TY - THES A1 - Balk, Anja T1 - Ionic liquids of active pharmaceutical ingredients: A novel platform addressing solubility challenges of poorly water soluble drugs T1 - Ionische Flüssigkeiten von Arzneistoffen: Ein neues Konzept für Löslichkeitsprobleme von schwer wasserlöslichen Wirkstoffen N2 - Starting in the late 1990s ionic liquids (ILs) gained momentum both in academia as well as industry. ILs are defined as organic salts with a melting point below 100 °C. Active pharmaceutical ingredients (APIs) may be transferred into ILs by creating salts with a bulky counterion with a soft electron density. ILs have demonstrated the potential to tune important pharmaceutical features such as the solubility and the dissolution rate, particularly addressing the challenge of poor water soluble drugs (PWSD). Due to the tunability of ILs, modification of physico-chemical properties of APIs may be envisioned without any modifications of the chemical structure. In the first chapter the potential as well as the limitation of ILs are discussed. The chapter commences with an overview of preparation and characterization of API-ILs. Moreover, examples for pharmaceutical parameters are presented which may be affected by IL formation, including the dissolution rate, kinetic solubility or hygroscopicity as well as biopharmaceutical performance and toxicology. The impact of IL formation on those pharmaceutically relevant features is highlighted, resulting in a blueprint for a novel formulation concept to overcome PWSD challenges without the need for structural changes of the API. Within the second chapter the IL concept is detailed for one specific API - counterion combination. A poorly water soluble acidic API against migraine attacks was transformed into an IL in an effort to minimize the time to maximum plasma concentration (tmax) and optimize the overall bioavailability. These studies were conducted in parallel to a prodrug of the API for comparison of the IL strategy versus a strategy involving modification of the API’s structure. A significantly longer duration of API supersaturation and a 700 fold faster dissolution rate of the IL in comparison to the free acid were obtained and the underlying mechanism was elucidated. The transepithelial absorption was determined using Caco-2 cell layers. For the IL about 3 times more substance was transported in comparison to the prodrug when substances were applied as suspensions, despite the higher permeability of the prodrug, as increased solubility of the IL exceeded this effect. Cytotoxicity of the counterion was assessed in hepatic, renal and macrophage cell lines, respectively, and IC50 values were in the upper µM / lower mM range. The outcome of the study suggested the IL approach instrumental for tuning biopharmaceutical properties, without structural changes of the API as required for preparation of prodrugs. Thus the toolbox for formulation strategies of poorly water soluble drugs could be extended by an efficient concept. The third chapter focuses on the effect of different counterions on the physico-chemical properties of an API-IL, in particular to overcome the challenge of poor water solubility. Therefore, the same poorly water soluble acidic API against migraine attacks mentioned above was combined with 36 counterions resulting in ILs and low lattice enthalpy salts (LLES). Depending on the counterions, different dissolution rates, durations of supersaturation and hygroscopicities were obtained and release profiles could be tailored from immediate to sustained release. Besides, in vitro the cytotoxicity of the counterions was assessed in three cell lines. Using molecular descriptors such as the number of hydrophobic atoms, the graph theoretical diameter and the number of positive charges of the counterion, the dissolution rate, supersaturation and hygroscopicity as well as the cytotoxicity of counterions could be adequately modeled, rendering it possible to predict properties of new LLESs. Within the forth chapter different poorly water soluble APIs were combined with the counterion tetrabutylphosphonium (TBP) studying the impact on the pharmaceutical and physical properties of the APIs. TBP-ILs and low lattice enthalpy salts were prepared of the acidic APIs Diclofenac, Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Sulfadiazine, Sulfamethoxazole and Tolbutamide. NMR and IR spectroscopy, DSC, XRPD, DVS and dissolution rate measurements, release profiles and saturation concentration measurements were used to characterize the free acids and TBP salts as compared to the corresponding sodium salts. The TBP salts as compared to the free acids displayed lower melting points and glass transition temperatures and up to 1000 times higher dissolution rates. The increase in the dissolution rate directly correlated with the salts’ hygroscopicity, an aspect which is critically discussed in terms of pharmaceutical translation challenges. In summary TBP ILs of solid salts were proved instrumental to approach the challenge of poor water solubility. The outcome profiled tailor-made counterions as a powerful formulation strategy to address poor water solubility, hence bioavailability and ultimately therapeutic potential of challenging APIs. In summary, a plethora of ILs and LLESs were prepared by combination of different acidic APIs and counterions. The IL and LLESs concept was compared to conventional salt and prodrug strategies. By choice of the counterion, biopharmaceutical relevant parameters were deliberately modified and release profiles were tuned ranging from immediate to prolonged release. The impact of distinct structural counterion features controlling the dissolution, supersaturation, hygroscopicity and counterion cytotoxicity were identified, correlations were presented and predictive models were built. ILs and LLESs could be proven to be a powerful concept for the formulation of poorly water soluble acidic APIs. N2 - Seit etwa 1990 haben Ionische Flüssigkeiten (IL) großes Interesse sowohl in der universitären als auch in der industriellen Forschung geweckt. ILs werden als organische Salze definiert, die einen Schmelzpunkt von unter 100 °C aufweisen. Arzneistoffe können in ILs umgewandelt werden, indem man Salze herstellt, mit einem voluminösen Gegenion mit delokalisierter Elektronendichte. ILs ermöglichen es wichtige pharmazeutische Eigenschaften wie Löslichkeit und Auflösungsgeschwindigkeit bewusst zu verändern, und im Besonderen stellen sie eine Möglichkeit dar, die Herausforderung, die schwer wasserlösliche Arzneistoffe mit sich bringen, zu bewältigen. Aufgrund der Variabilität von ILs, wird die Anpassung von physikochemischen Eigenschaften von Wirkstoffen denkbar, ohne die chemische Struktur des Stoffes zu modifizieren. Im ersten Kapitel werden die Potentiale aber auch die Grenzen von ILs dargestellt. Zu Beginn des Kapitels wird eine Übersicht über die Herstellung und Charakterisierung von ILs gegeben. Des Weiteren werden pharmazeutisch relevante Parameter gezeigt, die durch die IL Herstellung beeinflusst werden können, wie beispielsweise die Auflösungsgeschwindigkeit, die kinetische Löslichkeit oder die Hygroskopizität. Daneben können biopharmazeutische Größen und die Toxizität modifiziert werden. Der Einfluss der IL Bildung auf diese pharmazeutisch relevanten Parameter wird zusammengefasst und ein Formulierungskonzept aufgezeigt, um die schlechte Wasserlöslichkeit von Arzneistoffen zu überwinden ohne den Wirkstoff strukturell zu verändern. Im zweiten Kapitel wird das IL Konzept für eine spezifische Wirkstoff-Gegenion Kombination gezeigt. Ein schwer wasserlöslicher Arzneistoff gegen Migräne wird in ein IL umgewandelt, um eine schnellere und bessere Bioverfügbarkeit im Vergleich zu einem Prodrug zu erreichen. Eine signifikant verlängerte Übersättigung des Wirkstoffes und eine 700-fach schnellere Auflösung des ILs im Vergleich zur freien Säure wurden gemessen und der zugrunde liegende Mechanismus aufgeklärt. Die transepitheliale Aufnahme wurde anhand von Caco-2 Zellen untersucht. Vom IL wurde 3mal mehr Substanz transportiert als von dem Prodrug, wenn Suspensionen der Substanzen appliziert wurden und dies trotz der höheren Permeabilität des Prodrugs, da die verbesserte Löslichkeit des ILs hier überwog. Die Zytotoxizität des Gegenions wurde in einer Leber- und einer Nierenzellinie und in Makrophagen getestet und die IC50 Werte lagen im oberen µM- und unteren mM-Bereich. Die Ergebnisse der Untersuchungen legen dar, dass das IL Konzept hilfreich sein kann, um biopharmazeutische Eigenschaften zu variieren, ohne strukturelle Veränderung des Arzneistoffes, wie es für ein Prodrug nötig ist. Entsprechend konnten die Strategien, um schwer wasserlösliche Arzneistoffe zu formulieren, um ein neues und effizientes Konzept ergänzt werden. Der Fokus des dritten Kapitels liegt auf dem Einfluss von verschiedenen Gegenionen auf die physikochemischen Eigenschaften von Arzneistoff-ILs, insbesondere um Probleme aufgrund von schlechter Wasserlöslichkeit zu lösen. Dazu wurde der bereits im zweiten Kapitel genannte, saure und schwer wasserlösliche Arzneistoff gegen Migräne mit 36 Gegenionen kombiniert, wodurch ILs und Salze mit einer geringen Gitterenthalpie (LLES) erhalten wurden. In Abhängigkeit vom Gegenion wurden verschiedene Auflösungsgeschwindigkeiten, Übersättigungsdauern und Hygroskopizitäten erhalten. Durch Verändern des Gegenions konnte sowohl eine sofortige als auch verzögerte Freisetzung des Arzneistoffs erreicht werden. Daneben wurde in vitro die Zytotoxizität in drei Zelllinien bestimmt. Mittels zwei-dimensionaler Deskriptoren, wie der Anzahl der hydrophoben Atomen, dem graphentheoretischen Durchmesser und der Anzahl an positiven Ladungen des Gegenions, konnten die Auflösungsgeschwindigkeit, die Übersättigung und die Hygroskopizität sowie die Zytotoxizität des Gegenions berechnet werden, wodurch es gleichzeitig möglich wird, diese Eigenschaften für neue LLES vorherzusagen. Im vierten Kapitel werden verschiedene schwer wasserlösliche Arzneistoffe mit dem Gegenion Tetrabutylphosphonium (TBP) kombiniert und der Einfluss auf die pharmazeutischen und physikochemischen Eigenschaften des Wirkstoffes untersucht. TBP-ILs und Salze mit niedrigem Schmelzpunkt wurden von den sauren Arzneistoffen Diclofenac, Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Sulfadiazin, Sulfamethoxazol und Tolbutamid hergestellt. NMR- und IR-Spektroskopie, DSC, XRPD, DVS und Auflösungsgeschwindigkeitsmessungen wurden verwendet, um die freien Säuren und die TBP-Salze im Vergleich zu den entsprechenden Natrium-Salzen zu untersuchen. Die TBP-Salze zeigten im Vergleich zu den freien Säuren niedrigere Schmelzpunkte und Glasübergangstemperaturen und eine bis zu 1000-fach schnellere Auflösungsgeschwindigkeit. Ein Nachteil der Salze, die eine schneller Auflösungsrate zeigten, war die damit einhergehende erhöhte Hygroskopizität. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Herstellung von flüssigen und festen TBP-Salzen hilfreich sein kann, um die Wasserlöslichkeit von Arzneistoffen zu verbessern. Die Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass durch maßgeschneiderte Gegenionen neue Formulierungsstrategien für schlecht wasserlösliche Arzneistoffe zugänglich werden, wodurch die Bioverfügbarkeit und der therapeutische Nutzen optimiert werden kann. Insgesamt wurde eine Vielzahl von ILs und LLESs durch die Kombination von verschiedenen sauren Arzneistoffen und Gegenionen hergestellt. Das IL- und LLES-Konzept wurde mit der klassischen Salz– und Prodrug-Strategie verglichen. Durch die Wahl des Gegenions konnten biopharmazeutisch Parameter bewusst verändert werden und die Freisetzungsprofile von sofortiger bis hin zu verzögerter Freisetzung gewählt werden. Die strukturellen Merkmale der Gegenionen, die entscheidend für die Auflösungsgeschwindigkeit, die Übersättigung, die Hygroskopizität und die Gegenionen-Zytotoxizität waren, konnten gezeigt werden und Berechnungen dazu wurden präsentiert. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von ILs und LLESs ein wirkungsvolles Konzept ist, um schwer wasserlösliche, saure Arzneistoffe zu formulieren. KW - Arzneimittel KW - Wirkstofffreisetzung KW - Löslichkeit KW - Salz KW - Ionic Liquids KW - Poorly water soluble drugs KW - Active pharmaceutical ingredients KW - Supersaturation Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121925 ER - TY - THES A1 - Braun, Alexandra Carolin T1 - Bioresponsive delivery of anticatabolic and anabolic agents for muscle regeneration using bioinspired strategies T1 - Bioresponsive Verabreichung anti-kataboler und anaboler Wirkstoffe zur Muskelregeneration unter Verwendung bioinspirierter Strategien N2 - Progressive loss of skeletal muscle mass, strength and function poses a major threat to independence and quality of life, particularly in the elderly. To date, sarcopenia therapy consists of resistance exercise training in combination with protein supplementation due to the limited efficacy of available pharmacological options in counteracting the effects of muscle wasting. Therapeutic intervention with growth factors including insulin-like growth factor I (IGF-I) or inhibitors of myostatin  a potent suppressor of myogenesis  hold potential to rebalance the altered activity of anabolic and catabolic cytokines. However, dosing limitations due to acute side effects and disruptions of the homeostasis have so far precluded clinical application. Intending to provide a therapy with a superior safety and efficacy profile by directing drug release to inflamed tissue and minimizing off-target activity, we designed bioresponsive delivery systems for an anti-catabolic peptide and anabolic IGF-I responding to local flares of muscle wasting. In Chapter I, current concepts for bioorthogonal conjugation methods are discussed and evaluated based on various drug delivery applications. With a focus on protein delivery, challenges and potential pitfalls of each chemical and enzymatic conjugation strategy are analyzed and opportunities regarding their use for coupling of biomolecules are given. Based on various studies conjugating proteins to polymers, particles and biomaterials using different site-directed approaches, the chapter summarizes available strategies and highlights certain aspects requiring particular consideration when applied to biomolecules. Finally, a decision process for selection of an optimum conjugation strategy is exemplarily presented. Three of these bioorthogonal coupling reactions are applied in Chapter II detailing the potential of site-directed conjugation in the development of novel, homogenous drug delivery systems. The chapter describes the design of a delivery system of a myostatin inhibitor (MI) for controlled and local release counteracting myositis flares. MI release from the carrier is driven by increased matrix metalloproteinase (MMP) levels in compromised muscle tissues cleaving the interposed linker, thereby releasing the peptide inhibitor from the particulate carrier. Release experiments were performed to assess the response towards various MMP isoforms (MMP-1, -8, -9 and -13) – as upregulated during skeletal muscle myopathies – and the release pattern of the MI in case of disease progression was analyzed. By selection of the protease-sensitive linker (PSL) showing variable susceptibilities to proteases, release rates of the MI can be controlled and adapted. Immobilized MI as well as released MI as response to MMP upregulation was able to antagonize the effects of myostatin on cell signalling and myoblast differentiation. The approach of designing bioresponsive protein delivery systems was also applied to the anabolic growth factor IGF-I, as described in Chapter III. Numerous studies of PEGylated proteins or peptides reveal, that successful therapy is challenged by safety and efficacy issues, as polymer attachment considerably alters the properties of the biologic, thereby jeopardizing clinical efficacy. To this end, a novel promising approach is presented, intending to exploit beneficial effects of PEGylation on pharmacokinetics, but addressing the pharmacodynamic challenges by releasing the protein upon entering the target tissue. This was realized by integration of a PSL between the PEG moiety and the protein. The soluble polymer conjugate was produced by site-directed, enzymatic conjugation of IGF-I to the PSL, followed by attachment of a 30 kDa-PEG using Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strategy illustrates the potential of bioorthogonal conjugation (as described in Chapter I) for generation of homogenous protein-polymer conjugates with reproducible outcome, but also emphasizes the altered protein properties resulting from permanent polymer conjugation. As compared to wild type IGF-I, the PEGylated protein showed considerable changes in pharmacologic effects – such as impaired insulin-like growth factor binding protein (IGFBPs) interactions, submaximal proliferative activity and altered endocytosis patterns. In contrast, IGF-I characteristics were fully restored upon local disintegration of the conjugate triggered by MMP upregulation and release of the natural growth factor. For successful formulation development for the proteins and conjugates, the careful selection of suitable excipients is crucial for a safe and reliable therapy. Chapter IV addresses one aspect by highlighting the chemical heterogeneity of excipients and associated differences in performance. Polysorbate 80 (PS80) is a surfactant frequently used in protein formulations to prevent aggregation and surface adsorption. Despite being widely deployed as a standard excipient, heterogeneous composition and performance entails the risk of eliciting degradation and adverse effects on protein stability. Based on a comprehensive study using different batches of various suppliers, the PS80 products were characterized regarding chemical composition and physicochemical properties, facilitating the assessment of excipient performance in a formulation. Noticeable deviations were recorded between different suppliers as well as between batches of the same suppliers. Correlation of all parameters revealed, that functionality related characteristics (FRCs) could be reliably predicted based on chemical composition alone or by a combination of chemical and physicochemical properties, respectively. In summary, this thesis describes and evaluates novel strategies for the targeted delivery and controlled release of biologics intended to counteract the imbalance of anabolic and catabolic proteins observed during aging and musculoskeletal diseases. Two delivery platforms were developed and characterized in vitro – (i) using anti-catabolic peptides immobilized on a carrier for local delivery and (ii) using soluble IGF-I polymer conjugates for systemic application. Both approaches were implemented by bioorthogonal coupling strategies, which were carefully selected in consideration of limitations, side reactions and efficiency aspects. Bioresponsive release of the active biomolecules following increased protease activity could be successfully realized. The therapeutic potential of these approaches was demonstrated using various cell-based potency assays. The systems allow targeted and controlled release of the growth factor IGF-I and anti-catabolic peptides thereby overcoming safety concerns of current growth factor therapy and thus positively impacting the benefit-risk profile of potent therapeutics. Taking potential heterogeneity and by-product concerns into account, comprehensive excipient characterization was performed and a predictive algorithm for FRCs developed, in order to facilitate formulation design and guarantee a safe and efficient therapy from start to finish. N2 - Der zunehmende Verlust an Skelettmuskelmasse, Kraft und Funktion stellt insbesondere bei Älteren eine wesentliche Gefährdung der Unabhängigkeit und Lebensqualität dar. Bislang besteht die Sarkopenie-Therapie infolge der eingeschränkten Wirksamkeit verfügbarer pharmakologischer Möglichkeiten, den Auswirkungen des Muskelschwunds entgegenzuwirken, aus einer Kombination von Krafttraining und erhöhter Proteinzufuhr. Therapeutische Intervention mit Wachstumsfaktoren wie Insulin-like growth factor (IGF-I) oder Inhibitoren von Myostatin – eines wirkungsvollen Hemmstoffes der Myogenese – bietet das Potenzial, die veränderte Aktivität der anabolen und katabolen Zytokine wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Allerding haben Dosiseinschränkungen aufgrund akuter Nebenwirkungen und Beeinträchtigungen der Homöostase bislang eine klinische Anwendung ausgeschlossen. Mit der Absicht, eine Therapie mit besserem Sicherheits- und Wirksamkeitsprofil zu bieten, indem die Freisetzung des Wirkstoffs auf entzündetes Gewebe gelenkt wird und Aktivitäten außerhalb des Zielgewebes minimiert werden, entwickelten wir bioresponsive Freisetzungssysteme für ein antikataboles Peptid und das anabole IGF-I, die auf lokalen Ausbruch von Muskelschwund reagieren. In Kapitel I werden aktuelle Konzepte bioorthogonaler Konjugationsmethoden diskutiert und auf Basis einer Vielzahl von Drug Delivery Anwendungen beurteilt. Mit besonderem Fokus auf die Verabreichung von Proteinen werden Herausforderungen und Schwierigkeiten jeder chemischen und enzymatischen Konjugationsstrategie analysiert und Möglichkeiten im Hinblick auf ihre Verwendung für die Kopplung von Biomolekülen aufgezeigt. Auf Grundlage diverser Studien zur Verknüpfung von Proteinen mit Polymeren, Partikeln und Biomaterialien unter Verwendung verschiedener ortsspezifischer Ansätze, fasst das Kapitel vorhandene Strategien zusammen und hebt gewisse Aspekte hervor, die bei Anwendung auf Biomoleküle besondere Beachtung erfordern. Abschließend wird ein Entscheidungsprozess zur Auswahl einer optimalen Verknüpfungsstrategie exemplarisch dargestellt. Drei dieser bioorthogonalen Kopplungsreaktionen werden in Kapitel II angewendet, wodurch das Potenzial der ortsgerichteten Konjugation für die Entwicklung neuer, homogener Drug Delivery Systeme detailliert aufgezeigt wird. Dieses Kapitel beschreibt die Gestaltung eines Delivery Systems für einen Myostatin- Inhibitor (MI) für kontrollierte und lokale Freisetzung, um Myositis-Ausbrüchen entgegenzuwirken. Die Freisetzung des MI vom Träger wird durch erhöhte Konzentration an Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) in betroffenem Muskelgewebe vorangetrieben, die durch Spaltung des dazwischen positionierten Linkers das Peptid vom Partikelträger freisetzen. Es wurden Freisetzungsexperimente durchgeführt, um die Reaktion gegenüber mehreren MMP-Isoformen (MMP-1, -8, -9 und -13), die im Verlauf von Skelettmuskelmyopathien hochreguliert sind, festzustellen, und es wurde das Freisetzungsmuster des MI im Falle einer Krankheitsprogression analysiert. Durch Auswahl der Protease-sensitiven Linker (PSL), die unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Proteasen zeigen, können die Freisetzungsraten des MI kontrolliert und angepasst werden. Sowohl der immobilisierte MI, als auch der auf MMP-Hochregulation hin freigesetzte MI, waren dazu in der Lage, die Wirkungen von Myostatin auf Signaltransduktion von Zellen und Myoblastendifferenzierung aufzuheben. Das Konzept, bioresponsive Delivery Systeme für Proteine zu designen, wurde auch auf den anabolen Wachstumsfaktor IGF-I angewendet, wie in Kapitel III beschrieben wird. Zahlreiche Studien zu PEGylierten Proteinen oder Peptiden offenbaren, dass eine erfolgreiche Therapie durch Sicherheits- und Wirksamkeitsprobleme herausgefordert wird, da der Polymeranhang die Eigenschaften des biologischen Wirkstoffs beachtlich verändern und dadurch die klinische Wirksamkeit gefährden kann. Zu diesem Zweck wird ein neuer, vielversprechender Ansatz vorgestellt, mit der Absicht, die vorteilhaften Auswirkungen der PEGylierung auf die Pharmakokinetik zu nutzen, aber auch die pharmakodynamischen Herausforderungen dadurch zu adressieren, dass das Protein bei Eintritt ins Zielgewebe freigesetzt wird. Das wurde durch Einfügen eines PSL zwischen den PEG-Teil und das Protein erreicht. Das lösliche Polymerkonjugat wurde durch ortsspezifische, enzymatische Konjugation von IGF-I an den PSL hergestellt, gefolgt von Verknüpfung mit einem 30k Da-PEG unter Verwendung von kupferfreier Azid-Alkin Cycloaddition (SPAAC). Diese Strategie veranschaulicht das Potenzial der bioorthogonalen Konjugation (wie in Kapitel I beschrieben) zur Erzeugung homogener Protein-Polymer-Konjugate mit reproduzierbarem Ergebnis, aber betont auch die veränderten Proteineigenschaften, die sich aus der dauerhaften Polymerkonjugation ergeben. Verglichen mit dem Wildtyp-IGF-I zeigte das PEGylierte Protein beachtliche Veränderungen der pharmakologischen Eigenschaften, wie verminderte Interaktionen mit Insulin-like growth factor Bindungsproteinen (IGFBPs), eine submaximale proliferative Aktivität und ein verändertes Endozytosemuster. Im Gegensatz dazu wurden die Eigenschaften von IGF-I bei lokaler Spaltung des Konjugates durch MMP-Hochregulation und Freisetzung des natürlichen Wachstumsfaktors vollständig wiederhergestellt. Für eine erfolgreiche Formulierungsentwicklung der Proteine und Konjugate ist eine sorgfältige Auswahl geeigneter Hilfsstoffe für eine sichere und zuverlässige Therapie essenziell. Kapitel IV befasst sich mit einem Aspekt davon, indem die chemische Heterogenität von Hilfsstoffen und damit verbundene Unterschiede in der Leistung hervorgehoben werden. Polysorbat 80 (PS80) ist ein in Proteinformulierungen häufig verwendeter Hilfsstoff, der Aggregation und Oberflächenadsorption verhindern soll. Trotz dieser breiten Anwendung als Standardhilfsstoff birgt die heterogene Zusammensetzung und Performance Risiken, wie eine begünstigte Zersetzung und nachteilige Auswirkungen auf die Proteinstabilität. Auf Basis einer umfassenden Studie mit verschiedenen Chargen diverser Anbieter wurden die PS80 Produkte hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung und ihrer physikochemischen Eigenschaften charakterisiert, um eine Beurteilung der Hilfsstoffperformance in einer Formulierung zu ermöglichen. Auffällige Abweichungen sowohl zwischen unterschiedlichen Anbietern, also auch zwischen Chargen des gleichen Anbieters konnten verzeichnet werden. Die Korrelation aller Parameter ergab, dass funktionalitätsbezogene Eigenschaften (FRCs) auf Basis der chemischen Zusammensetzung alleine bzw. durch eine Kombination aus chemischen und physikochemischen Eigenschaften zuverlässig prognostiziert werden konnten. Zusammenfassend beschreibt und bewertet diese Dissertation neue Strategien für eine zielgerichtete und kontrollierte Freisetzung von biologischen Wirkstoffen mit der Absicht, dem Ungleichgewicht zwischen anabolen und katabolen Proteinen, welches im Laufe der Alterung und im Zuge muskuloskelettaler Erkrankungen beobachtet wird, entgegenzuwirken. Zwei Wirkstoff-Verabreichungsplattformen wurden entwickelt und in vitro charakterisiert: (i) unter Verwendung antikataboler Peptide, die für eine lokale Applikation auf einem Träger immobilisiert werden, und (ii) unter Verwendung löslicher IGF-I-Polymer Konjugate für die systemische Anwendung. Beide Ansätze wurden mittels bioorthogonaler Kopplungsstrategien, die unter Berücksichtigung von Einschränkungen, Nebenreaktionen und Effizienzaspekten sorgfältig ausgewählt wurden, durchgeführt. Die bioresponsive Freisetzung der aktiven Biomoleküle als Folge einer erhöhten Proteaseaktivität konnte erfolgreich umgesetzt werden. Das therapeutische Potenzial dieser Ansätze wurde anhand mehrerer zellbasierter Wirksamkeitsassays gezeigt. Die Systeme ermöglichen eine zielgerichtete und kontrollierte Freisetzung des Wachstumsfaktors IGF-I und antikataboler Peptide, wobei sie die Sicherheitsbedenken aktueller Wachstumsfaktortherapie bewältigen und somit das Nutzen-Risiko-Profil hochwirksamer Therapeutika positiv beeinflussen. Unter Berücksichtigung der potenziellen Bedenken bezüglich Heterogenität und Nebenprodukten wurde eine umfassende Hilfsstoffcharakterisierung durchgeführt und ein prognostischer Algorithmus für FRCs entwickelt, um die Formulierungsentwicklung zu erleichtern und eine sichere und effiziente Therapie von Anfang bis zum Ende zu garantieren. KW - Muskelatrophie KW - Kontrollierte Wirkstofffreisetzung KW - Insulin-like Growth Factor KW - Myositis KW - bioresponsive KW - protease-sensitive release KW - co-delivery Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169047 ER - TY - THES A1 - Dodt, Katharina Anna T1 - Monitoring enzyme activity by using mass-encoded peptides and multiplexed detection T1 - Überwachung von Enzymaktivität durch die Benutzung von massencodierten Peptiden und multiplexer Detektion N2 - Cell culture models are helpful tools to study inflammatory diseases, like rheumatoid arthritis (RA), osteoarthritis (OA), arteriosclerosis or asthma, which are linked to increased matrix metalloproteinase (MMP) activity. Such cell culture models often focus on the secretion of cytokines and growth factors or the direct effects of disease on tissue destruction. Even though the crucial role of MMPs in inflammatory diseases is known, the results of MMP studies are contradictious and the use of MMPs as biomarkers is inconsistent. MMPs play an important role in disease pathology, as they are involved in elastin degradation in the walls of alveoli in chronic obstructive pulmonary disease (COPD), tumor angiogenesis and metastasis and in cartilage and bone degradation in arthropathies. In RA and OA MMPs are secreted by osteocytes, synoviocytes, and by infiltrating immune cells in response to the increased concentration of inflammatory mediators, like growth factors and cytokines. MMPs are zinc and calcium-dependent proteinases and play an important role in physiological and pathological extracellular matrix (ECM) turn over. Their substrate specificity gives them the ability to degrade all major ECM components, like aggrecan, elastin, gelatin, fibronectin and all types of collagen even the triple helix of collagen monomers. The ECM consists of two large three-dimensional cross-linked macromolecule classes: one are fibrous proteins, like collagen and elastin fibers that are responsible for ECM’s structure, tensile strength, resiliency, reversible extensibility, and deformability and the second class is comprised of proteoglycans composed of glycosaminoglycan (GAG) chains covalently attached to protein cores that are multifunctionally involved in signaling pathways and cell interactions. ECM is present within all tissues and organs and changes in ECM structure contribute to pathogenesis, e.g. wounded and fibrotic tissue, COPD or tumours. This thesis primarily focuses on the development of a diagnostic peptide system, that enables to gain information on MMP activity from ECM by deploying the isobaric mass encoding strategy. The core element of the developed system is an isotopically labelled peptide sequence (mass tag), that is released in response to elevated levels of MMPs and allows multiplexed detection in tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The mass reporters possess a modular structure with different functionalities. C-terminal either a transglutaminase (TG) recognition sequence or a high molecular weight polyethylene glycol (PEG) moiety was attached to immobilize the mass reporters covalently or physically at the injection site. The following matrix metalloproteinase substrate sequence (MSS) is incorporated in two different versions with different sensitivity to MMPs. The MSS were applied in pairs for relative quantification consisting of the cleavable version synthesized with natural L-amino acids and the non-cleavable D-amino acid variant. The mass tag was synthesized with isotopically labelled amino acids and is separated from the MSS by a UV light-sensitive molecule. N-terminal the mass tag is followed by a tobacco etch virus protease (TEV) sensitive sequence, that is responsible to separate the mass tag from the affinity tag, which was either the Strep-tag II sequence or biotin and were added for purification purposes. Chapter 1 presents a step-by-step protocol on how to design a mass tag family allowing for multiplexed analysis by LC-MS/MS. The multiplexing is achieved by developing an isobar mass tag family with four family members, which are chromatographically indistinguishable, but due to the mass encoding principles they fragment in distinct y-type ions with a mass difference of 1 or 2 Da each in MS2. Furthermore, it is explained how to covalently attach the mass reporter peptides onto ECM by the activated calcium-catalyzed blood coagulation transglutaminase factor XIII (FXIIIa). The lysine of mass reporter’s TG sequence (D-domain of insulin-like growth factor-I (IGF-I)) and a glutamine in fibronectin are covalently crosslinked by FXIIIa and build an isopeptide bond. Elevated levels of MMP release the mass reporters from ECM by recognizing the inter-positioned MSS. The designed mass reporters were able to monitor enzyme activity in an in vitro setting with cell-derived ECM, which was shown in Chapter 2. The modular structured mass reporters were investigated in a proof of concept study. First, the different modules were characterized in terms of their MMP responsiveness and their sensitivity to TEV protease and UV light. Then the FXIIIa-mediated coupling reaction was detailed and the successful coupling on ECM was visualized by an immunosorbent assay or confocal laser scanning microscopy. Finally, the immobilized mass reporters on ECM were incubated with MMP-9 to investigate their multiplexing ability of MMP activity. The cleaved mass reporter fragments were purified in three steps and mass tags were analyzed as mix of all four in LC-MS/MS. Chapter 3 describes the change from an immobilizing system as seen in chapter 1 and 2 to a soluble enzyme activity monitoring system that was applied in an osteoarthritic mouse model. Instead of the immobilizing TG sequence the C-terminal MMS was extended with two amino acids where one holds an azide moiety to perform a strain-promoted azide-alkyne cycloaddition to a high molecular weight dibenzocyclooctyne-polyethylene glycol (DBCO-PEG), which was chosen to retain the mass reporters at the injection site. Furthermore, the N-terminal affinity tag was extended with a 2.5 kDa PEG chain to increase the half-life of the mass reporter peptides after MMP release. The systems biocompatibility was proved but its enzyme monitoring ability in an in vivo setting could not be analyzed as samples degraded during shipping resulting from the Chinese customs blocking transport to Germany. In summary the diagnostic peptide system was developed in two variants. The immobilized version one from chapter 1 and 2 was designed to be covalently attached to ECM by the transglutaminase-mediated cross-linking reaction. In an in vitro setting the functionality of the mass reporter system for the detection of MMP activity was successfully verified. The second variant comprises of a soluble mass reporter system that was tested in an OA mouse model and showed biocompatibility. With these two designed systems this thesis provides a flexible platform based on multiplexed analysis with mass-encoded peptides to characterize cell culture models regarding their MMP activity, to deploy cell-derived ECM as endogenous depot scaffold and to develop a mass tag family that enables simultaneous detection of at least four mass tags. N2 - Zellkulturmodelle sind hilfreiche Werkzeuge, um entzündliche Krankheiten, wie rheumatoide Arthritis (RA), Osteoarthritis (OA), Arteriosklerose und Asthma, die mit einer erhöhten Aktivität von Matrixmetalloproteinasen (MMPs) verbunden sind, zu untersuchen. Viele Zellkulturmodelle fokussieren sich hauptsächlich auf die Sekretion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren oder die direkten Effekte der Entzündung auf die Gewebezerstörung. Obwohl die zentrale Rolle der MMPs in entzündlichen Erkrankungen bekannt ist, wird die Untersuchung von MMPs in diesen Zellkulturmodellen vernachlässigt. MMPs spielen eine wichtige Rolle in der Krankheitsentstehung, da sie am Abbau von Elastin in den Wänden der Alveolen bei chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), an der Gefäßneubildung und Metastasenbildung von Tumoren und an Knorpelabbau und Knochenzerstörung in Gelenkerkrankungen beteiligt sind. In RA und OA werden MMPs von Osteozyten, Synoviozyten und infiltrierenden Immunzellen als Antwort auf erhöhte Konzentrationen an entzündlichen Mediatoren, wie Wachstumsfaktoren und Zytokinen, sekretiert. MMPs sind Zink- und Calcium-abhängige Proteinasen, die eine wichtige Rolle beim physiologischen und pathologischen Turnover der extrazellulären Matrix (EZM) spielen. Ihre Substratspezifität verleiht ihnen die Fähigkeit alle Hauptkomponenten der EZM, wie Aggrecan, Elastin, Gelatin, Fibronectin und alle Typen des Kollagens, sogar die dreifach-Helix der Kollagenmonomere, abzubauen. Die EZM besteht aus zwei großen, drei-dimensional vernetzten Makromolekülklassen: zu der ersten Klasse zählen die faserigen Proteine, wie Kollagen- und Elastinfasern, die für die Struktur der EZM, ihre Zugfestigkeit, Elastizität, reversible Dehnbar- und Verformbarkeit verantwortlich sind und zur zweiten Klasse gehören die Proteoglykane, die aus Glykosaminoglykanketten (GAG), die kovalent an Kernproteine gebunden sind, bestehen und zusammen multifunktional in Signalwege und Zellinteraktionen involviert sind. Jedes Gewebe und Organ ist mit EZM ausgekleidet und Änderungen in der EZM Struktur können zur Krankheitsentstehung beitragen, z.B. bei verletztem und fibrotischem Gewebe, COPD oder Tumoren. Diese Promotion fokussiert sich primär auf die Entwicklung eines diagnostischen Peptidsystem, das es ermöglicht durch die Anwendung der isobaren massencodierten Strategie Informationen über MMP Aktivität der EZM zu gewinnen. Eine isotopenmarkierte Peptidsequenz stellt dabei das Kernelement des entwickelten Systems dar, welche als Antwort auf erhöhte MMP Level von der EZM freigegeben wird und eine gebündelte Detektion per Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) erlaubt. Die Massenreporter besitzen einen modularen Aufbau mit unterschiedlichen Funktionalitäten. Am C-terminalen Ende wurde entweder eine Transglutaminase (TG) Erkennungssequenz oder eine hochmolekulare Polyethylenglykol (PEG) Einheit angehängt, um die Massenreporter kovalent oder physikalische am Applikationsort zu immobilisieren. Die darauffolgende eingeschobene Matrixmetalloproteinase Substratsequenz (MSS) wurde in zwei verschiedenen Versionen mit unterschiedlicher MMP Sensitivität angewendet. Die MSSs werden für die relative Quantifizierung jeweils in Paaren verwendet, wobei die spaltbare Variante mit natürlichen L-Aminosäuren synthetisiert wird und die nicht-spaltbare Sequenz mit D-Aminosäuren. Der Mass tag wird mit isotopenmarkierten Aminosäuren versehen und ist von dem MSS durch ein lichtsensitives Molekül getrennt. N-terminal des Mass tags folgt die TEV Protease-sensitive Peptidsequenz, die zur Abspaltung des Affinitäts-tags vom Mass tag eingebaut wurde. Zur Aufreinigung dient ein Affinitätstag, der entweder aus der Strep-tag II Sequenz oder Biotin besteht. In Kapitel 1 werden Schritt-für-Schritt Protokolle präsentiert, für die Gestaltung und Entwicklung einer Gruppe von isotopenmarkierten Peptiden, die eine simultane Analyse per LC-MS/MS zulassen. Die gleichzeitige Detektion wird dadurch erreicht, dass jedes Gruppenmitglied in der Summe die gleiche Molekülmasse besitzt, aber aufgrund der angewandten isobaren Isotopenmarkierungen fragmentieren diese in MS2 in spezifische y-Typ Ionen, die einen Massenunterschied von 1 oder 2 Da besitzen. Zudem wurde erklärt, wie die Massenreporter Peptide durch den aktivierten, Calcium-abhängigen Blutkoagulationsfaktor XIII (FXIIIa) kovalent an die EZM gebunden werden. Bei der enzymatischen Reaktion wird durch das Quervernetzen des Lysins der TG Aminosäuresequenz (der D-Domäne von IGF-I) der Massenreporter mit dem Glutamin der Aminosäureerkennungssequenz in Fibronectin eine Isopeptidbindung gebildet. Die Freisetzung der Massenreporter von der EZM erfolgt aufgrund des erhöhten MMP Level und geschieht durch die Spaltung der dazwischenliegenden MSS. Die entwickelten Massenreporter waren in der Lage die Enzymaktivität in einer aus Fibroblasten stammenden in vitro Umgebung aus EZM zu beobachten, was in Kapitel 2 dargestellt wird. Die modulare Struktur der Massenreporter wurde in einer Machbarkeitsstudie untersucht. Zuerst wurden die verschiedenen Module bezüglich ihrer Ansprechempfindlichkeit auf MMP und ihrer Sensitivität gegenüber der TEV Protease und UV-Licht charakterisiert. Dann wurden die vier Peptide FXIIIa-vermittelt an die EZM gekoppelt und die erfolgreiche Kopplung an EZM wurde mit Hilfe eines immunologischen Verfahrens oder konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert. Abschließend wurden die auf der EZM immobilisierten Massenreporter mit MMP-9 inkubiert, um deren Fähigkeit der gleichzeitigen Detektion von MMP Aktivität zu untersuchen. Die abgespalteten Massenreporterfragmente wurden in drei Schritten aufgereinigt und die vier isotopenmarkierten Tags wurden als Mix mittels LC-MS/MS analysiert. Kapitel 3 beschreibt die Änderung der aus Kapitel 1 und 2 bekannten immobilisierten System zu einem löslichen System, das die Enzymaktivität in Körperflüssigkeiten bestimmen soll und in einem Mausmodell für Osteoarthritis getestet wurde. Anstelle der immobilisierenden TG Sequenz wurde der C Terminus der MSS um zwei Aminosäuren erweitert. Eine Aminosäure trägt eine Azidgruppe um eine Azid-Alkin Cycloaddition mit einem hochmolekularen PEG durchzuführen, die ausgewählt wurde, um die Massenreporter an der Injektionsstelle zurückzuhalten. Des Weiteren wurde der Affinitäts-tag mit einer 2.5 kDa PEG-Kette erweitert, um die Halbwertszeit des von MMPs freigesetzten Massenreporterpeptides zu erhöhen. Die Biokompatibilität des Systems wurde erwiesen, allerdings war es nicht möglich die MMP Aktivität in einem in vivo Model zu zeigen, da eine Analyse der Proben aufgrund von Versand- und Zollproblemen und damit verbundenen Instabilitäten nicht möglich war. Zusammenfassend wurde ein diagnostische Peptidsystem bestehend aus zwei Varianten entwickelt. Die zu immobilisierende Version aus Kapitel 1 und 2 wurde so konzipiert, dass die Peptide durch die Transglutaminase vermittelte Quervernetzungsreaktion kovalent an EZM gebunden werden. In einem in vitro Model wurde die Funktionalität des Massenreporter Systems hinsichtlich der Detektion von MMP Aktivität erfolgreich bestätigt. Die zweite Variante, bestehend aus einem löslichen Massenreporter System, wurde in einem Osteoarthritis Mausmodel getestet und zeigte Biokompatibilität. Mit diesen zwei entworfenen Systemen stellt diese Dissertation eine flexible Plattform zur Verfügung, die basierend auf der multiplexen Detektion von isotopenmarkierten Peptiden, für die Charakterisierung von Zellkulturmodellen bezüglich deren MMP Aktivität genutzt wird, die zelluläre EZM als endogenes Depot anwendet und die durch die Entwicklung einer Familie aus isotopenmarkierten Tags eine simultane Detektion von mindestens vier Tags erlaubt. KW - Extrazelluläre Matrix KW - Tandem-Massenspektrometrie KW - Proteasen KW - Markierte Verbindungen KW - isotopically labelled peptides KW - tandem mass spectrometry KW - matrix metalloproteinase KW - extracellular matrix KW - transglutaminase Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229377 ER - TY - THES A1 - Gador, Eva T1 - Strategies to improve the biological performance of protein therapeutics T1 - Strategien zur Verbesserung der biologischen Wirkung von Proteintherapeutika N2 - During the last decades the number of biologics increased dramatically and several biopharmaceutical drugs such as peptides, therapeutic proteins, hormones, enzymes, vaccines, monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates conquered the market. Moreover, administration and local delivery of growth factors has gained substantial importance in the field of tissue engineering. Despite progress that has been made over the last decades formulation and delivery of therapeutic proteins is still a challenge. Thus, we worked on formulation and delivery strategies of therapeutic proteins to improve their biological performance. Phase I of this work deals with protein stability with the main focus on a liquid protein formulation of the dimeric fusion protein PR-15, a lesion specific platelet adhesion inhibitor. In order to develop an adequate formulation ensuring the stability and bioactivity of PR-15 during storage at 4 °C, a pH screening, a forced degradation and a Design of Experiments (DoE) was performed. First the stability and bioactivity of PR-15 in 50 mM histidine buffer in relation to pH was evaluated in a short-term storage stability study at 25 °C and 40 °C for 4 and 8 weeks using different analytical methods. Additionally, potential degradation pathways of PR-15 were investigated under stressed conditions such as heat treatment, acidic or basic pH, freeze-thaw cycles, light exposure, induced oxidation and induced deamidation during the forced degradation study. Moreover, we were able to identify the main degradation product of PR-15 by performing LC/ESI-MS analysis. Further optimization of the injectable PR 15 formulation concerning pH, the choice of buffer and the addition of excipients was studied in the following DoE and finally an optimal PR-15 formulation was found. The growth factors BMP-2, IGF-I and TGF-β3 were selected for the differentiation of stem cells for tissue engineering of cartilage and bone in order to prepare multifunctionalized osteochondral implants for the regeneration of cartilage defects. Silk fibroin (SF) was chosen as biomaterial because of its biocompatibility, mechanical properties and its opportunity for biofunctionalization. Ideal geometry of SF scaffolds with optimal porosity was found in order to generate both tissues on one scaffold. The growth factors BMP-2 and IGF-I were modified to allow spatially restricted covalent immobilization on the generated porous SF scaffolds. In order to perform site-directed covalent coupling by the usage of click chemistry on two opposite sides of the scaffold, we genetically engineered BMP-2 (not shown in this work; performed by Barbara Tabisz) and IGF-I for the introduction of alkyne or azide bearing artificial amino acids. TGF β3 was immobilized to beads through common EDC/NHS chemistry requiring no modification and distributed in the pores of the entire scaffold. For this reason protein modification, protein engineering, protein immobilization and bioconjugation are investigated in phase II. Beside the synthesis the focus was on the characterization of such modified proteins and its conjugates. The field of protein engineering offers a wide range of possibilities to modify existing proteins or to design new proteins with prolonged serum half-life, increased conformational stability or improved release rates according to their clinical use. Site-directed click chemistry and non-site-directed EDC/NHS chemistry were used for bioconjugation and protein immobilization with the aim to underline the preferences of site-directed coupling. We chose three strategies for the incorporation of alkyne or azide functionality for the performance of click reaction into the protein of interest: diazonium coupling reaction, PEGylation and genetic engineering. Azido groups were successfully introduced into SF by implementation of diazonium coupling and alkyne, amino or acid functionality was incorporated into FGF-2 as model protein by means of thiol PEGylation. The proper folding of FGF-2 after PEGylation was assessed by fluorescence spectroscopy, WST-1 proliferation assay ensured moderate bioactivity and the purity of PEGylated FGF-2 samples was monitored with RP-HPLC. Moreover, the modification of native FGF-2 with 10 kDa PEG chains resulted in enhanced thermal stability. Additionally, we genetically engineered one IGF-I mutant by incorporating the unnatural amino acid propargyl-L-lysine (plk) at position 65 into the IGF-I amino acid sequence and were able to express hardly verifiable amounts of plk-IGF-I. Consequently, plk-IGF-I expression has to be further optimized in future studies in order to generate plk-IGF-I with higher yields. Bioconjugation of PEGylated FGF-2 with functionalized silk was performed in solution and was successful for click as well as EDC/NHS chemistry. However, substantial amounts of unreacted PEG-FGF-2 were adsorbed to SF and could not be removed from the reaction mixture making it impossible to expose the advantages of click chemistry in relation to EDC/NHS chemistry. The immobilization of PEG-FGF-2 to microspheres was a trial to increase product yield and to remove unreacted PEG-FGF-2 from reaction mixture. Bound PEG-FGF-2 was visualized by fluorescence imaging or flow cytometry and bioactivity was assessed by analysis of the proliferation of NIH 3T3 cells. However, immobilization on beads raised the same issue as in solution: adsorption caused by electrostatic interactions of positively charged FGF-2 and negatively charged SF or beads. Finally, we were not able to prove superiority of site-directed click chemistry over non-site-directed EDC/NHS. The skills and knowledge in protein immobilization as well as protein characterization acquired during phase II helped us in phase III to engineer cartilage tissue in biofunctionalized SF scaffolds. The approach of covalent immobilization of the required growth factors is relevant because of their short in vivo half-lives and aimed at controlling their bioavailability. So TGF-β3 was covalently coupled by means of EDC/NHS chemistry to biocompatible and biostable PMMA beads. Herein, we directly compared bioactivity of covalently coupled and adsorbed TGF-β3. During the so-called luciferase assay bioactivity of covalent coupled as well as adsorbed TGF-β3 on PMMA beads was ensured. In order to investigate the real influence of EDC/NHS chemistry on TGF-β3’s bioactivity, the amount of immobilized TGF-β3 on PMMA beads was determined. Therefore, an ELISA method was established. The assessment of total amount of TGF-β3 immobilized on the PMMA beads allowed as to calculate coupling efficiency. A significantly higher coupling efficiency was determined for the coupling of TGF-β3 via EDC/NHS chemistry compared to the reaction without coupling reagents indicating a small amount of adsorbed TGF-β3. These results provide opportunity to determine the consequence of coupling by means of EDC/NHS chemistry for TGF β3 bioactivity. At first sight, no statistically significant difference between covalent immobilized and adsorbed TGF-β3 was observed regarding relative luciferase activities. But during comparison of total and active amount of TGF-β3 on PMMA beads detected by ELISA or luciferase assay, respectively, a decrease of TGF-β3’s bioactivity became apparent. Nevertheless, immobilized TGF β3 was further investigated in combination with SF scaffolds in order to drive BMSCs to the chondrogenic lineage. According to the results obtained through histological and immunohistochemical studies, biochemical assays as well as qRT-PCR of gene expression from BMSCs after 21 days in culture immobilized TGF-β3 was able to engineer cartilage tissue. These findings support the thesis that local presentation of TGF β3 is superior towards exogenous TGF β3 for the development of hyaline cartilage. Furthermore, we conclude that covalent immobilized TGF β3 is not only superior towards exogenously supplemented TGF-β3 but also superior towards adsorbed TGF-β3 for articular hyaline cartilage tissue engineering. Diffusion processes were inhibited through covalent immobilization of TGF-β3 to PMMA beads and thereby a stable and consistent TGF-β3 concentration was maintained in the target area. With the knowledge acquired during phase II and III as well as during the studies of Barbara Tabisz concerning the expression and purification of plk-BMP-2 we made considerable progress towards the formation of multifunctionalized osteochondral implants for the regeneration of cartilage defects. However, further studies are required for the translation of these insights into the development of multifunctionalized osteochondral SF scaffolds. N2 - In den letzten Jahrzehnten stieg die Zahl der Biologika dramatisch an und mehrere biopharmazeutische Arzneimittel wie Peptide, therapeutische Proteine, Hormone, Enzyme, Impfstoffe, monoklonale Antikörper und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate eroberten den Markt. Darüber hinaus hat die Applikation und lokale Verabreichung von Wachstumsfaktoren im Bereich des Tissue Engineerings eine wesentliche Bedeutung erlangt. Trotz der in den letzten Jahrzehnten erzielten Fortschritte ist die Formulierung und Verabreichung therapeutischer Proteine noch immer eine Herausforderung. Daher haben wir uns in dieser Arbeit mit der Formulierung und Verabreichung therapeutischer Proteine beschäftigt und Strategien entwickelt, um deren biologische Wirkung zu verbessern. In Phase I dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf die Stabilität des dimeren Fusionsproteins PR 15, einem Inhibitor der Adhäsion von Plättchen an arterielle Gefäßläsionen. Um eine geeignete flüssige Formulierung zu entwickeln, welche die Stabilität und Bioaktivität von PR-15 während der Lagerung bei 4 °C sicherstellt, wurde ein pH Screening, eine Forced Degradation Studie und ein Design of Experiments (DoE) durchgeführt. Zuerst wurde die Stabilität und Bioaktivität von PR-15 bei verschiedenen pH Werten in 50 mM Histidinpuffer in einer Kurzzeitstabilitätsstudie bei 25 °C und 40 °C nach 4 und 8 Wochen mit Hilfe verschiedener analytischer Methoden beobachtet. Des Weiteren wurden mögliche Abbauwege von PR-15 unter Stressbedingungen wie erhöhter Temperatur, saurem oder basischem pH-Wert, Einfrier-Auftau-Zyklen, Lichteinwirkung, induzierter Oxidation sowie induzierter Deamidierung während der Forced Degradation Studie untersucht. Darüber hinaus konnten wir das Hauptabbauprodukt von PR-15 durch LC/ESI-MS Analysen identifizieren. Im folgenden DoE wurde die injizierbare PR-15 Formulierung weiter optimiert und bezüglich pH, der Wahl des Puffers sowie der Zugabe von Hilfsstoffen analysiert, bis letztendlich eine optimale PR 15-Formulierung gefunden wurde. Die Wachstumsfaktoren BMP-2, IGF-I und TGF-β3 wurden zur Differenzierung von Stammzellen für das Tissue Engineering von Knochen und Knorpel ausgewählt, um multifunktionalisierte osteochondrale Implantate zur Regeneration von Knorpeldefekten herzustellen. Seidenfibroin (SF) wurde aufgrund seiner Biokompatibilität, seiner mechanischen Eigenschaften und seiner Möglichkeiten zur Biofunktionalisierung als Biomaterial gewählt. Zuerst wurden SF-Scaffolds mit idealer Geometrie und optimaler Porosität erzeugt, um sowohl Knochen also auch Knorpel auf einem Scaffold herzustellen. Um eine räumlich begrenzte kovalente Immobilisierung der Wachstumsfaktoren BMP-2 und IGF-I auf den porösen SF-Scaffolds zu ermöglichen, wurden diese mit unnatürlichen Aminosäuren genetisch modifiziert. Das Einführen von Alkin- bzw. Azidresten in die Aminosäuresequenz von BMP-2 (in dieser Arbeit nicht gezeigt; von Barbara Tabisz durchgeführt) und IGF-I erlaubt unter Verwendung der Click-Chemie eine ortsgerichtete kovalente Kopplung der Wachstumsfaktoren an zwei gegenüberliegenden Seiten der Scaffolds. TGF-β3 wurde durch gewöhnliche EDC/NHS-Chemie, welche keine Modifikation erforderte, kovalent an Mikrosphären immobilisiert und in den Poren des gesamten SF-Scaffolds verteilt. Daher beschäftigen wir uns in Phase II mit der Modifikation von Proteinen, dem Protein Engineering, der Immobilisation von Proteinen und mit Biokonjugation. Neben der Synthese lag der Fokus auf der Charakterisierung modifizierter Proteine und deren Konjugaten. Das Gebiet des Protein Engineerings bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten, bestehende Proteine zu modifizieren oder neue Proteine mit verlängerter Serumhalbwertszeit, erhöhter konformativer Stabilität oder verbesserten Freisetzungsraten entsprechend der klinischen Anwendung zu entwickeln. Die ortsspezifische Click-Chemie und die nicht-ortsspezifische EDC/NHS-Chemie wurden für die Biokonjugation und die Immobilisierung von Proteinen verwendet mit dem Ziel, die Vorzüge der ortsgerichteten Kopplung hervorzuheben. Für den Einbau der für die Durchführung der Click-Reaktion erforderlichen Alkin- bzw. Azidfunktionalität in das betreffende Protein wurden drei Strategien ausgewählt: die Azokupplung, die PEGylierung und die gentechnische Modifizierung. Azidgruppen wurden mittels Azokupplung erfolgreich in SF eingebaut und die Alkin-, Amino- oder Säurefunktionalität wurde mittels PEGylierung der Cysteine in das Modellprotein FGF-2 integriert. Die korrekte Faltung von FGF-2 nach erfolgreicher PEGylierung wurde durch Fluoreszenzspektroskopie bestätigt, im WST-1 Proliferationsassay wurde eine angemessene Bioaktivität festgestellt und die Reinheit von PEGylierten FGF-2 wurde mittels RP-HPLC analysiert. Darüber hinaus führte die Modifikation von nativem FGF-2 mit 10 kDa PEG-Ketten zu einer erhöhten thermischen Stabilität. Des Weiteren wurde ein IGF-I-Mutant gentechnisch hergestellt, indem die unnatürliche Aminosäure Propargyl-L-Lysin (Plk) an Position 65 in die IGF-I-Sequenz eingebaut wurde. Da letztendlich lediglich kaum nachweisbare Mengen an Plk-IGF-I exprimiert werden konnten, muss die Plk-IGF-I-Expression in anschließenden Studien weiter optimiert werden, um Plk-IGF-I mit höheren Ausbeuten erzeugen zu können. Die Biokonjugation von PEGyliertem FGF-2 und funktionalisierter Seide wurde sowohl mittels Click- als auch mittels EDC/NHS-Chemie erfolgreich durchgeführt. Allerdings wurden erhebliche Mengen PEG-FGF-2 lediglich an SF adsorbiert und nicht kovalent gekoppelt und konnten schlussendlich nicht aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Die anschließende Immobilisierung von PEG-FGF-2 an Mikrosphären, war ein Versuch die Ausbeute der Reaktion zu erhöhen und adsorbiertes PEG-FGF-2 leichter zu entfernen. Immobilisiertes PEG-FGF-2 wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und/oder Durchflusszytometrie nachgewiesen und die Bioaktivität wurde durch die Analyse der Proliferation von NIH-3T3-Zellen ermittelt. Die Immobilisierung auf Mikrosphären führte jedoch zu demselben Problem wie in Lösung: Adsorption von positiv geladenem FGF-2 an negativ geladenes SF bzw. negativ geladenen Mikrosphären durch elektrostatische Wechselwirkungen. Schließlich waren wir nicht in der Lage, die Überlegenheit der ortsgerichteten Click-Chemie gegenüber der nicht-ortsgerichteten EDC/ NHS-Chemie zu beweisen. Die während Phase II erworbenen Fähigkeiten und Kenntnisse im Bereich der Immobilisierung und Charakterisierung von Proteinen halfen uns in Phase III Knorpelgewebe in biofunktionalisierten SF-Scaffolds zu erzeugen. Der Ansatz der kovalenten Immobilisierung, der für das Tissue Engineering von Knorpel erforderlichen Wachstumsfaktoren, ist aufgrund ihrer kurzen in vivo Halbwertszeiten von Bedeutung und zielt darauf ab, ihre Bioverfügbarkeit zu kontrollieren. So wurde TGF-β3 mittels EDC/NHS-Chemie kovalent an biokompatible und biostabile PMMA-Mikrosphären gekoppelt. Mit Hilfe des sogenannten Luciferase-Assays wurden die Bioaktivitäten von kovalent gekoppeltem sowie von adsorbiertem TGF-β3 auf PMMA-Mikrosphären ermittelt. Um die Kopplungseffizienz zu berechnen und den tatsächlichen Einfluss der EDC/NHS-Chemie auf die Bioaktivität von TGF-β3 zu untersuchen, wurde die Menge an immobilisiertem TGF-β3 auf PMMA-Mikrosphären mittels ELISA bestimmt. Für die Kopplung von TGF-β3 mittels EDC/NHS-Chemie wurde eine signifikant höhere Kopplungseffizienz im Vergleich zu der Reaktion ohne Kopplungsreagenzien, welche eine geringe Menge an adsorbiertem TGF-β3 zeigte, bestimmt. Bei alleiniger Betrachtung der Ergebnisse des Luciferase-Assays, bei welchem kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen kovalent immobilisiertem und adsorbiertem TGF-β3 bezüglich der relativen Luciferase-Aktivität beobachtet wurde, scheint es als hätte die EDC/NHS-Kopplung keinen Einfluss auf die Bioaktivität von TGF β3. Beim Vergleich der mittels ELISA bestimmten TGF β3 Gesamtmenge und der mittels Luciferase-Assay bestimmten Menge an aktivem TGF-β3 auf den PMMA-Mikrosphären, wurde jedoch ein Verlust der Bioaktivität von TGF-β3 durch die EDC/NHS-Kopplung deutlich. Ungeachtet dessen, wurde immobilisiertes TGF-β3 genutzt, um Knorpelgewebe in SF-Scaffolds aus BMSCs zu generieren. Nach den Ergebnissen der histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen, der biochemischen Assays sowie der qRT-PCR der Genexpression von BMSCs nach 21 Tagen in Kultur, gelang es uns unter Verwendung von immobilisiertem TGF-β3 Knorpelgewebe aufzubauen. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass die lokale Präsentation von TGF-β3 gegenüber exogen zugegebenem TGF-β3 für die Entwicklung von hyalinem Knorpel überlegen ist. Außerdem schließen wir daraus, dass kovalent immobilisiertes TGF-β3 nicht nur gegenüber exogen zugegebenem TGF-β3 für die Entwicklung von hyalinem Knorpelgewebe überlegen ist, sondern auch gegenüber adsorbiertem TGF-β3. Diffusionsprozesse konnten durch kovalente Immobilisierung von TGF-β3 an PMMA-Mikrosphären verhindert werden und damit eine stabile und gleichmäßige TGF β3-Konzentration am Wirkort aufrechterhalten werden. Mit den in Phase II und III gewonnenen Erkenntnissen und den Untersuchungen von Barbara Tabisz zur Expression und Aufreinigung von plk-BMP-2 haben wir erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung multifunktionaler osteochondraler Implantate zur Regeneration von Knorpeldefekten gemacht. Für die Umsetzung dieser Erkenntnisse zur Herstellung multifunktionaler osteochondraler SF-Scaffolds sind jedoch weitere Studien erforderlich. KW - biologics KW - protein therapeutics KW - TGF-β3 KW - IGF-I KW - FGF-2 KW - injectable protein formulation KW - protein modification KW - bioconjugation KW - click chemistry KW - EDC-NHS chemistry KW - osteochondral implant KW - cartilage tissue engineering Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161798 ER - TY - THES A1 - Gunesch, Sandra T1 - Molecular Mode of Action of Flavonoids: From Neuroprotective Hybrids to Molecular Probes for Chemical Proteomics T1 - Wirkmechanismen von Flavonoiden: Von neuroprotektiven Hybriden zu Sonden für chemische Proteomik N2 - Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia, and currently, there is no treatment to cure or halt disease progression. Because the one-target strategy focusing on amyloid-β has failed to generate successful pharmaceutical treatment, this work studies natural products with pleiotropic effects focusing on oxidative stress and neuroinflammation as key drivers of disease progression. The central part of this work focused on flavonoids as neuroprotectants. 7-O-Esters of taxifolin and cinnamic or ferulic acid were synthesized and investigated towards their neuroprotective potential addressing aging and disease. 7-O-Feruloyl- and 7-O-cinnamoyltaxifolin showed overadditive effects in oxidative stress-induced assays in the mouse neuronal cell line HT22 and proved to be protective against neuroinflammation in microglial BV-2 cells. The overadditive effect translated to animals using an Aβ25-35-induced memory-impaired AD mouse model where the compounds were able to ameliorate short-term memory defects. While the disease-modifying effects in vivo were observed, the detailed mechanisms of action and intracellular targets of the compounds remained unclear. Hence, a chemical probe of the neuroprotective flavonoid ester 7-O-cinnamoyltaxifolin was developed and applied in an activity-based protein profiling approach. SERCA and ANT-1 were identified as potential targets. Further, chemical modifications on the flavonoids taxifolin, quercetin, and fisetin were performed. The achievements of this work are an important contribution to the use of secondary plant metabolites as neuroprotectants. Chemical modifications increased the neuroprotective effect of the natural products, and distinct intracellular pathways involved in the neuroprotective mechanisms were identified. The results of this work support the use of secondary plant metabolites as potential therapeutics and hint towards new pharmacological targets for the treatment of neurodegenerative disorders. N2 - Morbus Alzheimer ist die häufigste Form der Demenz und derzeit unheilbar. Die auf das Amyloidprotein fokussierte Medikamentenforschung konnte nicht zu einer erfolgreichen Therapie führen. In dieser Arbeit wurden Naturstoffe mit pleiotropischer Wirkung untersucht, die oxidativen Stress und Neuroinflammation als Schlüsselrollen für den Fortschritt der Krankheit adressieren. Das Flavonoid Taxifolin wurde in Position 7 mit Ferula- oder Zimtsäure verestert und hinsichtlich der neuroprotektiven Eigenschaften untersucht. Die Substanzen zeigten in Untersuchungen zu oxidativem Stress in der hippocampalen Mauszelllinie HT22 und in Untersuchungen neuronaler Entzündungsprozesse in BV-2 Mikroglia Zellen überadditive protektive Wirkung. Diese ließ sich auch auf ein Tiermodell übertragen. In einem Alzheimer Mausmodell konnten Beeinträchtigungen des Kurzzeitgedächtnisses durch die Verabreichung der Taxifolin-Zimtsäure- und -Ferulasäureester behoben werden. Trotz des krankheitsmodifizierenden Effekts in vivo sind die molekularen Mechanismen der Wirkung und die intrazellulären Zielstrukturen der Substanzen weitgehend unbekannt. Um dieses Problem zu adressieren, wurde eine chemische Sonde des Taxifolin-Zimtsäureesters entwickelt und synthetisiert, um Interaktionen der Substanz mit intrazellulären Proteinen mittels der sogenannten Activity Based Protein Profiling Methode aufzuklären. Hierbei konnten SERCA und ANT-1 als potenzielle Interaktionspartner identifiziert werden. Des Weiteren wurden chemische Modifikationen an den Flavonoiden Taxifolin, Quercetin und Fisetin durchgeführt. Die Erkenntnisse dieser Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag zu der Verwendung von pflanzlichen Sekundärmetaboliten als Substanzen mit neuroprotektiven Eigenschaften. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Entwicklung naturstoffbasierter Therapeutika, die dringend benötigt werden, um neue Strategien für die Behandlung komplexer, neurodegenerativer Erkrankungen hervorzubringen. KW - Flavonoide KW - Morbus Alzheimer KW - Alzheimerkrankheit KW - Flavonoide KW - Neuroprotektivum Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239360 ER - TY - THES A1 - Gutmann, Marcus T1 - Functionalization of cells, extracellular matrix components and proteins for therapeutic application T1 - Funktionalisierung von Zellen, extrazellulären Matrixbestandteilen und Proteinen für die therapeutische Anwendung N2 - Glycosylation is a biochemical process leading to the formation of glycoconjugates by linking glycans (carbohydrates) to proteins, lipids and various small molecules. The glycans are formed by one or more monosaccharides that are covalently attached, thus offering a broad variety depending on their composition, site of glycan linkage, length and ramification. This special nature provides an exceptional and fine tunable possibility in fields of information transfer, recognition, stability and pharmacokinetic. Due to their intra- and extracellular omnipresence, glycans fulfill an essential role in the regulation of different endogenous processes (e.g. hormone action, immune surveillance, inflammatory response) and act as a key element for maintenance of homeostasis. The strategy of metabolic glycoengineering enables the integration of structural similar but chemically modified monosaccharide building blocks into the natural given glycosylation pathways, thereby anchoring them in the carbohydrate architecture of de novo synthesized glycoconjugates. The available unnatural sugar molecules which are similar to endogenous sugar molecules show minimal perturbation in cell function and - based on their multitude functional groups - offer the potential of side directed coupling with a target substance/structure as well as the development of new biological properties. The chemical-enzymatic strategy of glycoengineering provides a valuable complement to genetic approaches. This thesis primarily focuses on potential fields of application for glycoengineering and its further use in clinic and research. The last section of this work outlines a genetic approach, using special Escherichia coli systems, to integrate chemically tunable amino acids into the biosynthetic pathway of proteins, enabling specific and site-directed coupling with target substances. With the genetic information of the methanogen archaea, Methanosarcina barkeri, the E. coli. system is able to insert a further amino acid, the pyrrolysine, at the ribosomal site during translation of the protein. The natural stop-codon UAG (amber codon) is used for this newly obtained proteinogenic amino acid. Chapter I describes two systems for the integration of chemically tunable monosaccharides and presents methods for characterizing these systems. Moreover, it gives a general overview of the structure as well as intended use of glycans and illustrates different glycosylation pathways. Furthermore, the strategy of metabolic glycoengineering is demonstrated. In this context, the structure of basic building blocks and the epimerization of monosaccharides during their metabolic fate are discussed. Chapter II translates the concept of metabolic glycoengineering to the extracellular network produced by fibroblasts. The incorporation of chemically modified sugar components in the matrix provides an innovative, elegant and biocompatible method for site-directed coupling of target substances. Resident cells, which are involved in the de novo synthesis of matrices, as well as isolated matrices were characterized and compared to unmodified resident cells and matrices. The natural capacity of the matrix can be extended by metabolic glycoengineering and enables the selective immobilization of a variety of therapeutic substances by combining enzymatic and bioorthogonal reaction strategies. This approach expands the natural ability of extracellular matrix (ECM), like the storage of specific growth factors and the recruitment of surface receptors along with synergistic effects of bound substances. By the selection of the cell type, the production of a wide range of different matrices is possible. Chapter III focuses on the target-oriented modification of cell surface membranes of living fibroblast and human embryonic kidney cells. Chemically modified monosaccharides are inserted by means of metabolic glycoengineering and are then presented on the cell surface. These monosaccharides can later be covalently coupled, by “strain promoted azide-alkyne cycloaddition“ (SPAAC) and/or “copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“ (CuAAC), to the target substance. Due to the toxicity of the copper catalysator in the CuAAC, cytotoxicity analyses were conducted to determine the in vivo tolerable range for the use of CuAAC on living cell systems. Finally, the efficacy of both bioorthogonal reactions was compared. Chapter IV outlines two versatile carrier – spacer – payload delivery systems based on an enzymatic cleavable linker, triggered by disease associated protease. In the selection of carrier systems (i) polyethylene glycol (PEG), a well-studied, Food and Drug Administration approved substance and very common tool to increase the pharmacokinetic properties of therapeutic agents, was chosen as a carrier for non-targeting systems and (ii) Revacept, a human glycoprotein VI antibody, was chosen as a carrier for targeting systems. The protease sensitive cleavable linker was genetically inserted into the N-terminal region of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) without jeopardizing protein activity. By exchanging the protease sensitive sequence or the therapeutic payload, both systems represent a promising and adaptable approach for establishing therapeutic systems with bioresponsive release, tailored to pre-existing conditions. In summary, by site-specific functionalization of various delivery platforms, this thesis establishes an essential cornerstone for promising strategies advancing clinical application. The outlined platforms ensure high flexibility due to exchanging single or multiple elements of the system, individually tailoring them to the respective disease or target site. N2 - Glykosylierung beschreibt einen auf biochemischen Reaktionen basierenden Prozess, welcher durch die Verknüpfung von Glykanen (Kohlenhydraten) mit Proteinen, Lipiden oder einer Vielzahl kleiner organischer Moleküle zur Bildung von Glykokonjugaten führt. Die Entstehung der Kohlenhydratketten erfolgt hierbei durch die kovalente Verknüpfung eines oder mehrerer verschiedener Einfachzucker, welche auf Grund unterschiedlicher Zusammensetzung der Bausteine, Verknüpfungsregion, Länge und Verzweigung eine hohe Diversität aufweisen. Diese Besonderheit ermöglicht eine außergewöhnliche Feinabstimmung im Bereich der Informationsübertragung, Erkennung, Stabilität und Pharmakokinetik. Aufgrund ihrer intra- und extrazellulären Omnipräsenz spielen Glykane zudem eine essentielle Rolle in der Regulierung verschiedenster körpereigener Prozesse (z.B. hormonelle Wirkung, Immunmodulation, Entzündungsreaktionen) und sind folglich ein zentraler Bestandteil bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Durch die Strategie des „Glycoengineering“ ist man in der Lage, strukturähnliche, aber chemisch modifizierte Zuckerbausteine in die natürlichen Glykosilierungswege einzubinden und diese somit in der Architektur der Kohlenstoffketten von neu-synthetisierten Glykokonjugaten zu verankern. Die hierfür zur Verfügung stehenden, unnatürlichen Zuckermoleküle führen auf Grund ihrer Ähnlichkeit zu körpereigenen Zuckern zu kaum relevanten Störungen der zellulären Funktion, bieten aber durch zahlreiche funktionelle Gruppen die Möglichkeit der gezielten Verknüpfung mit einer Zielsubstanz/-struktur und der Bildung neuer biologischer Eigenschaften. „Glycoengineering“ als chemisch-enzymatische Strategie bietet dabei eine wertvolle Ergänzung zu gentechnischen Ansätzen. Entsprechend beschäftigt sich diese Dissertation primär mit der Beschreibung potentieller Anwendungsgebiete des „Glycoengineering“ und dessen möglichen Einsatz in Klinik und Forschung. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt einen gentechnischen Ansatz, bei dem mit Hilfe von speziellen Escherichia coli Systemen chemisch modifizierbare Aminosäuren in den Biosyntheseweg von Proteinen eingebunden werden, wodurch anschließend eine spezifische und gerichtete Verknüpfung mit Zielsubstanzen ermöglicht wird. Hierbei benutzt das E. coli-System die genetische Information des methanbildenden Archaeas, Methanosarcina barkeri, mit der es in der Lage ist, eine weitere Aminosäure, das Pyrrolysin, bei der Translation eines Proteins am Ribosom einzufügen. Als Codon für diese neu gewonnene proteinogene Aminosäure fungiert das natürliche Stopp-Codon („amber codon“) UAG. Kapitel I beschreibt zwei Systeme für den Einbau von chemisch modifizierten Zuckern und zeigt Methoden für die Charakterisierung dieser Systeme auf. Es gibt zudem eine allgemeine Übersicht über den Aufbau und die Verwendung von Glykanen und veranschaulicht verschiedene Glykosilierungswege. Des Weiteren wird auch die Strategie des „metabolic glycoengineering“ erläutert. Hierbei wird der Aufbau der dabei verwendeten Grundbausteine dargestellt und auf die Epimerisierung der Zucker während deren Metabolismus eingegangen. Kapitel II überträgt das Konzept des „metabolic glycoengineering“ auf das extrazelluläre Netzwerk von Fibroblasten. Hierbei bietet der Einbau eines chemisch modifizierten Zuckerbausteins in die Matrix eine neue, elegante und biokompatible Möglichkeit der gezielten Verknüpfung von Zielsubstanzen. Die an der Neusynthese der Matrix beteiligten Bindegewebszellen sowie die isolierte Matrix wurden dabei im Vergleich zu nicht modifizierten Bindegewebszellen und Matrices charakterisiert. Durch den Aspekt des “metabolic glycoengineering” wird die natürliche Fähigkeit der Matrix erweitert und ermöglicht durch die Kombination verschiedener enzymatischer und bioorthogonal-chemischer Strategien die selektive Immobilisation einer Vielzahl von therapeutischen Substanzen. Dieser Ansatz erweitert das natürliche Spektrum der Extrazellulärmatrix (ECM), wie Bindung von spezifischen Wachstumsfaktoren, Rekrutierung von Oberflächenrezeptoren und damit einhergehend synergistische Effekte der gebundenen Stoffe. Durch die Auswahl des Zelltyps wird zudem ein breites Spektrum an verschiedenen Matrices ermöglicht. Kapitel III befasst sich mit der Möglichkeit, die Zellmembran von lebenden Fibroblasten sowie menschliche embryonale Nierenzellen gezielt zu verändern. Durch „metabolic glycoengineering“ werden auch hier chemisch modifizierte Zuckerbausteine eingefügt, die dabei auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Anschließend können diese Zucker mittels „ringspannungs-geförderter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“strain promoted azide-alkyne cycloaddition“, SPAAC) und „Kupfer(I)-katalysierter Azid-Alkin Cycloaddition“ (“copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition“, CuAAC) umgesetzt werden, was eine kovalente Verknüpfung mit einer Zielsubstanz ermöglicht. Aufgrund der Toxizität des Kupferkatalysators in der CuAAC wurde anhand von zytotoxischen Untersuchungen nach einem in vivo vertretbaren Bereich für diese Reaktion gesucht, um die CuAAC auch für lebende Systeme verwendbar zu machen. Zuletzt wurde die Effizienz dieser bioorthogonalen Reaktionen miteinander verglichen. Kapitel IV beschreibt zwei vielseitig einsetzbare „carrier – spacer – payload“ Therapiesysteme (Träger-Verbindungsstück-Therapeutikum-Systeme), basierend auf einem Verbindungsstück (Linker), dessen Spaltung enzymatisch durch krankheitsspezifisch prävalente Proteasen ausgelöst wird. Bei der Auswahl der Trägersysteme wurde für das nicht-zielgerichtete System Polyethylenglycol (PEG) als Träger eingesetzt, eine gut untersuchte, „Food and Drug Administration“ zugelassene Substanz, welche als sehr gängiges Mittel zur Verbesserung der pharmakologischen Eigenschaften verwendet wird. Für das zielgerichtete System diente Revacept als Träger, ein humaner Glykoprotein VI-Antikörper. Der Protease-sensitive Linker wurde genetisch in der N-terminalen Region des Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 verankert, ohne dabei die Bioaktivität zu gefährden. Durch den Austausch der Protease-sensitiven Erkennungssequenz oder des Therapeutikums stellen beide Systeme einen vielversprechenden und anpassungsfähigen Ansatz für therapeutische Systeme dar, welche auf ein bereits bestehendes Erkrankungsbild genau zugeschnitten werden können. Zusammengefasst setzt diese Arbeit durch eine spezifische Funktionalisierung von verschiedenen Therapiesysteme einen wichtigen Meilenstein für vielversprechende Strategien zur Verbesserung der klinischen Anwendbarkeit. Durch den Austausch einer oder mehrerer Komponenten des Systems gewährleisten die hier beschriebenen Therapiesysteme eine hohe Anpassungsfähigkeit, wodurch sie individuell auf die jeweilige Krankheit oder den jeweiligen Zielort angepasst werden können. KW - Glykosylierung KW - Extrazelluläre Matrix KW - Zelloberfläche KW - Antikörper KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Glycoengineering KW - Drug delivery platforms KW - Protease-sensitive release Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170602 ER - TY - THES A1 - Güntzel, Paul Mathias T1 - Bioinspired Ion Pairs Transforming Poorly Water-soluble Compounds into Protic Ionic Liquids and Deep Eutectic Solvents T1 - Bioinspirierte Ionenpaare Wandeln Schlecht-wasserlösliche Verbindungen in Protische Ionische Flüssigkeiten und Tiefe Eutektische Lösungsmittel N2 - Microbial, mammalian and plant cells produce and contain secondary metabolites, which typically are soluble in water to prevent cell damage by crystallization. The formation of ion pairs, e.g. with carboxylic acids or mineral acids, is a natural blueprint to keep basic metabolites in solution. It was aimed at showing whether the mostly large carboxylates form soluble protic ionic liquids (PILs) with basic natural products resulting in enhanced aqueous solubility. Furthermore, their supramolecular pattern in aqueous solution was studied. Thereby, naturally occurring carboxylic acids were identified being appropriate counterions for natural basic compounds and facilitate the formation of PILs with their beneficial characteristics, like improved dissolution rate and enhanced apparent solubility. N2 - Mikrobielle, Säugetier- und Pflanzenzellen produzieren und enthalten Sekundärmetaboliten, welche in Wasser gelöst vorliegen, um Zellschäden (z.B. durch Kristallisation) zu vermeiden. Die Bildung von Ionenpaaren, beispielsweise mit Carbonsäuren oder Mineralsäuren, ist eine natürliche Strategie, um basische Metaboliten in Lösung zu halten. Es sollte gezeigt werden, dass die vergleichsweise großen Carboxylate lösliche protische ionische Flüssigkeiten (PILs) mit basischen Naturstoffen bilden, was zu einer verbesserten Wasserlöslichkeit führt. Weiterhin wurde das supramolekulare Verhalten der PILs in wässriger Lösung untersucht. Dabei wurden natürlich vorkommende Carbonsäuren als geeignete Gegenionen für natürliche basische Verbindungen identifiziert. Die resultierenden PILs zeigten eine verbesserte Auflösungsrate und verbesserte scheinbare Löslichkeit. KW - Ionic Liquids KW - Carboxylates KW - Deep Eutectics KW - Ion Pairs KW - Protic Ionic Liquids Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219806 ER - TY - THES A1 - Hanio, Simon T1 - The impact of bile on intestinal permeability of drug substances T1 - Der Einfluss der Galle auf die intestinale Permeabilität von Arzneimittelwirkstoffen N2 - Most medicines are taken orally. To enter the systemic circulation, they dissolve in the intestinal fluid, cross the epithelial barrier, and pass through the liver. Intestinal absorption is driven by the unique features of the gastrointestinal tract, including the bile colloids formed in the lumen and the mucus layer covering the intestinal epithelium. Neglecting this multifaceted environment can lead to poor drug development decisions, especially for poorly water-soluble drugs that interact with bile and mucus. However, there is a lack of a rationale nexus of molecular interactions between oral medicines and gastrointestinal components with drug bioavailability. Against this background, this thesis aims to develop biopharmaceutical strategies to optimize the presentation of oral therapeutics to the intestinal epithelial barrier. In Chapter 1, the dynamics of bile colloids upon solubilization of the poorly-water soluble drug Perphenazine was studied. Perphenazine impacted molecular arrangement, structure, binding thermodynamics, and induced a morphological transition from vesicles to worm-like micelles. Despite these dynamics, the bile colloids ensured stable relative amounts of free drug substance. The chapter was published in Langmuir. Chapter 2 examined the impact of pharmaceutical polymeric excipients on bile-mediated drug solubilization. Perphenazine and Imatinib were introduced as model compounds interacting with bile, whereas Metoprolol did not. Some polymers altered the arrangement and geometry of bile colloids, thereby affecting the molecularly soluble amount of those drugs interacting with bile. These insights into the bile-drug-excipient interplay provide a blueprint to optimizing formulations leveraging bile solubilization. The chapter was published in Journal of Controlled Release. Chapter 3 deals with the impact of bile on porcine intestinal mucus. Mucus exposed to bile solution changed transiently, it stiffened, and the overall diffusion rate increased. The bile-induced changes eased the transport of the bile-interacting drug substance Fluphenazine, whereas Metoprolol was unaffected. This dichotomous pattern was linked to bioavailability in rats and generalized based on two previously published data sets. The outcomes point to a bile-mucus interaction relevant to drug delivery. The chapter is submitted. The Appendix provides a guide for biopharmaceutical characterization of drug substances by nuclear magnetic resonance spectroscopy aiming at establishing a predictive algorithm. In summary, this thesis deciphers bile-driven mechanisms shaping intestinal drug absorption. Based on these molecular insights, pharmaceuticals can be developed along a biopharmaceutical optimization, ultimately leading to better oral drugs of tomorrow. N2 - Die meisten Arzneimittel werden oral eingenommen. Um in den Blutkreislauf zu gelangen, liegen sie in der Darmflüssigkeit gelöst vor, überwinden die Epithelbarriere und passieren die Leber. Die intestinale Absorption wird durch die einzigartigen Eigenschaften des Magen-Darm-Trakts, einschließlich der im Lumen gebildeten Gallenkolloide und der Schleimschicht, die das Darmepithel bedeckt, bestimmt. Die Vernachlässigung dieser facettenreichen Umgebung kann zu schlechten Entscheidungen bei der Arzneimittelentwicklung führen, insbesondere bei schlecht wasserlöslich Wirkstoffen, die mit Galle und Schleim interagieren. Es fehlt jedoch eine rationale Verknüpfung der molekularen Wechselwirkungen zwischen oralen Arzneimitteln und gastrointestinalen Komponenten mit der Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln. Vor diesem Hintergrund zielt diese Arbeit darauf ab, biopharmazeutische Strategien zur Optimierung der Präsentation von oralen Therapeutika an der intestinalen Epithelbarriere zu entwickeln. In Kapitel 1 wurde die Dynamik von Gallenkolloiden bei der Solubilisierung des schwer wasserlöslichen Wirkstoffes Perphenazin untersucht. Perphenazin beeinflusste die molekulare Anordnung, die Struktur sowie die Bindungsthermodynamik und führte zu einem morphologischen Übergang von Vesikeln hin zu wurmartigen Mizellen. Trotz dieser Dynamik sorgten die Gallenkolloide für stabile relative Mengen an freiem Arzneistoff. Dieses Kapitel wurde in Langmuir veröffentlicht. In Kapitel 2 wurde der Einfluss von pharmazeutischen polymeren Hilfsstoffen auf die Solubilisierung von Wirkstoffen durch Galle untersucht. Perphenazin und Imatinib wurden als Modellverbindungen eingeführt, die mit der Galle interagieren, während Metoprolol dies nicht tat. Einige Polymere veränderten die Anordnung und Geometrie der Gallenkolloide und beeinflussten somit die molekular lösliche Menge von solchen Wirkstoffen, die mit der Galle wechselwirken. Diese Einblicke in das Zusammenspiel von Galle und Arzneistoffen bieten einen Ansatz zur Optimierung von Formulierungen, die die Solubilisierung in der Galle nutzen. Dieses Kapitel wurde in Journal of Controlled Release veröffentlicht. Kapitel 3 befasst sich mit den Auswirkungen von Galle auf den Dünndarmschleim von Schweinen. Schleim, der Gallenlösung ausgesetzt war, veränderte sich vorübergehend, versteifte sich und die Gesamtdiffusionsrate nahm zu. Die durch die Galle hervorgerufenen Veränderungen erleichterten den Transport des mit der Galle interagierenden Wirkstoffs Fluphenazin, während Metoprolol unbeeinflusst blieb. Dieses dichotome Muster konnte mit der Bioverfügbarkeit bei Ratten verknüpft werden und durch zwei zuvor veröffentlichte Datensätze mit insgesamt 50 Verbindungen verallgemeinert werden. Die Ergebnisse deuten auf eine Wechselwirkung zwischen Galle und Schleim hin, die für die Verabreichung von Medikamenten relevant ist. Dieses Kapitel ist eingereicht. Der Anhang bietet einen Leitfaden für die biopharmazeutische Charakterisierung von Arzneimittelsubstanzen durch kernmagnetische Resonanzspektroskopie mit dem Ziel des Aufstellens von prädiktiven Algorithmen. Zusammenfassend entschlüsselt diese Arbeit die von der Galle gesteuerten Mechanismen, die die Aufnahme von Arzneimitteln im Darm beeinflussen. Auf der Grundlage dieser molekularen Erkenntnisse können Arzneimittel entlang einer biopharmazeutischen Optimierung entwickelt werden, was letztendlich zu besseren oralen Arzneimitteln führt. KW - Solubilisation KW - Galle KW - Bioverfügbarkeit KW - Pharmazeutischer Hilfsstoff KW - drug delivery KW - absorption KW - intestinal permeability KW - poor water-soluble drugs KW - intestinal mucus KW - pig KW - drug formulation KW - molecular biopharmaceutics KW - mucin KW - Schleim KW - Bile KW - Mucus Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348906 ER - TY - THES A1 - Hauptstein, Niklas T1 - Site directed molecular design and performances of Interferon-α2a and Interleukin-4 bioconjugates with PEG alternative polymers T1 - Seitenspezifisches molekulares Design und Eigenschaften von Interferon-α2a und Interleukin-4 Biokonjugaten mit PEG alternativen Polymeren N2 - Serum half-life elongation as well as the immobilization of small proteins like cytokines is still one of the key challenges for biologics. This accounts also for cytokines, which often have a molecular weight between 5 and 40 kDa and are therefore prone to elimination by renal filtration and sinusoidal lining cells. To solve this problem biologics are often conjugated to poly(ethylene glycol) (PEG), which is the gold standard for the so called PEGylation. PEG is a synthetic, non-biodegradable polymer for increasing the hydrodynamic radius of the conjugated protein to modulate their pharmacokinetic performance and prolong their therapeutic outcome. Though the benefits of PEGylation are significant, they also come with a prize, which is a loss in bioactivity due to steric hindrance and most often the usage of heterogeneous bioconjugation chemistries. While PEG is a safe excipient in most cases, an increasing number of PEG related side-effects, such as immunological responses like hypersensitivity and accelerated blood clearance upon repetitive exposure occur, which highlights the need for PEG alternative polymers, that can replace PEG in such cases. Another promising method to significantly prolong the residence time of biologics is to immobilize them at a desired location. To achieve this, the transglutaminase (TG) Factor XIIIa (FXIIIa), which is an important human enzyme during blood coagulation can be used. FXIIIa can recognize specific peptide sequences that contain a lysine as substrates and link them covalently to another peptide sequence, that contains a glutamine, forming an isopeptide bond. This mechanism can be used to link modified proteins, which have a N- or C-terminal incorporated signal peptide by mutation, to the extracellular matrix (ECM) of tissues. Additionally, both above-described methods can be combined. By artificially introducing a TG recognition sequence, it is possible to attach an azide group containing peptide site-specifically to the TG, recognition sequence. This allows the creation of a site-selective reactive site at the proteins N- or C-terminus, which can then be targeted by cyclooctyne functionalized polymers, just like amber codon functionalized proteins. This thesis has focused on the two cytokines human Interferon-α2a (IFN-α2a) and human, as well as murine Interleukin-4 (IL-4) as model proteins to investigate the above-described challenges. IFN-α2a has been chosen as a model protein because it is an approved drug since 1986 in systemic applications against some viral infections, as well as several types of cancer. Furthermore, IFN-α2 is also approved in three PEGylated forms, which have different molecular weights and use different conjugation techniques for polymer attachment. This turns it into an ideal candidate to compare new polymers against the gold standard PEG. Interleukin-4 (IL-4) has been chosen as the second model protein due to its similar size and biopotency. This allows to compare found trends from IFN-α2a with another bioconjugate platform and distinguish between IFN-α2a specific, or general trends. Furthermore, IL-4 is a promising candidate for clinical applications as it is a potent anti-inflammatory protein, which polarizes macrophages from the pro-inflammatory M1 state into the anti-inflammatory M2 state. N2 - Die Verlängerung der Serum-Halbwertszeit sowie die Immobilisierung kleiner Proteine wie Zytokine ist nach wie vor eine der größten Herausforderungen für Biologika. Dies gilt auch für Zytokine, die häufig ein Molekulargewicht zwischen 5 und 40 kDa haben und daher leicht durch die Nierenfiltration und sinusoidale Endothelzellen eliminiert werden können. Um dieses Problem zu lösen, werden Biologika häufig an Poly(ethylenglykol) (PEG) konjugiert, das den Goldstandard für die so genannte PEGylierung darstellt. PEG ist ein synthetisches, biologisch nicht abbaubares Polymer, das den hydrodynamischen Radius des konjugierten Proteins vergrößert, um die pharmakokinetische Leistung zu modulieren und die therapeutische Wirkung zu verlängern. Obwohl die Vorteile der PEGylierung beträchtlich sind, haben sie auch ihren Preis, nämlich einen Verlust an Bioaktivität aufgrund sterischer Hindernisse und meist die Verwendung heterogener Biokonjugationstechniken. Obwohl PEG in den meisten Fällen ein sicherer Hilfsstoff ist, treten immer mehr PEG-bedingte Nebenwirkungen auf, wie z. B. immunologische Reaktionen wie Überempfindlichkeit und beschleunigter Abbau bei wiederholter Exposition, was den Bedarf an alternativen PEG-Polymeren unterstreicht, die PEG in solchen Fällen ersetzen können. Eine weitere vielversprechende Methode, um die Verweildauer von Biologika deutlich zu verlängern, besteht darin, sie an einem gewünschten Ort zu immobilisieren. Dazu kann die Transglutaminase (TG) Faktor XIIIa (FXIIIa) verwendet werden, die ein wichtiges menschliches Enzym bei der Blutgerinnung ist. FXIIIa kann bestimmte Peptidsequenzen, die ein Lysin enthalten, als Substrate erkennen und sie kovalent an eine andere Peptidsequenz, die ein Glutamin enthält, binden, wobei eine Isopeptidbindung entsteht. Dieser Mechanismus kann benutzt werden um modifizierte Proteine, welche durch Mutation ein N- oder C-terminal eingebautes Signalpeptid besitzen, mit der extrazellularen Gewebematrix (ECM) zu verknüpfen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die beiden Zytokine humanes Interferon-α2a (IFN-α2a) und humanes sowie murines Interleukin-4 (IL-4) als Modellproteine, um die oben beschriebenen Herausforderungen zu untersuchen. IFN-α2a wurde als Modellprotein ausgewählt, weil es seit 1986 ein zugelassenes Medikament für die systemische Anwendung gegen einige Virusinfektionen und verschiedene Krebsarten ist. Darüber hinaus ist IFN-α2 auch in drei PEGylierten Formen zugelassen, die unterschiedliche Molekulargewichte haben und verschiedene Konjugationstechniken für die Polymeranbindung verwenden. Dies macht es zu einem idealen Kandidaten für den Vergleich neuer Polymere mit dem Goldstandard PEG. Interleukin-4 (IL-4) wurde als zweites Modellprotein gewählt, da es eine ähnliche Größe und Biopotenz aufweist. Dies ermöglicht es, die von IFN-α2a gefundenen Trends mit einer anderen Biokonjugat-Plattform zu vergleichen und zwischen IFN-α2a-spezifischen und allgemeinen Trends zu unterscheiden. Darüber hinaus ist IL-4 ein vielversprechender Kandidat für klinische Anwendungen, da es ein starkes entzündungshemmendes Protein ist, das Makrophagen vom entzündungsfördernden M1-Zustand in den entzündungshemmenden M2-Zustand polarisiert. KW - Cytokine KW - Interferon KW - Konjugation KW - Polymere KW - Interleukin 4 KW - Bioconjugate KW - Polyglycerol KW - poly(2-ethyl-2-oxazoline) KW - Polyethylenglykole Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296911 ER - TY - THES A1 - Hebron Mwalwisi, Yonah T1 - Assessment of Counterfeit and Substandard Antimalarial Medicines using High Performance Thin Layer Chromatography and High Performance Liquid Chromatography T1 - Untersuchung der Qualität gefälschter Antimalaria-Medikamente mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie N2 - Although the prevalence of substandard and counterfeit pharmaceutical products is a global problem, it is more critical in resource-constrained countries. The national medicines regulatory authorities (MNRA) in these countries have limited resources to cater for regular quality surveillance programmes aimed at ensuring that medicines in circulation are of acceptable quality. Among the reasons explained to hinder the implementation of these strategies is that compendial monographs are too complicated and require expensive infrastructures in terms of environment, equipment and consumables. In this study it was therefore aimed at developing simple, precise, and robust HPLC and HPTLC methods utilizing inexpensive, readily available chemicals (methanol and simple buffers) that can determine the APIs, other API than declared one, and which are capable of impurity profiling. As an outcome of this study, three isocratic and robust HPLC and two HPTLC methods for sulfadoxine, sulfalene, pyrimethamine, primaquine, artesunate, as well as amodiaquine have been developed and validated. All HPLC methods are operated using an isocratic elution mode which means they can be implemented even with a single pump HPLC system and standard C18 columns. The densitometric sulfadoxine/sulfalene and pyrimethamine method utilizes standard TLC plates as well as inexpensive, readily available and safe chemicals (toluene, methanol, and ethyl acetate), while that for artesunate and amodiaquine requires HPTLC plates as well as triethylamine and acetonitrile due to challenges associated with the analysis of amodiaquine and poorly the detectable artesunate. These HPTLC methods can be implemented as alternative to those requiring HPLC equipment e.g. in countries that already have acquired densitometer equipment. It is understood that HPTLC methods are less sensitive, precise and accurate when compared to HPLC methods, but this hindrance can easily be addressed by sending representative samples to third party quality control laboratories where the analytical results are verified using compendial HPLC methods on a regular basis. It is therefore anticipated that the implementation of these methods will not only address the problem of limited resources required for medicines quality control but also increase the number of monitored targeted antimalarial products as well as the number of resource- constrained countries participating in quality monitoring campaigns. Moreover, the experiences and skills acquired within this work will be applied to other API groups, e. g. antibiotics, afterwards. N2 - Trotz der weltweiten Verbreitung gefälschter Arzneimittel und solcher, die nicht die deklarierte Menge an Wirkstoff enthalten, sind vor allem Entwicklungs- und Schwellenländer von dieser Problematik betroffen. Die Arzneimittelüberwachungs- bzw. Zulassungsbehörden dieser Länder verfügen nur über eingeschränkte Möglichkeiten, die Arzneimittelqualität regelmäßig zu überwachen und somit sicherzustellen, dass die im Markt befindlichen Medikamente eine gute Qualität aufweisen. Einer der Gründe hierfür ist unter anderem, dass die in Arzneibüchern beschriebenen Methoden oftmals sehr komplex sind und eine umfassende Laborausstattung, spezielle Geräte oder teure Chemikalien benötigen. In dieser Arbeit wurden einfache, genaue und robuste flüssigchromatographische Methoden entwickelt, die lediglich günstige, überall verfügbare Chemikalien (z. B. Methanol oder einfache Puffersalze) benötigen und mit denen der Gehalt des deklarierten Arzneistoffes, Arzneistoffverwechslungen sowie das Verunreinigungsprofil bestimmt werden kann. Es konnten drei isokratische, robuste flüssigchromatographische sowie zwei dünnschichtchromatographische Methoden zur Bestimmung von Sulfadoxin, Sulfalen, Pyrimethamin, Primaquin, Artesunat sowie Amodiaquin entwickelt und validiert werden. Alle flüssigchromatographischen Methoden arbeiten isokratisch, folglich können sie auch mit sehr einfachen HPLC-Geräten mit beispielsweise nur einem Pumpenkopf genutzt werden. Zudem werden nur einfache, kommerziell erhältliche C18-Säulen benötigt. Die densitometrischen Methoden für Sulfadoxin/Sulfalen sowie Pyrimethamin benötigen standardisierte Dünnschichtchromatographie-Platten sowie günstige, überall verfügbare und wenig toxische Chemikalien wie beispielsweise Toluol, Methanol oder Ethylacetat. Für die Methode zur Bestimmung von Artesunat und Amodiaquin werden Hochleistungsdünnschichtchromatographie-Platten und Triethylamin sowie Acetonitril benötigt. Dieser Umstand ist der Tatsache geschuldet, dass Amodiaquin und Artesunat sich anderweitig nur ungenügend trennen ließen. Die dünnschichtchromatographischen Protokolle können als Alternative zur HPLC eingesetzt werden, beispielsweise überall dort, wo bereits die entsprechenden Gerätschaften vorhanden sind. Natürlich weisen dünnschichtchromatographische Methoden im Vergleich zur Flüssigchromatographie eine geringere Sensitivität, Präzision und Richtigkeit auf, dies kann jedoch dadurch umgangen werden, die entsprechenden Methoden nur zum Screening zu verwenden und die zu analysierenden Proben anderweitig, z. B. in externen Laboratorien, detailliert zu untersuchen. Dort können beispielsweise Methoden aus gängigen Arzneibüchern verwendet werden. Durch die Implementierung der neu entwickelten Methoden kann zum einen das Problem schlecht verfügbarer Chemikalien umgangen werden und gleichzeitig die Anzahl an untersuchten Arzneimitteln erhöht werden. Dies ist ein wichtiger Beitrag zur Qualitätskontrolle in Ländern mit eingeschränkten Infrastrukturen. KW - Instrumentelle Analytik KW - Arzneimittel KW - Fälschung KW - Malaria KW - HPLC KW - Counterfeit Medicines KW - HPLC KW - Pharmaceutical Analysis KW - Impurity Profiling Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145821 ER -