TY  - THES
A1  - Götz, Silvia
T1  - Zuo1 - ein neues G-Quadruplex-bindendes Protein in \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\)
T1  - Zuo1 - a novel G-quadruplex binding protein in \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\)
N2  - G-Quadruplex (G4)-Strukturen sind sehr stabile und polymorphe DNA und RNA Sekundärstrukturen mit einem konservierten Guanin-reichen Sequenzmotiv (G4-Motiv). Sie bestehen aus übereinander gestapelten planaren G-Quartetts, in denen je vier Guanine durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten werden. 
Da G4-Motive in Eukaryoten an bestimmten Stellen im Genom angereichert vorkommen, wird angenommen, dass die Funktion von G4-Strukturen darin besteht, biologische Prozesse positiv oder negativ zu regulieren. Aufgrund der hohen thermodynamischen Stabilität von G4 Strukturen ist davon auszugehen, dass Proteine in die Faltung, Stabilisierung und Entfaltung dieser Nukleinsäure-Strukturen regulatorisch involviert sind. Bis heute wurden viele Proteine in der Literatur beschrieben, die G4-Strukturen entwinden können. Jedoch konnten bisher nur wenige Proteine identifiziert werden, die in vivo die Faltung fördern oder G4-Strukturen stabilisieren.
Durch Yeast One-Hybrid (Y1H)-Screenings habe ich Zuo1 als neues G4 bindendes Protein identifiziert. In vitro Analysen bestätigten diese Interaktion und es stellte sich heraus, dass Zuo1 G4-Strukturen stabilisiert. Übereinstimmend mit den in vitro Daten konnte gezeigt werden, dass Zuo1 signifikant an G4-Motive im Genom von Saccharomyces ceresivisiae bindet. Genomweit überlappen G4-Motive, an die Zuo1 bindet, mit Stellen, an denen die DNA Replikation zum Stillstand kommt und vermehrt DNA Schäden vorkommen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Zuo1 eine Funktion während der DNA Reparatur oder in Zusammenhang mit dem Vorankommen der DNA Replikationsgabel hat, indem G4-Strukturen stabilisiert werden. Diese Hypothese wird außerdem durch genetische Experimente gestützt, wonach in Abwesenheit von Zuo1 die Genominstabilität zunimmt. Aufgrund dieser Daten war es möglich ein Model zu entwickeln, bei dem Zuo1 während der S-Phase G4-Strukturen bindet und stabilisiert wodurch die DNA Replikation blockiert wird. Diese Interaktion findet neben Stellen schadhafter DNA statt und unterstützt somit DNA Reparatur-Prozesse wie beispielsweise die Nukleotidexzisionsreparatur. 

Als weiteres potentielles G4-bindendes Protein wurde Slx9 in Y1H-Screenings identifiziert. In vitro Experimente zeigten zwar, dass Slx9 mit höherer Affinität an G4-Strukturen bindet im Vergleich zu anderen getesteten DNA Konformationen, jedoch wurde in S. cerevisiae genomweit keine signifikante Bindung an G4-Motive festgestellt.
N2  - G-quadruplex (G4) structures are stable and polymorphic DNA and RNA secondary structures with a conserved Guanine-rich sequence motif (G4 motif). They consist of stacked planar G quartets that are held together by hydrogen bondings between four guanines. 
Because G4 motifs are enriched at specific sites in eukaryotic genomes, G4 structures are suggested to act as functional tools in the cell to regulate biological processes in a positive or negative manner. Considering the high thermodynamic stability of G4 structures it has been suggested that proteins regulate the formation, stabilization, and unfolding of this nucleic acid based structure. Up to now many proteins that unwind G4 structures have been described in the literature. But so far only a few proteins were identified that support the formation or stabilize G4 structures in vivo. 
Using yeast one-hybrid screenings, I identified Zuo1 as a novel G4-binding protein. In vitro studies confirmed this interaction and revealed that Zuo1 stabilizes G4 structures. In agreement with in vitro data I could show that Zuo1 binds significantly to G4 motifs in the S. cerevisiae genome. Genome-wide G4 motifs which are bound by Zuo1 overlap sites where DNA replication stalls and DNA damage is elevated. These results suggest that Zuo1 functions during the control of DNA repair or DNA replication fork progression by stabilization of G4 structures. This hypothesis is further supported by genetic assays showing that in the absence of Zuo1 genome instability is increased. On the basis of these data we propose a model in which Zuo1 binds and stabilizes G4 structures during S phase and by this block DNA replication. This interaction takes place near DNA damage sites and supports DNA repair processes such as nucleotide excision repair. 

Additionally, Slx9 was identified in Y1H screenings as a potential G4-binding protein. In vitro analyses showed that Slx9 interacts with higher affinity with G4 structures compared to other tested DNA conformations. However, no significant overlap with G4 motifs could be observed genome-wide in S. cerevisiae.
KW  - Saccharomyces cerevisiae
KW  - DNS-Bindungsproteine
KW  - DNS-Reparatur
KW  - DNA secondary structure
KW  - DNA Sekundärstruktur
KW  - Sekundärstruktur
KW  - Bäckerhefe
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152158
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wanzek, Katharina
T1  - The investigation of the function of repair proteins at G-quadruplex structures in \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\) revealed that Mms1 promotes genome stability
T1  - Die Untersuchung der Funktion von Reparaturproteinen an G-Quadruplex Strukturen in \(Saccharomyces\) \(cerevisiae\) zeigte, dass Mms1 Genomstabilität fördert
N2  - G-quadruplex structures are highly stable alternative DNA structures that can, when not properly regulated, impede replication fork progression and cause genome instability (Castillo Bosch et al, 2014; Crabbe et al, 2004; Koole et al, 2014; Kruisselbrink et al, 2008; London et al, 2008; Lopes et al, 2011; Paeschke et al, 2013; Paeschke et al, 2011; Piazza et al, 2015; Piazza et al, 2010; Piazza et al, 2012; Ribeyre et al, 2009; Sabouri et al, 2014; Sarkies et al, 2012; Sarkies et al, 2010; Schiavone et al, 2014; Wu & Spies, 2016; Zimmer et al, 2016). The aim of this thesis was to identify novel G-quadruplex interacting proteins in Saccharomyces cerevisiae and to unravel their regulatory function at these structures to maintain genome integrity. Mms1 and Rtt101 were identified as G-quadruplex binding proteins in vitro via a pull-down experiment with subsequent mass spectrometry analysis. Rtt101, Mms1 and Mms22, which are all components of an ubiquitin ligase (Rtt101Mms1/Mms22), are important for the progression of the replication fork following fork stalling (Luke et al, 2006; Vaisica et al, 2011; Zaidi et al, 2008). The in vivo binding of endogenously tagged Mms1 to its target regions was analyzed genome-wide using chromatin-immunoprecipitation followed by deep-sequencing. Interestingly, Mms1 bound independently of Mms22 and Rtt101 to G-rich regions that have the potential to form G-quadruplex structures. In vitro, formation of G-quadruplex structures could be shown for the G-rich regions Mms1 bound to. This binding was observed throughout the cell cycle. Furthermore, the deletion of MMS1 caused replication fork stalling as evidenced by increased association of DNA Polymerase 2 at Mms1 dependent sites. A gross chromosomal rearrangement assay revealed that deletion of MMS1 results in a significantly increased genome instability at G-quadruplex motifs compared to G-rich or non-G-rich regions. Additionally, binding of the helicase Pif1, which unwinds G4 structures in vitro (Paeschke et al, 2013; Ribeyre et al, 2009; Sanders, 2010; Wallgren et al, 2016), to Mms1 binding sites was reduced in mms1 cells. The data presented in this thesis, together with published data, suggests a novel mechanistic model in which Mms1 binds to G-quadruplex structures and enables Pif1 association. This allows for replication fork progression and genome integrity.
N2  - Bei G-quadruplex Strukturen handelt es sich um stabile Sekundärstrukturen der DNA, welche das Fortschreiten der Replikationsgabel behindern und Genominstabilität verursachen können, falls sie nicht konsequent reguliert werden (Castillo Bosch et al, 2014; Crabbe et al, 2004; Koole et al, 2014; Kruisselbrink et al, 2008; London et al, 2008; Lopes et al, 2011; Paeschke et al, 2013; Paeschke et al, 2011; Piazza et al, 2015; Piazza et al, 2010; Piazza et al, 2012; Ribeyre et al, 2009; Sabouri et al, 2014; Sarkies et al, 2012; Sarkies et al, 2010; Schiavone et al, 2014; Wu & Spies, 2016; Zimmer et al, 2016). Ziel dieser Doktorarbeit war es, neue Proteininteraktionspartner dieser Strukturen in Saccharomyces cerevisiae zu identifizieren und zu untersuchen, wie diese Proteine die Strukturen regulieren um Genomstabilität zu gewährleisten. Mit Hilfe eines Pulldown Assays und anschließender massenspektrometrischer Analyse wurden Mms1 und Rtt101 in vitro als Interaktionspartner von G-quadruplex Strukturen identifiziert. Rtt101, Mms1 und Mms22, Komponenten der Ubiquitinligase Rtt101Mms1/Mms22, spielen eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Replikationsgabel, falls dieses durch Agenzien gehemmt wurde (Luke et al, 2006; Vaisica et al, 2011; Zaidi et al, 2008). Durch Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung wurden die Bindestellen von Mms1 identifiziert. Interessanterweise hat Mms1 genomweit an G-reiche Sequenzen gebunden. Diese G-reichen Sequenzen bildeten G-quadruplex Strukturen in vitro aus. Die Bindung von Mms1 erfolgte unabhängig von Rtt101 und Mms22 sowie während des gesamten Zellzyklus. Außerdem kam es zu einer Verlangsamung der Replikationsgabel in mms1 Zellen, was durch eine verstärkte Bindung der DNA Polymerase 2 nachgewiesen wurde. Ein gross chromsomal rearrangement assay zeigte, dass die Genominstabilität in mms1 Zellen signifikant erhöht ist, wenn G-quadruplex Motive, im Vergleich zu nicht-G-reichen oder G-reichen Kontrollregionen, vorhanden sind. Zudem war die Bindung der Helikase Pif1, welche G-quadruplex Strukturen in vitro entwindet (Paeschke et al, 2013; Ribeyre et al, 2009; Sanders, 2010; Wallgren et al, 2016), stark reduziert, wenn Mms1 fehlte. Mit Hilfe der in dieser Doktorarbeit gewonnenen Ergebnisse, sowie mit Hilfe publizierter Daten, lässt sich ein Model postulieren, in welchem Mms1 an G-quadruplexe bindet und somit die Bindung von Pif1 ermöglicht. Dadurch werden das Fortschreiten der Replikationsgabel und die Genomstabilität gewährleistet.
KW  - Quadruplex-DNS
KW  - DNS-Reparatur
KW  - genome stability
KW  - Bierhefe
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142547
ER  - 
TY  - THES
A1  - Sauer, Markus
T1  - DHX36 function in RNA G-quadruplex-mediated posttranscriptional gene regulation
T1  - Funktion von DHX36 in RNA G-Quadruplex-vermittelter posttranskriptioneller Genregulierung
N2  - The expression of genetic information into proteins is a key aspect of life. The efficient and exact regulation of this process is essential for the cell to produce the correct amounts of these effector molecules to a given situation. For this purpose, eukaryotic cells have developed many different levels of transcriptional and posttranscriptional gene regulation. These mechanisms themselves heavily rely on interactions of proteins with associated nucleic acids. In the case of posttranscriptional gene regulation an orchestrated interplay between RNA-binding proteins, messenger RNAs (mRNA), and non-coding RNAs is compulsory to achieve this important function.
A pivotal factor hereby are RNA secondary structures. One of the most stable and diverse representatives is the G-quadruplex structure (G4) implicated in many cellular mechanisms, such as mRNA processing and translation. In protein biosynthesis, G4s often act as obstacles but can also assist in this process. However, their presence has to be tightly regulated, a task which is often fulfilled by helicases.
One of the best characterized G4-resolving factors is the DEAH-box protein DHX36. The in vitro function of this helicase is extensively described and individual reports aimed to address diverse cellular functions as well. Nevertheless, a comprehensive and systems-wide study on the function of this specific helicase was missing, so far.
The here-presented doctoral thesis provides a detailed view on the global cellular function of DHX36. The binding sites of this helicase were defined in a transcriptome-wide manner, a consensus binding motif was deviated, and RNA targets as well as the effect this helicase exerts on them were examined. In human embryonic kidney cells, DHX36 is a mainly cytoplasmic protein preferentially binding to G-rich and G4-forming sequence motifs on more than 4,500 mRNAs. Loss of DHX36 leads to increased target mRNA levels whereas ribosome occupancy on and protein output of these transcripts are reduced. Furthermore, DHX36 knockout leads to higher RNA G4 levels and concomitant stress reactions in the cell. I hypothesize that, upon loss of this helicase, translationally-incompetent structured DHX36 target mRNAs, prone to localize in stress granules, accumulate in the cell. The cell reacts with basal stress to avoid cytotoxic effects produced by these mis-regulated and structured transcripts.
N2  - Die Umsetzung genetischer Information in Proteine stellt einen Schlüsselaspekt des Lebens dar. Dabei ist die effiziente und exakte Regulierung dieses Prozesses für die Zelle essentiell, um die korrekte Menge dieser Effektormoleküle in einer gegebenen Situation zu produzieren. Zu diesem Zweck haben eukaryotische Zellen viele verschiedene Ebenen der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation entwickelt. Diese Mechanismen wiederum beruhen insbesondere auf den Interaktionen von Proteinen mit assoziierten Nukleinsäuren. Im Fall der posttranskriptionellen Genregulation ist ein abgestimmtes Wechselspiel zwischen RNA-bindenden Proteinen, Boten-RNAs und nicht-kodierenden RNAs zwingend erforderlich um diese wichtige Funktion zu erfüllen.
Ein zentrales Element hierbei bilden RNA-Sekundärstrukturen. Einer der stabilsten und variantenreichsten Vertreter dieser Strukturen ist die G-Quadruplexstruktur (G4), die in vielen zellulären Mechanismen, wie zum Beispiel Prozessierung und Translation der Boten-RNA, involviert ist. Während der Proteinbiosynthese agieren G4s häufig als Hindernisse, können diesen Prozess allerdings auch unterstützen. In beiden Fällen muss deren Präsenz genau reguliert werden, was häufig durch Helikasen erfolgt.
Einer der bestcharakterisiertesten, G4-entwindenden Faktoren ist das DEAH-Box Protein DHX36. Die in vitro Funktion dieser Helikase wurde bereits ausführlich beschrieben und einzelne Berichte haben darüber hinaus versucht, ihr verschiedene Funktionen in der Zelle zuzuweisen. Nichtsdestotrotz fehlt bislang eine umfassende und systemweite Studie zur Funktion dieser speziellen Helikase.
Die hier präsentierte Doktorarbeit liefert einen detaillierten Blick auf die globale Funktion von DHX36 in der Zelle. Bindestellen dieser Helikase im Transkriptom wurden definiert, ein allgemeines Bindemotiv abgeleitet und RNA-Bindeziele sowie der Effekt, den diese Helikase auf jene ausübt, untersucht. In humanen embryonalen Nierenzellen ist DHX36 ein vorwiegend zytoplasmatisches Protein, das bevorzugt G-reiche und G4-bildende Sequenzmotive auf über 4.500 Boten-RNAs bindet. Verlust von DHX36 führt zu einem erhöhten Level dieser Boten-RNAs in der Zelle, wobei deren Besetzung mit Ribosomen und die damit verbundene Proteinproduktion reduziert ist. Weiterhin führt der Verlust von DHX36 zu einem höheren RNA G4 Level und zu gleichzeitigen Stressreaktionen in der Zelle. Meine Vermutung ist, dass sich bei einem Verlust von DHX36 translationsinkompetente, strukturierte und leicht akkumulierende Ziel-Boten-RNAs in der Zelle anreichern. Die Zelle reagiert darauf mit basalem Stress um zytotoxische Effekte dieser miss-regulierten und strukturierten Transkripte zu vermeiden.
KW  - RNS
KW  - Helicasen
KW  - Genexpression
KW  - RNA secondary structures
KW  - G-quadruplex
KW  - RNA protein interactions
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183954
ER  - 
TY  - THES
A1  - Iltzsche, Fabian
T1  - The Role of DREAM/MMB-mediated mitotic gene expression downstream of mutated K-Ras in lung cancer
T1  - Die Rolle DREAM/MMB-vermittelter mitotischer Genexpression unterhalb von mutiertem K-Ras in Lungenkrebs
N2  - The evolutionary conserved Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex has an essential role in transcriptional activation of mitotic genes. MMB target genes as well as the MMB associated transcription factor B-Myb and FoxM1 are highly expressed in a range of different cancer types. The elevated expression of these genes correlates with an advanced tumor state and a poor prognosis. This suggests that MMB could contribute to tumorigenesis by mediating overexpression of mitotic genes. Although MMB has been extensively characterized biochemically, the requirement for MMB to tumorigenesis in vivo remains largely unknown and has not been tested directly so far.
In this study, conditional knockout of the MMB core member Lin9 inhibits tumor formation in vivo in a mouse model of lung cancer driven by oncogenic K-Ras and loss of p53. The incomplete recombination observed within tumors points towards an enormous selection pressure against the complete loss of Lin9. RNA interference (RNAi)-mediated depletion of Lin9 or the MMB associated subunit B-Myb provides evidence that MMB is required for the expression of mitotic genes in lung cancer cells. Moreover, it was demonstrated that proliferation of lung cancer cells strongly depends on MMB. Furthermore, in this study, the relationship of MMB to the p53 tumor suppressor was investigated in a primary lung cancer cell line with restorable p53 function. Expression analysis revealed that mitotic genes are downregulated after p53 re-expression. Moreover, activation of p53 induces formation of the repressive DREAM complex and results in enrichment of DREAM at mitotic gene promoters. Conversely, MMB is displaced at these promoters.
Based on these findings the following model is proposed: In p53-negative cells, mitogenic stimuli foster the switch from DREAM to MMB. Thus, mitotic genes are overexpressed and may promote chromosomal instability and tumorigenesis.
This study provides evidence that MMB contributes to the upregulation of G2/M phase-specific genes in p53-negative cells and suggests that inhibition of MMB (or its target genes) might be a strategy for treatment of lung cancer.
N2  - Der evolutionär konservierte Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex hat eine wesentliche Rolle in der transkriptionellen Aktivierung mitotischer Gene. Zielgene des MMB sowie die MMB assoziierten Transkriptionsfaktoren B-Myb und FoxM1 sind hoch exprimiert in einer Bandbreite verschiedener Krebsarten. Die erhöhte Expression dieser Gene korreliert mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium und einer geringen Prognose. Das weißt auf darauf hin, dass MMB an der Tumorentstehung beteiligt sein könnte indem es die Überexpression mitotischer Gene fördert. Obwohl MMB biochemisch eingehend untersucht wurde, ist die Erfordernis von MMB zur Tumorentstehung in vivo weitestgehend unbekannt und wurde bisher nicht direkt getestet.
In dieser Studie hemmt der konditionale Knockout der MMB Kerneinheit Lin9 die Tumorbildung in vivo in einem Lungenkrebs-Mausmodell angetrieben durch onkogenes K-Ras und den Verlust von p53. Die unvollständige Rekombination welche in Tumoren beobachtet wurde deutet auf einen starken Selektionsdruck gegen den kompletten Verlust von Lin9 hin. Die Verminderung von Lin9 und der MMB- assoziierten Untereinheit B-Myb durch RNAi-Interferenz (RNAi) liefert Beweise dafür, dass MMB für die Expression mitotischer Gene in Lungenkrebszellen notwendig ist. Zudem wurde gezeigt, dass das Zellwachstum von Lungenkrebszellen stark von MMB abhängig ist. Weiterhin wurde der Zusammenhang zwischen MMB und dem p53-Tumorsuppressor in einer primären Lungenkrebszelllinie mit wiederherstellbarer p53-Funktion untersucht. Expressionsanalysen zeigen, dass mitotische Gene nach Re-expression von p53 runterreguliert werden. Außerdem induziert die Aktivierung von p53 die Bildung des repressiven DREAM-Komplexes und führt zu einer Anreicherung von DREAM an Promotoren mitotischer Gene. Im Gegenzug wird MMB an den Promotoren verdrängt.
Basierend auf den Ergebnissen wird das folgende Model vorgeschlagen: In p53- negativen Zellen begünstigen mitogene Reize den Wechsel von DREAM zu MMB. Dadurch werden mitotische Gene überexprimiert und können so chromosomale Instabilität und Tumorentstehung fördern
Diese Studie liefert Hinweise, dass MMB an der Hochregulation G2/M- Phasenspezifischer Gene in p53-negativen Zellen beteiligt ist und dass die Hemmung von MMB (oder seiner Zielgene) eine Strategie zur Behandlung von Lungenkrebs sein könnte.
KW  - Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom (NSCLC)
KW  - Lungenkrebs
KW  - lung cancer
KW  - DREAM complex
KW  - MMB
KW  - K-Ras
KW  - mitotic gene expression
KW  - Mitose
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154108
ER  -