TY  - THES
A1  - Benke, Dominik
T1  - Charakterisierung der T2-Ribonuklease des Fuchsbandwurms \(Echinococcus\) \(multilocularis\)
T1  - Charcterisation of the T2-Ribonuclease of \(Echinococcus\) \(multilocularis\)
N2  - Die alveoläre Echinokokkose ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die durch tumorartig in der Leber wachsende Larven (Metazestoden) des Fuchsbandwurms ausgelöst wird. Während Th1-dominierte Immunantworten zur Expulsion des Parasiten führen können, sind Th2-Antworten mit chronischer Infektion assoziiert. Über seine exkretorisch-sekretorischen Produkte (ESPs) nimmt Echinococcus multilocularis Einfluss auf die Polarisierung der Immunantwort. Allerdings ist bislang nur wenig über die zugrundeliegenden Mechanismen und aktiven Komponenten der ESPs bekannt.
Die Immunmodulation durch Eier des Pärchenegels Schistosoma mansoni, der wie E. multilocularis zu den Plattwürmern gehört, ist dagegen schon besser charakterisiert. Hier hat omega-1, eine Ribonuklease der T2-Familie, Aufmerksamkeit als starker Induktor von Th2-Antworten und als Hepatotoxin erregt. 
Die Fragestellung dieser Arbeit war nun, ob die T2-RNase des Fuchsbandwurms (EmRNASET2) hinsichtlich ihrer Wirkungen auf Zellen des Immunsystems und der Leber Ähnlichkeiten mit omega-1 besitzt. Es konnte gezeigt werden, dass EmRNASET2 von allen Larvenstadien und auch vom adulten Wurm exprimiert wird. Der Einsatz polyklonaler Antikörper gegen rekombinant in Escherichia coli exprimierte recEmRNASET2 ermöglichte den Nachweis des Proteins in den ESPs von Primärzellen, die das frühe Stadium sich entwickelnder Metazestoden darstellen, und, wenngleich geringer ausgeprägt, in ESPs reifer Metazestoden. 
Zur Untersuchung einer möglichen immunmodulatorischen Wirkung wurden dendritische Zellen (DCs) aus murinem Knochenmark generiert und mit Überständen recEmRNASET2-produzierender HEK-Zellen exponiert. Diese zeigten im Vergleich zu Überständen von mit leerem Transfektionsvektor behandelten HEK-Zellen keine signifikante Inhibition der LPS-induzierten Reifung und Interleukin-12-Produktion von DCs, wie sie für omega-1 beschrieben ist. Auch ein Pilotexperiment mit der Leberzelllinie Hep3B lieferte keinen Anhalt für eine hepatotoxische Wirkung von EmRNASET2. Somit sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit gegen eine funktionelle Verwandtschaft von EmRNASET2 und omega-1. Unterstützt wird diese Beobachtung durch eine orientierende phylogenetische Untersuchung, in der sich EmRNASET2 näher verwandt zu einer zweiten T2-RNase von S. mansoni zeigte. Omega-1 könnte also das Resultat einer Genduplikation mit anschließender Akquirierung immunmodulatorischer Funktionen sein.
N2  - Alveolar Echinococcosis is a life-threatening disease caused by larvae (metacestodes) of the fox tapeworm, growing infiltratively in the liver. While Th1-dominated immune responses can lead to parasite expulsion, Th2-responses are associated with chronic infection. Through its excretory-secretory products (ESPs), Echinoccoccus multilocularis can influence polarisation of the immune response. However, little is known about the underlying mechanisms and active components of the ESPs. 
In contrast, immunomodulation by eggs of the blood fluke Schistosoma mansoni, a flat worm like E. multilocularis, has already been characterised more intensively and omega-1, a ribonuclease of the T2-family, has been identified as a major inductor of Th2-responses and as hepatotoxin. 
The aim of this study was to determine if the T2-RNase of E. multilocularis (EmRNASET2) has effects on cells of the immune system and the liver that are similar to those of omega-1. It could be shown that EmRNASET2 is expressed by all larval stages and by the adult worm. The use of polyclonal antibodies raised against the recombinantly expressed recEmRNASET2 allowed the detection of the protein in ESPs of primary cells, representing an early stage of developing metacestodes, and, however at a lower level, in ESPs of mature metacestodes. 
In order to address a potential immunomodulatory role, dendritic cells (DCs) were generated from murine bone marrow and exposed to supernatants of recEmRNASET2-producing HEK-cells. Compared to supernatants of HEK-cells transfected with the empty vector, conditioned medium did not show a significant inhibition of the LPS-induced maturation and interleukin-12 production of DCs, as described for omega-1. Moreover, a pilot experiment using the liver cell line Hep3B did not show evidence for a hepatotoxic effect of EmRNASET2. The results of this work therefore do not speak for a functional similarity of EmRNASET2 and omega-1. These observations are underlined by phylogenetic analyses, showing that EmRNASET2 clusters with a second T2-RNase from S. mansoni. Omega-1 could therefore be the result of a gene duplication event, with subsequent acquisition of its immunomodulatory functions.
KW  - Parasitologie
KW  - Immunologie
KW  - Alveoläre Echinokokkose
KW  - Ribonucleasen
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Immunoparasitologie
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-181064
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ashour, DiyaaEldin
T1  - Kinetics and timing of IL-12 production by dendritic cells for Th1 polarization \(in\) \(vivo\)
T1  - Kinetik und zeitlicher Ablauf der IL-12-Produktion durch Dendritische Zellen für die Th1 Polarisierung \(in\) \(vivo\)
N2  - Auf Dendritische Zellen (DCs) basierende Vakzinen hängen von der Qualität der DC-Reifung ab, um Antigenpräsentation, Kostimulation, Lymphknotenmigration und, im Faller einer T-Helfer-1 (Th1) Polarisierung, die Freisetzung von IL-12 zu induzieren. Die Herstellung des heterodimeren IL-12p70 durch injizierte DC wurde klassisch als Schlüsselfaktor beschrieben, der für die Erzeugung einer polarisierten Th1 Immunreaktion erforderlich ist. Dennoch induzieren DCs, die IL-12 nicht ausscheiden können (z. B. nach Reifung des Cytokin-Cocktails), Th1 polarisierte Immunantwortenin Mäusen und Menschen. Da zuvor auch beschrieben wurde, dass DCs in der Lage sind, andere DCs auf Bystander-Weise zu aktivieren, haben wir hier die DC-Quelle der IL-12 Produktion für die Th1-Polarisation in einem murinen DC-Vakzinemodell untersucht. Die Migration der injizierten, aus murinem Knochenmark generierten DCs (BM-DCs) war für den Antigentransport in den Lymphknoten wesentlich. Sie trugen jedoch nur teilweise zur Antigenpräsentation bei und induzierten nur einen nicht polarisierten Th0-Zustand der T-Zellen, die IL-2 produzierten, aber kein IFN-. Stattdessen deuten die Daten daraufhin, dass endogene dermale migrierende XCR1+ DCs als Bystander-DCs zur Antigenpräsentation beitragen und IL-12 für die Th1 Polarisation bereitstellten. Die genetische Ablation von migrierenden DCs und speziell von XCR1+ migrierenden DCs hebt das Th1 Priming vollständig auf, Die Kinetik der Wechselwirkungen in den drainierenden Lymphknoten erfolgt schrittweise, indem i) injizierte DCs mit verwandten T-Zellen, ii) injizierte DCs mit Bystander XCR1+ DCs und iii) Bystander XCR1+ DCs mit T-Zellen in Kontakt treten. Das Transkriptom der Bystander-DCs zeigte eine Herunterregulierung von Treg- und Th2/Th9-induzierenden Genen und eine Hochregulierung der für die Th1- Induktion erforderlichen Gene. Zusammen zeigen diese Daten, dass injizierte reife migrierende BM-DCs das T-Zell-Priming und die Bystander-DC-Aktivierung steuern, nicht jedoch die Th1-Polarisation, die durch endogene IL-12p70+ XCR1+ Bystander-DCs vermittelt wird. Unsere Ergebnisse sind von Bedeutung für klinische Studien mit Vakzine-DCs, bei denen endogene DCs durch eine Chemotherapie funktionell beeinträchtigt werden können.
N2  - Dendritic cell (DC) based vaccines rely on the quality of DC maturation to induce antigen presentation, co-stimulation, lymph node migration and the release of heterodimeric IL-12p70 in case of T helper type-1 cell (Th1) polarization. In contrast, DCs that cannot secrete IL-12p70 (e.g. after cytokine cocktail maturation) readily induce Th1 cells when injected into mice and humans. Since it was also previously suggested that DCs are capable of activating other DCs in a bystander fashion, we tested here for the DC source of IL-12p70 for Th1 polarization in a murine DC vaccination model. Migration of the injected murine bone marrow-derived DCs (BM-DCs) was essential for antigen delivery to the lymph node. However, they contributed only partially to antigen presentation, and induced a non-polarized Th0 state of the cognate T cells producing IL-2 but no IFN-. Instead, endogenous dermal migratory XCR1+ cDC1s underwent re-programming by the injected BM-DCs to acquire bystander antigen presentation and IL-12 release for Th1 polarization in the lymph node. Genetic deficiency of migratory DCs and specifically of XCR1+ migratory DCs completely abolished Th1 priming. The kinetic of cell interactions in the draining lymph nodes appeared step-wise as i) injected DCs with cognate T cells, ii) injected DCs with bystander XCR1+ DCs, and iii) bystander XCR1+ DCs with T cells. The transcriptome of the bystander DCs showed a down-regulation of Treg and Th2/Th9 inducing genes, and up-regulation of genes required for Th1 instruction. Together, these data show that injected mature lymph node migratory BM-DCs direct T cell priming and bystander DC activation, but not Th1 polarization which is mediated by endogenous IL-12p70+ XCR1+ migratory bystander DCs. Our results are of importance for clinical DC-based vaccinations against tumors where endogenous DCs may be functionally impaired by chemotherapy.
KW  - Immunologie
KW  - Dendritic cells
KW  - Dendritische Zellen
KW  - Vakzinen
KW  - Vaccine
KW  - IL-12p70
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Immunology
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179483
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gonzalez-Leal, Iris Janet
T1  - Roles of cathepsins B and L in the Th1/Th2 polarization by dendritic cells
T1  - Die Rolle von Kathepsinen B und L während der Th1/Th2 Polarisierung durch Dendritische Zellen
N2  - Leishmaniasis is a neglected tropical disease that can be manifested through different clinical forms, ranging from cutaneous to visceral. The host response against Leishmania spp. is greatly dependent on T cell-mediated immunity, in which T helper 1 responses are associated with macrophage activation and elimination of the parasite, while regulatory T cells and T helper 2 responses are correlated with parasite survival and persistence of infection. Leishmania uses different virulence factors as strategies for evading the immune response of the host. One of them are cathepsin-like cysteine proteases, which are currently under extensive investigation as targets for drug development. Previous studies with inhibitors of cathepsins B and L in vivo revealed an outstanding modulation of the host T helper cell response. However, the mechanisms behind these observations were not further investigated. Given the urgent need for better treatments against leishmaniasis, the aim of this study was to investigate the effects that the lack of cathepsin B and L activity have on the signals that dendritic cells use to instruct T helper cell polarization in response to infection with Leishmania major.

The cathepsin inhibitors tested showed low or no cytotoxicity in bone marrow-derived dendritic cells, and dendritic cells and macrophages could be generated from cathepsin B and cathepsin L-deficient mice without apparent alterations in their phenotype in comparison to wild-type controls. Furthermore, lack of cathepsin B and L activity showed no impact in the rate of promastigote processing by dendritic cells. Cathepsin B and cathepsin L-deficient macrophages showed no differences in parasite proliferation and capacity to produce nitric oxide in comparison to wild-type macrophages. In response to the parasite, dendritic cells treated with a cathepsin B inhibitor and dendritic cells from cathepsin B-deficient mice showed higher levels of expression of major histocompatibility complex (MHC) class II molecules than dimethyl sulfoxide (DMSO) or wild-type controls, but it was not accompanied by changes in the expression of costimulatory molecules. Wild-type dendritic cells and macrophages are not able to express the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-12 in response to promastigotes. However, cells treated with a cathepsin B inhibitor or cells deficient for cathepsin B were able to express IL-12, whilethe expression of other cytokines -including IL-6 and tumor necrosis factor (TNF)-alpha-remained unchanged. These characteristics point towards a more “pro-Th1” profile of dendritic cells in the absence of cathepsin B.
 
This data is the first report on IL-12 regulation depending on cathepsin B. The IL-12 up-regulation observed was already present at the transcriptional level. Furthermore, it was also present in macrophages and dendritic cells in response to LPS, and the latter had a higher capacity to induce T cell helper 1 polarization in vitro than wild-type dendritic cells. The activation of different signaling pathways was analyzed, but the up-regulation of IL-12 could not be attributed to modulation of nuclear factor-kappaB (NFkappaB), p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) and extra-cellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 pathways. Thus, the mechanism behind IL-12 regulation by cathepsin B remains to be elucidated, and the impact of these effects is yet to be confirmed in vivo. Altogether it is tempting to speculate that cathepsin B, in addition to its role in processing endocytosed material, is involved in the modulation of the pro-inflammatory cytokine IL-12.
N2  - Leishmaniose ist eine hauptsächlich in den Tropen vorkommende Infektionskrankheit, die sich in verschiedenen klinischen Formen, von kutan bis viszeral, manifestieren kann. Die Reaktion des Wirtes gegen Leishmania spp. hängt stark von der T-Zell-vermittelten Immunantwort ab, wobei die Antwort der T1-Helferzellen assoziiert ist mit der Aktivierung von Makrophagen und der Beseitigung des Parasiten, während die regulatorischen T-Zellen und T2-Helferzellen mit dem Überleben der Parasiten und der Fortdauer der Infektion in Verbindung stehen. Leishmania verwendet verschiedene Virulenzfaktoren als Strategie zur Umgehung der Immunantwort des Wirtes. Darunter zählen Cathepsin-ähnliche Cysteinproteasen, die derzeit Gegenstand umfangreicher Untersuchungen sind mit dem Ziel, für die Arzneimittelentwicklung eingesetzt werden zu können. Frühere Studien mit Inhibitoren von Cathepsin B und L in vivo zeigten eine hervorragende Modulation der Wirt-T-Helferzellantwort. Jedoch wurden die Mechanismen, die diesen Beobachtungen zu Grunde liegen, nicht weiter untersucht. Angesichts der dringenden Notwendigkeit einer besseren Behandlung gegen Leishmaniose war das Ziel dieser Studie die Auswirkungen zu untersuchen, die das Fehlen von Cathepsin B und L-Aktivität auf die Signale hat, welche die dendritischen Zellen verwenden, um die Reaktion der T-Helferzellen auf eine Infektion mit Leishmania major zu beeinflussen. 

Die getesteten Cathepsin-Inhibitoren zeigten geringe oder keine Cytotoxizität in den aus dem Knochenmark präparierten dendritischen Zellen. Dendritische Zellen und Makrophagen von Cathepsin B- und Cathepsin L-defizienten Mäusen zeigten keine offensichtlichen Veränderungen ihres Phänotyps im Vergleich zu Wildtypkontrollen. Weiterhin zeigte das Fehlen von Cathepsin B- und L-Aktivität keine Auswirkung auf die Prozessierung der Promastigoten durch dendritische Zellen. Auch zeigten Cathepsin Bund Cathepsin L-defiziente Makrophagen keine Unterschiede in der Parasitenproliferation und der Fähigkeit Stickoxid zu produzieren im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen. In Reaktion auf den Parasiten war bei mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelten dendritischen Zellen und dendritischen Zellen von Cathepsin-B-defizienten Mäusen eine höhere Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen ersichtlich im Vergleich zu DMSO oder Wildtyp-Kontrollen, aber es wurden keine Veränderungen in der Expression von costimulatorischen Molekülen festgestellt. Dendritische Zellen und Makrophagen von Wildtyp-Mäusen sind nicht in der Lage das pro-inflammatorische Zytokin IL-12 als Reaktion auf die Promastigoten zu exprimieren. Jedoch konnten dendritische Zellen, die mit einem Cathepsin-B-Inhibitor behandelt waren oder Cathepsin-B-defiziente Zellen, IL-12 exprimieren, während die Expression von anderen Zytokinen - einschließlich IL-6 und TNF-alpha- unverändert blieb. Diese Eigenschaften weisen in die Richtung einer "pro-Th1"-Antwort der dendritischen Zellen in Abwesenheit von Cathepsin B.

Diese Daten sind der erste Bericht über die IL-12-Regulierung in Abhängigkeit von Cathepsin B. Die Hochregulation von IL-12 war bereits auf der Transkriptionsebene zu beobachten. Weiterhin war sie in Makrophagen und dendritischen Zellen auch als Reaktion auf LPS vorhanden. Dendritische Zellen von Cathepsin B-defizienten Mäusen hatten eine höhere Kapazität zur Induktion einer eine T1-Helferzell-Polarisierung in vitro als dendritische Zellen von Wildtyp-Mäusen. Die Aktivierung von verschiedenen Signalwegen wurde untersucht, jedoch konnte die Hochregulierung von IL-12 nicht auf die Modulation von NF_B, p38 MAPK und ERK1/2-Signalwege zurückgeführt werden. Damit ist der für die IL-12-Regulierung durch Cathepsin B verantwortliche Mechanismus noch nicht geklärt; auch die Auswirkungen dieser Effekte in vivo müssen noch bestätigt werden. Insgesamt lässt die vorliegende Studie vermuten, dass Cathepsin B nicht nur an der Prozessierung von endozytiertem Material sondern auch an der Regulierung des pro-inflammatorischen Zytokins IL-12 beteiligt ist.
KW  - Leishmaniose
KW  - Dendritische Zelle
KW  - leishmaniasis
KW  - dendritic  cells
KW  - th1/th2 polarization
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Helferzelle
KW  - Immunologie
KW  - Infektionsbiologie
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114397
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eckert, Ina-Nathalie
T1  - Molecular markers of myeloid-derived suppressor cells and their functional role for homing and in disease models in mice
T1  - Molekulare Marker von myeloiden Suppressorzellen und ihre funktionelle Rolle für deren zielgerichtete Migration und bei Krankheitsmodellen in Mäusen
N2  - MDSCs are suppressive immune cells with a high relevance in various pathologies including cancer, autoimmunity, and chronic infections. Surface marker expression of MDSCs resembles monocytes and neutrophils which have immunostimulatory functions instead of suppressing T cells. Therefore, finding specific surface markers for MDSCs is important for MDSC research and therapeutic MDSC manipulation. In this study, we analyzed if the integrin VLA-1 has the potential as a novel MDSC marker. VLA-1 was expressed by M-MDSCs but not by G-MDSCs as well as by Teff cells. VLA-1 deficiency did not impact iNOS expression, the distribution of M-MDSC and G-MDSC subsets, and the suppressive capacity of MDSCs towards naïve and Teff cells in vitro. In mice, VLA-1 had no effect on the homing capability of MDSCs to the spleen, which is a major reservoir for MDSCs. Since the splenic red pulp contains collagen IV and VLA-1 binds collagen IV with a high affinity, we found MDSCs and Teff cells in this area as expected. We showed that T cell suppression in the spleen, indicated by reduced T cell recovery and proliferation as well as increased apoptosis and cell death, partially depended on VLA-1 expression by the MDSCs. In a mouse model of multiple sclerosis, MDSC injection prior to disease onset led to a decrease of the disease score, and this effect was significantly reduced when MDSCs were VLA-1 deficient. The expression of Sema7A by Teff cells, a ligand for VLA-1 which is implicated in negative T cell regulation, resulted in a slightly stronger Teff cell suppression by MDSCs compared to Sema7A deficient T cells. Live cell imaging and intravital 2-photon microscopy showed that the interaction time of MDSCs and Teff cells was shorter when MDSCs lacked VLA 1 expression, however VLA-1 expression had no impact on MDSC mobility. Therefore, the VLA-1-dependent interaction of MDSC and Teff cells on collagen IV in the splenic red pulp is implicated MDSC-mediated Teff cell suppression.
N2  - MDSCs sind suppressive Immunzellen mit hoher Relevanz bei verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, Autoimmunerkrankungen und chronischen Infektionen. Die Expression der Oberflächenmarker von MDSCs ähnelt Monozyten und Neutrophilen, welche im Gegensatz zu MDSCs immunstimulatorische Funktionen haben. Daher es wichtig für die Forschung und die therapeutische Manipulation von MDSCs, spezifische Oberflächenmarker für MDSCs zu identifizieren. In dieser Studie haben wir analysiert, ob das Integrin VLA-1 das ein möglicher neuer MDSC-Marker ist.
Effektor-T-Zellen und M-MDSCs, aber nicht G-MDSCs exprimierten VLA-1. VLA-1-Defizienz hatte keinen Einfluss auf die iNOS-Expression, die Verteilung der M-MDSC- und G-MDSC-Subpopulationen und die suppressive Kapazität von MDSCs gegenüber naiven und Effektor-T-Zellen in vitro. In Mäusen hatte VLA-1 keinen Einfluss auf die Fähigkeit zur zielgerichteten Migration von MDSCs zur Milz, welche ein wichtiges Reservoir für MDSCs ist. Da die rote Pulpa der Milz Kollagen IV enthält und VLA-1 Kollagen IV mit hoher Affinität bindet, fanden wir wie erwartet MDSCs und Effektor-T-Zellen in diesem Bereich. Wir konnten zeigen, dass die T Zell-Suppression in der Milz, indiziert durch verringerte T-Zell-Wiederfindung und  Proliferation sowie erhöhte Apoptose und Zelltod, teilweise von der VLA 1-Expression von MDSCs abhing. In einem Mausmodell für Multiple Sklerose führte die MDSC-Injektion vor Induktion der Krankheit zu einer Verringerung des Krankheits-Scores, und dieser Effekt war signifikant verringert, wenn MDSCs VLA-1-defizient waren. Die Expression von Sema7A durch Effektor-T-Zellen, ein Ligand für VLA-1, der mit negativer T Zell-Regulierung assoziiert ist, führte zu einer etwas stärkeren Effektor-T-Zell-Suppression durch MDSCs im Vergleich zu Sema7A-defizienten T-Zellen. Live-Cell-Imaging und intravitale 2-Photonen-Mikroskopie zeigten eine kürzere Interaktionszeit von MDSCs und Effektor-T-Zellen bei VLA-1 defizienten MDSCs, jedoch hatte die VLA-1-Expression keinen Einfluss auf die MDSC-Mobilität. Die Verwendung von VLA-1 bei der Identifizierungsstrategie von in vitro generierten MDSCs führte zu einer reineren Trennung von iNOS+ und Arg1+ Zellen von Zellen ohne Expression von Suppressormarkern. In Brusttumor-tragenden Mäusen und BCG-infizierten Mäusen, welche etablierte Modelle für die MDSC-Generierung in vivo sind, wurde VLA-1 nicht von endogenen MDSCs hochreguliert, daher ist VLA-1 möglicherweise kein geeigneter MDSC Marker in vivo. In BCG-infizierten Mäusen fanden wir CD16.2 (FcγRIV), welcher möglicherweise an der MDSC-vermittelten Immunsuppression beteiligt ist, in M-MDSCs und G-MDSCs hochreguliert, daher könnte CD16.2 ein neuer potenzieller MDSC-Marker in vivo sein. Die Analyse veröffentlichter RNA-Sequenzierungs- und Proteomikdaten von MDSCs ergab Markerkandidaten, die von MDSCs hochreguliert wurden, einschließlich VCAN und FCN1.
KW  - Immunologie
KW  - Immunsuppression
KW  - Maus
KW  - Myeloid-derived suppressor cells
KW  - Integrin
KW  - VLA-1
KW  - Homing
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319974
ER  -