TY  - THES
A1  - Schmidt, Stefanie
T1  - Cartilage Tissue Engineering – Comparison of Articular Cartilage Progenitor Cells and Mesenchymal Stromal Cells in Agarose and Hyaluronic Acid-Based Hydrogels
T1  - Tissue Engineering von Knorpel – Vergleich von Gelenkknorpel-Vorläuferzellen und mesenchymalen Stromazellen in Agarose- und Hyaluronsäure-basierten Hydrogelen
N2  - Articular cartilage damage caused by sports accidents, trauma or gradual wear and tear can lead to degeneration and the development of osteoarthritis because cartilage tissue has only limited capacity for intrinsic healing. Osteoarthritis causes reduction of mobility and chronic pain and is one of the leading causes of disability in the elderly population. Current clinical treatment options can reduce pain and restore mobility for some time, but the formed repair tissue has mostly inferior functionality compared to healthy articular cartilage and does not last long-term. Articular cartilage tissue engineering is a promising approach for the improvement of the quality of cartilage repair tissue and regeneration. In this thesis, a promising new cell type for articular cartilage tissue engineering, the so-called articular cartilage progenitor cell (ACPC), was investigated for the first time in the two different hydrogels agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) in comparison to mesenchymal stromal cells (MSCs). In agarose, ACPCs´ and MSCs´ chondrogenic capacity was investigated under normoxic (21 % oxygen) and hypoxic (2 % oxygen) conditions in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer. In the newly developed hyaluronic acid (HA)-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G), chondrogenesis of ACPCs and MSCs was also evaluated in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs like in agarose hydrogel. Additionally, the contribution of the bioactive molecule hyaluronic acid to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated in 2D monolayer, 3D pellet and HA-SH hydrogel culture. It was shown that both ACPCs and MSCs could chondrogenically differentiate in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels. In agarose hydrogel, ACPCs produced a more articular cartilage-like tissue than MSCs that contained more glycosaminoglycan (GAG), less type I collagen and only little alkaline phosphatase (ALP) activity. Hypoxic conditions did not increase extracellular matrix (ECM) production of ACPCs and MSCs significantly but improved the quality of the neo-cartilage tissue produced by MSCs. The creation of zonal agarose constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer led to an ECM production in zonal hydrogels that lay in general in between the ECM production of non-zonal ACPC and MSC hydrogels. Even though zonal co-culture of ACPCs and MSCs did not increase ECM production, the two cell types influenced each other and, for example, modulated the staining intensities of type II and type I collagen in comparison to non-zonal constructs under normoxic and hypoxic conditions. In HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogel, MSCs produced more ECM than ACPCs, but the ECM was limited to the pericellular region for both cell types. Zonal HASH/P(AGE-co-G) hydrogels resulted in a native-like zonal distribution of ECM as MSCs in the lower zone produced more ECM than ACPCs in the upper zone. It appeared that chondrogenesis of ACPCs was supported by hydrogels without biological attachment sites such as agarose, and that chondrogenesis of MSCs benefited from hydrogels with biological cues like HA. As HA is an attractive material for cartilage tissue engineering, and the HA-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) appeared to be beneficial for MSC chondrogenic differentiation, the contribution of HA to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated. An upregulation of chondrogenic gene expression was found in 2D monolayer and 3D pellet culture of MSCs in response to HA supplementation, while gene expression of osteogenic and adipogenic transcription factors was not upregulated. MSCs, encapsulated in a HA-based hydrogel, showed upregulation of gene expression for chondrogenic, osteogenic and adipogenic differentiation markers as well as for stemness markers. In a 3D bioprinting process, using the HA-based hydrogel, gene expression levels of MSCs mostly did not change. Nevertheless, expression of three tested genes (COL2A1, SOX2, CD168) was downregulated in printed in comparison to cast constructs, underscoring the importance of closely monitoring cellular behaviour during and after the printing process. In summary, it was confirmed that ACPCs are a promising cell source for articular cartilage engineering with advantages over MSCs when they were cultured in a suitable hydrogel like agarose. The performance of the cells was strongly dependent on the hydrogel environment they were cultured in. The different chondrogenic performance of ACPCs and MSCs in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels highlighted the importance of choosing suitable hydrogels for the different cell types used in articular cartilage tissue engineering. Hydrogels with high polymer content, such as the investigated HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels, can limit ECM distribution to the pericellular area and should be developed further towards less polymer content, leading to more homogenous ECM distribution of the cultured cells. The influence of HA on chondrogenic gene expression and on the balance between differentiation and maintenance of stemness in MSCs was demonstrated. More studies should be performed in the future to further elucidate the signalling functions of HA and the effects of 3D bioprinting in HA-based hydrogels. Taken together, the results of this thesis expand the knowledge in the area of articular cartilage engineering with regard to the rational combination of cell types and hydrogel materials and open up new possible approaches to the regeneration of articular cartilage tissue.
N2  - Gelenkknorpeldefekte, die durch Sportverletzungen, Unfälle oder graduelle Abnutzung ent-stehen, können zu Degeneration des Gewebes und zur Entstehung von Arthrose führen, da Knorpelgewebe nur über eine eingeschränkte Fähigkeit zur Selbstheilung verfügt. Arthrose reduziert die Beweglichkeit und verursacht chronische Schmerzen. Sie ist vor allem bei älte-ren Menschen einer der häufigsten Gründe für körperliche Behinderung. Die zurzeit verfüg-baren operativen Behandlungsmöglichkeiten können die Symptome meist für einige Zeit lindern, aber das dabei gebildete Ersatzgewebe zeigt meistens nur eingeschränkte Funktiona-lität im Vergleich zu natürlichem gesunden Knorpelgewebe und bleibt nur für eine begrenzte Zeit stabil. Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe ist ein vielversprechender Ansatz, um die Qualität des Ersatzgewebes und der Knorpelregeneration zu verbessern.
Diese Arbeit untersuchte einen neuen vielversprechenden Zelltyp für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe, sogenannte Gelenkknorpel-Vorläuferzellen (ACPCs). Diese Zellen wurden erstmals in zwei verschiedenen Hydrogelen, Agarose und HA-SH/P(AGE-co-G), mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) verglichen. Die chondrogene Kapazität von ACPCs und MSCs in Agarose wurde unter normoxischen (21 % Sauerstoff) und hypoxischen (2 % Sauerstoff) Bedingungen in Monokultur und zonal geschichteter Kokultur untersucht. In den zonalen Kokulturen befanden sich ACPCs in einer oberen Schicht und MSCs in einer unte-ren Schicht. In dem neu entwickelten Hyaluronsäure (HA)-basierten Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) wurde die chondrogene Differenzierung von ACPCs und MSCs ebenfalls in Monokultur und in zonal geschichteter Kokultur, wie im Agarose-Hydrogel, analysiert. Außerdem wurde der Beitrag des biologisch aktiven Moleküls Hyaluronsäure zur chondro-genen Genexpression von MSCs in 2D-, 3D-Pellet- und HA-SH-Hydrogel-Kulturen unter-sucht. 
Diese Arbeit zeigte, dass sowohl ACPCs als auch MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen chondrogen differenzieren konnten. ACPCs produzierten im Agarose-Hydrogel ein Gewebe, das dem Gelenkknorpel ähnlicher war als das von MSCs produzierte Gewebe, da es mehr Glykosaminoglykane (GAG), weniger Typ I Kollagen und nur geringe Aktivität der Alkalinen Phosphatase (ALP) aufwies. Hypoxische Bedingungen konnten die Produktion von extrazellulärer Matrix (ECM) durch ACPCs und MSCs nicht erhöhen, aber sie verbesserten die Qualität des von MSCs produzierten Gewebes. Die Herstellung von zon-alen Agarose-Konstrukten mit ACPCs in der oberen Schicht und MSCs in der unteren Schicht führte zu einer ECM-Produktion in zonalen Hydrogelen, die im Allgemeinen zwi-schen der ECM-Produktion der ACPC-Monokultur und der MSC-Monokultur lag. Zonale Kokultur von ACPCs und MSCs führte zwar nicht zu einer erhöhten ECM-Produktion, al-lerdings beeinflussten die beiden Zelltypen sich gegenseitig und modulierten zum Beispiel die Intensitäten der Typ II und Typ I Kollagen Färbungen im Vergleich zu Monokulturen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen. Im HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel produzierten die MSCs mehr ECM als die ACPCs, allerdings war die Verteilung der gebilde-ten ECM bei beiden Zelltypen auf den perizellulären Bereich beschränkt. Zonale HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogele führten zu einer zonalen Verteilung von ECM, die der natürli-chen Struktur von Gelenkknorpel ähnlich war, da die MSCs in der unteren Schicht mehr ECM produzierten als die ACPCs in der oberen Schicht. Anscheinend wurde die chondroge-ne Differenzierung von ACPCs von Hydrogelen unterstützt, die, so wie Agarose, keine bio-logischen Bindestellen aufwiesen, und die Chondrogenese von MSCs profitierte von Hydro-gelen mit biologischen Signalen wie HA. 
Da HA ein attraktives Material für Tissue Engineering von Knorpel darstellt und das HA-basierte Hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) anscheinend die chondrogene Differenzierung von MSCs begünstigte, wurde der Beitrag von HA zur chondrogenen Genexpression in MSCs untersucht. Eine Hochregulation der chondrogenen Genexpression ließ sich in 2D- und 3D-Pellet-Kulturen von MSCs als Reaktion auf HA beobachten, während die Genexpression von osteogenen oder adipogenen Transkriptionsfaktoren nicht hochreguliert wurde. Der Ein-schluss von MSCs in einem HA-basierten Hydrogel führte zu einer Erhöhung der Genex-pression von chondrogenen, osteogenen, adipogenen und Stemness-Markern. Ein 3D-Druck-Prozess mit dem HA-basierten Hydrogel veränderte die Genexpression von MSCs in den meisten Fällen nicht. Dennoch wurde die Expression von drei getesteten Genen (COL2A1, SOX2, CD168) in gedruckten im Vergleich zu gegossenen Konstrukten herunterreguliert. Dies unterstrich die Wichtigkeit einer genauen Kontrolle des Verhaltens der Zellen während und nach dem Druck-Prozess.
Zusammenfassend ließen sich ACPCs als vielversprechender neuer Zelltyp für das Tissue Engineering von Gelenkknorpelgewebe bestätigen. ACPCs haben Vorteile gegenüber MSCs, vor allem, wenn sie in einem passenden Hydrogel wie Agarose kultiviert werden. Die Leis-tung der Zellen war stark von den verschiedenen Hydrogelen und der Umgebung beeinflusst, die diese den Zellen darboten. Die unterschiedliche chondrogene Leistung von ACPCs und MSCs in Agarose- und HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogelen zeigte deutlich die übergeordnete Relevanz der Auswahl von passenden Hydrogelen für die verschiedenen Zelltypen, die im Tissue Engineering von Gelenkknorpel Verwendung finden. Hydrogele mit einem hohen Polymergehalt, wie das eingesetzte HA-SH/P(AGE-co-G)-Hydrogel, können die Verteilung der gebildeten ECM auf den perizellulären Bereich beschränken und sollten weiterentwickelt werden, um einen niedrigeren Polymergehalt und damit eine homogenere ECM-Verteilung durch die kultivierten Zellen zu erreichen. Der Einfluss von HA auf die chondrogene Gen-expression und auf die Balance zwischen Differenzierung und Erhaltung der Stemness in MSCs ließ sich aufzeigen. In Zukunft sollten weitere Studien die Signalfunktionen von HA und den Einfluss des 3D-Drucks in HA-basierten Hydrogelen genauer zu untersuchen. 
Zusammengenommen erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit das Wissen im Bereich des Tissue Engineerings von Gelenkknorpelgewebe, vor allem in Bezug auf eine rationale Kom-bination von Zelltypen und Hydrogel-Materialien, und eröffnen neue Ansätze zur Knorpel-regeneration.
KW  - Hyaliner Knorpel
KW  - Tissue Engineering
KW  - Hydrogel
KW  - Hypoxie
KW  - Mesenchymzelle
KW  - articular cartilage progenitor cells
KW  - Cartilage
KW  - Mesenchymal stem cell
KW  - Hyaluronsäure
KW  - Agarose
KW  - zonal Hydrogels
KW  - Bioprinting
KW  - Cartilage Tissue Engineering
KW  - Oxygen partial pressure
KW  - chondrogene Differenzierung
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251719
ER  - 
TY  - THES
A1  - Leucht, Maximilian
T1  - Charakterisierung der zellulären Signatur und Zusammensetzung von Knochenmarks-MSC aus osteoarthrotischen Hüften
T1  - Characterization of the cellular signature and composition of bone marrow MSCs from osteoarthritic hips
N2  - Die Coxarthrose ist eine häufige degenerative Erkrankung, deren Prävalenz mit steigendem Lebensalter zunimmt. Durch die steigende Lebenserwartung der Bevölkerung nimmt dementsprechend auch die Anzahl an Patienten mit Coxarthrose zu. Die Therapie besteht konservativ u.a. aus Physiotherapie und Analgesie. Reichen die konservativen Maßnahmen nicht aus, steht der totale Gelenkersatz in Form eine Totalendoprothese zur Verfügung. Bisher gibt es keine regenerativen Therapien, die den arthrotisch degenerierten Gelenkknorpel ersetzen können. Durch die Fähigkeit, sich in Knochen-, Fett- und Knorpelzellen zu differenzieren, ist in der Vergangenheit die mesenchymale Stammzelle in den Fokus der Forschung gerückt. Es wird vermutet, dass diese Stammzellpopulation das Potential besitzen könnte, den defekten Knorpel zu ersetzen. Diese Zellpopulation ist in vivo jedoch noch nicht ausreichend charakterisiert und es fehlen belastbare Daten, wie sich die (pathologische) Umgebung auf die MSC auswirkt. In den letzten Jahren sind diverse Populationen von MSC mit unterschiedlichen Eigenschaften entdeckt worden. Um die subchondralen Populationen aus arthrotischen Hüften genauer zu charakterisieren, wurde hier Reaming aus dem Acetabulum (ein bei der Hüft-TEP Implantation anfallendes chirurgisches Abfallprodukt) untersucht. Die enthaltenen Zellen wurden im Hinblick auf die zelluläre Signatur und donorenbezogenen Eigenschaften untersucht. Parameter, die untersucht wurden, waren das Alter, das Geschlecht, der BMI und der K&L Score. Außerdem wurde die zelluläre Signatur anhand bestimmter Oberflächenmarker untersucht. Weiterhin wurden die isolierten und kultivierten MSC untersucht, ob sie sich bzgl. ihrer Fähigkeit unterscheiden, sich in die adipogene bzw. osteogene Linie zu differenzieren. Eine Eigenschaft, die bisher bei allen Populationen von möglichen MNC bzw. MSC nachgewiesen wurde, ist ihre Fähigkeit Kolonien zu bilden - sog. CFU-F. Bei den durchgeführten Untersuchungen zeigte sich, dass aus allen erhaltenen Proben MSC in Form von CFU-F gewonnen werden konnten. Weiterhin waren alle Zellen in der Lage adipogen bzw. osteogen zu differenzieren. Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Differenzierungseigenschaften konnten nicht festgestellt werden. Eine höhere CFU-F Bildung konnte aus dem Reaming von männlichen Donoren nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich eine signifikant höhere Anzahl CD271-exprimierender Zellen im Reaming von männlichen Donoren befand. Ebenfalls konnte eine signifikante Zunahme für CD45- CD13+ CD105+ Zellen mit steigendem BMI nachgewiesen werden.
Durch diese umfassende Versuchsreihe konnte dargelegt werden, dass es in arthrotischen Hüften Unterschiede in der MSC Zahl im Vergleich der Geschlechter gibt und dass bestimmte Populationen von MSC mit steigendem BMI zunehmen. Um diese Ergebnisse einordnen zu können ist es in Zukunft notwendig zu untersuchen, ob diese Unterschiede allein durch die Arthrose bedingt sind oder ob dieser Unterschied auch im gesunden Knochenmark vorliegt.
N2  - Coxarthrosis is a common degenerative disease whose prevalence increases with age. Due to the increasing life expectancy of the population, the number of patients with coxarthrosis is also increasing accordingly. Among others, conservative therapy consists of physiotherapy and analgesia. If the conservative measures are not sufficient, total joint replacement in the form of a total endoprosthesis is available. To date, there are no regenerative therapies that can replace arthritically degenerated articular cartilage. Due to its ability to differentiate into bone-, fat- and cartilage-cells, mesenchymal stem cells have become the focus of research in the past. It is thought that this stem cell population may have the potential to replace defective cartilage. However, this cell population is not yet sufficiently characterized in vivo and robust data on how the (pathological) environment affects MSC is lacking. In recent years, diverse populations of MSC with different properties have been discovered.
 
To further characterize subchondral populations from osteoarthritic hips, reaming from the acetabulum (a surgical waste product generated during hip TEP implantation) was studied here. The contained cells were studied in terms of cellular signature and donor-related properties. Parameters examined were age, gender, BMI, and K&L score. In addition, the cellular signature was examined using specific surface markers. Furthermore, the isolated and cultured MSCs were examined to see if they differed in their ability to differentiate into the adipogenic and osteogenic lineages, respectively. One property that has been demonstrated so far in all populations of possible MNC or MSC is their ability to form colonies - so-called CFU-F. In the tests performed, it was shown that MSC in the form of CFU-F could be obtained from all the samples obtained. Furthermore, all cells were able to differentiate adipogenically or osteogenically. Significant differences in terms of differentiation properties could not be detected. A higher CFU-F formation could be demonstrated from reaming of male donors. Furthermore, it could be shown that a significantly higher number of CD271-expressing cells were in the reaming of male donors. Also, a significant increase for CD45- CD13+ CD105+ cells with increasing BMI was demonstrated. 
This comprehensive series of experiments demonstrated that there are differences in MSC numbers between the sexes in osteoarthritic hips and that certain populations of MSC increase with increasing BMI. In order to be able to classify these results, it will be necessary in the future to investigate whether these differences are solely due to osteoarthritis or whether this difference is also present in healthy bone marrow.
KW  - Mesenchymale Stromazelle
KW  - Coxarthrose
KW  - Mesenchymzelle
KW  - Hüftgelenkarthrose
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-305434
ER  - 
TY  - THES
A1  - Oliveira Alves Pereira, Ana Rita
T1  - Modelling of Mesenchymal Stromal Cells Interactions within the Skeletal Niche
T1  - Modellierung der Interaktionen von Mesenchymalen Stromazellen in der skelettalen Nische
N2  - Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) are a rare subpopulation of cells first identified in bone marrow with the potential to proliferate in plastic-adherent colonies and to generate de novo bone marrow stroma and its environment upon serial transplantation to heterotopic anatomical sites. Given their multipotency and self renewal competence, MSCs are prime prospective candidates for most modern musculoskeletal-tissue engineering and regenerative medicine approaches. Still, their envisioned therapeutic use is being questioned with concerns regarding their definition, characterization and integrative functions in vivo. It is well established that microenvironmental cues such as the extracellular matrix (ECM)-chemistry, the mechanical environment and local cellular and/or paracrine interactions critically control MSCs behavior. Yet, most of the scientific knowledge regarding the biology and therapeutic effect of MSCs originates from mechanistic in vitro studies where microenvironmental cues are hardly addressed. Therefore, manifestable changes in cell proliferation behavior and multilineage differentiation potential might be triggered that eventually compromise the translation of results to clinics. This thesis aims to address the complexity of MSCs interactions within the skeletal niche microenvironment in order to provide alternative methods to bypass the current MSCs in vitro culture limitations. Firstly, the influence of ECM-chemistry on MSCs behavior in vitro was explored by means of decellularized human bone models here established. Basal or osteogenic tailored cell-derived decellularized 2D matrices (dECM), proved to be suitable culture substrates for MSCs expansion by providing close-to-native cell-ECM interactions. Moreover, quantified morphological shape changes suggested a material osteo supportive potential, further functionally validated by observable spontaneous mineralization of MSCs. Aiming to identify novel intrinsic ECM regulatory features specific to the skeletal niche, 3D decellularized human trabecular bone scaffolds (dBone) were additionally developed and comprehensively characterized. Remarkably, the MSCs cultured on dBone scaffolds exhibit upregulation of genes associated with stemness as well as niche-related protein expression advocating for the conservation of the naïve MSCs phenotype. vi On the other hand, the effect of biomimetic mineralization on MSCs osteogenic lineage differentiation potential was further addressed by hydroxyapatite functionalization of type-I collagen in presence of magnesium. Mineralized scaffolds exhibited higher cell viability and a clear trend of osteogenic genes upregulation comparing with non-mineralized scaffolds. Lastly, in order to mimic the complexity of the native MSCs environment, a dynamic culture system was applied to the 3D decellularized bone constructs, previously studied in single static conditions. Mechanical stimuli generated by (1) continuous perfusion of cell culture medium at 1.7 mL/min and (2) compressive stress from 10% uniaxial load at 1 Hz, resulted in an improved cell repopulation within the scaffold and boosting of de novo ECM production. The stress-induced gene expression pattern suggested early MSCs commitment towards the osteogenic lineage mediated by integrin matrix adhesion, therefore further corroborating the recapitulation of a reliable in vitro bone niche model in dBone scaffolds. To conclude, the here developed in vitro models provide a progressive increased biomimicking complexity through which significant insights regarding MSC interactions with microenvironmental features in the skeletal niche can be obtained, thus surely paving the way for a better understanding of the role of MSCs in bone homeostasis and regeneration.
N2  - Mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSZ) sind eine seltene Subpopulation von Zellen, die erstmals im Knochenmark identifiziert wurden und die das Potenzial haben, sich in plastikadhärenten Kolonien zu vermehren und bei serieller Transplantation an heterotopen anatomischen Stellen de novo das Knochenmarkstroma und seine Umgebung zu bilden. Aufgrund ihrer Multipotenz und ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung sind MSZ erstklassige Kandidaten für moderne Ansätze des muskuloskelettalem Gewebe-Engineering und der regenerativen Medizin. Dennoch wird ihr therapeutischer Einsatz aufgrund von Bedenken hinsichtlich ihrer Definition, Charakterisierung und in vivo Integration in Frage gestellt.
	Es ist hinlänglich bekannt, dass die Mikroumgebung wie die Komposition der extrazellulären Matrix (EZM), die mechanische Umgebung und die lokalen zellulären und/oder parakrinen Interaktionen das Verhalten der MSZ entscheidend beeinflussen. Die meisten wissenschaftlichen Erkenntnisse über die Biologie und die therapeutische Wirkung von MSZ stammen jedoch aus mechanistischen In-vitro-Studien, in denen Faktoren aus der naiven Mikroumgebung von MSZ kaum berücksichtigt wurden. Dies kann zu offensichtlichen Veränderungen des Zellproliferationsverhaltens und des Differenzierungspotenzials der Zellen führen, was die Übertragung der Ergebnisse in die klinische Praxis beeinträchtigt. 
Diese Arbeit zielt darauf ab, die Komplexität der Interaktionen von MSZ in der Mikroumgebung der skelettalen Nische zu untersuchen, um Methoden zur Umgehung der derzeitigen Limitationen bei der In-vitro-Kultur von MSZ zu etablieren.
	Zunächst wurde der Einfluss der EZM auf das Verhalten von MSZ in vitro mit Hilfe von dezellularisierten menschlichen Knochenmodellen untersucht. Basale oder dezellularisierte 2D-Matrizen (dECM) osteogen differenzierter Zellen erwiesen sich als geeignete Zellkultursubstrate für die MSZ-Expansion, da sie nahezu native Zell-EZM-Interaktionen ermöglichen. Darüber hinaus deutet die quantifizierten morphologischen Formveränderungen in MSZ auf ein osteoinduktives Potenzial des Materials hin, was durch eine beobachtete spontane Mineralisierung der MSZ funktionell bestätigt wurde. Mit dem Ziel, neue intrinsische EZM-Faktoren zu identifizieren, die für die skelettale Nische spezifisch sind, wurden zusätzlich dezellularisierte 3D-Gerüste aus menschlichem trabekulärem Knochen (dBone) entwickelt und umfassend charakterisiert. Bemerkenswerterweise zeigen die auf dBone-Gerüsten kultivierten MSZ eine Hochregulierung von typischen Stammzell-assoziierten Genen, sowie die Expression von charakteristischen Nischenproteinen, was für die Erhaltung des Phänotyps naiver MSZ spricht.
	Andererseits wurde die Auswirkung einer biomimetischen Mineralisierung auf das osteogene Potenzial von MSZ durch Hydroxyapatit-Funktionalisierung von Typ-I-Kollagen Trägermaterialien in Gegenwart von Magnesium untersucht. Mineralisierte Gerüste zeigten eine höhere Zellviabilität und einen klaren Trend zur Hochregulierung osteogener Gene im Vergleich zu nicht-mineralisierten Gerüsten. 
	Um die Komplexität der nativen MSZ-Umgebung zu imitieren, wurde schließlich ein dynamisches Kultursystem auf die dezellularisierten 3D-Knochenkonstrukte angewandt, die zuvor unter statischen Bedingungen untersucht worden waren. Mechanische Stimuli, die durch (1) kontinuierliche Perfusion des Zellkulturmediums bei 1,7 ml/min und (2) Druckbelastung durch eine einachsige Last von 10 % bei 1 Hz erzeugt wurden, führten nachweislich zu einer verbesserten Zellrepopulation innerhalb des Gerüsts und zu einer Steigerung der de novo EZM-Produktion. Das stressinduzierte Genexpressionsmuster deutet darauf hin, dass es schon früh durch Integrin-Matrix-Adhäsion zu einer Festlegung der MSZ auf die osteogene Linie kommt, was die Rekapitulation eines Zuverlässigen in vitro-Knochennischenmodells in dBone-Konstrukten weiter bestätigt.
	Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier entwickelten in vitro-Modelle eine zunehmende Komplexität der zellulären Mikroumgebung darstellen, durch die wichtige Erkenntnisse über die Interaktionen von MSZ mit der Mikroumgebung in der Knochennische gewonnen werden können, was sicherlich den Weg für ein besseres Verständnis der Rolle von MSZ in der Knochenhomöostase und -regeneration ebnet.
KW  - Stem Cells
KW  - In vitro models
KW  - Bone regeneration
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266603
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seiler, Jonas
T1  - Die Expression des Vitamin-D-Rezeptors und der 24-Hydroxylase in Knochenmetastasen unterschiedlicher Entität
T1  - Vitamin-D-receptor- and CYP24A1- expression in bone metastases of different primary origin
N2  - Knochenmetastasen sind unter den drei häufigsten Manifestationsorten metastatischer Absiedelungen von fortgeschrittenen Tumorerkrankungen. Dabei sind insbesondere Patientinnen und Patienten mit Prostata- und Mammakarzinom von Knochenmetastasen betroffen. Diese Knochenmetastasen führen häufig zu einer deutlichen Verschlechterung der Lebensqualität und zu einer Begrenzung der Therapieoptionen auf lediglich palliative Ansätze. 
Die biologisch aktive Form von Vitamin D3, 1,25(OH)2-Vitamin D3, zeigt in präklinischen Studien antiproliferative und differenzierende Effekte auf Tumorzellen (101, 102, 104), die haupsächlich durch die Bindung an den Vitamin D-Rezeptor (VDR) vermittelt werden. Darüberhinaus konnte präklinisch gezeigt werden, dass eine niedrige Expression des VDRs, ligandenunabhängig, die Knochenmetastasierung und das Tumorwachstum begünstigt (118). Eine niedrige VDR-Expression ist in Primärtumoren in klinischen Studien mit aggressiven Tumoreigenschaften assoziiert (111, 113, 115) und kann zudem mit einer erhöhten/früheren ossären Metastasierung einhergehen (167). Zudem gibt es Hinweise auf einen dysregulierten 1,25(OH)2-Vitamin D3-Katabolismus durch eine erhöhte Expression des 1,25(OH)2-Vitamin D3 katabolisierenden Enzyms CYP24A1/24-Hydroxylase in primärem Tumorzellen (70, 121, 122). Durch die Untersuchungen der Primärtumoren ist damit zu hypothetisieren, dass die Expression des VDRs und von CYP24A1 bei der Tumorprogression und Knochenmetastasierung von Bedeutung sein könnte. Entsprechende Untersuchungen des VDRs und der 24-Hydroxylase in Knochenmetastasen fehlen allerdings. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Expression des VDRs und von CYP24A1 in Knochenmetastasen unterschiedlicher Primärtumoren von 66 Patientinnen und Patienten untersucht und mögliche Assoziationen mit aggressiven Tumoreigenschaften analysiert. 
Der VDR konnte sowohl im Zytoplasma als auch im Nukleus nachgewiesen werden, während CYP24A1 nur im Zytoplasma lokalisiert war. Dabei wiesen insgesamt 71 % der Knochenmetastasen eine hohe VDR-Expression im Nukleus und 56 % im Zytoplasma auf. 59 % der Knochenmetastasen wiesen eine hohe Expression des VDRs insgesamt auf. CYP24A1 war ebenso in 59 % der Knochenmetastasen hoch exprimiert. Bei der Auswertung des Zusammenhangs zwischen den TNM-Stadien und des Gradings zeigte sich ein nicht signifikanter Trend von schlecht differenzierten Tumoren hin zu einer niedrigeren nukleären VDR-Expression (p=0.07, siehe Abbildung 33). Bezüglich der T-Stadien zeigten sich keine Unterschiede der Expression des VDRs und von CYP24A1 in den Knochenmetastasen zwischen lokal fortgeschrittenen und kleinen Primärtumoren. Weiterhin hatten Patientinnen und Patienten mit Lymphknotenmetastasen tendenziell eine verminderte VDR- und auch CYP24A1-Expression in den Knochenmetastasen im Vergleich zu Patienten und Patientinnen ohne Lymphknotenmetastasen (pVDR=0.15, pCYP24A1=0.06, siehe Abbildung 35). Außerdem hatten Patientinnen und Patienten mit multiple metastasierten Tumoren eine signifikant niedrigere nukleäre VDR- und auch CYP24A1-Expression im Vergleich zu Patientinnen und Patienten mit ausschließlich ossärer Metastasierung (pVDR=0.03, pCYP24A1=0.01, Abbildung 36). Die Proteinexpression des VDRs- und von CYP24A1 korrelierten signifikant (p=0.001). 
Somit konnte mit dieser Arbeit die Proteinexpression des VDRs und von CYP24A1 in Knochenmetastasen durch Immunhistologie nachgewiesen werden. Insgesamt wurde der VDR und CYP24A1 von Knochenmetastasen diverser Entität unterschiedlich stark exprimiert. Jedoch könnten insbesondere Patienten mit VDR-exprimierenden Knochenmetastasen von einer Vitamin D3-Supplementierung profitieren, die häufig einen 25-OH-Vitamin D3 Mangel  zeigen (165, 166). Ebenso könnte eine Untersuchung auf einen niedrigen VDR-Status in Primärtumoren dabei helfen, Krebspatienten mit einem hohen Metastasierungsrisiko zu identifizieren. Allerdings sind weitere und größere Studien inbesondere mit Evaluation des gesamten Vitamin D-Metabolismus und -Signalwegs notwendig, um diesen Zusammenhang weiter zu untersuchen.
N2  - Bone metastases are among the three most frequent sites of metastatic manifestation of late-stage cancers, particularly of prostate and breast cancers. Bone metastases often reduce patient’s quality of life due to skeletal-related events. Additionally, bone metastatic tumor treatment is predominantly restricted to palliative measures.
In preclinical studies, the biologically active form of vitamin D3, 1,25(OH)2-vitamin D3, has been demonstrated to have antiproliferative and differentiating effects on cancer cells (101, 102, 104), which are mostly mediated by binding to the vitamin D receptor (VDR). Moreover, the VDR expression itself may affect cancer growth and the metastatic potential to bone. For example, preclinically, it has been shown that VDR knockdown promotes bone metastases manifestation and growth (118). Furthermore, low VDR expression is associated to aggressive cancer characteristics in primary cancers (111, 113, 115) and also linked to earlier bone metastasis manifestation in breast cancer (120). In addition, there is evidence that 1,25(OH)2-vitamin D3- catabolism is altered in cancer cells. Thus, inactivation of local 1,25(OH)2-vitamin D3-levels in cancer cells may be increased (70, 121, 122). VDR and CYP24A1 expression could therefore be important concerning cancer progression and bone metastases manifestation and growth. However, there are currently no reports of studies investigating VDR expression and vitamin D-metabolism in bone metastases. The aim of this study was hence to assess VDR and CYP24A1 (vitamin D-catabolizing enzyme) expression in bone metastases of 66 patients secondary to prostate-, breast-, kidney-, lung-, follicular thyroid- and colorectal cancers using immunohistochemistry (132).
While the VDR was localised in the nucleus and cytoplasm, CYP24A1 was identified in the cytoplasm only. A high VDR nuclear protein expression was detected in 47/66 (71 %) and cytoplasmatic in 37/66 (56 %). 39/66 (59 %) of bone metastases had a high total VDR expression. CYP24A1 was also strongly expressed in 39/66 (59 %) of bone metastases. Expression levels were correlated to patient data and cancer characteristics. There was a non-significant trend of high-grade cancers towards low nuclear VDR expression (p=0.07, see figure 33). Additionally, patients with lymph node metastases (N-stage) tended to have a reduced bone metastatic VDR and CYP24A1 expression compared to patients without lymph node metastases (pVDR=0.15, pCYP24A1=0.06, see figure 35). There was no difference of VDR and CYP24A1 expression in bone metastases between locally advanced and small primary cancers (T-stage). Interestingly, patients with further metastases other than bone metastases had reduced nuclear VDR and CYP24A1 levels compared to patients without other distant metastases (pVDR=0.03, pCYP24A1=0.01, see figure 36). Nuclear VDR and CYP24A1 expression showed a significant positive correlation (p=0.001).
In conclusion, this study demonstrated that the VDR and CYP24A1 are widely expression in bone metastases of various origin. Therefore, patients with VDR-expressing bone metastases could, in particular, benefit from vitamin D3-supplementation, as vitamin D deficiency is frequent in patients with bone metastases (165, 166). Additionally, screening for a low VDR status in primary cancers could help to identify cancer patients at a high risk of metastasis. However, further and larger studies, that evaluate the entire vitamin D metabolism and signalling pathway, are needed to investigate this association.
KW  - Vitamin D3
KW  - Vitamin D
KW  - Vitamin D-Rezeptor
KW  - Knochenmetastasen
KW  - CYP24A1
KW  - vitamin d
KW  - vitamin d receptor
KW  - bone metastases
KW  - vdr
KW  - Knochenmetastase
KW  - Metastase
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321827
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schiffmaier, Jana
T1  - Parathormon als potentielle Therapiestrategie der Odonto-Hypophosphatasie - Untersuchungen in einem dentogenen \(in-vitro\)-Modell
T1  - Parathyroid hormone as a potential therapeutic strategy for odonto-hypophosphatasia - investigations in a dentogenic \(in\) \(vitro\) model
N2  - Hypophosphatasie (HPP) beschreibt eine seltene Erbkrankheit, die hauptsächlich durch heterozygote Mutationen im ALPL-Gen verursacht wird. Diese führen zu einer verminderten Aktivität der gewebeunspezifischen alkalischen Phosphatase (TNAP). Neben skelettalen Symptomen sind Zahnanomalien wie der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ohne resorbierte Wurzel sowie eine gestörte Mineralisierung der Zahnhart-substanzen ein typisches Merkmal der HPP. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bisher noch nicht vollständig verstanden.
In der vorliegenden Arbeit wurden Zelllinien des parodontalen Ligaments mit Mutationen im ALPL-Gen charakterisiert, um anschließend mögliche Therapiestrategien für die HPP auf molekularer Ebene zu untersuchen. 
Im Rahmen der basalen Charakterisierung wurden die Zelllinien hinsichtlich der TNAP-Expression (Immunhistochemie, Western Blot), des Stoffwechselprofils (ATP-Assay) und des osteogenen Differenzierungspotenzials (Alizarin-Färbung) analysiert. Von Interesse war auch, ob durch CRISPR/Cas9-basiertes Genediting Off-Target Mutationen entstanden sind. Zur Untersuchung der molekularen Auswirkungen von PTH, welches die ALPL-Expression steigern kann, wurden zwei Protokolle etabliert, die eine kontinuier-liche, kurzzeitige bzw. intermittierende Präsenz von PTH in-vitro imitieren. Anschließend wurde die ALPL-Expression (qPCR) sowie TNAP-Aktivität (CSPD-Assay) ermittelt. 
Die basale TNAP-Expression war variabel und reichte vom völligen Fehlen in den Zell-linien mit Deletionen bis hin zu einer starken TNAP-Expression in der Zelllinie mit einer heterogenen Punktmutation. Eine niedrige Expression ging mit einer verringerten Zell-proliferation sowie extrazellulären ATP einher. Es zeigte sich ein unterschiedliches Mineralisierungspotenzial, das hauptsächlich das TNAP-Expressionsniveau in den verschiedenen Zelllinien widerspiegelt, während die PTH-Stimulation keine Wirkung auf die Differenzierung hatte. Im Gegensatz zu klinischen Beobachtungen deuten die Ergebnisse auf eine hohe Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp in-vitro hin, die in-vivo noch bestätigt werden müssen. Die Sequenzierung bestätigte, dass durch die Geneditierung keine Off-Target Mutationen aufgetreten sind, welche somit keinen limitierenden Faktor hinsichtlich der Differenzierungskapazität darstellen können. 
Die Stimulation mit PTH führte zwar nicht zu einer gesteigerten ALPL-Expression, doch konnte die TNAP-Aktivität in den ALPL-defizienten Zelllinien punktuell gesteigert werden und bildet somit eine solide Basis für weitere Experimente, die zur Therapieentwicklung für die Odonto-HPP beitragen können.
N2  - Hypophosphatasia (HPP) describes a rare inherited disorder caused mainly by heterozygous mutations in the ALPL gene. These lead to impaired activity of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP). In addition to skeletal symptoms, dental abnormalities such as premature loss of deciduous teeth without resorption of the roots and impaired mineralization of tooth hard tissues are typical features of HPP. The underlying molecular mechanisms are not yet fully understood.
In the present study, cell lines of the periodontal ligament with mutations in the ALPL gene were characterized to subsequently investigate potential therapeutic strategies for HPP at the molecular level. 
As part of the basal characterization, the cell lines were analyzed with respect to TNAP expression (immunohistochemistry, Western blot), metabolic profile (ATP assay) and osteogenic differentiation potential (alizarin staining). Also of interest was whether off-target mutations resulted from CRISPR/Cas9-based gene editing. To investigate the molecular effects of Parathyroid Hormone (PTH), which can increase ALPL expression, two protocols were established that mimic continuous, short-term, and intermittent presence of PTH in-vitro. ALPL gene expression (qPCR), as well as TNAP activity (CSPD assay) were then determined. 
Basal TNAP expression was variable, ranging from complete absence in the cell lines with deletions to strong TNAP expression in the cell line with a heterogeneous point mutation. Low expression was associated with decreased cell proliferation as well as extracellular ATP. There was a differential mineralization potential mainly reflecting the TNAP expression level in the different cell lines, whereas PTH stimulation had no effect on differentiation. In contrast to clinical observations, the results indicate a high correlation between genotype and phenotype in-vitro, which remains to be confirmed in-vivo. Sequencing confirmed that no off-target mutations occurred as a result of gene editing, which thus cannot be a limiting factor with respect to differentiation capacity. 
Although stimulation with PTH did not result in increased ALPL expression, TNAP activity was selectively increased in the ALPL-deficient cell lines, providing a solid basis for further experiments that may contribute to therapy development for Odonto-HPP.
KW  - Hypophosphatasie
KW  - Alkalische Phosphatase
KW  - Parathormon
KW  - CRISPR/Cas-Methode
KW  - PTH
KW  - TNAP
KW  - Odonto-HPP
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349152
ER  -