TY  - THES
A1  - Wu, Fang
T1  - Adding new functions to insulin-like growth factor-I (IGF-I) via genetic codon expansion
T1  - Hinzufügen neuer Funktionen zu Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I) durch genetische Codon-Erweiterung
N2  - Insulin-like growth factor-I (IGF-I) is a 70-amino acid polypeptide with a molecular weight of approximately 7.6 kDa acting as an anabolic effector. It is essential for tissue growth and remodeling. Clinically, it is used for the treatment of growth disorders and has been proposed for various other applications including musculoskeletal diseases. Unlike insulin, IGF-I is complexed to at least six high-affinity binding proteins (IGFBPs) exerting homeostatic effects by modulating IGF-I availability to its receptor (IGF-IR) on most cells in the body as well as changing the distribution of the growth factor within the organism.1-3 Short half-lived IGF-I have been the driving forces for the design of localized IGF-I depot systems or protein modification with enhanced pharmacokinetic properties. In this thesis, we endeavor to present a versatile biologic into which galenical properties were engineered through chemical synthesis, e.g., by site-specific coupling of biomaterials or complex composites to IGF-I. For that, we redesigned the therapeutic via genetic codon expansion resulting in an alkyne introduced IGF-I, thereby becoming a substrate for biorthogonal click chemistries yielding a site-specific decoration. 
In this approach, an orthogonal pyrrolysine tRNA synthetase (PylRS)/tRNAPyl CUA pair was employed to direct the co-translational incorporation of an unnatural amino acid—¬propargyl-L-lysine (plk)—bearing a clickable alkyne functional handle into IGF-I in response to the amber stop codon (UAG) introduced into the defined position in the gene of interest. We summarized the systematic optimization of upstream and downstream process alike with the ultimate goal to increase the yield of plk modified IGF-I therapeutic, from the construction of gene fusions resulting in (i) Trx-plk-IGF-I fusion variants, (ii) naturally occurring pro-IGF-I protein (IGF-I + Ea peptide) (plk-IGF-I Ea), over the subsequent bacterial cultivation and protein extraction to the final chromatographic purification. The opportunities and hurdles of all of the above strategies were discussed. Evidence was provided that the wild-type IGF-I yields were pure by exploiting the advantages of the pHisTrx expression vector system in concert with a thrombin enzyme with its highly specific proteolytic digestion site and multiple-chromatography steps. The alkyne functionality was successfully introduced into IGF-I by amber codon suppression. The proper folding of plk-IGF-I Ea was assessed by WST-1 proliferation assay and the detection of phosphorylated AKT in MG-63 cell lysate. The purity of plk-IGF-I Ea was monitored with RP-HPLC and SDS-PAGE analysis. This work also showed site-specific coupling an alkyne in plk-IGF-I Ea by copper (I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) with potent activities in vitro. The site-specific immobilization of plk-IGF-I Ea to the model carrier (i.e., agarose beads) resulted in enhanced cell proliferation and adhesion surrounding the IGF-I-presenting particles. Cell proliferation and differentiation were enhanced in the accessibility of IGF-I decorated beads, reflecting the multivalence on cellular performance. 
Next, we aimed at effectively showing the disease environment by co-delivery of fibroblast growth factor 2 (FGF2) and IGF-I, deploying localized matrix metalloproteinases (MMPs) upregulation as a surrogate marker driving the response of the drug delivery system. For this purpose, we genetically engineered FGF2 variant containing an (S)-2-amino-6-(((2-azidoethoxy)carbonyl)amino)hexanoic acid incorporated at its N-terminus, followed by an MMPs-cleavable linker (PCL) and FGF2 sequence, thereby allowing site-directed, specific decoration of the resultant azide-PCL-FGF2 with the previously mentioned plk-IGF-I Ea to generate defined protein-protein conjugates with a PCL in between. The click reaction between plk-IGF-I Ea and azide-PCL-FGF2 was systematically optimized to increase the yield of IGF-FGF conjugates, including reaction temperature, incubation duration, the addition of anionic detergent, and different ratios of the participating biopharmaceutics. The challenge here was that CuAAC reaction components or conditions might oxidize free cysteines of azide-PCL-FGF2 and future work needs to present the extent of activity retention after conjugation. Furthermore, our study provides potential options for dual-labeling of IGF-I either by the introduction of unnatural amino acids within two distinct positions of the protein of interest for parallel “double-click” labeling of the resultant plk-IGF-I Ea-plk or by using a combination of enzymatic-catalyzed and CuAAC bioorthogonal coupling strategies for sequentially dual-labeling of plk-IGF-I Ea.
In conclusion, genetic code expansion in combination with click-chemistry provides the fundament for novel IGF-I analogs allowing unprecedented site specificity for decoration. Considerable progress towards IGF-I based therapies with enhanced pharmacological properties was made by demonstrating the feasibility of the expression of plk incorporated IGF-I using E. coli and retained activity of unconjugated and conjugated IGF-I variant. Dual-labeling of IGF-I provides further insights into the functional requirements of IGF-I. Still, further investigation warrants to develop precise IGF-I therapy through unmatched temporal and spatial regulation of the pleiotropic IGF-I.
N2  - Insulin-like growth factor-I (IGF-I) ist ein 70 Aminosäuren langes Polypeptid mit einem Molekuargewicht von 7,5 kDa, dass als anaboler Effektor wirkt und dadurch eine essentielle Rolle in Gewebewachstum und -umbau spielt. Klinisch wird IGF-I für die Behandlung von Wachstumsstörungen verwendet und ist für weitere Anwendungen wie muskuloskelettale Erkrankungen von Interesse. Im Gegensatz zu Insulin wird IGF-I von mindestens sechs hochaffinen Bindungsproteinen (IGFBPs) komplexiert, die homöostatisch regulierend wirken, indem  sie die Verfügbarkeit von IGF-I zu seinem Rezeptor (IGF-IR) auf vielen Zellen modulieren und ebenso die Verteilung des Wachstumsfaktors im Körper steuern. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von IGF-I wurde die Entwicklung von lokalen IGF-I Depot-Systemen und von auf Proteinebene modifizierten IGF-I-Varianten mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften vorangetrieben. In der vorliegenden Arbeit sind wir bestrebt ein vielseitiges Biopharmazeutikum zu präsentieren, das hinsichtlich seiner galenischen Eigenschaften optimiert wurde, z. B. durch chemische Modifikation,  wie ortsspezifische Kopplung von IGF-I an Biomaterialien oder komplexe Verbundstoffe. Für diesen Zweck wurde das Therapeutikum neu entworfen und über die Erweiterung des genetischen Codes eine Alkin-Funktionalität eingefügt. Durch dieses Alkin wird IGF-I zugänglich für die Modifizierung mit bio-orthogonaler, ortsspezifischer „Click-Chemie“.
In diesem Ansatz wird ein orthogonales Pyrrolysin tRNA-Synthase (PylRS)/tRNAPyl-CUA – Paar verwendet, um den co-translationalen Einbau einer unnatürlichen Aminosäure — Propargyl-L-lysine (Plk) —, die eine Alkin-Funktionalität für Click-Reaktionen enthält, an Stelle des Amber-Stop-Codons (UAG) im entsprechenden Gen, im IGF-I-Protein zu gewährleisten. Die systematische Optimierung von Up- und Downstream-Prozessen, mit dem Ziel die Ausbeute von Plk-modifiziertem IGF-I-Biopharmazeutikum zu erhöhen, wurden zusammengefasst: von der Konstruktion von Genfusionen, die in (i) einer Trx-plk-IGF-I Fusionsvariant und (ii) natürlich vorkommendem pro-IGF-I Protein (IGF-I + Ea peptide) (Plk-IGF-I Ea) resultierten, über die folgende Expression in Bakterien und Proteinextraktion, bis hin zur finalen chromatographischen Reinigung des Biopharmazeutikums. Die Möglichkeiten und Schwierigkeiten aller oben genannten Strategien wurden diskutiert. Es wurde gezeigt, dass die Wildtyp-IGF-I-Ausbeuten durch den Einsatz des vorteilhaften pHisTrx-Expressionsvektor-Systems zusammen mit dem Enzym Thrombin und seiner hochspezifischen proteolytischen Spaltstelle und mehrfacher chromatographischer Aufreinigung einen hohen Reinheitsgrad aufwiesen. Die Alkin-Funktionalität wurde erfolgreich durch Unterdrückung des Amber-Codons in IGF-I eingeführt. Die richtige Faltung von Plk-IGF-I Ea wurde durch den WST-1 Proliferationsassay und den Nachweis von phosphorylierten Akt in MG-63-Zelllysat nachgewiesen. Die Reinheit von Plk-IGF-I Ea wurde durch RP-HPLC- und SDS-PAGE-Analyse überwacht. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass die ortspezifische Kopplung von Alkinen an Plk-IGF-I Ea durch Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin Zykloaddition (CuAAC) in einem Produkt mit hoher in vitro Aktivität resultiert. Die ortspezifische Immobilisierung von Plk-IGF-I Ea an einem Modell-Trägersystem (hier: Agarosepartikel) führte zu einer verbesserten Zellproliferation und Zelladhäsion in der Umgebung der IGF-I-präsentierenden Partikel. Der vielfältige Einfluss von IGF-I auf Zellen wird durch die verbesserte Zellproliferation und -differenzierung durch die Verfügbarkeit von IGF-I präsentierenden Partikeln widergespiegelt. 
Als Nächstes setzten wir uns zum Ziel den Krankheitseinfluss durch die gleichzeitige Anwendung von Fibroblast-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) und IGF-I zu zeigen, indem wir uns der lokalen Hochregulierung von Matrixmetalloproteinasen (MMPS) als Surrogat-Krankheitsmarker bedienten, der die Antwort des Drug Delivery-Systems auslöst. Zu diesem Zweck wurde eine FGF2-Variante genetisch modifiziert, sodass sie am N-Terminus eine (S)-2-amino-6-(((2-azidoethoxy)carbonyl)amino)Hexansäure trägt - gefolgt von einen durch MMPs spaltbaren Verbindungsstück (PCL) und der FGF2 Sequenz - und dadurch die gezielte, spezifische Konjugation des resultierenden Azid-PCL-FGF2 mit dem vorher erwähnten Plk-IGF-I Ea ermöglicht, um definierte Protein-Protein-Konjugate, die mit einem PCL verbunden sind, zu erzeugen. Die Click-Reaktion zwischen Plk-IGF-I Ea und Azid-PCL-FGF2 wurde zur Erhöhung der IGF-FGF Ausbeute systematisch optimiert, indem die Parameter Temperatur, Inkubationsdauer, Zugabe von anionischem Tensid und verschiedene Eduktverhältnisse untersucht wurden. Es gilt zu bedenken, dass die in der CuAAC Reaktion eingesetzten Komponenten oder Reaktionsbedingungen freie Cysteinreste von Azid-PCL-FGF2 oxidieren können und es in Zukunft gilt, die verbleibende Aktivität nach Proteinkonjugation zu bestimmen. Des Weiteren zeigen unsere Untersuchungen potentielle Möglichkeiten für duale Konjugation von IGF-I entweder durch die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure an zwei verschiedenen Positionen innerhalb des Proteins (Plk-IGF-I Ea-Plk) für parallele „Doppel-Click“-Konjugation oder durch die Kombination bioorthogonaler Kopplungsreaktionen -  einer enzymkatalysierten Reaktion und CuAAC - für sequentielles duales Verknüpfen von Plk-IGF-I Ea.
Schlussendlich stellt die Erweiterung des genetischen Codes in Kombination mit Click-Chemie eine Grundlage für neue IGF-I-Analoga dar, die eine noch nie dagewesene Ortsspezifität für Konjugationen besitzen. Ein entscheidender Fortschritt hin zu IGF-I basierten Therapeutika mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften wurde durch die Expression, Reinigung und Konjugation von bioaktivem IGF-I mit Plk sowie konjugierten IGF-I Varianten erreicht. Duales Modifizieren von IGF-I erlaubt weitere Einblicke in die funktionalen Anforderungen an IGF-I. Dennoch sind weitere Untersuchungen nötig, um eine gezielte IGF-I Therapie trotz der unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Regulierung des pleiotropen IGF-I zu ermöglichen.
KW  - Insulin-like growth factor-I
KW  - genetic codon expansion
KW  - site-specific protein modification
KW  - Insulin-like Growth Factor I
KW  - Codon
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175330
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gador, Eva
T1  - Strategies to improve the biological performance of protein therapeutics
T1  - Strategien zur Verbesserung der biologischen Wirkung von Proteintherapeutika
N2  - During the last decades the number of biologics increased dramatically and several biopharmaceutical drugs such as peptides, therapeutic proteins, hormones, enzymes, vaccines, monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates conquered the market. Moreover, administration and local delivery of growth factors has gained substantial importance in the field of tissue engineering. Despite progress that has been made over the last decades formulation and delivery of therapeutic proteins is still a challenge. Thus, we worked on formulation and delivery strategies of therapeutic proteins to improve their biological performance.
Phase I of this work deals with protein stability with the main focus on a liquid protein formulation of the dimeric fusion protein PR-15, a lesion specific platelet adhesion inhibitor. In order to develop an adequate formulation ensuring the stability and bioactivity of PR-15 during storage at 4 °C, a pH screening, a forced degradation and a Design of Experiments (DoE) was performed. First the stability and bioactivity of PR-15 in 50 mM histidine buffer in relation to pH was evaluated in a short-term storage stability study at 25 °C and 40 °C for 4 and 8 weeks using different analytical methods. Additionally, potential degradation pathways of PR-15 were investigated under stressed conditions such as heat treatment, acidic or basic pH, freeze-thaw cycles, light exposure, induced oxidation and induced deamidation during the forced degradation study. Moreover, we were able to identify the main degradation product of PR-15 by performing LC/ESI-MS analysis. Further optimization of the injectable PR 15 formulation concerning pH, the choice of buffer and the addition of excipients was studied in the following DoE and finally an optimal PR-15 formulation was found. 
The growth factors BMP-2, IGF-I and TGF-β3 were selected for the differentiation of stem cells for tissue engineering of cartilage and bone in order to prepare multifunctionalized osteochondral implants for the regeneration of cartilage defects. 
Silk fibroin (SF) was chosen as biomaterial because of its biocompatibility, mechanical properties and its opportunity for biofunctionalization. Ideal geometry of SF scaffolds with optimal porosity was found in order to generate both tissues on one scaffold. 
The growth factors BMP-2 and IGF-I were modified to allow spatially restricted covalent immobilization on the generated porous SF scaffolds. In order to perform site-directed covalent coupling by the usage of click chemistry on two opposite sides of the scaffold, we genetically engineered BMP-2 (not shown in this work; performed by Barbara Tabisz) and IGF-I for the introduction of alkyne or azide bearing artificial amino acids. TGF β3 was immobilized to beads through common EDC/NHS chemistry requiring no modification and distributed in the pores of the entire scaffold.
For this reason protein modification, protein engineering, protein immobilization and bioconjugation are investigated in phase II. Beside the synthesis the focus was on the characterization of such modified proteins and its conjugates. The field of protein engineering offers a wide range of possibilities to modify existing proteins or to design new proteins with prolonged serum half-life, increased conformational stability or improved release rates according to their clinical use. 
Site-directed click chemistry and non-site-directed EDC/NHS chemistry were used for bioconjugation and protein immobilization with the aim to underline the preferences of site-directed coupling.
We chose three strategies for the incorporation of alkyne or azide functionality for the performance of click reaction into the protein of interest: diazonium coupling reaction, PEGylation and genetic engineering. Azido groups were successfully introduced into SF by implementation of diazonium coupling and alkyne, amino or acid functionality was incorporated into FGF-2 as model protein by means of thiol PEGylation. The proper folding of FGF-2 after PEGylation was assessed by fluorescence spectroscopy, WST-1 proliferation assay ensured moderate bioactivity and the purity of PEGylated FGF-2 samples was monitored with RP-HPLC. Moreover, the modification of native FGF-2 with 10 kDa PEG chains resulted in enhanced thermal stability.
Additionally, we genetically engineered one IGF-I mutant by incorporating the unnatural amino acid propargyl-L-lysine (plk) at position 65 into the IGF-I amino acid sequence and were able to express hardly verifiable amounts of plk-IGF-I. Consequently, plk-IGF-I expression has to be further optimized in future studies in order to generate plk-IGF-I with higher yields.
Bioconjugation of PEGylated FGF-2 with functionalized silk was performed in solution and was successful for click as well as EDC/NHS chemistry. However, substantial amounts of unreacted PEG-FGF-2 were adsorbed to SF and could not be removed from the reaction mixture making it impossible to expose the advantages of click chemistry in relation to EDC/NHS chemistry. The immobilization of PEG-FGF-2 to microspheres was a trial to increase product yield and to remove unreacted PEG-FGF-2 from reaction mixture. Bound PEG-FGF-2 was visualized by fluorescence imaging or flow cytometry and bioactivity was assessed by analysis of the proliferation of NIH 3T3 cells. However, immobilization on beads raised the same issue as in solution: adsorption caused by electrostatic interactions of positively charged FGF-2 and negatively charged SF or beads. Finally, we were not able to prove superiority of site-directed click chemistry over non-site-directed EDC/NHS.
The skills and knowledge in protein immobilization as well as protein characterization acquired during phase II helped us in phase III to engineer cartilage tissue in biofunctionalized SF scaffolds. 
The approach of covalent immobilization of the required growth factors is relevant because of their short in vivo half-lives and aimed at controlling their bioavailability. So TGF-β3 was covalently coupled by means of EDC/NHS chemistry to biocompatible and biostable PMMA beads. Herein, we directly compared bioactivity of covalently coupled and adsorbed TGF-β3. During the so-called luciferase assay bioactivity of covalent coupled as well as adsorbed TGF-β3 on PMMA beads was ensured. In order to investigate the real influence of EDC/NHS chemistry on TGF-β3’s bioactivity, the amount of immobilized TGF-β3 on PMMA beads was determined. Therefore, an ELISA method was established. The assessment of total amount of TGF-β3 immobilized on the PMMA beads allowed as to calculate coupling efficiency. A significantly higher coupling efficiency was determined for the coupling of TGF-β3 via EDC/NHS chemistry compared to the reaction without coupling reagents indicating a small amount of adsorbed TGF-β3. These results provide opportunity to determine the consequence of coupling by means of EDC/NHS chemistry for TGF β3 bioactivity. At first sight, no statistically significant difference between covalent immobilized and adsorbed TGF-β3 was observed regarding relative luciferase activities. But during comparison of total and active amount of TGF-β3 on PMMA beads detected by ELISA or luciferase assay, respectively, a decrease of TGF-β3’s bioactivity became apparent. Nevertheless, immobilized TGF β3 was further investigated in combination with SF scaffolds in order to drive BMSCs to the chondrogenic lineage. According to the results obtained through histological and immunohistochemical studies, biochemical assays as well as qRT-PCR of gene expression from BMSCs after 21 days in culture immobilized TGF-β3 was able to engineer cartilage tissue. These findings support the thesis that local presentation of TGF β3 is superior towards exogenous TGF β3 for the development of hyaline cartilage. Furthermore, we conclude that covalent immobilized TGF β3 is not only superior towards exogenously supplemented TGF-β3 but also superior towards adsorbed TGF-β3 for articular hyaline cartilage tissue engineering. Diffusion processes were inhibited through covalent immobilization of TGF-β3 to PMMA beads and thereby a stable and consistent TGF-β3 concentration was maintained in the target area.
With the knowledge acquired during phase II and III as well as during the studies of Barbara Tabisz concerning the expression and purification of plk-BMP-2 we made considerable progress towards the formation of multifunctionalized osteochondral implants for the regeneration of cartilage defects. However, further studies are required for the translation of these insights into the development of multifunctionalized osteochondral SF scaffolds.
N2  - In den letzten Jahrzehnten stieg die Zahl der Biologika dramatisch an und mehrere biopharmazeutische Arzneimittel wie Peptide, therapeutische Proteine, Hormone, Enzyme, Impfstoffe, monoklonale Antikörper und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate eroberten den Markt. Darüber hinaus hat die Applikation und lokale Verabreichung von Wachstumsfaktoren im Bereich des Tissue Engineerings eine wesentliche Bedeutung erlangt. Trotz der in den letzten Jahrzehnten erzielten Fortschritte ist die Formulierung und Verabreichung therapeutischer Proteine noch immer eine Herausforderung. Daher haben wir uns in dieser Arbeit mit der Formulierung und Verabreichung therapeutischer Proteine beschäftigt und Strategien entwickelt, um deren biologische Wirkung zu verbessern.
In Phase I dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf die Stabilität des dimeren Fusionsproteins PR 15, einem Inhibitor der Adhäsion von Plättchen an arterielle Gefäßläsionen. Um eine geeignete flüssige Formulierung zu entwickeln, welche die Stabilität und Bioaktivität von PR-15 während der Lagerung bei 4 °C sicherstellt, wurde ein pH Screening, eine Forced Degradation Studie und ein Design of Experiments (DoE) durchgeführt. Zuerst wurde die Stabilität und Bioaktivität von PR-15 bei verschiedenen pH Werten in 50 mM Histidinpuffer in einer Kurzzeitstabilitätsstudie bei 25 °C und 40 °C nach 4 und 8 Wochen mit Hilfe verschiedener analytischer Methoden beobachtet. Des Weiteren wurden mögliche Abbauwege von PR-15 unter Stressbedingungen wie erhöhter Temperatur, saurem oder basischem pH-Wert, Einfrier-Auftau-Zyklen, Lichteinwirkung, induzierter Oxidation sowie induzierter Deamidierung während der Forced Degradation Studie untersucht. Darüber hinaus konnten wir das Hauptabbauprodukt von PR-15 durch LC/ESI-MS Analysen identifizieren. Im folgenden DoE wurde die injizierbare PR-15 Formulierung weiter optimiert und bezüglich pH, der Wahl des Puffers sowie der Zugabe von Hilfsstoffen analysiert, bis letztendlich eine optimale PR 15-Formulierung gefunden wurde.
Die Wachstumsfaktoren BMP-2, IGF-I und TGF-β3 wurden zur Differenzierung von Stammzellen für das Tissue Engineering von Knochen und Knorpel ausgewählt, um multifunktionalisierte osteochondrale Implantate zur Regeneration von Knorpeldefekten herzustellen. Seidenfibroin (SF) wurde aufgrund seiner Biokompatibilität, seiner mechanischen Eigenschaften und seiner Möglichkeiten zur Biofunktionalisierung als Biomaterial gewählt. Zuerst wurden SF-Scaffolds mit idealer Geometrie und optimaler Porosität erzeugt, um sowohl Knochen also auch Knorpel auf einem Scaffold herzustellen. Um eine räumlich begrenzte kovalente Immobilisierung der Wachstumsfaktoren BMP-2 und IGF-I auf den porösen SF-Scaffolds zu ermöglichen, wurden diese mit unnatürlichen Aminosäuren genetisch modifiziert. Das Einführen von Alkin- bzw. Azidresten in die Aminosäuresequenz von BMP-2 (in dieser Arbeit nicht gezeigt; von Barbara Tabisz durchgeführt) und IGF-I erlaubt unter Verwendung der Click-Chemie eine ortsgerichtete kovalente Kopplung der Wachstumsfaktoren an zwei gegenüberliegenden Seiten der Scaffolds. TGF-β3 wurde durch gewöhnliche EDC/NHS-Chemie, welche keine Modifikation erforderte, kovalent an Mikrosphären immobilisiert und in den Poren des gesamten SF-Scaffolds verteilt.
Daher beschäftigen wir uns in Phase II mit der Modifikation von Proteinen, dem Protein Engineering, der Immobilisation von Proteinen und mit Biokonjugation. Neben der Synthese lag der Fokus auf der Charakterisierung modifizierter Proteine und deren Konjugaten. Das Gebiet des Protein Engineerings bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten, bestehende Proteine zu modifizieren oder neue Proteine mit verlängerter Serumhalbwertszeit, erhöhter konformativer Stabilität oder verbesserten Freisetzungsraten entsprechend der klinischen Anwendung zu entwickeln.
Die ortsspezifische Click-Chemie und die nicht-ortsspezifische EDC/NHS-Chemie wurden für die Biokonjugation und die Immobilisierung von Proteinen verwendet mit dem Ziel, die Vorzüge der ortsgerichteten Kopplung hervorzuheben. Für den Einbau der für die Durchführung der Click-Reaktion erforderlichen Alkin- bzw. Azidfunktionalität in das betreffende Protein wurden drei Strategien ausgewählt: die Azokupplung, die PEGylierung und die gentechnische Modifizierung. Azidgruppen wurden mittels Azokupplung erfolgreich in SF eingebaut und die Alkin-, Amino- oder Säurefunktionalität wurde mittels PEGylierung der Cysteine in das Modellprotein FGF-2 integriert. Die korrekte Faltung von FGF-2 nach erfolgreicher PEGylierung wurde durch Fluoreszenzspektroskopie bestätigt, im WST-1 Proliferationsassay wurde eine angemessene Bioaktivität festgestellt und die Reinheit von PEGylierten FGF-2 wurde mittels RP-HPLC analysiert. Darüber hinaus führte die Modifikation von nativem FGF-2 mit 10 kDa PEG-Ketten zu einer erhöhten thermischen Stabilität. 
Des Weiteren wurde ein IGF-I-Mutant gentechnisch hergestellt, indem die unnatürliche Aminosäure Propargyl-L-Lysin (Plk) an Position 65 in die IGF-I-Sequenz eingebaut wurde. Da letztendlich lediglich kaum nachweisbare Mengen an Plk-IGF-I exprimiert werden konnten, muss die Plk-IGF-I-Expression in anschließenden Studien weiter optimiert werden, um Plk-IGF-I mit höheren Ausbeuten erzeugen zu können. 
Die Biokonjugation von PEGyliertem FGF-2 und funktionalisierter Seide wurde sowohl mittels Click- als auch mittels EDC/NHS-Chemie erfolgreich durchgeführt. Allerdings wurden erhebliche Mengen PEG-FGF-2 lediglich an SF adsorbiert und nicht kovalent gekoppelt und konnten schlussendlich nicht aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden. Die anschließende Immobilisierung von PEG-FGF-2 an Mikrosphären, war ein Versuch die Ausbeute der Reaktion zu erhöhen und adsorbiertes PEG-FGF-2 leichter zu entfernen. Immobilisiertes PEG-FGF-2 wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und/oder Durchflusszytometrie nachgewiesen und die Bioaktivität wurde durch die Analyse der Proliferation von NIH-3T3-Zellen ermittelt. Die Immobilisierung auf Mikrosphären führte jedoch zu demselben Problem wie in Lösung: Adsorption von positiv geladenem FGF-2 an negativ geladenes SF bzw. negativ geladenen Mikrosphären durch elektrostatische Wechselwirkungen. Schließlich waren wir nicht in der Lage, die Überlegenheit der ortsgerichteten Click-Chemie gegenüber der nicht-ortsgerichteten EDC/ NHS-Chemie zu beweisen. 
Die während Phase II erworbenen Fähigkeiten und Kenntnisse im Bereich der Immobilisierung und Charakterisierung von Proteinen halfen uns in Phase III Knorpelgewebe in biofunktionalisierten SF-Scaffolds zu erzeugen. Der Ansatz der kovalenten Immobilisierung, der für das Tissue Engineering von Knorpel erforderlichen Wachstumsfaktoren, ist aufgrund ihrer kurzen in vivo Halbwertszeiten von Bedeutung und zielt darauf ab, ihre Bioverfügbarkeit zu kontrollieren. So wurde TGF-β3 mittels EDC/NHS-Chemie kovalent an biokompatible und biostabile PMMA-Mikrosphären gekoppelt. Mit Hilfe des sogenannten Luciferase-Assays wurden die Bioaktivitäten von kovalent gekoppeltem sowie von adsorbiertem TGF-β3 auf PMMA-Mikrosphären ermittelt. Um die Kopplungseffizienz zu berechnen und den tatsächlichen Einfluss der EDC/NHS-Chemie auf die Bioaktivität von TGF-β3 zu untersuchen, wurde die Menge an immobilisiertem TGF-β3 auf PMMA-Mikrosphären mittels ELISA bestimmt. Für die Kopplung von TGF-β3 mittels EDC/NHS-Chemie wurde eine signifikant höhere Kopplungseffizienz im Vergleich zu der Reaktion ohne Kopplungsreagenzien, welche eine geringe Menge an adsorbiertem TGF-β3 zeigte, bestimmt. Bei alleiniger Betrachtung der Ergebnisse des Luciferase-Assays, bei welchem kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen kovalent immobilisiertem und adsorbiertem TGF-β3 bezüglich der relativen Luciferase-Aktivität beobachtet wurde, scheint es als hätte die EDC/NHS-Kopplung keinen Einfluss auf die Bioaktivität von TGF β3. Beim Vergleich der mittels ELISA bestimmten TGF β3 Gesamtmenge und der mittels Luciferase-Assay bestimmten Menge an aktivem TGF-β3 auf den PMMA-Mikrosphären, wurde jedoch ein Verlust der Bioaktivität von TGF-β3 durch die EDC/NHS-Kopplung deutlich. Ungeachtet dessen, wurde immobilisiertes TGF-β3 genutzt, um Knorpelgewebe in SF-Scaffolds aus BMSCs zu generieren. Nach den Ergebnissen der histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen, der biochemischen Assays sowie der qRT-PCR der Genexpression von BMSCs nach 21 Tagen in Kultur, gelang es uns unter Verwendung von immobilisiertem TGF-β3 Knorpelgewebe aufzubauen. Diese Ergebnisse unterstützen die These, dass die lokale Präsentation von TGF-β3 gegenüber exogen zugegebenem TGF-β3 für die Entwicklung von hyalinem Knorpel überlegen ist. Außerdem schließen wir daraus, dass kovalent immobilisiertes TGF-β3 nicht nur gegenüber exogen zugegebenem TGF-β3 für die Entwicklung von hyalinem Knorpelgewebe überlegen ist, sondern auch gegenüber adsorbiertem TGF-β3. Diffusionsprozesse konnten durch kovalente Immobilisierung von TGF-β3 an PMMA-Mikrosphären verhindert werden und damit eine stabile und gleichmäßige TGF β3-Konzentration am Wirkort aufrechterhalten werden.
Mit den in Phase II und III gewonnenen Erkenntnissen und den Untersuchungen von Barbara Tabisz zur Expression und Aufreinigung von plk-BMP-2 haben wir erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung multifunktionaler osteochondraler Implantate zur Regeneration von Knorpeldefekten gemacht. Für die Umsetzung dieser Erkenntnisse zur Herstellung multifunktionaler osteochondraler SF-Scaffolds sind jedoch weitere Studien erforderlich.
KW  - biologics
KW  - protein therapeutics
KW  - TGF-β3
KW  - IGF-I
KW  - FGF-2
KW  - injectable protein formulation
KW  - protein modification
KW  - bioconjugation
KW  - click chemistry
KW  - EDC-NHS chemistry
KW  - osteochondral implant
KW  - cartilage tissue engineering
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161798
ER  - 
TY  - THES
A1  - Braun, Alexandra Carolin
T1  - Bioresponsive delivery of anticatabolic and anabolic agents for muscle regeneration using bioinspired strategies
T1  - Bioresponsive Verabreichung anti-kataboler und anaboler Wirkstoffe zur Muskelregeneration unter Verwendung bioinspirierter Strategien
N2  - Progressive loss of skeletal muscle mass, strength and function poses a major threat to independence and quality of life, particularly in the elderly. To date, sarcopenia therapy consists of resistance exercise training in combination with protein supplementation due to the limited efficacy of available pharmacological options in counteracting the effects of muscle wasting. Therapeutic intervention with growth factors including insulin-like growth factor I (IGF-I) or inhibitors of myostatin  a potent suppressor of myogenesis  hold potential to rebalance the altered activity of anabolic and catabolic cytokines. However, dosing limitations due to acute side effects and disruptions of the homeostasis have so far precluded clinical application.
Intending to provide a therapy with a superior safety and efficacy profile by directing drug release to inflamed tissue and minimizing off-target activity, we designed bioresponsive delivery systems for an anti-catabolic peptide and anabolic IGF-I responding to local flares of muscle wasting.
In Chapter I, current concepts for bioorthogonal conjugation methods are discussed and evaluated based on various drug delivery applications. With a focus on protein delivery, challenges and potential pitfalls of each chemical and enzymatic conjugation strategy are analyzed and opportunities regarding their use for coupling of biomolecules are given. Based on various studies conjugating proteins to polymers, particles and biomaterials using different site-directed approaches, the chapter summarizes available strategies and highlights certain aspects requiring particular consideration when applied to biomolecules. Finally, a decision process for selection of an optimum conjugation strategy is exemplarily presented. 
Three of these bioorthogonal coupling reactions are applied in Chapter II detailing the potential of site-directed conjugation in the development of novel, homogenous drug delivery systems. The chapter describes the design of a delivery system of a myostatin inhibitor (MI) for controlled and local release counteracting myositis flares. MI release from the carrier is driven by increased matrix metalloproteinase (MMP) levels in compromised muscle tissues cleaving the interposed linker, thereby releasing the peptide inhibitor from the particulate carrier. Release experiments were performed to assess the response towards various MMP isoforms (MMP-1, -8, -9 and -13) – as upregulated during skeletal muscle myopathies – and the release pattern of the MI in case of disease progression was analyzed. By selection of the protease-sensitive linker (PSL) showing variable susceptibilities to proteases, release rates of the MI can be controlled and adapted. Immobilized MI as well as released MI as response to MMP upregulation was able to antagonize the effects of myostatin on cell signalling and myoblast differentiation. 
The approach of designing bioresponsive protein delivery systems was also applied to the anabolic growth factor IGF-I, as described in Chapter III. Numerous studies of PEGylated proteins or peptides reveal, that successful therapy is challenged by safety and efficacy issues, as polymer attachment considerably alters the properties of the biologic, thereby jeopardizing clinical efficacy. To this end, a novel promising approach is presented, intending to exploit beneficial effects of PEGylation on pharmacokinetics, but addressing the pharmacodynamic challenges by releasing the protein upon entering the target tissue. This was realized by integration of a PSL between the PEG moiety and the protein. The soluble polymer conjugate was produced by site-directed, enzymatic conjugation of IGF-I to the PSL, followed by attachment of a 30 kDa-PEG using Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strategy illustrates the potential of bioorthogonal conjugation (as described in Chapter I) for generation of homogenous protein-polymer conjugates with reproducible outcome, but also emphasizes the altered protein properties resulting from permanent polymer conjugation. As compared to wild type IGF-I, the PEGylated protein showed considerable changes in pharmacologic effects – such as impaired insulin-like growth factor binding protein (IGFBPs) interactions, submaximal proliferative activity and altered endocytosis patterns. In contrast, IGF-I characteristics were fully restored upon local disintegration of the conjugate triggered by MMP upregulation and release of the natural growth factor. 
For successful formulation development for the proteins and conjugates, the careful selection of suitable excipients is crucial for a safe and reliable therapy. Chapter IV addresses one aspect by highlighting the chemical heterogeneity of excipients and associated differences in performance. Polysorbate 80 (PS80) is a surfactant frequently used in protein formulations to prevent aggregation and surface adsorption. Despite being widely deployed as a standard excipient, heterogeneous composition and performance entails the risk of eliciting degradation and adverse effects on protein stability. Based on a comprehensive study using different batches of various suppliers, the PS80 products were characterized regarding chemical composition and physicochemical properties, facilitating the assessment of excipient performance in a formulation. Noticeable deviations were recorded between different suppliers as well as between batches of the same suppliers. Correlation of all parameters revealed, that functionality related characteristics (FRCs) could be reliably predicted based on chemical composition alone or by a combination of chemical and physicochemical properties, respectively. 
In summary, this thesis describes and evaluates novel strategies for the targeted delivery and controlled release of biologics intended to counteract the imbalance of anabolic and catabolic proteins observed during aging and musculoskeletal diseases. Two delivery platforms were developed and characterized in vitro – (i) using anti-catabolic peptides immobilized on a carrier for local delivery and (ii) using soluble IGF-I polymer conjugates for systemic application. Both approaches were implemented by bioorthogonal coupling strategies, which were carefully selected in consideration of limitations, side reactions and efficiency aspects. Bioresponsive release of the active biomolecules following increased protease activity could be successfully realized. The therapeutic potential of these approaches was demonstrated using various cell-based potency assays. The systems allow targeted and controlled release of the growth factor IGF-I and anti-catabolic peptides thereby overcoming safety concerns of current growth factor therapy and thus positively impacting the benefit-risk profile of potent therapeutics. Taking potential heterogeneity and by-product concerns into account, comprehensive excipient characterization was performed and a predictive algorithm for FRCs developed, in order to facilitate formulation design and guarantee a safe and efficient therapy from start to finish.
N2  - Der zunehmende Verlust an Skelettmuskelmasse, Kraft und Funktion stellt insbesondere bei Älteren eine wesentliche Gefährdung der Unabhängigkeit und Lebensqualität dar. Bislang besteht die Sarkopenie-Therapie infolge der eingeschränkten Wirksamkeit verfügbarer pharmakologischer Möglichkeiten, den Auswirkungen des Muskelschwunds entgegenzuwirken, aus einer Kombination von Krafttraining und erhöhter Proteinzufuhr. Therapeutische Intervention mit Wachstumsfaktoren wie Insulin-like growth factor (IGF-I) oder Inhibitoren von Myostatin – eines wirkungsvollen Hemmstoffes der Myogenese – bietet das Potenzial, die veränderte Aktivität der anabolen und katabolen Zytokine wieder ins Gleichgewicht zu bringen. Allerding haben Dosiseinschränkungen aufgrund akuter Nebenwirkungen und Beeinträchtigungen der Homöostase bislang eine klinische Anwendung ausgeschlossen.
Mit der Absicht, eine Therapie mit besserem Sicherheits- und Wirksamkeitsprofil zu bieten, indem die Freisetzung des Wirkstoffs auf entzündetes Gewebe gelenkt wird und Aktivitäten außerhalb des Zielgewebes minimiert werden, entwickelten wir bioresponsive Freisetzungssysteme für ein antikataboles Peptid und das anabole IGF-I, die auf lokalen Ausbruch von Muskelschwund reagieren. 
In Kapitel I werden aktuelle Konzepte bioorthogonaler Konjugationsmethoden diskutiert und auf Basis einer Vielzahl von Drug Delivery Anwendungen beurteilt. Mit besonderem Fokus auf die Verabreichung von Proteinen werden Herausforderungen und Schwierigkeiten jeder chemischen und enzymatischen Konjugationsstrategie analysiert und Möglichkeiten im Hinblick auf ihre Verwendung für die Kopplung von Biomolekülen aufgezeigt. Auf Grundlage diverser Studien zur Verknüpfung von Proteinen mit Polymeren, Partikeln und Biomaterialien unter Verwendung verschiedener ortsspezifischer Ansätze, fasst das Kapitel vorhandene Strategien zusammen und hebt gewisse Aspekte hervor, die bei Anwendung auf Biomoleküle besondere Beachtung erfordern. Abschließend wird ein Entscheidungsprozess zur Auswahl einer optimalen Verknüpfungsstrategie exemplarisch dargestellt. 
Drei dieser bioorthogonalen Kopplungsreaktionen werden in Kapitel II angewendet, wodurch das Potenzial der ortsgerichteten Konjugation für die Entwicklung neuer, homogener Drug Delivery Systeme detailliert aufgezeigt wird. Dieses Kapitel beschreibt die Gestaltung eines Delivery Systems für einen Myostatin- Inhibitor (MI) für kontrollierte und lokale Freisetzung, um Myositis-Ausbrüchen entgegenzuwirken. Die Freisetzung des MI vom Träger wird durch erhöhte Konzentration an Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) in betroffenem Muskelgewebe vorangetrieben, die durch Spaltung des dazwischen positionierten Linkers das Peptid vom Partikelträger freisetzen.  Es wurden Freisetzungsexperimente durchgeführt, um die Reaktion gegenüber mehreren MMP-Isoformen (MMP-1, -8, -9 und -13), die im Verlauf von Skelettmuskelmyopathien hochreguliert sind, festzustellen, und es wurde das Freisetzungsmuster des MI im Falle einer Krankheitsprogression analysiert. Durch Auswahl der Protease-sensitiven Linker (PSL), die unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Proteasen zeigen, können die Freisetzungsraten des MI kontrolliert und angepasst werden.  Sowohl der immobilisierte MI, als auch der auf MMP-Hochregulation hin freigesetzte MI, waren dazu in der Lage, die Wirkungen von Myostatin auf Signaltransduktion von Zellen und Myoblastendifferenzierung aufzuheben.
Das Konzept, bioresponsive Delivery Systeme für Proteine zu designen, wurde auch auf den anabolen Wachstumsfaktor IGF-I angewendet, wie in Kapitel III beschrieben wird. Zahlreiche Studien zu PEGylierten Proteinen oder Peptiden offenbaren, dass eine erfolgreiche Therapie durch Sicherheits- und Wirksamkeitsprobleme herausgefordert wird, da der Polymeranhang die Eigenschaften des biologischen Wirkstoffs beachtlich verändern und dadurch die klinische Wirksamkeit gefährden kann. Zu diesem Zweck wird ein neuer, vielversprechender Ansatz vorgestellt, mit der Absicht, die vorteilhaften Auswirkungen der PEGylierung auf die Pharmakokinetik zu nutzen, aber auch die pharmakodynamischen Herausforderungen dadurch zu adressieren, dass das Protein bei Eintritt ins Zielgewebe freigesetzt wird. Das wurde durch Einfügen eines PSL zwischen den PEG-Teil und das Protein erreicht. Das lösliche Polymerkonjugat wurde durch ortsspezifische, enzymatische Konjugation von IGF-I an den PSL hergestellt, gefolgt von Verknüpfung mit einem 30k Da-PEG unter Verwendung von kupferfreier Azid-Alkin Cycloaddition (SPAAC). Diese Strategie veranschaulicht das Potenzial der bioorthogonalen Konjugation (wie in Kapitel I beschrieben) zur Erzeugung homogener Protein-Polymer-Konjugate mit reproduzierbarem Ergebnis, aber betont auch die veränderten Proteineigenschaften, die sich aus der dauerhaften Polymerkonjugation ergeben. Verglichen mit dem Wildtyp-IGF-I zeigte das PEGylierte Protein beachtliche Veränderungen der pharmakologischen Eigenschaften, wie verminderte Interaktionen mit Insulin-like growth factor Bindungsproteinen (IGFBPs), eine submaximale proliferative Aktivität und ein verändertes Endozytosemuster. Im Gegensatz dazu wurden die Eigenschaften von IGF-I bei lokaler Spaltung des Konjugates durch MMP-Hochregulation und Freisetzung des natürlichen Wachstumsfaktors vollständig wiederhergestellt. 
Für eine erfolgreiche Formulierungsentwicklung der Proteine und Konjugate ist eine sorgfältige Auswahl geeigneter Hilfsstoffe für eine sichere und zuverlässige Therapie essenziell. Kapitel IV befasst sich mit einem Aspekt davon, indem die chemische Heterogenität von Hilfsstoffen und damit verbundene Unterschiede in der Leistung hervorgehoben werden. Polysorbat 80 (PS80) ist ein in Proteinformulierungen häufig verwendeter Hilfsstoff, der Aggregation und Oberflächenadsorption verhindern soll. Trotz dieser breiten Anwendung als Standardhilfsstoff birgt die heterogene Zusammensetzung und Performance Risiken, wie eine begünstigte Zersetzung und nachteilige Auswirkungen auf die Proteinstabilität. Auf Basis einer umfassenden Studie mit verschiedenen Chargen diverser Anbieter wurden die PS80 Produkte hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung und ihrer physikochemischen Eigenschaften charakterisiert, um eine Beurteilung der Hilfsstoffperformance in einer Formulierung zu ermöglichen. Auffällige Abweichungen sowohl zwischen unterschiedlichen Anbietern, also auch zwischen Chargen des gleichen Anbieters konnten verzeichnet werden. Die Korrelation aller Parameter ergab, dass funktionalitätsbezogene Eigenschaften (FRCs) auf Basis der chemischen Zusammensetzung alleine bzw. durch eine Kombination aus chemischen und physikochemischen Eigenschaften zuverlässig prognostiziert werden konnten.
Zusammenfassend beschreibt und bewertet diese Dissertation neue Strategien für eine zielgerichtete und kontrollierte Freisetzung von biologischen Wirkstoffen mit der Absicht, dem Ungleichgewicht zwischen anabolen und katabolen Proteinen, welches im Laufe der Alterung und im Zuge muskuloskelettaler Erkrankungen beobachtet wird, entgegenzuwirken. Zwei Wirkstoff-Verabreichungsplattformen wurden entwickelt und in vitro charakterisiert: (i) unter Verwendung antikataboler Peptide, die für eine lokale Applikation auf einem Träger immobilisiert werden, und (ii) unter Verwendung löslicher IGF-I-Polymer Konjugate für die systemische Anwendung. Beide Ansätze wurden mittels bioorthogonaler Kopplungsstrategien, die unter Berücksichtigung von Einschränkungen, Nebenreaktionen und Effizienzaspekten sorgfältig ausgewählt wurden, durchgeführt. Die bioresponsive Freisetzung der aktiven Biomoleküle als Folge einer erhöhten Proteaseaktivität konnte erfolgreich umgesetzt werden. Das therapeutische Potenzial dieser Ansätze wurde anhand mehrerer zellbasierter Wirksamkeitsassays gezeigt. Die Systeme ermöglichen eine zielgerichtete und kontrollierte Freisetzung des Wachstumsfaktors IGF-I und antikataboler Peptide, wobei sie die Sicherheitsbedenken aktueller Wachstumsfaktortherapie bewältigen und somit das Nutzen-Risiko-Profil hochwirksamer Therapeutika positiv beeinflussen. Unter Berücksichtigung der potenziellen Bedenken bezüglich Heterogenität und Nebenprodukten wurde eine umfassende Hilfsstoffcharakterisierung durchgeführt und ein prognostischer Algorithmus für FRCs entwickelt, um die Formulierungsentwicklung zu erleichtern und eine sichere und effiziente Therapie von Anfang bis zum Ende zu garantieren.
KW  - Muskelatrophie
KW  - Kontrollierte Wirkstofffreisetzung
KW  - Insulin-like Growth Factor
KW  - Myositis
KW  - bioresponsive
KW  - protease-sensitive release
KW  - co-delivery
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169047
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gunesch, Sandra
T1  - Molecular Mode of Action of Flavonoids: From Neuroprotective Hybrids to Molecular Probes for Chemical Proteomics
T1  - Wirkmechanismen von Flavonoiden: Von neuroprotektiven Hybriden zu Sonden für chemische Proteomik
N2  - Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia, and currently, there is no treatment to cure or halt disease progression. Because the one-target strategy focusing on amyloid-β has failed to generate successful pharmaceutical treatment, this work studies natural products with pleiotropic effects focusing on oxidative stress and neuroinflammation as key drivers of disease progression. The central part of this work focused on flavonoids as neuroprotectants. 7-O-Esters of taxifolin and cinnamic or ferulic acid were synthesized and investigated towards their neuroprotective potential addressing aging and disease. 7-O-Feruloyl- and 7-O-cinnamoyltaxifolin showed overadditive effects in oxidative stress-induced assays in the mouse neuronal cell line HT22 and proved to be protective against neuroinflammation in microglial BV-2 cells. The overadditive effect translated to animals using an Aβ25-35-induced memory-impaired AD mouse model where the compounds were able to ameliorate short-term memory defects. While the disease-modifying effects in vivo were observed, the detailed mechanisms of action and intracellular targets of the compounds remained unclear. Hence, a chemical probe of the neuroprotective flavonoid ester 7-O-cinnamoyltaxifolin was developed and applied in an activity-based protein profiling approach. SERCA and ANT-1 were identified as potential targets. Further, chemical modifications on the flavonoids taxifolin, quercetin, and fisetin were performed. The achievements of this work are an important contribution to the use of secondary plant metabolites as neuroprotectants. Chemical modifications increased the neuroprotective effect of the natural products, and distinct intracellular pathways involved in the neuroprotective mechanisms were identified. The results of this work support the use of secondary plant metabolites as potential therapeutics and hint towards new pharmacological targets for the treatment of neurodegenerative disorders.
N2  - Morbus Alzheimer ist die häufigste Form der Demenz und derzeit unheilbar. Die auf das Amyloidprotein fokussierte Medikamentenforschung konnte nicht zu einer erfolgreichen Therapie führen. In dieser Arbeit wurden Naturstoffe mit pleiotropischer Wirkung untersucht, die oxidativen Stress und Neuroinflammation als Schlüsselrollen für den Fortschritt der Krankheit adressieren. Das Flavonoid Taxifolin wurde in Position 7 mit Ferula- oder Zimtsäure verestert und hinsichtlich der neuroprotektiven Eigenschaften untersucht. Die Substanzen zeigten in Untersuchungen zu oxidativem Stress in der hippocampalen Mauszelllinie HT22 und in Untersuchungen neuronaler Entzündungsprozesse in BV-2 Mikroglia Zellen überadditive protektive Wirkung. Diese ließ sich auch auf ein Tiermodell übertragen. In einem Alzheimer Mausmodell konnten Beeinträchtigungen des Kurzzeitgedächtnisses durch die Verabreichung der Taxifolin-Zimtsäure- und -Ferulasäureester behoben werden. Trotz des krankheitsmodifizierenden Effekts in vivo sind die molekularen Mechanismen der Wirkung und die intrazellulären Zielstrukturen der Substanzen weitgehend unbekannt. Um dieses Problem zu adressieren, wurde eine chemische Sonde des Taxifolin-Zimtsäureesters entwickelt und synthetisiert, um Interaktionen der Substanz mit intrazellulären Proteinen mittels der sogenannten Activity Based Protein Profiling Methode aufzuklären. Hierbei konnten SERCA und ANT-1 als potenzielle Interaktionspartner identifiziert werden. Des Weiteren wurden chemische Modifikationen an den Flavonoiden Taxifolin, Quercetin und Fisetin durchgeführt. Die Erkenntnisse dieser Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag zu der Verwendung von pflanzlichen Sekundärmetaboliten als Substanzen mit neuroprotektiven Eigenschaften. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Entwicklung naturstoffbasierter Therapeutika, die dringend benötigt werden, um neue Strategien für die Behandlung komplexer, neurodegenerativer Erkrankungen hervorzubringen.
KW  - Flavonoide
KW  - Morbus Alzheimer
KW  - Alzheimerkrankheit
KW  - Flavonoide
KW  - Neuroprotektivum
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239360
ER  -