen verschiedene Pathologien wie zum Beispiel Ödeme, hämorrhagischer Schlaganfall und vaskuläre Malformationen. Es ist bekannt, dass cAMP die Endothelbarriere zum Teil durch Aktivierung der kleinen GTPase Rac1 stabilisiert. Trotz der großen medizinischen Relevanz dieses Signalweges, sind die damit einhergehenden Effekte auf die interzellulären Kontakte auf ultrastruktureller Ebene weitgehend unbekannt. In mikrovaskulären Endothelzellkulturen kam es ähnlich wie in intakten Mikrogefäßen zur Stärkung der Barrierefunktion. So resultierte sowohl nach Behandlung mit Forskolin und Rolipram (F/R), welche zur Steigerung der intrazellulären cAMP-Spiegel führen, als auch nach Zugabe von 8-(4-chlorophenylthio)-2´-O-methyladenosin-3´,5´-cyclic monophosphorothioate (O-Me-cAMP), einem selektiven Aktivator des cAMP nachgeschalteten Epac/Rap1-Signalweges, ein Anstieg des TER; außerdem konnte durch beide Substanzen (F/R und O-Me-cAMP) die Aktivierung von Rac1 induziert werden. Desweiteren wurde eine verstärkte Intensität und Linearisierung des Immunfluoreszenzsignals der Zelljunktionsproteine VE-Cadherin und Claudin5 entlang der Zellgrenzen beobachtet. In der ultrastrukturellen Analyse der interzellulären Kontaktzonen-Architektur zeigte sich unter F/R- oder O-Me-cAMP-Exposition ein signifikanter Anstieg an komplexen Interdigitationen. Diese komplexen Strukturen waren dadurch charakterisiert, dass sich die Membranen benachbarter Zellen, die durch zahlreiche endotheliale Junktionen stabilisiert wurden, über vergleichsweise lange Distanzen eng aneinanderlegten, so dass ein deutlich verlängerter Interzellularspalt resultierte. Die Inhibition der Rac1-Aktivierung durch NSC-23766 verminderte die Barrierefunktion und blockierte effektiv die O-Me-cAMP-vermittelte Barrierestabilisierung und Reorganisation der Kontaktzone einschließlich der Junktionsproteine. Demgegenüber konnte die F/R-vermittelte Barrierestabilisierung durch NSC-23766 nicht beeinträchtigt werden. Parallel dazu durchgeführte Experimente mit makrovaskulären Endothelien zeigten, dass es in diesem Zelltyp unter Bedingungen erhöhter cAMP-Konzentrationen weder zur Rac1-Aktivierung noch zur Barrierestärkung oder Kontaktzonen-Reorganisation kam. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in mikrovaskulären Endothelien Rac1-vermittelte Änderungen der Kontaktzonen-Morphologie zur cAMP-induzierten Barrierestabilisierung beitragen. N2 - Evidence exists that cAMP stabilizes the endothelial barrier in part via activation of the small GTPase Rac1. However, despite the high medical relevance of this signaling pathway, the mechanistic effects on intercellular contacts on the ultrastructural level are largely unknown. In microvascular endothelial cell monolayers, in which increased cAMP strengthened barrier properties similar to intact microvessels in vivo, both forskolin and rolipram (F/R) to increase cAMP and 8-(4-chlorophenylthio)-2´-O-methyladenosine-3´,5´-cyclic monophosphorothioate (O-Me-cAMP) to stimulate exchange protein directly activated by cAMP/Ras proximate-1 (Epac/Rap1) signaling enhanced transendothelial electrical resistance (TER) and induced activation of Rac1. Concurrently, augmented immunofluorescence intensity and linearization of signals at cell borders were observed for intercellular junction proteins VE-cadherin and claudin5. Ultrastructural analysis of the intercellular contact zone morphology documented that exposure to F/R or O-Me-cAMP led to a significant increase in the proportion of contacts displaying complex interdigitations of cell borders in which membranes of neighboring cells were closely apposed over comparatively long distances and which were stabilized by numerous intercellular junctions. Interference with Rac1 activation by NSC-23766 completely abolished both barrier stabilization and contact zone reorganization in response to O-Me-cAMP whereas F/R-mediated barrier enhancement was not affected by NSC-23766. In parallel experiments using macrovascular endothelium, increased cAMP failed to induce Rac1 activation, barrier enhancement and contact zone reorganization. These results indicate that in microvascular endothelium Rac1-mediated alterations in contact zone architecture contributes to cAMP-induced barrier stabilization. KW - Endothelbarriere KW - Endothelial barrier functions KW - Adhärens-/ Occludensjunktionen KW - cAMP KW - Rho GTPase KW - Rac1 KW - Epac KW - adherens tight junctions Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97787 ER -