TY - THES A1 - Zechner, Martin T1 - Quantifizierung morphologischer Veränderungen an Neuronen der lateralen Amygdala in SPRED2-defizienten Mäusen T1 - Quantification of morphological changes on lateral amygdala neurons in SPRED2-deficient mice N2 - In der vorliegenden Dissertation wurden die Folgen einer SPRED2-Defizienz in einem Knockout Mausmodell untersucht. Dabei wurde insbesondere die mögliche Verbindung zur Zwangsstörung, einer psychiatrischen Erkrankung beleuchtet. Das SPRED2-Protein kommt im menschlichen Körper in zahlreichen Geweben vor, besonders im Hirn wurde eine ubiquitäre Expression nachgewiesen und ein Zusammenhang mit der Neurogenese und neuronaler Differenzierung vermutet. Seine regulatorische Funktion besteht in einer inhibitorischen Wirkung auf den BDNF/TrkB-ERK-Signalweg, welcher u.a. für die Transkription neuronaler Gene verantwortlich ist. Die verwendeten SPRED2-defizienten Mäuse wurden durch Insertion eines Gene-Trap Vektors in das Spred2-Gen generiert. Die Insertion verhindert letztendlich die korrekte Translation des Proteins. Von der durch weitere Verpaarung entstehenden SPRED2-Knockout Mauslinie wurden ausschließlich männliche Tiere verwendet. Im Rahmen einer SPRED2-KO-Studie von der AG Schuh des Physiologischen Instituts der Universität Würzburg, die u.a. die Entgleisung der HHNA mit resultierendem erhöhten Stresshormonspiegel und eine Dysregulation des Mineralhaushaltshormons Aldosteron zeigte, wurden bei den Versuchstieren zwanghafte Verhaltensmuster beobachtet. Daraufhin wurden elektrophysiologische Messungen durchgeführt, die auf eine Anomalie in der synaptischen Übertragung zwischen Thalamus und Amygdala hindeuteten. Erhöhte Effizienz und Erregbarkeit der amygdaloiden Neuronen führten zu der morphologischen Untersuchung, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden. Da die Afferenzen des Thalamus vorwiegend in den lateralen Kern der Amygdala projizieren, wurde zunächst dieser betrachtet. Ziel der Untersuchung war es, Erkenntnisse darüber zu erlangen, ob der Knockout des SPRED2-Proteins in Mäusen zu einer veränderten Morphologie der Neuronen der lateralen Amygdala führt. Falls dies der Fall sein sollte, könnte damit zumindest ansatzweise das zwanghafte Verhalten der SPRED2-defizienten Mäusen erklärt werden. Die Hirne der Versuchstiere wurden nach der Golgi-Cox-Imprägnierung nach Glaser und Van der Loos und der Einbettung in Celloidin in 150 μm dicke Scheiben geschnitten und anschließend mithilfe eines Hellfeld-Mikroskops und des Neurolucida-Systems analysiert. Quantitativ erfasst und analysiert wurden pyramidale Klasse 1-Neuronen der lateralen Amygdala inklusive absoluter Anzahl und Dichte der Spines an ihren Dendriten. Die Untersuchung zeigte bei SPRED2-KO-Mäusen eine signifikante Erhöhung der mittleren Länge des apikalen Dendriten in Branch order 3 und eine tendenzielle Erhöhung der Gesamtzahl der Spines an den Dendriten in Branch order 1-3 gegenüber den Wildtyp-Mäusen. Daraus lässt sich folgern, dass ein Knockout des SPRED2-Proteins sich auf die Morphologie der Neuronen der lateralen Amygdala auswirkt. Die erhöhte mittlere Länge des apikalen Dendriten in Branch order 3 und die tendenziell erhöhte Spine-Anzahl korrelieren mit der gesteigerten synaptischen Übertragung und Erregbarkeit an amygdaloiden pyramidalen Neuronen. Auf molekularer Ebene kann die Hyperaktivität der lateralen Amygdala als Folge der fehlenden Inhibition des BDNF/TrkB-ERK-Signalwegs und der dadurch veränderten Expression zahlreicher synaptischer Proteine diskutiert werden. Die veränderte Morphologie der Neuronen in der lateralen Amygdala kann eine Ursache für das zwanghafte Verhalten der Mäuse sein, jedoch ist anzunehmen, dass Zwangsstörungen nicht bloß eine monokausale Ursache haben. Diese Arbeit identifiziert SPRED2 als neuen Regulator der Morphologie und Aktivität von Synapsen und die Amygdala als wichtige Hirnregion bei der Entstehung von Zwangsstörungen. SPRED2 ist somit ein vielversprechender Angriffspunkt für andere und spezifischere Untersuchungen der Hirnfunktion und eine potenzielle genetische Ursache für weitere neurologische Erkrankungen. N2 - In this present dissertation, the consequences of SPRED2-deficiency in a knockout mouse model have been investigated. In particular, the possible connection to the obsessive-compulsive disorder was examined. The SPRED2 protein is found in many tissues in the human body. Especially in the brain, ubiquitous expression was found and a connection to neurogenesis and neuronal differentiation was suspected. Its regulatory function is an inhibitory effect to the BDNF/TrkB-ERK signaling pathway, which amongst others is responsible for the transcription of neuronal genes. The SPRED2-deficient mice used were generated by insertion of a gene trap vector into the Spred2 gene. The insertion ultimately prevents the correct translation of the protein. From the SPRED2 knockout mouse line only male animals were used. As part of a SPRED2-KO study by AG Schuh of the Physiological Institute of the University of Würzburg, which showed, inter alia, the derailment of HHNA resulting in increased stress hormone levels and a dysregulation of the mineral household hormone aldosterone, obsessive behaviors were observed in the experimental animals. Subsequently, electrophysiological measurements were performed indicating an abnormality in synaptic transmission between thalamus and amygdala. Increased efficiency and excitability of the amygdaloid neurons led to the morphological investigation, which were accomplished in the context of this work. Since the afferents of the thalamus predominantly project into the lateral nucleus of the amygdala, it was first considered. The aim of the study was to find out if the knockout of the SPRED2 protein in mice leads to an altered morphology of neurons of the lateral amygdala. If so, it could at least somewhat explain the compulsive behavior of SPRED2-deficient mice. The brains of the test animals were cut into 150 μm slices and, after Golgi-Cox impregnation according to Glaser and Van der Loos, embedded in celloidin and then analyzed using a bright field microscope and the Neurolucida system. Quantitatively, pyramidal class 1 neurons of the lateral amygdala were recorded and analyzed, including the absolute number and density of the spines at their dendrites. The study showed a significant increase in the mean length of the apical dendrites in branch order 3 in SPRED2-KO mice and a tendency to increase the total number of spines on the dendrites in branch order 1-3 compared to the wild-type mice. It can be concluded that a knockout of the SPRED2 protein affects the morphology of the neurons of the lateral amygdala. The increased mean length of the apical dendrites in branch order 3 and the tendency to increased spine counts correlate with the increased synaptic transmission and excitability of amygdaloid pyramidal neurons. At the molecular level, the hyperactivity of the lateral amygdala may be discussed as a consequence of the lack of inhibition of the BDNF/TrkB-ERK pathway and the resulting altered expression of numerous synaptic proteins. The altered morphology of the neurons in the lateral amygdala may be a cause of the compulsive behavior of the mice, but it can be assumed that obsessive-compulsive disorder does not merely have a monocausal cause. This work identifies SPRED2 as a new regulator of morphology and activity of synapses and the amygdala as an important brain region in the development of obsessive-compulsive disorder. SPRED2 is thus a promising target for other and more specific studies of brain function and a potential genetic cause for other neurological disorders. KW - SPRED2 KW - OCD KW - Amygdala KW - SPRED2-defiziente Mäuse KW - Zwangsstörung KW - Ras-Raf-Signalweg Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-172291 ER - TY - THES A1 - Bandleon, Sandra T1 - Der Einfluss von FKBP52 auf die Funktion von TRPC3 Kanälen im Herzen T1 - Role of FKBP52 in the regulation of TRPC3 channels in the heart N2 - Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) Kanäle sind Ionenkanäle in der Plasmamembran und erlauben einen nicht selektiven Ca2+-Einstrom in die Zelle. Durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GqPCRs) wird dieser Ca2+-Einstrom erhöht, wodurch über Calmodulin, die Phosphatase Calcineurin aktiviert wird. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) wird durch Calcineurin dephosphoryliert und wandert in den Nucleus, wo er mit anderen Transkriptionsfaktoren interagiert und Hypertrophie-induzierende Gene aktiviert. TRPC3 ist hierbei eine der relevantesten Isoformen für die Entwicklung einer Myokardhypertrophie, wie sie im Rahmen zahlreicher kardiovaskulärer Erkrankungen zu finden ist. Eine kardiale Hypertrophie ist an der Pathogenese der Herzinsuffizienz beteiligt und stellt somit einen wichtigen Risikofaktor für den plötzlichen Herztod dar. Aus diesem Grund ist es von besonderer Bedeutung die Regulation von TRPC3 Kanälen und deren Einfluss auf hypertrophe Prozesse genauer zu untersuchen. In Vorversuchen wurde FK506 bindendes Protein 52 (FKBP52) als neuer Interaktionspartner von TRPC3 im Herzen gefunden. Die dabei gefundene FKBP52-Bindestelle von TRPC3 lag erstaunlicherweise außerhalb der zu erwartenden Bindestelle mit den vermeintlichen FKBP Bindemotiven. FKBP52 ist ein Immunophilin, das als cis/trans Isomerase fungiert und dadurch an der Regulation von verschiedenen Ionenkanälen beteiligt ist, darunter auch TRPC-Kanäle. Es zeigte sich, dass alle Domänen von FKBP52, bis auf die TPR3-Domäne und der C Terminus, in der Lage waren, mit TRPC3 zu interagieren. Aufgrund der Funktion der FKBPs und der Tatsache, dass TRPC3 eine Rolle in der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie spielt, sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob FKBP52 die Aktivität und die nachgeschalteten hypertrophen Signalwege von TRPC3 beeinflusst. Die Downregulation von FKBP52 führte zu einer verstärkten TRPC3-abhängigen hypertrophen Antwort in neonatalen Rattenkardiomyozyten (engl. neonatal rat cardiomyocytes, NRCs). Der gleiche Effekt war sowohl in NRCs und in adulten Rattenkardiomyozyten (engl. adult rat cardiomyocytes, ARCs) zu sehen, wenn Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPIase) defiziente Mutanten von FKBP52 überexprimiert wurde. Verkürzte FKBP52 Mutanten erhöhten ebenfalls die TRPC3-abhängige Aktivität von Calcineurin, was durch eine verstärkte Translokation von NFAT in den Nucleus von NRCs zu sehen war. Außerdem konnte in NRCs und in menschlichen embryonalen Nierenzellen (engl. human embryonic kidney cells, HEK 293 Zellen), die die PPIase defizienten Mutanten exprimierten, ein erhöhter Ca2+-Einstrom in die Zelle beobachtet werden. Das gleiche war nach Downregulation von FKBP52 in HEK 293 Zellen, die TRPC3 überexprimieren (T3.9 Zellen), zu sehen. Eine funktionelle Interaktion von FKBP52 und TRPC3 konnte auch in elektrophysiologischen Messungen bestätigt werden. Nach der Interaktion von TRPC3 mit den FKBP52 Mutanten zeigte sich eine erhöhte TRPC3-Aktivität. Die Daten zeigen somit, dass TRPC3-Kanäle durch FKBP52 reguliert werden und diese Regulation abhängig von der PPIase Funktion ist. Eine Interaktion von TRPC3 mit vollfunktionsfähigem FKBP52 könnte vor einer Ca2+-Überlastung und einer damit einhergehenden pathologischen Hypertrophie des Herzens schützen. N2 - Transient Receptor Potential (TRP; C-classical; TRPC) channels are ion channels in the plasma membrane which allow a non-selective Ca2+ influx into the cell. Stimulation of Gq-protein-coupled receptors (GqPCRs) increases the Ca2+ influx and activates the phosphatase calcineurin via calmodulin. Afterwards the transcription factor nuclear factor of activated T-cells (NFAT) is dephosphorylated by calcineurin and translocates to the nucleus, where it interacts with other transcription factors and activates hypertrophy-associated genes. TRPC3 is one of the most relevant isoforms of TRPC channels in the maladaptive hypertrophic program during chronic cardiac diseases. Hypertrophy can lead to the development of heart failure and is therefore an important risk factor for cardiac death. For this reason it is important to understand the regulation of TRPC3 channels in the heart and the influence of TRPC3 in hypertrophy. Preliminary experiments revealed FK506 binding protein 52 (FKBP52) as a novel interaction partner of TRPC3 in the heart. Surprisingly, the FKBP52 binding domain of TRPC3 was beyond the expected binding domain with the putative FKBP binding motifs. FKBP52 is an immunophilin which functions as cis/trans isomerase and is involved in the regulation of various ion channels, including TRPC channels. We demonstrated that all domains of FKBP52, except the TPR3 domain and the C-terminal region, interact with TRPC3. Due to the function of FKBPs and the fact that TRPC3 is important in development of cardiac hypertrophy, the aim of this work was to examine whether FKBP52 influences the activity and downstream hypertrophic signalling pathways of TRPC3. Downregulation of FKBP52 promoted an enhanced TRPC3-dependent hypertrophic response in neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The same effect could be seen by overexpression of peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase (PPIase) mutants of FKBP52 in NRCs and adult rat cardiomyocytes (ARCs). Additionally, the PPIase-deficient FKBP52 mutants increased the TRPC3-dependent activity of calcineurin, which was observed by enhanced translocation of NFAT into the nucleus of NRCs. We detected that the expression of the PPIase-deficient FKBP52 mutants in NRCs and human embryonic kidney cells (HEK 293 cells) increased the Ca2+ influx to the cells. A similar effect could be seen after downregulation of FKBP52 in HEK 293 cells overexpressing TRPC3 (T3.9 cells). A functional interaction of FKBP52 and TRPC3 was also confirmed in electrophysiological measurements. The interaction of TRPC3 with the FKBP52 mutants promoted an increased TRPC3 activity. The data demonstrate that TRPC3 channels are regulated by FKBP52 and that this regulation depends on the PPIase function. An interaction of TRPC3 with functional FKBP52 could protect against Ca2+ overload and Ca2+-associated pathological hypertrophy of the heart. KW - Hypertrophie KW - Calciumkanal KW - TRPC3 KW - FKBP52 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210083 ER - TY - THES A1 - Hilz, Teresa Magdalena T1 - Die antiapoptotischen Effekte der Pim-1 Kinase im Rahmen der ischämischen und Desfluran-induzierten Postkonditionierung T1 - Antiapopiotic Effects of ishemic- and Desflurane-induced postconditioning are mediated by Pim-1 Kinase N2 - Die antiapoptotischen Effekte der Pim-1 Kinase im Rahmen der ischämischen und Desfluran-induzierten Postkonditionierung N2 - Antiapopiotic Effects of ishemic- and Desflurane-induced postconditioning are mediated by Pim-1 Kinase KW - Pim-1 Kinase KW - Postkonditonierung Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-153998 ER - TY - THES A1 - Augustin, Anne Marie T1 - Auswirkung der SPRED2-Defizienz auf die kardiale Funktion und Beeinflussung durch die Behandlung mit dem Aldosteronantagonisten Eplerenon T1 - Impact of SPRED2-deficiency on cardiac function and influence through treatment with aldosterone receptor antagonist eplerenone N2 - SPRED2 ist ein Inhibitor des Ras/ERK-MAPK-Signalwegs. Um die Folgen einer SPRED2-Defizienz zu erforschen, wurden im Rahmen vorheriger von Ullrich et al. durchgeführter Untersuchungen mittels Gene-Trap-Methode bereits mannigfaltige Auffälligkeiten im Phänotyp der SPRED2-Mäuse festgestellt. So zeigten die Tiere einen Hypochondroplasie-ähnlichen Zwergenwuchs, Verhaltensauffälligkeiten, einen krankhaft gesteigerten Wasserkonsum und nicht zuletzt eine deutlich reduzierte Lebenserwartung im Vergleich mit den WT-Tieren. Des Weiteren fielen erhöhte Aldosteronspiegel auf, die bei näheren Untersuchungen nicht einer erhöhten Aktivität des RAAS geschuldet zu sein schienen. Vielmehr zeigte sich eine deutlich erhöhte Aldosteron-Synthase-Expression in der Nebennierenrinde. Erste Hinweise darauf, dass die SPRED2-Defizienz auch Auswirkungen auf den kardiologischen Phänotyp haben könnte, ergaben sich bereits bei initialen Untersuchungen von Ullrich et al. So konnte bei den SPRED2-KO-Tieren neben hämodynamischer Auffälligkeiten eine gesteigerte Herz-Körpergewicht-Ratio festgestellt werden. Die im Rahmen dieses Folgeprojekts durchgeführten Untersuchungen sollten die Frage klären, ob die Defizienz des SPRED2-Gens Auswirkungen auf die Herzleistung hat und hierüber die verkürzte Lebenserwartung der KO-Tiere verschulden könnte. Hierfür wurden zunächst Untersuchungen der elektrischen kardialen Aktivität mittels EKG und Elektrophysiologischer Untersuchung durchgeführt. Die Ermittlung von Herzrhythmusstörung und die Quantifizierung derselben spielte hierbei eine besondere Rolle. Des Weiteren sollte mit der Durchführung von PSR-Färbungen zur Bestimmung des kardialen Kollagengehaltes histologischen Fragestellungen Rechnung getragen werden. Aufgrund des bereits aus den vorherigen Studien bekannten Hyperaldosteronismus der KO-Tiere stellte sich darüber hinaus die Frage, ob die im Rahmen der Studie feststellbaren kardiologischen Auffälligkeiten als Konsequenz der gesteigerten Aldosteronwerte, oder aber als direkte Folge des Genotyps gewertet werden müssen. Aus diesem Grund wurden alle oben genannten Untersuchungen mit Tieren, welche einer Behandlung mit dem Aldosteronantagonisten Eplerenon zugeführt worden waren, wiederholt. Bei der Auswertung der basalen Ruhe- und Stress-EKGs zeigten sich einige Parameter bei den KO-Tieren pathologisch verändert. So war das QRS-Intervall, als Korrelat zur intraventrikulären Überleitungszeit, bei den KO-Mäusen verlängert, im Stress-EKG waren darüber hinaus sowohl die Dauer der P-Welle als auch des PQ-Intervalls erhöht. Durch die Behandlung mit Aldosteron waren diese Unterschiede zwischen WT- und KO-Gruppe teilweise nicht mehr feststellbar. Das die atrioventrikuläre Überleitungszeit abbildende PQ-Intervall war sowohl im Vergleich mit dem behandelten WT, als auch mit dem unbehandelten WT nicht mehr signifikant erhöht. Auch die Länge des QRS-Komplexes näherte sich unter Eplerenon-Behandlung dem der unbehandelten WT-Tiere an und sank bei der Stress-EKG-Auswertung sogar unterhalb des Signifkanzniveaus. Bei der EKG-Analyse in Bezug auf Arrhythmien ergab sich bei Gegenüberstellung der basalen WT- und KO-Gruppe eine deutlich gesteigerte Vulnerabilität für Herzrhythmusstörungen bei den KO-Tieren. Durch die Behandlung mit Eplerenon konnte hierbei ein deutlicher Erfolg erzielt werden mit signifikanter Reduktion der Arrhythmieereignisse. Die elektrophysiologische Untersuchung ergab neben unauffälligen Parametern der Funktion des Sinusknotens und der AV-Überleitung ebenfalls Hinweise für eine gesteigerte Empfindlichkeit für Arrhythmien. Die durch EPU induzierten Arrhythmien zeigten sich durch Eplerenon-Behandlung gleichermaßen rückgängig. Mittels Kollagenfärbung konnte der initiale Verdacht, dass die SPRED2-KO-Tiere zu einer vermehrten kardialen Fibrosierung neigen, bestätigt werden. Dabei zeigte sich durch die Behandlung mit Eplerenon eine deutliche Beeinflussung und Reduktion des kardialen Kollagengehaltes. Insgesamt lässt sich schlussfolgern, dass die mannigfaltigen phänotypischen Effekte, die die SPRED2-Defizienz bedingt, nur teilweise dem Hyperaldosteronismus der Tiere geschuldet sind und durch therapeutische Einflussnahme auf diesen auch nur partiell kompensiert werden können. N2 - SPRED proteins are inhibitors of the Ras/ERK/MAPK signaling pathway, an evolutionary highly conserved and very widespread signaling cascade regulating cell proliferation, differentiation, and growth. To elucidate physiological consequences of SPRED2 deficiency, SPRED2 KO mice were generated by a gene trap approach and heart investigations were systematically performed. An initial phenotypical characterization in studies of Ullrich et al showed a hypochondroplasia-like dwarfism, abnormally high water uptakes, behavioural syndromes with excessive grooming and reduced survival times. Also, investigations revealed hyperaldosteronism in SPRED2 KO mice with doubled serum aldosterone as compared with WT mice. Systematic investigation of contributing upstream hormone axes demonstrated, that hyperaldosteronism developed independently of an overactivated Renin-Angiotensin system as indicated by halved serum Ang II levels in KO mice. However, aldosterone synthase expression in the adrenal gland was substantially augmented. First indications for cardiac pathologies in SPRED KO mice resulted from initial cardiac tests of Ullrich et al., revealing enlarged hearts with elevated heart weight/body weight ratios, as well as increased stroke volumes in KO mice. To investigate whether the cardiac phenotype and the reduced survival time is a consequence of the genotype or secondary due to hyperaldosteronism, electrocardiograms, electrophysiological studies, both with arrhythmia analysis, as well as PSR-stainings, were performed with untreated mice, as well as animals after eplerenone treatment. Some ECG-parameters showed significant differences, for example QRS-interval was prolonged in KO-mice, as correlation for ventricular conduction time. Under isoproterenol stimulation, p-wave duration as well as PQ-interval revealed to be extended. These differences showed to be reduced due to eplerenone treatment, in case of PQ-time and QRS-interval after isoproterenol stimulation, even in significant dimension. Concerning the arrhythmia analysis in ECG and EPU, results showed a distinctly increased vulnerability for arrhythmias in KO-mice, which could be influenced with eplerenone treatment. EP studies revealed no significant differences regarding function of sinus and atrioventricular node, but, analogous to ECG-studies, significant more and severe arrhythmias could be detected in KO-mice, which could be clearly reduced with eplerone. By use of Picro-sirius red staining as a tool to appraise collagen fibers, a significant higher amount of collagen in heart slices of KO-mice could be proved, while treatment with eplerenone reduced fibrosis distinctly, both in WT and in KO-mice. In summary, manifold phenotypical characterizations of SPRED2 KO mice showed to be only partially result of the hyperaldosteronism and revealed only partial influence due to eplerenone treatment. KW - Spred-Proteine KW - Renin-Angiotensin-System KW - Aldosteronantagonist KW - Herzfunktion KW - MAP-Kinase KW - Gen-Knockout KW - Renin-Angiotensin-Aldosteron-System KW - heart KW - aldosterone Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-166029 ER - TY - THES A1 - Neuser, Julia T1 - Die Rolle der Pim-1 Kinase im Zweiten Fenster der Anästhetika-induzierten Präkonditionierung T1 - The role of Pim-1 kinase in the Second Window of Anaesthetic-induced Preconditioning N2 - Der Myokardinfarkt zählt weltweit zu den Hauptursachen für Tod und Erwerbsunfähigkeit. Große Bedeutung kommt der Untersuchung kardioprotektiver Mechanismen und der Etablierung kardioprotektiver Strategien zu. Die Anästhetika-induzierte Präkonditionierung weist einen biphasichen Verlauf auf und lässt sich in eine frühe und eine späte Phase (Zweites Fenster) einteilen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Pim-1 Kinase im Zweiten Fenster der Desfluran-induzierten Präkonditionierung gegen Myokardinfarkt in einem murinen in-vivo Herzinfarktmodell untersucht. N2 - Myocardial infarction is a leading cause of mortality and morbidity worldwide. The investigation of cardioprotective mechanisms and establishing cardioprotective strategies is of great significance. Anaesthetic-induced preconditioning has a biphasic course with an early phase and a late phase (Second Window). In this manuscript the role of the pim-1 kinase was investigated in the Second Window of Desflurane-induced Preconditioning against myocardial infarction in a murine in-vivo modell. KW - Präkonditionierung KW - Myokardprotektion KW - preconditioning Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-212866 ER - TY - THES A1 - Hellwig, Nico T1 - Implementierung eines Herzinfarktnetzes im ländlichen Raum mit Hilfe der FITT-STEMI-Studie T1 - Implementation of a heart attack network in rural areas with the help of the FITT-STEMI study N2 - Ziel der Doktorarbeit war die Implementierung eines Herzinfarktnetzes im ländlichen Raum mit Hilfe der FITT-STEMI-Studie und damit die Optimierung der Abläufe der Behandlungen und Verbesserung der Prognose der Patienten. Die Ergebnisse wurden quartalsweise mit den beteiligten Berufsgruppen wie Notärzten, Sanitätern, Personal der Intensivstation, den einweisenden Kliniken etc. besprochen und so ein Netzwerk aufgebaut. Dadurch konnte das Einzugsgebiet erweitert werden, die Primärtransporte nahmen von 54 auf 65 % und die telefonischen Infarktankündigungen von 43 auf 80 % zu, zudem konnte die door-to-catheter-Zeit bei Primärtransporten von 40 auf 23 min. gesenkt werden. N2 - The aim of the doctoral thesis was the implementation of a heart attack network in rural areas with the help of the FITT-STEMI study, thus optimizing the treatment processes and improving the prognosis of patients. The results were discussed on a quarterly basis with the occupational groups involved, such as emergency physicians, paramedics, ICU staff, referring clinics, etc., thus creating a network. This allowed the catchment area to be expanded, primary transports increased from 54% to 65% and telephone infarct announcements increased from 43% to 80% Addictionally the door-to-catheter time for primary transports decreased from 40 minutes to 23 minutes. KW - STEMI KW - Herzinfarktnetz KW - FITT-STEMI-Studie Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184414 N1 - aus dem Akademischen Lehrkrankenhaus der Universität Würzburg, Krankenhaus Rothenburg o.d.T. ER - TY - THES A1 - Neuser, Jonas Georg T1 - Pentaerythrityltetranitrat-Therapie bei experimentellem chronischem Herzinfarkt durch Koronarligatur in Ratten : Einfluss auf Remodeling, Hämodynamik und Redox-Stoffwechsel T1 - Pentaerythrityltetranitrate Therapy in Experimental Chronic Myocardial Infarction due to Coronary Artery Ligation in Rats N2 - Obwohl die Herzinsuffizienz eine sehr häufige Erkrankung darstellt, ist deren Entwicklung nicht vollständig verstanden und die Notwendigkeit für weitere Therapieoptionen gegeben. Die Forschungen der letzten Jahre haben dem Redox-­‐ Stoffwechsel eine führende Rolle zugeschrieben. Ziel dieser Arbeit war es, das kardiale Remodeling bei Herzinsuffizienz sowie die Möglichkeit der therapeutischen Beeinflussung mit dem organischen Nitrat Pentaerythrityltetranitrat zu untersuchen. Hierfür wurde bei Ratten ein Infarkt induziert und ab dem achten Tag nach der Infarzierung ein Placebo beziehungsweise das Verum Pentaerythrityltetranitrat verabreicht. Nach neun Wochen wurden hämodynamische Messungen durchgeführt, in einem Aortensegment die Superoxidanionenspiegel erfasst, Immunhistologische Studien des Myokards angefertigt und Aortengewebe mittels Gelelektrophorese und Western Blotting molekulargenetisch untersucht. Bei letzterem lag ein Schwerpunkt auf am Redox-­‐Stoffwechsel beteiligten Enzymen. Bei den Ergebnissen der hämodynamischen Messungen wiesen die scheinoperierten Tiere in nahezu allen Parametern signifikant bessere Werte als die infarzierten Tiere auf. Jedoch zeigte sich, dass unter Verum Kontraktilität, Ejektionsfraktion sowie das LVESV der infarzierten Tiere signifikant besser waren als unter Placebo. Die Kollagenablagerung war durch die Pentaerythrityltetranitrattherapie vermindert, die Angiogenese erhöht. Die Superoxidanionenspiegel im Herzen und der Aorta lagen bei Verumgabe nahezu auf dem Niveau der scheinoperierten Tiere. Die Expression der antioxidativ wirkenden Enzyme HO-­‐1, MnSOD und eNOS war durch Pentaerythrityltetranitrat signifikant gesteigert. Die erhobenen Daten lassen somit einen ergänzenden therapeutischen Effekt von Pentaerythrityltetranitrat in der Herzinsuffizienztherapie vermuten. N2 - Reduced NO bioavailability is reduced in ischemic heart disease and heart failure. We therefore investigated the effects of the organic nitrate pentaerythrityltetranitrate (PETN) in rats suffering from heart failure due to chronic myocardial infarction by coronary artery ligation. Myocardial superoxide anion formation and also myocardial fibrosis were attenuated by PETN leading to improved left ventricular remodeling and function KW - Pentaerythrityltetranitrat KW - Pentaerythrityltetranitrat KW - Chronische Herzinsuffizienz KW - Myokardinfarkt KW - Myokardiales Remodeling KW - Redox-Stoffwechsel Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103670 ER - TY - THES A1 - Snitko, Mariya T1 - Identifizierung neuer Dengue Virus Typ-2 Proteaseinhibitoren T1 - Identification of new dengue virus serotype 2 protease inhibitors N2 - Weltweit leben ca. 2,5 Mrd. Menschen im Dengue Virus Verbreitungsgebiet. Dengue Virus Infektionen führen zum Dengue Fieber und können bei Re-Infektionen mit anderen Serotypen das sog. Dengue Schocksyndrom mit einer Letalität von 10% verursachen. Momentan stehen jedoch weder Impfstoffe noch antivirale Substanzen zur Verfügung. In der vorliegenden Arbeit sollten DENV2-Proteaseinhibitoren entwickelt werden. Dazu wurde ein in vitro DENV Proteasetest etabliert, für den die DENV Protease in Bakterien exprimiert und anschließend gereinigt wurde. Mit diesem System wurden 144 Verbindungen getestet und Diaryl-Thioether, Thiazole und Zimtsäurederivate als Dengue PIs charakterisiert. Ein Diarythioether (FM 47) wurde an die Proteasestruktur modelliert und nach den Strukturdaten zielgerichtet derivatisiert. Diese Derivate ihibierten die Protease im mikromolaren Bereich und wurden anschließend in einer Zellkultur getestet. Drei Substanzen - HWu 11, HWu 51, HWu 62 - zeigten gute bis sehr gute Hemmung in vivo bei 2,5 μM. Die Charakterisierung der Inhibitoren zeigte eine nicht-kompetitive Hemmung. Die gefundenen Substanzen bilden eine gute Grundlage für die weitere Inhibitorforschung. N2 - About 2,5 billion people live in dengue virus endemic area. There is neither a established medical treatment or vaccine for dengue virus infection. The Dengue virus protease represents a prime target for rational drug design. Here, I report the development of a fluorometric dengue virus protease test and the screening of a library of potential dengue virus protease inhibitors, which resulted in the identification of several substances inhibiting the dengue protease with IC50 values in the low micromolar range. Among these, three diaryl thioethers were shown to be potent non-competitive inhibitors, which blocked DENV replication in cell culture in the submicromolar range KW - Proteaseinhibitor KW - Dengue KW - Virus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112502 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Alexandra T1 - Beeinflussung des Na+-D-Glukose-Kotransporters SGLT1 und der Na+-Nukleosidtransporter CNT durch Peptidmotive des Regulatorproteins RS1 im Darm T1 - Effects of RS1-derived peptides on Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and Na+- nucleoside cotransporters CNTs in small intestine N2 - Der Natrium-D-Glukose Kotransporter 1 (SGLT1) spielt eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Glukose aus dem Darmlumen in die Enterozyten des Darms. Anhand von Untersuchungen an Xenopus laevis-Oozyten konnte in unserem Labor das Protein RS1 als posttranslationales Regulatorprotein für SGLT1 und diverse andere Transporter ermittelt werden. Es wurde eine regulatorische Domäne aus RS1 mit vielen potentiellen Phosphorylierungsstellen isoliert (RS1-Reg) und gezeigt dass RS1-Reg die Abschnürung von Transporter enthaltenen Vesikeln vom Transgolgi-Netzwerk hemmt. Neben SGLT1 reguliert RS1 auch die konzentrierenden Nukleosidtransporter (CNTs) am TGN. Die Regulation der Transporter ist vom Phosphorylierungszustand von RS1-Reg abhängig. So wurde durch Versuche an Oozyten von Xenopus laevis und Injektion von RS1-Reg Mutanten gezeigt, dass die Phosphorylierung von RS1-Reg an einigen Stellen zu einer Inhibition von SGLT1 führte, während der Nukleosidtransporter CNT1 durch die dephosphorylierte Mutante herunterreguliert wurden. Neben der phosphorylierungsabhängigen Regulation konnte für SGLT1 auch gezeigt werden, dass die Herunterregulation nur unter Niedrigzucker-Bedingungen erfolgte, nicht jedoch bei hohen Glukosekonzentrationen. Für die CNTs war eine derartige Zuckerabhängigkeit nicht zu beobachten. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob die Ergebnisse aus den Oozytenmessungen auch in vivo in einem Säugetier gezeigt werden können. Hierzu wurden Mutanten der regulatorischen Domäne (RS1-Reg) des Maus-Proteins, welche den phosphorylierten Zustand simulierten (RS1-Reg (S19E)), oder die Phosphorylierung verhinderten (RS1-Reg (S19A)) eingesetzt. Diese wurden an ein Nanohydrogel gekoppelt, um eine Aufnahme in die Enterozyten im Darm zu gewährleisten. Es wurde in der RS1KO-Mausohne funktionelles RS1 gezeigt, dass auch im in vivo-System eine Herunterregulation von SGLT1 durch mRS1-Reg (S19E), nicht jedoch durch mRS1-Reg (S19A) erfolgte, während die CNTs nur durch mRS1-Reg (S19A) inhibiert wurden. Des Weiteren führte mRS1-Reg (S19A) in der Wildtypmaus bei niedrigen Zuckerkonzentrationen zu einer Stimulation von SGLT1, was für eine Kompetition mit dem endogenen RS1-Proteins spricht. Es konnte indirekt der Beweis erbracht werden, dass über Nanohydrogele längere Proteine in die Zelle gebracht werden können und dort funktionell freigesetzt werden. N2 - The Sodium-D-glucose cotransporter 1 (SGLT1) is important for the uptake of glucose from the intestinal lumen into the enterocytes. In experiments with Xenopus-laevis oocytes, which were performed in our laboratory, we identified protein RS1 as a regulatory protein for SGLT1. A sequence of 80 aminoacids was identified to be the regulatory domain of RS1 (RS1-Reg) and prevents the constriction of transporter-containing vesicles from the transgolgi-network (TGN). Besides SGLT1, RS1 is able to regulate concentrative nucleoside transporters (CNTs) and the organic cation transporter 2 (OCT2). The regulation of the transporters depends on the phosphorylation-state of RS1-Reg. While SGLT1 is inhibited by the phosphorylated form of the regulatory domain, CNTs are regulated by the dephosphorylated form. In addition, the regulation of SGLT1 depends on the glucose concentration of the cells. RS1 only inhibits SGLT1 under low glucose conditions, while the regulation of CNTs is independent of glucose. In the following study we analyzed whether the results of the oocyte measurements could be reproduced in vivo. For this, we used mutants of the mouse regulatory domain (mRS1-Reg). In one mutant, the phosphorylation was mimicked (mRS1-Reg (S19E)), in a second mutant, phosphorylation was prevented (mRS1-Reg (S19A)). The mutants were coupled to nanohydrogels, to enable the uptake into enterocytes. By usage of a mouse-strain without functional RS1 and a wildtype-mouse-strain, I was able to discriminate between direct effects of the mutant and competition of mutants with endogenous RS1. Only mRS1-Reg (S19E) down regulates SGLT1, but not mRS1-Reg (S19A), while CNTs were downregulated by mRS1-Reg (S19A) but not by mRS1-Reg (S19E). In the wildtype-mouse mRS1-Reg (S19A) leads to an increase of SGLT1-activity which could be due to a competition with the endogenous RS1. The fact, that some peptides were able to regulate transporters leads to the conclusion, that longer proteins can be transported into cells by nanohydrogels and that these proteins are released in the cells in a functional active state. KW - Glucosetransport KW - SGLT1 KW - RS1 KW - Regulation KW - Glatter Krallenfrosch KW - Oozyte KW - Glucosetransportproteine KW - Darm Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127394 ER - TY - THES A1 - Guerrero González, Hans T1 - Quantifizierung von prä- und postsynaptischen Protein-Veränderungen in der Amygdala-Region in SPRED2-defizienten Mäusen T1 - Quantification of pre- and postsynaptic protein-alterations in the amygdala-region in SPRED2-deficient mice N2 - SPRED2 ist ein Membran-assoziiertes Protein, das als wichtiger Regulator der Zelle fungiert. Es übt eine inhibitorische Wirkung auf dem Ras/ERK/MAPK-Signalweg und ist u.a. in der Neurogenese im zentralen Nervensystem beteiligt. Durch diverse Verhaltenstests in SPRED2-KO Mäusen konnten OCD-ähnliche Symptome bei den Tieren festgestellt werden sowie eine vermehrte Aktivität in thalamo-amygdalen Synapsen. Zur weiteren Abklärung dieser synaptischen Dysfunktion, wurde eine Quantifizierung von prä- und postsynaptischen Protein-Veränderungen in der Amygdala-Region in SPRED2-defizienten Mäusen im Vergleich zur Wildtyp Mäusen durchgeführt. Hier konnten signifikante Unterschiede festgestellt werden. N2 - SPRED2 is a membran associated protein that functions as an important cell-regulator. It has an inhibitory effect on the Ras/ERK/MAPK signaling pathway and is involved in neurogenesis of the central nervous system. Various behavioral tests in the SPRED2-KO mice displayed signs of OCD-behavior and showed an increased activity in thalamo-amygdal synapses. To further explain this synaptic dysfunction, a quantification of pre- and postsynaptic protein-alterations in the amygdala region was carried out in SPRED2-KO Mice. We were able to show significant difference between both groups. KW - Spred-Proteine KW - SPRED2 KW - OCD Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216701 ER - TY - THES A1 - Lausenmeyer, Eva Maria T1 - Einfluss von Fractalkin und mfg-e8 auf die Thrombozytenaktivierung und ihre Interaktion mit pharmakologischen Thrombozytenaggregationshemmern T1 - Impact of fractalkin and mfg-e8 on platelet activation and their interaction with pharmacologic platelet inhibitors N2 - Die genauen Mechanismen der frühen Atheroskleroseentstehung sind Thema intensiver Forschungsarbeit. Hierbei hat sich in den letzten Jahren eine zunehmend wichtige Rolle für Thrombozyten herauskristallisiert. Sie spielen nicht nur in der Hämostase, sondern auch bei immunologischen und entzündlichen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Aktivierte Blutplättchen interagieren auf vielfältige Weise mit unterschiedlichen Zellen ihrer Umgebung – Endothelzellen, glatten Muskelzellen oder Leukozyten – wodurch es auf beiden Seiten zur Freisetzung von Botenstoffen und nachfolgend zur Aktivierung diverser Signalwege kommt. Auf der Thrombozytenoberfläche finden sich u.a. Rezeptoren für das Chemokin Fractalkin (CX3CL1). Dieses wurde bereits mit Thrombozytenaktivierung und Leukozytenadhäsion am Endothel in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der thrombozytäre ADP-Rezeptor P2Y12 und der Rezeptor für Fractalkin, CX3CR1, eine ähnliche intrazelluläre G-Protein-Kopplung und Signalkaskade aufweisen, die in der Aktivierung der PI3K mündet. Der Effekt ist unabhängig von einer ADP-Zugabe und wird über G vermittelt, so dass hierüber eine Blockung des P2Y12-Rezeptors durch z.B. Clopidogrel umgangen werden könnte. Des Weiteren ist bekannt, dass Fractalkin die Expression des Glykoproteins mfg-e8 beeinflusst. Inwiefern mfg-e8 einen Einfluss auf Thrombozyten hat, ist bislang nur unzureichend erforscht. In der vorliegenden Arbeit konnte eine proaktivierende Wirkung von mfg-e8 auf Thrombozyten nachgewiesen werden: Sowohl im Western blot (Aktivierung der PI3K) wie auch durchflusszytometrisch (Aktivierung des GPIIb/IIIa). Unter arteriellen Flussbedingungen schwächte mfg-e8 die Bindung von Thrombozyten an Fibrinogen-beschichtete Oberflächen ab. Welche Rezeptoren an dieser Interaktion beteiligt sind, ist derzeit nicht geklärt. Sowohl mfg-e8 als auch Fractalkin stellen interessante, thrombozytenaktivierenden Substanzen dar, deren Einfluss aufeinander und auf das Gefäßsystem weiterführender Untersuchung bedarf. N2 - Platelets are crucially involved in early development of atherosclerosis. They interact with multiple cells in their environment which activates diverse signalling pathways. On the platelet surface chemokine receptors, amongst others, receptors for fractalkine (CX3CL1), can be found. Here, we show for the first time that ADP-receptor P2Y12 and fractalkine-receptor CX3CR1 have a similar intracellular pathway which leads to activation of PI3K. Once released from an atherosclerotic lesion, this mechanism could contribute locally to impaired clopidogrel responsiveness at the vulnerable plaque. Furthermore, fractalkine influences the expression of glycoprotein mfg-e8. We prove a pro-activating effect of mfg-e8 on platelets in Western Blot and flow cytometry. Yet, the detailed mechanism and the involved receptors still remain unclear. KW - Thrombozytenaggregationshemmung KW - Fractalkin KW - mfg-e8 KW - ADP-Rezeptor KW - Atherosklerose KW - CX3CR1 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134469 ER - TY - THES A1 - Hundertmark, Moritz Jens T1 - Die Bedeutung des Eya4-Signalweges für die Entstehung und Entwicklung von Herzkrankheiten T1 - Significance of the transcriptional coactivator Eya4 in development of cardiac disease N2 - Diese Arbeit untersucht die Relevanz des Transkriptionskofaktors Eya4 in der Entstehung und Entwicklung von Herzkrankheiten. Hierzu wurde, neben adenoviralen Transfektionsarbeiten in neonatalen Rattenkardiomyozyten, ein transgenes Mausmodell etabliert, wodurch die Identifikation von Downstreamtargets des Transkriptionskofaktors Eya4 im Sinne eines Signalweges ermöglicht wurde. Der Transkriptionskofaktor Eya4 wirkt als Suppressor des cyclinabhängigen Kinaseinhibitors p27, während die trunkierende Mutante des wildtypischen Proteins (E193) die Suppression auf p27 aufhebt.Phänotypisch entwickeln E193-überexprimierende Mäuse eine altersabhängig einsetzende DCM während die Eya4-überexprimierenden Tiere eine konzentrische Myokardhypertrophie entwickeln. N2 - This work researches the significance of the transcriptional coactivator Eya4 and its involvement in cardiac disease. By adenoviral transfection of neonatal rat cardiomyocytes as well as creation of a transgenic mouse model, different downstream targets of Eya4 could be identified working in a complex signaling cascade to regulate development of myocardial hypertrophy. Consecutively Eya4-transgenic animals developed a cardiac phenotype with concentric hypertrophy while E193-overexpressing mice developed a DCM-phenotype, mimicing the human disease known in E193-affected humans. KW - Eya4 KW - Herzinsuffizienz KW - DCM KW - E193 KW - Heart failure KW - Dilated Cardiomyopathy Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102257 ER - TY - THES A1 - Ullrich, Melanie T1 - Identification of SPRED2 as a Novel Regulator of Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis Activity and of Body Homeostasis T1 - SPRED2 - Ein neuer Regulator der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrindenachse und der Hormonbalance N2 - SPRED proteins are inhibitors of the Ras/ERK/MAPK signaling pathway, an evolutionary highly conserved and very widespread signaling cascade regulating cell proliferation, differentiation, and growth. To elucidate physiological consequences of SPRED2 deficiency, SPRED2 KO mice were generated by a gene trap approach. An initial phenotypical characterization of KO mice aged up to five months identified SPRED2 as a regulator of chondrocyte differentiation and bone growth. Here, the loss of SPRED2 leads to an augmented FGFR-dependent ERK activity, which in turn causes hypochondroplasia-like dwarfism. However, long term observations of older KO mice revealed a generally bad state of health and manifold further symptoms, including excessive grooming associated with severe self-inflicted wounds, an abnormally high water uptake, clear morphological signs of kidney deterioration, and a reduced survival due to sudden death. Based on these observations, the aim of this study was to discover an elicitor of this complex and versatile phenotype. The observed kidney degeneration in our SPRED2 KO mice was ascribed to hydronephrosis characterized by severe kidney atrophy and apoptosis of renal tubular cells. Kidney damage prompted us to analyze drinking behavior and routine serum parameters. Despite polydipsia, which was characterized by a nearly doubled daily water uptake, the significantly elevated Na+ and Cl- levels and the resulting serum hyperosmolality could not be compensated in SPRED2 KOs. Since salt and water balance is primarily under hormonal control of aldosterone and AVP, we analyzed both hormone levels. While serum AVP was similar in WTs and KOs, even after experimental water deprivation and an extreme loss of body fluid, serum aldosterone was doubled in SPRED2 KO mice. Systematic investigation of contributing upstream hormone axes demonstrated that hyperaldosteronism developed independently of an overactivated Renin-Angiotensin system as indicated by halved serum Ang II levels in KO mice. However, aldosterone synthase expression in the adrenal gland was substantially augmented. Serum corticosterone, which is like aldosterone released from the adrenal cortex, was more than doubled in SPRED2 KOs, too. Similar to corticosterone, the production of aldosterone is at least in part under control of pituitary ACTH, which is further regulated by upstream hypothalamic CRH release. In fact, stress hormone secretion from this complete hypothalamic-pituitary-adrenal axis was upregulated because serum ACTH, the mid acting pituitary hormone, and hypothalamic CRH, the upstream hormonal inductor of HPA axis activity, were also elevated by 30% in SPRED2 KO mice. This was accompanied by an upregulated ERK activity in paraventricular nucleus-containing hypothalamic brain regions and by augmented hypothalamic CRH mRNA levels in our SPRED2 KO mice. In vitro studies using the hypothalamic cell line mHypoE-44 further demonstrated that both SPRED1 and SPRED2 were able to downregulate CRH promoter activity, CRH secretion, and Ets factor-dependent CRH transcription. This was in line with the presence of various Ets factor binding sites in the CRH promoter region, especially for Ets1. Thus, this study shows for the first time that SPRED2-dependent inhibition of Ras/ERK/MAPK signaling by suppression of ERK activity leads to a downregulation of Ets1 factor-dependent transcription, which further results in inhibition of CRH promoter activity, CRH transcription, and CRH release from the hypothalamus. The consecutive hyperactivity of the complete HPA axis in our SPRED2 KO mice reflects an elevated endogenous stress response becoming manifest by excessive grooming behavior and self-inflicted skin lesions on the one hand; on the other hand, in combination with elevated aldosterone synthase expression, this upregulated HPA hormone release explains hyperaldosteronism and the associated salt and water imbalances. Both hyperaldosteronism and polydipsia very likely contribute further to the observed kidney damage. Taken together, this study initially demonstrates that SPRED2 is essential for the appropriate regulation of HPA axis activity and of body homeostasis. To further enlighten and compare consequences of SPRED2 deficiency in mice and particularly in humans, two follow-up studies investigating SPRED2 function especially in heart and brain, and a genetic screen to identify human SPRED2 loss-of-function mutations are already in progress. N2 - SPRED-Proteine sind Inhibitoren des hochkonservierten und in allen Geweben verbreiteten Ras/ERK/MAPK-Signalwegs, welcher Proliferation, Differenzierung und das Wachstum von Zellen reguliert. Um physiologische Konsequenzen der SPRED2-Defizienz im lebenden Modellorganismus aufzuklären, haben wir SPRED2-KO-Mäuse mithilfe der „gene trap“-Methode generiert. Eine erste Studie zur phänotypischen Charakterisierung mit KO-Mäusen bis zu einem Alter von fünf Monaten identifizierte SPRED2 als Regulator der Chondrozytendifferenzierung und des Knochenwachstums. So bewirkt der Verlust der SPRED2-Proteinfunktion eine erhöhte FGFR-vermittelte ERK-Aktivität, was wiederum einen Hypochondroplasie-ähnlichen Minderwuchs verursacht. Allerdings offenbarten Langzeitbeobachtungen älterer KO-Mäuse einen im Allgemeinen sehr schlechten Gesundheitszustand und weitere facettenreiche Symptome, darunter exzessives Putzverhalten mit schweren, selbst zugefügten Wunden, einen abnorm hohen täglichen Wasserkonsum, klare morphologische Anzeichen einer Nierenschädigung und eine reduzierte Überlebenswahrscheinlichkeit durch plötzlichen Tod. Ziel dieser Studie war es, basierend auf unseren Beobachtungen, einen Auslöser für diesen komplexen und vielseitigen Phänotyp zu finden. Die beobachtete Nierendegeneration in unseren SPRED2-KO-Mäusen war auf eine Hydronephrose zurückzuführen, welche durch schwere Atrophie des Nierengewebes und Apoptose von Nierentubuluszellen gekennzeichnet war. Aufgrund des Nierenschadens haben wir Trinkverhalten und gängige Serumparameter analysiert. Trotz der Polydipsie, die sich durch eine nahezu verdoppelte tägliche Wasseraufnahme manifestierte, konnten signifikant erhöhte Na+- und Cl--Werte und die daraus resultierende Hyperosmolalität im Serum der SPRED2-KOs nicht kompensiert werden. Weil Salz- und Wasserhaushalt zum größten Teil unter der hormonellen Kontrolle von Aldosteron und ADH stehen, haben wir beide Hormonspiegel untersucht. Während die ADH-Werte im Serum von WT- und KO-Mäusen vergleichbar waren, insbesondere nach experimentellem Wasserentzug und einem extremen Verlust von Körperflüssigkeit, waren die Serumspiegel von Aldosteron in den SPRED2-KO-Mäusen verdoppelt. Die systematische Untersuchung übergeordneter regulatorischer Hormonachsen ergab, dass sich der Hyperaldosteronismus unabhängig von einer erhöhten Aktivität des Renin-Angiotensin-Systems entwickelte, da die Serum-Ang II-Spiegel in den SPRED2-KOs etwa um die Hälfte reduziert waren. Die Expression der Aldosteronsynthase in der Nebenniere war jedoch wesentlich erhöht. Für Kortikosteron, das wie Aldosteron von der Nebennierenrinde freigesetzt wird, konnten wir ebenfalls mehr als doppelt so hohe Werte im Serum der KO-Tiere detektieren. Die Aldosteron-Produktion steht, ähnlich wie bei Kortikosteron, zumindest teilweise unter der Kontrolle des hypophysären Hormons ACTH, dessen Sekretion wiederum übergeordnet durch die Freisetzung von CRH aus dem Hypothalamus geregelt wird. Tatsächlich war die Stresshormon-Sekretion entlang dieser gesamten Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse erhöht, da Serum-ACTH, das mittlere, hypophysäre Hormon, und hypothalamisches CRH, der übergeordnete hormonelle Induktor der HPA-Achse, in den SPRED2-KOs auch um 30% erhöht waren. Zusätzlich waren die ERK-Aktivität ebenso wie die CRH-mRNA-Spiegel im paraventrikulären Nukleus des Hypothalamus in unseren SPRED2-KO-Mäusen deutlich höher. In vitro Studien mit der Hypothalamus-Zelllinie mHypoE-44 zeigten weiterhin, dass sowohl SPRED1 als auch SPRED2 die Aktivität des CRH-Promotors, die CRH-Sekretion und die Ets-Faktor-abhängige CRH-Transkription reduzieren können. Passend dazu enthält die CRH-Promotorregion zahlreiche verschiedene Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren der Ets-Familie, speziell für Ets1. Somit zeigt diese Studie zum ersten Mal, dass die durch SPRED2-vermittelte Hemmung der Ras/ERK/MAPK-Signalkaskade mittels Unterdrückung der ERK-Aktivität zu einer Herunterregulation der Ets1-Faktor-abhängigen Transkription führt, was eine Hemmung der CRH-Promotoraktivität, der CRH-Transkription und der CRH-Freisetzung aus dem Hypothalamus zur Folge hat. Die daraus resultierende Hyperaktivität der gesamten HPA-Achse in unseren SPRED2-KO-Mäusen spiegelt eine erhöhte endogene Stress-Reaktion wider und äußert sich durch übermäßiges Putzverhalten und durch selbst zugefügte Hautläsionen auf der einen Seite; auf der anderen Seite erklärt dies, in Kombination mit der erhöhten Aldosteronsynthase-Expression, den Hyperaldosteronismus und das damit verbundene Ungleichgewicht in Salz- und Wasserhaushalt. Weiterhin tragen sowohl Hyperaldosteronismus als auch Polydipsie sehr wahrscheinlich zu den beobachteten Nierenschädigungen bei. Zusammengefasst ist diese Studie ein erster Hinweis, dass SPRED2 wesentlich an der adäquaten Regulation der HPA-Achsen-Aktivität beteiligt ist und essentiell ist für die Aufrechterhaltung der Homöostase im Körper. Um die Folgen von SPRED2-Defizienz in Mäusen und vor allem im Menschen weiter aufzuklären und zu vergleichen, erforschen wir in zwei Folgeprojekten die Funktion von SPRED2 speziell im Gehirn und im Herzen und führen parallel ein genetisches Screening zur Identifikation von funktionellen SPRED2-Mutationen im Menschen durch. KW - Renin-Angiotensin-System KW - Spred-Proteine KW - MAP-Kinase KW - Hypophysen-Zwischenhirn-System KW - Knockout KW - SPRED2 KW - ERK KW - MAP Kinase Signaling KW - HPA Axis KW - Renin Angiotensin System KW - Knockout mouse KW - Spred Protein KW - Hypothalamisch-hypophysäre Achse KW - Renin-Angiotensin-Aldosteron-System KW - MAP-Kinase KW - Gen-Knockout Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107355 ER - TY - THES A1 - Hittler, Friederike Heléne T1 - Chemokinrezeptorexpression auf humanen Monozyten vor und nach perkutaner Koronarangiographie mit Stentimplantation T1 - Chemokine receptor expression in human monocytes before and after percutaneous coronary intervention and stent implantation N2 - Die Koronare Herzkrankheit (KHK) zählt zu den häufigsten Todesursachen in Deutschland und weltweit. Die Atherosklerose der Herzkranzgefäße gilt als pathophysiologisches Korrelat der KHK. Die manifeste KHK geht mit Myokardhypoxie einher, persistierende Myokardhypoxie resultiert im Myokardinfarkt. Atherosklerose ist ein multifaktorieller, sich selbst verstärkender Inflammationsprozess, an dem multiple Zellen und Moleküle beteiligt sind. Hierzu zählen zum Beispiel das monozytär-phagozytäre System (MPS) und Chemokine sowie Chemokinrezeptoren. Auch im Regenerationsprozess nach Myokardinfarkt spielt die MPS-Chemokinrezeptor-Interaktion eine bedeutsame Rolle. Die perkutane Koronarintervention mit Stentimplantation (PCI) hat sich als geeignete Behandlungsmöglichkeit der manifesten KHK etabliert. Häufigste Komplikationsfolge der Implantation von Bare-Metal-Stents stellt die In-Stent-Restenose aufgrund einer überschießenden Inflammationsreaktion dar. Konsekutiv entwickelte Drug-Eluting-Stents sondern Immunmodulatoren zu Eindämmung der Inflammationsreaktion ab. Dadurch kommt es auch zu Eindämmung der gewollten Reendothelialisierung des Stents mit Zunahme gefürchteter Stent-Thrombosen. Ideal wäre demnach eine selektivere Hemmung der Inflammationsreaktion, die die gewünschte Reendothelialisierung nicht beeinträchtigt. Hierzu müssen die molekularbiologischen Zusammenhänge am Gefäßbett nach Stenting beleuchtet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Expressionsverhalten der Chemokinrezeptoren CXCR4, CX3CR1 und CCR2 auf Monozyten vor und nach PCI im humanen Modell untersucht, alle untersuchten Probanden litten an Atherosklerose, circa die Hälfte hatte bereits vormalig einen Myokardinfarkt erlitten. 24 Stunden nach Stenting zeigte sich eine signifikant geringere CXCR4-Expression und Positivität auf Monozyten der Gesamtpopulation. Dies ist vermutlich Korrelat einer Achsenaktivierung mittels CXCR4-typischer Rezeptorinternalisierung und mittels Abwanderung CXCR4-positiver Monozyten ins Gefäßbett und spricht für eine grundlegende Rolle der CXCR4-MPS-Interaktion nach PCI. Patienten, die bereits einen Myokardinfarkt erlitten hatten, konnten eine signifikant niedrigere CXCR4-Expression auf Monozyten aufweisen als die Vergleichsgruppe. Weiterhin zeigten Patienten mit pectanginösen Beschwerden einen signifikant höheren Rezeptorverlust an der Oberfläche der Monozyten nach Stenting. Dies deutet auf eine grundlegende Rolle der CXCR4-MPS-Interaktion bei Myokardhypoxie hin und liefert einen Einblick in das komplexe Geschehen der Infarktheilung und Hypoxiekompensation. Hypothetisch denkbar wäre eine protektive Rolle der CXCR4-Achse nach Ischämie, mit Hypoxie-vermittelter Präkonditionierung humaner Monozyten nach stattgehabtem Myokardinfarkt und konsekutiv basal gesteigerter CXCR4-Expression, die nach erneutem Hypoxie-Ereignis einen schnelleren Zugriff auf CXCR4-vermittelte, protektive Signalwege erlauben könnte. Patienten, die sich bereits vormals einem Stenting unterzogen hatten, konnten eine signifikant niedrigere CX3CR1-Expression auf Monozyten aufweisen. Dies steht in Kongruenz mit Ergebnissen von Tierstudien, die eine grundlegende Rolle von CX3CR1 im chronischen Monozytenrecruitment nach Gefäßverletzung beschrieben hatten. Für CCR2 ergaben sich keine relevanten Ergebnisse. Die Rolle der Interaktion der Chemokinrezeptoren CXCR4, CX3CR1 und CCR2 mit humanen Monozyten in Neointimagenese, Atherosklerose und Myokardheilung nach Infarkt ist nicht eindeutig beschrieben und wird zum Teil kontrovers diskutiert. Unsere Studie liefert interessante neue Erkenntnisse bezüglich der Beteiligung der untersuchten Rezeptoren und dem MPS bei den beschriebenen pathogenetischen Prozessen. Die erstmalig beschriebene CXCR4-MPS-Interaktion nach Stenting sowie die Hinweise auf eine Beteiligung von CX3CR1 im chronischen Monozytenrecruitment der humanen Neointimagenese liefern einen interessanten Anhaltspunkt für die Entwicklung neuer, selektiver Antagonisten im Kampf gegen die In-Stent-Restenose. N2 - Coronary artery disease arising from atherosclerosis is a leading cause of death and morbidity worldwide. With the increasing emphasis on the importance of inflammation in atherosclerosis, more attention has been drawn to the role of chemokines and inflammatory cells. Here we investigated the expression of Chemokine Receptors CCR2, CX3CR1 and CXCR4 in human monocytes before and 24 hours after percutaneous coronary intervention and stent implantation. KW - Monozyten KW - PCI KW - KHK KW - CXCR4 KW - CX3CR1 KW - CCR2 KW - Chemokinrezeptoren Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107731 ER - TY - THES A1 - Grünemay, Nadine T1 - Histologische, biochemische und statistische Untersuchungen zur Funktion des Proteins LASP-1 im Urothelkarzinom der Harnblase T1 - Histological, biochemical and statistical analysis of the function of LASP-1 protein in transitional cell carcinoma of the urinary bladder N2 - LASP-1, das LIM und SH3 Protein 1, ist ein Aktin-bindendes Gerüstprotein, das in verschiedenen Tumorentitäten überexprimiert ist. Dabei scheint LASP-1 eine wichtig Rolle sowohl bei der Proliferation und Migration von Zellen als auch bei der Tumorgenese und Metastasierung zu spielen. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression von LASP-1 im Urothelkarzinom der Harnblase zu untersuchen und eine daraus abzuleitende klinische Relevanz für die Diagnostik zu evaluieren. Dazu wurden histologische Blasenschnitte immunhistochemisch nach LASP-1 gefärbt und Western Blot-Analysen von Urinproben durchgeführt. Die Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Blasenschnitte ergab, dass Urothelkarzinome signifikant mehr LASP-1 auf Proteinebene exprimieren als gesundes Blasengewebe. Allerdings konnte keine Korrelation zwischen der Stärke der LASP-1-Expression und verschiedener klinisch-pathologischer Parameter nachgewiesen werden. Mittels Western Blot-Analysen gelang es, LASP-1 eindeutig im Urin und statistisch signifikant häufiger bei Blasenkarzinompatienten zu detektieren. Ohne Berücksichtigung einer Kontamination mit LASP-1-positiven Blut- und Entzündungszellen ist der LASP-1-Nachweis im Western Blot mit einer Gesamtsensitivität von 84,2% derzeit sensitiver als die meisten erhältlichen Tumormarker. Darüber hinaus ergab der Vergleich von Spontanurin und von Harnblasenspülflüssigkeit, dass Spontanurinproben sogar geeigneter zur Diagnostik zu sein scheinen. Abschließend kann zusammengefasst werden, dass LASP-1 aufgrund der einfachen, nicht invasiven und kostengünstigen Probengewinnung zusammen mit den hohen Werten für Sensitivität und Spezifität als Urin-basierter Tumormarker für das Urothelkarzinom der Harnblase vielversprechend zu sein scheint. N2 - The LIM and SH3 protein 1 (LASP-1) is an actin-binding scaffolding protein, which is overexpressed in several tumour entities. LASP-1 seems to play an important role for proliferation and migration of cells as well as for tumourgenesis and metastasis. The aiim of this dissertation was to analyse the expression of LASP-1 in transitional cell carcinoma of the urinary bladder and to evaluate the clinical relevance for diagnostics. To analyse this, immunohistochemical staining for LASP-1 of archieved bladder tumour tissue samples and Western blot analysis of urine samples were performed. The evaluation of the immunohistochemical stained tissue specimens showed that LASP-1 expression is significantly higher in bladder cancer than in normal bladder tissue. However, there were no correlation between histological scored expression level of LASP-1 and standard clinicopathological parameters. Western blot analysis helped to prove that LASP-1 is clearly contained in the urine and significantly more frequent in that of bladder cancer patients. Without considering a contamination with LASP-1-positive blood- and inflammatory cells, the detection of LASP-1 with Western blot analysis is more sensitive than most common available tumour markers with an overall sensitivity of 84,2%. Furthermore the comparison between voided urine and bladder washing samples showed that voided urine seemes to be more adapted for the diagnosis. In conclusion, it can be said that LASP-1 is promisingly useful as an urine-based tumour marker for the transitional cell carcinoma of the urinary bladder because of its non-invasive and cost-effective sampling as well as its high values for sensitivity and specificity. KW - bladder cancer KW - transitional cell carcinoma KW - LASP-1 KW - LASP-1 KW - Harnblasenkarzinom KW - Urothelkarzinom Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-95211 ER - TY - THES A1 - Häbich, Hannes Jan T1 - Die kardialen Auswirkungen einer SPRED2-Defizienz im Mausmodell T1 - The cardiac effects of a SPRED2 deficiency in the mouse model N2 - SPRED 2 wirkt inhibitorisch auf den Ras/ERK-MAPK-Signalweg. Im Knockout Mausmodell zeigen sich einige schwerwiegende phänotypische Eigenschaften, unter anderem zeigen sich ein genereller Minderwuchs, veränderte hormonelle Regelkreise, neurologische Auffälligkeiten, eine deutlich verringerte Lebenserwartung, sowie kardiale Veränderungen. Besonders schwerwiegende SPRED 2 KO typische Ausprägungen im Herzen sind hierbei eine myokardiale Fibrosierung, eine myokardiale Hypertrophie und Herzrhythmusstörungen. In dieser Arbeit wurden insbesondere kardiale Veränderungen auf Zell- und Proteinebene untersucht. Zur Proteinanalyse der Kardiomyozyten wurden Western Blots und eine Schnittbildgebung angefertigt. Für eine funktionelle Untersuchung wurden isolierte vitale Kardiomyozyten mittels Fluoreszenzfarbstoffen untersucht und unter elektrischer Stimulation beobachtet. Desweiteren wurden isolierte Mitochondrien auf ihren Stoffwechsel und eventuelle Defekte hin analysiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass junge SPRED2 KO Mäuse keine wesentlichen hämodynamischen Einschränkungen aufweisen und eine gute Kompensationsfähigkeit gegenüber einer Nachlaststeigerung aufweisen. Auch gezeigt werden konnte, dass Veränderungen im Rahmen der Zellkontraktion beim Kalziumhaushalt und Membranpotential existieren und im Zusammenhang mit einer verminderten Expression von SERCA und CaV1.2 stehen. Bei der Untersuchung von Mitochondrien konnten keine wesentlichen Defizite der mitochondrialen Funktion der SPRED 2 KO Mäuse gefunden werden. In diesem Zusammenhang ist die bekannte Störung der Autophagie am ehesten Ursache für eine gesteigerte Fibrosierung, sowie der gesteigerten Apoptose der Kardiomyozyten. In Folge dessen könnten die oben beschriebenen Veränderungen des Kalziumhaushaltes der Kardiomyozyten stehen und letztendlich über maligne Herzrhythmusstörungen zum vorzeitigen Versterben führen. N2 - SPRED 2 has an inhibitory effect on the Ras/ERK-MAPK signaling pathway. In the knockout mouse model, some severe phenotypic features are shown, among others a general short stature, altered hormonal regulatory circuits, neurological abnormalities, a significantly reduced life expectancy, and cardiac changes. Especially severe SPRED 2 KO typical manifestations in the heart are myocardial fibrosis, myocardial hypertrophy and cardiac arrhythmias. In this work, cardiac changes at the cellular and protein levels were studied in particular. For protein analysis of the cardiomyocytes, Western blots and cross-sectional imaging were performed. For a functional study, isolated vital cardiomyocytes were examined by fluorescent dyes and observed under electrical stimulation. Furthermore, isolated mitochondria were analyzed for metabolism and possible defects. It was shown that young SPRED2 KO mice do not exhibit significant hemodynamic limitations and show a good ability to compensate for the increase in afterload. Moreover, it was shown that alterations in cell contraction exist in calcium balance and membrane potential and are associated with decreased expression of SERCA and CaV1.2. When mitochondria were examined, no significant deficits in mitochondrial function were found in SPRED 2 KO mice. In this context, the known disruption of autophagy is most likely the cause of increased fibrosis, as well as increased apoptosis of cardiomyocytes. As a consequence, the above calcium balance of the cardiomyocytes ultimately lead to premature death via malignant cardiac arrhythmias. KW - Spred-Proteine KW - Herzinsuffizienz KW - TAC KW - Noonan-Syndrom KW - Maus KW - Herz Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346286 ER - TY - THES A1 - Wobbe, Christina T1 - Hochaufgelöste Mikroskopie mittels strukturierter Beleuchtung zur altersabhängigen Akkumulation autofluoreszierender Granula im retinalen Pigmentepithel des Menschen T1 - High-resolution microscopy using structured illumination for age-dependent accumulation of autofluorescent granules in human retinal pigment epithelium N2 - Die Technik der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (structured illumination microscopy, SIM) ist eine etablierte ultrastrukturelle Aufnahmemethode, die der hochauflösenden Visualisierung intrazellulärer Strukturen dient. In der Ophthalmologie findet diese Art der Bildgebung bisher wenig Anwendung. SIM ermöglicht die histologische Darstellung retinaler Strukturen, wie der Zellen des humanen retinalen Pigmentepithels (RPE). In den Zellen des RPE reichern sich Granula an, die für die Autofluoreszenz-Bildgebung von Bedeutung sind. Anhand der Morphologie und autofluoreszierenden Merkmale lassen sich grundsätzlich drei Granulatypen im RPE unterscheiden: Melanosomen (M), Melanolipofuszin (ML)- und Lipofuszin (L)-Granula. Die Anwendung der SIM ermöglicht die präzise Darstellung und Differenzierung dieser autofluoreszierenden Strukturen, sowie die Bestimmung ihrer Anzahl und Lokalisation. Ziel der Arbeit ist die Darstellung der im humanen RPE lokalisierten Granula mithilfe der SIM. Anhand der unterschiedlichen Autofluoreszenz (AF) der Granula können diese innerhalb des RPE-Zellkörpers klassifiziert, sowie deren Anzahl und Dichte analysiert werden. Diese Analyse wird in Altersgruppen und Retinalokalisationen differenziert. Zudem sind direkte Vergleiche zwischen der Histologie (SIM, ex vivo) und klinischen Aufnahmen (Fundusautofluoreszenz, in vivo) kaum existent. Durch Ermittlung der Gesamt-AF pro Zelle in Korrelation zu der intrazellulären Granuladichte und -verteilung soll eine neue Interpretationsebene ermöglicht werden. Diese Arbeit soll helfen anhand der gewonnenen Daten die Stoffwechselmechanismen der Retina und deren Einfluss auf die Fundusautofluoreszenz (FAF) besser verstehen zu können. Sie soll insbesondere dazu beitragen bestehende und neue klinische FAF-Bildgebungsverfahren zu validieren, die Diagnostik pathologischer Prozesse der Retina zu optimieren und sowohl eine möglichst frühe Erkennung als auch präzise Prognostik zu ermöglichen. Zudem sollen die Daten eine belastbare Basis darstellen, um die mit einem hohen Zeitaufwand verbundene manuelle Zellanalyse einer geschulten künstlichen Intelligenz zu überlassen. Damit könnte der Analyseprozess von Gewebeproben immens beschleunigt werden und in seiner Effizienz maximiert werden. N2 - Structured illumination microscopy (SIM) is an established ultrastructural imaging technique for high-resolution visualization of intracellular structures. So far, this type of imaging has not been used much in ophthalmology. SIM enables the histological visualization of retinal structures, such as the cells of the hu- man retinal pigment epithelium (RPE). Granules accumulate in the cells of the RPE, which are important for autofluorescence imaging. Basically, three types of granules in the RPE can be distinguished on the basis of the morphology and autofluorescent characteristics: Melanosomes (M), Melanolipofuscin (ML) granules and Lipofuscin (L) granules. The use of SIM enables the precise representation and differentiation of these autofluorescent structures, as well as the determination of their number and localization. The aim of this work is to visualize the granules localized in human RPE using SIM. Based on the different autofluorescence (AF) of the granules, they can be classified within the RPE cell body and their number and density can be analyzed. This analysis is differentiated into age groups and retinal localizations. In addition, direct comparisons between histology (SIM, ex vivo) and clinical images (fundus autofluorescence, in vivo) hardly exist. By determining the total AF per cell in correlation to the intracellular granule density and distribution, a new level of interpretation should be made possible. This work will help to understand the metabolic mechanisms of the retina and their influence on fundus autofluorescence (FAF). In particular, it should contribute to validating existing and new clinical FAF imaging methods, optimizing the diagnosis of pathological processes in the retina and enabling both early detection and precise prognosis. In addition, the data should provide a reliable basis for leaving the time-consuming manual cell analysis to a trained artificial intelligence. This could immensely accelerate the analysis process of tissue samples and maximize its efficiency. KW - Netzhaut KW - Retinales Pigmentepithel KW - Autofluoreszenz KW - structured illumination microscopy KW - Retina Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321490 ER - TY - THES A1 - Offner, Kristin T1 - SH3-mediated protein interactions of Mena and VASP T1 - SH3 vermittelte Proteininteraktionen von Mena und VASP N2 - Regulation of actin cytoskeletal turnover is necessary to coordinate cell movement and cell adhesion. Proteins of the Enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important mediators in cytoskeleton control, linking cyclic nucleotide signaling pathways to actin assembly. In mammals, the Ena/VASP family consists of mammalian Enabled (Mena), VASP, and Ena-VASP-like (EVL). The family members share a tripartite domain organization, consisting of an N-terminal Ena/VASP homology 1 (EVH1) domain, a central proline-rich region (PRR), and a C-terminal EVH2 domain. The EVH1 domain mediates binding to the focal adhesion proteins vinculin and zyxin, the PRR interacts with the actin-binding protein profilin and with Src homology 3 (SH3) domains, and the EVH2 domain mediates tetramerization and actin binding. Endothelial cells line vessel walls and form a semipermeable barrier between blood and the underlying tissue. Endothelial barrier function depends on the integrity of cell-cell junctions and defective sealing of cell-cell contacts results in vascular leakage and edema formation. In a previous study, we could identify a novel interaction of the PRR of VASP with αII-spectrin. VASP-targeting to endothelial cell-cell contacts by interaction with the αII-spectrin SH3 domain is sufficient to initiate perijunctional actin filament assembly, which in turn stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, barrier function of VASP-deficient endothelial cells and microvessels of VASP- null mice is defective, demonstrating that αII-spectrin/VASP complexes regulate endothelial barrier function in vivo. The aim of the present study was to characterize the structural aspects of the binding of Ena/VASP proteins to αII-spectrin in more detail. These data are highly relevant to understand the cardiovascular function of VASP and its subcellular targeting. In the present study, the following points were experimentally addressed: 1. Comparison of the interaction between αII-spectrin and Mena, VASP, or EVL In contrast to the highly conserved EVH1/EVH2 domains, the PRR is the most divergent part within the Ena/VASP proteins and may differ in binding modes and mechanisms of regulation. More specifically, VASP contains a triple GP5 motif, whereas EVL and Mena contain one or more GP6 motifs or even longer proline stretches. In the present study, we used peptide scans and competitive αII-spectrin SH3 pull-down assays with the recombinant Mena, VASP, and VASP mutants to investigate the relative binding efficiency. Our results indicate that binding of the αII-spectrin SH3 domain to GP6 motifs is superior to GP5 motifs, giving a rationale for a stronger interaction of αII-spectrin with EVL and Mena than with VASP. 2. Interaction of SH3i with Ena/VASP proteins In the mammalian heart, an αII-spectrin splice variant exists (SH3i), which contains a 20 amino acid insertion C-terminal to the SH3 domain. We used GST-fusion proteins of αII-spectrin, comprising the SH3 domain with or without the alternatively spliced amino acids, to pull-down recombinant Mena, VASP or VASP mutants. The results demonstrate a substantially increased binding of the C-terminal extended SH3 domain as compared to the general αII-spectrin isoform without the 20 amino acid insertion. These findings were also confirmed in pull-down experiments with heart lysates and purified Mena from heart muscle. The increased binding was not due to an alternative, SH3-independent binding interface because a pointmutation of the SH3 domain (W1004R) in the alternatively spliced αII-spectrin isoform completely abrogated the interaction. To analyze the interaction of SH3i and Ena/VASP proteins in living cells, we expressed the extended SH3 domain as GFP fusion proteins in endothelial cells. Here, we observed an extensive co-localization with Mena and VASP at the leading edge of lamellipodia confirming the in vivo relevance of the interaction with potential impact on cell migration and angiogenesis. 3. Binding affinity and influence of the Ena/VASP tetramerization domain We also determined the binding affinity of the general and the alternatively spliced αII-spectrin SH3 with Ena/VASP proteins by isothermal titration calorimetry (ITC) using a peptide from the PRR of Mena (collaboration with Dr. Stephan Feller, University of Oxford). Surprisingly, the binding affinity of the general SH3 domain was low (~900 μM) as compared to other SH3 domain- mediated interactions, which commonly display binding constants in the low micromolar range. Furthermore and in contrast to the pull-down assays, we could not detect an increased binding affinity of the C-terminally extended SH3 domain. This could be either explained by the existence of a third protein, which “bridges” the Mena/αII-spectrin complex in the pull-down assays, or, more likely, by the small size of the Mena peptide, which lacks major parts of the Mena protein, including the tetramerization domain. Indeed, it has been previously shown that the tetramerization of Ena is crucial for the interaction with the Abl- SH3 domain, although no SH3 binding sites are found in the tetramerization domain. To address this point experimentally, we used a VASP mutant that lacks the tetramerization domain in pull-down assays. Neither the general nor the alternatively spliced SH3 domain bound to the monomeric VASP, demonstrating the crucial (indirect) impact of Ena/VASP tetramerization on the interaction with αII-spectrin. In summary, we conclude that the αII-spectrin SH3 domain binds to the proline- rich region of all Ena/VASP proteins. However, binding to EVL and Mena, which both possess one or more GP6 motifs, is substantially more efficient than VASP, which only contains GP5 motifs. The C-terminally extended SH3 domain, which is present in the αII-spectrin splice variant SH3i, binds stronger to the Ena/VASP proteins than the general isoform and expression of the isolated domain is sufficient for co-localization with Ena/VASP in living endothelial cells. Finally, the tetramerization of the Ena/VASP proteins is indispensable for the interaction with either isoform of αII-spectrin. N2 - Die Regulation des Umbaus des Aktinzytoskeletts ist für die Fortbewegung sowie die Adhäsion von Zellen essentiell. Proteine der Enabled/vasodilator- stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) Familie sind wichtige Mediatoren bei diesem Prozess, indem sie zyklische Nukleotidprotein-Signalwege mit dem Aktinzytoskelett-Aufbau verknüpfen. In Säugern besteht die Ena/VASP-Protein Familie aus mammalian Enabled (Mena), VASP und Ena-VASP-like (EVL). Diese Proteine teilen sich einen gemeinsamen strukturellen Aufbau: N-terminal befindet sich die Ena/VASP homology 1 (EVH1) Domäne, zentral liegt eine prolinreiche Region (PRR) und C-terminal befindet sich eine EVH2 Domäne. Die EVH1 Domäne vermittelt eine Interaktion mit den fokalen Adhäsionsproteinen Vinculin und Zyxin, die PRR interagiert mit dem aktinbindenden Protein Profilin sowie mit Src homology 3 (SH3) Domänen und die EVH2 Domäne vermittelt die Tetramerisierung der Proteine sowie die Interaktion mit Aktin. Endothelzellen kleiden die Gefäßwand aus und bilden eine semipermeable Barriere zwischen Blut und dem umgebenden Gewebe. Die Funktion des Endothels hängt dabei von der Integrität der Zell-Zell-Kontakte ab. Die Zerstörung dieser Kontakte führt zu vaskulärer Leckage sowie zur Ausbildung von Ödemen. In einer vorausgehenden Arbeit konnten wir eine neue Interaktion zwischen der PRR von VASP und αII-Spektrin zeigen. Durch die Interaktion mit der SH3 Domäne von αII-Spektrin gelangt VASP an Zell-Zell-Kontakte von Endothelzellen und ist dort in der Lage die Aktinverknüpfung in der Umgebung der Zell-Zell-Kontakte zu initiieren, was wiederum die Zell-Zell-Kontakte stabilisiert und die vaskuläre Permeabilität reduziert. Umgekehrt konnten wir beobachten, dass die Barrierefunktion von Endothelzellen und Mikrogefäßen von VASP-defizienten Mäusen gestört ist, was darauf hindeutet, dass VASP/αII- Spektrin-Komplexe an der Regulation der endothelialen Barrierefunktion in vivo beteiligt sind. Das Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Charakterisierung der Strukturen von Ena/VASP Proteinen und αII-Spektrin, die an der Interaktion zwischen diesen Proteinen beteiligt sind. Diese Daten sind äußerst wichtig um die genaue Funktion von VASP im kardiovaskulären System zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die folgenden Punkte genauer analysiert: 1. Vergleich der Interaktion zwischen αII-Spektrin und Mena, VASP oder EVL Verglichen mit den hochkonservierten EVH1/2 Domänen besitzt die zentrale PRR der Ena/VASP Proteinfamilie die größte Diversität und könnte sich bezüglich der Binde- und Regulationsmechanismen zwischen den einzelnen Proteinen unterscheiden. Im Detail besitzt VASP ein sich dreifach wiederholendes GP5 Motiv wohingegen Mena und EVL ein sich ein- oder mehrfach wiederholendes GP6 Motiv oder noch längere Prolinsequenzen aufweisen. In dieser Arbeit nutzten wir peptide scan arrays und kompetitive αII- Spektrin SH3 pull-down Versuche mit rekombinantem Mena, VASP und VASP Mutanten um die relative Bindungsstärke der Interaktion zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Bindung der αII-Spektrin SH3 Domäne an GP6 Motive der Bindung an GP5 Motive überlegen ist, was darauf hindeutet, dass die Interaktion zwischen αII-Spektrin und EVL und Mena stärker ist als die Interaktion mit VASP. 2. Interaktion von SH3i mit Ena/VASP Proteinen Im Säugerherzen kommt eine αII-Spektrin Splicevariante (SH3i) vor, die eine Insertion aus 20 Aminosäuren C-terminal der SH3 Domäne enthält. Wir nutzten GST-αII-Spektrin Fusionsproteine, die die SH3 Domäne mit oder ohne Aminosäuren-Insertion beinhalteten, im pull-down Versuch mit rekombinantem Mena, VASP oder mit VASP Mutanten. Die Ergebnisse zeigten eine deutlich ansteigende Bindungsrate bei der C-terminal verlängerten SH3 Domäne verglichen zu der üblichen αII-Spektrin Isoform ohne Aminosäureninsertion. Diese Ergebnisse konnten auch durch pull-down Versuche mit Herzlysat und aufgereinigtem Mena aus Herzmuskulatur bestätigt werden. Dieser Effekt auf die Bindung war dabei nicht bedingt durch ein alternatives, SH3-unabhängiges Bindungsmuster, da eine Punktmutation (W1004R) in der Sequenz der SH3 Domäne der alternativ gespleißten αII-Spektrin Isoform die Interaktion komplett aufhob. Um die Interaktion von SH3i und Ena/VASP Proteinen in lebenden Zellen zu untersuchen, exprimierten wir die verlängerte SH3 Domäne als GFP- Fusionsprotein in Endothelzellen. Hierbei konnten wir eine ausgeprägte Kolokalisation mit Mena und VASP an Lamellipodien beobachten, was die Relevanz der Interaktion im lebenden Organismus bestätigt und auf einen potentiellen Effekt auf Zellmigration und Angiogenese schließen lässt. 3. Bindungsaffinität und Einfluss der Ena/VASP Tetramerisierungsdomäne Zusätzlich wurde die Bindungsaffinität der üblichen sowie der alternativ gespleißten αII-Spektrin SH3 Domäne mit den Ena/VASP Proteinen mittels isothermal titration calorimetry (ITC) bestimmt, wobei ein Peptid bestehend aus der PRR von Mena genutzt wurde (Kollaboration mit Dr. Stephan Feller, Universität von Oxford). Überraschenderweise war die Bindungsaffinität der üblichen SH3 Domäne verglichen mit anderen SH3 Interaktionen, die normalerweise Bindungskonstanten im unteren mikromolaren Bereich aufweisen, niedrig (~900 μM). Außerdem und im Kontrast zu den Ergebnissen der pull-down Versuche konnten wir keine gesteigerte Bindungsaffinität der C- terminal verlängerten SH3 Domäne feststellen. Dies könnte entweder durch die Beteiligung eines dritten Proteins erklärt werden, das den Mena/αII-Spektrin- Komplex in den pull-down Versuchen überbrückt, oder aber, was wahrscheinlicher ist, durch die geringe Größe des Mena Peptids, dem wichtige Bestandteile des Mena Proteins inklusive der Tetramerisierungsdomäne fehlen. Tatsächlich wurde erst kürzlich gezeigt, dass die Tetramerisierung von Ena essentiell für eine Interaktion mit der Abl SH3 Domäne ist, obwohl keine SH3 Bindestellen in der Tetramerisierungsdomäne gefunden wurden. Um dieser Beobachtung nachzugehen, nutzten wir eine VASP Mutante in pull-down Versuchen, der die Tetramerisierungsdomäne fehlt. Weder die übliche noch die alternativ gespleißte SH3 Domäne interagierte mit dem monomeren VASP, was einen essentiellen (indirekten) Einfluss der Tetramerisierung von Ena/VASP Proteinen auf die Interaktion mit αII-Spektrin nahelegt. Zusammengefasst können wir sagen, dass die αII-Spektrin SH3 Domäne an die prolinreiche Region aller Ena/VASP Proteine bindet. Jedoch ist festzuhalten, dass die Bindung an EVL und Mena, die beide ein oder mehrere GP6 Motive enthalten, deutlich effizienter ist als die Bindung an VASP, das ausschließlich GP5 Motive beinhaltet. Die C-terminal verlängerte SH3 Domäne, die in der alternativ gespleißten αII-Spektrin Variante SH3i vorkommt, bindet stärker an Ena/VASP Proteine als die übliche αII-Spektrin Isoform und bereits die Expression der isolierten Domäne alleine ist für eine Kolokalisation mit Ena/VASP Proteinen in lebenden Endothelzellen ausreichend. Letztlich konnten wir zeigen, dass die Tetramerisierung der Ena/VASP Proteine unentbehrlich für die Interaktion mit allen untersuchten αII-Spektrin Isoformen ist. KW - SH3 KW - proteininteraction KW - Mena KW - VASP KW - Proteininteraktion Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154481 ER - TY - THES A1 - von Ehrlich-Treuenstätt, Viktor Heinrich T1 - Die Einflüsse des Ionenkanals Transient Receptor Potential Canonical 4 (TRPC4) auf die Kalzium-Homöostase in Kardiomyozyten T1 - The influence of Transient Receptor Potential Canonical 4 channel (TRPC4) on the calcium homeostasis in cardiomyocytes N2 - Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig. Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte. N2 - The Transient Receptor Potential Channel Subunit 4 (TRPC4) has been considered as a crucial Ca2+ component in cardiomyocytes promoting structural and functional remodeling in the course of pathological cardiac hypertrophy. Functional properties of TRPC4 are also based on the expression of the TRPC4 splice variants TRPC4α and TRPC4β. Aim of the present study was to analyze cytosolic Ca2+ signals, signaling, hypertrophy and vitality of cardiomyocytes in dependence on the expression level of either TRPC4α or TRPC4β. KW - Herzhypertrophie KW - TRP-Kanäle KW - Natrium-Calcium-Austauscher KW - Fluoreszenz KW - TRPC4 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186806 N1 - Aus datenschutzrechtlichen Gründen wurde der Zugriff auf den Volltext zu diesem Dokument gesperrt. Eine inhaltlich identische neue Version ist erhältlich unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-20276 ER - TY - THES A1 - Röser [geb. Aßmus], Benjamin T1 - SPRED2 (Sprouty-related EVH1 domain containing 2) reguliert die Autophagie in Kardiomyozyten T1 - SPRED2 (Sprouty-related EVH1 domain containing 2) regulates autophagy in cardiomyocytes N2 - Das Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) ist ein inhibitorisches, downstream von Ras wirkendes Protein des MAP-Kinase Signalwegs, welches entscheidenden Einfluss auf die Regulation von Proliferation, Expression von Proteinen und der zellulären Homöostase hat. Der kardiale Phänotyp von SPRED2- defizienten Mäusen zeigt nicht nur eine deutliche linksventrikuläre Hypertrophie, sondern auch eine erhöhte Fibrosierung des Herzgewebes. Zellulär wird die SPRED2- Defizienz durch die Akkumulation von vesikulären Strukturen innerhalb der Zelle, sowie eine markant erhöhte Anzahl von Vesikeln entlang der longitudinalen Reihen der Mitochondrien gekennzeichnet. Ziel dieser Arbeit war es, den Charakter dieser vesikulären Strukturen näher zu beleuchten und festzustellen, in welchem Zusammenhang die subzellulär veränderte Architektur mit der Hypertrophie der SPRED2-defizienten Tiere steht. Um diese Fragestellung zu beantworten, wurde zunächst nach einem vesikulären Degradationsmechanismus gesucht, der in SPRED2-/--Cardiomyocyten betroffen sein könnte. Die Macroautophagie, im folgenden Autophagie bezeichnet, ist ein solcher Degradationsmechanismus, bei dem selektiv langlebige Proteine und Zellorganellen abgebaut werden. Es konnten signifikante Veränderung der Protein-Level an Schlüsselpositionen der Autophagie identifiziert werden. Das Ubiquitin-aktivierende (E1) Enzym Homolog Atg7 sowie die Cystein-Protease Atg4B zeigen sich im SPRED2- KO deutlich reduziert. Ebenso Atg16L, das als essentieller Bestandteil des Atg5- Atg12-Atg16-Konjugationssystems bei der Konjugation von MAPLC3-II an das Phospholipid Phosphatidylethanolamin beteiligt ist. Die Autophagie-Rate als Verhältnis von konjugiertem zu unkonjugiertem MAPLC3 ist ebenfalls reduziert. Die Akkumulation der autophagischen Vesikel zeigt sich kongruent zu dem erhöhten Protein-Level der autophagischen Cargo-Rezeptoren SQSTM1 und NBR1, sowie des lysosomalen Markers CathepsinD. Außer der verringerten Autophagie-Rate zeigt sich in Einklang mit der Fibrosierung des Herzgewebes eine erhöht aktive Caspase-3 als Marker für Apoptose. Um die mitochondriale Integrität näher zu beleuchten, wurde die Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Wildtyp und SPRED2-KO untersucht. Hierbei zeigte sich eine erhöhte Menge an ROS im KO, was ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der Mitochondrien darstellt. Letztlich wurde die Hypothese überprüft, ob ein gestörter Transport der Vesikel durch eine Beeinträchtigung der Motorproteine Dynein und Kinesin vorliegt. In der Tat zeigte sich die Aktivität der Dynein-ATPase verringert in der Abwesenheit von SPRED2. Diese Beobachtung wird durch die erhöhten Mengen des vSNARE-Proteins VTI1b unterstützt, was letztlich die Akkumulation der autophagischen Vesikel mit einer verringerten Fähigkeit zur Membranfusion und dem ineffizienteren Transport der Vesikel in Einklang bringt. Da die gesamten Experimente in einem globalen SPRED2-KO System durchgeführt wurden, können eventuelle Auswirkungen der beeinflussten hormonellen Situation der SPRED2-KO Tiere auf den Herzphänotyp nicht final ausgeschlossen werden. Um die genaue Wirkung einer SPRED2-Defizienz auf das Herzgewebe und das Herz als Organ zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine SPRED2- defiziente knockout Mauslinie mit konditionalem Potential generiert, die eine gesteuerte Deletion von SPRED2 im Herzgewebe erlaubt. N2 - The Sprouty-related, EVH1 domain containing protein 2 (SPRED2) is a MAP kinase signaling inhibitor working downstream of Ras. It has a critical influence on regulating proliferation, differentiation, expression of proteins and cellular hemostasis. The cardiac phenotype of SPRED2 deficient mice not only shows a significant left ventricular hypertrophy but also a hightened fibrosis of the heart tissue. On the cellular level the SPRED2 deficiency is marked by an accumulation of ventricular structures within the cell, as well as a decisive number of vesicles along the longitudinal rows of mitochondria. The aim of this work was to elucidate the properties of these vesicular structures and to determine in which context the subcellularly modified architecture and the hypertrophy of the SPRED2 deficient animals stand to each other. To answer this question, a protein degradation mechanism that could be changed within the SPRED2 deficient cardiomyocytes was identified. Macroautophagy, further called autophagy, is such a degradation mechanism, which degrades long-lived proteins and cell organelles. This work identified significant changes made to the protein level of key regulators of autophagy. The ubiquitin-activating (E1) enzyme homolog Atg7 as well as the cystein protease Atg4B are reduced in the SPRED2 KO. Similarly, Atg16L, which acts as an essential part of the Atg5-Atg12-Atg16 conjugation system in the process of conjugating MAPLC3 to the phospholipid phosphatidylethanolamine. The autophagic flux, as the relation between conjugated and unconjugated MAPLC3, is reduced in the knockout as well. The accumulation of autophagic vesicles is in accordance with the elevated protein levels of the cargo receptors SQSTM1 and NBR1 as well as the lysosomal marker CathepsinD. Besides the reduced autophagic flux there is an elevated protein level of activated caspase-3 as a marker of apoptosis. To further elucidate the mitochondrial integrity, the endogenous levels of reactive oxygen species were determined in wildtype and knockout individuals. It was shown that the SPRED2 knockout contains an elevated level of ROS which could be a sign of reduced mitochondrial survival. Finally, it was investigated whether the disturbed transport of vesicles was due to impaired motor protein efficiency. It was shown that the activity of the dynein ATPase was reduced when SPRED2 was absent. This observation is supported by the elevated levels of the vSNARE protein VTI1b, which connects the accumulation of autophagic vesicles with the reduced ability to membrane fusion and a less efficient transport of vesicles. The experiments of this work were conducted in a global SPRED2-KO system. Possible effects of the changed hormonal situation of the SPRED2 deficient animals to the heart phenotype cannot be excluded. For that reason a conditional SPRED2 knockout mouse line with conditional potential was created capable of further elucidating the effect of a SPRED2 deficiency to the heart. KW - Spred-Proteine KW - Autophagie KW - Herzmuskelzelle KW - Autophagozytose KW - Autophagosom KW - autophagocytosis KW - autophagosome KW - Kardiomyozyt KW - Vesikel KW - Lysosom Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-182700 ER - TY - THES A1 - von Ehrlich-Treuenstätt, Viktor Heinrich T1 - Die Einflüsse des Ionenkanals Transient Receptor Potential Canonical 4 (TRPC4) auf die Kalzium-Homöostase in Kardiomyozyten T1 - The influence of Transient Receptor Potential Canonical 4 channel (TRPC4) on the calcium homeostasis in cardiomyocytes N2 - Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig. Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte. N2 - The Transient Receptor Potential Channel Subunit 4 (TRPC4) has been considered as a crucial Ca2+ component in cardiomyocytes promoting structural and functional remodeling in the course of pathological cardiac hypertrophy. Functional properties of TRPC4 are also based on the expression of the TRPC4 splice variants TRPC4α and TRPC4β. Aim of the present study was to analyze cytosolic Ca2+ signals, signaling, hypertrophy and vitality of cardiomyocytes in dependence on the expression level of either TRPC4α or TRPC4β. KW - Herzhypertrophie KW - TRP-Kanäle KW - Natrium-Calcium-Austauscher KW - Fluoreszenz KW - TRPC4 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202763 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am: 04.09.2019 ER - TY - THES A1 - Megerle, Felix T1 - Herzfrequenzvariabilität und Kinetik der Sauerstoffaufnahme während körperlicher Belastung bei Patienten mit primärer Nebennierenrindeninsuffizienz und Diabetes mellitus Typ 1 T1 - Heart rate variability and kinetics of oxygen uptake during exercise in patients with primary adrenal insufficiency and type 1 diabetes N2 - Die primäre Nebenniereninsuffizienz stellt ein seltenes Krankheitsbild dar, welches mit einem Mangel an Kortisol in Folge eines defekten bzw. fehlenden Nebennierenrindengewebes einhergeht. Im Rahmen eines autoimmun polyglandulären Syndroms Typ 2 (APS 2) können, neben anderen Kombinationsmöglichkeiten, eine primäre Nebenniereninsuffizienz (NNRI) zusammen mit einem Diabetes mellitus Typ 1 vorliegen. Bisher wenig bis gar nicht beleuchtet ist der Einfluss dieser Erkrankungen auf die kardiopulmonale Leistungsfähigkeit aus sportmedizinischer Sicht. Mit Kortisol als ein komplexer Modulator verschiedenster Stoffwechselprozesse und Anpassungen des Körpers an physische wie psychische Belastung ist ein entsprechender Einfluss auf kardiopulmonale Belastungsgrößen zu vermuten. In der hier vorgestellten Arbeit wurde ein Testprotokoll zur standardisierten und vergleichbaren körperlichen Belastung auf einem Fahrradergometer erstellt und Patienten mit primärer NNRI, APS 2, Diabetes Typ 1 sowie gesunde Kontrollprobanden mittels dieses Protokolls körperlich belastet. Dabei wurden unter kontinuierlicher spirometrischer und elektrokardiographischer Überwachung verschiedene Parameter der Herzfrequenzvariabilität sowie die Slow Component der Sauerstoffaufnahme (SCVO2) beleuchtet und zwischen den einzelnen Gruppen verglichen. Bei den im Rahmen dieser Arbeit erhobenen HRV-Parametern in Ruhe, bei körperlicher Belastung und in der anschließenden Erholungsphase konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Probandengruppen gesehen werden. Für die SCVO2 zeigte sich ein signifikanter (p<0,05) Unterschied zwischen Diabetikern und Nicht-Diabetikern. Probanden mit Diabetes wiesen dabei signifikant niedrigere Werte der SCVO2 auf im Vergleich zu Probanden ohne Diabetes. Darüber hinaus zeigte sich eine negative Korrelation zwischen dem HbA1c und der SCVO2. Ursächlich hierfür könnte ein verändertes Rekrutierungsverhalten von Skelettmuskelfasern sein, wobei zur genaueren Beleuchtung weitere Untersuchungen notwendig sind. N2 - Primary adrenal insufficiency is a rare disease that is associated with a lack of cortisol as a result of defective or missing adrenal tissue. In the context of an autoimmune polyglandular syndrome type 2 (APS 2), among other possible combinations, primary adrenal insufficiency (NNRI) together with type 1 diabetes mellitus may be present. Little or no research has been done on the influence of these diseases on cardiopulmonary performance from a sports medicine point of view. With cortisol as a complex modulator of various metabolic processes and adaptations of the body to physical and psychological stress, a corresponding influence on cardiopulmonary stress variables can be assumed. In the work presented here, a test protocol for standardized and comparable physical stress on a bicycle ergometer was created and patients with primary NNRI, APS 2, type 1 diabetes and healthy control subjects were physically stressed using this protocol. With continuous spirometric and electrocardiographic monitoring, various parameters of heart rate variability and the slow component of oxygen uptake (SCVO2) were examined and compared between the individual groups. In the HRV parameters recorded at rest, during physical exertion and in the subsequent recovery phase, no significant difference between the test groups could be seen. For SCVO2, there was a significant (p <0.05) difference between diabetics and non-diabetics. Subjects with diabetes showed significantly lower values ​​of SCVO2 compared to subjects without diabetes. In addition, there was a negative correlation between the HbA1c and the SCVO2. The reason for this could be an altered recruitment of skeletal muscle fibers, whereby further investigations are necessary to clarify this assumption. KW - Herzfrequenzvariabilität KW - Sauerstoffaufnahme KW - Nebennierenrindeninsuffizienz KW - Diabetes mellitus Typ 1 KW - Kinetik der Sauerstoffaufnahme KW - Autoimmun polyglanduläres Syndrom Typ 2 KW - Slow Component der Sauerstoffaufnahme KW - kinetics of oxygen uptake KW - slow component of oxygen uptake KW - autoimmune polyglandular syndrome type 2 Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209661 ER -